Estudio-de-la-expresion-de-HIF-1a-y-su-mecanismo-de-accion-en-un-modelo-de-restriccion-de-crecimiento-placentario-y-fetal-en-gestaciones-interespecies-Ovis-canadensis-mexicana-x-Ovis-aries

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
PROGRAMA DE MAESTRIA Y DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA 
PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
 
 
Estudio de la expresión de HIF-1α y su mecanismo de acción en un modelo de 
restricción de crecimiento placentario y fetal en gestaciones interespecies (Ovis 
canadensis mexicana x Ovis aries) 
 
 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
 
Doctora en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal 
 
 
 
 
 
PRESENTA: 
 
MA. TRINIDAD ARACELI CHÁVEZ GARCÍA 
 
 
 
 
TUTOR: MARCO ANTONIO CERBÓN CERVANTES 
Facultad de Química 
 
COMITÉ TUTOR: CARMEN ADRIANA MENDOZA RODRÍGUEZ 
Facultad de Química 
 
MEJÍA VILLANUEVA VICENTE OCTAVIO 
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia 
 
 
 
 
Ciudad Universitaria, Cd. Mx. Mayo 2017 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
I 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
Gracias infinitas a Dios como el gran creador 
 
 
A mis hijos, por su apoyo constante e incondicional, depositarios de mi amor, por 
los que doy gracias todos los días 
 
A mi nieta Regina, por su apoyo, amor, ternura y compañía, quien es una fuente 
de sueños en mi vida 
 
A mi mamá, quien ha sido mi guía, ya que me enseñó a trabajar por lo que se 
quiere y se sueña 
 
A mis hermanas, por su cariño de siempre 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Los sueños parecen al principio imposibles, luego improbables, y luego, cuando 
nos comprometemos, se vuelven inevitables. 
 
Mahatma Gandhi 
II 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
 
A la UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO, por permitirme ser 
parte de ella. 
 
A la FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA, por ser mí 
 
segundo hogar. 
 
 
A la FACULTAD DE QUÍMICA, por ser mí segunda familia. 
 
 
A mi Tutor: Dr. MARCO A. CERBÓN CERVANTES, por su confianza y entereza, 
pero sobre todo por su calidad humana, que fueron fundamentales para el 
desarrollo de éste proyecto. 
 
A todos los integrantes del CENTRO DE ENSEÑANZA, INVESTIGACIÓN y 
EXTENSIÓN en PRODUCCIÓN OVINA, por su valioso apoyo en el desarrollo de 
ésta investigación. 
 
Al Dr. V. OCTAVIO MEJÍA VILLANUEVA, por su apoyo y paciencia en el 
desarrollo del proyecto. 
 
A los miembros de mi JURADO, por sus acertadas recomendaciones para el 
mejoramiento del presnte trabajo. 
 
A TODOS LOS AMIGOS DEL LABORATORIO 206, por su invaluable apoyo 
siempre. 
 
A MI AMIGA CHIO, quien siempre está con su hombro, sereno y noble. 
Al Posgrado UNAM en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal. 
Al CONACYT, por la beca otorgada para la realización de estos estudios. 
Al PAPIIT (IN 220315), por el financiamiento otorgado. 
Al PAIP (5000-9108), por el financiamiento otorgado. 
Al Proyecto IT201512. 
3 
 
Promoción de la vascularización placentaria y del crecimiento fetal intrauterino en 
gestaciones restringidas. 
Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica 
(PAPIIT). UNAM. Por el financiamiento otorgado 
4 
 
RESUMEN 
 
 
 
 
 
Las gestaciones interespecies, entre especies cercanas, se realizan generalmente 
en el ganado para obtener una descendencia mejorada y adaptada al medio 
ambiente. Asimismo se han obtenido híbridos con fines de investigación desde 
hace muchos años, para el estudio de las interacciones materno-fetales o como 
una estrategia para la conservación de las especies, generalmente en vías de 
extinción. El objetivo del presente estudio fue caracterizar el modelo de restricción 
del crecimiento placentario y fetal, en la gestación interespecies (Ovis canadensis 
mexicana x Ovis aries) y estudiar la expresión de genes que participan en la 
vascularización: HIF-1α y sus genes blanco VEGF y PlGF. Los híbridos se 
obtuvieron mediante inseminación artificial, seguida de la transferencia de 
embriones y se compararon con gestaciones intraespecies (Ovis aries x Ovis 
aries), que se obtuvieron por inseminación artificial. Se midieron los niveles de 
proteína en orina y la presión sanguínea durante los dos últimos tercios de la 
gestación. En ese mismo periodo se obtuvieron muestras semanales de plasma 
con el fin de determinar Progesterona (P4), Factor de Crecimiento Vascular 
Endotelial (VEGF), Factor de Crecimiento Placentario (PlGF) y obtener ARN libre 
en el suero, como un método no invasivo, para evaluar la expresión del Factor 
Inducible por Hipoxia 1-alfa (HIF-1α). Después del parto, las crías y sus placentas 
fueron pesadas y medidas, se contaron los cotiledones, se pesaron y se determinó 
su área. Los resultados mostraron que durante los dos últimos tercios de 
gestación, las ovejas de ambos grupos presentaron una presión arterial normal y 
ninguna alteración en el contenido de proteínas en orina. Sin embargo, las 
gestaciones híbridas presentaron una disminución en el crecimiento fetal y 
placentario en comparación con el grupo de ovejas con gestaciones domésticas, 
así como en el área de los cotiledones. Además, en el grupo híbrido, hubo 
insuficiencia placentaria, caracterizada por una disminución en el crecimiento fetal 
y placentario así como en la producción de P4, así mismo hubo indicaciones de 
disfunción endotelial, caracterizada por un aumento de los niveles plasmáticos de 
VEGF y PlGF, así como en la expresión génica de HIF-1α. En general, los 
resultados indican que los híbridos de Ovis canadensis mexicana y Ovis aries 
presentan restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), fundamentalmente 
debido a la insuficiencia placentaria crónica y a la función endotelial alterada. La 
gestación híbrida en borregos representa un modelo ideal para el estudio de la 
restricción del crecimiento fetal intrauterino. 
 
 
 
 
 
 
Palabras clave: disfunción endotelial, híbrido, restricción de crecimiento 
intrauterino, insuficiencia placentaria, gestación 
5 
 
ABSTRACT 
 
 
 
 
 
Interspecies pregnancies between closely related species are usually performed in 
livestock to obtain improved, enriched and environmentally adapted offspring. 
Different hybrid populations have been obtained for research purposes since many 
years ago, and the maternal–fetal interactions have been studied as a potential 
strategy for species preservation of endangered species. The aim of this study was 
to characterize the model of restriction of placental and fetal growth in interspecies 
gestation (Ovis canadensis mexicana x Ovis aries), and to study the expression of 
genes involved in the vascularization such as HIF-1α and its target genes VEGF 
and PlGF. Control group normal pregnancy was obtained from (Ovis aries x Ovis 
aries) by artificial insemination, and hybrids were obtained by artificial insemination 
followed by embryo transfer. Protein levels in urine and blood pressure were 
assessed during the last two quarters of gestation. During the same period, weekly 
plasma samples were obtained in order to determine Progesterone (P4), 
Endothelial Vascular Growth Factor (VEGF), Placental Growth Factor (PlGF) and 
cell-free RNA from plasma to evaluate the expression of Hypoxia Inducible Factor 
1 -alpha (HIF-1α). After delivery, the offspring and their placentas were weighed 
and measured, the cotyledons counted, weighed, and their area determined. The 
results showed that during the last quarter of gestation, ewes from control groupand hybrids have normal blood pressure and urinary protein content. However, 
hybrid gestations showed a decrease in fetal and placental growth compared to the 
group of ewes with domestic gestations, as well as, in the cotyledons surface area. 
In addition, in the hybrid group, there was placental insufficiency, characterized by 
a decrease in fetal and placental growth, and production of P4, as well as, 
indications of endothelial dysfunction, characterized by an increase in plasma 
levels of VEGF and PlGF, and over expression of HIF-1α. Overall, the results 
indicate that Ovis canadensis mexicana and Ovis aries hybrids presented 
intrauterine growth restriction (IUGR), essentially due to chronic placental 
insufficiency and altered endothelial function. Hybrid pregnancy in sheeps is an 
useful model for the study of intrauterine fetal growth restriction. 
 
 
 
 
 
 
Key words: endothelial dysfunction, hybrid, intrauterine growth restriction, 
placental insufficiency, pregnancy 
6 
 
 
 
Contenido 
 
Dedicatoria I 
 
Agradecimientos II 
 
Resumen IV 
 
Abstract V 
 
Contenido VI 
 
Lista De Figuras IX 
 
Abreviaturas XI 
I. Introducción 1 
II. Antecedentes 3 
Gestaciones interespecies 3 
El borrego Cimarrón 3 
La oveja doméstica 5 
Restricción del crecimiento intrauterino 5 
La placenta 7 
Características generales 7 
Clasificación placentaria 8 
Vasculogénesis 12 
Angiogénesis 13 
Factor inducido por hipoxia alfa (HIF –1α) 17 
Progesterona y sus receptores 19 
Esteroidogénesis en Placenta 21 
Justificación 26 
Hipótesis 26 
Objetivo general 26 
7 
 
Objetivos específicos 27 
III. Metodología 27 
Animales 27 
Inseminación de ovejas donadoras 28 
Recolección de embriones híbridos Ovis canadensis mexicana x 
Ovis aries 29 
Transferencia de embriones 29 
Diagnóstico de gestación 30 
Evaluación de niveles plasmáticos de progesterona, VEGF y PlGF 31 
Evaluación de presión arterial 31 
Evaluación de proteína en orina 32 
Peso de las crías al nacimiento 32 
Peso de placentas y sus cotiledones 32 
Expresión de HIF-1α, a nivel de ARNm 32 
RT – PCR 33 
PCR 34 
Geles de Agarosa 35 
Estudio de proteínas placentarias 36 
Extracción de proteínas placentarias y cuantificación 36 
Western blot para receptores de progesterona (PR) 37 
Western blot para MLN64 (Metastatic Lymph Node 64) o StARD3 (StAR-
related lipid transfer domain protein 3) 38 
Western blot para StAR (Steroidogenic Acute Regulatory Protein) 38 
Perfil lipídico en plasma 39 
Determinación de colesterol en tejido placentario 39 
Análisis estadísticos 39 
8 
 
IV. Resultados 40 
Presión arterial 40 
Determinación de proteínas en orina 41 
Características fenotípicas de las crías 42 
Características de las placentas 43 
Niveles plasmáticos de progesterona 45 
Expresión de los receptores de progesterona A y B (PR-A y PR-B) 45 
Expression de StAR (Steroidogenic Acute Regulatory Protein) y de StARD3 
(StAR- related lipid transfer domain protein 3) 46 
Perfil lipídico en plasma 47 
Determinación de colesterol en tejido placentario 49 
Niveles plasmáticos de VEGF 49 
Concentraciones plasmáticas de PlGF 50 
Expresión de HIF-1α, a nivel de ARNm 51 
V. Discusión 52 
VI. Conclusiones 64 
VII. Perspectivas 65 
VIII. Referencias 66 
IX. Anexos 83 
Phenotypic and molecular characterization of intrauterine fetal growth restriction in 
interspecies sheep pregnancy 84 
IX 
 
Lista de figuras 
 
Figura 1. Representación esquemática de diferentes tipos de placenta 8 
 
Figura 2 Representación esquemática de la placenta ovina y capas de tejidos 
materno-fetales 10 
 
Figura 3. Cascada de angiogénesis 12 
 
Figura 4. Regulación de la estabilidad y actividad del HIF-1α dependiente del 
oxígeno 17 
 
Figura 5. Síntesis de pregnenolona en la mitocondria de la placenta humana 25 
 
Figura 6. Registro de presión arterial media (PAM) 40 
 
Figura 7. Registro de proteínas en orina durante la gestación 41 
 
Figuras 8. Peso promedio de los corderos al nacimiento 42 
 
Figura 9. Peso promedio de las placentas 42 
 
Figura 10. Peso promedio de los cotiledones 43 
 
Figura 11. Número de cotiledones promedio de las placentas 43 
 
Figura 12. Promedio del área cotiledonaria 43 
 
Figura 13. Niveles plasmáticos de progesterona 44 
 
Figura 14. Western blot representativo de la expresión del receptor de 
progesterona A (RP-A) 45 
 
Figura 15. Western blot representativo de la expresión del receptor de 
progesterona B (RP-B) 45 
 
Figura 16. Western blot representativo de la expresión de StAR (Steroidogenic 
Acute Regulatory Protein) 46 
 
Figura 17 Western blot representativo de la expresión del StARD3 (StAR-related 
lipid transfer domain protein 3) o MLN64 (metastatic lymph node 64 protein) 46 
 
Figura 18. Niveles de colesterol en plasma 47 
 
Figura 19. Niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) 47 
 
Figura 20. Niveles lipoproteínas de baja densidad (LDL) 47 
 
Figura 21. Niveles de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) 47 
 
Figura 22. Niveles de colesterol en tejido placentario 48 
1
0 
 
 
Figura 23. Concentración plasmática del factor de crecimiento vascular endotelial 
(VEGF) 49 
La figura 24. Concentración plasmática del factor de crecimiento placentario 
(PlGF) 49 
Figura 25. Expresión de HIF-1α en plasma 50 
1
1 
 
 
Abreviaturas 
 
 
 
3β-HSD 1,3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa 
Ang-1 Angiopoyetina-1 
Ang-2 Angiopoyetina-2 
 
bFGF Factor de crecimiento de fibroblastos básico 
bHLH-PAS Del inglés basic Hélix-Loop-Hélix-Per/ARNT/Sim 
CYP11A1 Enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol 
dNTP’s Desoxirribonucleótidos trifosfatados 
dT Desoxitimina 
 
EGF Factor de crecimiento epidérmico 
 
Flk-1 De inglés fetal liver kinase-1 
 
Flt-1 Tirosina tipo fms-1 
 
HDL Lipoproteínas de alta densidad 
 
HIF Factor inducido por hipoxia 
 
HIF-α Factor inducible por hipoxia alfa 
 
HRE Elemento de respuesta a hipoxia 
 
KDR Del inglés Kinase insert domain receptor 
 
LDL Lipoproteínas de baja densidad 
 
MLN64 Del inglés Metastatic Lymph Node 64 
 
mM Milimolar 
 
M-M LV Virus Moloney de leucemia murina 
 
ng Nanogramo 
 
ODDD Dominio de degradación dependiente de oxígeno 
PAM Presión arterial media 
PAM Presión arterial media 
 
PBS Tampón fosfato salino 
XII 
 
PD Presión diastólica 
 
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas 
PKA Proteína quinasa A 
PlGF Factor de crecimiento placentario 
 
PR Receptor de progesterona 
 
PR-A Receptor de progesterona A 
 
PR-B Receptor de progesterona B 
 
PS Presión sistólica 
 
PV Peso vivo 
 
PVDF Polifluoruro de vinilideno 
 
RCIU Restricción de crecimiento intrauterino 
 
RT-PCR Transcriptasa inversa con reacción en cadena de la polimerasa 
SDS Dodecilsulfato sódico 
sFlt-1 Tirosina tipo fms-1 soluble 
 
StAR Proteína reguladora aguda esteroidogénica 
 
StARD3 Del inglés StAR-related lipid transfer domain protein 3 
StARD3 StAR-related lipid transfer domain protein 3 
START Del inglés StAR-related lipid-transfer 
TBE Buffer de electroforesis tris-borato 
TBS Solución salina tamponada Tris 
 
UA Unidades arbitrarias 
 
VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial 
 
VHL Von Hippel-Lindau 
 
μg Microgramo 
 
μl Microlitro 
 
μM Micromolar 
1 
 
I. Introducción 
 
 
Uno de los grandes retos para los especialistas de la salud, médicos veterinarios, 
ha sido mantener el equilibrio interespecies, conservando el equilibrio biológico y 
el ambiente natural de cada especie, conservando también el equilibrio ecológico 
del planeta. 
 
En la actualidad han desaparecido cientos o miles de especies animales, con la 
repercusión concomitante al equilibrio ecológico y consecuentemente con el 
enorme error que se ha cometido en este sentido, no pudiendo en la actualidad 
recuperar dichas especies a la vida y al equilibrio de este planeta. 
 
Una de las estrategias que se ha realizado con el interés demantener especies en 
vías de extinción es la producción de modelos animales híbridos, sin embargo, 
estos modelos representan un reto de estudio ya que son complejos y de difícil 
manejo. 
 
Por otro lado, son sumamente interesantes ya que su estudio representa un 
modelo para el entendimiento de la herencia, la reproducción y sus posibles 
fisiopatologías entre otros. Una de éstas, ha sido la disfunción placentaria, 
representada por la baja producción de progesterona, que en el presente estudio 
se observó a lo largo de las gestaciones híbridas, por sus características nos da la 
oportunidad de identificar las diferentes particularidades de ésta alteración y sus 
consecuencias, como es el caso de la restricción de crecimiento intrauterino. 
 
Si bien un gran número de sus etiologías no han sido identificadas, se ha 
observado que diversos factores están implicados en la restricción de crecimiento 
intrauterino, condiciones intrínsecas al feto por ejemplo las anomalías 
cromosómicas, o los factores maternos como son la hipertensión, diabetes o 
preeclampsia entre otras. En el ambiente placentario, la placenta tiene un papel 
integral, ya que la inadecuada perfusión, y la disfunción de sus vellosidades 
pueden ser responsables de esta patología, la respuesta de estas vellosidades al 
2 
 
daño causado por la isquemia y/o hipoxia puede implicar una angiogénesis 
errática, lo que limita sus posibilidades en cuanto a las exigencias por parte del 
feto. 
 
Los factores angiogénicos, Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF) y el 
Factor de Crecimiento Placentario (PlGF) y sus inhibidores, tienen gran 
importancia en la proliferación de las vellosidades placentarias y la angiogénesis, 
pues actúa en el desarrollo de ambos, y son altamente expresados durante el 
desarrollo placentario y fetal. VEGF es esencial en la formación de nuevos vasos, 
participa en la proliferación y migración, actuando como modulador en la 
diferenciación de los tejidos y la angiogénesis además PlGF actúa impulsando la 
angiogénesis, estimulando la quimiotaxis y la proliferación en las células 
endoteliales. 
 
La angiogénesis placentaria está regulada principalmente por el factor inducido 
por hipoxia (HIF-1), a través de su subunidad α, es un factor de transcripción que 
regula la respuesta celular a hipoxia y actúa como moderador de la homeostasis 
del oxígeno, estos procesos también incluyen vasculogénesis, metabolismo, 
vasodilatación y migración celular. HIF-1, es un regulador maestro mediante el 
cual las células se adaptan a los cambios en las concentraciones de oxígeno. Si 
los embriones no responden a esta tensión de oxígeno estresante, no logran 
sobrevivir y desarrollarse y en última instancia, morir. 
 
La síntesis de progesterona implica procesos por los que el colesterol se convierte 
en hormonas esteroides, por lo tanto la comprensión de la esteroidogénesis es de 
gran importancia dada la complejidad de cada paso, siendo cada paso una 
limitante en la velocidad de la síntesis, sujeto a mecanismos de regulación 
finamente acoplados. 
3 
 
II. Antecedentes 
Gestaciones interespecies. 
La gestación interespecie ocurre cuando una hembra lleva en el útero un embrión 
de una especie diferente, el que será una cría hibrida que tendrá un nuevo 
genoma (Cuevas, 2012; Musa et al., 2012, Widayati, 2012). Estos son generados 
en menor número en la naturaleza y en mayor número por la mano del hombre. 
Los motivos para producir gestaciones interespecies han sido variados, desde 
estudios en el laboratorio, de la fisiología de la gestación, de las interacciones 
materno-fetales, la conservación de animales en peligro de extinción o la 
producción de animales con características deseables. Por ejemplo en la cruza de 
Bos indicus x Bos taurus, híbridos fértiles con tolerancia al calor y resistencia a 
enfermedades, para el trabajo las mulas admiten más carga, más paciencia, 
resistencia y menor consumo de alimento, o en la cruza de alpaca x llama, mejor 
calidad de fibra fina, mayor peso al nacimiento y al destete (Mine et al., 2000, 
Zhang, 2000; Lira, 2010; Huanca et al., 2011, Widayati, 2012, Musa et al., 2012, 
Sumar, 2013). 
 
 
 
 
 
El borrego Cimarrón 
 
 
El borrego cimarrón (Ovis canadensis) es una de las especies de mamíferos 
mayores que estuvo ampliamente distribuida en las regiones desérticas y 
montañosas de los estados de Baja California Norte, Baja California Sur, Sonora, 
Chihuahua, Coahuila y Nuevo León; sin embargo, durante los siglos XIX y XX, sus 
poblaciones silvestres se vieron fuertemente afectadas principalmente por la 
transformación y fragmentación de su hábitat natural, cacería legal e ilegal, la 
competencia con el ganado doméstico (Pelz-Serrano et al., 2006; Valdez, 2012; 
Rodríguez-Rodríguez et al., 2013). 
4 
 
El borrego cimarrón o del desierto (Ovis canadensis) pertenece al Orden 
Artyodactila, Suborden Rumantia, Familia Bovidae y subfamilia Caprinae 
(Shackleton, 1985; Smith y Krausman 1988). De las subespecies de borrego 
cimarrón reconocidas en Norteamérica, tres ocurren en México; dos en la 
península de Baja California (Ovis canadensis cremnobates y O. c. weemsi y una 
en el Estado de Sonora (O. c. mexicana) (Instituto Nacional de Ecología, 2000; 
Valdez, 2012). 
 
Las ovejas cimarronas son poliéstricas estacionales, por lo general el celo ocurre 
durante el otoño y parte del invierno, por lo que los nacimientos son en primavera, 
sin embargo, la especie tiene una época reproductiva extendida, desde julio a 
diciembre con ciclos estrales de alrededor de 28 días, por lo general paren 1 cría 
(Shackleton, 1985; Álvarez-Romero et al., 2008). Los pesos de corderos en 
cautividad en el rango del nacimiento entre 2,8 a 5,5 kg (Shackleton, 1985). El 
periodo de gestación de los cimarrones es de 174 a 180 días (Shackleton, 1985; 
Smith y Krausman 1988; Álvarez-Romero et al., 2008). 
 
El borrego cimarrón (Ovis canadensis mexicana) es considerado como uno de los 
mamíferos sujetos a protección especial (Pr), en la (NORMA Oficial Mexicana 
NOM-059-ECOL-1994, que determinó las especies y subespecies de flora y fauna 
silvestres terrestres y acuáticas en peligro de extinción, amenazadas, raras y las 
sujetas a protección especial, y que estableció especificaciones para su protección 
(Instituto Nacional de Ecología, 1994). Así como la NORMA Oficial Mexicana 
NOM-059-ECOL-2001, Protección ambiental-Especies nativas de México de flora 
y fauna silvestres-Categorías de riesgo y especificaciones para su inclusión, 
exclusión o cambio-Lista de especies en riesgo (SEMARNAT, 2001), y la NOM- 
059-SEMARNAT-2010, Medio Ambiente y el Ministerio de Recursos Naturales), 
por calificar entre aquellas especies que podrían llegar a encontrarse amenazadas 
por factores que inciden negativamente en su viabilidad, por lo que se determina la 
necesidad de propiciar su recuperación y conservación o la recuperación 
(SEMARNAT, 2010). 
5 
 
La oveja doméstica 
 
 
La actual oveja doméstica se conoce científicamente por Ovis aries, lo que indica 
su pertenencia al género Ovis, el cual está integrado en la familia Bovidae, y ésta 
a su vez en el orden Artiodactyla, uno de los más importantes mamíferos desde el 
punto de vista zootécnico (Álvarez-Romero y Medellín 2005; Delgado y Nogales 
2009), es poliéstrica estacional, la duración de la temporada de apareamiento 
varía con la duración del día, raza y nutrición, coincidiendo con el final del verano y 
el otoño, con el objetivo de que la temporada de partos generalmente es durante 
la primavera. En el periodo de actividad reproductiva, presenta una sucesión de 
ciclos estrales con intervalos entre dos ciclos de 17 días, que varía entre 16 a 19 
días, con un tiempo de gestación: De 144 a 150 días (Jainudeen et al., 2000; 
Álvarez-Romero y Medellín 2005; Forcada, 2010; Bartlewski et al., 2011). 
 
 
 
 
Restricción de crecimientointrauterino (RCIU) 
 
 
En los mamíferos euterios, la placenta es el principal órgano de comunicación 
entre el feto y la madre. Una de las principales funciones de la placenta es 
entregar nutrientes y oxígeno al feto. El fracaso de la placenta para entregar un 
suministro adecuado de nutrientes al feto se denomina insuficiencia placentaria y 
resulta en RCIU (Sandovici et al., 2012; Zhang et al., 2015). 
 
Restricción de crecimiento intrauterino (RCIU), en medicina humana, este término 
es utilizado para referirse a un feto que no ha alcanzado su máximo potencial de 
crecimiento en el útero, puede ser causado por factores de origen materno, 
placentario, fetal o del medio ambiente que alteran la respuesta materna, 
presentan un peso y talla por debajo del percentil 10 para su edad gestacional, al 
nacer son patológicamente pequeños y con el riesgo de no evolucionar 
correctamente (Regnault et al., 2002; Rosenberg, 2007; Morrison, 2008; Zhang et 
al., 2015), resultando en bajo peso al nacer, parto prematuro y aumento de la 
6 
 
morbilidad perinatal y mortalidad (Barut et al., 2010). Las causas pueden ser 
originadas por la madre, la placenta, el feto o el medio, la isquemia placentaria y 
su insuficiencia se da en consecuencia una función placentaria deteriorada 
(Regnault et al., 2002; Brodsky y Christou 2004; Morrison, 2008; Barut et at., 2010; 
Maynard y Karumanchi 2011). 
 
En este sentido, el crear un modelo animal y poder usarlo para el estudio de la 
fisiología de la placenta y del feto ha sido de incalculable valor, debido a la 
posibilidad de repetir el muestreo, controlar experimentos y analizar múltiples 
periodos durante la gestación, bajo diferentes condiciones maternas y fetales 
(Morrison, 2008; Ulbrich et al., 2013). Las ovejas, se han utilizado ampliamente 
como un modelo experimental para el estudio de RCIU, reduciendo el suministro 
del sustrato feto placentario, utilizando una variedad de métodos, incluyendo la 
eliminación quirúrgica de la mayoría de las carúnculas del endometrio antes de la 
gestación, induciendo hipertermia materna, ligando la arteria umbilical, o con 
exceso de alimentación a hembras en pubertad gestantes (Reynolds et al., 2005; 
Zhang et al., 2015). 
 
El crecimiento fetal y el tamaño al nacer, en particular, son fundamentales para 
determinar la mortalidad y morbilidad, tanto inmediatamente después del 
nacimiento como durante el crecimiento y desarrollo. En los mamíferos, el principal 
determinante del crecimiento intrauterino es el suministro de nutrientes de la 
placenta al feto, de hecho, en muchas especies, el peso del feto en el corto plazo 
se correlaciona positivamente con el peso de la placenta, como una medida 
aproximada de la superficie para el transporte materno-fetal de nutrientes (Fowden 
et al., 2009; Zhang et al., 2015). A su vez, la capacidad de transferencia de 
nutrientes de la placenta depende de su tamaño, la morfología, el flujo sanguíneo 
y la abundancia transportada (Zhang et al., 2015). 
7 
 
La placenta 
Características generales 
En los mamíferos, el desarrollo del embrión su supervivencia, así como una 
gestación exitosa, dependen de la creación de órgano materno-fetal funcional. 
Esta conexión se inicia durante el contacto principal del embrión, seguido por la 
implantación del embrión al endometrio materno, y culmina con la generación de la 
placenta juntos, estos procesos se conocen como placentación (Bressan et al., 
2009; Sandovici et al., 2012). 
 
La placenta es un órgano transitorio mediante la cual se realizan múltiples 
funciones necesarias para el éxito de dar una nueva vida, que van desde el 
anclaje del conceptus, (producto de la concepción), a la pared uterina, la 
modulación de la respuesta inmune de la madre para prevenir el rechazo 
inmunológico, facilita el intercambio de nutrientes, gases y deshechos entre el 
sistema materno y fetal. También produce y metaboliza varias hormonas que son 
liberadas a la circulación materna, que desempeñan un papel importante en la 
regulación de las adaptaciones maternas a la gestación. Es el primer órgano que 
se forma durante la gestación. (Reynolds y Redmer, 2001; Bressan et al., 2009; 
Fowden et al., 2009; Sandovici et al., 2012; Zhang et al., 2015). 
8 
 
 
 
Figura 1. Representación esquemática de diferentes tipos de placenta, en varias 
especies: 1; placenta humana, 2; equina, 3; felina, 4; roedor; 5; rumiante; y 6; 
porcina. Am: amnios, Al: alantoides, V: saco vitelino y C: corion (adaptado de 
Fernandes et al., 2012). 
 
 
Clasificación placentaria 
 
La placenta se ha descrito como el órgano más variable en estructura que 
cualquier otro órgano en los mamíferos, por lo que se clasifican de diferentes 
formas y desde diferentes puntos de vista. Considerando la relación entre la 
madre y el feto según su origen vascular o por su morfología e histología (Barreto 
y Souza 2012; Burton et al., 2006). Figura 1, de acuerdo a su morfología, son 
cuatro tipos (difusa, cotiledonaria, zonal, y discoidal), clasificándose de acuerdo 
con el área de intercambio materno-fetal, si se encuentra disponible sobre toda la 
superficie del saco coriónico, aumentado por la formación de pliegues o si está 
restringido, a algunas zonas, que es la característica de este grupo (Carter y 
Enders 2004; Barreto y Souza 2012; Fernandes et al., 2012; Furukawa et al., 
2014). 
Difusa. Toda superficie del epitelio luminal uterino está cubierto por vellosidades, 
que se distribuyen uniformemente y se encuentra en caballos y cerdos (Barreto y 
Souza 2012; Furukawa et al., 2014). 
9 
 
Cotiledonaria. Este tipo de placenta se caracteriza por tener las vellosidades 
coriónicas agrupadas llamadas en cotiledones (100 a 120), sitio donde el útero 
está en contacto con la placenta, la porción del feto se llama cotiledón y los sitios 
de fusión maternos son carúnculas que al unirse forman un placentoma. Este tipo 
de placenta se encuentra en rumiantes (vaca, oveja y cabra) (Ferrugem, 2008; 
Barreto y Souza 2012). 
Zonal. Este tipo de placenta muestra una zona del corion recubierta de 
vellosidades formando una banda en la región ecuatorial del saco coriónico, donde 
se unen al endometrio, formando una circunferencia correspondiente al lumen del 
útero. Este tipo de placenta se encuentra en los carnívoros (perras y gatas) 
(Barreto y Souza 2012; Furukawa et al., 2014). 
Discoidal. Este tipo de placenta no se encuentra en ninguna especie doméstica, se 
localiza en primates, roedores y conejos. Se caracteriza porque el área de la 
placenta por medio del cual se une con el endometrio forma un disco oval por lo 
que la interacción materna se limita a esa área (Ferrugem, 2008; Furukawa et al., 
2014). 
10 
 
 
 
Figura 2. Representación esquemática de la placenta ovina y capas de tejidos 
materno-fetales. De acuerdo a la clasificación de Grosser. 1; alantoides, 2; 
amnios, 3; saco vitelino, 4; epitelio coriónico, 5; cotiledón EC: epitelio coriónico, 
EU: epitelio uterino, CF: capilares fetales, CM: capilares maternos, LB: lámina 
basal, Si: sincitiotrofoblasto, IM: intersticio materno, SM: sangre materna 
(modificado de Burton et al., 2006). 
 
 
En la clasificación por su estructura histológica (Figura 2), Otto Grosser, propuso 
un sistema de clasificación tomando en cuenta el número de capas de tejido que, 
bajo el microscopio de luz, separan las corrientes sanguíneas materna y fetal, 
aunque el sistema se ha actualizado, proporcionó un marco útil para su estudio, 
por lo general se aplica de una forma simplificada con tres tipos principales: 
epiteliocorial, endoteliocorial, y hemocorial (Carter y Enders 2004; Burton et al., 
2006; Carter, 2011; Furukawa et al., 2014). 
Epiteliocorial. Este tipo de placenta, se constituye de seis capas histológicas, 
donde el epitelio uterino se mantiene intacto, se pone en contacto con el corion, 
11 
 
carece de invasión o destrucciónde sus paredes. Esta placenta se encuentra en 
yegua, cerda, vaca y borrega (Carter, 2011; Furukawa et al., 2014). 
Endoteliocorial. En esta placenta, el epitelio uterino y el tejido conectivo 
desaparecen después de la implantación por lo que el corion entra en contacto 
directo con el endometrio materno, esta placenta la constituyen cuatro capas 
histológicas. Este tipo de placenta se encuentra en la perra y en la gata (Ferrugem, 
2008; Furukawa et al., 2014). 
Hemocorial. Este tipo de placentación es la más invasiva, está constituida por tres 
capas histológicas, donde todas las capas de tejidos maternos desaparecen a 
través de la erosión, lo que lleva a la conexión directa entre el corion y la sangre 
materna. Este tipo de placenta lo encontramos en primates y roedores (Burton et 
al., 2006; Ferrugem, 2008; Furukawa et al., 2014). 
Existen variaciones específicas en cada especie, en el caso de algunos rumiantes 
(vaca y oveja), las células binucledas características de éstos, modifican el epitelio 
uterino por fusión apical para formar un sincicio mixto materno-fetal, para describir 
este tipo de relación placentaria se ha aceptado el término sinepiteliocorial (Burton 
et al., 2006; Barreto y Souza 2012). 
De la creación de un entorno materno adecuado para el desarrollo del feto 
depende el buen funcionamiento y desarrollo de las células trofoblásticas, éste 
está regulado únicamente por las señales que emanan de ambos, y requieren la 
expresión bien coordinada de muchos factores de transcripción, factores de 
crecimiento, citocinas y sus receptores entre otros (Reynolds y Redmer 2001; 
Myatt, 2006; Bressan et al., 2009; Sandovici et al., 2012). La placenta presenta un 
tejido de rápido crecimiento con una alta demanda metabólica que requiere la 
formación de vasos sanguíneos y procesos angiogénicos dinámicos desde 
temprano hasta el final del embarazo para apoyar su crecimiento y función 
(Grazul-Bilska et al., 2010). Para el desarrollo vascular son necesarios 2 procesos 
distintos, vasculogénesis y angiogénesis. 
12 
 
Vasculogénesis 
 
La vascularización de la placenta es el resultado de la formación de novo de 
capilares a partir de células precursoras mesenquimales pluripotentes (Burton et 
al., 2006). La neovascularización, o la formación de nuevos vasos sanguíneos, se 
divide en dos procesos: vasculogénesis y angiogénesis. Vasculogénesis 
embrionaria o clásica es el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a 
partir de hemangioblastos que se diferencian en células sanguíneas y células 
endoteliales maduras. En el embrión, los vasos sanguíneos se desarrollan primero 
por agregación de angioblastos en una red primitiva de tubos endoteliales simples, 
que son remodelados en un sistema circulatorio, se someten a proliferación, así 
como de ramificación y migración (Roskoski, 2007; Arroyo y Winn 2008; Patel-Hett 
y D’Amore 2011), el desarrollo vascular y angiogénesis es paralelo al crecimiento 
de los tejidos uterinos y de la placenta para apoyar el crecimiento y el desarrollo 
fetal (Reynolds y Redmer 2001 , Sandovici et al., 2012). 
 
 
Figura 3. Cascada de angiogénesis. 1. Producción y liberación de factores de 
crecimiento. 2. Unión a los receptores de la célula endotelial y activación. 3. 
Degradación enzimática de la membrana basal. 4. Migración y proliferación de la 
célula endotelial. 5. Formación de los tubos vasculares. 
13 
 
Angiogénesis 
 
Es el proceso por el cual se desarrollan nuevos vasos sanguíneos a partir de 
preexistentes redes vasculares. Figura 3, este proceso se inicia a partir de la 
producción y liberación de factores de crecimiento, seguido de la unión a sus 
receptores y su activación, posteriormente la destrucción local de la pared de un 
vaso preexistente, así como la activación de la proliferación celular endotelial y la 
migración, a continuación las células endoteliales se ensamblan en estructuras 
tubulares alrededor de la cual se forman entonces paredes del vaso sanguíneo. 
Durante la maduración posterior de la red vascular, los capilares se funden en 
vasos más grandes, arterias, venas, para finalmente madurar en vasos 
sanguíneos estables (Devorak, 2005; Roskoski, 2007; Arroyo y Winn 2008; Patel- 
Hett y D’Amore 2011). 
La actividad del tejido durante la angiogénesis depende del equilibrio de muchos 
factores, ya sea estimulante o inhibidora. Este sistema de señalización molecular 
es clave en la activación y modulación de la proliferación y migración de células 
endoteliales que forman la base de cualquier vaso (Arroyo y Winn 2008; 
Karamysheva, 2008; Patel-Hett y D’Amore 2011). Hay cerca de 30 factores pro- 
angiogénicos endógenos conocidos, varios de los cuales han sido identificados 
como importantes reguladores de estos procesos, incluyendo el factor de 
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico 
(EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoyetinas-1 y -2 
(Ang-1 y Ang-2), y altamente regulado por la familia de proteínas del factor de 
crecimiento vascular endotelial (VEGF) y sus receptores, que son inducidos por el 
factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) (Regnault et al., 2002; Devorak, 2005; 
Arroyo y Winn 2008; Roskoski, 2007). 
VEGF es una familia de glicoproteínas homodiméricas de cinco miembros: VEGF 
(o VEGF-A), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E y el factor de crecimiento 
placentario PlGF. Una diferencia importante entre las isoformas es su afinidad por 
la heparina lo que afecta su unión con la superficie celular (Devorak, 2005; 
Roskoski, 2007; Patel-Hett y D’Amore 2011). Las principales actividades biológicas 
14 
 
de VEGF contribuyen a la inducción de la angiogénesis, como son: crecimiento, 
proliferación, migración, supervivencia y aumento de la permeabilidad vascular 
(Ferrara, 1997; Matsumoto, 2001; Koch y Claesson-Welsh 2012). 
Al factor de angiogénesis VEGF, se le identificó originalmente como un factor de 
permeabilidad vascular (Matsumoto, 2001; Takahashi y Shibuya 2005), es el 
miembro más ampliamente estudiado de esta la familia y se ha implicado tanto en 
la vasculogénesis como en la angiogénesis (Takahashi y Shibuya 2005; Roy et al., 
2006; Patel-Hett y D’Amore 2011). 
 
El VEGF es una glicoproteína homodimérica de 45 kDa. Se han identificado cinco 
isoformas variantes, expresadas de un solo gen de VEGF, VEGF121, VEGF145, 
VEGF165, VEGF189 y VEGF206, indicado así por su número de residuos de 
aminoácidos, resultado del proceso de maduración por corte y empalme del 
ARNm, que contiene ocho exones separados por 7 intrones. El VEGF121 y el 
VEGF165 son los más ampliamente expresados y son los principales reguladores 
en la proliferación y migración de las células endoteliales, al igual que de la 
permeabilidad vascular (Ferrara y Davis-Smith 1997; Matsumoto, 2001; 
Karamysheva, 2008; Patel-Hett y D’Amore 2011). 
En ovinos se ha observado que está presente desde el inicio del desarrollo fetal, 
Cheung et al. (1995), detectaron la expresión de las isoformas de VEGF en 
cotiledones, corion y amnios, a través de la gestación Así mismo Bogíc et al., en 
(2002), observaron la expresión de VEGF en placenta ovina. 
El factor de crecimiento placentario (PlGF), miembro de la familia VEGF, comparte 
el 53% de similitud con la secuencia de aminoácidos con VEGF, se identificó 
primero en placenta, se expresa en todas las etapas de gestación, también se 
sabe que está presente en corazón, pulmón, glándula tiroides y músculo 
esquelético. Por empalme alternativo, o splicing alternativo que es un proceso de 
edición post-transcripcional producido tras la obtención del ARN mensajero 
primario, se han descrito cuatro isoformas PlGF-1- 4, las cuales tienen diferente 
afinidad a heparina. Los PlGFs median sus efectos a través de VEGFR-1 (Roy et 
al., 2006; Burton et al., 2009). PlGF tiene efecto directo en células endoteliales 
15 
 
mediante la inducciónde su propia señalización y por la interacción con VEGF 
impulsando la angiogénesis (Takahashi y Shibuya 2005; Roy et al., 2006). Se ha 
observado que la expresión de PlGF disminuye condiciones de hipoxia 
(Matsumoto, 2001). 
VEGF induce la angiogénesis en una variedad de condiciones fisiológicas y 
patológicas incluyendo la embriogénesis, la formación del cuerpo lúteo, 
crecimiento tumoral, cicatrización de heridas y la angiogénesis compensatoria en 
el corazón. Mediante la interacción con sus receptores de tipo tirosina cinasas, 
expresados en la superficie celular de la mayoría de las membranas celulares de 
las células endoteliales: VEGFR-1 o Flt-1 (fms-like tyrosine kinase-1) y VEGFR-2 o 
Flk-1 (fetal liver kinase-1) en ratones, y en humanos, KDR (Kinase insert domain 
receptor) (Ferrara y Davis-Smyth 1997; Cross et al., 2003; Ferrara et al., 2003; 
Roy et al., 2006). VEGFR-1 y VEGFR-2 están expresados predominantemente por 
las células endoteliales vasculares, así mismo ambos receptores son regulados en 
condiciones de hipoxia (Hoeben et al., 2004). 
VEGFR-1 es un receptor que se une con alta afinidad a VEGF y PlGF, se expresa 
en las células endoteliales vasculares y en una variedad de células no 
endoteliales. Tiene actividad cinasa mucho más débil que VEGFR-2, es incapaz 
de generar una respuesta mitogénica en las células endoteliales cuando son 
estimuladas por VEGF (Hoeben et al., 2004). Modula la división de las células 
endoteliales en las primeras etapas del desarrollo vascular, antes de la formación 
de los primeros vasos sanguíneos primitivos. Durante el desarrollo, se expresa 
primero en angioblastos y en el endotelio, aunque en menor medida que VEGFR- 
2, su expresión disminuye durante las etapas embrionarias posteriores (Takahashi 
y Shibuya 2005; Otrock et al., 2007). 
La unión de VEGF a VEGFR-2 promueve la dimerización del receptor que se 
estabiliza adicionalmente por interacciones con baja afinidad (Matsumoto, 2001; 
Cross et al., 2003; Roy et al., 2006; Koch, 2012). VEGFR-2 se considera que es el 
principal mediador de varios efectos fisiológicos de VEGF en las células 
endoteliales como son: proliferación, supervivencia, migración y la permeabilidad 
16 
 
(Cross et al., 2003, Ferrara et al., 2003; Koch y Claesson-Welsh 2012), tras la 
unión de sus ligandos con el dominio extracelular del receptor, activan una 
cascada de proteínas, después de la dimerización y autofosforilación de los 
receptores intracelulares tipo tirosina cinasas (Cross et al., 2003; Takahashi y 
Shibuya 2005; Otrock et al., 2007; Patel-Hett y D’Amore 2011). 
Los receptores de tipo tirosina cinasas, de VEGF, son proteínas 
transmembrananales con un único dominio transmembrana, su región extracelular 
esta formado por siete dominios similares a inmunoglobulina. Los receptores 
VEGFR son altamente homólogos (Roy et al., 2006; Otrock et al., 2007; 
Karamysheba, 2008). 
Es importante señalar que VEGFR-1 tiene una forma soluble (sVEGFR-1 o sFlt-1), 
resultado del proceso de maduración por corte y empalme del ARNm, solo tiene 
los seis primeros dominios y carece de la región transmembrana, se une con alta 
afinidad a VEGF lo que contribuye a ambas condiciones fisiológicas y patológicas 
mediante el bloqueo de la función de los factores de crecimiento VEGF y PlGF, lo 
que sugiere que puede ser un regulador negativo (Ferrara y Davis-Smyth 1997; 
Roskoski, 2007; Arroyo y Winn 2008). 
La expresión génica de VEGF está regulada positivamente por la hipoxia, se ha 
observado que el ARNm de VEGF se expresa rápidamente y de forma reversible 
por la exposición a bajo O2, se ha establecido que factor inducible por hipoxia-1 
(HIF-1), a través de su subunidad α, es un mediador clave de las respuestas 
hipóxicas (Ferrara y Davis-Smyth 1997; Takahashi y Shibuya 2005). 
Durante la embriogénesis temprana, etapa en la que el ambiente uterino es 
relativamente hipóxico, en respuesta a la adaptación a la hipoxia se activa la 
expresión de HIF-1α, que regula directamente la transcripción de los factores 
angiogénicos, específicamente la familia VEGF y sus receptores (Ahmed et al., 
2000; Barut et al., 2010; Koch y Claesson-Welsh 2012). En etapas posteriores, se 
detecta la expresión de VEGF en la mayoría de los órganos en el ratón y humano 
incrementándose en las áreas de hipoxia que se caracterizan por una 
17 
 
angiogénesis activa debido a la presencia de elementos de respuesta a hipoxia 
(HRE) (Ferrara y Davis-Smyth 1997; Matsumoto, 2001). 
 
 
Factor inducido por hipoxia 1α (HIF-1α) 
 
HIF-1α, es un factor de transcripción que regula directamente la transcripción de 
estos factores, conforme aumenta la edad gestacional y la concentración de 
oxígeno, la expresión de HIF-1 y la de sus genes blanco, disminuyen favoreciendo 
la maduración del trofoblasto (Ahmed et al., 2000; Regnault et al., 2002; Barut et 
al., 2010, Pringle et al., 2010). 
 
 
 
 
Figura 4. Regulación de la estabilidad y actividad del HIF-1α dependiente del 
oxígeno. En normoxia, HIF-1α es hidroxilada en sus dominios de degradación por 
PHD-2 y PHD-3, permitiendo su interacción con la proteína VHL (von Hippel- 
Lindau). Ese complejo marca a HIF-1α con una serie de moléculas de ubiquitina, y 
son inmediatamente reconocidas por el proteosoma. Además, FIH (factor inhibidor 
de HIF) actúa como una asparaginil hidroxilasa, evitando la interacción de HIF-1α 
con diversos coactivadores, tales como p300/CBP, dando por resultado su 
inactivación. Durante la hipoxia, la actividad de las prolil y asparaginil-hidroxilasas, 
que dependen del oxígeno, se reduce. El HIF-1α acumulado se combina con HIF- 
1β para formar un heterodímero que se une al ADN e interactúa con sus 
coactivadores, impulsando la transcripción de diversos genes inducibles por HIF- 
1α (modificado de Reshef, 2012). 
18 
 
Los factores inducibles por hipoxia (HIF) se identificaron por primera vez en 
estudios de eritropoyesis inducida por hipoxia. Este factor mostró unirse y activar 
la transcripción del gen humano EPO que codifica la eritropoyetina (Hubbi y 
Semenza 2015). Los HIFs son una familia de factores de transcripción que 
responden a cambios en la presión de oxígeno del entorno celular. HIF-1 es un 
heterodímero que contiene una subunidad expresada constitutivamente (HIF-1β) y 
una subunidad (HIF-1α), que es regulada por los niveles de oxígeno por poseer un 
dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODDD), el cual regula la 
estabilidad de la proteína, ambas subunidades α y β, pertenecen a la familia de 
proteínas de unión a ADN conocidas como bHLH-PAS (basic Hélix-Loop-Hélix- 
Per/ARNT/Sim) porque contienen dominios básicos hélice-bucle-hélice y dominios 
PAS que regulan su actividad transcripcional. También poseen una región básica, 
que les permite la unión específica a secuencias de ADN formando el elemento de 
respuesta a hipoxia (HRE) que se encuentran asociados a gran número de genes, 
HIF reconoce y se une a los motivos de secuencia GACGTG. En normoxia, las 
concentraciones de oxígeno (20% O2) favorecen la hidroxilación de dos residuos 
de prolina (P402 y P564), en el dominio ODDD, de HIF-1α promoviendo la 
interacción de HIF con el complejo E3 ubiquitina ligasa de la proteína de Von 
Hippel-Lindau (VHL), ese complejo marca a HIF-1α con una serie de moléculas de 
ubiquitina, y son inmediatamente reconocidas por el proteasoma. En situación de 
hipoxia, HIF-1α se estabiliza y se transloca del citoplasma al núcleo, donde 
dimeriza con la subunidad 1β, y el complejo formado se transforma en 
transcripcionalmente activo, este complejo activo se une a elementos de respuesta 
en el promotor, reconoce los HRE que se encuentran en las regiones promotoras 
de sus genes blanco, incluyendo muchos factores involucrados en la regulación de 
la angiogénesis, tales como VEGF, PlGF, Ang-1, Ang-2 y PDGF e induce la 
transcripción de dichos genes (Figura 3) (Cunnigiaet al., 2000; Semenza, 2001; 
Regnault et al., 2002; Peña, 2008; Reshef, 2012). 
El principal regulador de HIF-1α, es el oxígeno, diversos mecanismos 
postraduccionales son los encargados de regular la degradación de HIF-1α: 
19 
 
hidroxilación, ubiquitinación y acetilación: pero es la hidroxilación el evento que 
juega un papel más relevante en su regulación, HIF-1α esta expresado de modo 
constitutivo en la mayoría de tipos celulares, por debajo de una presión parcial de 
O2 del 6%, estabilizándose rápidamente (Pringle et al., 2010; Dongjun et al., 
2014). 
La isquemia placentaria e hipoxia, se han observado que con frecuencia están 
asociados, así mismo se ha observado que las mujeres con preeclamsia tienen 
alteraciones en el factor HIF-1 placentario y sus genes blanco, incluyendo VEGF, 
PlGF y VEGFR-1, la inadecuada placentación es común a restricción de 
crecimiento placentario y preeclampsia, ocurriendo ésta restricción de crecimiento 
con o sin preeclampsia Wang et al., 2009; Ashur-Fabian et al., 2012). 
 
 
Progesterona y sus receptores 
 
Durante la gestación, la progesterona juega un papel fundamental e indiscutible en 
el establecimiento y mantenimiento de la preñez en los mamíferos. Conceptus en 
crecimiento y desarrollo, en los mamíferos requieren progesterona, sus acciones 
en el útero regulan la diferenciación y función endometrial, la señalización 
reconocimiento de la gestación, la receptividad uterina para la implantación del 
blastocisto y las interacciones embrión y útero (Spencer et al., 2004; Reynolds et 
al., 2015). Por lo que el mantenimiento de una gestación depende en gran medida 
de la esteroidogénesis placentaria adecuada (Tuckey, 2005; Parraguez et al., 
2013). Las hormonas esteroides se sintetizan a partir del colesterol, sustrato para 
las mitocondrias de células especializadas de la corteza adrenal, gónadas y 
placenta (Gómez-Chang et al., 2012; Esparza-Perusquía et al., 2015; Martínez et 
al., 2015). 
Durante la gestación en seres humanos, la progesterona ovárica es inicialmente 
importante para el mantenimiento de la gestación, sin embargo, como progresa la 
gestación, la placenta se convierte en la principal fuente de progesterona. Esto 
también se aplica a otros mamíferos, incluyendo la oveja (Lea et al., 2007). 
20 
 
La mayoría de las acciones de progesterona están mediadas por receptores 
específicos que se encuentran en la membrana celular y en el núcleo. Los 
receptores intracelulares de progesterona (PR), PR-A y PR-B, regulan el 
desarrollo y la función del endometrio e inducen cambios esenciales en las células 
para la implantación y el establecimiento y mantenimiento de la gestación (Tuckey, 
2005; Camacho-Arroyo et al., 2007; Vázquez-Martínez et al., 2014). 
PR-A y PR-B pertenecen a una familia de factores de transcripción activados por 
ligando y comparten elementos estructurales y funcionales comunes, como la 
región reguladora, dominio de unión al ADN, región bisagra y el dominio de unión 
a ligando, con otros receptores de hormonas esteroides, el dominio de unión al 
ADN, región bisagra y el dominio de unión al ligando son idénticos en PR-A y B 
con la diferencia entre los dos RPs que el dominio regulador N-terminal se trunca 
en 164 aminoácidos en PR-A (Boonyaratanakornkit y Dean 2004; Patel et al., 
2015; Reynolds et al., 2015). Una diferencia en la actividad transcripcional de las 
isoformas del RP, está relacionada con su estructura, en la región N-terminal de 
PR-B posee una función de activación, que está ausente en PR-A. Así mismo PR- 
A, posee una función inhibidora situada junto a la función de activación, solo en 
ésta. De hecho, PR-A normalmente funciona como un inhibidor transcripcional de 
PR-B. Por otra parte, se ha informado que ambas isoformas actúan como 
activadores transcripcionales de genes diferentes en la misma célula. Esto 
significa que la actividad fisiológica de los PRs es el resultado de la proporción de 
contrapeso de estas isoformas cuando ambos están presentes en las mismas 
células (Camacho-Arroyo et al., 2007; Vázquez-Martínez et al., 2014). 
Tras la unión del ligando, PR-A y PR-B afectan la función celular mediante dos 
mecanismos de acción: genómica o clásica, que implica cambios en la expresión 
génica, donde la función de los RPs, como factores de transcripción activados por 
ligando interactúan directamente con el promotor de ADN con elementos 
potenciadores y co-rreguladores transcripcionales para modular la expresión de 
genes que están relacionados con los efectos a largo plazo, mientras que el modo 
21 
 
no genómico o no clásico, implican cambios a nivel de la membrana celular y se 
relacionan con efectos rápidos (Patel et al., 2015; Reynolds et al., 2015). 
Vasconcellos et al. (2011), realizaron un estudio para evaluar la expresión de los 
RPs y de estrógenos, en el tracto genital de ovejas, detectando la expresión 
mediante inmunohistoquímica y por RT-PCR, tiempo real y concluyeron que 
ambos receptores estuvieron presentes. Asimismo en otro estudio, 
interesantemente se ha observado la expresión de los PRs en carúnculas y en 
membranas fetales durante el inicio de gestaciones ovinas (Reynolds et al., 2015). 
 
 
 
Esteroidogénesis en Placenta 
 
 
El colesterol es la molécula básica para la síntesis de todas las hormonas 
esteroides, y el primer paso de la esteroidogénesis es la especialización celular 
para este propósito (Finco et al., 2015). Numerosas fuentes de colesterol pueden 
ponerse a disposición de la célula para este fin, estos incluyen colesterol 
transportado por las lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta 
densidad (HDL), la hidrólisis de ésteres de colesterol intracelular almacenados en 
gotitas de lípidos, el colesterol que se internaliza de la membrana plasmática, y la 
síntesis de novo a partir de acetato (Miller, 2013; Finco et al., 2015; Ruggiero y 
Lalli 2016). Además una cantidad significativa de colesterol es sintetizada por el 
feto, a más de tener una fuente externa, específicamente la circulación materna a 
través de la placenta, transportado del trofoblasto y células endoteliales mediado 
por receptores (Woollett, 2005; Woollett, 2011). 
 
La biosíntesis de hormonas esteroides requiere la transferencia de colesterol, su 
precursor, desde el exterior a la membrana mitocondrial interna en ovinos (Lea et 
al., 2007), igualmente en la placenta humana, ésta es la primera limitante en la 
esteroidogénesis, para su conversión en pregnenolona, paso finamente 
coordinado (Miller y Auchus 2011; Finco et al., 2015). 
22 
 
Se ha observado que en tejidos como cerebro, suprarrenales y gónadas, el 
transporte de colesterol se lleva a cabo por la proteína StAR (Steroidogenic Acute 
Regulatory Protein), la cual está ausente en la placenta humana (Pulak et al., 
2009; Finco et al., 2015), el colesterol transportado se convierte en pregnenolona 
por la enzima citocromo P450scc (CYP11A1), que se encuentra en el lado de la 
matriz de la membrana mitocondrial interna (Yamazaki et al., 2006; Finco et al., 
2015; Martínez et al., 2015). StAR es una proteína mitocondrial que regula la 
producción de esteroides aguda en las glándulas suprarrenales y gónadas en 
respuesta a la corticotropina y a la hormona luteinizante, respectivamente (Alpy el 
al., 2005, Clark y Stocco 2014). 
 
La placenta pertenece al grupo de los tejidos esteroidogénicos de respuesta 
crónica y es probable que ésta sea la razón por la cual, las células del trofoblasto 
no tengan las proteínas que transportan el colesterol del citoplasma a las 
mitocondrias descritas en los tejidos de respuesta aguda, como las glándulas 
suprarrenales y gónadas (Miller y Auchus 2011; Gómez-Chang et al., 2012; 
Martínez et al., 2015). 
 
StAR, StAR1 o StARD1, se sintetiza como una proteína precursora de 37 kDa, a la 
importación y procesamiento de éste precursor mitocondrial producenun producto 
intermedio 32 kDa y una forma madura de 30 kDa que se localiza dentro de la 
matriz (Clark et al., 1994; Clark, 2012; Clark y Stocco 2014). Esta proteína fue 
descubierta en la búsqueda del factor que desencadena la respuesta aguda a la 
esteroidogénesis, identificada, como una fosfoproteína 30 kDa asociada con 
mitocondrias (Arakane et al., 1997; Miller, 2013), a continuación, clonó el ADNc y 
la nombró Steroidogenic Acute Regulatory protein (StAR) (Clark et al., 1994; Miller, 
2013). Descrita por primera vez como una proteína de 30 kDa, en un cultivo de 
células de la corteza adrenal de ratas, su patrón de expresión se correlacionó con 
el aumento de la producción de hormonas esteroides. La clonación de ADNc de 30 
kDa de la línea celular tumoral MA-10 de ratón, reveló una proteína predicha de 
23 
 
284 aminoácidos y su expresión dio como resultado un incremento en la síntesis 
de esteroides (Clark et al., 1994., Clark, 2012). 
 
La expresión de la proteína StAR está generalmente regulada por mecanismos 
dependientes de AMPc en las glándulas suprarrenales y las gónadas (Pulak et al., 
2009; Alpy el al., 2005). Además requiere la fosforilación de la proteína precursora 
de 37 kDa por la proteina quinasa A (PKA), para la actividad máxima de la 
proteína de 30 kDa biológicamente activa (Miller y Auchus 2011; Clark et al., 2012, 
Arakane et al., 1997). 
 
Otra proteína de la misma familia de transportadores es, la MLN64 (por sus siglas 
en inglés Metastatic Lymph Node 64) o StARD3, (StAR-related lipid transfer 
domain protein 3), es una proteína de 445 residuos, con dos dominios distintos: un 
dominio amino-terminal que contiene cuatro hélices transmembrana y un dominio 
carboxilo terminal de transferencia de lípidos relacionado con START 
(steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer), que es un dominio 
conservado de unión a colesterol. El dominio START, es una secuencia 
conservada que se pliega en una estructura α/β formando un bolsillo hidrofóbico 
de unión a esteroles y otros lípidos (Miller y Auchus 2011; Clark, 2012). Este 
dominio es el responsable de la mecánica de inducir la transferencia de colesterol 
y que funciona en la membrana mitocondrial externa (Alpy et al., 2005; Pulak et 
al., 2009; Rigotti, 2010; Clark, 2012). EL ADNc de MLN64 se identificó a partir de 
una biblioteca de ADNc de ganglios linfáticos metastásicos de cáncer de mama 
(Alpy et al., 2005; Clark, 2012). 
 
MLN64 se encuentra en los endosomas tardíos, de esta localización específica 
sugirió que MLN64 es un transportador de colesterol derivado de lipoproteínas de 
baja densidad (LDL), que por endocitosis se transporta a los endosomas tardíos, 
donde el colesterol se encamina a diferentes orgánulos (Alpy et al., 2005). Los 
estudios de localización subcelular han demostrado que la MLN64 parcialmente 
co-localiza con los marcadores asociados con principios de reciclaje, endosomas 
24 
 
tardíos y con los lisosomas, se encontró con LBPA (ácido lisofosfatídico), un 
marcador de endosomas tardíos, lo que demuestra que MLN64 es una proteína 
residente de endosomas tardíos (Alpy y Tomasetto 2006). 
 
MLN64 contiene un dominio que comparte 33% de identidad de secuencia y 53% 
de similitud de secuencia con la START de StAR humana por lo que MLN64 se 
reconoció como una proteína START y se nombró StARD3 (Clark, 2012). Se ha 
observado en ensayos de Western blot para StARD3 que la proteína 55-kDa se 
procesa proteolíticamente en cuatro proteínas con pesos moleculares de 27, 28, 
31, y 33-kDa (Esparza-Perusquía et al., 2015). 
 
A diferencia de otros tejidos como la corteza suprarrenal o las gónadas, la 
placenta no cuenta con regulación aguda de la esteroidogénesis, la placenta 
humana no expresa la proteína StAR, se ha sugerido que es a través de StARD3 o 
MLN64 que se estimula la esteroidogénesis y que ésta es la proteína responsable 
del transporte de colesterol en la placenta humana, en virtud de su homología a 
StAR (Watari et al., 1997; Gómez-Chang et al., 2012; Esparza-Perusquía et al., 
2015). START 
 
Se ha identificado una familia de genes en base a la homología estructural, cada 
proteína contiene un dominio de ~245 aminoácidos de transferencia de lípidos 
relacionados con StAR, START, (por sus siglas en inglés StAR-related lipid- 
transfer) El genoma de los mamíferos contiene 15 proteínas de dominio START 
(StARD1-StARD15), StARD1 es sinónimo de StAR, se han clasificado así porque 
se unen al colesterol (5), o a proteínas (10) (Soccio y Breslow 2003; Rigotti et al., 
2010). 
25 
 
 
 
Figura 5. Síntesis de pregnenolona en la mitocondria de la placenta humana. 
P450scc: Cholesterol side chain cleavage enzyme; 3β-HSD: 1,3β-hidroxiesteroide 
deshidrogenasa; AR: adrenodoxina reductasa; Adx: Adrenodoxina (adaptado de 
Tuckey, 2005). 
 
Una vez que las moléculas de colesterol se transfirieron con éxito a la mitocondria, 
primer paso limitante en la síntesis y después de la primera reacción de 
esteroidogénesis catalizada por la enzima P450scc (CYP11A1; por sus siglas en 
inglés Cholesterol side chain cleavage enzyme), ésta conversión es otra limitante 
que regula la síntesis de la esteroidogénesis. La adrenodoxina y la adrenodoxina 
reductasa constituyen una pequeña cadena que transporta electrones hacia el 
P450scc desde el NADPH. En el caso de la placenta las mitocondrias expresan la 
enzima 1,3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa isomerasa (3β-HSD), la cual cataliza 
la biotransformación de pregnenolona a progesterona (Figura 5), (Tuckey, 2005; 
Miller y Auchus 2011). 
26 
 
Justificación 
 
 
Se tiene conocimiento de algunas de las principales características reproductivas 
generales de los híbridos Ovis canadensis mexicana x Ovis aries, pero los 
aspectos fisiopatológicos de este tipo gestación interespecie no han sido 
estudiados, por lo que esta investigación permitirá conocer tanto parámetros 
bioquímicos y moleculares como aspectos clínicos de este modelo. 
 
 
 
 
 
 
 
Hipótesis 
 
 
Una gestación interespecífica (Ovis canadensis mexicana x Ovis aries) originará 
un inadecuado desarrollo placentario y fetal, así como alteraciones en la expresión 
de HIF-1α y sus genes blanco (VEGF y PlGF), causando un síndrome de 
restricción del crecimiento intrauterino. 
 
 
 
 
 
Objetivo general 
 
 
Caracterizar el modelo de restricción del crecimiento placentario y fetal en la 
gestación interespecies (Ovis canadensis mexicana x Ovis aries) y estudiar la 
expresión de genes que participan en la vascularización HIF-1α y sus genes 
blanco VEGF y PlGF. 
27 
 
Objetivos específicos 
 
 
1. Caracterizar el modelo híbrido de crecimiento placentario y fetal, evaluando 
parámetros de funcionalidad del sistema cardiovascular y renal. 
 
2. Estudiar las características fenotípicas de las crías. 
 
3. Estudiar las concentraciones plasmáticas de factores angiogénicos (VEGF, 
PlGF, HIF-1α) y progesterona. 
 
4. Estudiar los mecanismos moleculares que participan en la esteroidogénesis del 
trofoblasto. 
 
 
 
 
 
 
III. Metodología 
Animales 
Se utilizaron borregas domésticas del Centro de Enseñanza, Investigación y 
Extensión en Producción Ovina (CEIEPO) perteneciente a la Facultad de Medicina 
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
Localzado en el poblado de Tres Marías, km 53.1 carretera Federal México – 
Cuernavaca, Municipio de Huitzilac, Estado de Morelos C. P. 62515. 
 
Para la obtención de las gestaciones híbridas, a fin de obtener una cría por oveja, 
se realizó transferencia de embriones, para lo cual se organizaron, en 2 grupos, 
donadoras y receptoras. A las donadoras, se inseminaron con semen congelado 
de borrego Cimarrón (Ovis canadensis mexicana), los embriones obtenidos se 
transfirieron seis días después a las ovejas receptoras. Para el grupo control, se 
utilizó semen de borrego doméstico (Ovis aries).28 
 
Inseminación de ovejas donadoras 
 
 
Las ovejas donadoras de embriones, se sincronizaron con dispositivos 
intravaginales de liberación controlada de progesterona (CIDR, Pfizer), al mismo 
tiempo que las receptoras. Para la superovulación se les administró 
intramuscularmente una dosis total de 140 mg de hormona folículo estimulante 
(FSH, Folltropin V, Bioniche, Canadá), durante 4 días cada 12 horas, en dosis 
decrecientes, iniciando dos días antes del retiro del dispositivo. Se les detectó el 
celo y posteriormente se inseminaron intrauterinamente con semen congelado de 
borrego Cimarrón. Para ello, las ovejas permanecieron sin alimento 48 horas y sin 
agua 24 hr, antes de ser anestesiadas con Xilacina al 10%, a dosis de 0.44 mg/kg 
de peso vivo vía intramuscular y 1 mg/kg de ketamina vía endovenosa. Fueron 
esquiladas previamente y se rasuraron, se lavó con jabón la región abdominal y 
posteriormente con jabón quirúrgico y benzal. Se colocaron en una mesa para 
inseminación, en una posición decúbito dorsal, se introdujo una aguja de Veress 
para insuflar la cavidad abdominal. Se realizaron 2 incisiones de 3 cm a cada lado 
de la línea media y por debajo de la ubre para insertar 2 trócares con cánula de 5 
mm de diámetro: por una se introdujo un laparoscopio recto por la otra el aplicador 
para semen, y se inseminaron en cada uno de los cuernos uterinos con una dosis 
de semen de 70 millones de células. Finalizada la inseminación se suturaron las 
incisiones y se les administró un antibiótico de larga acción, 1 ml por 30 – 40 kg de 
PV de Penicilina de larga acción (Pencivet Super fuerte, Intervet, México). Horas 
después de realizada la inseminación (1-2), cuando se recuperaron de la cirugía 
se les proporcionó agua y pastura en pequeñas cantidades, al día siguiente la 
alimentación habitual y se les dejó descansar en corrales individuales (Mejía, 
2012a). 
29 
 
Recolección de embriones híbridos Ovis canadensis mexicana por Ovis 
aries 
 
Se llevó a cabo mediante laparoscopía medio ventral el sexto día posterior a la 
inseminación artificial, para lo cual las hembras se anestesiaron con 0.44 mg/kg 
PV (peso vivo), de Xilacina al 10% y 1mg/kg de Ketamina. Previamente fueron 
rasuradas, se lavó y desinfectó la región abdominal, se realizó una incisión de 4 
cm de largo a 10 cm anterior a la ubre sobre la línea media, para ingresar a la 
cavidad abdominal. Se evaluó la respuesta de la superovulación mediante la 
revisión de los ovarios contando el número de cuerpos lúteos y su calidad. Se 
exteriorizó el útero y se lavó cada cuerno del útero utilizando una sonda de Foley 
calibre 10, que se introdujo en la base mediante una punción realizada, con un 
catéter intravenoso (14G x 5½) para recuperar el medio de lavado (Vigro Complete 
Flush Solution, AB Technology, USA); a través de otro catéter intravenoso (18G x 
1¼) insertado en la punta del cuerno uterino, se administraron 60 ml de dicho 
medio, que a su vez se colectó en un filtro concentrador. Concluida la recolección 
de embriones, el útero se regresó a la cavidad abdominal y se suturaron las 
incisiones, se les administró un antibiótico de larga acción, 1 ml por 30 – 40 kg de 
peso vivo de Penicilina de larga acción (Pencivet Super fuerte, Intervet, México). 
Horas más tarde (1-2), cuando se recuperaron de la cirugía se les proporcionó 
agua y pastura en pequeñas cantidades, el día siguiente la alimentación habitual y 
se les dejó descansar en corrales individuales. Los embriones se conservaron en 
una solución de mantenimiento (Vigro Holding Plus, AB Technology, USA), se 
evaluaron morfológicamente en un microscopio estereoscópico, para clasificarlos 
de acuerdo a su grado de desarrollo y calidad (Mejía et al; 2011, Mejía, 2012a). 
 
 
 
 
Transferencia de embriones a las receptoras 
 
 
Para la transferencia de embriones híbridos Ovis canadensis mexicana x Ovis 
aries y generar gestaciones interespecies, los embriones recolectados se 
30 
 
transfirieron individualmente a las receptoras, lo que permitió controlar que cada 
oveja gestara solo un producto. Las ovejas domésticas receptoras de embriones 
se sincronizaron paralelamente al grupo de donadoras (Mejía, 2012a). 
 
Las receptoras estaban previamente sin alimento durante 48 horas y sin agua 
durante 24 horas; para ser anestesiadas con 0.44 mg/kg de Xilacina vía 
intramuscular y 1.0 mg/kg de ketamina vía endovenosa. La transferencia se realizó 
con la ayuda de un endoscopio para exteriorizar el cuerno uterino isolateral al 
ovario que presentó el cuerpo lúteo de mejor calidad. En el cuerno seleccionado 
se hizo una pequeña punción y se introdujo el embrión previamente cargado en un 
catéter. Una vez finalizada la transferencia se suturaron las incisiones y se 
administró intramuscularmente un antibiótico de larga acción, 1 ml por 30 – 40 kg 
de peso vivo de Penicilina de larga acción (Pencivet Super fuerte, Intervet, 
México). Horas después de realizada la transferencia (1-2), cuando se 
recuperaron de la cirugía, se les proporcionó agua y pastura en pequeñas 
cantidades, al día siguiente se les proporcionó la alimentación habitual y se les 
dejó descansar en corrales individuales (Mejía et al., 2011). 
 
 
 
 
Diagnóstico de gestación 
 
 
Se realizó diagnóstico de gestación, verificando primero el no retorno al estro, 
introduciendo un macho celador cubierto con un mandil, y posteriormente con 
ultrasonografía de imagen y tiempo real, vía rectal, utilizando un transductor de 5.0 
Mhz, para el monitoreo del desarrollo placentario y verificando la presencia de las 
vesículas embrionarias, la presencia de líquido en el útero, el desarrollo de los 
placentomas indicadores de una gestación, con lo cual se confirmaron las 
gestaciones al día 50 (Mejía, 2012b). 
 
Finalmente se obtuvieron 10 gestaciones, de las cuales seis fueron para el grupo 
control y cuatro para el grupo de híbridos o de estudio. 
31 
 
 
 
 
Evaluación de los niveles plasmáticos de progesterona, VEGF y PlGF 
 
 
Para la determinación de las concentraciones séricas de Progesterona, VEGF y 
PlGF se obtuvieron muestras sanguíneas semanales, a partir del día 50 de la 
gestación, obteniendo 10 ml mediante punción de la vena yugular en 2 tubos 
vacutainer. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 2,500 rpm durante 10 
minutos para obtener el suero que fue conservado a -20° C hasta su 
procesamiento. 
La determinación de las concentraciones séricas de progesterona se realizó por 
radioinmunoensayo (RIA) en fase sólida, con una sensibilidad del 0.1 ng/ml y un 
coeficiente de variación intraensayo de 3.09% (Gómez, 2013). 
La determinación sérica de VEGF se realizó con un ensayo tipo a sándwich de 
Enzimo-inmunoensayo (ELISA), con un kit comercial siguiendo las 
recomendaciones del fabricante, con una sensibilidad de ensayo de 3.58 pg/ml y 
un coeficiente de variación intraensayo de 8.26% (Gómez, 2013). 
El límite de detección para PlGF-1, fue de 2.15 pg/ml y el coeficiente de variación 
intraensayo fue de 6.85%. 
 
 
 
Evaluación de presión arterial 
 
 
Se realizaron las tomas de presión arterial corporal utilizando un baumanómetro 
digital automático de muñeca (Microlife EMT BP 3BUI – 3) registrándose en el 
miembro izquierdo en la región proximal del carpo, arteria mediana (Mucha, 2007). 
Se calculó la presión arterial media con la fórmula: PAM = (PS – PD)/3 + PD, 
siendo presión sistólica (PS), presión diastólica (PD) (Acoltzin-Vidal et al., 2010). 
Se realizó un muestreo a 100 hembras no gestantes al azar para obtener el 
parámetro de presión arterial de las hembras del rancho. Al grupo de hembras de 
estudio se les realizaron 3 tomas previas al manejo reproductivo y después de la 
32 
 
confirmación de gestación se les evaluó 1 vez por semana a partir del día 50 de la 
gestación. 
 
 
 
 
Evaluación de proteína en orina 
 
 
Para la determinación de proteinuria,al grupo de estudio se les tomaron 2 
muestras de orina previas al manejo reproductivo y a partir del día 50 de la 
gestación se obtuvo 1 muestra por semana. Se utilizaron tiras reactivas para 
urianálisis (Mission de Laboratorios, Inc. ACCON USA), ya que son 
particularmente específicas y sensibles a albúmina en un 99% (Campuzano y 
Arbeláez 2007). 
 
 
 
 
Peso de las crías al nacimiento 
 
 
Inmediatamente después del parto se pesaron las crías, utilizando una báscula de 
tipo reloj. 
 
 
 
 
Peso de placentas y sus cotiledones 
 
 
También inmediatamente después del parto se recuperaron las placentas, las 
cuales se pesaron y se tomaron 12 cotiledones al azar, se pesaron y se midieron 
para obtener su área. 
 
 
 
 
Expresión de HIF-1α, a nivel de ARNm 
 
 
Extracción y cuantificación de ARN 
 
Se realizó la extracción y cuantificación del ARN a partir del plasma obtenido 
semanalmente utilizando TRIzol Reagent (INVITROGEN). 
33 
 
a) Para la fase de homogenización, a un tubo de 15 ml, se agregaron 900 
μl de plasma, 2,700 μl TRIzol, se homogenizó pipeteando y se dejó 
incubar 5 minutos. 
b) En la fase de separación, se agregaron 720 μl de cloroformo, se mezcló 
vigorosamente 15 segundos, se incubó durante 15 minutos y se 
centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4º C. 
c) Se retiró la fase acuosa y se colocó en un tubo de microcentrífuga para 
la siguiente fase. 
d) En la fase de precipitación, se agregaron 1,800 μl de isopropanol al 
100%, se dejó incubar 10 minutos y se centrifugó a 12,000 g por 10 
minutos a 4º C. 
e) Para lavar el ARN, se eliminó el sobrenadante, se agregó 1 ml de etanol 
al 75%, se resuspendió la muestra, se cambió de tubo a uno de 1.5 ml y 
se centrifugó a 7,500 g por 5 minutos a 4º C. 
f) Se descartó el sobrenadante, el tubo con la pastilla de ARN se puso en 
un desecador conectado a la línea de vacío por 15 minutos de para 
permitir que se secara la muestra. Se resuspendió en 20 μl de agua libre 
de RNAsas. 
Se cuantificó la muestra en un lector de absorbancia (Epoch Biotek) y se ajustó la 
concentración a 200 ng por μl. 
 
 
RT – PCR (transcriptasa inversa con reacción en cadena de la polimerasa) 
 
El ARNm fue convertido a ADNc utilizando la transcriptasa reversa M-MLV 
(Invitrogen). Lo anterior se realizó en 3 pasos: 
Primer paso, la reacción se inició con un ciclo de desnaturalización. 
En un tubo para PCR (200 μl), se agregaron y mezclaron: 
- 1 μl de Oligo (dT), 0.5 μg/μl 
 
- 1 μl de dNTP’s, 0.2 mM 
 
- 10 μl de ARNm 
34 
 
Se incubó la mezcla a 65º C durante 5 minutos, posteriormente se enfrió a 4º C. Al 
terminar, se colocó el tubo en hielo para evitar la re-naturalización. 
Segundo paso, un ciclo para que hibridara el primer se agregó: 
 
- 4 μl Buffer 5X 
 
- 2 μl DTT 0.1 M 
 
- 1 μl de H2O 
 
Se mezcló suavemente y se incubó durante 2 minutos a 37º C. 
 
Tercer paso, en el ciclo de síntesis para obtener la hebra del ADNc, se agregó: 
1 μl, M – MLV RT 200 U/μl 
La mezcla se sometió a un ciclo de 70º C durante 50 min. 
 
 
 
PCR 
 
Una vez obtenido el ADNc, se estandarizó la PCR punto final. 
 
Se realizó una curva de ciclos para observar el diagrama de saturación a fin de 
elegir a cuantos ciclos se debería correr las muestras, tanto la muestra de estudio 
como el control de carga, las cuales se corrieron para HIF1α 35 ciclos y para 18S, 
33 ciclos. 
Se utilizaron 200 ng de ADNc para realizar la PCR punto final, los primers o 
cebadores usados para amplificar el fragmento de 219 pares de bases del gen 
HIF1α fueron: 5’-[GCT TGG TGC TGA TTT GTG AA]-3’ sentido y 5’-[GAT GGG 
TTT TGG TCA GAT GG]-3’ anti-sentido, la reacción fue realizada en un volumen 
final de 20 μl, como sigue: 
En un tubo para PCR de (200 μl), se agregaron los reactivos para obtener las 
siguientes concentraciones finales: 
Buffer 1X 
dNTP’s 0.2 mM 
Taq polimerasa 2.5 unidades 
Oligonucleótido sentido 1.0 μM 
Oligonucleótido anti-sentido 1.0 μM 
MgCl2 1.0 μM 
35 
 
ADNc 200 ng 
 
H2O 11.8 μl 
 
Todas las reacciones contaron con un control negativo utilizando para ello una 
reacción sin ADNc. 
Los pasos de la PCR fueron: 
 
Desnaturalización, un ciclo de 95º C durante 5 minutos. Posteriormente para la 
amplificación se realizaron 35 ciclos de, 95º C 30 segundos (desnaturalización), 
55º C 30 segundos (alineamiento) y 72º C por 1 min (extensión). Por último, un 
ciclo de extensión de 72º C por 5 min. Se utilizó un termociclador BioRad 
(MyCycler Termal Cycler). 
Para el control de carga se amplificó in fragmento de 154 pares de bases del gen 
ARN ribosomal 18s. Los oligos iniciadores fueron: 5’- [AAA CGG CTA CCA CAT 
CCA AG]-3’ sentido y 5’-[CCT CCA ATG GAT CCTCGT TA]-3’ anti-sentido, 
reportado previamente por Mendoza-Garcés et al., 2013. Se realizó la reacción en 
un volumen final de 20 μl y se agregaron los reactivos para obtener las siguientes 
concentraciones finales: 
Buffer 1X 
dNTP’s 0.2mM 
Taq polimrasa 2.5 unidades 
Oligonucleótido sentido 0.5 μM 
Oligonucleótido anti-sentido 0.5 μM 
MgCl2 1.0 μM 
ADNc 100 ng/μl 
 
H2O 8.6 μl 
 
 
 
Geles de Agarosa 
 
Los productos de la reacción se separaron para su observación en geles de 
agarosa al 2% para lo cual se utilizó: 
Buffer de electroforesis tris-borato (TBE) 1X 
Agarosa 
36 
 
Buffer de carga GelRed 
 
1. En un matraz de Erlenmeyer se calentó mezclando perfectamente, 120 ml TBE, 
 
2.4 g de agarosa y se agregó 2.4 μl de GelRed, se mezcló perfectamente, se 
colocó en el molde para electroforesis y se ubicó el peine, dejando polimerizar la 
agarosa durante 50 minutos a temperatura ambiente. 
2. Se colocó el gel en la cámara de electroforesis, se vertió buffer de electroforesis 
(TBE 1X), hasta cubrir el gel. 
3. Se agregó 1 µl del buffer de carga por cada 5 μl de ADN y se mezcló y aplicó la 
muestra a partir del segundo pocillo. En el primero se colocó un marcador de peso 
molecular de 100 bp GeneRuler, (Thermo Scientific), se aplicaron 80 voltios 
durante 2 horas. 
4. Terminada la electroforesis, se observó el gel en un transiluminador UVP y se 
capturó y analizó la imagen utilizando un equipo (Vision Works ® LS Image 
Acquisition UVP® CA, USA). 
 
 
 
Estudio de proteínas placentarias 
 
 
De las placentas, recuperadas al parto, se tomaron 12 cotiledones al azar, de los 
cuales se obtuvieron pequeñas partes (1cm2 aproximadamente), se lavaron en 
PBS frío (137 mM NaCl, 2.7 Mm KCl, 8.1 mM Na2HPO4, KH2PO4, pH 7.4) y se 
les añadió tampón de lisis (radioimmuno precipitation assay) RIPA que está 
compuesto de 0,1% (dodecilsulfato sódico) SDS, 0.5% desoxicolato de sodio, 1% 
Nonidet P-40, 150 mM NaCl y 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, y se almacenaron a -70º C, 
hasta su evaluación. 
 
 
 
 
Extracción de proteínas placentarias y cuantificación 
 
 
El tejido placentario se homogenizó utilizando un Polytrón (Pt 2100 Kinemateca 
A.C.), se realizaron ciclos de 20 segundos, con intervalos iguales, durante 3 
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minutos, todo el proceso se llevó a cabo en hielo, para continuar con la 
homogenización posteriormente se sometió a un sonicador (Vibra Cell. Sonic 
Materials INC.), a una amplitud de 65%, manteniendo las muestras en hielo, 
posteriormente se centrifugaron a 5000 g durante 15 min a 4º C. El sobrenadante 
se recuperó y la proteína total se cuantificó por medio de espectrofotometría y por 
medio el método de Lowry, que es un método colorimétrico de valoración 
cuantitativa de proteínas, en el cual se mide la cantidad de proteína a una 
absorbancia de 750 nm y se utiliza como referencia una curva de albúmina. 
 
 
 
 
Western blot para receptores de progesterona (PR) 
 
 
Se utilizaron 80 µg de proteína total, a la cual se le adicionó la solución 
amortiguadora de Carga Laemeli 1X (63 Mm Tris-HCl, pH 6.8, 10% glicerol, 2% 
SDS, 5% β-mercapto etanol y 0.0025% azul de bromofenol) y se calentaron a 95º 
C, por 5 minutos,