Estudio-de-la-respuesta-de-quorum-sensing-en-la-cepa-Pseudomonas-aeruginosa-148-aislada-de-delfn

•

Biológicas / Saúde

Medicina Fácil

5/8/2022

¡Este material tiene más páginas!

Entonces, ¿te gustó este material?

Ayude a animar a otros estudiantes a mejorar el contenido

¿Te gustó este material? ¡Compartir! 🧡

Medicina

249.833 Materiales compartidos

Descarga la aplicación para disfrutar aún más

Lea materiales sin conexión, sin usar Internet. Además de muchas otras características!

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

TITULO:
“Estudio de la respuesta de quorum sensing en la cepa
Pseudomonas aeruginosa 148, aislada de delfín”

TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS

PRESENTA:
Estefanía Morales Ruiz

TUTOR:
Dra. Gloria Soberón Chávez
(Instituto de Investigaciones Biomédicas)

MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR:
Dra. Guadalupe Espín Ocampo
(Instituto de Biotecnología)
Dr. Luis Servín González
(Instituto de Investigaciones Biomédicas)

Ciudad Universitaria, CDMX, septiembre de 2017

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Aquí debería estar tu nombre.

A la amorosa memoria
de mi mamá, Estela,
y de mi mejor
amiga y mi tía,
Iraís.
Hermanas ambas.
Ausentes ambas.
Amadas y extrañadas.
i

Agradecimientos

Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología
#7 del Instituto de Investigaciones Biomédicas bajo la tutoría de la doctora Gloria
Soberón Chávez.

Agradezco haber sido apoyada con la beca para estudios de posgrado número
275731 otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a
través del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, UNAM.

Gracias también al del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e
Innovación Tecnológica (PAPIIT) por financiar este proyecto con la beca IN200416
y a CONACYT por su financiamiento con la beca CB-252269.

Muchas gracias al doctor Luis Servín González y a la doctora Elda Guadalupe Espín
Ocampo por su tutoría durante la realización de este proyecto como miembros del
comité tutor.

Mis agradecimientos al jurado de grado conformado por el doctor Rodolfo García
Contreras, la doctora Gloria Soberón Chávez, la doctora Rosa Laura Camarena
Mejía, la doctora Katy Juárez López y la doctora Cinthia Ernestina Núñez López,
por sus valiosas aportaciones al trabajo.

También agradezco a la Maestra en Ciencias Alejandra Abigaíl González Valdéz por
su asistencia técnica.

… y más agradecimientos.

Estimado lector que te adentras en esta tesis. Antes que sigas leyendo debes saber que
este trabajo es el punto final de los últimos cinco años de mi vida. Punto final.
Aun no lo puedo creer. Quiero compartirte que en estos cinco años aprendí que la
experiencia de hacer un doctorado implica un sinnúmero vivencias y a diversas
personas. Este trabajo está alimentado de incontables intenciones.
Por tanto, quiero darle las gracias a todas las personas que me han acompañado
en este camino. Mis más profundos agradecimientos a los que están y a los que faltan:
Doctora Gloria, muchas gracias por las dos oportunidades que me dio para hacer el
doctorado. Gracias por su apoyo y sus enseñanzas.
Dimitris y el laboratorio 226 norte del IFC. Aunque no pude terminar el doctorado
con ustedes, les agradezco mucho… A Dimitris, el haberme recibido y
confiado un proyecto; a Adrián, te agradezco haberme ayudado a crecer y a confiar en
mí. A Claus y Hoty les agradezco su cariño, apoyo y confianza. Gracias también a todos
con quienes conviví ese año y medio: Quique, Danita, Marta y por supuesto, Peterϯ.
Iri, si estás leyendo esto, si de alguna manera puedes saberlo, gracias por tu vida. Eres
mi mejor cimiento y mi mejor sueño. Te extraño tanto.
Mamá. Siempre dije que tú yo nos queríamos mucho pero que funcionábamos mejor
de lejos. No quise decir tan lejos. Hoy no estás, pero igual te abrazo.
Papá, yo creo que tú pudiste haber hecho esta tesis incluso mejor que yo. Gracias por
estarme acompañando todo este tiempo, por ser mi inspiración y mi maestro.
Greta, la vida en este monstruo de ciudad ha sido iluminada muchas veces gracias a ti.
Me has dado tu mano siempre que la necesité (y también cuando no). Gracias por tus
consejos, tus palabras de ánimo y por ser la mejor compañía. Soy tu fan.
Perpi, Aleja querida o de los reencuentros. Recuperarte, aunque en trozos ha sido
reencontrarme con una gran parte de mi vida. Gracias por los divagues y por ser mi
ancla con nuestro mundo. Gracias por ser mi casa.
Babs, querida Estela, en estos cinco hemos perdido mucho. Hemos compartido un
camino herido e incompleto. Nosotras mismas hemos quedado en pedazos. Pero ten
presente que siempre estaré ahí para ser tu pata de palo o tu garfio y
te agradezco que tú lo has sido para mí.
Abicita hermosa. Qué sería de la cotidianeidad del laboratorio sin tu presencia, sin los
torciditos con salsa valentina, los juguitos y claro, la ayuda con los experimentos (cof
cof). Eres el alma del laboratorio. Gracias Abicita.
iii

Juan Luis. Hoy digo tu nombre que en realidad no debí callar jamás. Gracias a ti por
el sueño hecho realidad.
Nojinezin, senka nimizŧasohkamacililia itec moŧasohŧalis. Que nunca llegue el último
trago.
Gabo. Que el concierto, que el libro, que el huacal, que la chela, que la pintura. Gracias
por traer siempre algo nuevo a mi vida. Gracias por ser la oreja y la mano amiga.
A mis compañeros del laboratorio Gabriel, Uriel y Enrique; gracias por compartir el
gusto por la biología molecular de la pseudomona. Gracias también por las discusiones,
el apoyo y por hacer ameno el trabajo en el laboratorio.
A Martín, Miguel y Selene. Gracias por ser además de mis compañeros ñoños del lab,
mis amigos. Todas las experiencias que compartimos hacen que extrañe el lab más de
lo que debería. Los quiero.
A los vecinos, Mel, Silvana y Omar gracias por las aventuras, los mojitos y los festejos
de cumpleaños.
A la Unidad de Bioprocesos, Marta docsi, Ram Gamboa y Ram Chaka, Giroshi, Sara,
Darks, Monchis; gracias por dejarme ser una de ustedes. Fueron a veces mi refugio y
otras tantas, mi inspiración.
Querida Nidia ponquecito. Gracias por tu amistad incondicional, por rescatarme del
laboratorio y por quererme tanto.
A mis rumis, Lau y Ginni, les agradezco su infinita paciencia y la amistad que me
brindaron. Gracias a ustedes, nuestro depa fue para mí, un hogar.
CESDER. Gracias a ti por los nuevos ojos. Por haberme dejado entrar en la vida de
muchas maravillosas personas. Nataxolotl, Beto, Itzel, Brenda, Eutiquia, David, Gaby,
Miriam, Tavo, Toño, Julio… ustedes son mi ejemplo y mi estandarte.
A la CDTM. Porque así quiero ir por la vida, bailando. Porque bailando este doctorado
se fue como agua, bailadora por supuesto. Gracias a todos por el cariño, el
compañerismo, la lealtad y la paciencia. Lupita y Ale gracias por haberme dado la
oportunidad de compartir el escenario con ustedes y poder equilibrar la vida de
ñoñeo con esta bella actividad.
A mis compinches queridos Lau, Dani, Pame Fashion y Rebelde, Angel, Castrejón, Cris,
Javi, Chivis… gracias muchachos y… ¡que viva san Rafaelito!
Virito. No sé cómo te volviste, en tan poco tiempo, unaamiga tan entrañable. Me
siento afortunada de haberte conocido. Gracias por eso.
Al nahuatetetetel. Senka niyolpaki ipampa onikmat inin mahuistik tomaseualŧahtol.
Nohuanpoxzizinhuan nahuamomactianimeh nisempaki nanmecixmati: Panchito,
iv

Zacatzi, Renato, Victor, Fer, Ceci, Adolfo, Miguel, Leo, Gaby, Enrique, profe Fer... Inin
ohzinŧi tohui ika pakilistli ipampa tosepan tinehnemiskeh.
Y gracias, gracias, gracias a todas las personas que de alguna manera se han
involucrado conmigo. Créanme que todos forman parte de mi vida y tienen un lugar
en mi corazón.
Gracias
Victoria Grosso, Rodolfo García, Miguelandii y Lili, Ofelicus, mis padrinos Nieves y
Rico, Davicho, Melisa, Ricolín, Angie, Valentina, Tíos Mario y Sara, Tíos Raúl y tía Lucy,
Raú y Dani, Meche, Ray, Fer, Xadi…
Y así terminan cinco años. Cruzar la meta, cerrar con broche de oro… por fin es el final
tan anhelado. Creo que ya me toca contar mi vida por décadas.

“A las
Honorables
Autoridades
Marítimas
Celestes
Y terrestres:
No
Se culpe
A nadie
De
Mi
Vida.”

Efraín Huerta

Y gracias infinitas a la UNAM.

1. Contenido
Agradecimientos .............................................................................................. i
1. Contenido ................................................................................................. v
Abreviaciones ................................................................................................ xii
Resumen. ...................................................................................................... 13
Abstract. ........................................................................................................ 14
2. Introducción. .......................................................................................... 15
2.1. El descubrimiento del sistema de quorum sensing. ............................. 15
2.2. El quorum sensing de V. fischeri y el arquetipo de un sistema de
comunicación. ............................................................................................... 16
Figura 2.1 Representación del operón lux de V. fischeri (A) y de su funcionamiento (B).
........................................................................................................................................... 17
2.2.1. La sintasa LuxI. ................................................................................. 18
Tabla 2.1 Ejemplos de algunos de los homólogos de LuxR y LuxI. ................................. 18
Figura 2.2 Esquema de la síntesis de las acil-homoserina lactonas por LuxI y sus
homólogos. ........................................................................................................................ 19
2.2.2. El factor transcripcional LuxR. ......................................................... 19
Tabla 2.2 Ejemplos de SQS en diferentes bacterias, el autoinductor que producen y su
blanco de regulación. ....................................................................................................... 20
2.3. Otros SQS en bacterias Gram negativas. .............................................. 21
2.3.1. El quorum sensing de Xanthomonas campestris. ............................. 21
Figura 2.3 Esquema representativo del sistema de quorum sensing en X. campestris
pv. campestris. La molécula autoinductora DSF es detectada por la cinasa de histidina
RpfC tras lo cual se desencadena una cascada de fosforrelevo que culmina en la
activación del factor transcripcional Clp a través de RpfG. Clp a su vez regula de
manera positiva la expresión de genes asociados al QS: flagelo, síntesis de xantano
vi

(EPS) y también de rpfF lo que conlleva al aumento en la concentración de DSF.
Imagen modificada de He y Zhang, 2008. ...................................................................... 23
2.4. Sistemas de quorum sensing en bacterias Gram positivas. .................. 23
2.4.1. SQS de Bacillus subtilis. ................................................................... 24
Figura 2.4 SQS de B. subtillis que controla la esporulación y la competencia a través
del Factor de Competencia y Esporulación (CSF) y la feromona ComX,
respectivamente. ComX activa al sistema de dos componentes ComP/ComA cuya
fosforilación culmina en la acumulacion del regulador central de la competencia,
ComK. Por su parte, el CSF impide la defosforilación de ComA al inhibir la actividad de
la fosfatasa RapC, impidiendo la degradación de ComK. Opp: permeasa
transmembranal. Figura modificada de Hamoen, Venema y Kuipers, 2003. .............. 24
2.5. Los SQS de Pseudomonas aeruginosa. ................................................ 25
Figura 2.5 Representación de los tres SQS de P. aeruginosa: Las, Rhl y Pqs. ............... 26
2.5.1. El sistema Las. .................................................................................. 27
Figura 2.6 Representación de la expresión de los genes del sistema Las. Vfr activa la
transcripción de lasR el cual a su vez activa la transcripción de los genes rsaL y lasI.
LasI sintetiza el autoinductor 3o-C12-AHL mientras que RsaL reprime la expresión de
lasI y regula la producción del autoinductor. ................................................................. 28
Tabla 2.3 Comparación de la secuencia nucleotídica de distintas cajas las. Los
nucleótidos conservados (CT y AG) se señalan con negritas. ......................................... 29
2.5.2. El sistema Rhl. .................................................................................. 30
Figura 2.7 Esquema del operón rhlAB y los genes rhlR y rhlI. Los cuatro promotores
de rhlR se indican con los números del 1 al 4. LasR/3O-C12-AHL activa la
transcripción de rhlR a partir de sus promotores 1 y 4 y asimismo activa la
transcripción de rhlI. El promotor 2 de rhlR se expresa de manera constitutiva. Vfr
activa la transcripción de rhlR actuando sobre los promotores 1, 2 y 3 mientras que
sobre el promotor 4 ejerce un efecto de represión. .......................................................... 31
2.5.3. El sistema Pqs. .................................................................................. 32
vii

Figura 2.8 Esquema representativo de la regulación y expresión de los miembros del
sistema Pqs. El autoinductor PQS se sintetiza por el trabajo de las enzimas PqsABCD
codificadas en el operón pqsABCDE, y por la enzima PqsH. El factor trasncripcional
PqsR unido a PQS activa la transcripción de los operones pqsABCDE pqsABCDE y
phnAB. Se propone que PqsE estabiliza a la proteína RhlR (flecha punteada). LasR/3O-
C12-AHL activa la transcripción tanto de pqsR como de pqsH mientras que RhlR C4-
AHL impide la expresión de pqsR y del operón pqsABCDE. ........................................... 33
2.6. El quorum quenching. ......................................................................... 33
2.7. La regulación de los SQS de P. aeruginosa. .......................................... 36
2.7.1. El regulador Vfr. ............................................................................... 38
Figura 2.9 Representación de la regulación que ejerce Vfr sobre la transcripción de
rhlR. Vfr se une a cada uno de los cuatro promotores de rhlR en su caja consenso
(VBS); sobre los promotores 1, 2 y 3 actúa como activador mientras que en el promotor
4, actúa como represor de la transcripción. .................................................................... 40
3. Antecedentes. .......................................................................................... 40
Figura 3.1 Esquema representativo de la deleción de 20 kpb del genoma de la cepa P.
aeruginosa 148. En A se comparan las cepas PAO1 y 148, indicándose los genes que
perdió ésta última. En B se muestra la secuencia nucleotídica de la región río arriba del
gen lasI en la cepa 148. Se señalan subrayadosen rojo, los 16 nucleótidos que restan de
la región promotora de lasI. Con flechas rojas se indica la dirección del gen PA1415
(naranja) y del gen lasI (verde). ...................................................................................... 42
4. Justificación. ........................................................................................... 43
5. Hipótesis. ................................................................................................ 44
6. Objetivos. ................................................................................................ 44
6.1. General. ............................................................................................... 44
6.2. Particulares. ........................................................................................ 44
7. Materiales y métodos. ............................................................................. 44
viii

7.1. Material biológico y medios de cultivo. ................................................ 44
7.2. Cuantificación de factores de virulencia. ............................................. 45
7.2.1. Medición de la producción de elastasa. ............................................. 45
7.2.2. Cuantificación de piocianina. ............................................................ 45
7.2.3. Cuantificación de ramnolípidos. ....................................................... 46
7.2.3.1. Cromatografía en capa fina (TLC). .................................................... 46
7.2.3.2. Cuantificación de ramnolípidos por el método de orcinol. ................ 47
7.3. Extracción y determinación semi cuantitativa de C4-AHL. ................... 47
7.4. Técnicas de manipulación de ADN. ...................................................... 48
7.4.1. Generación de mutantes. .................................................................. 48
7.4.1.1. Mutante 148ΔrhlR. ............................................................................ 49
7.4.1.2. Mutante 148ΔrhlI. ............................................................................. 49
7.4.2. Construcción de plásmidos. .............................................................. 49
7.4.3. Construcción de fusiones transcripcionales. ..................................... 50
7.4.4. Transcripción reversa (RT-PCR). ...................................................... 51
7.5. Actividad enzimática de β-galactosidasa. ............................................. 51
7.5.1. Fusiones en plásmido........................................................................ 51
7.5.2. Fusiones integradas en cromosoma. ................................................. 52
7.6. Unión de RhlR a cajas las. ................................................................... 52
7.7. Western blot. ....................................................................................... 53
7.8. Análisis bioinformáticos. ..................................................................... 54
ix

8. Resultados. ............................................................................................. 54
8.1. El fenotipo deficiente de producción de elastasa en la cepa 148, se debe
únicamente a la ausencia del sistema Las. ..................................................... 54
Figura 8.1 Medición de la producción de elastasa (A) y de la actividad de la fusión
lasB-lacZ (B) en la cepa 148 complementada con el plásmido pECP64. U.M.: unidades
miller ................................................................................................................................. 55
8.2. Análisis de la expresión de rhlR y rhlI. ................................................. 55
Figura 8.2 Determinación por western blot (A) de la concentración de RhlR en las
cepas 148 y PAO1. Se presenta la membrana (B) que se usó para el experimento, teñida
con Rojo Ponceau como control de carga de la misma concentración de proteína. ...... 56
Figura 8.3 Medición de la actividad de una fusión transcripcional rhlI-lacZ en el
plásmido pTdKS3 en la cepa 148 (A) y la cepa PAO1 (B). Se usó el plásmido pLP170
como control. U.M.: Unidades Miller. ............................................................................. 57
8.3. Determinación de la dependencia de la producción de piocianina y
ramnolípidos del sistema Rhl. ....................................................................... 57
Figura 8.4 Análisis cualitativo por cromatografía en capa fina (TLC) para ver la
producción de ramnolípidos en la cepa 148 y sus mutantes 148ΔrhlI y 148ΔrhlR. Se
usaron los estándares sintéticos Mono: mono-ramnolípido y Di: di-ramnolípido.
También se usaron las cepas PAO1 y PAO1ΔrhlA con fines comparativos. ................... 58
Figura 8.5 Medición de la producción de piocianina (A) y ramnolípidos (B) en la cepa
148 y sus mutantes derivadas 148ΔrhlI y 148ΔrhlR, así como las mutantes
complementadas. La mutante PAO1ΔrhlA se usó como control negativo de la
producción de ramnolípidos. ........................................................................................... 59
Figura 8.6 Medición en E. coli DH5α de la actividad de una fusión rhlA-lacZ codificada
en el plásmido pECP61.5 que además expresa a RhlR. La fusión se activa en presencia
del autoinductor que se extrajo de las cepas: 148, 148ΔrhlI, 148ΔrhlR y
148ΔrhlR+pJMG1-rhlR. Como control positivo se usó C4-AHL sintético y como control
negativo, metanol. Unidades Miller. ............................................................................... 60
Tabla 8.1 Determinación del pegado de LasR o RhlR a distintas cajas las, expresado en
porcentaje (%) de disminución de la expresión de la fusión lacZ. ND: no detectado. .... 61
x

8.4. Análisis de la transcripción entre rhlR y rhlI. ...................................... 61
Figura 8.7 Experimento de transcripción reversa en las cepas 148 y PAO1 que
demuestran que rhlR y rhlI forman una unidad transcripcional. El panel A
corresponde a la amplificación de la región intergénica entre rhlR-rhlI (179 pb), el
panel B a la región intergénica rhlA-rhlB (64 pb) y el panel C a rpoD(650 pb). Los
carriles 1 y 2 son controles de amplificación sobre ADN cromosomal (cepa silvestre y
∆rhlR, respectivamente). Los carriles 3 y 4 son la amplificación sobre cADN de la cepa
silvestre y la mutante ∆rhlR. El carril 6 es el control negativo sin transcriptasa
reversa. Pb: pares de bases. ............................................................................................. 62
8.5. La cepa 148 es mutante en vfr. ............................................................. 62
Figura 8.8 Amplificación por PCR (A) de vfr en las cepas PAO1 (carril 1) y 148 (carriles
2-4) donde se observa el mayor tamaño del amplicón obtenido de la cepa 148. En (B) se
hace una representación esquemática de la interrupción de vfr por la ISAzo1 en la cepa
148. Las flechas azules señalan la ubicación de los oligonucleótidos utilizados para
amplificar el gen vfr. También se señalan los tamaños predichos del locus de vfr en las
cepas PAO1 y 148. Pb: pares de bases.............................................................................. 63
Figura 8.9 Cuantificación de piocianina y ramnolípidos en la cepa 148 transformada
con el plásmido pUV que expresa a Vfr. Como control se usó el vector vacío, pCUP20.64
8.6. Evaluación del efecto de Vfr sobre la expresión de rhlR. ...................... 65
Figura 8.10 Medición de la fusión transcripcional insertada en el cromosoma de las
cepas 148 (A) y PAO1 (B) transformadas con el plásmido pUV que expresa a Vfr. La
fusión lacZ sin promotor y el vector vacío pUCP20 se usaron como controles. Unidades
Miller. ............................................................................................................................... 66
Figura 8.11 Medición de la actividad de la fusión del promotor4 de rhlR-lacZ en su
versión silvestre y mutante – donde se evita la unión de Vfr. La fusión lacZ sin
promotor y el vector vacío pUCP20 se usaron como controles. ..................................... 67
8.7. La actividad de LasR es epistática sobre la de Vfr en la transcripción de
rhlR…. ........................................................................................................... 67
Figura 8.12 Medición de la actividad de la fusión rhlR-lacZ en presencia de LasR, Vfr y
ambos. Se usaron como controles la fusión lacZ sin promotor y el plásmido vacío
pUCP20. ............................................................................................................................ 68
xi

9. Discusión. ............................................................................................... 68
Figura 9.1 Representación del funcionamiento del SQS Rhl en las cepas de P.
aeruginosa PAO1 (izquierda) y 148 (derecha). En PAO1, LasR activa la transcripción
de rhlR y rhlI mientras que Vfr activa la transcripción de lasR y sobre rhlR impide la
transcripción a partir del promotor 4 (P4). En la cepa 148, dado que Vfr está ausente,
rhlR se puede transcribir desde su P4 y, a pesar de la ausencia de LasR, rhlI se
transcribe como un operón a través de rhlR. .................................................................. 74
10. Conclusiones. ....................................................................................... 75
11. Anexos ................................................................................................. 76
11.1. Tablas. ................................................................................................. 76
Tabla 11.1 Genes que faltan en el genoma de P. aeruginosa 148, en comparación con el
genoma de P. aeruginosa PAO1. ...................................................................................... 76
Tabla 11.2 Cepas utilizadas .............................................................................................. 77
Tabla 11.3 Plásmidos utilizados. ...................................................................................... 77
Tabla 11.4 Oligonucleótidos utilizados............................................................................. 79
11.2. Artículo de investigación. ..................................................................... 80
12. Bibliografía .......................................................................................... 81

xii

Abreviaciones
SQS: sistema de quorum sensing.
AHL: acil-homoserina lactona.
SAM: S-adenosil-L-metionina.
Acil-ACP: proteína acarreadora de grupos acilo.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
HTH: dominio hélice-vuelta-hélice de unión a ADN.
Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris.
EPS: polisacárido extracelular.
TCS: sistema de dos componentes.
HD-GYP: dominio de fosfodiesterasa.
DSF: Diffusible Signal Factor, en inglés.
di-GMP: ácido di-(3’ 5’) guanosin-monofosfato, ó 3',5'-diguanilato cíclico.
cGMP: guanosín monofosfato cíclico.
3O-C12-AHL: 3-oxo-dodecanoil-homoserina lactona.
C4-AHL: butanoil-homoserina lactona.
AQ: alquil-quinolona.
PQS: 2-heptil-3-hidroxi-4(1H)-quinolona.
HHQ: precursor 2-heptil-4-quinolona.
C: citosina.
A: adenina.
G: guanina.
T: timina.
ChIP-chip:
IQS: 2-(2-hidroxifenil)-tiazol-4-carbaldehido.
QQ: quorum quenching o interferencia del quorum sensing.
5-FU: 5-fluorouracilo.
VBS: Vfr binding site, en inglés.
PCA: ácido fenazin-carboxílico.

Resumen.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental ubicua capaz de causar
infecciones en plantas, animales e insectos. La gran variedad de ambientes y de
condiciones a los que P. aeruginosa se adapta implica que posee una gran
versatilidad metabólica y la capacidad de regular de manera estricta la producción
de elementos que le permiten colonizar diversos nichos ecológicos. Como patógeno
oportunista humano, P. aeruginosa produce un vasto arsenal de factores de
virulencia de los cuales, la mayoría se producen bajo el control de un complejo
sistema de quorum sensing. En P. aeruginosa, el sistema de quorum sensing es
complejo pues se conforma a su vez de tres sistemas estructurados de manera
jerárquica: LasR/LasI, RhlR/RhlI y Pqs. Los sistemas Las y Rhl se conforman de
las sintasas de homoserina lactona LasI y RhlI que sintetizan 3-oxo-dodecanoil-
homoserina lactona y butanoil-homoserina lactona respectivamente, mientras que
LasR y RhlR son factores transcripcionales que tras unirse a su molécula señal,
activan la transcripción de genes blanco. El sistema Pqs se conforma del factor
transcripcional PqsR y el autoinductor PQS (sintetizado por las enzimas
PqsABCDH) cuya estructura es una quinolona. Dado que LasR controla la
expresión de los genes rhlR, rhlI pqsR y pqsH, se considera al sistema Las en la
cima de la jerarquía. La cepa de P. aeruginosa 148, que fue aislada del estómago de
un delfín, es una cepa atípica que carece del sistema Las y, aun así, es virulenta en
un modelo murino y produce piocianina y ramnolípidos, factores de virulencia
dependientes del sistema Rhl. El propósito de este trabajo fue el de profundizar el
estudio de la cepa 148 de P. aeruginosa para determinar cómo se activa la
transcripción de los genes rhlR y rhlI a pesar de carecer del activador
transcripcional LasR, y cómo se regula la producción de los factores de virulencia
piocianina y ramnolípidos.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, quorum-sensing, virulencia.

Abstract.
Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous and versatile bacterium capable of
producing acute and chronic infections in humans due to the production of several
extracellular virulence factors. The complex regulatory network quorum sensing
response regulates the expression of several of those virulence determinants. The P.
aeruginosa QS is comprised by the LasR-LasI and RhlR-RhlI systems. LasI and
RhlI are acyl-homoserine lactone synthases producing 3-oxo-dodecanoyl
homoserine lactone (3O-C12) and butanoyl homoserine lactone (C4) respectively;
while LasR and RhlR are transcriptional regulators that after binding to their
cognate signals activate target gene expression. Since LasR controls the expression
of both rhlR and rhlI, the Las system is considered to be at the top of the QS
hierarchy. Strain 148 of P. aeruginosa, isolated from a dolphin, lacks the Las
system but is still virulent in a mice-based model and does produce RhlR-
dependent virulence factors such as pyocyanin and rhamnolipids. The aim of the
present work is to describe how the expression of the Rhl system is activated
independently of LasR and how the production of the RhlR-dependent virulence
factors is regulated in strain 148 of P. aeruginosa.
Keywords: quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, virulence.

2. Introducción.
La presente tesis doctoral versa sobre un sistema de comunicación bacteriana
denominado quorum sensing (SQS) o sistema de detección de quórum, y en
específico, sobre este sistema de comunicación en la bacteria Pseudomonas
aeruginosa. La investigación que se realizó y que se presenta en este trabajo es de
gran importancia para entender los procesos fisiológicos y metabólicos de P.
aeruginosa relacionados con su virulencia. De ahí, que esta investigación tiene el
propósito de contribuir con conocimiento que permita llegar a reducir o atenuar los
efectos adversos que causa este patógeno en el ser humano.

2.1. El descubrimiento del sistema de quorum sensing.
El sistema de quorum sensing se describió - sin enunciarse como tal - por
primera vez en las bacterias marinas Vibrio fischeri y Vibrio harveyi (Eberhard,
1972). Ambas bacterias se sabían que eran simbiontes de los órganos luminosos de
algunos peces piña (Monocentris japonica y Cleidopus gloriamaris) y en ambas
bacterias se estudiaba laproducción de la enzima luciferasa, una enzima que
cataliza una reacción bioquímica que emite luz, como parte del estudio de la
ecología de bacterias luminiscentes. Diversos estudios demostraban que la síntesis
de esta enzima era inducible por glucosa y algún otro compuesto producido por las
mismas bacterias, de naturaleza desconocida, que se denominó autoinductor.
(Nealson, Eberhard y Hastings, 1972; Greenberg, Hastings y Ulitzur, 1979)
Además, se descubrió que la enzima se producía solo cuando el crecimiento
bacteriano alcanzaba cierta densidad celular. Así, la luciferasa se encontraba
cuando la bacteria crecía en simbiosis con los peces (o en altas densidades celulares
alcanzadas en medios ricos en el laboratorio) pero no se producía en vida libre o
medios mínimos cuando no había altas densidades celulares, y que el autoinductor
producido por una bacteria no provocaba la producción de luciferasa de otra.
Posteriormente se estudió la composición química del llamado autoinductor y se
encontró que era una homoserina lactona (Eberhard et al., 1981). Ya para el año
1983, se publicaron los primeros reportes de que la inducción de la producción de
16

luciferasa funcionaba a nivel transcripcional, sobre los genes que codifican las
subunidades de la enzima (Engebrecht, Nealson y Silverman, 1983). Entre los años
1984 y 1989, se definieron las unidades transcripcionales necesarias para la
regulación y producción de la luciferasa (Engebrecht y Silverman, 1984; Devine,
Shadel y Baldwin, 1989).
Desde entonces se ha estudiado este tipo de comunicación bacteriana que se
agrupa bajo el término de quorum sensing (Fuqua, Winans y Greenberg, 1994) y
se ha encontrado en más de 30 especies bacterianas. En general, la detección de
quórum se relaciona con comportamientos sociales, cooperativos o multicelulares,
como son la producción de ciertos metabolitos, la movilidad tipo enjambre o la
producción de factores de virulencia (Popat et al., 2015). En los siguientes
apartados, se presentará la estructura canónica de los sistemas de quorum sensing
con especial énfasis en el modelo de trabajo que atañe a esta tesis: P. aeruginosa.

2.2. El quorum sensing de V. fischeri y el arquetipo de
un sistema de comunicación.
Como se mencionó anteriormente, V. fischeri produce una enzima
luminiscente llamada luciferasa, cuya síntesis está regulada por un sistema de
detección de quórum (SQS) (Devine, Shadel y Baldwin, 1989). Los genes que
codifican para la producción de esta enzima (luxA y luxB) forman parte del operón
luxICDABE. De manera divergente a esta unidad transcripcional, se encuentra
codificado el gen luxR (Figura 2.1-A). Las proteínas LuxI y LuxR (productos de
los genes luxI y luxR), conforman el SQS arquetípico de las bacterias Gram
negativas (Engebrecht y Silverman, 1984).
El funcionamiento de este SQS se explica a continuación (Figura 2.1-B): a bajas
densidades celulares, el operón luxICDABE se transcribe de manera basal. La
proteína LuxI sintetiza cantidades bajas del autoinductor N-(3-oxohexanoil)-
homoserina lactona, el cual se difunde a través de la membrana celular hacia el
espacio extracelular. Conforme la densidad celular aumenta, aumenta también la
concentración del autoinductor que, dentro de las células, interacciona con la
17

proteína LuxR (que es un factor transcripcional). LuxR unido al autoinductor se
une a la región promotora del operón luxICDABE y activa su transcripción,
provocando un aumento de la producción tanto del inductor como de la luciferasa
en un circuito de autorregulación positiva. Asimismo, LuxR unido al autoinductor
se une a la región promotora del propio gen luxR inhibiendo su transcripción,
compensando de cierta forma el circuito de autorregulación positiva (Greenberg,
Hastings y Ulitzur, 1979; Waters y Bassler, 2005).

Figura 2.1 Representación del operón lux de V. fischeri (A) y de su funcionamiento (B).
Ya que éste fue el primer SQS que se describió, sentó las bases para el estudio de
otros sistemas detectores de quórum y permitió definir a los participantes de este
sistema de comunicación: una enzima que sintetiza una molécula señal y una
proteína que detecta esa molécula señal y responde a ella. Si bien estos
participantes constituyen la unidad operacional mínima necesaria para llevar a
cabo este tipo de comunicación bacteriana, los trabajos consecutivos nos han
enseñado que existen SQS que forman complejas redes de regulación bacterianas.
18

2.2.1. La sintasa LuxI.
De manera general, los SQS similares al descrito en V. fischeri se conocen
como del tipo LuxR/I y se entiende que funcionan de manera similar (Figura 2.1).
Se han encontrado hasta la fecha homólogos de luxI en más de 150 especies de alfa,
beta y gamma proteobacterias; algunos ejemplos se enlistan en la Tabla 2.1
(Churchill y Chen, 2008).
Tabla 2.1 Ejemplos de algunos de los homólogos de LuxR y LuxI.
Bacteria Homólogo de LuxR Homólogo de LuxI
α-proteobacterias
Agrobacterium tumefaciens TraR TraI
Rhodobacter sphaeroides CerR CerI
β-proteobacterias
Burkhordelia cepacia CepR CepI
Chromobacterium violaceum CviR CviI
γ-proteobacterias
Escherichia coli SdiA -
Yersinia enterocolitica YenR YenI
Pantoea stewartii EsaR EsaI
Pseudomonas aeruginosa
LasR LasI
RhlR RhlI
Pseudomonas aeurofaciens PhzR PhzI
Vibrio anguillarum VanR VanI

La enzima LuxI cataliza la síntesis de la molécula autoinductora que en estos
sistemas es una acil-homoserina lactona (AHL) que consiste en un anillo de
homoserina lactona unido a una cadena acilo de longitud variable -desde 4 a 18
carbonos- según el organismo que la sintetice. Otras variaciones de las AHL
incluyen la saturación y el estado de oxidación de la cadena acilo (Tabla 2.2).
LuxI sintetiza las AHL a partir de S-adenosil-L-metionina (SAM) y cadenas de
ácidos grasos acarreados por la proteína transportadora de grupos acilos (acil-ACP)
(Figura 2.2). Si bien la mayoría de AHL es sintetizada por enzimas tipo LuxI, se
19

han encontrado otras dos enzimas, LuxM y HdtS que pueden sintetizar AHL y que
además de usar acil-ACP, usan acil-CoA (Schaefer et al., 1996).
Figura 2.2 Esquema de la síntesis de las acil-homoserina lactonas por LuxI y sus homólogos.
LuxI se compone de un dominio único de aproximadamente 205 aminoácidos de
los cuales, 8 residuos del extremo amino se conservan siempre pues son cruciales
para la actividad enzimática, en particular, para la unión del sustrato SAM. El
extremo carboxilo, más variable en secuencia, está involucrado en reconocer el
sustrato acil-ACP (Hanzelka et al., 1997).
2.2.2. El factor transcripcional LuxR.
La proteína citoplasmática LuxR es un factor transcripcional que, tras unirse
a una AHL, se agrupa en dímeros y se une a secuencias blanco de ADN. LuxR se
compone de alrededor de 250 aminoácidos y posee dos dominios funcionales: en el
extremo amino se une la AHL mientras que en el extremo carboxilo hay un
dominio de unión a ADN (hélice-vuelta-hélice, HTH) (Churchill y Chen, 2008).
LuxR se une a secuencias blanco de ADN que consisten en fragmentos de
aproximadamente 20 nucleótidos llamadas cajas lux. Estas cajas lux por lo
general son secuencias palindrómicas imperfectas localizadas río arriba del sitio de
inicio de la transcripción del gen blanco de regulación. Por ejemplo, la secuencia de
la caja lux río arriba de luxI es: 5’-ACCTGTAGGATCGTACAGGT-3’. La interacción
del dominio HTH con la caja depende de interacciones hidrofóbicas y puentes de
sal (Fuqua, Winans y Greenberg, 1994).
20

Tabla 2.2 Ejemplos de SQS en diferentes bacterias, el autoinductor que producen y su blanco de
regulación.
Bacteria SQS
Autoinductor
(AHL)
Blanco de
regulación
Agrobacterium tumefaciens TraR/TraI
N-3-(oxo-octanoil)-
L- AHL (AAI)
Conjugación, genes
tra, traR
Rhodobacter sphaeroides CerR/CerI
7,8-cis-N-(tetradecanoil)-AHL
Agregación
bacteriana
Burkhordelia cepacia CepR/CepI N-octanoil-AHL
Producción de
proteasas y
sideróforos
Chromobacterium violaceum CviR/CviI N-hexanoil-AHL
Producción de
violaceína, HCN,
exoproteasas
Escherichia coli SdiA/? -
División celular
(ftsQAZ)
Yersinia enterocolitica YenR/YenI
N-hexanoil-AHL, N-
3-(oxohexanoil)-
AHL
Movilidad
Pantoea stewartii EsaR/EsaI
N-3-(oxohexanoil)-
AHL
Síntesis de
exopolisacáridos,
(wts)
Pseudomonas aeruginosa
LasR/LasI
N-3-(oxo-
dodecanoil)-L-AHL
Producción de
factores de
virulencia (lasB,
aprA, toxA, rhlR)
RhlR N-(butanoil)-L-AHL
Producción de
ramnolípidos
(rhlAB)
Pseudomonas aeurofaciens PhzR/PhzI N-hexanoil-AHL
Biosíntesis de
fenazinas (phz)
Vibrio anguillarum VanR/ VanI
N-3-(oxo-decanoil)-
L-AHL
Agregación y
movilidad

Los homólogos de LuxR se unen a cajas similares a las cajas lux de entre 18 y 22
nucleótidos. Comúnmente, estas cajas tipo lux se localizan río arriba de la caja -35
de la región promotora del gen diana, sin embargo, existen genes cuya caja tipo lux
está localizada en otra posición o bien, que poseen más de una caja tipo lux. Y si
bien aún no se entiende por completo la razón, está claro que la posición de la caja
lux modifica la actividad del activador transcripcional de LuxR o sus homólogos
(Egland y Greenberg, 1999; Whiteley y Greenberg, 2001; Antunes et al., 2008).
En el mismo V. fischeri ahora se sabe que convergen por lo menos tres SQS
diferentes, no solo en el tipo de regulador transcripcional sino en el autoinductor
con el que funcionan. Este fenómeno se repite en diferentes géneros bacterianos
donde se han estudiado los SQS: hay diferentes señales, diferentes proteínas
reguladoras diferentes blancos de regulación (Tabla 2.2). (Fuqua, Winans y
Greenberg, 1996; Miller y Bassler, 2001).

2.3. Otros SQS en bacterias Gram negativas.
Fuera del SQS canónico de V. fischeri, se han encontrado, como se mencionó
antes, sistemas de comunicación que difieren en la estructura química de la
molécula señal y la manera de detectarla.

2.3.1. El quorum sensing de Xanthomonas
campestris.
X. campestris pv. campestris (Xcc) es una de las 141 patovariedades del
género Xanthomonas, bacterias Gram negativas que infectan a nivel mundial a
numerosas verduras como el brócoli, la coliflor, el tomate, el rábano y la col. Xcc es
causante en particular, de la enfermedad “podredumbre negra”: cuando coloniza el
sistema vascular de las plantas, produce un polisacárido extracelular (EPS) llamado
xantano que obstruye la xilema (sistema de conducción para el transporte de
líquidos) y produce necrosis y marchitez. Este mismo xantano es usado en la
industria farmacéutica, cosmética y de alimentos como espesante y emulsificante.
22

La síntesis y secreción de xantano (y algunas enzimas extracelulares) están
regulados por un sofisticado SQS (He y Zhang, 2008) .
En Xcc, el SQS (Figura 2.3) está codificado en el operón rpfABCDEFG. RpfC/G
forman parte de un sistema de transducción de señales de dos componentes (TCS)
donde RpfC es una cinasa de histidina, híbrida y transmembranal, y RpfG es un
regulador de respuesta con un dominio HD-GYP (fosfodiesterasa que degrada el
segundo mensajero c-di-GMP). Este TCS es el responsable de detectar tanto a la
molécula autoinductora del sistema como ciertas señales ambientales (He et al.,
2006).
La molécula autoinductora se denomina DSF (Diffusible Signal Factor, en inglés)
cuya estructura corresponde al ácido graso insaturado cis-11-metil-dodecenoico. La
DSF es sintetizada por dos proteínas: RpfB y RpfF, a diferencia de los sistemas
tipos LuxR/I donde existe una sola sintasa del autoinductor. RpfF es similar a las
enoil-CoA hidratasas y posee actividad de tioesterasa y desaturasa. Por su parte,
RpfB, que se predice es una ligasa de ácidos grasos, acarrea y activa ácidos grasos
saturados para ser usados en la síntesis de fosfolípidos -contrarrestando la
actividad tioesterasa de RpfF (Barber et al., 1997).
Una vez que la cinasa RpfC detecta la DSF, activa al regulador de respuesta RpfG
que a su vez degrada el di-GMP cíclico a cGMP. Este último activa a la proteína Clp
que es un factor transcripcional de la familia Crp-FNR que afecta la expresión de
diversos genes (Ryan y Dow, 2011).
Una característica interesante de este SQS es que la DSF regula su propia
producción a nivel pos-traduccional: a bajas densidades celulares, la concentración
extracelular de la DSF es baja y no activa al TCS RpfC/G. La cinasa RpfC, que no
está fosforilada adopta una conformación estructural que le permite unirse a RpfF,
evitando que ésta interactúe con RpfB, limitando así, la síntesis de la DSF. Cuando
aumenta la densidad celular, se acumula la DSF que es ahora detectada por RpfC,
la cual se activa (autofosforila) liberándola de la interacción con RpfF y dejando a
su vez a RpfF libre para sintetizar más DSF (He y Zhang, 2008; Ryan et al., 2015).
23

Figura 2.3 Esquema representativo del sistema de quorum sensing en X. campestris pv.
campestris. La molécula autoinductora DSF es detectada por la cinasa de histidina RpfC tras lo cual
se desencadena una cascada de fosforrelevo que culmina en la activación del factor transcripcional
Clp a través de RpfG. Clp a su vez regula de manera positiva la expresión de genes asociados al QS:
flagelo, síntesis de xantano (EPS) y también de rpfF lo que conlleva al aumento en la concentración
de DSF. Imagen modificada de He y Zhang, 2008.

2.4. Sistemas de quorum sensing en bacterias Gram
positivas.
Si bien los SQS se comenzaron a estudiar en bacterias Gram negativas, las
bacterias Gram positivas también se ha demostrado que regulan diversos procesos
de manera relacionada a la densidad celular. Sin embargo, en estas bacterias las
moléculas autoinductoras son en su mayoría péptidos (llamados feromonas) que
24

son detectados por sistemas de dos componentes (TCS). Por lo tanto, la detección
de quórum de las bacterias Gram positivas incluye cadenas de fosfo-relevo para
responder a un determinado estímulo (Waters y Bassler, 2005).

2.4.1. SQS de Bacillus subtilis.
B. subtilis es una bacteria Gram positiva, aerobia, que se encuentra
ampliamente distribuida en la naturaleza (suelo, plantas y agua) y que ha sido
estudiada por más de 40 años. B. subtilis es una fuente importante de producción
de enzimas como amilasas y proteasas que se usan en la industria (Kunst et al.,
1997).

Figura 2.4 SQS de B. subtillis que controla la esporulación y la competencia a través del Factor de
Competencia y Esporulación (CSF) y la feromona ComX, respectivamente. ComX activa al sistema
de dos componentes ComP/ComA cuya fosforilación culmina en la acumulacion del regulador
central de la competencia, ComK. Por su parte, el CSF impide la defosforilación de ComA al inhibir
la actividad de la fosfatasa RapC, impidiendo la degradación de ComK. Opp: permeasa
transmembranal. Figura modificada de Hamoen, Venema y Kuipers, 2003.
Entre algunas de sus características, destacan dos procesos de diferenciación
celular: por un lado, cuando B. subtilis crece en ambientes de carencia nutricional,
se induce la formación de endoesporas resistentes a la radiación y a la disecación.
Por otro lado, B. subtilis desarrolla el estado de competencia natural que le permite
25

tomar e incorporar ADN foráneo en su propio cromosoma. Ambos procesos, entre
otros, dependen de por lo menos dos péptidos para detectar y responder a cambios
en la densidad celular (Bacon Schneider, Palmer y Grossman, 2002).
La competencia de B. subtilis, está regulada por un SQS (Figura 2.4) que se
compone de la feromona ComX y del sistema TCS ComP/ComA. Cuando ComX
alcanza una concentración umbral, es detectada por la cinasa de histidina ComP la
cual se autofosforila y transfiereel grupo fosfato al regulador de respuesta ComA, el
cual a su vez activa la transcripción del operón srfA que incluye al gen comS. ComS
a su vez, previene la degradación de ComK, el factor transcripcional que funge
como regulador central de la competencia (Kleerebezem et al., 1997; Lazazzera,
Solomon y Grossman, 1997; Ansaldi et al., 2002).
Un segundo péptido, el Factor de Competencia y Esporulación (CSF por sus siglas
en inglés) codificado por el gen phrC actúa de manera intracelular impidiendo la
defosforilación de ComA (por la fosfatasa RapC), por lo que impacta también en el
aumento de la transcripción de sfrA/comS (Lazazzera, Solomon y Grossman, 1997;
Hamoen, Venema y Kuipers, 2003).
En los SQS de algunas bacterias Gram positivas, incluyendo a B. subtilis, el péptido
o feromona de señalización sufre algunas modificaciones post transcripcionales
para ser funcional, agregando más componentes al circuito de señalización.

2.5. Los SQS de Pseudomonas aeruginosa.
P. aeruginosa es una gamma-proteobacteria capaz de habitar distintos
nichos ecológicos; entre ellos, esta bacteria es capaz de infectar al ser humano en
condiciones de inmunodepresión como es el caso de los enfermos de sida, los
pacientes quemados y enfermos de fibrosis quística (Driscoll, Brody y Kollef, 2007;
El-khashaab et al., 2016; Sonmezer et al., 2016).
La gran variedad de ambientes a los que P. aeruginosa se adapta nos da una idea
de la versatilidad metabólica que posee. En el caso particular de su papel como
26

patógeno oportunista se sabe que regula de una manera estricta la producción de
factores de virulencia que le permiten colonizar al humano (Hardalo et al., 2017).
Entre algunos de los factores de virulencia que produce P. aeruginosa encontramos
proteasas extracelulares (elastasas LasA y LasB, proteasa alcalina), pigmentos
bactericidas (piocianina), formación de biopelícula, secreción de surfactantes
(ramnolípidos) y la expresión de bombas de eflujo de antibióticos. La producción
de la mayoría de éstos está regulada por un complejo SQS (Smith y Iglewski, 2003;
Williams, Cámara y Ca, 2009).
En P. aeruginosa, convergen tres SQS (Figura 2.5) que regulan un estimado de
315 genes (6% del genoma) (Schuster et al., 2003; Wagner, Gillis y Iglewski, 2004);
dos de ellos, el sistema Las y el sistema Rhl son similares al sistema LuxR/I. El
tercer sistema se denomina Pqs y su molécula señal no es una AHL sino una
quinolona.

Figura 2.5 Representación de los tres SQS de P. aeruginosa: Las, Rhl y Pqs.
Estos tres SQS se estructuran de manera jerárquica, con el sistema Las en la cima
de la cascada de la regulación: LasR interactúa con el autoinductor 3-oxo-
dodecanoil-homoserina lactona (3O-C12-AHL), que es producido por la enzima
LasI. El complejo LasR/3O-C12-HSL activa la transcripción de diversos genes que
27

codifican para algunos factores de virulencia (elastasa LasB, exotoxina A) así como
al gen lasI y a los genes rhlR y rhlI (Seed y Passador, 1995; Goldberg et al., 1997;
Gilbert, Kim, Gupta, Greenberg y Martin Schuster, 2009). Estos últimos codifican
para el factor transcripcional y la sintasa de un segundo SQS: RhlR/RhlI,
respectivamente. El complejo que forma RhlR con su molécula señal butanoil-
homoserina lactona (C4-AHL) sintetizada por RhlI promueve la expresión de otros
genes involucrados en la producción de diversos factores de virulencia como
piocianina y ramnolípidos (Medina, Juárez, Valderrama, et al., 2003; Dobler et al.,
2016).
El tercer SQS -Pqs- depende de la proteína PqsR y su molécula activadora la 2-
heptil-3-hidroxi-4(1H)-quinolona (PQS). El sistema LasR/3O-C12-HSL activa la
transcripción de pqsR y la de pqsH (uno de los genes que participan en la síntesis
de PQS). Por su parte, el sistema RhlR-C4-HSL es un regulador negativo de la
transcripción de pqsR (Wade et al., 2005). De tal modo que podemos notar que
existe un vínculo entre los tres SQS de P. aeruginosa.
Adicionalmente, la proteína Vfr (virulence factor regulator) juega un papel
importante en el SQS (Figura 2.5). Vfr es un factor transcripcional de la familia
Crp/FNR de proteínas receptoras de 3’,5’-cAMP y se ha demostrado que es
necesario para la transcripción de lasR y que tiene un efecto tanto negativo como
positivo en la transcripción de rhlR (Croda-García, M.-V. Grosso-Becerra, et al.,
2011). Estos resultados colocan a Vfr por encima de la cascada del SQS de P.
aeruginosa (Albus, Pesci, L. J. Runyen-Janecky, et al., 1997).

2.5.1. El sistema Las.
Se propone que el sistema Las está en la cima de la red de los SQS de P.
aeruginosa pues controla la transcripción de rhlR, rhlI, pqsH y pqsR, que forman
parte de los otros dos SQS de esta bacteria (De Kievit et al., 2002a; Medina, Juárez,
Díaz, et al., 2003). De hecho, en cepas mutantes en lasR, se ha demostrado que
esos genes no se expresan y, además, que la virulencia de la cepa disminuye (Tang
et al., 1996; Heurlier et al., 2005; Lutter et al., 2012).
28

El sistema Las se compone del factor transcripcional LasR y la sintasa de AHL,
LasI. LasR, como los reguladores transcripcionales de la familia LuxR, en su
extremo amino detecta a la molécula autoinductora 3O-C12-AHL y en su extremo
carboxilo posee un dominio de unión a ADN (HTH). Tras unirse a la 3O-C12-AHL,
forma homodímeros y entonces es capaz de unirse a genes blanco para activar su
transcripción (Kiratisin et al., 2002; Schuster, Urbanowski y Greenberg, 2004).
La transcripción de lasR es basal hasta que es inducida por Vfr a la mitad de la fase
estacionaria (Albus, Pesci, Laura J. Runyen-Janecky, et al., 1997). LasR activa la
transcripción de lasI, formando un circuito de regulación positiva que amplifica la
producción del autoinductor. Esta misma producción está limitada por la actividad
del regulador transcripcional RsaL codificado por el gen rsaL que se transcribe de
manera divergente a lasI y que también requiere de LasR para activar su
transcripción (Figura 2.6). De este modo, la producción de 3O-C12-AHL se
estabiliza antes de la fase estacionaria de crecimiento.

Figura 2.6 Representación de la expresión de los genes del sistema Las. Vfr activa la transcripción
de lasR el cual a su vez activa la transcripción de los genes rsaL y lasI. LasI sintetiza el autoinductor
3o-C12-AHL mientras que RsaL reprime la expresión de lasI y regula la producción del
autoinductor.

LasR reconoce secuencias palindrómicas conservadas en las regiones promotoras
de sus genes blanco; estas secuencias se conocen como cajas las. El alineamiento
de diversas cajas las reveló que es una región de alrededor de 20 nucleótidos de los
cuales son invariables los nucleótidos tercero y cuarto y diecisiete y dieciocho – CT
y AG, respectivamente. Cabe señalar que algunas cajas las son reconocidas por
LasR, RhlR o ambos (Tabla 2.3). (Schuster et al., 2003; Soberón-Chávez, Aguirre-
Ramírez y Ordoñez, 2005; Gilbert, Kim, Gupta, Greenberg y M. Schuster, 2009;
González-Valdez et al., 2014).
Diversos análisis con micro-arreglos, así como experimentos para demostrar la
unión de LasR con un gen blanco (tipo ChIP-chip) han demostrado que el sistema
Las regula directamente la expresión de 195 genes que se encuentran codificados
en 114 unidades transcripcionales reguladas por 104 promotores – 10 de ellos,
bidireccionales (Schuster et al., 2003; Gilbert, Kim, Gupta, Greenberg y Martin
Schuster, 2009).
Tabla 2.3 Comparación de la secuencia nucleotídica de distintas cajas las. Los nucleótidos
conservados (CT y AG) se señalan con negritas.
Gen caja las Regulador
rsaL AACTAGCAAATGAGATAGAT LasR
lasI ATCTATCTCATTTGCTAGTT LasR
lasA TACTGGAAAAGCTGATAGTT LasR
lecA TCCTGCATGAATTGGTAGGC LasR/RhlR
lasB-1* ACCTGCCAGTTCTGGCAGGT LasR/RhlR
rhlR-1* TGCTGGCATAACAGATAGGG LasR
rhlI CCCTACCAGATCTGGCAGGT LasR
pqsR CGCTAACAAAAGACATAGGT LasR/RhlR
pqsH AACTCGATCTTCTGATAGGGLasR
rmlA ACCTACCAGATCTGGGGTTG RhlR
rhlA TCCTGTGAAATCTGGCAGTT RhlR/LasR
*Tanto lasB como rhlR tienen dos cajas las; en esta tabla se presenta la secuencia de sólo una de ellas, para
cada gen.

Entre los varios genes que regula LasR, y que están relacionados con la virulencia
de P. aeruginosa, se encuentran: lasB (elastasa LasB), aprA (proteasa alcalina),
lasA (elastasa LasA), exotoxina A (toxA), hcnA (sintasa de ácido cianhídrico, HCN),
lasI, rhlR, rhlI (SQS Rhl), pqsR y pqsH (SQS Pqs) (Brint y Ohman, 1995; Coin
et al., 1997; Dubern y Diggle, 2008; Casilag et al., 2015; Chowdhury y Bagchi,
2016).

2.5.2. El sistema Rhl.
El sistema Rhl se compone del factor transcripcional RhlR y de la sintasa de
C4-AHL, RhlI. LasR/3O-C12-AHL activa la transcripción de rhlR y rhlI (De Kievit
et al., 2002b). Vfr desempeña un papel tanto de activador como de represor de la
transcripción de rhlR (Croda-García, V. Grosso-Becerra, et al., 2011).
Tanto rhlR como rhlI están codificados río abajo del operón rhlAB que codifica
para las enzimas RhlA y RhlB que participan en la síntesis de ramnolípidos, un
importante factor de virulencia de P. aeruginosa (Medina, Juárez, Valderrama,
et al., 2003).
El gen rhlR se transcribe a partir de 4 promotores diferentes (Figura 2.7), de los
cuales, los promotores 3 y 4 se localizan en la región codificante del gen rhlB. La
transcripción de rhlR es constitutiva a partir del promotor 2 mientras que los
promotores 1 y 4 dependen de LasR/3O-C12-AHL. Vfr activa la transcripción de
rhlR actuando sobres los promotores 1, 2 y 3 mientras que reprime la transcripción
a partir del promotor 4. Además, RhlR/C4-AHL activa la transcripción del operón
rhlAB y se ha demostrado que este operón continúa con rhlR; creando un circuito
de autorregulación positiva que implica la transcripción de rhlABR como parte de
un solo operón (Medina, Juárez, Díaz, et al., 2003; Croda-García, M.-V. Grosso-
Becerra, et al., 2011).
31

Figura 2.7 Esquema del operón rhlAB y los genes rhlR y rhlI. Los cuatro promotores de rhlR se
indican con los números del 1 al 4. LasR/3O-C12-AHL activa la transcripción de rhlR a partir de sus
promotores 1 y 4 y asimismo activa la transcripción de rhlI. El promotor 2 de rhlR se expresa de
manera constitutiva. Vfr activa la transcripción de rhlR actuando sobre los promotores 1, 2 y 3
mientras que sobre el promotor 4 ejerce un efecto de represión.
RhlR, como LasR, reconoce secuencias palindrómicas conservadas en sus genes
blancos, denominadas también cajas las, ya que en muchos casos también son
reconocidas por LasR, aunque con menor especificidad (Soberón-Chávez, Aguirre-
Ramírez y Ordoñez, 2005); e incluso, la única caja reportada que es una caja rhl
(que no es reconocida por LasR) es la caja que se encuentra en el promotor del
operón rmlBDAC (Tabla 2.3) (Aguirre-Ramírez et al., 2012). Pero, a diferencia de
LasR, RhlR puede unirse algunas de sus cajas blanco en presencia y ausencia de su
autoinductor, la C4-AHL (Medina et al, 2003, Croda-García 2011).
Entre los genes cuya transcripción es activada por RhlR se encuentran: rhlAB
(ramnolípidos), lecA (lectina), hcnABC (síntesis de ácido cianhídrico) y los
operones phzABCDEFG (síntesis de fenazinas, como piocianina). RhlR también
32

está involucrado en la regulación negativa de pqsH (Mavrodi et al., 2001; Schuster
y Greenberg, 2007; Dobler et al., 2016).

2.5.3. El sistema Pqs.
Este tercer SQS de P. aeruginosa utiliza como molécula autoinductora, en
lugar de AHL, dos alquil-quinolonas (AQ): PQS (2-heptil-3-hidroxi-4(1H)-quinolona)
y su precursor 2-heptil-4-quinolona (HHQ). Éstas se unen al factor transcripcional
PqsR que pertenece a la familia de reguladores tipo LysR. Un análisis de micro-
arreglos indica que el sistema Pqs regula 141 genes (Déziel et al., 2005).
La síntesis de la molécula autoinductora depende de los genes pqsABCD, pqsH y
phnAB. PhnA/B proveen el antranilato que funciona como sustrato para las
enzimas PqsABCD, las cuales sintetizan en su conjunto a HHQ el cual es después
convertido a PQS por PqsH (Dubern y Diggle, 2008).
La activación de la transcripción de pqsH y de pqsR depende de LasR/3O-C12-AHL
(Whiteley, Lee y Greenberg, 1999; Wade et al., 2005). Asimismo, RhlR/C4-AHL
impide la traducción de pqsA y la transcripción de pqsR. Además, PqsR activa la
transcripción de los operones phnAB y pqsABCDE y se crea un circuito de
autorregulación positiva dentro del sistema Pqs (McGrath, Wade y Pesci, 2004),
similar al de los sistemas Las y Rhl.
La función de PqsE no se ha elucidado por completo. Se sabe que tiene actividad de
tioesterasa y que participa sin ser indispensable, en la síntesis de PQS (Drees y
Fetzner, 2015). También se propone que tiene que ver con estabilizar a RhlR y
mejorar su funcionamiento ya que la sobreexpresión de PqsE se refleja en un
aumento de la producción de ramnolípidos y piocianina, factores de virulencia cuya
síntesis depende del sistema Rhl (Dubern y Diggle, 2008; Farrow et al., 2008).

2.6. El quorum quenching.
El quorum quenching (QQ) o interferencia del quorum sensing es un proceso
natural de algunos organismos, que poseen o no algún SQS, que sirve para
degradar o reciclar moléculas autoinductoras (Uroz, Dessaux y Oger, 2009). A
34

continuación, se enlistan unos ejemplos representativos de las enzimas de QQ
producidas por algunos organismos:

• Hay enzimas llamadas lactonasas que inactivan a las AHL (Czajkowski y
Jafra, 2009). La primer lactonasa descrita es la enzima AiiA de Bacillus
240B1. Las lactonasas actúan hidrolizando el anillo lactonado de las AHL.
La expresión de AiiA en Erwinia carotovora y P. aeruginosa, resulta en la
disminución de la concentración de sus respectivas AHL y en los factores de
virulencia asociados a ellas (Reimmann et al., 2017).

• Las AHL también pueden ser inactivadas por enzimas acilasas que
hidrolizan el enlace amida entre la homoserina lactona y la cadena acilo. La
expresión de la acilasa AiiD (aislada de Ralstonia) en P. aeruginosa
disminuye la concentración de AHL, la formación de biopelícula y la
virulencia en el modelo de C. elegans (Lin et al., 2003). Inclusive, P.
aeruginosa PAO1 tiene una acilasa llamada PvdQ contra 3O-C12-AHL que le
permite crecer en medios con 3O-C12-AHL como fuente de carbono (Sio
et al., 2006).

• También hay enzimas que modifican las AHL sin degradarlas, afectando su
capacidad de unirse a un factor transcripcional. A la fecha se han estudiado
una óxido-reductasa de Rhodococcus erythropolis que reduce el grupo ceto
de las 3-oxo-AHL (Lactonases et al., 2008) y la monooxigenasas de Bacillus
megaterium que oxida AHL de cadena larga (Chowdhary et al., 2007).

• Otras enzimas con actividad similar a las lactonasas son las paraoxonasas
(PON) que se han encontrado en células epiteliales humanas. Suactividad se
ha demostrado contra la 3O-C12-AHL de P. aeruginosa (Dong, Wang y
Zhang, 2007).
Esta característica del QQ se ha aprovechado para desarrollar diversas estrategias
para interrumpir los SQS (no sólo de P. aeruginosa) como una alternativa
terapéutica antibacteriana no sólo en contexto de patógenos humanos sino también
35

en el campo de la agronomía (Dong et al., 2001). Para obstaculizar cualquier punto
de la vía de señalización del QS (la síntesis, difusión, acumulación y detección del
autoinductor), se usan moléculas de diversa naturaleza (enzimas o compuestos
químicos, naturales o sintéticos) (Dong et al., 2001):
• Se ha visto que el uso de furanonas halogenadas inhiben fenotipos
relacionados a QS en diversas bacterias como nado en enjambre en Serratia
liquefaciens y luminiscencia y virulencia en V. harveyi. Las furanonas tienen
una estructura similar a las AHL y se propone que por tanto compiten con
ellas para unirse a los factores transcripcionales LuxR. Además, el complejo
LuxR/furanona se degrada más rápido que LuxR/AHL (Manefield et al.,
2017).

• También se usan homólogos de los sustratos que usan las enzimas tipo LuxI,
como butiril-S-adenosil-metionina (butiril-SAM) que se ha visto que reduce
la actividad de RhlI en un 97% (Reverchon et al., 2002).
Hay otras innovadoras herramientas para contender con los SQS como: la
elaboración de vacunas contra el 3O-C12-AHL y los péptidos de señalización de
Staphylococcus aureus y usar co-cultivos de bacterias productoras de AHL con
bacterias que las degradan, a manera de control biológico (Uroz, Dessaux y Oger,
2009).
Debido a que LasR es el factor transcripcional necesario para activar a los otros dos
SQS de P. aeruginosa, se ha buscado bloquear este sistema con alguno de las
estrategias arriba mencionadas para así disminuir la virulencia de la bacteria. Por
ejemplo, a partir de la furanona producida por la macro-alga Delisea pulchra (que
posee actividad anti AHL en P. aeruginosa), se han sintetizado diversas furanonas
para elegir aquellas con la mejor actividad, como la furanona 56 que antagoniza la
expresión de genes dependientes del sistema Las (Hentzer et al., 2002).
También se ha estudiado el efecto de la furanona C-30 y se ha visto que afecta la
expresión de los genes lasA, rhlAB, phzABCDEFG y hcnABC, pero no a los genes
rhlRI ni lasRI. De manera interesante, se observó que la expresión de los genes
36

fabH1, fabH2 y phnAB, cuyos productos están involucrados en la síntesis de AHL
(los dos primeros) y de PQS (el último) también está reprimida (Hentzer et al.,
2003).
Otra molécula utilizada es el 5-fluorouracilo (5-FU), un análogo del uracilo. En
la cepa de P. aeruginosa PA14, se ha demostrado que el uracilo se necesita para la
expresión de los genes lasA, lasB, rhlABR, phzABCDEFGMS y aprA y que su
análogo, el 5-FU reduce la síntesis de elastasa, piocianina, ramnolípidos y PQS así
como el nado en enjambre (Ueda et al., 2009).
Sin embargo, investigaciones recientes han demostrado que los inhibidores de QS,
si bien son funcionales en cepas de laboratorio (PAO1, PA14) son menos útiles en
cepas clínicas o ambientales. Incluso, la furanona C-30 y el 5-FU tienen diferente
efectividad cuando se han estudiado en las mismas cepas. Este fenómeno sugiere
que el uso de inhibidores de QS no es la mejor estrategia para tratar infecciones de
P. aeruginosa (García-Contreras et al., 2013). Es más, se han aislado cepas que son
resistentes a la furanona C-30 (García-Contreras et al., 2015).
Aunado a la demostración de que el QQ parece no ser la mejor alternativa
terapéutica contra P. aeruginosa, se ha acumulado evidencia de que en algunas
cepas clínicas y ambientales mutantes en lasR, dependiendo del medio de cultivo y
las condiciones de crecimiento, algunos factores de virulencia se expresan y la cepa
es potencialmente virulenta (Feltner et al., 2016; García-Contreras, 2016).
Por tanto, es necesario un mejor entendimiento del circuito de quorum sensing en
P. aeruginosa que nos permita elegir un mejor blanco para disminuir o atenuar su
virulencia.

2.7. La regulación de los SQS de P. aeruginosa.
Los tres SQS de P. aeruginosa que están mejor caracterizados (Las, Rhl y
Pqs) están conectados entre sí y forman una dinámica y compleja red de regulación
(Figura 2.5). Hemos visto que LasR/3O-C12-AHL se requiere para activar la
transcripción de rhlR/rhlI y de pqsR (Whiteley, Lee y Greenberg, 1999), por lo que
37

la ausencia de un sistema Las funcional, el quorum sensing en esta bacteria, se
apaga (Dekimpe y Déziel, 2009). Además, se sabe también que algunos genes que
forman parte de esta red de regulación, son blanco de regulación de más de un
factor transcripcional (Dekimpe y Déziel, 2009).
Además de la interconexión de los tres SQS en P. aeruginosa, existen otros
reguladores que participan de alguna manera con estos SQS entre los que se
encuentran: el factor sigma de fase estacionaria RpoS, las proteínas parecidas a
histonas MvaT y MvaU, RsaL, el factor transcripcional tipo Lux QscR, el
regulador de respuesta GacA, el factor transcripcional de la familia AraC, VqsM y
el factor transcripcional de la familia Crp/FNR, Vfr (Venturi, 2006; Rampioni
et al., 2007; Balasubramanian et al., 2013; Kang et al., 2016).
Diversos trabajos con micro-arreglos han revelado que RpoS, MvaT/MvaU, RsaL,
VqsM y VqsR son reguladores globales que gobiernan la expresión de diversos
genes relacionados con diversos procesos celulares de P. aeruginosa, entre ellos a
algunos genes de los SQS: tanto de la síntesis de factores de virulencia, como de los
factores transcripcionales y las sintasas de los autoinductores (Whiteley, Parsek y
Greenberg, 2000; Juhas et al., 2004; Schuster et al., 2004; Castang et al., 2008; Li
et al., 2009). Estos reguladores también resultan de alguna manera
interconectados: MvaT/MvaU regulan la expresión de rpoS (Castang et al. 2008),
VqsM regula la expresión de rpoS, rsaL y qscR (Dong et al., 2005; Liang et al.,
2014), mientras que VqsR hace lo propio con qscR (Liang et al., 2012).
QscR es un homólogo a LuxR y se considera un factor transcripcional huérfano
porque no se le ha encontrado un homólogo a LuxI. Forma heterodímeros no
funcionales con LasR y RhlR que evitan que éstos puedan pegarse a sus secuencias
blanco (Ledgham et al., 2003; Chugani y Greenberg, 2014).
El regulador global GacA, forma parte de un TCS junto con la cinasa de histidina,
GacS. Una cepa mutante en gacA, produce menos C4-AHL, piocianina y ácido
cianhídrico que la cepa silvestre. Este fenómeno se relaciona con que la expresión
de lasR y rhlR requiere de GacA (Reimmann et al., 1997). La acción reguladora de
38

GacA sobre los SQS parece ser a través de los pequeños ARN reguladores RsmY y
RsmZ y la proteína de unión a ADN, RsmA (Kay et al., 2006).
Vfr es un regulador global la familia Crp/FNR que controla la producción de
diversos factores de virulencia como la exotoxina A, piocianina y elastasa a través
de regular la transcripción de lasR y rhlR (Albus, Pesci, Laura J. Runyen-Janecky,
et al., 1997; Croda-García, M.-V. Grosso-Becerra, et al., 2011) al unirse a secuencias
blanco que reconoce en las regiones promotoras de ambos genes. De los varios
reguladores de los SQS que hemos mencionado, Vfr es el más directo y cercano a
los sistemas Las y RhlR por lo que discutiremos con más profundidad su
funcionamiento y su relación con el QS.
La participación de estos llamados superreguladores, hace que los SQS se integren
a otras redes de regulación, lo que a su vez le permite ampliar la cantidad y tipo de
estímulos ambientales a los que puede responder la bacteria. Además, nos permite
observar que los SQS son regulados a distintos niveles: transcripcional, post-
transcripcional y post-traduccional.

2.7.1. El regulador Vfr.
Este regulador globalcontrola la expresión de más de 100 genes en P.
aeruginosa (Fuchs et al., 2010) incluyendo los genes necesarios para la producción
de diversos factores de virulencia como el pili tipo IV, exotoxina A (ETA), proteasa
IV, el sistema de secreción tipo 3 y la biogénesis del flagelo (Marsden et al., 2016).
Vfr pertenece a la familia de reguladores Crp/FNR (West, Sample y Runyen-
Janecky, 1994). La proteína CRP de E. coli es el miembro más estudiado de esta
familia como regulador de genes involucrados en el catabolismo de carbono
(Gosset et al., 2004). Vfr y CRP comparten una identidad del 67% y una similitud
del 91%. Entre ambas proteínas están conservados los aminoácidos necesarios para
su función: unión de cAMP, unión a ADN e interacción con al ARN polimerasa por
lo que se sugiere que Vfr y CRP funcionan de manera similar (West, Sample y
Runyen-Janecky, 1994) aunque regulan procesos celulares diferentes.
39

El extremo carboxilo de Vfr está implicado en la unión a ADN gracias a un motivo
HTH mientras que en el extremo amino se reconoce el cAMP. Una región
intermedia de la proteína permite su dimerización. La unión de cAMP favorece e
incrementa la afinidad de Vfr por el ADN blanco, pero a diferencia de lo que ocurre
con CRP, donde el cAMP es indispensable para su función, hay por lo menos un
ejemplo donde Vfr puede trabajar en ausencia de cAMP.
Otra diferencia entre Vfr y CRP es que Vfr tiene tres aminoácidos adicionales en el
sitio de unión a cAMP lo que le permite que también una cGMP (Lee et al., 1994).
De manera interesante, mutantes espontaneas en Vfr a las que les faltan 5
aminoácidos del sitio de unión a cAMP, mantienen su capacidad de regular la
producción de factores de virulencia a través del sistema Las (Fuchs et al., 2010).
La secuencia de nucleótidos que reconoce Vfr, denominada VBS (Vfr binding site
en inglés) varía sustancialmente, así como la afinidad de su unión. Esta
característica también es diferente al caso de CRP que tiene un consenso más
conservado en sus cajas de pegado. Esta situación también explica por qué Vfr
puede complementar una mutante crp de E. coli, pero no al revés (Kanack et al.,
2006).
Vfr activa su propia transcripción al unirse a un VBS en su propio promotor.
También se une a VBS que se encuentran en la región promotora de lasR y de rhlR.
En el caso de lasR, Vfr es indispensable para que el gen se exprese (Albus, Pesci,
Laura J. Runyen-Janecky, et al., 1997) y en el caso de rhlR la situación es más
compleja: Vfr tiene cuatro VBS, uno por cada uno de los cuatro promotores de
rhlR. Al unirse a los VBS correspondientes a los promotores 1, 2 y 3 de rhlR,
funciona como activador de la transcripción pero al unirse al VBS correspondiente
al promotor 4 de rhlR, actúa como represor (Figura 2.9) (Croda-García, M.-V.
Grosso-Becerra, et al., 2011).
40

Figura 2.9 Representación de la regulación que ejerce Vfr sobre la transcripción de rhlR. Vfr se
une a cada uno de los cuatro promotores de rhlR en su caja consenso (VBS); sobre los promotores 1,
2 y 3 actúa como activador mientras que en el promotor 4, actúa como represor de la transcripción.

3. Antecedentes.
Del año 2000 a la fecha, se han secuenciado los genomas de diversos aislados
de Pseudomonas aeruginosa, siendo la cepa PAO1 asilada de la herida de un
paciente en Australia en 1955 la cepa utilizada como referencia internacional (Silby
et al., 2011; Grosso-Becerra, Santos-Medellín, et al., 2014).
Actualmente se cuenta con la secuencia de los genomas de diversos aislados
clínicos, así como de aislados ambientales. De manera interesante, al comparar los
diversos genomas disponibles de P. aeruginosa se pudo observar que su contenido
genómico está bastante bien conservado (95% en su genoma central) (Grosso-
Becerra, Santos-Medellín, et al., 2014).
Es difícil e intrigante explicar por qué hay poca variabilidad genética entre cepas
ambientales y clínicas de P. aeruginosa y cómo relacionarlo con la diversidad
fenotípica que presentan las diversas cepas.
Este fenómeno tiene su antecedente directo en la cepa M18 aislada de la rizósfera
de melón. En esta cepa, la jerarquía del sistema de QS es diferente a la de la cepa
PAO1, y también lo es la producción de los factores de virulencia como es el caso
del ácido fenazin-carboxílico (PCA) que es el precursor de la piocianina. Sin
41

embargo, los genomas de ambas cepas (M18 y PAO1) están altamente conservados
(Lu et al., 2009).
Otro claro ejemplo lo tenemos en una investigación publicada recientemente por
nuestro grupo en el cual se estudiaron tres cepas aisladas del ambiente (ID4365 del
océano Índico, M10 de una poza de Cuatro Ciénegas, IGB83 de un coco podrido de
Chiapas) y una cepa aislada del estómago de un delfín, llamada 148. En el trabajo
se demostró que todas estas cepas presentan una amplia diversidad fenotípica en
cuanto a la producción de factores de virulencia y movilidad, pero esta diversidad
en sus fenotipos no se refleja en su variabilidad genómica ya que sus genomas
poseen un alto grado de similitud (Grosso-Becerra, Santos-Medellín, et al., 2014).
El caso de la cepa 148 es de nuestro particular interés porque durante su estudio se
pudo observar que comparada con la cepa PAO1, es menos virulenta (60% de
letalidad con un inóculo de 108 unidades formadoras de colonias – ufc – contra un
100% de letalidad de la cepa PAO1 con el mismo inóculo), produce más piocianina
pero que no produce elastasa.
Un análisis bioinformático del genoma de la cepa 148 evidenció que tiene una
eliminación de aproximadamente 20 kpb en su genoma que incluye la mitad del
gen PA1415, 16 genes adicionales entre los que se encuentra lasR, así como la
región promotora de lasI (Figura 3.1, Tabla 11.1). Esta eliminación se traduce en
la ausencia de LasR y en la deficiencia de la producción de 3O-C12-HSL (Grosso-
Becerra, Santos-Medellín, et al., 2014).
La producción de piocianina depende del sistema de QS RhlR/RhlI mientras que la
producción de elastasa depende del sistema LasR/LasI; a su vez, el sistema Rhl
depende del sistema Las. ¿Cómo explicar entonces que la cepa 148 produce RhlR,
C4-HSL y factores de virulencia dependientes de RhlR (ramnolípidos y piocianina)
en ausencia de LasR, si este es necesario para la transcripción de rhlR y rhlI?

Figura 3.1 Esquema representativo de la deleción de 20 kpb del genoma de la cepa P. aeruginosa
148. En A se comparan las cepas PAO1 y 148, indicándose los genes que perdió ésta última. En B se
muestra la secuencia nucleotídica de la región río arriba del gen lasI en la cepa 148. Se señalan
subrayados en rojo, los 16 nucleótidos que restan de la región promotora de lasI. Con flechas rojas
se indica la dirección del gen PA1415 (naranja) y del gen lasI (verde).
La cepa 148 no es la primera ni única mutante en LasR aislada: hay diversos
reportes de que en pacientes con infecciones pulmonares crónicas (Winstanley,
O’Brien y Brockhurst, 2016) o experimentos de evolución in vitro (Rumbaugh
et al., 1999; Sandoz, Mitzimberg y Schuster, 2007) se suelen aislar cepas mutantes
en lasR. De hecho, se ha propuesto el termino cheating o social cheaters para
describir el fenómeno en el que individuos de una población reducen la producción
43

o dejan de producir los llamados bienes públicos (en este caso factores de
virulencia extracelulares regulados por LasR) y se benefician de lo que produce el
resto de la población (llamados cooperadores) (Diggle, Griffin, et al., 2007).
Los SQS son por tanto susceptibles de generar cheaters y en efecto, se han
encontrado cepas que o no producen la señal, o son incapaces de detectarla. Estas
cepas cheaters aunque pierden las características dependientes del gen ausente, se
ahorran el gasto energético de producir antedichos compuestos, lo que les genera
une ventaja en cuanto a crecimiento (Rumbaugh