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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL ESTUDIO IN VITRO SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MESENQUIMALES DE BOVINO HACIA LOS LINAJES MUSCULAR Y ADIPOSO, ASÍ COMO SU EFECTO EN EL METABOLISMO ENERGÉTICO T E S I S QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS P R E S E N T A JESÚS JONATHAN RAMÍREZ ESPINOSA TUTOR DRA.MARÍA OFELIA MORA IZAGUIRRE FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DR. ENRIQUE PIÑA GARZA FACULTAD DE MEDICINA DR. ARMANDO SHIMADA MIYASAKA FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN CUAUTITLÁN IZCALLI , ESTADO DE MÉXICO OCTUBRE 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Dedicatorias A mis padres por apoyarme siempre en todo lo que he hecho sin cuestionarme. Amá, Apá los amo. A la familia en todas sus extensiones, hermanas, tios, primos, que con sus palabras de aliento me motivan a seguir adelante. A los que ya no estan pero siguen presentes. A la familia de destino, los amigos cercanos y lejanos, temporales o definitivos, a las buenas y malas influencias que te enseñan un poco más a vivir y disfrutar la vida. 3 Agradecimientos. A la Doctora Ofelia Mora por aceptarme como su estudiante y brindarme todo el apoyo y los regaños necesarios para culminar este trabajo. Ahora ya tengo una mamá académica. A los Doctores Armando Shimada y Enrique Piña por sus observaciones a lo largo de este trayecto, por sus consejos más allá de lo académico, pero sobre todo por sus humildad como seres humanos. A Laura González, MC Técnico académico del RuMen por todas sus enseñanzas, apoyarme en la realización de este proyecto y por su amistad. Al laboratorio de diferenciación neuronal y axogénesis (A-03) del Instituto de Neurobiología encabezado por el Dr. Alfredo Varela, por el apoyo brindado, tanto material como intelectual, para la realización de esta tesis. A los compañeros y amigos que vivieron conmigo esta etapa. La mejor de las suertes para todos ellos. A los miembros del jurado, Dra. Aurea Orozco, Dr Miguel Ángel Cornejo, Dr. Carlos Gutiérrez y MC Pablo Pérez-Gavilán por el tiempo que dedicaron a la revisión de este trabajo, así como por sus observaciones y aportaciones al mismo. A mi alma mater, la UNAM que me ha nutrido más de la mitad de mi vida y particularmente a la FES Cuautitlán por las enseñanzas adquiridas en ella, las oportunidades que me ha dado. A CONACyT por la beca otorgada y tener así el apoyo financiero para realizar mis estudios. 4 “Los dos llegaron cojeando: Guy y el perrito más dócil que había nacido en el patio. Guy tenía una pierna vendada y el perrito una de las patitas envuelta en trapos. Los dos caminaban a saltos. El perrito gruñía – tal vez de dolor – y meneaba la cola – tal vez de agradecimiento. - Nos caímos Jacinto. - Ya lo veo, niño Guy. - Al perrito se le torció una patita. Ya se la compuse. - ¿Y tú? - Acércate. No se lo digas a nadie. Yo no tengo nada. Me vendé sólo para consolarlo CANEK ERMILO ABREU GÓMEZ 5 INDICE Página RESUMEN 9 ABSTRACT 10 INDICE DE ABREVIATURAS 11 1. INTRODUCCIÓN 14 2. ANTECEDENTES 15 Artículo. Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies pecuarias. Parte I. Rosa M. Pérez-Serrano, Jesús J. Ramírez-Espinosa, Armando Shimada, Anaid Antaramian, Enrique Piña, Ofelia Mora 15 Artículo. Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies domésticas y pecuarias. Parte II. Rosa M. Pérez-Serrano, Jesús J. Ramírez-Espinosa, Armando Shimada, Anaid Antaramian, Enrique Piña, Ofelia Mora. 15 Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies pecuarias. Parte I. 16 Resumen 16 Introducción 16 Biología 17 Caracterización 19 Capacidad de adhesión al plástico 19 Capacidad proliferativa 19 Detección de proteínas de superficie 20 Expresión de factores de transcripción 22 Multipotencialidad 23 Conclusiones 25 Literatura Citada 25 6 Artículo. Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies domésticas y pecuarias. Parte II. 28 Resumen 28 Introducción 28 Caracterización de células troncales mesenquimales de especies domésticas 29 Caninos 29 Felinos 29 Equinos 30 Porcinos 30 Ovinos y caprinos 31 Bovinos 31 Aves 32 Aplicaciones de las CTM de MO en medicina veterinaria y zootecnia 33 Terapéutica 33 Producción pecuaria 34 Desarrollo y metabolismo de músculo y tejido adiposo 34 Reproducción, transferencia nuclear, tecnologías de ADN recombinante y transgénicos. 35 Producción de carne in vitro 36 Conclusiones 37 Literatura citada 37 2. HIPÓTESIS 41 3. OBJETIVOS 42 3.1 Objetivo General 42 3. 2Objetivos específicos 42 4 MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS. 43 Artículo. Bovine (Bos taurus) bone marrow mesenchymal cells differentiation to adipogenic and myogenic lineages. Jesús Jonathan 43 7 Ramírez-Espinosa, Laura González-Dávalos, Armando Shimada, Enrique Piña, Alfredo Varela-Echavarría, y Ofelia Mora. Abstract 47 Abbreviations used in this paper 48 Introduction 49 Material and methods 50 Cell isolation, culture, and passaging. 50 RNA Isolation 51 cDNA synthesis 51 Real time-PCR 52 Experiment 1: Proliferation capacity, mesenchymal stem cell marker assessment, and induction of adipogenic and myogenic lineages. 53 Proliferation capacity 53 Expression of MSC markers 54 Adipogenic differentiation 54 Myogenic differentiation 55 Experiment 2: Enhancement of adipogenic and myogenic differentiation of bovine bone marrow-derived MSC and changes in expression of genes related to energy metabolism. 56 Adipogenic differentiation 56 Myogenic differentiation 56 Statistical analysis 57 Results 58 Experiment 1 58 Proliferation capacity 58 Expression of MSC markers 58 Adipogenic differentiation 58 Myogenic differentiation 59 Experiment 2 60 Effect of PPAR agonists on adipogenic differentiation 60 8 Effect of PPAR agonists on myogenic differentiation 61 Discussion 62 Differentiation improvement 65 Effect on adipogenesis 65 Effect on myogenesis 67 Effects of PPAR agonists on energy metabolism 69 Conclusions 71 Acknowledgements 72 References 72 Figure legends 80 Tables 83 Figures 88 5. DISCUSIÓN 93 6. CONCLUSIONES 1067. LITERATURA CITADA 107 9 RESUMEN Las células troncales mesenquimales (CTM) son células multipotenciales capaces de diferenciarse a varios linajes, esto las hace un modelo útil para estudiar el desarrollo y la diferenciación. El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de diferentes agonistas de los PPAR sobre la diferenciación y metabolismo de CTM derivadas de bovino e inducidas a los linajes muscular y adiposo. Se aislaron células de médula ósea de becerros Holstein de 7 días de edad y se evaluaron las condiciones para promover la diferenciación adiposa (DA) y muscular (DM). Para la DA se usaron células del primer pasaje y se suplementó el medio con Rosiglitazona, Telmisartan, Sirtinol o Ácido Linoleico conjugado 9-cis, 11-trans. Para la DM se agregó al medio Bezafibrato, Telmisartan o Sirtinol. Mediante qPCR se evaluó la expresión de PPARγ para la DA y de cadena pesada de miosina (MyHC) para la DM así como genes relacionados con el metabolismo energético. Los datos obtenidos se analizaron como un modelo completamente aleatorizado usando el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS. Para la DA, el uso de Telmisartan a 20 µM mostró la mayor expresión de PPARγ (15.58 ± 0.62, p < 0.0001) y se encontraron diferencias en la expresión de Hexocinasa II (HK2) (p < 0.0001); Fosfofructocinasa (PFK) (p = 0.0027); Lipasa de Triglicéridos del Adipocito (ATGL) (p < 0.0001); Acetil-CoA carboxilasa α (ACACα) (p < 0.0001) y Ácido Graso Sintasa (FASN) (p < 0.0001), pero no para ACACβ (p = 0.4275). Para la DM, el Bezafibrato a 200 µM mostró la mayor expresión de MyHC (73.98 ± 11.79), y se encontraron diferencias en la expresión para todos los genes evaluados (HK2: p = 0.0011; PFK: p = 0.0328; ACACβ: p < 0.0001; PPARδ p = 0.0097; y FABP: p < 0.0001). Estos resultados indican que se incrementa la diferenciación hacía adipocitos y miocitos en células de bovino derivadas de médula ósea con el uso de Telmisartan y Bezafibrato respectivamente, además de que la captación, almacenamiento, uso y movilización de sustratos energéticos se mejora con ambos compuestos. Palabras clave: PPAR, diferenciación celular, metabolismo de energía 10 ABSTRACT Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells able to differentiate into several lineages, making them a useful model to study development and differentiation. The purpose of this study was to evaluate the effect of PPAR agonists on differentiation and metabolic features of bovine MSC induced to adipogenic or myogenic lineages. Bone marrow cells from 7 days old Holstein calves were isolated and conditions to promote adipogenic differentiation (AD) or myogenic differentiation (MD) were explored. For AD, cultured cells after one passage, were transferred to adipogenic medium supplemented with either Rosiglitazone, Telmisartan, Sirtinol, or Conjugated 9-cis, 11-trans linoleic acid. For MD, third-passage cells were added to myogenic medium with either Bezafibrate, Telmisartan, or Sirtinol. mRNA expression of PPARγ for AD, myosin heavy chain (MyHC) for MD, and genes related to energy metabolism were measured by qPCR. Data were analyzed as a completely randomized design using the GLM procedure from SAS. For AD 20 µM Telmisartan showed the highest PPARγ expression (15.58 ± 0.62 fold, p < 0.0001) and differences in expression of energy metabolism related genes were found for Hexokinase II (HK2) (p < 0.0001); Phosphofructokinase (PFK) (p = 0.0027); Adipose triglyceride lipase (ATGL) (p < 0.0001); Acetyl-CoA carboxylase α (ACACα) (p < 0.0001) and Fatty acid synthase (FASN) (p < 0.0001), but not for ACACβ (p = 0.4275). For MD, 200 µM Bezafibrate showed the highest MyHC expression (73.98 ± 11.79 fold), and differences in the expression of all energy metabolism related genes were found (HK2: p = 0.0011; PFK: p = 0.0328; ACACβ: p < 0.0001; PPARδ p = 0.0097; and FABP: p < 0.0001). This results point out that adipocyte and myocyte differentiation of bovine-derived MSC is enhanced with Telmisartan and Bezafibrate, respectively; energy uptake, storage, mobilization, and use of energy substrates are improved with both compounds. Keywords: PPAR, cell differentiation, energy metabolism 11 INDICE DE ABREVIATURAS ACACa / b Acetil Coenzima A carboxilasa a / b ADM Medio de diferenciación adiposa ADN / DNA Ácido desoxirribonucleico ARN / RNA Ácido ribonucleico ATGL Lipasa de triglicéridos del adipocito / Desnutrina BM Medio basal BMD-MSC Células troncales mesenquimales derivadas de médula ósea BMP4 Proteína morfogenética 4 C/EBPα / β Proteínas de unión al promotor CCAAT α / β cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario CH / HC Células hematopoyéticas CLA 9Z, 11E Ácido linoleico conjugado 9 cis, 11 trans CPT-1 Carnitin palmitoil transferasa 1 CT / SC Células troncales CTE / ESC Células troncales embrionarias CTM / MSC Células troncales mesenquimales CTS / SSC Células troncales somáticas DA / AD Diferenciación adiposa DM / MD Diferenciación muscular DMEM Medio de Eagle modificado de Dulbecco DMSO Dimetil sulfóxido EF1α Factor de elongación 1-α Eya1 Homólogo de la proteína ojos ausentes FABP Proteína de unión a ácidos grasos FASN Ácido graso Sintasa FGF-2 Factor de crecimiento de fibroblastos 2 GAPDH Gliceraldehído -3-fosfato deshidrogenasa 12 Gasp 1 Factor de crecimiento y diferenciación asociado a la proteína sérica-1 GLUT4 Transportador de glucosa tipo 4 GPDH Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa HDL Lipoproteínas de alta densidad HGF Factor de crecimiento de hepatocitos HK2 Hexocinasa II HS Suero equino IBMX Isobutil-metil xantina ICQ Inmunocitoquímica IL-11 Interleucina 11 IL-6 Interleucina 6 IM Medio de inducción para diferenciación adiposa I-MET Inmunomicroscopía electrónica ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular ITS Suplemento de insulina, transferrina, selenito de sodio LPL Lipoproteína lipasa MCC Microscopía de campo claro MEF2C Factor potenciador específico de miocitos 2C Meox1 Proteína de la homeobox MOX-1 MET Microscopia electrónica MO / BM Médula ósea MRF4 Factor regulador del músculo 4, Factor miogénico 6, Herculina Myf5 Factor miogénico 5 MyHC Cadena pesada de miosina MyoD1 Proteína de determinación de mioblastos 1 Pax3 Factor de transcripción Paired box 3 Pax7 Factor de transcripción Paired box 7 PCR Reacción en cadena de la Polimerasa PD Duplicaciones celulares PFK Fosfofructocinasa 13 PPAR α / γ Receptor activado por proliferadores de peroxisomas α / γ PPIA Ciclofilina A PPRE Elemento de respuesta a PPARs qPCR Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real RPL13a Proteína ribosomal L13a RT-PCR Reacción en cadena de la Polimerasa tras transcripción reversa Six1 Proteína de la homeobox SIX-1 TGF-β1 / β3 Factor de crecimiento transformante β1 y β3 WB Western blot YWHAZ Proteína de activación de la Tirosin-3-monooxigenasa y Triptófano-5- monooxigenasa 14 1. INTRODUCCIÓN El crecimiento del sector pecuario, impulsado por la industrialización de la producción y el incremento de la demanda de los productos de origen animal, exige una mejora en la capacidad de producción y en la calidad de los productos ofertados a los consumidores. Por lo que, en el caso de los productos cárnicos, es necesario el conocimiento de los mecanismos celulares y moleculares que regulan tanto el metabolismo energético como los procesos de diferenciación y desarrollo de los tejidos muscular y adiposo. A la par del entendimiento de estos procesos se requiere el desarrollo de nuevas tecnologías con el fin de incrementar la eficiencia de las diferentes especies pecuarias. Dentro de estas nuevas tecnologías, se encuentra el uso potencial de moléculas sintéticas o naturales, que, mediante la regulación de la expresión génica, modifiquen positivamente el metabolismo y diferenciaciónde los tejidos muscular y adiposo. En este sentido los Receptores Activados por Proliferador de Peroxisomas (PPARs) son blancos potenciales de estas tecnologías al ser factores de transcripción relacionados con la regulación del metabolismo energético y con la diferenciación celular. Por otro lado las células troncales mesenquimales (CTM) son células multipotenciales capaces de dar origen a diversos tejidos (adiposo, óseo, muscular, neuronal, entre otros). Esta propiedad de las CTM las hacen un modelo atractivo para el estudio de los mecanismos implicados en la diferenciación celular por lo que en el presente trabajo se les utilizó como modelo biológico para evaluar el efecto de diferentes compuestos que modificaran la actividad de los PPARs y con ello la capacidad de diferenciación y el metabolismo energético de estas células ya diferenciadas hacia los linajes muscular y adiposo. 15 2. ANTECEDENTES CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES: BIOLOGÍA, CARACTERIZACIÓN Y FUTURAS APLICACIONES EN SALUD Y PRODUCCIÓN DE ESPECIES PECUARIAS. PARTE I Rosa M. Pérez-Serrano, Jesús J. Ramírez-Espinosa, Armando Shimada, Anaid Antaramian, Enrique Piña, Ofelia Mora CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES: BIOLOGÍA, CARACTERIZACIÓN Y FUTURAS APLICACIONES EN SALUD Y PRODUCCIÓN DE ESPECIES DOMÉSTICAS Y PECUARIAS. PARTE II Rosa M. Pérez-Serrano, Jesús J. Ramírez-Espinosa, Armando Shimada, Anaid Antaramian, Enrique Piña, Ofelia Mora Artículos publicados en: Agrociencia, Vol. 46, No 4 y 6 respectivamente. 16 , " IJ ' .\\ . , ." '" " "..., "",.. "./1" ~ .\I •. ~ """ , ~ .... ( '" "" ' "" ~ : o('N , , un;I." "",,-ICACI()KU; ",. :!.<!XI> Y l"IIOOua:J<">N O& E..<rOC!r.s JUU\O.W. P"O'" ~"L'" 'O' ..... " '" Ull>< ,"""'-'< O","""" ,'"'"" .... -'-'U W "' .. , ..... . """,,, "' .,,'" ~. H " ". " " ' " "'" <. , ....... " .,,,,,,,,- ,. .. , ... 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H, 'l~ ~~ j t~ ~ t ~¡~ ii i ·~p ; 1: -. j, > ~i I ~- "¡~ H; l: ·t t . ',' .. "<- t' ¡- I, .t '~ -, " ', ,'l " ,. ,! ~ ,,~ ~. ~ , ~ " . , - , - ~ , .. . " ,, ', ' - . ; H , 1 r i ~ n . i ' ~ ~ ¡; ~ " _; : ". !r ' i: ¡} ~. ~, .. ,; " t. ~ "~ ~ ,. H t· :~ ~~ l¡ ' . '1- :' r ' , " j i 'i j O. ; .,. :r ,. I~ '~ i ~~ í .. " ' ~l ~j ;_ ;~ t~ <~ :) r¡ , ~~ ': 't .!l r! !f 'i i! ¡; d P " ~~ !; ,,!, t" ~~, ,' ¡- n -i t! _ "1 ~~ I ~ p~ ~1 1. ~: 'fi ~¡ ! l ~ ~1~ 1 :. ! rr ft~ E }~ ~; f'! .~ !F P -ü í ff· t~· ~: r\ b • ~ _, "- ,r , ~- ". "q l ~~ _I' ~" . l. ,. ¡t ·f " I" ·t '· , .- , ~ , " - ~ ' " , - . , . • - ! . ' .' ~ ' d <,-; h ¡l u[ !. ,·,r nlq ~, pf :~ ~~ ~ ¡il "·~ iJ ~I ~; .. , : ¡ H rj i ¡ "' [' ; ~ !. I , . ~ 1-' ~ ¡ -- i d " " " 1 .¡ . ~ ~~ t > ! ., . ,~ ~. td .¡ ~' ~~ ; r~ i : ~_~ ~ ;t H l '~F 'n d . . i., ,'¡ I~ ~;' ) ~. ¡ j !l ¡ >'~ d P , . . • " 'd . 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Evaluar el efecto de compuestos agonistas de PPAR, naturales o sintéticos, sobre el desarrollo, diferenciación y metabolismo energético de células mesenquimales obtenidas de médula ósea de bovino diferenciadas hacia los linajes muscular y adiposo. 3.2 Objetivos Específicos. 1) Establecer cultivos primarios de células troncales mesenquimales (multipotenciales) obtenidos de médula ósea de bovinos. 2) Estandarizar un sistema de cultivo-diferenciación de células multipotenciales hacia los linajes muscular y adiposo. 3) Conocer los cambios en la expresión de diferentes factores de transcripción asociados a la diferenciación muscular o adiposa. 4) Manipular diferentes factores de transcripción usando agonistas (naturales o sintéticos) que permitan una mejor diferenciación de ambos tipos celulares así como conocer sus efectos en el metabolismo energético. 43 4. MATERIAL, METODOS Y RESULTADOS. Bovine (Bos taurus) bone marrow mesenchymal cells differentiation to adipogenic and myogenic lineages. Jesús Jonathan Ramírez-Espinosa, Laura González-Dávalos, Armando Shimada, Enrique Piña, Alfredo Varela-Echavarría, y Ofelia Mora Artículo aceptado para publicación en Cell Tissue Organs 44 ~ ~_."..-"Ju -. ,..""" ,- ... , ~""" ..... ~.~- 00 ..... " h« •. ..,no._ ..,.~,t:.., .... " , . "~-- "" .. ",-,,~ ., ~""H lO "' ... , H"""" C'Io"-' 'I>~U"" ,'''"''''",,; .... >k._ """""" T", ..,...., 1"'" ....... , ..... """"" '"" ""'" _ ,.,.. • ...,........, lo ~ .. ~ ,.,......,u_ A ..... · R_, ' . C.=-niJ". I "'''''''' .. , 9 .... ' , '" .......... , . ...,-. ,~. ", .. U . ......... '0'00 '" _ ., ... flt .. ,~ ....... """ _ ... CELL..i T "", "EO """""5 ~ "'" 'Are. ~'"",lue'~ . ", ... .--. .. _ r.~"" ,.,.,.... ., ...,..<c. """""',.., ... , •• "" .... -. _, . ..... '0 1.,""'" .... ," ~~ .. , , ._" " :n; ''''. r . " ., "'" "" , ,... .... ...-.. _ 45 Bovine (Bos taurus) bone marrow mesenchymal cells differentiation to adipogenic and myogenic lineages J.J. Ramíreza, L. González-Dávalosb, A. Shimadab, E. Piñac, A. Varela-Echavarriad and O. Morab a Programa de Posgrado en Ciencias