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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL "EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE FRUCTOOLIGOSACÁRIDOS EN PERROS ADULTOS DE RAZA PEQUEÑA Y SU REPERCUSIÓN EN LA CONCENTRACIÓN DE AMONIACO Y UREA SÉRICOS" TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS PRESENTA: DAVID ARIAS HERNÁNDEZ TUTORA: DRA. DINORAH VARGAS ESTRADA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA COMITÉ TUTORAL: DR. CARLOS GUTIÉRREZ OLVERA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DRA. MARIA JOSEFA BERNAD BERNAD FACULTAD DE QUÍMICA MÉXICO,D.F. NOVIEMBRE DE 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DEDICADA A la memoria de mi abuelo el señor Elpidio Hernández Ramírez. A mi novia, madre, hermanos y sobrinos. A mi familia. AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM por permitirme realizar mis estudios de maestría en su programa de posgrado. A la Universidad Nacional Autónoma de México por el apoyo recibido a través del programa PAEP. A CONACYT por el financiamiento otorgado para la realización de mis estudios de maestría. Al Dr. Carlos Gutiérrez Olvera por sus enseñanzas, por el apoyo en la realización del experimento y por su tutoría. A la Dra. Dinorah Vargas Estrada por todo su apoyo. A la MC. Ma. Guadalupe Sánchez González por su apoyo en la realización del análisis estadístico. Al Dr. Jan Bouda por sus recomendaciones y consejos para el mejoramiento de esta tesis. A los miembros del jurado por sus recomendaciones: Dr. Gerardo Garza Malacara, Dra. Norma González Monzón y Dr. Antonio Díaz Cruz. A todos aquellos que de alguna manera de cerca o lejos contribuyeron en la realización de este trabajo. A los perros que involuntariamente participaron en el experimento. I CONTENIDO Página RESUMEN................................................................................................. 1 ABSTRACT................................................................................................ 2 I. REVISIÓN DE LA LITERATURA............................................................ 1.Introducción....................................................................................... 3 3 2. Fructooligosacáridos......................................................................... 4 2.1 Estructura química de los FOS................................................ 5 2.2 Propiedades físico químicas.................................................... 6 2.3 Producción de FOScc.............................................................. 7 2.4 Fuentes de FOS...................................................................... 7 2.5 Valor calórico de FOS.............................................................. 9 3. Microbiota intestinal de perros.......................................................... 10 4. Prebióticos........................................................................................ 12 4.1 Propiedades de los prebióticos................................................ 13 4.2 Fibra soluble............................................................................ 14 4.3 Efectos de los prebióticos........................................................ 14 4.4 Fuentes de prebióticos............................................................ 15 4.4.1 Fuentes naturales........................................................... 15 4.4.2 Producción industrial...................................................... 16 4.5 FOS como prebióticos............................................................. 17 4.7 Efectos gastrointestinales de los FOS en animales no rumiantes................................................................................. 18 4.8 Efecto sistémicos de los FOS en animales no rumiantes......... 19 4.9 Efecto de los FOS sobre la uremia y el metabolismo del nitrógeno................................................................................... 21 4.9.1 Beneficios del aporte de FOS en dietas para perros con insuficiencia renal..................................................... 23 4.9.2 Efecto en la modulación del ciclo entero hepático de la II urea y amoniaco.............................................................. 24 II. JUSTIFICACIÓN.................................................................................... 26 III. HIPÓTESIS........................................................................................... 27 IV.OBJETIVOS.......................................................................................... 27 V. MATERIAL Y MÉTODOS...................................................................... 28 1. Animales y dieta............................................................................... 28 2. Colección de muestras..................................................................... 29 3. Procesamiento de muestras............................................................. 30 4. Análisis estadístico........................................................................... 31 VI. RESULTADOS..................................................................................... 32 1. Amoniaco.......................................................................................... 32 2. Urea.................................................................................................. 33 VII. DISCUSIÓN........................................................................................ 35 VI. CONCLUSIÓN..................................................................................... REFERENCIAS......................................................................................... 40 41 III LISTA DE CUADROS Página Cuadro 1 Contenido de FOS en alimentos para mascotas y otros ingredientes alimenticios 8 Cuadro 2 Función de la microbiota intestinal en el tubo gastrointestinal normal. 11 Cuadro 3 Grupos bacterianos predominantes en el tubo digestivo de perros y gatos. 12 Cuadro 4 Tipos y fuentes de prebiótico 16 Cuadro 5 Análisis químico del alimento 29 Cuadro 6 Concentración de amoniaco sérico en los perros suplementados con FOS desde el día cero hasta el día 42. 32 Cuadro 7 Efecto del tiempo en la concentración de amoniaco de los muestreos en el experimento. 33 Cuadro 8 Concentración de urea sérica en los perros suplementados con FOS desde el día cero hasta el día 42. 34 Cuadro 9 Estudios analizadosdel efecto de los prebióticos en perros. 39 IV LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 Estructura química de los FOScc. 5 Figura 2 Fórmula para calcular requerimiento energético de perros adultos activos. 30 Figura 3 Analizador bioquímico IDEXX VetTest® 8008 utilizado para la obtención de las mediciones de concentraciones de amoniaco y urea séricos. 31 Arias-Hernández, D. 1 RESUMEN. Se ha demostrado que las fibras solubles pueden modular las concentraciones de urea y amoniaco séricos en perros. Sin embargo, su eficacia depende de su origen, propiedades físicas, la fermentabilidad en el intestino grueso y de la dieta del animal. Trece perros adultos sanos de raza pequeña fueron alimentados con una dieta comercial de baja calidad complementada con fructooligosacáridos (FOS). Fueron divididos en tres grupos: Testigo (n=4), FOS1 (n=4) y FOS2 (n=5), a los grupos FOS1 y FOS2 se les complementó en el alimento con 1 y 2 g de FOS respectivamente por perro al día, durante 42 días. Se tomaron muestras sanguíneas al día cero, a los 21 y 42 días. Se midieron las concentraciones de amoniaco (NH3) y urea séricos. Se compararon las medias entre los tres tratamientos y dentro de cada tratamiento en el tiempo con un análisis multivariante de la varianza. En las variables NH3 y urea para el efecto de la interacción tratamiento-muestreo no se encontró diferencia estadística (P>0.05). Las dosis bajas de FOS pueden ser rápidamente fermentadas por las bacterias intestinales, utilizando como fuente de nitrógeno el aportado por la proteína dietaria. Los resultados arrojados en el análisis realizado a los muestreos a través del tiempo para NH3 mostró diferencia (P<0.05) entre el día 0 al 21 habiendo mayor concentración en el 21 y siendo menores al 42, la hidrólisis de urea y la desaminación bacteriana de proteína de la dieta producen amoniaco pudiendo ser absorbido por el colon si este no es utilizado. Los resultados arrojados por el estudio sugieren que la eficacia en la utilización de los FOS como fuente de energía para la microbiota del intestino grueso y la utilización del nitrógeno ureico endógeno para su síntesis proteica, puede ser afectada por la dosis administrada de FOS y por la calidad de los ingredientes utilizados en la dieta. PALABRAS CLAVE: perros, fructooligosacáridos, microbiota, intestino, urea, amoniaco. Arias-Hernández, D. 2 ABSTRACT. It has been shown that the soluble fibers can modulate serum concentrations of urea and ammonia in dogs. However, its effectiveness depends of its origin, physical properties, fermentability in the large intestine and the animal's diet. Thirteen adult dogs healthy of small breed were fed a low-quality commercial diet supplemented with fructo-oligosaccharides (FOS). They were divided into three groups: Control (n=4), FOS1 (n=4) and FOS2 (n=5), the FOS1 and FOS2 groups were supplemented in the food with 1 g and 2 g of FOS, respectively per dog per day during 42 days. Blood samples were taken at 0, 21 and 42 days. Concentrations of ammonia (NH3) and serum urea were measured. Means between the three treatments within each treatment over time with a multivariate analysis of variance were compared. The variables NH3 and urea to the effect of treatment-sample interaction no statistical difference (P > 0.05) was found. Low doses of FOS can be rapidly fermented by intestinal bacteria, using as the source of nitrogen contributed by dietary protein. The results obtained in the analysis of the samples over time for NH3 showed difference (P < 0.05) from day 0 to 21 having the highest concentration being 21 and under 42, hydrolysis of urea and bacterial deamination protein diet produce ammonia which can absorbed by the colon if not used. Results from this study suggest that the effectiveness of the use of FOS as a energy source for microbiota the large intestine and the use of endogenous urea nitrogen for protein synthesis can be affected by the dose of FOS administered and the quality of the ingredients used in the diet. KEYWORDS: dogs, fructo-oligosaccharides, microbiota, gut, urea, ammonia. Arias-Hernández, D. 3 I. REVISIÓN DE LA LITERATURA 1. Introducción Actualmente se acepta que una dieta nutricionalmente equilibrada y un ambiente microbiano adecuado son necesarios para la salud intestinal , por lo que el uso de probióticos y prebióticos se ha incrementado con el fin de mantener una microflora equilibrada y promover la salud intestinal (Swanson, et al. 2002; Suchodolski 2011). Los prebióticos son ingredientes alimentarios no digeribles que afectan benéficamente al huésped estimulando selectivamente el crecimiento y actividad de las bacterias o de un número limitado de éstas en el colon, además pueden reprimir el crecimiento de bacterias patógenas mejorando la salud del huésped (Gibson et al. 2004).El uso de prebióticos y probióticos o la combinación de los dos, se ha convertido en un área de actividad de la investigación en nutrición humana y animal (Blaut 2002; Al-Sheraji et al. 2013; Wang 2009). Los fructooligosacáridos (FOS) pertenecen a una clase de carbohidratos conocidos como fructanos que son considerados nutracéuticos por su efecto prebiótico, los cuales estimulan el crecimiento y actividad de la microfolora colónica, afectando algunos de los procesos fisiológicos y bioquímicos en humanos, ratas (Kaur & Gupta 2002; Kanakupt et al. 2011), cerdos, perros, gatos y otras especies (Flickinger et al. 2003). Los FOS alteran la composición de la flora microbiana intestinal, lo cual resulta en una comunidad bacteriana predominante de bifidobacterias y la reducción de bacteroides, fusobacterias y clostridios. Otros efectos fisiológicos de la adición de FOS a la dieta es la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) como el acetato, butirato y propionato, lactato y gases como metano y dióxido de carbono, producto de la digestión, siendo el 95% de los ácidos absorbidos por el colon (Yun 1996; Roberfroid 2000; Mabel et al. 2008). Arias-Hernández, D. 4 Estudios han demostrado que la adición de fructanos en la dieta disminuye el pH cecal, disminuye la constipación, aumenta la absorción de Ca y otros minerales, reducen la glucemia posprandial y la insulinemia, reduce las concentraciones de triglicéridos en sangre e hígado y disminuye los nivele de colesterol sérico, otros estudios han demostrado que aumenta la excreción de nitrógeno fecal y disminuye la excreción renal del nitrógeno y además inhiben las lesiones pre neoplásicas en colon (Younes et al. 1997; Younes et al. 1998; Roberfroid & Slavin 2000). 2. Fructooligosacáridos Los fructooligosacáridos (FOS) son fructanos. Fructano es un término general utilizado para cualquier carbohidrato en el que los enlaces fructosil- fructosa constituyen la mayoría de los enlaces glucosídicos. El número de unidades de fructosa difiere de 2 a más de 70. (Roberfroid 2000). Los FOS son oligosacáridos lineales que están formados de dos a diez monómeros de fructosa, si tienen de dos a cuatro monómeros de fructosa son conocidos como FOS de cadena corta (FOScc) o FOS de cadena larga (FOScl) si contienen de cinco a diez monómeros, estos monómeros están unidos por enlaces β(2-1) y tienen una molécula de glucosaen su extremo terminal unida con un enlace α(1-2) (Yun 1996; Kaur & Gupta 2002; Flickinger et al. 2003; Roberfroid 2007). Debido a la β configuración del carbono dos anomérico en los monómeros de fructosa, (Roberfroid 2000; Kaur & Gupta 2002), estos fructanos son resistentes a la hidrólisis por las enzimas digestivas de los animales no rumiantes (α -glucosidasas, maltasas, isomaltasas, sacarasas) que son específicos para enlaces α glicosídicos (Kaur & Gupta 2002; Flickinger et al. 2003; Roberfroid 2007). http://es.wikipedia.org/wiki/Oligosac%C3%A1rido http://es.wikipedia.org/wiki/Mon%C3%B3mero http://es.wikipedia.org/wiki/Fructosa http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa Arias-Hernández, D. 5 2.1 Estructura química de los FOS Los FOS de cadena corta constituyen una serie de oligosacáridos homólogos extraídos de las plantas de achicoria, alcachofa de Jerusalén espárragos, entre otras plantas o sintetizada a partir de la sacarosa, generalmente representado por la fórmula GFn, son un grupo glucosil lineal α(1-2) (fructosil)n, β(2-1) polímeros de fructosa con un grado de polimerización (GP) a partir de n = l hasta 5 (Yun 1996, Bornet et al. 2002). (Figura 1) Figura 1. Estructura química de los FOScc Modificado por (Bornet et al. 2002). 2.2 Propiedades físico químicas Los FOScc forman finos cristales blancos muy rápido. La rotación específica ([α] D 20) y la temperatura de fusión de I- kestosa son 28.5° y 199-200 ° C respectivamente. La dulzura relativa de 1-kestosa, nistosa, and 1 F- fructofuranosil nistosa en comparación con una solución de sacarosa al 10% G G G F F F F F F F F F GF2 1-kestosa GF3 nistosa GF4 fructosil- nistosa Glucosil α (1-2) Fructosa (sacarosa) (Fructosil)n β(1-2) Fructosa (FOScc: n=1 a 3) Estructura Química de los FOS cc Glucosil α (1-2) (fructosil)n β (2-1) fructosa Arias-Hernández, D. 6 son de 31, 22 y 16%, respectivamente. Los FOS son altamente higroscópicos; es difícil mantener los productos liofilizados estables en condiciones atmosféricas durante períodos prolongados. La viscosidad de una solución de FOS es relativamente mayor que el de la sacarosa cuando están en la misma concentración y la estabilidad térmica es también más alta que el de la sacarosa. Además, los FOScc son muy estables en medios con pH (4.0-7.0) y a temperaturas de refrigeración (8-4°C) durante más de un año (Yun 1996). 2.3 Producción de FOScc La producción de FOS se lleva a cabo por dos diferentes procesos, uno de ellos es por transfructosilación (intercambio de residuos fructosa), empleando enzimas fructosiltransferasas como la enzima β-fructosidasa de Aspergillus niger sobre un sustrato de sacarosa o bien por la hidrólisis parcial de la inulina utilizando una enzima conocida como endoinulinasa, el producto final resultante posee una fórmula general Glucosa- α(1-2)- (Fructosil)n- β (1-2)- Fructosa, (Yun 1996; Roberfroid & Slavin 2000; Bornet et al. 2002; Mussatto & Mancilha 2007) En la producción de FOScc a partir de la sacarosa, esta tiene un doble papel importante el cual es aceptar y donar fructosas. Dependiendo de las condiciones de reacción, las fructosiltransferasas son capaces de realizar varias reacciones, pueden sintetizar un polímero transfiriendo la fructosa a las cadenas que van creciendo, o bien, pueden hidrolizar la sacarosa. Cuando se agrega una molécula ajena al medio de reacción, molécula a la que se denomina “aceptor”, la enzima puede transferirle también fructosa, dando lugar a la molécula fructosilada, es decir, un “fructósido” (Bornet et al. 2002; Olvera et al. 2007). La primera reacción en presencia de sacarosa es producir kestosa más glucosa, la acción de la fructiniltransferasa sobre la http://es.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger http://es.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger Arias-Hernández, D. 7 kestosa produce nistosa y la reacción sobre esta produce fructosil nistosa (Bornet et al. 2002). La enzima endoinulinasa rompe los enlaces glucosídicos de la inulina de achicoria produciendo FOS (glucosil α(1-2)(fructosil)n β(2-1) n=1 a 6) y oligofructosa (fructosil β(2-1)(fructosil)n β(2-1) n=2 a 7) (Bornet et al. 2002). 2.4. Fuentes de FOS Las especies de plantas que contienen fructanos se encuentran en la familia de mono y dicotiledóneas, tales como Liliaceae, Amaryllidaceae, Gramineae y Compositae. Los FOS se encuentran en diferentes verduras y plantas como: Los espárragos, achicoria, jitomates, trigo, cebolla, ajo, plátano, puerro y alcachofa de Jerusalén. El ajo contiene la mayor concentración de fructanos seguida por el trigo y la cebolla que contienen cantidades similares. Algunos estudios concluyeron que la oligofructosa y la inulina están presentes en cantidades significativas en una amplia variedad de los alimentos comunes y en ingredientes alimentarios y que diversas plantas también contienen fructanos como los espárragos, alcachofa de Jerusalén, achicoria, entre otras (Roberfroid & Delzenne 1998; Roberfroid 2007; Kaur & Gupta 2002). Las concentraciones de los tres subcomponentes principales de oligofructosa (1-kestotriosa, 1,1 -kestotetraosa y 1,1,1-kestopentaosa) se encuentran en ingredientes para la alimentación animal y se ha determinado que el trigo y sus productos (salvado y germen) contenía las concentraciones más altas de fructanos totales, seguido de la cáscaras de cacahuate, la harina de alfalfa y la cebada. Otros ingredientes como el gluten de maíz, la harina de avena, el salvado de arroz, la pulpa de remolacha, la cáscara de soya y la canola contienen concentraciones muy bajas de oligofructosa (<0,4 mg/g) (Flickinger et al. 2003). Sin embargo, sólo un número limitado de especies son aptas para la industria de la alimentación. A pesar del alto contenido de fructanos de muchas gramíneas, particularmente de plantas Arias-Hernández, D. 8 jóvenes (hasta 70% de su peso seco), en pastos y cereales no se realiza la extracción y procesamiento industrial de fructanos. Por el contrario, en las familias de Liliaceae, Amaryllidaceae y Compositae, los fructanos se suelen almacenar en los bulbos, tubérculos y sus raíces tuberosas y debido a la ausencia de componentes que interfieren, pueden ser fácilmente extraídos y procesados (Roberfroid & Delzenne 1998) (Cuadro 1). Cuadro 1. Contenido de FOS en alimentos para mascotas y otros ingredientes alimenticios. Modificado de (Flickinger et al. 2003) Ingrediente Contenido de FOS mg/g materia seca Harina de alfalfa Cebada Pulpa de remolacha Harina de canola Gluten de maíz Harina de gluten de maíz Avena Granos de avena Cáscara de cacahuate Salvado de arroz Cáscaras de soya Trigo Salvado de trigo Germen de trigo Subproductos de trigo 2.24 1.92 0.05 0.04 0.09 0.34 0.036 0.012 2.40 0.14 0.12 1.36 4.0 4.68 5.07 Las dos especies de plantas más utilizadas actualmente por la industria productora de inulina y FOS son: las achicorias (Cichorium intybus) y alcachofa Jerusalem (Helianthus tuberosus). La mayor parte de la inulina y oligofructosa son extraídas de las raíces de achicoria (contiene aproximadamente 150 a 200 mg/g de inulina y de 80 a 120 mg/g Arias-Hernández, D.9 oligofructosa), utilizándola como fuente para producir FOS por degradación de la inulina (Yun 1996; Roberfroid & Delzenne 1998; Kaur & Gupta 2002). 2.5 Valor calórico de FOS Los FOScc llegan al intestino grueso intactos donde son fermentados e hidrolizados por las bacterias sacarolíticas, tienen como resultado la producción de AGCC, ácido láctico, gases, contribuyendo al mantenimiento y crecimiento bacteriano, además, hay disipación de calor, teniendo una pérdida de energía que se estima que es igual al 50% del contenido total de energía de los carbohidratos y mostrándose, en algunos estudios, que hasta el 7% de la energía metabólica de los perros y en menor medida en los gatos, se produce por fermentación microbiana en el colon (Suchodolski 2011) . Los carbohidratos de la dieta que son absorbidos como monosacáridos (glucosa, fructosa, entre otros) tienen un valor calórico de 3,9 kcal/g. Dependiendo del grado de fermentación en el intestino grueso y el modelo utilizado para su medición, el valor calórico de tales carbohidratos no digeridos, pero fermentados, varía entre 0 y 2,5 kcal/g. El valor calórico de un residuo fructosil de inulina de achicoria y de oligofructosa se ha calculado que es del 25 al 35% menor que el de una molécula de fructosa completamente digerida y absorbida, dando un valor calórico de 1,5 kcal/g (Roberfroid 1999). Mientras que otros estudios calcularon el valor energético para carbohidratos no digestibles, pero fermentados en intestino grueso entre un rango de 1.5 a 2 kcal/g (Flamm et al. 2001). La estimación del valor energético para FOS está entre 2 a 2.2 kcal/g (Bornet et al. 2002). Arias-Hernández, D. 10 3. Microbiota intestinal de perros La microbiota del tubo digestivo está compuesta por diferentes microorganismos entre los que se encuentran: bacterias, arqueas, hongos, protozoos y virus. Estudios han revelado que el tubo digestivo de los mamíferos alberga de cientos a miles de filotipos de bacterias, se estima que contiene aproximadamente de 1010 a 1014 microorganismos. La interacción compuesta por las células huésped y los microorganismos residentes se le conoce como microbiota intestinal. Estos microorganismos desempeñan un papel crucial en la salud del huésped. Ellos actúan como una barrera de defensa contra los patógenos invasores, ayuda en la digestión y la obtención de energía de la dieta, proporcionan apoyo nutricional para los enterocitos y estimulan el desarrollo del sistema inmune. La composición de la microbiota intestinal puede verse influida hasta cierto punto por factores externos, como la dieta. Sin embargo, la microbiota es resistente a la mayoría de las influencias ambientales, volviendo rápidamente a su estado normal. Cada compartimento intestinal alberga un microbioma único esto es debido a las diferencias anatómicas y fisiológicas existentes en cada porción intestinal (Suchodolski 2011). Los microorganismos habitan nichos que les proveen sustratos y nutrientes del huésped para sus funciones especializadas y a cambio, proporcionan productos y metabolitos útiles para éste. (Cuadro 2) Cada perro contiene un muy singular e individual perfil en su contenido de microorganismos, la principal diferencia existe en las especies bacterianas contenidas en cada huésped, también en el contenido y en el total de bacterias de cada compartimento del tubo digestivo. Arias-Hernández, D. 11 Cuadro 2. Función de la microbiota intestinal en el tubo gastrointestinal normal. Tomado de (Suchodolski 2011). Actividad microbiana Productos Representativas Descarboxilación, desaminación de AA Amoniaco Clostridium spp., Peptostreptococcus spp., Peptococcus spp. Desconjugación / deshidroxilación de ácidos biliares Ácidos biliares secundarios (colato / desoxicolato) Clostridium hiranonis, Lactobacillus spp. Síntesis de vitamina Vitamina K2, B12, biotina, ácido fólico Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Sphingomonas spp., Lactobacillus spp. Fermentación carbohidratos Lactato, propionato, acetato, butirato Clostridium cluster XIVa, Prevotella spp., Faecalibacterium spp., Bifidobacterium spp. Fermentación AA Hidrógeno, el metano, aminas, fenoles, NH3, ácidos orgánicos, de sulfito de hidrógeno y Sulfate-reducing bacteria (SRB), Desulfovibrio spp., Clostridium spp., Peptostreptococcus spp. Degradación de oxalato Formato y CO2 Oxalobacter formigenes Degradación del inulina y almidón Lactato Bifidobacterium spp. Metabolismo de H2, alcoholes y ácido acético Metano y CO2 Methanobacteria El estómago alberga entre 101 y 106 ufc/g de bacterias. Los conteos bacterianos en el duodeno y yeyuno son normalmente pequeños (105 ufc/mL de contenido), pero puede alcanzar hasta 109 ufc/mL en algunos perros y gatos. El íleon contiene una microbiota más diversa y con un mayor número de bacterias (107 ufc/mL). Los conteos bacterianos en colon van de 109 y 1011 ufc/g de contenido. Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium spp. y Enterobacteriaceae son los grupos predominantes de bacterias que se han cultivado en perros y gatos. Las bacterias aeróbias y anaerobias facultativas se encuentran en mayor cantidad en el intestino delgado, mientras que las anaerobias predominan en el intestino grueso (Suchodolski 2011). (Cuadro 3) Arias-Hernández, D. 12 Cuadro 3. Grupos bacterianos predominantes en el tubo digestivo de perros y gatos. Modificado de (Suchodolski 2011). 4. Prebióticos Actualmente se sabe que la microflora del colon tiene una gran influencia en la salud. En consecuencia, existe un gran interés en el uso de ingredientes funcionales como prebióticos para manipular la composición de la microflora del colon con el fin de mejorar la salud (Al-Sheraji et al. 2013; Manning & Gibson 2004; Wang 2009). Los prebióticos se definen como: "ingredientes fermentados selectivamente que permiten cambios específicos en la Resultados de cultivos Resultados gen16S RNA FISH 1 Grupo bacteriano Cantidad Log cfu/g Grupo bacteriano % ST 2 . Grupo bacteriano Log10 cels/g heces Intestino delgado Barras en espiral Bacteroides Lactobacillus sp. Streptococcus spp. Escherichia coli C. perfringens 3.0 a 6.8 0 a 5.5 1.0 a 5.4 3.0 a 5.2 2.3 a 5.0 1.0 a 2.5 Clostridiales Enterobacteriales Lactobacillales Bacteroidales Campylobacterales Actinomycetales Fusobacteriales Pasteurellales Spirochaetes 30 a 50 20 a 60 5 a 30 0 a 5 0 a 2 0 a 3 0 a 10 2 a 5 0 a 12 N/A Intestino grueso Bacteroides Bifidobacterium spp. C. perfringens Clostridium spp. E. coli Lactobacillus spp. Prevotella Ruminococcus Staphylococcus spp. Streptococcus spp 7.3 a 10.2 8.0 a 10.0 5.5 a 8.0 7.3 a 9.5 6.4 a 8.6 5.5 a 9.0 7.0 a 8.5 7.0 a 8.0 5.2 a 5.3 8.8 a 9.1 Aeromonadales Bacteroidales Bifidobacterium sp. Coriobacteriales Clostridiales Enterobacteriales Erysipelotrichales Fusobacteriales Lactobacillales 0.2 a 0.5 0.5 a 35 N/A 1 a 2.5 10 a 78 0.1 a 2 0 a 8 0.3 a 25 1 a 5 Bacteroides spp. Bifidobacterium spp. C. cluster IX C. cluster XI C. histolyticum group Desulfovibrio Escherichia coli Eubacterium Lactobacillus 9.1 8.3 a 9.3 8.3 8.03 7.9 a 8.0 7.3 6.9 9.2 8.6 a 9.4 1 FISH= hibridaciónin situ fluorescente. 2 %ST= Porcentaje secuencia total. N/A= No aplica. Arias-Hernández, D. 13 composición o actividad de la microflora intestinal que confiere bienestar y salud 4.1 Propiedades de los prebióticos Para que un ingrediente alimenticio pueda ser clasificado como prebiótico tiene que cumplir con al menos tres criterios; el sustrato debe resistir la acidez del estómago y a la hidrólisis de las enzimas digestivas de los no rumiantes, debe ser selectivamente benéfico para las bacterias del colon, tales como las bifidobacterias o lactobacilos y la fermentación del sustrato debe inducir efectos beneficiosos locales y sistémicos en el huésped (Manning & Gibson 2004; Gibson et al. 2004; Al-Sheraji et al. 2013). Los prebióticos conocidos están compuestos principalmente a partir de glucosa, fructosa, galactosa y xilosa. El enlace entre los monosacáridos es un factor crucial en la determinación tanto de la selectividad para la fermentación y la digestibilidad en el intestino delgado. La fermentación de los FOS es selectiva debido a un b- fructofuranosidasa asociada a las células en las bifidobacterias. La mayoría de los prebióticos actuales son relativamente pequeños, con excepción de la inulina. Los oligosacáridos deben ser hidrolizados por bacterias antes de la absorción de los monosacáridos resultantes. Por lo tanto, se asume que cuanto más largo es el oligosacárido más lenta es la fermentación, por ello el efecto prebiótico penetrará con mayor eficacia en todo el colon. Por ejemplo, la inulina de cadena larga puede ejercer un efecto prebiótico en regiones más distales del colon en comparación con los FOS de menor peso molecular, que pueden ser fermentados más rápidamente en el intestino grueso proximal (Manning & Gibson 2004). Arias-Hernández, D. 14 3.2 Fibra soluble Las fibras se describen como polisacáridos no amiláceos. La fibra dietaria incluye los azucares más lignina que no se hidrolizan y no son absorbidos en la parte superior del tubo gastrointestinal. Algunos constituyentes de las fibras son la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas, las gomas y los mucílagos. Las fibras pueden incluir también algunos compuestos no polisacáridos como puede ser la lignina (Mora et al. 2012). La fibra se ha dividido en dos grupos principales según sus características químicas y sus efectos en el organismo y se clasifica basándose en su grado de solubilidad en agua. Así, se puede mencionar a la fibra soluble, que está formada por componentes que captan mucha agua y son capaces de formar geles viscosos, se caracteriza porque sufren un proceso de fermentación por las bacterias del colon, donde se incluyen los almidones resistentes, las pectinas, las gomas, los mucílagos y los oligosacáridos. (Sastre 2003; Dikeman & Fahey 2006). La solubilidad y el tamaño de partícula de la fibra influyen en el aumento de la viscosidad del medio. (Dikeman & Fahey 2006). Las fibras solubles llegan el intestino grueso intactas, donde pueden ser fermentados total o parcialmente, también contribuyen a un aumento del volumen fecal, pueden contribuir directamente a través de su propia masa o por el agua que atraen. (Flamm et al. 2001; Escudero & González 2006). 4.3 Efectos de los prebióticos Los prebióticos son selectivamente utilizados por las bacterias benéficas de la flora intestinal (bifidobacterias y lactobacilos), pero no promueven patógenos potenciales, como clostridios, bacteroides proteolíticas y Escherichia coli toxigénica. http://es.wikipedia.org/wiki/Pectina http://es.wikipedia.org/wiki/Goma http://es.wikipedia.org/wiki/Muc%C3%ADlago http://es.wikipedia.org/wiki/Polisac%C3%A1rido http://es.wikipedia.org/wiki/Lignina Arias-Hernández, D. 15 Las especies de microorganismos colónicos desarrollan una serie de efectos ampliamente beneficiosos para el portador, entre los que se encuentran: producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), síntesis de vitamina K, intervención en procesos relacionados con la absorción del calcio, magnesio y hierro y la modulación del sistema inmunitario local(la producción más importante de inmunoglobulinas es gastrointestinal). Cuando los prebióticos alcanzan el colon, los componentes son hidrolizados a monómeros de fructosa por la acción de las enzimas extracelulares de las bacterias colónicas. El metabolismo de estos monómeros continúa en interior de la bacteria hasta la obtención de piruvato, a partir de la glucosa, en la vía metabólica de Embdem-Meyerhoff. Este piruvato es convertido en AGCC (acetato, propionato y butirato) y también en productos gaseosos finales: CO2, H2 y CH4. Los AGCC pueden ser metabolizados localmente o a nivel sistémico y proporcionar energía para el huésped (Delzenne & Roberfroid 1994; Sastre 2003; Manning & Gibson 2004). 4.4 Fuentes de prebióticos 4.4.1 Fuentes naturales Los prebióticos de origen natural se puede encontrar en diversos alimentos como: espárragos, achicoria, jitomates, trigo, cebolla, ajo, plátano, puerro y alcachofa de Jerusalén, sin embargo, los niveles en estos alimentos son demasiado bajos para ejercer algún efecto significativo en el huésped (Al- Sheraji et al. 2013; Kaur & Gupta 2002; Manning & Gibson 2004; Roberfroid 2007). (Cuadro 4) Arias-Hernández, D. 16 Cuadro 4. Tipos y fuentes de prebióticos. Tomado de (Al-Sheraji et al. 2013). Tipo Fuentes Fructooligosacáridos Isomaltulosa Xilooligosacáridos Galactooligosacáridos Ciclodextrinas Oligosacáridos rafinosa Lactulosa Oligosacáridos de soya Lactosacarosa Isomaltulosa Palatinosa Maltooligosacáridos Isomaltooligosacáridos Arabinoxilooigosacáridos Enzima dextrina resistente Espárragos, remolacha, ajo, achicoria, cebolla, alcachofa de Jerusalén, trigo, miel, plátano, cebada, jitomate y centeno. Miel y jugo de caña de azúcar Retoños de bambú, frutas, verduras, leche, miel y salvado de trigo Leche de humano y leche de vaca Glucanos solubles en agua Semillas de legumbres, lentejas, frijol, habas, garbanzos, compuesto de malva y Mostaza Lactosa (leche) Soya Lactosa Sacarosa Sacarosa Almidón Almidón Salvado de trigo Fécula de papa 4.4.2 Producción industrial Actualmente, la inulina y la oligofructosa es utilizada como ingrediente en muchos productos alimenticios. Los métodos de producción industrial se han utilizado para producir prebióticos a partir de otras fuentes naturales por medio de hidrólisis de polisacáridos, ya sea de tipo enzimática o química, a partir de síntesis de disacárido, por extracción directa para producir oligosacáridos de soya y rafinosa y se ha empleado la reacción de isomerización para producir lactulosa. (Mussatto & Mancilha 2007; Al-Sheraji et al. 2013) Arias-Hernández, D. 17 4.5 FOS como prebióticos Los fructooligosacáridos mejoran los índices de salud intestinal, ya que llegan al colon y sirven como una fuente de sustrato altamente digestible para las bacterias colónicas. El efecto nutricional más conocido de los oligofructanos es su capacidad para modificar la composición de la flora intestinal y la actividad metabólica en el intestino grueso. Los oligosacáridosprebióticos se fermentan en el colon, esta estimulación selectiva se produce porque estos fermentan fácilmente por tipos benéficos de bacterias y no pueden ser utilizados tan eficazmente por especies de bacterias potencialmente patógenas como los Staphylococcus, Salmonela, Listeria, Shigella, Escherichia coli, Veillonella y ciertas clostridias. Las bacterias que mejor utilizan los FOS son: las bifidobacterias, lactobacilos y eubacterias (Roberfroid 2000; Kaur & Gupta 2002; Flickinger et al. 2003). Los efectos bifidogénicos de los oligofructanos han sido demostrados en diferentes investigaciones, sin embargo, la microflora intestinal junto con los tipos de sustratos disponibles para la fermentación influye en el tipo de fermentación y por lo tanto en los productos generados (Swanson et al. 2002; Flickinger et al. 2003; Sastre 2003). 4.6 Efectos gastrointestinales de los FOS en animales no rumiantes. En los cerdos, perros y gatos, el intestino grueso es el sitio primario de la fermentación. El intestino grueso de las tres especies contiene un ecosistema microbiano complejo compuesto de un gran número de géneros y varios cientos de especies de bacterias, la mayoría de los cuales son anaerobios, sin embargo, el ciego de los cerdos es más desarrollado y contribuye a la fermentación bacteriana más que el ciego de los perros y gatos. A pesar de que la contribución de energía por la fermentación de fibra es mínima en perros y gatos, algunas investigaciones indican que la Arias-Hernández, D. 18 fermentación colónica contribuye a la salud intestinal y otros estudios han demostrado un efecto positivo en la suplementación con FOS en el intestino de los perros (Kaur & Gupta 2002; Swanson et al. 2002; Flickinger et al. 2003) y gatos (Kanakupt et al. 2011). Los FOS y la inulina son fermentados rápidamente en el colon produciendo AGCC. Cuando son fermentados in vitro con inóculo fecal de perro, la oligofructosa rápidamente produce altas concentraciones de AGCC (2.68, 1.49 y 0.27 mmol/g de materia orgánica de acetato, propionato y butirato, respectivamente, después de 12 horas de fermentación) según un estudio realizado por Sunvold et al., citado por Flickinger (Flickinger et al. 2003). Un efecto promotor de la salud está en la producción de AGCC. Los colonocitos dependen en gran medida de la disponibilidad de AGCC derivado de la fermentación bacteriana. Se ha demostrado que la oxidación del butirato compensa más del 70% del consumo de oxígeno por el tejido colónico humano, lo que indica que el butirato es el primer sustrato de energía del colonocito (Bornet et al. 2002). El butirato puede actuar como regulador de la expresión de genes involucrados en la proliferación y diferenciación del colonocito, además de disminuir el riesgo de cáncer de colon (Flickinger et al. 2003; Escudero & González 2006; Mussatto & Mancilha 2007). La disminución del pH en el colon y en consecuencia en las heces, resulta de la producción de AGCC. El pH bajo inhiben el crecimiento de ciertos patógenos bacterianos, mientras que estimula el crecimiento de las bifidobacterias y otras especies ácido lácticas (Roberfroid 2000; Flamm et al. 2001; Mussatto & Mancilha 2007). Una microbiota intestinal equilibrada prepara y estimula al sistema inmunológico, ayuda en la defensa contra la invasión de patógenos intestinales y proporciona nutrientes, ayudando al desarrollo y mantenimiento Arias-Hernández, D. 19 de la estructura intestinal. La microbiota es una parte integral de la barrera intestinal, que protege al huésped de la invasión de patógenos (mecanismo denominado resistencia a la colonización). Los mecanismos propuestos incluyen la competencia por oxígeno, nutrientes, sitios de adhesión a la mucosas y la creación de un ambiente fisiológicamente restrictiva para las especies bacterianas no residentes (Suchodolski 2011). El consumo de FOS se ha asociado con un efecto positivo en la inmuno- modulación del sistema inmune intestinal. Esto debido a la inmuno- rregulación por la secreción de inmunoglobulinas A e interferón α por las placas de peyer, el incremento de receptores de inmunoglobulinas poliméricas en el intestino de ratones y el aumento de tejido linfocítico en intestino (Roberfroid & Delzenne 1998). Se ha reportado que las bifidobacterias ejercen diversos efectos sobre la función del sistema inmune, tales como, actividad mitogénica, actividad adyuvante y presentación de los macrófagos. Por lo tanto, la estimulación de la producción de anticuerpos (Bornet et al. 2002). 4.7 Efecto sistémicos de los FOS en animales no rumiantes Los efectos de los fructanos tipo inulina sobre la glucemia y la insulinemia pudieran ser contradictorios, ya que su efecto puede depender de la condiciones fisiológico del animal (el ayuno frente posprandial), o enfermedad (diabetes). Los fructanos tipo inulina a pesar de que no se digieren en la parte superior del tubo digestivo pueden influir en la absorción de macronutrientes, especialmente carbohidratos, al retrasar vaciado gástrica y acortar el tiempo de tránsito en el intestino delgado (Roberfroid & Delzenne 1998). Entre los AGCC producidos por la fermentación de los FOS, el propionato afecta el metabolismo hepático de la glucosa. El propionato es un gluconeogenerador y se ha demostrado que inhibe la gluconeogénesis a Arias-Hernández, D. 20 partir de lactato y estimula la glucólisis en hepatocitos aislados. Los efectos de la fibra soluble sobre el metabolismo de la glucosa son ejercidos a través de los productos de su fermentación y no sólo a través de la acción sobre el tubo digestivo superior (reducción de vaciado gástrico, retardo de la digestión y absorción de carbohidratos digeribles) (Bornet et al. 2002). La suplementación con FOS reduce los lípidos en sangre, esto debido a la inhibición de una enzima lipogénica en el hígado, que puede ser un resultado de la acción de propionato producido a partir de la fermentación de los prebióticos por las bacterias intestinales. El aumento de viscosidad en el tubo intestinal superior puede actuar como una barrera física y disminuir la reabsorción de las grasas, incluyendo colesterol y ácidos biliares, también, como consecuencia de la disminución del pH intestinal, la cantidad de ácidos biliares solubles disminuye y como resultado, disminuye la absorción de lípidos y la excreción de ácidos biliares fecales aumenta, traduciéndose en un mayor catabolismo del colesterol en el hígado, lo que lleva a reducir las concentraciones de colesterol en plasma (Bornet et al. 2002; Mussatto & Mancilha 2007; Al-Sheraji et al. 2013). Los cambios en el pH del colon y la producción de AGCC, han sido propuestos para explicar el incremento en la absorción de elementos minerales, además de una mayor biodisponibilidad de calcio. Investigaciones experimentales con diferentes animales, han demostrado un efecto positivo en el consumo de FOS sobre la absorción de elementos minerales como el calcio, magnesio, hierro y zinc (Delzwnne et al. 1995). Los minerales se unen o son quelados por las fibras solubles y no son absorbidos en el intestino delgado, llegando hasta el colon, donde las fibras solubles son fermentadas y éstos son liberados de las fibras y posteriormente absorbidos. (Roberfroid & Delzenne 1998; Roberfroid 2000; Mussatto & Mancilha 2007). Arias-Hernández, D.21 4.8 Efecto de los FOS sobre la uremia y el metabolismo del nitrógeno. Varios experimentos demuestran que las fibras solubles como los FOS mejoran la eficacia fecal para la excreción de nitrógeno y disminuyen su excreción renal (Younes et al. 1995; Howard et al. 2000; Lynch et al. 2007; Nahm 2003). Esto es debido a que los carbohidratos fermentables sirven como una fuente de energía para la microflora intestinal, que también requiere una fuente de nitrógeno para la síntesis de proteínas, además de que los oligosacáridos también pueden favorecer el establecimiento de una microflora ureolítica. El aporte de nitrógeno para el crecimiento bacteriano es proporcionado en cierta medida por proteínas de la dieta, pero también otra fuente disponible para la síntesis de proteína bacteriana en el ciego es la urea de la sangre. Cuando hay hipertrofia de las vellosidades del ciego, la mucosa cecal tiene mayor flujo de sangre y una mayor superficie de absorción, esto permite la difusión de urea de la sangre, donde está presente como un producto final del metabolismo de las proteínas (Rémésy & Demigné 1989). Debido a la presencia de bacterias ureolíticas en el ciego, el gradiente de concentración de urea favorece una transferencia neta de urea al lumen del ciego. El amoniaco generado por las ureasas bacterianas se utiliza para la síntesis de proteínas. Esta proteína microbiana finalmente se excreta en las heces y representan la mayor parte de nitrógeno. Todos los carbohidratos fermentables estudiados en la excreción de nitrógeno fecal incrementan de 1.5 hasta 2 veces su excreción, disminuyendo el nitrógeno urinario de 25 a 30%, lo que da lugar a una reducción de 20 a 30% de urea en sangre (Levrat et al. 1993; Younes et al. 1995). Los oligosacáridos son particularmente eficaces aumentando la transferencia de nitrógeno de urea al intestino grueso, pero su acción parece menor en cuanto al tiempo de tránsito intestinal (Younes et al. 1996; Howard et al. 2000). Un efecto osmótico en el intestino delgado podría acelerar la Arias-Hernández, D. 22 transferencia de urea en el íleon distal y en el intestino grueso. Por otro lado, los efectos de la fibra en la excreción del nitrógeno fecal también depende de la concentración de proteína en la dieta (Lynch et al. 2007). Los oligosacáridos con relativamente alto grado de polimerización, tal como inulina, mejoran la captura de la urea en el ciego de rata y promueven la excreción fecal del nitrógeno, sin perturbaciones digestivas, particularmente, cuando la concentración de proteína en la dieta es moderada (Younes et al. 1996). La fibra soluble favorece la proliferación de bacterias en la parte proximal del intestino grueso y fibras menos fermentables ayudan para limitar la proteólisis y la desaminación de nitrógeno y sus productos finales en el colon distal (Macfarlane et al. 1986; Nahm 2003). Además, algunas fibras no fermentables aceleran el tránsito y evitan la exposición del intestino grueso a los productos del catabolismo de las proteínas. Estas diferencias en la fermentación han llevado a sugerir que las dietas deben contener mezclas de fuentes de fibra fermentables y no fermentables con el fin de lograr la salud gastrointestinal óptima o cambios deseables en la excreción de N (Younes et al. 1996; Howard et al. 2000). La inulina y la oligofructosa sirven como una fuente de energía para las bacterias intestinales que durante el crecimiento también requieren una fuente de nitrógeno para la síntesis de proteínas, sin embargo, parece poco probable que fructanos tipo inulina ejerzan algún efecto notable en la digestibilidad de proteínas en el intestino delgado. Cuando la ingesta de carbohidratos fermentables es alta, la cantidad de amoniaco necesaria para mantener la síntesis de proteína bacteriana máxima puede llegar a ser insuficiente y la urea en sangre será requerida como una fuente para la síntesis de proteína bacteriana en el ciego. Además, el propionato ( producto final de la fermentación bacteriana) también inhibe la generación de urea en Arias-Hernández, D. 23 el hígado en presencia de amoniaco y aminoácidos.(Younes et al. 1995, 1996,1998) Otra forma de eliminación de nitrógeno es por medio de la fibra no fermentable, el consumo de esta lleva a un aumento del nitrógeno fecal, aumentando la excreción fecal de nitrógeno bacteriano mediante el aumento de la masa fecal y del aumento del tránsito digestivo, debido a que el aumento en el nitrógeno fecal se correlaciona bien con el peso fecal (5.9g contra 1.8 g / día con una dieta sin fibra). Resultados en las investigaciones sugieren la posible utilidad de combinar carbohidratos fermentables con una reducción del consumo de proteína para reducir la excreción renal de nitrógeno, ya que las dietas bajas en proteínas aumentan la eficiencia de la eliminación de urea en el ciego y disminuyen el reciclaje de amoniaco. Además, se ha demostrado que la transferencia de urea es proporcional al tamaño cecal y a la concentración de urea en sangre (Younes et al. 1995, 1996). 4.8.1 Beneficios del aporte de FOS en dietas para perros con falla renal A nivel fisiológico, existen dos rutas para eliminar nitrógeno la orina y las heces. La eliminación de urea por el riñón es la mayor vía de excreción de nitrógeno, pero una considerable cantidad de urea también se hidroliza en el intestino grueso y es eliminado en las excretas. La excreción de urea extrarrenal por vía enteral puede ser clínicamente relevante en pacientes con IRC. La urea es transferida dentro del tubo digestivo por difusión desde el plasma sanguíneo y por vía gástrica, biliar y por secreción intestinal. Una vez transferida al intestino grueso en el lumen, la urea es hidrolizada por la microflora bacteriana ureolítica para su utilización como proteína bacteriana. Se ha estimado que la urea hidrolizada de esta manera representa aproximadamente un tercio de la urea total producida por el hígado (Younes Arias-Hernández, D. 24 et al. 1997). El consumo de fibra fermentable puede estimular la ruta de excreción del N vía enteral, como consecuencia de la utilización del N por las bacterias, o bien, puede ser reciclado una gran proporción del N liberado por hidrólisis de la urea en intestino, a través de la reabsorción de amoniaco, reduciendo la síntesis de urea hepática, contribuyendo así a disminuir la necesidad de nitrógeno (Younes 2012). 4.8.2 Efecto en la modulación del ciclo entero hepático de la urea y amoniaco Existen varios factores que controlan la hidrólisis de la urea: la cantidad de urea transferida al sitio de hidrólisis, la actividad de las ureasas bacterianas, la demanda de amoniaco para la síntesis de proteínas bacteriana y la disponibilidad de otra fuente de nitrógeno (Younes et al. 1997). La cantidad de urea y amoniaco colónico, depende ciertamente de la disponibilidad de carbohidratos fermentables para el mantenimiento de la alta actividad de las ureasas. De hecho, la transferencia de urea es proporcional al gradiente de concentración de urea a través de la pared del colon, lo cual explica el efecto estimulador de las bacterias del colon a través de su actividad ureolítica para promover la difusión de urea hacia el colon. En consecuencia, en presencia de carbohidratos fermentables (en particular oligosacáridos los cuales ejercen efectos osmóticos y favorece la actividad ureolítica) y en caso de hiperuremia, esta transferencia en el colon puede llegar aser considerable (Younes et al. 2001). La urea podría ser utilizada en íleon distal el cual presenta una alta permeabilidad para esta molécula. Sin embargo, la población bacteriana en el íleon terminal es sólo una milésima o menos que la encontrada en el colon. La transferencia de urea para el colon puede ser mayor porque el tiempo de tránsito en el colon es más largo. Una parte del amoniaco producido a partir de urea se utiliza para la síntesis de proteínas bacterianas que se elimina en las heces, y por lo tanto se Arias-Hernández, D. 25 incrementa la excreción fecal de N (Younes et al. 1995, 1997). Otra parte del amoniaco se absorbe y es convertido en el hígado a urea o es reciclado por diferentes vías para la síntesis de aminoácidos no esenciales (Younes 2012). La incorporación de amoniaco en proteína bacteriana conduce a una pérdida irreversible de N a través de la ruta fecal y es significativa cuando la cantidad carbohidratos fermentables es alta. Algunos resultados apoyan la idea de que existe una estrecha relación entre el flujo neto de urea hacia intestino grueso y excreción fecal de N , por lo tanto, una disminución de la urea en plasma (Younes et al. 2001). Una alta tasa de transferencia de urea en el ciego se ve favorecida por un amplia área de la superficie de intercambio y por un mayor flujo sanguíneo en el ciego (Rémésy & Demigné 1989; Younes et al. 1997) (Figura 3) Arias-Hernández, D. 26 II. JUSTIFICACIÓN En las últimas décadas, la utilización de diversos tipos de nutraceúticos ha ido en aumento en la dieta de los humanos y al mismo tiempo su utilización se ha visto incrementada en sus mascotas. Dentro de estos nutraceúticos los fructooligosacáridos (FOS) han tomado gran importancia como prebióticos siendo utilizados también como una forma de disminuir niveles de compuestos nitrogenados séricos en pacientes con insuficiencia renal dando resultados variables por lo que su uso ha sido traspolado a los perros, sin embargo, los estudios en estos últimos son limitados por lo que es necesario indagar mas sobre sus beneficios para poder recomendarlos. Arias-Hernández, D. 27 III. HIPÓTESIS La suplementación con fructooligosacáridos en dietas para perros disminuyen la concentración de urea y amoniaco en sangre. IV. OBJETIVOS Objetivo general: 1.- Comprobar si la suplementación con fructooligosacáridos en las dietas para perros, disminuyen las concentraciones sanguíneas de amoniaco y urea. Objetivos particulares: 1.- Establecer si se producen cambios en las concentraciones sanguíneas de amoniaco y urea como consecuencia de la suplementación de FOS a dosis de 1 y 2 g por perro al día durante 42 días. 2.- Evaluar si la interacción de los FOS con el alimento de bajo valor nutritivo afecta las concentraciones de urea y amoniaco séricos. Arias-Hernández, D. 28 V. MATERIAL Y MÉTODOS 1. Animales y dieta Los animales utilizados en este trabajo fueron tratados según la legislación vigente en materia de bienestar y experimentación animal y los protocolos experimentales fueron aprobados por el subcomité institucional para el cuidado y uso de animales experimentales de la Universidad Nacional Autónoma de México. Se trabajó con 13 perros adultos (12 perros de 18 meses de edad, dos de tres años y uno de siete), sanos, raza pequeña (ocho Dachshund, cinco Schnauzer miniatura, un Beagle, un Basenji), ocho machos y siete hembras enteros, con un peso promedio de 8.6 kg. Fueron asignados aleatoriamente a uno de tres tratamientos (cinco perros por tratamiento). Los perros fueron alojados por grupos en corrales con patio y sombra. Fueron alimentados en platos individuales dos veces al día, con la cantidad necesaria para cubrir sus requerimientos energéticos diarios con croquetas para perros adultos en mantenimiento establecidos por el NRC (1985) y se les ofreció agua a libre acceso. Los analitos sanguíneos analizados fueron urea y amoniaco séricos (NH3). La formulación de las croquetas está hecha a base de cereales y/o sus subproductos, harina y/o subproductos (vísceras y menudencias) de pollo y/o puerco y/o res y/o pastas de oleaginosas, grasa animal de puerco y/o pollo y/o res (conservada con BHA y BHT), sabor natural y/o artificial (pollo, res o cerdo), colorantes naturales y/o artificiales, sal yodatada, antioxidantes (BHA y BHT), L- lisina, vitaminas (suplementos de vitaminas D, A, E, ácido pantoténico, riboflavina, tiamina, cobalamina), minerales (óxidos o sales de: potasio, zinc, calcio, yodo y cobre). En el cuadro 5 se muestra el análisis químico del alimento y su aporte de contenido energético es de 311 Kcal/100 Arias-Hernández, D. 29 g. Croquetas comerciales consideras de bajo valor nutricional en cuanto a la naturaleza de sus ingredientes. Cuadro 5. Análisis químico del alimento. Nutriente Porcentaje (%) Proteína cruda (mínima) 22.0 Grasa cruda (mínima) 9.0 Fibra cruda (máxima) 4.0 Carbohidratos (calculado) 45.0 Humedad(máxima) 12.0 Cenizas 8.0 Dos de los grupos fueron complementados con fructooligosacáridos (un comprimido= 1000 mg de FOS) administrados vía oral junto con el alimento; Los perros del grupo 1 fueron asignados como grupo control (1), al grupo 2 se le proporciono 1 g de FOS (FOS1) y al grupo 3 se les dio 2 g de FOS (FOS2) al día, fueron complementados durante 42 días. Los fructooligosacáridos de cadena corta proporcionados fueron a partir de un producto de distribución comercial en comprimidos puros al 100%. (Figura 4) 2. Colección de muestras Para el inicio del experimento, los animales tuvieron un periodo de adaptación de 15 días con el alimento, la fase experimental tuvo una duración total de 42 días. Los perros fueron pesados al inicio del experimento para calcular sus requerimientos energéticos y la cantidad de alimento necesaria para cubrirlo (Figura 2). La colección de muestras sanguíneas se realizó los días: 0, 21 y 42. Arias-Hernández, D. 30 CÁLCULO DE REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS PARA PERROS ADULTOS EM requerido= K x (P kg) 0.67 EM= Energía metabolizable K= 132 perros activos P= Peso Figura 2. Fórmula para calcular requerimiento energético de perros adultos activos. Los perros fueron pesados en báscula digital de piso y la toma de muestras fue realizada con ayuno previo de 8 a 12 horas, realizando los tres muestreos a la misma hora del día aproximadamente. La técnica para la toma de muestra utilizada fue la siguiente: la sujeción del animal fue hecha por un ayudante, se localizó el área donde se encuentra la vena cefálica, se realizó limpieza y desinfección del área, se obtuvo la muestra sanguínea de 1.5 a 2 mL, cantidad suficiente para el procesamiento de muestras, la cual fue traspasada a un tubo de ensayo sin anticoagulante para su posterior procesamiento, idéntica técnica utilizada para todos los animales en los tres muestreos. 3. Procesamiento de muestras Las muestrasfueron centrifugadas a 3000 rpm (50 ciclos por segundo) durante 10 minutos, para la separación del suero, trasladando 0.2 a 0.5 mL a un micro pozo para procesar y obtener la medición de urea y amoniaco (NH3). La medición de los analitos se realizó en el analizador bioquímico IDEXX VetTest® 8008, el cual permite una lectura rápida y precisa, ya que la estabilidad del amoniaco en el suero se ve alterada después de 15 minutos de la colección de la muestra (Diaz et al. 2007) (Figura 3). Arias-Hernández, D. 31 Figura 3. Analizador bioquímico IDEXX VetTest® 8008 utilizado para la obtención de las mediciones de concentraciones de amoniaco y urea séricos. 4. Análisis Estadístico Los resultados fueron expresados como la media ± desviación estándar. Las variables urea y NH3 fueron analizadas por medio de un análisis de varianza multivariado (MANOVA) para datos con distribución normal, comparando entre tratamientos y por tratamiento a través del tiempo. Las diferencias fueron consideras significativas con una P<0.05, la prueba de MANOVA se realizó usando el paquete estadístico JMP 5.1. Arias-Hernández, D. 32 VI. RESULTADOS 1. Amoniaco El efecto de los fructooligosacáridos sobre la concentración de amoniaco sérico en los perros se presentan en el cuadro 6. Para el efecto del tratamiento no hay diferencia significativa (P=0.1978) entre los tres tratamientos durante todo el estudio. Para el efecto de la interacción tratamiento-muestreo tampoco se encontró diferencia (P=0.2038), mientras que los resultados arrojados en el análisis realizado a los muestreos a través del tiempo (cuadro 7) mostró diferencia significativa, lo cual indica que las concentraciones de amoniaco fueron mayores al día 21 con respecto al primer muestreo y también que en el muestreo del día 42 hay menor concentración de amoniaco en sangre que en el día 21 del experimento sin importar el tratamiento. Cuadro 6. Concentración de amoniaco sérico en los perros suplementados con FOS desde el día cero hasta el día 42. Tratamiento NH3 (µmol/L) Día 0 Día 21 Día 42 Testigo (n=4) 53.75 ± 20.67 91.75 ± 22.05 54.5 ± 13.72 FOS1 (n=4) 53.5 ± 33.98 112.25 ±17.23 78.25 ± 20.71 FOS2 (n=5) 54.2 ± 21.87 77.6 ± 6.42 76.6 ± 21.64 Medias ± desviación estándar. Arias-Hernández, D. 33 Cuadro 7. Efecto del tiempo en la concentración de amoniaco de los muestreos en el experimento. Todos los tratamientos produjeron un incremento de las concentraciones de amoniaco en mayor o menor medida al día 21, sin embargo, al día 42 las concentraciones fueron menores sin representar un cambio significativo entre los tratamientos. 2. Urea El efecto de los FOS sobre la concentración de urea en la sangre en los animales se muestra en el cuadro 8. Los resultados indicaron que para el efecto de tratamiento no hubo diferencia significativa (P=0.3468) y para la interacción tratamiento-muestreo tampoco se mostró significancia (P=0.1442). Cuadro 8. Concentración de urea sérica en los perros suplementados con FOS desde el día cero hasta el día 42. Tratamiento Urea (mmol/L) Día 0 Día 21 Día 42 Testigo (n=4) 4.91±0.73 4.73±1.44 4.55±0.79 FOS1 (n=4) 8.03±5.16 7.23±4.47 6.42±3.4 FOS2 (n=5) 6.28±1.35 4.07±1.3 5.49±1.3 Medias ± desviación estándar. Tiempo(días) F Exacta NumDF DenDF Prob>F 0-21 22.8333 1 10 0.0007* 21-42 12.0692 1 10 0.0060* * Existe diferencia significativa si (P<0.05) Arias-Hernández, D. 34 La concentración de urea sérica en todos los grupos se ve disminuida ligeramente al final del experimento en comparación con la primer muestra para el grupo de FOS2 y para los grupos testigo y FOS1 disminuyo con respecto al segundo y primer muestreo, sin embargo al analizar los datos no se encontró diferencia significativa (P=0.1757) para el tiempo del experimento. Arias-Hernández, D. 35 VII. DISCUSIÓN Este experimento se realizó para examinar si la complementación con FOS tenía influencia en las concentraciones de amoniaco y urea séricos en perros. Las concentraciones de amoniaco y urea sérico en los perros sanos de raza pequeña no fueron afectadas por la complementación con FOS en dosis de 1 g y 2 g al día por perro, durante 42 días de experimentación. Diversas investigaciones en diferentes especies no rumiantes, ratas, perros, cerdos, gatos, humanos, hámsters y conejos, en las cuales se ha analizado el efecto de los fructooligosacáridos y otros prebióticos sobre la concentración de urea en sangre y la tasa de eliminación en heces y orina han teniendo resultados variables. Los trabajos realizados en ratas concluyen que la adición de oligosacáridos a la dieta indujo una disminución de urea en sérica del 20 al 30% y la excreción renal del nitrógeno en relación con el control. En otro estudio con ratas nefrectomizadas complementadas con oligosacáridos se encontró que la concentración de nitrógeno en el ciego fue mayor habiendo una mayor tasa de transferencia de urea (50-60% mayor) y el flujo de amoniaco desde el lumen cecal hacia la sangre era dos veces mayor que en ratas normales, pero la excreción del nitrógeno fecal fue igual para ambos grupos (nefrectomizadas y normales). Sin embargo, la comparación en la excreción del nitrógeno fue menor al 20% en animales con dieta libre de fibra en comparación con ratas normales y nefrectomizadas complementadas (45 al 50 y 40% respectivamente). En general concluyeron que la suplementación de fibra fermentable resulta en el aumento del flujo de urea hacia el ciego atribuible al aumento de la absorción debido a la hipertrofia de las vellosidades de la pared cecal y al gradiente de concentración favorable, debido a las bacterias ureolíticas. Los resultados en los estudios también sugieren una posible utilidad de la combinación de carbohidratos fermentables, tales como FOS, con una dieta baja en proteínas Arias-Hernández, D. 36 para aumentar la excreción de N a través de la vía digestiva, con el fin de disminuir la excreción por la vía renal (Younes et al. 1995, 1996, 1997, 1998). Los resultados obtenidos en un estudio son parecidos a los de esta investigación, en el cual 5 perros fueron complementados con oligofructosa en su dieta con una dosis de 10 g/kg durante 21 días, no se encontró efecto de la oligofructosa sobre la excreción de nitrógeno en heces y orina, concluyendo que la ausencia o presencia del efecto de la oligofructosa sobre la excreción de nitrógeno urinario y fecal depende de la composición de la dieta y del contenido de carbohidratos fermentables (Beynen et al. 2002). En otro trabajo, se investigó el efecto de la adición de prebióticos a las dietas de perros enriquecidos con fuentes de proteínas de origen animal sobre la digestibilidad aparente y la concentración de amoniaco fecal, adicionando 3% de FOS o 3% de IMOS a la dieta e incrementando la cantidad de proteína de origen animal.La cantidad de amoniaco fecal se incrementó significativamente por la suplementación con proteína, los oligosacáridos no redujeron la concentración de amoniaco fecal, esto puede ser debido al hecho de que las éstas no son un reflejo claro de la producción de amoniaco, ya que su absorción depende del pH local y de la tasa de incorporación del amoniaco en proteína bacteriana y esto depende de la disponibilidad de la energía de los carbohidratos fermentables (Hesta et al. 2007). Un estudio con perros de raza beagles adultos, reveló los efectos de la complementación de oligofructosa (50 g/kg) y goma guar (34 g/kg) sobre la concentración de urea sérica, resultando que a las 6 horas postprandial con la oligofructosa se obtuvo una reducción de la concentración de urea (-10%), cuando se compara con la goma de guar (-15%). Un estudio con perros meztisos adultos, reveló los efectos de la complementación de FOS, mananooligosacáridos y xilooligosacáridos a dosis de 5 g/kg de materia seca de alimento, sobre el amoniaco fecal y otros parámetros en el cual concluyeron que los oligosacáridos tienen poco efecto sobre el crecimiento Arias-Hernández, D. 37 bacteriano en el intestino grueso y que se requiere mayor cantidad de estos para tener un mayor crecimiento bacteriano (Strickling et al 2000). En otro trabajo, 28 perros adultos fueron alimentados con una de cuatro dietas que diferían en el tipo de fibra dietética (pulpa de remolacha 60g/kg, FOScc 15g/kg, celulosa 20 g/kg y una mezcla de fibras 60 g/kg de alimento) para evaluar los efectos sobre la digestibilidad, la participación de componentes nitrogenados y los cambios en la microflora intestinal. Teniendo como resultados que el consumo de materia seca se redujo y la digestibilidad aumentó en los perros alimentados con la dieta con FOS. El nitrógeno fecal y la excreción del N microbiano (g/día) fue mayor con la mezcla de fibras, los FOS aumentaron las bacterias aeróbicas totales en el colon distal. Concluyeron que los carbohidratos fermentables aumentan el crecimiento microbiano en el colon y tienen el potencial de quelar y eliminar el N del cuerpo (Howard et al. 2000). Las respuestas con concentraciones mayores de FOS contrastan con los resultados de este trabajo (dosis 1 y 2 g por animal), sugieren que elevadas concentraciones de oligofructosa puede desempeñar un mejor papel en la modulación de metabolitos sanguíneos y ser útiles en dietas para perros que son urémico (Flickinger et al. 2003). En otro experimento se probaron tres concentraciones (0.3, 0.6, y 0.9% de la dieta) de oligofructosa e inulina en perros adultos durante 98 días, teniendo como resultado un aumento en la concentración de amoniaco fecal (Propst et al. 2003). La respuesta en la concentración al 0.3% difiere con los resultados presentados por Flickinger et al. (2003), en donde se determinó la suplementación con oligofructosa a una dosis similar (1.9 g/d), disminuyendo la concentración de amoniaco fecal en los perros que consumen una dieta a base de maíz. Se analizó una serie de investigaciones donde se evalúa el efecto de algunos prebióticos (cuadro 9), en el cual se determinó que aunque los prebióticos contribuyen a dar volumen en la dieta, parece que no pueden Arias-Hernández, D. 38 influir en dosis bajas en perros, debido presumiblemente a la fermentación rápida de la microbiota intestinal, sin disminuir el tiempo de tránsito de los alimentos y también, que la disminución de la digestibilidad aparente de la proteína en respuesta a la alimentación de prebióticos podrían ser atribuidos al aumento de la síntesis de proteína microbiana en el intestino y por lo tanto, en el aumento de la excreción nitrógeno fecal. Influyendo en el ciclo de la urea- amoniaco en el intestino de los perros (Patra 2011). Cuadro 9. Estudios analizados del efecto de los prebióticos en perros. Tomado de Patra (2011). Estudio Probióticos Raza n Dosis (% MS) G Beynen et al. (2002) FOS Beagles 10 0 y 1 2 Diez et al. (1998) Inulin Beagles 16 0 y 7 2 Flickinger et al. (2003) FOS Beagles 11 0 y 0.63 2 Flickinger et al. (2003) FOS Hound 16 0 a 0.83 4 Grieshop et al. (2002) AG Hound blood 49 0 a 0.53 7 Grieshop et al. (2004) MOS Beagle, Pointer 34 0 a 1.55 4 Hesta et al. (2003) FOS o IMO Beagles 24 0 y 3 6 Middelbos et al. (2007a) YCW Hound 25 0 a 0.65 5 Middelbos et al. (2007b) FOS + YCW Hound 24 0 y 1.55 4 Propst et al. (2003) FOS e inulin Hound 49 0 a 0.9 7 Strickling et al. (2000) FOS, MOS, XOS Mestizos 28 0 y 5 4 Swanson et al. (2002a) FOS+MOS Hound 12 0 y 1.98 3 Swanson et al. (2002b) FOS, MOS Hound 16 0 a 1.06 4 Swanson et al. (2002c) FOS Pointer 26 0 a 0.39 4 Verlinden et al. (2006) Inulin Beagles 64 0 a 3 4 Zentek et al. (2002) Inulin Beagles 14 0 y 1.65 3 FOS= fructooligosacáridos, AG= Arabinogalactosa, MOS= mananooligosacáridos, IMO= isomalto-oligosacáridos, XOS= xilooligosacáridos YCL= pared celular de levadura. n= animales y G= grupos en el estudio. Arias-Hernández, D. 39 La producción de amoniaco en el colon es por hidrólisis bacteriana de la urea, así como por desaminación bacteriana de aminoácidos, péptidos y proteína de la dieta. Las diferencias en la respuesta a la suplementación de fructanos entre los estudios quizá se debe al tipo de la dieta con la que fueron alimentados (proteína de origen animal o vegetal y concentración de proteína). La influencia de la fuente y el porcentaje de proteína de la dieta fueron evaluados en un estudio con perros en el cual se probaron cinco dietas experimentales que varían en fuente de proteína (gluten de trigo vs harina de pollo semi-digerida), con una concentración de proteína de 21.4 a 21.6% y de 38.2 a 39.2%, concluyendo que una dieta formulada con proteínas de alta digestibilidad y en un porcentaje moderado, lleva a reducir la concentración de productos de su fermentación, tales como amoniaco, fenoles, índoles y AGCC en las heces (Nery et al. 2012). En otra investigación se demostró que la fermentación de la fibra afecta significativamente la digestión en el perro, aumentando la fibra soluble mejora la digestión de la materia seca y energía. Sin embargo, el aumento de la fibra soluble disminuye la digestibilidad de la proteína cruda, pudiendo atribuirse a la mayor excreción de proteína microbiana como resultado de una mayor fermentación de la fibra (Silvio et al. 2000). Para futuras investigaciones se recomienda complementar con dosis mayores de FOS a estas e incluir dietas con mayor digestibilidad y concentraciones moderadas de proteína. Arias-Hernández, D. 40 VIII. CONCLUSIÓN Se puede concluir que la suplementación con fructooligosacáridos a dosis de 1 y 2 g a perros adultos sanos no produce cambios en la urea y el amoniaco séricos, en comparación con el grupo control. Basándose en estos resultados, la inclusión de FOS en estas dosis con dietas similares a la utilizada en el presente trabajo, ofrece pocos o nulos beneficios para los perros, ya que la eficiencia en la utilización de la fibra dietética como fuente de energía para las bacterias del intestino grueso y la utilización del nitrógeno ureico endógeno para su síntesis proteica, puede ser afectada por la dosis administrada, por la fermentabilidad en el intestino grueso y por la calidad de los ingredientes utilizados en la dieta.
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