Evaluacion-del-oxido-de-cromo-Cr2O3-y-dioxido-de-titanio-TiO2-como-marcadores-de-la-digestibilidad-aparente-en-ovinos

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I 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA 
PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
 
 
 
 
EVALUACIÓN DEL ÓXIDO DE CROMO (Cr2O3) Y DEL DIÓXIDO DE 
TITANIO (TiO2) COMO MARCADORES DE LA DIGESTIBILIDAD 
APARENTE EN OVINOS 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA 
 
AXEL EDMUNDO GUZMÁN CEDILLO 
 
 
TUTOR: 
MVZ, M. en C. Francisco Alejandro Castrejón Pineda 
COMITÉ TUTORAL: 
MVZ, MPA, Dr. Luis Corona Gochi 
MVZ, Dr. Manuel González Ronquillo 
 
 
 
México D. F. 2011
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 II 
DEDICATORIA 
 
A mis padres que con su apoyo y motivación me impulsan a seguir adelante. Papá con 
este proyecto pudimos comprendernos mejor y gracias a tus consejos pude terminarlo. 
Mamá con tu aliento a mi lado cada día llegare más lejos. 
 
A Roxana, gracias a tu amor nada me faltó, eres un pilar importante en mi vida, te amo. 
 
A mis hermanos que día a día me enseñan el camino de la vida. Edgar quien me tatuó 
una piel dorada que jamás podré quitarme, Yunuen quien me enseña que el peso del 
conocimiento es infinito, pero lo es más la preparación, Yatzin quien me enseña día a día 
la felicidad en esta vida y la perseverancia para mantenerla. 
 
A mis sobrinos Zabdiel, Azariel y el nuevo integrante que será recibido con los brazos 
abiertos, son una bella luz que nos ilumina. 
 
A mis abuelos; mamá grande, papá grande, don Lencho, los llevo presente en mis 
recuerdos y para mama María y tía Otilia mis mejores maestras en el trabajo diario. 
 
A mis cuñados Alejandro, Cuauhtémoc y Silvia que le dan un sabor y toque diferente a la 
familia. 
 
A mis amigos, aquellos “hermanos y hermanas” con las que pase momentos alegres y 
difíciles, no saben cuanto los estimo. 
 
A Dr. Mascota por quien me esforzaré día a día y quien me enseña a picar piedra para 
obtener los frutos que nos da la tierra. 
 
A mis queridos Pumas Acatlán, corazón azul y piel dorada, orgullOSOS por siempre. 
 
 
¿Qué es si no la vida, sin los nuevos comienzos que le dan un nuevo sentido a lo que 
sentimos? 
 III 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi querida Universidad Nacional Autónoma de México, por darme todo lo necesario 
para forjarme como profesional y persona. 
 
A mi asesor Francisco A. Castrejón Pineda por todo el asesoramiento, estímulo y amistad, 
para seguir adelante. 
 
Al comité tutoral, Luis Corona Gochi y Manuel González Ronquillo, por su disposición y 
sugerencias que cada día mejoraron este trabajo y mi formación. 
 
Al Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica. 
 
Al personal del laboratorio de bromatología Águeda, Fer, Martín, Tere, Ladislau, Hugo, 
Angel y doña Aure. 
 
Al Centro de Enseñanza Práctica e Investigación en Producción y Salud Animal.
 IV 
ÍNDICE 
 
Resumen 1 
 1. Introducción 2 
 2. Revisión de literatura 2 
 2.1. La evaluación de la digestibilidad aparente en rumiantes 2 
 2.2. Colección total de heces 3 
 2.3. Otros métodos para determinar la digestibilidad 3 
 2.3.1. Características de un marcador 5 
 2.3.2. Los marcadores y su clasificación 5 
 2.3.3. Marcadores Internos 6 
 2.3.4. Marcadores externos 9 
 2.4. Métodos utilizados en el análisis de marcadores externos 14 
 2.4.1. Espectrofotometría de luz visible (VIS) 14 
 2.4.1.1. Regiones de la espectrofotometría 15 
 2.4.1.2. Determinación de la concentración por medio de la espectrofotometría 16 
 2.4.1.3. Métodos utilizados para la determinación de la concentración por medio 
de la espectrofotometría. 
18 
 2.4.1.4. Factores a considerar que pueden alterar los análisis de 
espectrofotometría 
19 
 2.4.1.5. Componentes básicos de un espectrofotómetro 20 
 2.4.2. Espectrofotometría de emisión de flama y absorción atómica 21 
 2.4.2.1. Espectrofotometría de emisión de flama 21 
 2.4.2.2. Interferencia en el análisis de emisión de flama 22 
 2.4.2.3. Espectrofotometría de absorción atómica 23 
 2.4.2.4. Partes de un espectrofotómetro de absorción atómica 23 
 2.5. Técnicas utilizadas para la determinación de Óxido de Cromo (Cr2O3). 25 
 2.5.1. Interferencias 26 
 2.5.2. Recuperaciones 26 
 2.6. Técnicas utilizadas para la determinación de TiO2 27 
 3. Objetivos 29 
 4. Hipótesis 29 
 5. Material y métodos 30 
 5.1. Experimento 1. Recuperación in vitro de Cr2O3, TiO2 y sus mezclas 30 
 V 
 5.2. Experimento 2. Evaluación in vivo de los marcadores como marcadores de la 
digestibilidad aparente 
31 
 6. Resultados y discusión 35 
 6.1. Experimento 1 Recuperación in vitro de Cr2O3, TiO2 y sus mezclas 35 
 6.1.1. Recuperación de los marcadores en muestra de alimento 35 
 6.1.2. Recuperación de los marcadores en muestras de contenido duodenal de 
bovino 
37 
 6.1.3. Recuperación de los marcadores en muestras de contenido duodenal de 
ovino 
38 
 6.1.4. Recuperación de los marcadores en muestras de heces de bovino 42 
 6.1.5. Recuperación de los marcadores en muestras de heces de ovino 44 
 6.2. Experimento 2. Evaluación in vivo de los marcadores como marcadores de la 
digestibilidad aparente en ovinos 
47 
 6.2.1. Dietas y consumo de materia seca 47 
 6.2.2. Recuperación de los marcadores in vivo 50 
 6.2.3. Consumo de Nitrógeno y recuperación en heces 52 
 6.2.4. Comparación de la estimación del coeficiente de digestibilidad aparente 
del tracto digestivo total. 
53 
 7. Conclusiones 56 
 8. Bibliografía 57 
 
 
 1 
RESUMEN 
 
Se evaluaron dos marcadores Cr2O3, TiO2 y técnicas utilizadas para su determinación: 
espectrofotometría de absorción atómica (EAA) y espectrofotometría visible (VIS), in vitro 
se adicionó cada marcador en diferentes niveles a muestras de alimento, contenido 
duodenal (0.4, 0.8, 1.2 y 1,6%) y heces (bovino y ovino) (0.8, 1.6 2.4 y 3.2%), in vivo se 
utilizaron 6 ovinos macho en un diseño experimental cuadrado latino con ajuste por efecto 
residual. In vitro: El Cr2O3 y Cr2O3+TiO2 en todas las muestras analizadas por EAA, en los 
niveles de marcador 1.6 a 3.2% arrojaron recuperaciones cercanas a 100%. Las 
recuperaciones fueron diferentes (P<0.05) en las muestras analizadas con TiO2 y 
TiO2+Cr2O3 en cada nivel, por ambas técnicas. In vivo: la variación encontrada in vitro no 
afecto los coeficientes de digestibilidad aparente obtenidos por medio del TiO2 y 
TiO2+Cr2O3 ya que predijeron valores similares a los obtenidos por colección total de 
heces (CTH) o la utilización de Cr2O3, determinados tanto por EAA como por VIS. La 
mezcla Cr2O3+TiO2.determinado por VIS y EAA dio resultados menores a CTH (P<0.05). 
El uso de TiO2 solo o mezclado con cromo (TiO2+Cr2O3) puede ser una alternativa a CTH 
y Cr2O3, para la estimación de la digestibilidad aparente del tracto digestivo total en 
ovinos. 
 
Palabras clave: colección total de heces, espectrofotometría de absorción atómica, 
espectrofotometría visible, marcadores y digestión. 
 
ABSTRACT 
 
Cr2O3 and TiO2 were evaluated, and mixture, as well the technique used for determining: 
atomic absorption spectrophotometry (AAS) and visiblespectrophotometry (VIS) in vitro 
was added to each marker at different levels in samples feed, duodenal content (0.4, 0.8, 
1.2 y 1,6%) and feces (steers and sheep) (0.8, 1.6 2.4 y 3.2%), in vivo 6 male sheep were 
used according to an experiment design Latin square for adjustment residual effects. In 
vitro: The Cr2O3 and Cr2O3+TiO2 in all samples analyzed by AAS, marker levels 1.6 to 
3.2% yielded recovery close to 100%. The recoveries were different (P <0.05) in all the 
samples analyzed by both techniques at each level of TiO2 and TiO2+Cr2O3. In vivo, the 
variation found in vitro did not affect apparent digestibility coefficients obtained by TiO2 and 
TiO2+Cr2O3 as predicted similar values to those obtained by total fecal collection (TFC) or 
the use of Cr2O3, determined both by AAS and VIS. The mixture Cr2O3+TiO2 determined 
by AAS and VIS gave results less than TFC (P<0.05). The use of TiO2 alone or in mixture 
with chromium (Cr2O3+TiO2) could be an alternative to TFC and Cr2O3 in the estimation of 
total tract apparent digestibility in sheep. 
 
Keywords: total fecal collection, atomic absorption spectrophotometry, visible 
spectrophotometry, markers and digestion. 
 
 2 
Introducción 
La correcta evaluación de la digestibilidad de los alimentos en los animales, por distintas 
técnicas permite conocer su grado de aprovechamiento (Church et al., 2003; Shimada, 
2003;). 
Dentro de estas técnicas para su evaluación, está el uso de marcadores, que son 
sustancias inertes e indigestibles que ayudan a conocer la digestibilidad de los alimentos 
de una forma práctica y sencilla (Church et al., 2003), pero la evaluación de estas 
sustancias, en cuanto a recuperación y concentración in vitro e in vivo, permite asegurar 
la correcta estimación de la digestibilidad de la dieta. 
 
1. REVISIÓN DE LITERATURA 
 
2.1. Evaluación de la digestibilidad aparente en rumiantes 
 
La necesidad de conocer la composición y evaluación de los alimentos, para determinar 
su valor nutricional, permite determinar su selección e interacción con otros ingredientes 
para elaborar una ración que sea capaz de cumplir los requerimientos productivos 
(Shimada, 2003). Con base en lo anterior, la información obtenida por un buen análisis 
químico, puede llegar a ser confiable. Sin embargo esto sólo indica el contenido de 
nutrientes, pero no su disponibilidad para el animal, por lo que es importante contar con 
los datos de la digestibilidad de dicho alimento (Shimada, 2003). La digestibilidad está 
determinada por el porcentaje de un nutriente que se digiere y absorbe en su paso por el 
tubo gastrointestinal (Church et al., 2003; Cooke, 1998; Shimada, 2003). La mayoría de 
los métodos para medirla, consiste en ofrecer cantidades determinadas de un alimento de 
composición conocida a un animal. De esta forma se mide y analiza lo que es excretado, 
ya sea a través del método de colección total de heces (CTH) o incluso por medio de 
obtención de muestras de contenido gastrointestinal (Church et al., 2003; Cooke, 1998; 
Ørskov, 1986). 
 
 3 
2.2. Colección total de heces 
 
En esta técnica se recomienda mantener una ingestión diaria de alimento constante, lo 
cual se logra restringiendo la cantidad de alimento ofrecido al 90% de la cantidad de 
consumo voluntario, previa al periodo de muestreo, a fin de disminuir la variación que se 
presenta de un día al otro en la producción de excretas. Los residuos de un alimento, en 
el caso de los rumiantes, atraviesan el conducto gastrointestinal en un lapso de 3 a 10 
días. De esta forma para la administración y estudio de un nuevo alimento, es importante 
considerar este tiempo, así mismo una adecuada adaptación a este se lleva a cabo en un 
período de 4 a 10 días, y así poder recolectar las muestras correspondientes al alimento 
en estudio después del período mencionado; ya que la variabilidad de digestibilidad entre 
animales, es mínima, la posibilidad de contar con 4 o 6 animales por tratamiento para su 
estudio, resulta conveniente (Church et al., 2003; Ørskov, 1986). 
La digestibilidad aparente utilizando la CTH, se calcula con la siguiente formula: 
 
DIGESTIBILIDAD APARENTE =100*[(NutsIng - Nutshcs)/ NutsIng] 
 
Donde: NutsIng son los nutrientes en ingredientes (g/d) y Nutshcs son los nutrientes en 
heces (g/d). 
 
En estos estudios, parte del contenido en heces, como; nitrógeno, grasas, carbohidratos y 
elementos inorgánicos, provienen de fuentes externas al alimento. Es decir, algunas 
células de la mucosa gastrointestinal, secreciones, etc.; por tanto las heces contienen 
alimento sin digerir y material endógeno (Church et al., 2003; Owens y Handson, 1992). 
Debido a esto, al cuantificar la digestibilidad por medio del análisis de heces, se obtiene 
una digestibilidad aparente (Church et al., 2003; Ørskov, 1986). 
 
2.3. Otros métodos para determinar la digestibilidad 
 
El uso de sustancias de referencia para medir la digestibilidad, cuando no es factible la 
recolección total de heces, se presentan como: no absorbibles y por lo tanto indigeribles, 
no tóxicas y deben resultar de fácil detección en heces. Estas sustancias son conocidas 
como indicadores o marcadores de digestibilidad. (Church et al., 2003). Estos marcadores 
se adicionan al alimento, o son parte del mismo o administrados de forma oral (Kotb y 
 4 
Luckey, 1972; Lachman y Araujo, 2005). Permiten realizar ensayos sin la CTH, tanto para 
animales estabulados o en pastoreo (Lachman y Araujo, 2005; Fahey y Jung, 1983), 
siempre y cuando se conozca la concentración del marcador en el alimento y heces, es 
decir por medio de las proporciones de este (Van Soest, 1994). 
 
El uso de marcadores por medio de proporciones, simplifican la determinación de la 
digestibilidad, y al conocer la composición porcentual de nutrientes del alimento y de las 
heces, se puede determinar la digestibilidad de los nutrientes (Church et al., 2003; Kane 
et al., 1950). 
 
El uso de fórmulas para el cálculo de la digestibilidad aparente con marcadores por medio 
del método de proporciones, se puede dar en la relación de las concentraciones de los 
nutrientes y el marcador en alimento y heces (Kotb y Luckey, 1972). 
 
Utilizando la siguiente fórmula es posible conocer la producción de heces: 
 
Producción de heces MS g/d = (marcador consumido g/d) / (marcador en heces g/d) 
 
Para el cálculo de la digestibilidad de la materia seca con marcadores se usa la siguiente 
ecuación: 
 
D MS =100* (Consumo de MS g/d – Producción de MS en heces g/d)/ Consumo de MS g/d 
 
Para la estimación de la digestibilidad de componentes (MO, FDN) 
 
Digestibilidad de X = 100* [(Consumo de X g/d – Excreción de X g/d)/ Consumo de X g/d] 
 
Donde X= MO, FDN, N, etcétera. 
Donde el consumo y excreción están en gramos por día y el Coeficiente de digestibilidad 
en porcentaje. 
 
Los coeficientes de digestibilidad pueden ser ajustados con base en lo obtenido a la CTH 
(Lachman y Araujo, 2005), siendo justificada para aquellos marcadores que son parte del 
 5 
alimento (Van Soest, 1994), ya que estos marcadores por ciertas características, que se 
describirán más adelante, llegan a variar en cantidad y composición dentro del alimento. 
 
2.3.1. Características de un marcador 
 
Una sustancia que pretenda ser utilizada como marcador debe ser inerte y no tóxica, no 
tener efectos fisiológicos, no debe ser absorbida ni metabolizada en su paso por el tracto 
digestivo y deberá ser recuperada totalmente de la muestras del alimento y mantenerse 
uniformemente distribuida en el material digerido o en la excreción, no tener efecto sobre 
la micro flora del tracto digestivo y además de ser fácil y preciso análisis (Kotb y Luckey, 
1972)., sumado a esto, no debe afectar al animal, ni a la digestibilidad del alimento 
(Robertson y Van Soest, 1981). 
Los marcadores son ampliamente utilizados para estudios de digestibilidad, tanto para 
animales en pastoreo comoen estabulación (Fahey y Jung, 1983). El uso de marcadores 
es útil cuando se dificulta medir el consumo total del alimento o incluso si la colección total 
de heces resulta complicada (Church et al., 2003; Lachman y Araujo, 2005). También se 
utilizan cuando se requiere conocer el sitio de digestión en el tracto digestivo. Para lo cual, 
se emplean animales canulados (rumen, abomaso, intestino delgado, íleon etc.) 
 
2.3.2. Los marcadores y su clasificación 
 
Los marcadores son clasificados en internos y externos. Los internos son aquellos que 
están presentes dentro del alimento y son muy poco o totalmente indigeribles (Church et 
al., 2003). Los marcadores internos más utilizados en estudios de digestibilidad son: 
lignina (Church et al., 2003; Lachman y Araujo, 2005; Van Soest, 1989), sílice (Church et 
al., 2003; Lachman y Araujo, 2005), ceniza insoluble en ácido (Church et al., 2003; Sales 
y Janssens, 2003) y recientemente ha aumentado el uso de n-alcanos (Dove y Mayes, 
1991; Piasantier et al., 1995; Steven et al., 2002; Ayala 2005). 
Los marcadores externos son añadidos al alimento, agua e incluso se introducen 
directamente en rumen o por la vía oral (Church et al., 2003). Generalmente estos 
marcadores son compuestos químicos, los cuales se agregan al alimento generalmente 
son colorantes, insolubles y no tóxicos. 
Los marcadores externos más utilizados son: Óxido de Cromo (Cr2O3) (Perez et al., 
1994); elementos de tierras raras como Lantano (La) (Austreng et al., 2000), Cerio (Ce) 
 6 
(Gidenne y Lapanouse, 1997), Samario (Sm) (Church et al., 2003), Iterbio (Yb) (Austreng 
et al., 2000; Perez et al., 1994) y Disprosio (Dy) (Imbeah et al., 1995), estos últimos se 
utilizan para estimar la cinética de la digestibilidad (Church et al., 2003). Otro marcador 
utilizado es el Dióxido de titanio (TiO2) (Peddie et al., 1982; Titgmeyer et al., 2001; Myers 
et al., 2004). 
 
2.3.3. Marcadores internos 
Lignina 
La lignina es un polímero de las plantas, su definición y componentes no están claramente 
reconocidos. 
El contenido de lignina superior al 5% en la materia seca (MS) dentro de un forraje 
permite una mejor recuperación (Van Soest, 1994), cabe resaltar que la mayoría de los 
Es un polímero condensado de fenil propanoide de alto peso molecular, la 
clasificación de la lignina se basa en sus monómeros estructurales y de la clasificación 
taxonómica de la planta, si son monocotiledóneas o dicotiledóneas por lo tanto, la 
definición de la lignina llega a ser diferente en la literatura (Lachman y Araujo, 2005). 
La lignina es utilizada en estudios de digestibilidad principalmente con rumiantes, las 
pérdidas y retenciones durante su análisis generan resultados incorrectos (Lachman y 
Araujo, 2005) e incluso, nutrientes como la proteína cruda en la fibra detergente neutro 
(PCFDN), afectan la determinación de fibra detergente ácido (FDA) (Lachman y Araujo, 
2005), ya que el 1.5 y 18 % de la lignina puede estar representado por proteína. 
La determinación de lignina puede afectarse por la composición de diferentes forrajes e 
incluso una alteración por el uso de ácidos fuertes que causen que el material soluble, 
por medio de una polimerización y condensación, se vuelva insoluble (Van Soest, 1994), 
se ha concluido que la lignina es indigerible, cuando en realidad, se desconoce su 
solubilidad en condiciones naturales (Lachman y Araujo, 2005). 
La degradación parcial de la lignina en el tracto digestivo es un tema de discusión, 
puesto que se cree indigestible, pero algunos investigadores creen que esta llega a ser 
digerida aparentemente en el rumen e intestinos (Fahey y Jung, 1983). Siendo posible por 
la formación de complejos solubles de lignina y carbohidratos, generando polímeros en 
solución que no son excretados (Lachman y Araujo, 2005), por lo que la lignina no es una 
sustancia inerte en su paso a través del tracto digestivo de los rumiantes. Por otra parte, 
los forrajes jóvenes presentan una menor cantidad de lignina con respecto a los maduros, 
dificultando su recuperación y análisis, por lo que el uso de lignina como marcador en 
forrajes inmaduros es restringido (Lachman y Araujo, 2005). 
 7 
estudios realizados sobre recuperación de lignina ha sido en plantas de clima templado 
(Lachman y Araujo, 2005). Con base en lo anterior, conociendo las limitantes en pérdidas 
y análisis de este marcador, así como un factor de corrección por medio del método de 
CTH, permiten un ajuste válido de la lignina como un marcador de la digestibilidad, en 
animales con alimentación controlada, no necesariamente es aplicable a animales con 
alimentación en pastoreo (Lachman y Araujo, 2005). 
 
Sílice 
La utilización del compuesto formado por silicio y oxigeno, originan dióxido de silicio 
(SiO2), el cual es llamado comúnmente sílice que es el componente principal de la arena y 
algunos cereales tales como avena, cebada y arroz (Church et al., 2003). Fue de los 
primeros marcadores propuestos como indicador para evaluar la digestibilidad, pero se ha 
demostrado que su recuperación es variable, posiblemente debido a problemas de 
absorción, excreción urinaria y contaminación con suelo (Kotb y Luckey, 1972), su uso se 
recomienda para la evaluación de consumo en pastoreo. 
 
Ceniza insoluble en ácido 
La ceniza insoluble en ácido (CIA) se considera que representa la contaminación normal 
de tierra por parte del alimento que no es digerido y ofrece un alto grado de recuperación 
del marcador en las heces (Sales y Janssens, 2003), su procedimiento como marcador 
llega a ser confiable para determinar la digestibilidad fecal en las especie animales en 
determinadas circunstancias y con la aplicación de algunas precauciones (Sales y 
Janssens, 2003), tales como el contenido de CIA en los alimentos de al menos 0.75%. 
Las variación fecal diurna, según Pina (2006), puede afectar los resultados o incluso se 
puede ausentar esta variación en aves de corral, ovejas, cerdos, como lo reportan Sales y 
Janssens (2003). La mayoría de los errores en su recuperación pueden ser debidos a 
fallas analíticas en el uso de alimentos con bajo contenido de CIA (Sales y Janssens, 
2003). Son necesarios mas estudios sobre la velocidad y el ritmo de flujo del la CIA, para 
poder predecir la digestibilidad en condiciones de campo. También se encontró bajos 
niveles de CIA en dietas basadas en cereales, por lo que es necesario la adición de 0.5 % 
de Zeolita (Celite) (Kavanagh et al., 2001) dando recuperaciones del 99.9 ± 2.27% en 
cerdos y valores similares a la CTH. 
 
 8 
Fibra detergente ácido o neutro indigestible 
La fibra detergente ácido o neutro indigestible presenta una recuperación de 98% en 
heces y su uso como indicador de la digestibilidad es posible, pero tomando en cuenta la 
variación en la que influye el tamaño de la partícula y el estado de madurez de la planta. 
Los resultados obtenidos con tan sólo dos días de recolección han demostrado que la 
fibra detergente neutro es un buen estimador de la excreción fecal de materia seca, 
digestibilidad de la dieta y sus nutrientes (Pina et al., 2006). 
 
n-Alcanos 
Los alcanos son constituyentes de las superficies de insectos y vegetales, presentes en 
la superficie tisular la cual forma la cera cuticular que cubre la mayor parte aérea de los 
vegetales (Dove y Mayes, 1991; Steven et al., 2002), representan casi 50% de la pared 
celular de las plantas. Están presentes en la hoja, fruto y flor, excepto el tallo y ramas 
maduras de arbustivas y arbóreas (Piasantier et al., 1995), son parte de una barrera 
contra el frío, el calor y los microorganismos (Dove y Mayes, 1991; Steven et al., 2002). 
Los n-alcanos son hidrocarburos de cadena larga saturados, el prefijo n (normal) se 
refiere a que la cadena no está ramificada, contienen enlaces sencillos y compuestos 
(Piasantier et al., 1995). Son insolubles en agua, por que son no polares, tienden a servolátiles a medida que aumentan de peso molecular; a temperatura ambiente son sólidos 
con apariencia de cera (Piasantier et al., 1995), para su identificación es necesaria la 
cromatografía de gases (Dove y Mayes, 1991; Steven et al., 2002), su recuperación llega 
a ser variable en heces (lo que es su mayor desventaja), ya que influye la edad, estado 
fisiológico y especie del animal, así como la especie y estado fenológico por parte de la 
planta, el clima también influye sobre la cantidad de n-alcanos presentes en la planta 
(Piasantier et al., 1995). 
Los hidrocarburos de cadena larga (C19 y C32) fueron sugeridos para utilizarse como 
marcadores internos en la década de 1950-60. Sin embargo, fue difícil su análisis para la 
época en que fueron propuestos (Dove y Mayes, 1991; Steven et al., 2002). El consumo 
individual se puede obtener mediante el uso de los n-alcanos (Dove y Mayes, 1991). 
Para su utilización es necesario conocer el perfil de n-alcanos por especie vegetal, 
etapa de maduración y parte de la planta, para que la composición calculada sea similar a 
la consumida (Piasantier et al., 1995). 
La indigestibilidad de los n-alcanos, permite que las pérdidas sean bajas: 0.05-17% 
(Steven et al., 2002). Su mayor desaparición esta entre el duodeno y el íleon (Dove y 
 9 
Mayes, 1991). La secreción de n-alcanos por parte de la microflora intestinal es 
insignificante (0.0004%) (Steven et al., 2002), por lo que no afecta la determinación de la 
digestibilidad por la variación en el contenido de n-alcanos. Los n-alcanos han permitido 
separar los forrajes de clima templado y tropical, por familia, gramíneas y leguminosas, 
son útiles también para la identificación de los forrajes por especie, en praderas 
homogéneas, (Dove y Mayes, 1991; Steven et al., 2002), mientras en praderas 
heterogéneas no es posible la distinción de los forrajes por especie, si bien la relación de 
n-alcanos nos sirve para poder evaluar la digestibilidad en forma similar a la CTH (Ayala 
2005), así como también resultan eficientes para obtener el consumo de materia seca ya 
que ofrece un resultado cercano al método de CTH (Piasantier et al., 1995). 
 
2.3.4. Marcadores externos 
 
Como se había mencionado anteriormente, los marcadores externos no forman parte del 
alimento, son utilizados para evaluar la digestibilidad, producción fecal y el consumo 
voluntario, entre los cuales se encuentran: 
 
Óxido de Hierro 
El óxido de Hierro (Fe2O2) fue utilizado como marcador para identificar el inicio y final del 
periodo de colección de muestras en cerdos (Farrell et al., 1983). Compuesto que 
difícilmente se mezcla con el bolo alimenticio, llegando a acumularse en rumen; por lo que 
su uso es limitado en rumiantes (Ayala, 2005). 
 
Polietilenglicol 
El polietilenglicol (PEG) resulta extremadamente soluble en agua, por lo que es utilizado 
como marcador de fluidos (Russell et al., 1982), con una recuperación alta en heces y 
pocos problemas al analizarlo. Sin embargo, se precipita con taninos al ofrecerse con 
alimentos ricos en estos compuestos (Ayala, 2005). El análisis de este marcador se 
realiza por medio de la determinación de la turbidez que produce en una solución, se 
estabiliza para su lectura a 360 nm con ácido tricloroacético (Russell et al., 1982). 
 
 Polietileno 
Utilizado en equinos con 3.5 % de inclusión, dio resultados similares a la CTH con 
recuperación de 103.2%, la elevada recuperación es atribuida a la pérdida de humedad 
 10 
que puede ocurrir en el lapso entre la colección y el deshidratado. Puesto que esta 
pérdida incrementa la cantidad de materia seca extraída y así indirectamente elevar la 
estimación del marcador, (Knapka et al., 1992) de modo que debe hacerse el ajuste 
correspondiente. Por otra parte con 5% de inclusión, se obtuvieron resultados menores a 
la CTH (Chandler et al., 1964) 
 
Sulfato de plata 
El componente iónico sulfato de plata (Ag2SO4) resulta ser un marcador insoluble en el 
tubo digestivo, su recuperación y análisis en heces resulta adecuado, pero es costoso y 
esa desventaja limita su uso (Ayala, 2005). 
 
Tierras raras 
Elementos ampliamente distribuidos en la naturaleza pero en bajas concentraciones, son 
metales que poseen la propiedad de ser sensibles a la temperatura y la presión, son 
treinta elementos que constituyen la serie de los lantánidos y actínidos. Todos ellos 
pertenecientes a los periodos 6 y 7 de la tabla periódica. 
Su uso como marcadores inertes, es por medio de óxidos, de ahí el termino de tierras, 
tales como; él óxido de lantano (La2O3), oxido de itrio (Y2O3) y el óxido de iterbio (Yb2O3) 
pueden ser utilizados exitosamente para determinaciones de digestibilidad (Austreng et 
al., 2000), e incluso resultan en valores similares a los obtenidos con el oxido de cromo. 
Su uso es principalmente para estimar la cinética de la digestión, la rapidez de paso, y los 
tiempos de retención de diferentes nutrientes de los alimentos, ingredientes y partículas 
(Church et al., 2003). El uso del Cerio (Ce) da buenos resultados, sin embargo, su uso es 
limitado debido a la radio-contaminación (Knapka et al., 1992). 
 
Fibra de Cromo Mordiente 
Se fundamenta en atrapar el Cromo (Cr) a la fibra vegetal a través de enlaces, que 
permanecen a través del tracto digestivo, la densidad de la fibra y la tasa de pasaje de 
esta pude ser diferente a la de la fibra no marcada. Es utilizado para estudios de 
digestibilidad y para determinar el avance del bolo alimenticio (Ayala, 2005; Van Soest, 
1994). Se recomiendan bajos contenidos de Cr para minimizar el efecto de la densidad y 
la tasa de pasaje de la fibra, densidades menores a 2.08 g/ml, ya que esta cantidad es 
suficiente para depositarse en el fondo del rumen y generar los efectos indeseables del 
marcador, por lo que las concentraciones de Cr entre 2 y 4% del peso de la fibra llegan a 
 11 
controlar estos problemas (Van Soest, 1994).Se han encontrado variaciones diurnas en la 
excreción del marcador, por lo que se debe tomar muestras de contenido rectal a 
diferentes horas, para determinar la curva de excreción del marcador (Van Soest, 1994; 
Lachman y Araujo, 2005). 
 
Oxido de cromo 
El óxido de cromo (Cr2O3) fue introducido como marcador en 1918 por Edin (Knapka et al., 
1992). Por sus características inertes ha sido uno de los marcadores más antiguos y 
utilizados en estudios de digestibilidad (Lachman y Araujo, 2005). Prácticamente resulta 
insoluble en agua y no se asocia con el alimento, recorre el tracto digestivo en forma de 
suspensión, llegando a sedimentarse en el retículo-rumen y de forma esporádica llega a 
los intestinos, lo que puede llevar a una variación en el patrón de excreción (Van Soest, 
1994). 
En cuanto a su recuperación en heces, la variabilidad en los resultados puede deberse 
a la fineza de moler el marcador que lleva a su retención por el tracto gastrointestinal, esto 
permite explicar recuperaciones bajas del marcador (Jagger et al., 1991), además la 
excreción de este en rumiantes llega a presentarse en recuperaciones menos precisas, 
debido a una excreción fecal irregular (Lachman y Araujo, 2005). Puesto que la técnica 
depende básicamente del muestreo, es posible evitar el efecto de la variación diurna, al 
realizarlo dos veces al día (Van Soest, 1994; Lachman y Araujo, 2005). En el caso de 
reportes con recuperación completa o superior a 100%, puede deberse a la variabilidad 
entre las metodologías de los programas experimentales (Jagger et al., 1991). Sin 
embargo ha sido asociado con muchos problemas como una recuperación inconstante, 
puede oxidar la grasa insaturada (Jagger et al., 1991) así como un cuidadoso empleo, por 
lo que resulta ser carcinogénico para el que lo utiliza y de forma crónica para el animal 
(Lachman y Araujo, 2005). Se ha indicado que las recuperaciones del 93 al 98% no 
defieren, del uso en jaulas metabólicas como en pastoreo (Piasentieret al., 1995) En 
estos últimos ensayos su empleo puede ser por medio de la administración en cápsulas 
de gelatina, una o dos veces al día, resultando más exacta la determinación de la 
excreción fecal, aunque algunas ocasiones su administración no suele coincidir con lo 
excretado (Owens y Handson, 1992). 
La determinación de este marcador puede realizarse con diferentes técnicas 
colorimétricas o de espectrofotometría de luz ultravioleta-visible (UV/VIS) como: Hill y 
Anderson (1958); Fenton y Fenton (1979); Czornocki et al. (1961) y Kozloski et al. (1998) 
 12 
y de espectrofotometría o espectrofotometría de emisión de flama (EEF) o absorción 
atómica (EAA) como: Williams et al, (1962); Robinson et al, (1987); Fadel et al. (1987) y 
Yiakoulaki et al. (1997). Entre estas técnicas existe variación en las cantidades de 
muestra a analizar, uso de diferentes sustancias para la digestión de las muestras, así 
como la obtención de cenizas ya sea por incineración o digestión húmeda y en el caso de 
colorimetría diferentes longitudes de onda, las cuales se describen mas adelante. 
La comparación entre los métodos colorimétrico determinado por luz ultravioleta-visible 
(UV/VIS) y espectrofotometría de emisión de flama (EEF) resultaron en diferentes 
recuperaciones entre los dos métodos donde fue mayor la recuperación a través de la 
EEF (Carciofi et al., 2007), pero en los coeficientes de digestibilidad obtenidos por ambos 
métodos no se encontró diferencia significativa, resultado similares se obtuvieron al 
utilizar una longitud de onda de 350 nm en VIS (Kozloski et al., 1998) 
La digestión ácida de la muestra para la determinación de este marcador puede causar 
pérdida por la volatilización o formación de compuestos insolubles (Christian y Coup, 1954 
y Mir et al., 1989). En cerdos su recuperación de forma individual por medio de la técnica 
de Fenton y Fenton, 1979 dio recuperaciones de 74.6 % y 79.7% en dietas adicionadas 
con 1 y 5 g de Cr2O3 por Kgkg alimento, respectivamente, por otra parte su uso de forma 
combinada con dióxido de titanio ha dado recuperaciones de 93% por medio de un 
análisis con la técnica de EAA Williams et al. (1962) (Kavanagh et al., 2001). En cambio 
un estudio llevado a cabo con novillos, el porcentaje de recuperación fue de 112.3% 
utilizando la misma técnica de análisis de concentración de EAA (Titgemeyer et al., 2001). 
Adicionalmente el uso del Cr2O3 como aditivo en dietas de animales no es aprobado por la 
Food and Drug Adminstration (FDA) en los Estados Unidos de América (Titgemeyer et al., 
2001). 
 
Dióxido de titanio 
El dióxido de titanio (TiO2) tiene gran importancia como pigmento blanco por sus 
propiedades de dispersión, su estabilidad química y su no toxicidad. El dióxido de titanio 
es el pigmento inorgánico más importante en términos de producción mundial. Empieza a 
ser utilizado como marcador de la digestibilidad en algunas especies como; ratas 
(Krawielitzki et al., 1987), cerdos (Jagger et al., 1991), pollos (Short et al., 1996), vacas 
de leche (Hafez et al., 1998), y novillos (Titgmeyer et al., 2001). 
En los últimos años el dióxido de titanio (TiO2), se presenta como una alternativa al uso 
del Cr2O3 (Myers et al., 2004; Titgmeyer et al., 2001; Peddie et al., 1982), ya que los 
 13 
estudios realizados con este marcador, demuestran que su recuperación no es al 100%. 
El TiO2 ha sido poco estudiado como marcador de digestibilidad para los rumiantes, 
siendo mayormente utilizado en aves y cerdos (Jagger et al., 1991; Short et al., 1996). 
De acuerdo con Leone en 1973 y con una técnica similar propuesta por Jagger et al. 
(1991), su determinación se basa en el uso del H2O2 para su análisis por medio del 
cambio del Ti4+ incoloro, hacia un color naranja, puesto que al transformarse en Ti3+ es de 
un color violeta (Barriel, 1999), sin embargo la mezcla de TiO2 y H2O2 forma H4TiO5 (Snell 
y Snell 1949). A su vez, Vogel et al., (1989) sugirieron que el ion formado es TiO2 (SO4)2-. 
Por lo que ambos compuestos pueden estar presentes con la reacción inicial que forma 
H4TiO5 que disocia en el TiO2 (SO4)2-
En el caso de ganado bovino, se encontró una excreción constante de 94.6% y sin 
diferencias a partir de los días 7 al 21, también demostró que puede ser utilizado para 
estimar la digestibilidad en dietas para rumiantes, ya que dio recuperaciones fecales del 
90% al 95% (Titgemeyer et al., 2001) sin embargo al comparar los coeficientes de 
, formando el color anaranjado (Jagger et al., 1991). 
Muhlebach et al, (1970), informaron que el color de la reacción de TiO2/H2O2 es 
anaranjado debajo de un pH ácido de 1, se pone amarillo alrededor de un pH 3, y 
gradualmente disipa conforme aumenta el pH hacia la región alcalina. Leone (1973), 
afirma que los elementes causantes de interferencias con el Ti, son el Hierro (Fe), Niquel 
(Ni), Cobre (Cu), Cobalto (Co), Molibdeno (Mb) y Cromo (Cr), sin embargo Kavanagh et 
al., (2001), Titgemeyer et al., (2001) y Jagger et al., (1991) utilizaron el Cr y el Ti 
combinados sin interferencias en su análisis, con métodos colorimétricos. 
En otros estudios, el uso del TiO2 sobre el Cr2O3 en pollos de engorda, resultó más 
confiable que el cromo como marcador de la digestibilidad, siendo menos variable y 
obteniéndose mayor digestibilidad, lo cual indica una mayor recuperación (Short et al., 
1996). El uso de este marcador para evaluar el contenido de energía metabolizable de los 
alimentos en aves de corral, dio resultados de recuperación en heces del 98%, superiores 
al Cr (Sales y Janssenes, 2003). 
En cerdos las recuperaciones obtenidas a partir de dietas adicionadas con 1 y 5 g/kg 
de alimento fueron de 98.3% y 96.9% respectivamente por medio de la técnica de Jagger 
et al., (1991). En combinación con Cr2O3 el TiO2 dio recuperaciones menores que el 
primero siendo 96% y 92.3% respectivamente cuando se utilizó la técnica de Short et al, 
(1996), los coeficientes de digestibilidad obtenidos resultaron menores para el TiO2 con 
respecto a la CTH y sin diferencias para CIA y Cr2O3 (Kavanagh et al., 2001). 
 14 
digestibilidad obtenidos con el TiO2 y la CTH, se encontró una subestimación de los 
valores obtenidos a partir del titanio entre 1.1 y 5.5 unidades porcentuales. 
Con base en lo anterior, el uso de este marcador puede ser una opción para la 
investigación ya que es inerte, sin embargo su análisis, por medio de la 
espectrofotometría de absorción o emisión, no ha sido citado en estudios de digestibilidad. 
 
2.4. Métodos utilizados en el análisis de marcadores externos 
La mayoría de los marcadores utilizados llegan a ser excretados por los animales sin que 
estos interactúen con el alimento o en los mismos procesos fisiológicos de la digestión 
(Cavalieri et al., 2007), posteriormente son cuantificados en heces, por lo que la precisión 
en su análisis de laboratorio y recuperación total resultan esenciales para un apropiado 
estudio de digestibilidad (Saha y Gilbreath, 1991). 
La detección de la concentración del marcador en heces puede realizarse por medio de 
la espectrofotometría de luz ultravioleta-visible (UV/ VIS) y la espectroscopía o 
espectrofotometría de absorción atómica (EAA) o de emisión de flama (EEF). Las 
diferencias entre cada metodología están dadas por la absorbancia obtenida por la 
sustancia (UV/VIS) o la absorbancia dada por los átomos libres del elemento a estudiar 
(EEF). 
 
2.4.1. Espectrofotometría de luz ultravioleta-visible 
 
Las moléculas pueden absorber la energía de la luz y almacenarla como energía, de esta 
forma es posible la medición de la luz que transmite una solución para determinar la 
concentración, por medio de la luz que absorbe el material presente en la solución 
(Softley, 1994). La espectrofotometría es utilizada para análisis de minerales, vitaminas, 
constituyentes sanguíneos y otros compuestos (Barriel, 1999), es ampliamente utilizado 
en laboratoriosdebido a su bajo costo (Kozloski et al., 1998). El principio de la 
espectrofotometría, es aplicado, al observar una solución y determinar en cual existe una 
mayor concentración tan solo con la intensidad del color que presente (Barriel, 1999). 
Las unidades de medida en la espectrofotometría son la transmitancia y absorbancia. 
Entendiéndose como transmitancia; “La medida de la intensidad de la luz que emerge de 
 15 
una solución y de la luz que incide en la solución” (Fritz y Schenk, 1979). La transmitancia 
puede ser expresada como: 
T = Is/Ie 
Donde: 
• T = Transmitancia 
• Is = intensidad de la luz saliente 
• Ie =intensidad de la luz que entra. 
En la práctica no se miden las intensidades de luz, pero sí se utiliza el paso de la luz al 
ser absorbida por el material un una solución (Fritz y Schenk, 1979). Los valores de 
transmitancia van del 0 al 1.0, generalmente se expresan en porcentaje (Barriel, 1999). 
La absorbancia o densidad óptica (D.O) es el logaritmo negativo de la transmitancia y 
es utilizada sobre esta, ya que en ciertas condiciones, la luz absorbida es directamente 
proporcional a la concentración del material en la solución (Fritz y Schenk, 1979; Barriel, 
1999; Softley, 1994). 
 
2.4.1.1. Regiones de la espectrofotometría 
 
Las regiones del espectro electromagnético comúnmente utilizadas en la 
espectrofotometría resultan ser la luz visible, infrarroja y ultravioleta (UV) (Barriel, 1999), 
siendo para la luz visible la medición de la luz, que absorbe un ion o molécula por si 
mismo (Fritz y Schenk, 1979). La presencia de color en la solución absorberá luz en 
cualquiera de las regiones infrarroja o ultravioleta. En el caso de compuestos que no 
absorben cantidades apreciables de luz, se utiliza una reacción que produzca un complejo 
que realmente la absorba, como sucede en el análisis de glucosa o fósforo (Fritz y 
Schenk, 1979, Barriel, 1999). 
La energía luminiscente es caracterizada de acuerdo a una longitud de onda, la cual es 
medida en nanómetros (nm), donde un nm equivale a 10-9 metros (Fritz y Schenk, 1979). 
La longitud de onda será específica al color visible de la solución a analizar, puesto que la 
luz absorbida por ésta se encuentra en una región específica como se muestra en el 
Cuadro 1. 
 16 
Cuadro 1. Color de luz visible y absorbida de acuerdo a su longitud de onda (λ) 
(Barriel, 1999). 
λ (nm) Color visible Color absorbido 
400-420 Verde-Amarillento Violeta 
429-450 Amarillo Violeta-Azul 
450-490 Naranja Azul 
490-510 Rojo Azul-Verde 
510-545 Púrpura Verde 
545-580 Violeta Verde-Amarillo 
580-630 Azul Amarillo 
630-720 Azul-Verde Rojo 
 
En la colorimetría, puede representarse a grandes rasgos el color obtenido a partir de los 
iones a analizar, los aniones son incoloros y los cationes tienen color (Barriel, 1999). 
Las demás regiones UV e infrarroja, presentan diferentes intervalos siendo las 
superiores para la luz infrarroja con más de 750 nm, e inferiores para luz UV de 10 a 380 
nm (Fritz y Schenk, 1979). La absorción de la luz está en función de la longitud de onda 
que es capaz de absorber cada elemento químico, ya que la longitud de onda 
corresponde a la energía necesaria para causar un cambio en la configuración electrónica 
del compuesto químico (Fritz y Schenk, 1979). Debido a que la absorción de luz por las 
moléculas, genera cambios eléctricos, vibracionales y rotacionales en su composición 
(Softley, 1994). 
Los cambios eléctricos se deben a que la energía de los electrones en la molécula, es 
cambiada (Softley, 1994). Los cambios vibracionales suceden cuando se modifica la 
distancia entre los núcleos de dos o más átomos, y los rotacionales suceden cuando una 
molécula gira alrededor de un centro gravitacional (Fritz y Schenk, 1979). La variedad de 
cambios en la molécula que pueden suceder por la absorción de luz depende de la 
longitud de onda a la que es expuesta la molécula, por lo que es importante seleccionar la 
longitud de onda donde se presente la mayor absorbancia (Fritz y Schenk, 1979; Softley, 
1994). 
 
 17 
2.4.1.2. Determinación de la concentración por medio de la espectrofotometría 
 
La determinación de la concentración en una solución por medio de su análisis con 
espectrofotometría puede realizarse aplicando la ley de Beer, ya que un 
espectrofotómetro proveerá de una fuente de luz con una determinada longitud de onda, 
la cual es determinada de acuerdo al espectro electromagnético de la sustancia a 
analizar, por medio de una serie de sustancias con concentraciones conocidas, que son 
llamadas estándar, a las cuales se obtendrá su absorbancia por medio de un 
espectrofotómetro (Softley, 1994). 
Una vez que el espectro de absorción ha sido determinado, es posible aplicar el 
principio de la espectrofotometría para determinar la concentración de un compuesto en 
una solución. Como se mencionó dentro de los principios de la espectrofotometría 
destaca la ley de Beer que nos indica; “para la transmitancia de una solución que contiene 
al material, la absorción de luz dependerá de la naturaleza de la solución, la longitud de 
onda, la distancia de la fuente de luz y la concentración de la sustancia” (Fritz y Schenk, 
1979, Softley, 1994), expresándose como: 
T=10-klc 
Donde “k” es la constante para la sustancia, “l” es la distancia de la fuente de luz y “c” es 
la concentración del material absorbente de luz. Pero como se mencionó anteriormente, 
utilizaremos el –log de la T, es decir la densidad óptica o absorbancia, esta formula 
quedaría como: 
(Absorbancia) –log T = klc 
 
La ley de Lambert también llega a ser aplicada dentro de estos análisis, puesto que 
consiste en agregar a los criterios de la ley de Beer, la distancia que recorre la luz en 
dicha substancia, la cual puede resultar en una absorbancia diferente, incluso dentro de 
una misma muestra, por lo que las celdas a utilizar para el análisis, deben de ser del 
mismo tamaño y material (Softley, 1994). 
 
 18 
2.4.1.3. Métodos utilizados para la determinación de la concentración por 
medio de la espectrofotometría 
 
Una vez que se conoce la absorbancia y la concentración de cada estándar, la longitud de 
onda será la misma para el análisis y así se podrá analizar una sustancia de 
concentración desconocida por medio de su absorbancia. Para esto se consideran tres 
métodos (Fritz y Schenk, 1979). 
El primer método es conocido como “estándar cerrado”, para esto necesitamos las 
absorbancias de los estándares y de la sustancia de concentración desconocida, 
utilizando el estándar que tenga la absorbancia mas cercana a la sustancia a analizar 
(Fritz y Schenk, 1979). 
Utilizando la formula de la ley de Beer, obtenemos las siguientes ecuaciones: 
 Absorbancia (A) desconocida = k l c desconocida 
 Absorbancia (A) estándar = k l c estándar 
Ya que el estándar y la desconocida son las mismas sustancias, “k” será igual en ambas 
ecuaciones, por lo que pasaría lo mismo con “l” ya que la celdas de lectura poseen las 
mismas dimensiones. Al dividir ambas ecuaciones obtenemos: 
A desconocida / A estándar = C desconocida / C estándar 
Despejando la ecuación para la concentración desconocida: 
 C desconocida = C estándar x (A desconocida / A estándar) 
Así al sustituir los valores de concentración del estándar y las absorbancias podremos 
conocer la concentración desconocida (Fritz y Schenk, 1979). 
 
El segundo método es conocido como la curva del estándar y es por medio de un plano 
en el que sustituimos en el eje de las “X” la absorbancia de los estándares y la 
concentración de estos en el eje de las “Y”, trazando así una línea que nos permitirá 
conocer la concentración de una sustancia, al buscar la coordenada que coincida con la 
absorbancia y la línea trazada, como se muestra en la Figura 1. 
 19 
 
Figura 1. Método de curva del estándar. 
 
En el tercer método también es necesario generar una curva con estándares, pero pormedio de una regresión lineal, siendo así un método altamente deseable, ya que nos 
permite confiar en los límites de la estimación para la predicción de la concentración de 
una sustancia (Fritz y Schenk, 1979). 
 
2.4.1.4. Factores a considerar que pueden alterar los análisis de 
espectrofotometría 
 
Entre los factores que pueden alterar los análisis de espectrofotometría sobresale la 
concentración del constituyente es decir se debe asegurar que se encuentre dentro de un 
intervalo de concentración óptima para poder aplicar la ley de Beer (Softley, 1994). 
La concentración del reactivo no debe exceder la necesaria para evitar saturar la reacción 
(Fritz y Schenk, 1979). 
La estabilidad del color debe ser estudiada puesto que algunas veces con el paso del 
tiempo es inestable (Fritz y Schenk, 1979, Softley, 1994). 
La temperatura de las muestras puede afectar la lectura, por lo que las muestras 
calientes pueden altera el color o la reacción (Barriel, 1999, Softley, 1994), por lo que, 
algunas técnicas aconsejan dejar enfriar las muestras a temperatura ambiente para su 
lectura con espectrofotometría (Hill y Anderson 1958; Titgmeyer et al., 2001). 
 20 
Las interferencias iónicas se presentan cuando cationes o aniones interactúan con el 
reactivo y eviten la formación del compuesto a estudiar y por último, existe la naturaleza 
del solvente, por lo que es importante el uso de blancos, esto es: uso del reactivo sin 
muestra para corregir lecturas (Fritz y Schenk, 1979; Barriel, 1999). 
 
2.4.1.5. Componentes básicos de un espectrofotómetro 
 
La fuente de luz generalmente emite un tipo continuo con un amplio rango de longitud de 
onda, por lo que es necesaria la emisión de luz visible y ultravioleta siendo de 200 a 750 nm. 
La lámpara de filamento tungsteno es comúnmente usada en la región visible y la lámpara 
de descarga de deuterio en la región UV (Softley, 1994). 
Para seleccionar la longitud de onda a utilizar proveniente de la fuente de luz, es 
necesario un monocromador, la selección puede ser por medio de la banda de paso (Fritz 
y Schenk, 1979, Softley, 1994). Las partes del monocromador son: abertura de entrada, 
lente o espejo que produce que la luz viaje en rayos paralelos, sitio de dispersión que 
selecciona la luz en sus diferentes longitudes de onda, espejo o lente de enfoque y 
abertura de salida (Softley, 1994). El sitio de dispersión usualmente es un prisma o una 
parrilla de difracción, esta última se compone de una superficie que contiene paneles 
paralelos con una longitud de onda específica, la luz calienta la parrilla y es difractada en 
diferentes longitudes de onda que pueden ser seleccionadas. Las abertura ajustan la 
banda de paso espectral del monocromador (Softley, 1994). 
La celda objetivo puede variar en tamaño y forma dependiendo del espectrofotómetro. 
Las celdas de cristal pueden ser utilizadas en el rango visible, pero las de cuarzo y sílice 
son necesarias para el rango de UV, ya que el cristal de boro silicato puede absorber la 
radiación de longitudes de onda pequeñas (Barriel, 1999; Softley, 1994). 
Un fototubo de vacío funciona como el típico detector. Con cátodo de plata u óxido de 
plata niquelada con cesio y un ánodo son introducidos en un tubo de vidrio al vacío. 
Donde el ánodo se mantiene a un voltaje relativamente positivo con respecto al cátodo. 
Cuando los fotones de luz golpean al cátodo, los electrones son ionizados lejos del cesio 
y golpean el ánodo, produciendo una corriente, ésta puede ser ampliada y convertida en 
una forma útil de lectura (Fritz y Schenk, 1979). Los componentes básicos de un 
espectrofotómetro se muestran en la Figura 2. 
 21 
 
Figura 2. Componentes básicos de un espectrofotómetro. 
(Adaptado de Fritz y Schenk, 1979). 
 
2.4.2. Espectrofotometría de emisión de flama y absorción atómica 
 
La Espectrofotometría o espectrofotometría de absorción atómica (EAA) y de emisión de 
flama (EEF) son técnicas de análisis para determinar la concentración de elementos 
metálicos. Siendo considerada la EAA con un mayor grado de precisión (Yiakoulaki et al., 
1997; Kozloski et al., 1998), sensibilidad (Cavalieri et al., 2007) incluso a concentraciones 
de 0.5 mg/g de Cromo (Yiakoulaki et al., 1997). 
 
2.4.2.1. Espectrofotometría de emisión de flama 
 
La emisión de flama consiste en medir la intensidad de la radiación de los átomos 
excitados a diferencia de la absorción atómica que mide la absorción de la luz por los 
átomos libres (Haswell, 1991). 
La EEF funciona de modo en que la muestra es rociada sobre una flama, ocasionando 
que el solvente se evapore, dejando partículas solidas en el aire, las cuales se 
encontraban disueltas en el solvente, posteriormente estas partículas solidas son 
convertidas en vapor y separadas en átomos gaseosos (Softley, 1994; Haswell, 1991). 
Mg Cl2 (sólidos) Mg Cl2 (gas) Mg (gas) +Cl2 (gas) 
El calor de la flama excita los átomos en forma de gas, al retornar a un estado sin 
excitación los electrones emiten un fotón de luz visible o UV (Haswell, 1991). 
 Mg (gas) Mg (gas) Mg (gas) + fotón ( =estado excitado) 
 22 
Cuando el calor y la evaporación de la muestra son constantes, la luz emitida por los 
átomos será directamente proporcional a su concentración en la muestra. Por lo que la luz 
generada en el análisis del mineral presenta una longitud de onda específica, donde un 
monocromador selecciona la luz que llega a este, y por medio de estándares se 
determinará la concentración en las muestras (Haswell, 1991). 
 
2.4.2.2. Interferencias en el análisis con emisión de flama 
 
Se ha encontrado que la intensidad de la luz emitida no presenta un comportamiento 
lineal con respecto a la concentración de la muestra por lo que los análisis por medio de la 
emisión de flama, utilizan regresiones poligonales o cuadráticas para encontrar la 
ecuación apropiada de acuerdo a los estándares (Fritz y Schenk, 1979, Haswell, 1991). 
Esto puede deberse a que la energía producida por un átomo puede absorberse por otro 
del mismo elemento, disminuyendo la intensidad de luz emitida, incluso las interferencias 
producidas por luz proveniente de átomos de otros elementos que se encuentren en la 
muestra con una línea espectral muy cercana a la del mineral analizado, por lo que es 
importante usar soluciones blanco para corregir las lecturas, aun con el uso de un 
monocromador (Haswell, 1991). 
Las interferencias de tipo iónico, como su nombre lo indica, es la ionización de los 
átomos, por lo que la luz emitida en su longitud de onda deseada disminuye. El uso de 
sales fácilmente ionizadas puede solucionar esta interferencia, pero un exceso de 
electrones de esta sal revierte el equilibrio en el elemento de interés, por lo que varios de 
estos átomos son ionizados (Fritz y Schenk, 1979, Haswell, 1991). 
Los problemas en las condiciones de la flama producen interferencias en el número de 
átomos en estado excitado (Williams et al., 1962). Esto puede ser corregido con el uso de 
estándares internos adicionados en una cantidad conocida a todas las muestras, este 
debe tener una línea espectral cercana al mineral a analizar. Si la intensidad en la emisión 
del estándar interno cambia, se podrá ajustar los valores de intensidad del elemento de 
interés (Fritz y Schenk, 1979). 
La formación de sales u óxidos en la muestra producen interferencias de tipo químico, 
ya que ocasiona que algunos átomos no puedan liberarse (Williams et al., 1962). 
 
 23 
2.4.2.3. Espectrofotometría de absorción atómica 
 
La EAA a diferencia de la EEF necesita una fuente de luz que emita una línea espectral 
igual a la que va a analizar y en donde los átomos libres absorban esta luz. Donde se 
aplica la ley de Beer, debido a que la absorción de luz es proporcional a la concentración 
del elemento. La EAA es menos susceptible a las interferencias que se encuentran en la 
emisión de flama, con excepción delas interferencias químicas que afectan ambos tipos 
de Espectrofotometría (Yiakoulaki et al., 1997; Kozloski et al., 1998). 
La fuente de luz en la absorción atómica es conocida como lámpara de cátodo hueco, la 
cual contiene un gas noble en su interior como neón o argón, por su parte el cátodo esta 
hecho del elemento a analizar. Al aplicar voltaje, el gas es ionizado, estos iones golpean 
al cátodo (Fritz yy Schenk, 1979), ocasionando así la liberación de átomos del cátodo que 
interactúan con los del gas, ocasionando su excitación, al regresar a un estado normal, 
los átomos despiden una luz con la longitud de onda deseada (Haswell 1991). 
 
2.4.2.4 Partes de un espectrofotómetro de absorción atómica 
 
La luz emitida por la lámpara de cátodo hueco es controlada por un detector el cual 
distingue la luz que proviene de los átomos libres en la flama. De esta forma se evita que 
los valores de absorbancia sean menores de lo que son realmente (Haswell, 1991; Barriel, 
1999). El control puede ser por un corte manual de la luz o alternando la corriente de la 
fuente de luz y poniendo al detector en la misma frecuencia, en cualquiera de estos, la 
emisión constante de luz por los átomos libres en la flama no es afectada por el detector 
(Haswell, 1991). 
Los aparatos actuales utilizan cámara de pre mezcla, el cual junta el oxidante y la 
muestra antes de entrar a la flama, logrando una flama más estable y el consumo total. El 
nebulizador se encarga de convertir la muestra en una fina aspersión previa a la 
combustión (Haswell, 1991). El monocromador y detector utilizado en la absorción 
atómica son en principio iguales a los utilizados en espectrofotometría, Estos 
componentes se muestran en la Figura 3. 
 
 24 
 
Figura 3. Componentes básicos del espectrofotómetro de absorción (Fritz y Schenk, 1979; 
Haswell, 1991). 
 
2.5. Técnicas utilizadas para la determinación de Óxido de Cromo (Cr2O3) 
 
Las diferentes de técnicas para el análisis de concentración del Cr2O3 varian en 
composición de los disolventes para la suspensión, así como en la longitud de onda 
utilizada en el análisis, por lo que a continuación se resumen las diferentes técnicas 
reportadas. 
La técnica de espectrofotometría VIS propuesta por Hill FW y Anderson DL, (1958) 
consiste en una pre-digestión de 1.5 g de muestra con ácido nítrico concentrado ya sea 
una noche antes para facilitar la digestión, aunque alguna veces este paso no llega a ser 
necesario, posteriormente se realiza la digestión por medio de un reactivo de molibdato de 
sodio (10 g por cada 500 ml de solución), 30% de agua destilada, 30% de ácido sulfúrico 
(H2SO4) y 40% de ácido perclórico (HClO4) al 70%, este paso se lleva acabo por medio de 
la ebullición del reactivo con la muestra que contiene el Cr2O3, hasta obtener un color 
amarillo, anaranjado o rojo dependiendo de la concentración de cromo. La densidad 
óptica es analizada a 430 nm en un espectrofotómetro. La curva obtenida para el 
estándar, es por medio de alícuotas de una solución obtenida a partir de 0.5 g de óxido de 
cromo puro. 
Otra técnica similar, propuesta por Fenton TW y Fenton M., (1979) consiste en 
incinerar la muestra a 450°C antes de la suspensión, en seguida se utiliza una solución 
similar a la técnica de Hill y Anderson (1958) a 200°c, posteriormente es aforada a 200 ml 
de volumen y centrifugada a 700 g por 5 minutos, obteniéndose 5 ml para su lectura a 440 
nm. La digestión de la muestra oxida el Cr2O3 en CrO3, el cual dentro de la solución forma 
ácido crómico (H2O y H2CrO), posteriormente se polimeriza por la pérdida de agua del 
 25 
ácido dicrómico, ácido tricromico y en polímeros mayores. Dentro de dicho procedimiento 
se observa el efecto causado por el H2SO4 de disminución en la densidad óptica en 0.010 
unidades (U) por mililitro (ml), con el HClO4 el decremento fue de 0.001 U/ml. Esto puede 
ser debido por el efecto deshidratante del H2SO4 causando un equilibrio en la mayoría de 
los polímeros que poseen una absorción similar a la del ion de dicromato. Debido a esta 
condición de equilibrio, es importante mantener la concentración de ácido lo más 
constante posible (Fenton y Fenton, 1979). Esta técnica se basa en el principio de la 
oxidación del Cr2O3 para formar dicromato (Cr2O42-) por medio de la oxidación presente 
durante la ebullición, con un exceso de persulfato el cual es eliminado por medio del calor 
(Cavalieri et al., 2007). Utilizando el principio de que el Cr3+ y el Cr2+ de color natural verde 
y azul respectivamente, cambian hacia amarillo y naranja al oxidarse en cromato y 
dicromato (Barriel, 1999). 
Dentro de esta técnica, la solución de digestión, difiere en su composición con respecto 
a la de Hill FW y Anderson DL., 1958, en donde se utiliza 70% de ácido sulfúrico 
concentrado y 30 % de ácido perclórico al 70%. 
En otros estudios, que utilizan esta técnica, la densidad óptica es determinada a 
diferentes longitudes de onda, como a 450 nm (Cavalieri et al., 2007) o incluso a 415 nm 
(Sandoval et al., 2001). 
Czarnocki et al. (1961) utilizan diferentes cantidades de muestra dependiendo de su 
tipo, por ejemplo: 1 g para heces y 2 g para alimento, la incineración es a 450°C, con una 
densidad óptica de 350 nm, a su vez el tiempo de digestión es de 15 minutos, 
posteriormente del primer cambio de color verde a naranja/amarillo, cabe mencionar que 
durante su estudio no se encontró efecto alguno sobre la D.O. al utilizar H2SO4 combinado 
con HClO4. Por otra parta Kozloski et al. (1998) utilizaron esta técnica con la variación de 
utilizar 2 g de muestra independientemente si es alimento o heces. 
La técnica de Espectrofotometría propuesta por Williams et al. (1962) donde las 
muestras son incineradas a 600°C por 1.5 h y digeridas por medio de una solución de 
acido fosfórico, sulfato de manganeso y bromato de potasio, al mantener en ebullición la 
muestra obtuvieron un color purpura. La ausencia del HClO4 es justificada, debido a que 
satura las soluciones de perclorato de potasio, que puede afectar la generación adecuada 
de la atomización, ocasionado errores, se recomienda adicionar calcio (Ca) en cantidad 
de 4000 partes por millón (ppm) a la muestra para evitar posibles interferencias. 
 
 26 
Robinson et al. (1987) realizaron una modificación a la técnica utilizando 50 mg de 
muestra de Cr Mordiente y 500 mg de heces para su análisis, adicionándole 156 ml de 
ácido nítrico en un baño de agua a 20 o 30°C aumentando la temperatura gradualmente 
hasta llegar a los 75°C por una hora, posteriormente se agregan 50 ml de agua destilada 
dejándose enfriar a temperatura ambiente, se prosigue a centrifugar a 1000 g por 10 
minutos y el sobrenadante es utilizado para la EAA. 
Por otra parte Fadel et al. (1987), proponen utilizar 0.67g de muestra de contenido 
ruminal o heces en 20 ml de solución HNO3 4M (molar) por un tiempo de cuatro horas a 
temperatura ambiente, posteriormente a 75°C por 12 horas. Permitiendo sedimentarse a 
temperatura ambiente, se utiliza el sobrenadante para el análisis de Cr por 
espectrofotometría de absorción atómica. 
Otra modificación es la de Yiakoulaki et al. (1997) quienes propusieron el uso de una 
fusión alcalina. Con 0.5 g de muestra incinerada a 560°C por tres horas, posteriormente 
se agrega 2 g de Na2O2, el cual debe estar perfectamente mezclado con la muestra, la 
cual es calentada y se obtiene un color amarillo brillante, en caso de no obtenerlo se 
agrega HCl, para su posterior análisis con EAA. 
 
2.5.1. Interferencias 
 
Las interferencias encontradas en el análisis de Cr2O3 por medio de esas técnicas han 
sido la formación de silicatos insolubles en ácido, formados durante la incineración de las 
muestras que pueden absorber el Cr (Mir, 1989). La volatilización de compuestos como 
clorhidrato de cromo, por medio del uso de ácido perclórico (Mir, 1989) aunque Fenton y 
Fenton (1979), encontraron un menor efectocausado por el HClO4 que con el H2SO4 al 
disminuir la densidad óptica de las muestras analizadas. 
Algunas partículas de la muestra tienden a flotar en el ácido utilizado en la digestión, 
por lo que pueden adherirse a las paredes de los crisoles, y existir una pérdida de 
contacto de estas partículas de la muestra y el ácido, resultando en una suspensión 
incompleta y una recuperación variable del Cr (Mir, 1989). 
 
2.5.2. Recuperaciones 
 
En un experimento realizado por Mir et al., (1989) el porcentaje de recuperación de Cr en 
heces frescas (HFF) fue mayor que el obtenido por las muestras deshidratadas, de las 
 27 
cuales la deshidratación con microondas resulta mejor que la de aire forzado (P<0.05). En 
ambos casos las recuperaciones obtenidas fueron menores al 100% 
Recuperaciones de Cr en forma Mordiente por medio de diferentes métodos de 
deshidratación de la muestra dieron menores recuperaciones por medio del horno de aire 
forzado con un 68.3%, con tratamiento de Tween 80 (Mir et al., 1989). 
 
2.6. Técnicas utilizadas para la determinación de TiO2 
La técnica utilizada para sel análisis de TiO2 a través de la espectrofotometría. (Leone, 
1973), recomienda incinerar la muestra a 850 °C, al enfriarse se añade 1.5 g de sulfato de 
sodio (Na2SO4) y 10 ml de H2SO4, calentándolos hasta la ebullición, dejándolos enfriar y 
posteriormente se agrega 30 ml de H2O, siendo aforado a 100 ml con agua destilada y 
obteniéndose 3ml para su análisis agregándose 0.2 ml de H2O2 leyéndose a 408 nm. 
Por otra parte Jagger et al. (1991) modificaron esta técnica al digerir por 30 minutos 0.5 
g de muestra utilizando 20 ml de acido sulfúrico (H2SO4) al 42% y el uso de catalizadores 
Kjeltabs, aforándolas a 100 ml con agua destilada y filtrándolas. Obtuvieron una alícuota 
de 5 ml adicionándole 0.2 ml de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 30% y leyeron también a 
408 nm. 
En la técnica propuesta por Short et al. (1996) utilizaron una incineración a 600°C por 
13 horas, seguida por una suspensión con acido sulfúrico concentrado, mas la adición de 
20 ml de H2O2 al 30% leyeron a 400 nm. Titgmeyer et al. (2001), modifica la técnica de 
Short et al. (1996) al reducir el volumen a 10 ml de H2O2 a 30%. 
La técnica propuesta por Myers et al. (2004) utilizaron una digestión húmeda por medio 
de 13 ml de H2SO4 a 420°C por 2 horas, con la adición de un catalizador con 3.5 g de 
sulfato de potasio (K2SO4) y 0.4 g de sulfato de cobre (CuSO4), posteriormente agregaron 
10 ml de H2O2 a 30%, a diferencia de otras técnicas, se recomendó el uso de matraces 
gravimétricos de 100 g y papel filtro Whatman del No. 541, leyeron a una absorbancia de 
410 nm, sin embargo existe la dificultad de hervir H2SO4 por mas de 30 minutos en alturas 
superiores a los 2, 200 msnm (Myers et al., 2004) . 
En peces se encuentra la técnica propuesta por Richter et al. (2003) utilizando 
aproximadamente de 30 a 40 mg de muestra de alimento y heces, digeridas con 10 ml de 
H2SO4 al 96% y 1.5 g de catalizador (K2SO4+CuSO4+5H2O) a 400°C por 4 h y transferidas 
a vasos volumétricos de 25 ml y llevados al volumen con agua destilada, dejándose 
enfriar por 12 h, posteriormente con una alícuota de 1.0 ml y se adiciona 0.1 ml de H2O2 a 
 28 
35%, dejándose reposar por 1 h y leídas a 405 nm. Por medio de esta técnica encontraron 
recuperaciones del 90% en Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus). 
El análisis de TiO2 por medio de espectrofotomoetria de absorción atómica como 
marcador de la digestibilidad no ha sido citado hasta el momento. 
Las diferentes técnicas mencionadas, utilizaron una variedad en disolventes, los cuales 
pueden influir al disminuir la absorbancia (efecto hipocrómico) obtenida del compuesto 
analizado como lo mencionan Fenton y Fenton, (1979) y Williams et al. (1962) o incluso 
aumentarla (efecto hipercrómico) ya que pueden unirse al conjunto de átomos a analizar 
(cromóforos) grupos ácidos o básicos (auxocromos) y tender a intensificar la longitud de 
onda de los cromóforos (Higson, 2007). 
 29 
3. Objetivos 
 
3.1. Objetivo General 
Evaluar el Cr2O3 y TiO2 como marcadores de la digestibilidad. 
 
3.2. Objetivos Específicos 
 
1. Evaluar in vitro la precisión de los procedimientos de espectrofotometría (UV/VIS 
versus EAA) para cuantificar la recuperación de los marcadores Cr2O3 y TiO2 solos 
y en mezcla, en muestras de alimento ofrecido, contenido duodenal y heces de 
ovinos y bovinos. 
2. Determinar la recuperación de Cr2O3, TiO2 solos y en mezcla mediante una prueba 
de digestibilidad in vivo con ovinos. 
3. Comparar las estimaciones obtenidas de digestibilidad de materia seca (DMS), 
materia orgánica (DMO), fibra detergente neutro (DFDN) y nitrógeno total (N) con 
CTH y los marcadores Cr2O3 y TiO2 solos y en mezcla. 
 
4. Hipótesis 
1. La recuperación de los marcadores TiO2, Cr2O3 y su mezcla (Cr2O3+TiO2, 
TiO2+Cr2O3), es distinta según la técnica de análisis utilizada (espectrofotometría 
UV/VIS y EAA) para su cuantificación en muestras de alimento, contenido 
duodenal y heces de ovinos y bovinos. 
2. La recuperación de los marcadores TiO2, Cr2O3 y su mezcla (Cr2O3+TiO2, 
TiO2+Cr2O3) es distinta según el nivel de marcador utilizado y la técnica de análisis 
(espectrofotometría y absorción atómica) usada para su cuantificación en muestras 
de alimento, contenido duodenal y heces de bovinos y ovinos. 
3. En estudios de digestibilidad del alimento en ovinos el uso de TiO2 sólo o en su 
mezcla con Cr2O3 permite predicciones de digestibilidad similares a las obtenidas 
por colección total de heces o a la utilización de Cr2O3 como marcador. 
 
 
 30 
5. Material y Métodos 
 
En el presente estudio se realizaron dos experimentos, que a continuación se describen. 
 
5. 1. Experimento 1. Recuperación in vitro de Cr2O3, TiO2 y sus mezclas 
 
Animales y toma de muestras 
 
Se utilizaron seis ovinos machos (PV 35 ± 4.25 Kg) y seis bovinos machos (PV 190 ± 120 
Kg) alimentados con heno de avena 28% de la ración y concentrado comercial 72% de la 
ración en base seca. Los animales fueron habilitados con cánulas en duodeno proximal 
(Zinn y Plascencia, 1993). El contenido duodenal se colectó de 0 a 5 (8:00 a 13:00) y 6 a 
11 (14:00 a 19:00) horas post ingestión, por 5 días. Diariamente se colectaron muestras 
de heces directamente del recto, por cinco días. Las muestras de heces se mezclaron 
para obtener una muestra compuesta de cada tipo de animal. Lo mismo se realizó con el 
contenido duodenal y se conservaron en congelación a -20°C hasta que finalizo el periodo 
de muestreo. Posteriormente se deshidrataron en recipientes de vidrio en una estufa de 
aire forzado (Lindbergh Blue M) a 50°C 48h. En el caso del contenido duodenal y heces 
se usaron charolas de aluminio. Una vez secas las muestras se molieron en un molino de 
café (Braun) a un tamaño de partícula de 1mm para heces y contenido duodenal. Para 
alimento se utilizo un molino de granos (Arthur Thomas) con una criba de 1mm. 
 
Análisis de las muestras 
 
En un vidrio de reloj se pesaron por cuadruplicado los diferentes niveles de Cr2O3 y TiO2 y 
su mezcla, siendo para heces: 0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2 %, para alimento y contenido 
duodenal: 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 %, con pesos de 1.5 g de muestra para la técnica propuesta 
por Hill y Anderson, (1958) y 0.5g para la técnica propuesta por Titgemeyer et al. (2001) 
en una balanza analítica (Sartorius 3L 120) en vasos de precipitado de 80 ml, una vez 
adicionados los marcadores se homogenizaron por agitación y se cuantificaron por medio 
de la técnicas mencionadas y un espectrofotómetro VIS (Thermo Fisher Scientific modelo 
Genesys 10 Vis), a una longitud de onda de 430 nm para Cr2O3 y 410 nm para TiO2, y un 
espectrofotómetro de absorción atómica (Perkin Elmer 3110) con una lámpara de Cr y Ti 
(Perkin Elmer). La curva de calibración analítica fue por medio del uso de soluciones 
 31 
estándar con cantidadesconocidas de cada marcador, Cr2O3 (0.05, 0.1, 0.15, 0.5 mg/ml) 
siendo la misma para VIS y EAA, en el caso de TiO2 (0.0125, 0.025, 0.0375, 0.05 y 0.2 
mg/ml) para VIS y (10, 20 y 40 ppm) de Ti para EAA. Las mezclas Cr2O3+ TiO2 y TiO2+ 
Cr2O3 difieren en que los dos están mezclados pero solo se suspende y analiza uno de los 
compuestos ya sea Cr2O3 o TiO2 por medio de las técnicas ya mencionadas. 
 
Análisis estadístico 
 
Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) de los porcentajes de recuperación de los 
marcadores, de acuerdo a un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2 
(técnica: VIS y EAA) x 4 (marcador: Cr2O3, TiO2, Cr2O3+ TiO2, TiO2+ Cr2O3) x nivel del 
marcador (0, 0.8, 1.6, 2.4. 3.2 para heces y 0, 0.4, 0.8, 1.2 y 1.6% para alimento y 
contenido duodenal) en cada tipo de muestra: alimento y contenido duodenal y heces de 
bovino o contenido duodenal y heces de ovino. La comparación de medias se realizó 
mediante la prueba de Tukey (P<0.05) (Tukey, 1949). 
 
Para efectos por tipo de muestra, técnica y niveles del marcador se utilizaron polinomios 
ortogonales (Cochran y Cox, 1957), en ambos se utilizo el procedimiento GLM del 
software estadístico SAS (1999). 
 
5.2. Experimento 2. Evaluación in vivo de los marcadores como marcadores 
de la digestibilidad aparente en ovinos 
 
Animales y dietas 
 
Se utilizaron seis ovinos machos de la raza Pelibuey (PV 40.75 ± 5.83 kg), para evaluar la 
recuperación de los marcadores: oxido de cromo (Cr2O3) y dióxido de titanio (TiO2) solos y 
de forma combinada. Los ovinos fueron alimentados con 72% grano de sorgo, 6.18% 
alfalfa heno, 12.35% de heno de avena, 1% de urea, 5.46% de melaza de caña, 1.15% de 
Calcio al 38%, 0.21% de oxido de Magnesio, 0.5% de bicarbonato de sodio, 0.2% de 
fosfato dicálcico, 0.5% de sal común y 0.05% premezcla mineral (Fosforysal). A la que se 
adiciono 0.4% del marcador (Cr2O3, TiO2 y su mezcla). La ingestión de alimento se 
restringió al 2.2 % del peso vivo. Los animales se alojaron en jaulas metabólicas, con un 
arnés individual para recolectar las heces. La alimentación fue en porciones iguales en 
 32 
intervalos de 12 horas. Antes de comenzar el experimento se realizó un periodo de 
adaptación a la dieta por 20 días y entre periodos 15 días, con 5 días de recolección de 
muestras. Las muestras de heces se colectaron de los arneses en los días 21 al 25 a las 
9:00 h, se pesó y separó un 10% del total, mezclándose para obtener una muestra 
compuesta por animal y periodo, conservándose en congelación (–20ºC) para su posterior 
análisis en laboratorio. 
 
Análisis de laboratorio 
 
Las muestras de alimento y heces fueron deshidratadas en recipientes de plástico en una 
estufa de aire forzado (Lindbergh Blue M) a 50°C 48h. Una vez secas las muestras se 
molieron en un molino de café (Braun) a un tamaño de partícula de 1mm para alimento y 
heces. La composición química del alimento y heces se determinó; MS, MO y N, (AOAC, 
1991), la concentración de FDN (Van Soest et al., 1991). Para la determinación de óxido 
de cromo se utilizo la técnica de Hill y Anderson, (1958), mientras que el dióxido de titanio 
fue determinado con la técnica utilizada por Titgemeyer et al. (2001). Analizados por 
medio del espectrofotómetro VIS (Thermo Fisher Scientific modelo Genesys 10 Vis) o 
espectrofotómetro de absorción atómica (Perkin Elmer 3110) con una lámparas de Cr y Ti 
(Perkin Elmer). La curva de calibración analítica fue por medio del uso de soluciones 
estándar con las cantidades mencionadas en el experimento 1. 
 
Estimación de la digestibilidad aparente 
 
Para la estimación de la digestibilidad aparente se utilizaron las siguientes ecuaciones: 
 
Utilizando la CTH: 
 
Digestibilidad aparente =100*[(NutsIng - Nutshcs)/ NutsIng] 
 
Donde: NutsIng son los nutrientes en ingredientes (g/d) y Nutshcs son los nutrientes en 
heces (g/d). 
 
 33 
Utilizando marcadores: 
 
Producción de heces MS g/d = (marcador consumido g/d) / (marcador en heces g/d) 
 
 
Para la estimación de la digestibilidad de componentes (MS, MO, FDN) 
Digestibilidad X = 100* [(Consumo de X g/d – Excreción de X g/d)/ Consumo de X g/d] 
 
Donde X= MO, FDN, N, etc. 
Donde el consumo y excreción están en gramos por día y el Coeficiente de digestibilidad 
en porcentaje. 
 
 
Análisis estadístico 
 
Los valores de digestibilidad aparente del tracto total en cada tratamiento (MS, MO, FDN y 
N) fueron sometidos a un análisis de varianza para un diseño experimental de cuadrado 
latino con ajuste por residuales ocupando 3 tratamientos que se repartieron e 6 animales 
en forma distinta en 3 periodos, de acuerdo a como se presentan en el cuadro 2. 
(Cochran y Cox, 1957) se utilizo el procedimiento GLM del software estadístico SAS 
(1999). 
Para efectos de marcador y técnica en los valores de digestibilidad aparente del tracto 
total en cada uno (MS, MO, N y FDN) y excreción de N con un diseño totalmente al azar; 
siendo ahora 11 tratamientos (CTH1, CTH2, CTH3, Cr2O3 VIS, Cr2O3 + TiO2 VIS, Cr2O3 
EAA, Cr2O3 + TiO2 EAA, TiO2 VIS, TiO2 + Cr2O3 VIS, TiO2 EAA, TiO2 + Cr2O3 EAA) con 6 
repeticiones por cada uno (Kuehl, 2001) por medio del software estadístico SPSS 15.0 
(2006). Siendo CTH para cada tratamiento y las mezclas Cr2O3+ TiO2 y TiO2+ Cr2O3 
difieren en que los dos están mezclados pero solo se suspende y analiza uno de los 
compuestos ya sea Cr2O3 o TiO2 por medio de VIS o EAA. 
 
 34 
Cuadro 2. Distribución de tratamientos en ovinos alimentados con dietas basadas en 
sorgo, adicionando 0.4 % de Cr2O3 (T1), 0.4% de TiO2 (T2) y 0.4% de Cr2O3 + 0.4% de 
TiO2 (T3), utilizando un cuadrado latino de ajuste por residuales. 
 
Periodo Número de animal 
 1 2 3 4 5 6 
1 T1 T2 T3 T1 T2 T3 
2 T2 T3 T1 T3 T1 T2 
3 T3 T1 T2 T2 T3 T1 
 
Modelo estadístico; cuadrado latino 
 Yijk= µ + αi + βj + τi + εijk 
Y = variable de respuesta 
i = subíndice para identificar periodos i =1, 2 y 3. 
j = subíndice para identificar animales j = 1, 2, 3, 4, 5, y 6. 
k = Subíndice para identificar tratamientos k = 1, 2 y 3 
Donde: 
Yijk = Efecto causado por la i-ésimo periodo con el j-ésimo animal y el k-ésimo 
tratamiento. 
µ = Media general 
αi = Efecto de la i-ésimo periodo 
βj = Efecto del j-ésimo animal 
τk = de la i-ésimo tratamiento 
εijk = Error aleatorio 
 
Para las comparaciones de medias de tratamiento se utilizó la prueba de Tukey 
(Tukey,1949). 
 35 
6. Resultados y discusión 
 
6.1. Experimento 1. Recuperación in Vitro de Cr2O3, TiO2 y sus mezclas 
 
6.1.1. Recuperación de los marcadores en la muestra de alimento 
Como se observa en el Cuadro 3 con respecto al porcentaje de recuperación se obtuvo 
una interacción entre el nivel de marcador, técnica y tipo de marcador (P<0.001). Los 
valores más cercanos a 100% correspondieron a Cr2O3 + TiO2 (95%) analizando Cr por 
EAA, y Ti (108%) por EAA con un nivel de 1.2%, los cuales fueron similares a TiO2 + 
Cr2O3 con los niveles 1.2 y 1.6 (96 y 83% respectivamente) analizando Ti, por EAA. En un 
estudio realizado por Carfciofi et al. (2007) en muestras de alimento de dieta comercial de 
perro adulto en mantenimiento, registraron una recuperación del 99% para Cr2O3 cuando 
utilizaron VIS, en comparación al 103% de recuperación utilizando EEF, en una 
concentración de 3.5 g de Cr2O3 por kg de alimento. Por otra parte Kozloski et al. (1998) 
estudiaron estos marcadores en una dieta compuesta por heno de zacate italiano, grano 
de maíz, harina de soya y sales minerales, obtuvieron recuperaciones de 125% para VIS 
y 100% con EAA, bajo una concentración de1.2 mg de Cr2O3 /g de MS en heces de 
bovinos productores de leche. 
En el presente estudio, para Cr2O3 con niveles inferiores a 1.6 % la recuperación de los 
marcadores indicados fue menor a 83 %. La recuperación mas cercana a 100% para 
Cr2O3 fue con el nivel de 1.6% por EAA (113%). La recuperación <100 % obtenida al 
utilizar VIS es