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Por convertirte en mi mejor amigo, confidente y mayor apoyo durante esta travesia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
No te rindas que la vida es eso, continuar el viaje, 
perseguir tus sueños, destrabar el tiempo, 
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Benedetti. 
 
 
 
 
 
 
EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN TUMORES DE WILMS CON ANAPLASIA 
 
 
 
ÍNDICE 
 
1. RESUMEN .............................................................................................................. 5 
2. INTRODUCCIÓN. ................................................................................................... 6 
3. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES. ............................................................. 10 
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................. 16 
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................... 16 
6. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 16 
7. OBJETIVOS ......................................................................................................... 17 
8. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 17 
9. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 18 
11. PLAN DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................... 20 
12. DESCRIPCIÓN DE VARIABLES .......................................................................... 20 
13. RESULTADOS. .................................................................................................... 21 
14. DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 26 
15. CONCLUSIONES: ................................................................................................ 26 
16. LIMITACIONES DEL ESTUDIO ............................................................................ 28 
17. CRONOGRAMA. .................................................................................................. 29 
18. BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................... 30 
 
1. RESUMEN 
Los microRNAs (miRNAs) tienen un papel muy importante en el desarrollo del riñón y las 
funciones específicas de sus componentes celulares. Se cree que el nefroblastoma y las 
neoplasias embrionarias renales en niños se originan de restos nefrogénicos, semejantes 
morfológicamente al riñón en desarrollo. Los microRNAs son pequeños fragmentos de RNA 
no codificante que actúan a nivel de RNA mensajero con mecanismos post 
transcripcionales. Particularmente, en el tumor de Wilms, la participación de elementos 
epiteliales, mesenquimatosos y blastemales indican el involucro de múltiples miRNAs. 
Estos actúan en diferentes genes favoreciendo el desarrollo de la neoplasia. El tumor de 
Wilms con anaplasia es considerado una variedad particular con pronóstico pobre y 
resistencia al tratamiento. El objetivo del estudio es comparar la expresión de los 
microRNAs miR-21 y 221 en pacientes con tumor de Wilms sin anaplasia y tumor de Wilms 
con anaplasia en nuestro hospital. Material y métodos: se incluyeron 8 tumores de Wilms 
con anaplasia y 6 tumores de Wilms trifásicos sin anaplasia de tejido fijado en formol e 
incluido en parafina. En cada caso se incluyó tejido renal no tumoral adyacente al tumor. La 
expresión de cada microRNA se obtuvo mediante PCR en tiempo real con sondas 
comerciales TaqMan. Resultados: en los casos de TW con anaplasia la expresión de miR-
21 fue menor en 6 casos (75 %), por el contrario en el TW sin anaplasia la expresión de 
miR-21 fue mayor en 4 casos (66 %). En el caso de miR-221 la expresión de miR-221 fue. 
Análisis: De acuerdo a los resultados obtenido y a la información donde sabemos que miR-
21 se encuentra normalmente expresado en el tejido renal no tumoral, lo cual sugiere que 
la sub expresión de este confiere el comportamiento altamente agresivo, por otro lado miR-
221 en la mayoría de las neoplasia que se ha descrito se encuentra sobre expresado y en 
nuestro estudio se mostró de la misma manera en ambos muestras (con y sin anaplasia). 
Conclusiones: Los resultados demuestran que son microRNAs que pueden participar en 
la patogenia del TW con anaplasia y por lo tanto en el tratamiento y pronóstico. 
 
 
 
 
 
2. INTRODUCCIÓN. 
Las neoplasias en la edad pediátrica son en su mayoría de origen no epitelial, la principal 
en esta categoría son las neoplasias linfoides. Sin embargo, las neoplasias sólidas son 
también un rubro importante que afectan a este grupo etario. En particular el nefroblastoma 
es la neoplasia renal más frecuente y constituye el 6% de las neoplasias pediátricas, la 
edad de presentación oscila entre 1-4 años (Tabla 1). Se puede presentar en forma 
esporádica o hereditaria, algunos tumores presentan cariotipo normal, pero más del 50% 
presentan deleciones del brazo corto del cromosoma 11. El 10% de estos tumores se 
asocian a síndromes dismórficos y solo el 5% de ellos son de presentación bilateral, existen 
factores que conceden características de mal pronóstico uno de ellos es la anaplasia la cual 
consiste en tres características histológicas: hipercromacia nuclear, agrandamiento nuclear 
y mitosis multipolares (Stocker 2011). 
Tabla 1. Clasificación de tumores renales y frecuencia de presentación (Stocker, 
2011) 
 
 
 
TUMOR FRECUENCIA 
Tumor de Wilms con histología 
favorable 
80% 
Tumor de Wilms con Anaplasia 10% 
Nefroma mesoblástico 5% 
Sarcoma de células claras 4% 
Tumor Rabdoide 2% 
Misceláneos 
 Neuroblastoma 
 Tumor neuroectodermico 
primitivo 
 Sarcoma sinovial 
 Carcinoma de células renales 
 Angiomiolipoma 
 
4% 
Linfoma <1% 
2.1. Desarrollo de riñón normal 
El riñón deriva del mesodermo para-axial, de la placa lateral y de la fusión de tres 
estructuras: pronefros, mesonefros y metanefros el riñón definitivo deriva directamente del 
metanefros (Imagen 1). Las señales del mesénquima metanéfrico inducen el nacimiento de 
la yema ureteral que será el primordio del uréter. La condensación del mesénquima es 
necesaria para la nefrogenia y esto se da cuando las células mesenquimatosas se agregan 
alrededor de las puntas de la yema ureteral, posterior a esto se hace la remodelación de la 
vesícula y al final se adquiere la forma de “s” y es cuando se concreta la unión del blastema 
mesenquimal y el brote ureteral y con esto se comienza la ramificación del brote 
(Cherñawsky 2002). 
 
 
Imagen 1. (Moore, 2013). Muestra las etapas de desarrollo normal renal en las que se 
observan las tres estructuras básicas que son el pronefros, mesonefros y metanefros. 
2.2. Regulación molecularde la nefrogénesis 
Hay una interacción de varios tipos celulares en la que intervienen factores de transcripción, 
factores de crecimiento, proteasas, receptores de genes, moléculas de adhesión y 
componentes de la matriz extracelular, de todos ellos destacan los que son punto de control 
en este proceso como GDNF- c- RET y cascada de GDNFR del receptor alfa, se describió 
como un gen que promueve la sobrevida de las neuronas dopaminérgicas y actualmente 
se sabe que es importante para el crecimiento del brote ureteral, se expresa principalmente 
en el conducto de Wolf y después en las puntas de las ramificaciones ureterales; Los 
factores de transcripción Pax 2 y Pax 8 participan determinando el linaje de las primeras 
células embrionarias renales, inducción del riñón metanéfrico, y diferenciación de la 
nefrona. Pax-2 se expresa en el conducto mesonéfrico, en el brote ureteral y en el 
mesénquima metanéfrico; Pax-8 se distribuye igual que Pax-2 y además en vesículas 
renales y en los cuerpos en forma de “s”. En tumores renales ambos genes se han 
encontrado sobre-expresados promoviendo proliferación y plasticidad celular (Sharma 
2015). WT1 es un gen supresor de tumor que actúa como factor de transcripción de las 
células del mesénquima que inducen el brote uretral, su expresión es necesaria para el 
desarrollo de los túbulos mesonéfricos caudales; las mutaciones en este en particular se 
han asociado con tumores de Wilms y con el síndrome de Denysh-Drash; la familia de 
genes Wnt contribuye a la diferenciación del mesénquima durante el desarrollo, de esta 
familia específicamente el Wnt-4 está implicado en el desarrollo renal glomerular, el Wnt-
11 participa en la ramificación del brote ureteral; Emx 2 y BF2 son factores de transcripción, 
el Emx es un homeobox que está implicado en la ramificación del uréter y el BF2 se expresa 
inicialmente en las células del mesénquima; TGF-B1 es un factor de crecimiento que se 
expresa en el mesénquima metanéfrico (Chernawsky 2002). 
2.3. Nefroblastoma (tumor de Wilms) 
Es el tumor renal primario más frecuente en la infancia y la cuarta neoplasia pediátrica 
maligna más frecuente. Alrededor del 5 % de los nefroblastomas surgen en ambos riñones 
de forma simultánea o metácrona. La biología molecular de este tumor ilustra varios 
aspectos importantes de las neoplasias infantiles como son la relación entre la 
organogénesis y la oncogénesis, teoría de los dos golpes, papel de las lesiones 
premalignas y las posibilidades de tratamiento que pueden influir de manera importante en 
el pronóstico y evolución (Robbins 2010) 
2.3.1. Características clínicas 
Las principales características clínicas que se presentan en niños por orden de frecuencia 
son masa abdominal (75%), dolor abdominal (25%), hematuria microscópica (24%), fiebre 
(22%) y hematuria macroscópica (18%). En los estudios de imagen se realiza ultrasonido 
abdominal, telerradiografía de tórax, tomografía computarizada con doble contraste; la 
tomografía computarizada es el estudio de elección, ya que da el diagnóstico de certeza en 
el 82% de los casos; se deben realizar además estudios moleculares y genéticos en busca 
de WT1, WT2, WT3 Y P53 (Robbins 2008). 
2.3.2. Patología. 
El tumor de Wilms tiende a presentarse como una masa abdominal, solitaria, bien 
circunscrita, solo el 10% de los tumores son bilaterales o multicéntricos; al corte el tumor es 
sólido, homogéneo, blando, marrón a gris, con focos de hemorragia y formación de quistes 
y necrosis. Microscópicamente se caracteriza por que presenta diferentes momentos de la 
nefrogénesis, la presentación clásica es trifásica en la que se encuentran las células con 
diferenciación blastemal, estromal y epitelial (Imagen 2), el porcentaje de cada uno de los 
componentes es variable, es muy raro encontrar elementos heterólogos tales como epitelio 
escamoso o mucinoso, músculo liso, tejido adiposo, cartílago, tejido osteoide y 
neurogénico. Solo el 10% de estos tumores presentan características de anaplasia la cual 
se define por tres características específicas que es la presencia de núcleos grandes, 
hipercromáticos, pleomorficos y mitosis multipolares, (Imagen 3.) esta característica es de 
mal pronóstico y se asocia con mutaciones de p53 (Ackermann, 2010). 
 
Imagen 2. Nefroblastoma trifásico sin anaplasia, en el que con las flechas se indica cada 
uno de los componentes que lo conforma. El componente mesenquimal constituido por 
células fusocelulares, componente epitelial representado por formación de tipo tubular y por 
último el blastema que es la parte más primitiva de este tumor constituido por células de 
pequeño tamaño, redondas con núcleos basófilos. 
 
Imagen 3. Nefroblastoma con anaplasia se muestran las tres características necesarias 
para que este tumor, mitosis multipolares o atípicas, hipercormasia nuclear y aumento más 
de tres veces del tamaño nuclear. 
2.3.3. Histogénesis 
La lesión precursora de este tumor es la presencia de restos nefrogénicos y se observan 
en el parénquima renal adyacente aproximadamente en el 40% de los tumores unilaterales 
y esta frecuencia aumenta hasta casi el 100% en los tumores bilaterales, el aspecto de 
estos restos es desde formas expansivas (restos hiperplásicos), restos escleróticos y 
algunas veces restos de glomérulos y túbulos inmaduros, es importante mencionar su 
hallazgo ya que aumenta el riesgo de presentar tumor contralateral (Junghanns, 2015). 
3. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES. 
3.1.1. Genética 
El gen clave en el desarrollo del Tumor de Wilms es el WT1, en la actualidad se han descrito 
alteraciones más específicas, pero antes de describir éstas es necesario entender cómo 
actúa este gen. WT1 es un gen crítico para el desarrollo gonadal y renal codifica un factor 
de transcripción que se expresa en el desarrollo gonadal del feto humano, funciona como 
activador y represor de la transcripción (Rakheja 2015). El análisis genético molecular 
también ha mostrado que aproximadamente el 20 % de los TW esporádicos contienen 
mutación o deleción de WT1 y cerca del 15 % presentan mutación en β-catenina 
componente fundamental de la vía de señalización Wnt. Otro hallazgo importante es que 
cerca del 80 % de TW con mutación en WT1 también presentan mutación en β-catenina, 
sugiriendo que la mutación de WT1 junto con alteraciones en la vía Wnt participan en el 
desarrollo del TW (Lu 2015). En otros casos el tumor de Wilms se ha asociado con pérdida 
de la impronta del alelo materno del gen IGF2 (factor II de crecimiento semejante a la 
insulina), lo que ocasiona sobre-expresión de la proteína IGF-2 y con ello se activa la 
fosforilación de varias moléculas de la vía ERK1/2 (Rakheja 2015). En el caso de los TW 
con anaplasia se ha encontrado sobre-expresada HDAC7 promoviendo la progresión del 
ciclo celular. En modelos animales el knockdown de HDAC7 bloquea el ciclo celular debido 
a que se suprime la expresión de cMyc y se incrementan los niveles de p21 y p27 (Lu 2015) 
Existen nuevas alteraciones que únicamente se encuentran en 1/3 de los tumores de Wilms, 
entre ellos los genes WTX, CTNNB1, TP53 y DICER1, de las cuales en el 44% de los 
tumores de Wilms con anaplasia se encuentra alteración del TP53, mutación somática en 
los factores de Remodelación en la cromatina SMARCA4 y AR1D1A, y del c-MYC en el 
codón 44 (Rakheja 2015). También es importante hacer mención que el 10% de los tumores 
se asocian a síndromes dismórficos que son el síndrome de WAGR (aniridia, anomalías 
genitales, retraso mental y tumor de Wilms), estos pacientes presentan deleciones 
constitucionales de 11p13, con ellos se descubrió el primer gen asociado a WT1 y del gen 
autosómico dominante causante de la aniridia PAX 6, con esto se puede explicar la teoría 
del primer golpe cuando existe deleción en la línea germinal del WT1, que generalmente se 
relaciona con una mutación de “sentido” o de desplazamiento en el segundoalelo del WT1, 
explicando con esto la teoría del segundo golpe (Rakheja 2015). 
El segundo grupo en riesgo son los pacientes con Síndrome de Denys-Drash 
(pseudohermafrodistismo masculino, nefropatía de inicio precoz con lesión glomerular de 
esclerosis mesangial difusa, tumor de Wilms y gonadoblastoma), estos pacientes muestran 
alteración en la línea germinal WT1 con anomalía genética “secuencia anormal”; y el 
síndrome de Beckwith-Wiedemann (organomegalía, macroglosia, hemihipertrofia, 
onfalocele y células grandes anormales de la corteza suprarrenal) en este la lesión se 
encuentra en el cromosama 11p15.5, denominándose por el locus específico WT2. 
3.1.2. Pronóstico 
Actualmente el pronóstico es bueno basándose en el tratamiento combinado de nefrectomía 
y quimioterapia, la tasa de supervivencia a dos años es de hasta 90%; los tumores con 
anaplasia difusa, en especial los que tienen afección extrarrenal, presentan una evolución 
menos favorable. La supervivencia a 4 años para la fase III es del 56 % y para la fase IV 
del 17 % (Murphy 2004). 
3.2. MicroRNAS 
Los miRNAs son moléculas de RNA no codificante de 18 a 24 nucleótidos que regulan la 
expresión de genes a nivel post-transcripcional. (Mendell 2005; Zeng 2009). Se estima que 
el genoma de los vertebrados codifica más de 1,000. Se han identificado cerca de 1424 
miRNAs en el genoma humano (http//microRNA.sanger.ac.uk versión 17). Este número se 
ha incrementado rápidamente en los últimos años, sin embargo, poco se conoce acerca de 
sus blancos específicos y las funciones biológicas que desempeñan en el desarrollo del 
cáncer y otras enfermedades. (Cho 2007; MacFarlane 2010). 
 
3.2.1. Biogénesis 
Los miRNAs se transcriben inicialmente como transcritos largos conocidos como miRNAs 
primarios (pri-miRNA) cuya longitud va de 3 a 4 kb, aunque algunas moléculas pueden 
medir hasta 10 kb (Saini 2007). Los pri-miRNAs son reconocidos en el núcleo por el 
complejo compuesto por la enzima RNAsa III Drosha y DGCR8 (proteína con un dominio 
de unión a RNA de doble banda). Este complejo corta la estructura en horquilla 
denominándose ahora miRNA precursor (pre-miRNA) con una longitud de 60 a 80 
nucleótidos. El pre-miRNA es reconocido por la exportina 5 (factor de exportación nuclear) 
y la proteína nuclear Ran-GTP, ambas transportan el pre-miRNA hacia el citoplasma. La 
enzima Dicer y TRBP (proteína con dominio de unión a RNA) realizan un segundo corte en 
la base del tallo-asa y se genera una molécula de RNA de doble banda de 18 a 24 
nucleótidos (Lynam 2009). Un gran complejo proteínico conocido como complejo de 
silenciamiento inducido por RNA (RISC) se asocia con el RNA duplex y separa ambas 
cadenas. RISC es un complejo tetramérico compuesto de Dicer, TRBP (proteína con un 
dominio de unión a RNA), PACT (proteína de activación) y Ago2 (proteína de la familia 
Argonauta) (MacFarlane 2010). Ago2 identifica el RNAm blanco basándose en la 
complementariedad con el microRNA de una sola banda asociado. Las secuencias 
reconocidas del RNAm blanco se ubican principalmente en la región 3´ no traducida 
(3´UTR). Generalmente solo una banda es incorporada dentro de RISC y la otra es 
degradada. El miRNA guía a RISC hacia el mensajero blanco inhibiendo su traducción 
(Chang 2009; Zeng 2009 
 
 
 
Imagen 4. Biogénesis y función de miRNA. El microRNA es transcrito por una RNA 
polimerasa II o III para generar un transcrito de RNA primario dentro del núcleo. La 
estructura tallo-asa del pri-miRNA es reconocida y cortada por un complejo 
microprocesador compuesto por Drosha y DGCR8, para producir un microRNA precursor 
de 60 a 70 nucleótidos de longitud. El pre-miRNA es exportado al citoplasma a través del 
poro nuclear por la exportina-5 y procesado en el citoplasma por Dicer-TRBP. La molécula 
de RNA de doble cadena es separada por una helicasa de RNA. Una de las bandas del 
dúplex miRNA/miRNA* (la banda guía o antisentido) es incorporada preferencialmente 
dentro de RISC y guiará el complejo miR-RISC hacia el RNA mensajero que alberga una 
secuencia complementaria al miRNA. Una vez que el RNAm es reconocido, RISC puede 
regular la traducción inhibiendo el paso de iniciación o elongación. En algunos casos el 
complejo miR-RISC puede regresar al núcleo (Modificado de Mendell 2005). 
3.3. MicroRNAS y su relación con cáncer 
Calin y col. (2002) fueron los primeros en encontrar evidencia acerca de la relación entre 
los miRNAs y el cáncer, demostrando que los miR-15 y miR-16 están localizados en una 
región mutada, en más de la mitad de las leucemias linfocíticas crónicas de células B (Calin 
2002). Varios estudios posteriores han mostrado que los perfiles de expresión de varios 
miRNAs están alterados en diversos tipos de tumores (Volinia 2006, Nicoloso 2007). Por 
esta razón algunos de ellos se consideran como genes supresores de tumor u oncogenes 
(Chung-sean 2009). 
 
 
3.3.1. MicroRNAs en el tumor de Wilms 
La biología molecular actual intenta describir diferentes vías moleculares involucradas en 
el desarrollo de estos tumores, varios estudios se han enfocado en resaltar la participación 
de los microRNAs en el tumor de Wilms, actualmente se sabe que participan en el control 
de la proliferación celular, diferenciación celular y apoptosis, de manera específica en este 
tumor se han encontrado alteraciones en varias enzimas relacionadas con la maduración 
de los microRNAs, destacando las mutaciones en la región E1147K de DROSHA (12 %), 
en DICER1 (2.6 %), DGCR8, XPO5 y TARBP2 (Senanayake, 2012; Wu, 2013; Torrezan, 
2014). 
Existen microRNAs específicos que se expresan durante el desarrollo renal como miR194, 
miR-204, miR-215, miR-200c, miR-141, estos se encuentran en ACVR2B (Activin receptor 
tyoe 2B) localizado en el cromosoma 2 brazo largo; juega un rol importante en la activación 
de la activina, siendo esta un elemento crucial de TGF-B y todos ellos en unión son 
importantes para poder llevar acabo la ramificación de la cresta ureteral, el ACVR2B induce 
la ramificación y aumenta la proliferación en la cresta ureteral y al mismo tiempo frena la 
proliferación en el mesénquima metanéfrico , el miR-200 se expresa en las células de origen 
mesenquimal y epitelial durante el desarrollo renal. 
Se han encontrado otras alteraciones genéticas como la deleción del cromosoma 2q37.1 
causando disminución en la expresión de miR-562, localizado en la región EYA1; la 
sobreexpresión del miR483-3p se ha correlacionado con la sobreexpresión IGF2 y 
alteración en el miR-185 que funciona como un gen tumor supresor involucrado en el 
desarrollo del riñon (Senanayake, 2012). 
2.5.2 Características de miR-21 y miR-221 
MiR21 
El gen que codifica para el miR-21 se encuentra localizado en el cromosoma 17q23.1. La 
sobre-expresión de este miRNA se describió por primera vez en el GBM y posteriormente 
en otros tipos de tumores sólidos (Chan 2005, Volinia 2006). 
Existen varios blancos importantes que contribuyen a su acción antiapoptótica y proliferativa 
como algunas moléculas involucradas en las rutas supresoras de tumor de p53, TGF-β 
(factor de crecimiento transformante β) y ruta apoptótica mitocondrial (Papagiannakopoulos 
2008, Novakova 2009, Silber 2009). 
Se ha descrito su participación de manera ubiquitinizada en los tejidos y células normales, 
así como en proliferación oncológica. De manera fisiológica se ha descrito en la formación 
de peroxisomas, función mitocondrial, migración celular, angiogénesis, apoptosis y como 
inhibidor de metaloproteasas (Nelson, 2012); así como la sobreexpresión en tumores 
estómago, vejiga, riñón, próstata, pulmón, colon, colangiocarcinomas y glioblastomas (Lin, 
2014). 
En el riñón normalmente se encuentra la expresión de este microRNA, pero en casos de 
obstrucción uretral e isquemia, (Lin, 2014). La vía TGF-B/Smad es una de los mecanismos 
por los que miR21 se expresa para generar fibrosis. De manera particularen el riñón se ha 
identificado su participación en hipertrofia glomerular y en nefropatía diabética temprana 
(Sydwell, 2015). 
La invasión tumoral facilitada por miR21 está dada por la vía especifica postranscripcional 
3´-UTR, lo cual lleva a una regulación negativa del PDCD4 ocasionando invasión a tejidos 
adyacentes e invasión vascular (Asangani, 2008). A pesar de los estudios que existen el 
miR21 no es tejido especifico y tiene un rol pivote dependiendo del órgano en el que se 
exprese (Sydwell, 2015).Tiene además un rol importante en la progresión de enfermedades 
malignas y enfermedades renales. 
 
miR221 
MiR-221/222 se localizan en el cromosoma Xp11.3 su expresión es co-regulada y tienen la 
misma especificidad de blancos debido a que la región denominada “semilla” es la misma 
en ambos casos y se encuentran sobre-expresados en astrocitomas, (Lewis, Burge, & 
Bartel, 2005). Gillies y colaboradores describieron a p27kip1 como un blanco directo de 
miR-221/miR-222. P27kip1 es una proteína reguladora del ciclo celular, su función es inhibir 
a la cinasa dependiente de ciclina (CDK), de tal forma que hay un arresto en el ciclo celular 
en la fase G1, evitando la proliferación celular (Gillies & Lorimer, 2007). Medina y 
colaboradores estudiaron la participación de varios microRNAs en la regulación del ciclo 
celular y observaron que la expresión de miR-221 y miR-222 se incrementó en células 
humanas quiescentes que son estimuladas para proliferar. Predijeron y comprobaron dos 
blancos: p27 y p57, ambos suprimen el crecimiento celular porque inhiben cinasas 
dependientes de ciclina. La sobre-expresión de estos miRs está estrechamente relacionada 
con el control del ciclo celular, que asegura la supervivencia de la célula por una 
competencia coordinada entre la entrada en la fase S y rutas de señalización del factor de 
crecimiento que estimula la proliferación celular(Medina et al., 2008) Ciafrè y colaboradores 
identificaron al miR-221 como uno de los miRNAs con mayor sobre-expresión en 
comparación con valores obtenidos en cerebro normal y muestras de tejido sano 
adyacentes al tumor (Ciafrè et al., 2005). 
El miR-221 se ha encontrado sobre-expresado en heces de pacientes con lesiones pre-
invasoras epiteliales de colon, surgiendo como una opción prometedora para su exploración 
en el carcinoma colorectal (Yau et al, 2014). 
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
El tumor de Wilms es el tumor abdominal más frecuente en la edad pediátrica; la variante 
histológica con anaplasia representa 10% de los tumores renales y es considerado una 
variedad diferente del tumor de Wilms, con resistencia al tratamiento y pronóstico pobre en 
estadios II a IV. Las vías moleculares involucradas en esta variante se encuentran poco 
estudiadas, su diagnóstico se basa en características de morfología histológica específica; 
lo que sugiere una naturaleza genética diferente al tumor de Wilms sin anaplasia. En los 
tumores renales la alteración en la expresión de los microRNAs se considera una 
herramienta potencial para el pronóstico y diagnóstico, además se considera que puede 
definir subtipos tumorales dentro de una misma entidad. Las diferencias en su expresión 
puede reflejar alteración en diferentes vías moleculares y puede delinear un mecanismo de 
regulación post-transcripcional poco explorado en el tumor de Wilms. 
5. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
En el tumor de Wilms con anaplasia, la expresión de miR-21 y miR-221 se encuentra 
alterada de manera diferencial con respecto al tumor de Wilms sin anaplasia?. Dichos 
cambios pueden reflejar un comportamiento biológico distinto entre ambos subtipos 
tumorales? 
6. JUSTIFICACIÓN 
El pronóstico de supervivencia de los pacientes con tumor de Wilms es de 
aproximadamente 90 %, dependiendo del estadio clínico, que disminuye a 63 % si el tumor 
se presenta después de los 5 años, edad en la cual la presencia de anaplasia es más 
frecuente. La expresión de microRNAs en este tipo de tumores es un campo poco explorado 
con un número reducido de investigaciones, pero que han mostrado la participación de los 
microRNAs en la patología del tumor de Wilms. En el tumor de Wilms con anaplasia se 
pretende describir la expresión de miR-21 y miR-221 y comparar con respecto a la 
expresión en el tumor de Wilms sin anaplasia. MiR-21 es uno de los microRNAs más 
estudiado, su expresión esta alterada en un amplio número de tumores en los que se ha 
descrito como un oncogén. El miR-221 también tiene un papel importante en el cáncer 
debido a que induce proliferación celular (Catto 2011) 
7. OBJETIVOS 
Objetivo General: 
Determinar el perfil de expresión de microRNAs en pacientes con tumor de Wilms con 
anaplasia. La meta es determinar la relevancia de los microRNAs en el TW con anaplasia 
y describir un grupo de microRNAs que constituyan biomarcadores potenciales. 
Objetivos específicos: 
 Comparar el perfil de expresión de microRNAs en pacientes con tumor de Wilms 
con anaplasia, Wilms sin anaplasia y riñón no neoplásico mediante arreglos de baja 
densidad. Meta: mostrar diferencias en la expresión de los microRNAs en cada 
grupo. La duración de esta etapa será de seis meses y corresponde a la etapa 1. 
 Seleccionar un grupo de microRNAs con cambios significativos en su expresión y 
confirmar en un número mayor de casos. Meta: demostrar la relevancia de los 
microRNAs y relacionar con las características clínicopatológicas de cada paciente 
para definir su posible papel como biomarcadores. Duración de 1año y corresponde 
a la etapa 2 y 3. 
 Determinar las principales moléculas blanco de los microRNAs alterados. Meta: A 
través de conocer la función de sus moléculas blanco (RNAm) explicar los cambios 
que se observan en los TW con anaplasia a diferencia de lo que ocurre con los que 
no tienen anaplasia. Duración de 6 meses y corresponde a la etapa 3. 
8. HIPÓTESIS 
Existen microRNAs que son característicos del tumor de Wilms con anaplasia y que pueden 
contribuir a establecer un comportamiento biológico más agresivo a diferencia de lo 
observado en la variedad de Wilms sin anaplasia y riñón sin alteración. Esta información 
permitirá proponer microRNAs que participen en la patología de este tumor. 
 
9. MATERIAL Y MÉTODOS 
Estudio transversal, comparativo y observacional. 
9.1. Criterios de Selección 
 Muestra de tejido incluidos en parafina, con diagnóstico de Tumor de Wilms con 
criterios de anaplasia y sin anaplasia. 
 Muestras con 80 % de tejido libre de necrosis, con patrón histológico íntegro. 
 
9.2. Tamaño de la muestra a estudiar 
 El tamaño de la muestra será por conveniencia, se incluirán en la primer parte 8 
tumores de Wilms con anaplasia, 5 tumores de Wilms sin anaplasia y 12 controles 
(tejido renal adyacente al tumor). Estos casos se utilizarán para determinar el perfil 
de expresión de microRNAs. 
 
9.3. Procedimiento 
 Todos los casos serán revisados por tres patólogos, uno quien emitió el diagnóstico 
y dos revisores más. Los TW se dividirán entre los que no tienen anaplasia y los que 
tengan anaplasia difusa. En este último caso, las laminillas en donde se identifique 
la anaplasia serán de las que se extraerá el RNA. 
 Para determinar la expresión de miR-21 y miR-221, se seleccionaron ocho casos 
con tumor de Wilms con anaplasia, seis tumores de Wilms sin anaplasia y como 
control en cada caso se incluyó riñón no neoplásico adyacente al tumor, por lo que 
se incluyeron en total 14 controles. 
 En cada caso, a partir del bloque de parafina se realizaron 4 cortes cada uno de 10 
micras y se colocaron en micro tubos de 1.5 ml. Material en el que se realizó 
procesamiento para desparafinar que consistió en: 
o Eliminar la parafina agregando 1 mL de xilol y agitar en vortex, incubar por 
5 minutos a 45°C. Repetir una vez más. 
o Eliminar xilol realizando tres lavados con 1 mL de etanol absoluto y agitar en 
cada ocasión. Centrifugar1 minuto y decantar. 
o Abrir los tubos para que se evapore el etanol y agregar la mezcla de digestión 
que consiste de 15µL de la enzima proteinasa K y 335µL de buffer de 
digestión, posteriormente se colocó el tubo en incubación en un termoblock 
a 45 °C, de 24 a 48 horas, agitando ocasionalmente. 
o Para la extracción de RNA total se utilizó el reactivo trizol. Se realizó 
tratamiento con DNAsa en todas las muestras. Se determinó la 
concentración y pureza del RNA total de cada muestra en un Nanodrop-1000 
(Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA) y se incluyeron las que 
tuvieron una relación de A260/A280 de 1.7 a 2.1. 
 A continuación se realizó la reacción de transcriptasa reversa con 200ng de RNA 
total usando el kit TaqMan microRNA reverse transcription kit (Applied Biosystem, 
Manasas Ca) en un volumen total de 10µl. 
 Se utilizaron sondas de hidrólisis (TaqMan) para amplificar los microRNAs miR-21 
y miR-221 utilizando como gen de referencia a RNU48. Las muestran se 
amplificaron en un termociclador Stratagene 3500 (Agilent) con el programa de 
amplificación: 50°C 2min, 95 °C 10 min, posteriormente 40 ciclos a 95 °C 15 seg 
(desnaturalización) y 60 °C 1 min (alineamiento/extensión). 
 Se realizó una cuantificación relativa mediante el método Ct comparativo (Delta Ct). 
Los valores de expresión de los microRNAs se compararon contra los valores de 
expresión de los controles (tejido renal normal) y el resultado se representó como el 
número de veces que la expresión se encontró alterada, para ello se tomaron en 
cuenta los siguientes parámetros: sobre-expresión cuando el número de veces fue 
mayor o igual a dos en el tumor en comparación con el control, sub-expresión 
cuando el número de veces fue dos veces menos en el tumor, en comparación con 
el control; se consideró expresión sin cambios cuando el número de veces fue menor 
de dos. 
 
 
 
Imagen 5. Reacción de RT-qPCR. Paso 1. Oligonucleótido tallo asa se sintetiza el 
cDNA e incluye en su terminación 3´ la secuencia específica de cada microRNA. 
Paso 2 inicia la reacción de qPCR, donde la sonda TaqMan, secuencia específica 
del microRNA, hibrida en una región intermedia del producto de cDNA. La sonda 
incluye en 5’ un fluoróforo reportero y en 3’ un apagador no fluorescente (NFQ). 
Reportero (R), non-fluorescent quencher (NFQ), and minor groove binder (MGB) 
10. CONSIDERACIONES ÉTICAS 
El presente protocolo es una investigación sin riesgo para los pacientes ya que el 
universo a estudiar son tejidos almacenados en el Departamento de Patología, no se harán 
intervenciones directas en pacientes. El presente estudio no traerá beneficios directos para 
los propietarios de las muestras, sin embargo es un beneficio social porque podrá aportar 
conocimiento nuevo a cerca del comportamiento biológico del tumor de Wilms. 
Confidencialidad: nos comprometemos a asignar números seriados consecutivos con el fin 
de ocultar el numero biopsia asignado (número que vincula la biopsia con los datos clínicos 
de los pacientes) esto para guardar absoluta confidencialidad de los datos del paciente. 
 
11. PLAN DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
Se utilizó como control endógeno RNU48 y como calibrador el riñón adyacente al tumor. Se 
utilizará el método de cuantificación relativa mediante la fórmula 2-∆∆Ct. Se analizarán los 
datos mediante el programa computacional Graph Pad Prim 5. 
 
12. DESCRIPCIÓN DE VARIABLES 
 
Variable Definición 
conceptual 
Definición 
operacional 
Tipo de 
variable 
Unidad de 
medición 
Edad Tiempo 
transcurrido entre 
el nacimiento y la 
presentación del 
tumor 
El consignado 
en el estudio de 
patología 
Cuantitativa 
discreta 
Meses 
Sexo Fenotipo de los 
pacientes 
El consignado 
en los 
expedientes 
Cualitativa 
nominal 
Femenino 
o 
masculino 
Localización 
tumoral 
Localización 
espacial en el 
riñon y lateralidad 
Derecho, 
izquierdo, 
bilateral y si es 
Cualitativa 
nominal 
Derecho o 
izquierdo, 
bilateral, 
 
 
13. RESULTADOS. 
El número de muestra utilizado fueron 14 pacientes (100%) (Lista 1.) donde 5 (35.7%) 
correspondían al sexo masculino y 9 (64.28%) corresponden a sexo femenino (Gráfica 1) 
 
 
 Gráfica 1. Distribución por sexo del Tumor de Wilms. 
 
El rango de edad abarcó desde los 2 hasta los 8 años; la edad presentada con mayor 
frecuencia fue “≥4 años”, donde se encontraron 5 pacientes, que equivalen a poco más de 
un tercio de la población estudiada; el siguiente grupo etario es el de “3 y 2 años” con 4 
pacientes cada uno de ellos (25%) y por último el grupo de“7-8 años Joven” con 1 paciente 
en cada uno (8.3%) (Gráfica 2). 
 
0
10
Gráfica 1. Sexo
femenino
masculino
central o en los 
polos. 
polo 
inferior, 
superior o 
central 
Tipo de 
histología 
Aspecto 
histológico del 
tumor 
Mediante estudio 
histológico 
determinar el 
tipo 
Cualitativa 
nominal 
Sin 
anaplasia, 
con 
anaplasia 
Expresión 
de miR-21 
Valor de expresión 
en PCR 
Medición con 
PCR en tiempo 
real 
Cuantitativa 
continua 
Valor 
numérico 
Expresión 
de miR-221 
Valor de expresión 
en PCR 
Medición con 
PCR en tiempo 
real 
Cuantitativa 
continua 
Valor 
numérico 
 
Gráfica 2. Distribución pore dad del Tumor de Wilms 
 
 El cuadro clínico que se presentó con mayor frecuencia fue masa abdominal en 8 pacientes 
(50%), diagnosticada por estudios de gabinete; después hematuria en 4 pacientes (33.3%), 
dolor abdominal en 3 pacientes (25%), disuria en 2 pacientes (16.66%) y por último pérdida 
de peso, fiebre e hipertensión arterial en 1 paciente (8.33%). (Gráfica 3). 
 
 
Gráfica 3. Clínica mas frecuente diagnóstica 
 
 En la muestra analizada el riñón más afectado fue el izquierdo el cual se encontraba 
afectado en 8 pacientes (58.33%), el riñón derecho en 3 (25%) y únicamente 2 (16.66%) 
fueron casos donde se encontraron afectados de forma bilateral (Gráfica 4). 
 
0
2
4
6
8
Gráfica 2. Edad
CASO 1
CASO 2
CASO 3
CASO 4
CASO 5
CASO 6
0
1
2
3
4
5
6
Gráfica 3. Clínica
dolor abdominal
perdida de peso
fiebre
masa renal
hematuria
disuria
hipertensión
 
Gráfica 4. Localización más frecuente. 
 
Las biopsias analizadas fueron clasificadas de acuerdo a las características histológicas 
para poder encasillarlos en la categoría de TW con anaplasia y sin anaplasia, en cada uno 
de los casos sin importar la categoría histológica en la que se encontraba, se pesó cada 
espécimen quirúrgico, el peso promedio fue de 965.5 g. (1650g a 220g), el promedio de 
tamaño en el eje mayor del tumor se observó de 12.85 cm. En seis de los tumores se 
documentó infiltración al seno renal de los cuales 5 de ellos estaban dentro de la categoría 
con anaplasia (Gráfica 5), tres con invasión a capsula renal, dos de ellos dentro de la 
categoría con anaplasia; tres con infiltración vascular dos de ellos se en la categoría TW 
sin anaplasia (Tabla 5); todos los casos analizados se informaron sin tumor en límite 
quirúrgico, se reportaron tres de catorce casos con infiltración a ganglios linfático peri-
renales; dos casos con metástasis uno de ellos a pulmón y uno más con implantes 
peritoneales ambos se encontraron dentro de la clasificación de TW con anaplasia. 
 
 
Gráfica 5. Prevalencia de infiltración a seno renal. 
 
13.1 Expresión cuantitativa de micro RNAs en 14 muestras de riñón con tumor de 
Wilms con anaplasia y sin anaplasia. 
 
0
10
Gráfica 4. Riñón afectado
IZQUIERDO
DERECHO
BILATERAL
0
1
2
3
INFILTRADA CON
ANAPLASIA
INFILTRADA SIN
ANAPLASIA
Gráfica 5. Infiltración al seno renal
INFILTRADA CON
ANAPLASIA
INFILTRADA SIN
ANAPLASIA
Tabla 2. Número de veces que la expresión se observó aumentada o disminuida con 
respecto al tejido adyacente al tumor. Los valores negativos indican los casos que tienen 
una expresión menor a la del control (tejido adyacente al tumor). 
 miR21 miR221 
1 -1,9 -2,2 
2 -1,3 -2,4 
3 -24,5 2,54 1,6 5,7 
5 -1,7 3,0 
6 2,8 29,1 
7 -1,1 16,0 
8 -3,6 -1,8 
 
13.2 Expresión cuantitativa de microRNAs en tumor de Wilms con Anaplasia y Tumor 
de Wilms sin anaplasia. 
 
La expresión de miR-21 y miR-221 fue analizada en los Tumores de Wilms con anaplasia 
y tumores de Wilms sin anaplasia y se comparó mostrando diferencia significativa en la 
expresión de ambos microRNAs. (Gráfica 7,8, 9 y 10). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gráfica 7. Expresión de miR-21 en tumor de Wilms sin anaplasia 
 
 
 
 
 
 
Expresión miR-21
 (TW sin anaplasia)
-2
-1
0
1
2
3
4
E
x
p
re
s
ió
n
 (
n
ú
m
e
ro
 v
e
c
e
s
)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Gráfica 8. Expresión de miR-21 en tumor de Wilms con anaplasia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Gráfica 9. Expresión de miR-221 en tumor de Wilms sin anaplasia. 
 
 
 
 
 
 
Expresión miR-21
 (TW con anaplasia)
-30
-20
-10
0
10
E
x
p
re
s
ió
n
 (
n
ú
m
e
ro
 v
e
c
e
s
)
Expresión miR-221
(TW sin anaplasia)
-20
-10
0
10
20
30
E
x
p
re
s
ió
n
 n
ú
m
e
ro
 v
e
c
e
s
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gráfica 10. Expresión de miR-221 en tumor de Wilms con anaplasia 
 
miR-21 en las muestras de tumores de Wilms sin anaplasia se mostró sobreexpresado en 
cuatro de los casos con el mayor valor de sobreexpresión de 2,89 veces más, mir-221 en 
la mitad de las muestras se sobrexpresó pero una de ellas se sobrexpresó 20.97 veces 
más de lo normal y en la el resto de los casos sobreexpresado con uno de ellos que se 
expresó 14 veces menos. 
En los tumores de Wilms con anaplasia miR-21 en 6 de las muestras mostro subexpresión 
con una de ellas que está por debajo de la expresión 24 veces y miR-221 se sobre expreso 
en 5 de las muestras con un valor máximo de sobre expresión de 21. 
 
14. DISCUSIÓN. 
La presentación más frecuente fue con masa abdominal, seguido de hematuria y dolor 
abdominal, se informaron otras formas de presentación menos frecuentes como disuria, 
dolor abdominal, pérdida de peso e hipertensión arterial sin que alguno de estos se 
presentara de manera específica en alguno de los tipos del tumor ni mostrando un indicio 
para clasificarlo previo a la histología, de igual forma en las muestras analizadas la 
neoplasia es más frecuente en el sexo femenino con una relación 2:1 (mujer: hombre), en 
este caso se presentaron con mayor frecuencia en el riñón izquierdo en polo superior, ¼ de 
los casos se presentaron de forma central aunque esta localización es poco común. Los 
TW clasificados con anaplasia presentaron mayor invasión al seno renal, a la cápsula de 
Gerota así como metástasis pulmonares e implantes peritoneales, lo cual confirma el 
Expresión miR-221
(TW con anaplasia)
-40
-20
0
20
40
E
x
p
re
s
ió
n
 (
n
ú
m
e
ro
 v
e
c
e
s
)
carácter de mayor agresividad que le confiere el tener anaplasia al tumor. El tamaño de la 
masa tumoral no presenta cambios en las dimensiones que resulten significativos en los 
grupos de TW con y sin anaplasia. En las muestran analizadas se encontró un Síndrome 
de Beckwith-Wiedemann el cual a presenta TW sin anaplasia con presentación bilateral. 
Por otro lado es importante mencionar que en el siglo XXI los microRNAs comenzaron a 
tomar importancia en su participación en el crecimiento tumoral, invasión, angiogénesis y 
evasión inmune, en el Nefroblastoma sin importar si es con anaplasia o sin anaplasia no se 
ha descrito como es que se comportan el miR-21 y miR-221 en el riñón con tumor 
particularmente nefroblastoma, existe bibliografía que menciona la actividad de estos en la 
tubulogenesis y proliferación celular; miR-21 específicamente se encuentra sobre 
expresado para regular la diferenciación mesenquimal a epitelial. Esto nos convierte en el 
primer estudio que describe el comportamiento de estos microRNA´s en el Tumor de Wilms. 
El gen que más se ha estudiado en el nefroblastoma es WT que está bien descrito que 
participa en proliferación, diferenciación, adhesión polaridad y morfogénesis además de 
otros puntos clave en la oncogénesis de esté tumor . 
De acuerdo a los resultados obtenidos y a la información incluida de la literatura sabemos 
que miR-21 se encuentra normalmente expresado en el tejido renal no tumoral, lo cual 
sugiere que la sub-expresión de éste confiere el comportamiento altamente agresivo en el 
TW con anaplasia; podemos decir que la sobre-expresión de este microRNA en los tumores 
de Wilms sin anaplasia no agrega características de peor pronóstico como se ha descrito 
en otros tipos de tumores (Nelson,2012 ); parece ser que para el desarrollo celular normal 
renal la expresión alta de miR-21 es favorable; por otro lado miR-221 en la mayoría de las 
neoplasias que se ha descrito se encuentra sobre-expresado (Lin, 2014) y en nuestro 
estudio se mostró de la misma manera en ambos muestras (con y sin anaplasia). 
15. CONCLUSIONES: 
El nefroblastoma en México es un problema de salud oncológica pediátrica importante, ya 
que al ser la neoplasia sólida abdominal más frecuente es la causa de un gran porcentaje 
de la morbi-mortalidad en nuestro país, en este estudio se confirmaron algunos parámetros 
clínicos publicados en la literatura universal, como la prevalencia de sexo y edad así como 
que el lado izquierdo es generalmente el más afectado, se confirmó de igual forma que el 
TW es una neoplasia que se desarrolla en los polos renales, aunque pude llegar a 
presentarse en el centro del riñón. Por otro lado se observa el carácter de mayor agresividad 
que presenta el TW con anaplasia al observarse mayor incidencia en la infiltración a seno 
renal y metástasis a otros sitios. La genética del TW sin anaplasia está siendo entendida y 
en la actualidad han aumentado los estudios para descifrar los que confieren la 
característica de anaplasia, lo cual causará un efecto negativo en cuanto a la respuesta al 
tratamiento. 
 
En conclusión, nuestro estudio encontró alteración en la expresión de miR-21 y miR-221 en 
Nefroblastoma. La expresión de miR-21 no había sido explorada en Nefroblastoma, sin 
embargo al igual que otras neoplasias reportadas en la literatura su expresión está alterada. 
Lo cual lo perfila como posible biomarcador de este tumor, y probable blanco terapéutico, y 
confirmaría la diferencia en la patogenia y oncogénesis que diferencia y da las 
características específicas al tumor de Wilms con anaplasia. La sobre-expresión de miR-
221 en el nefroblastoma coincide con lo reportado previamente en la literatura, lo cual 
confirma su importancia en el desarrollo y progresión de este tumor. Las vías a través de 
las cuales ejerce su efecto son múltiples. La interacción con vías moleculares que alteran 
el ciclo celular son complejas, se necesita seguir investigando más al respecto para poder 
aplicar estos conocimientos en un futuro y poder realizar cambios tanto en el tratamiento 
como en pronóstico de este tumor y otras neoplasias. En la actualidad se ha descrito un 
poco más de las actividad de ellos en muchas neoplasias es necesario poseer mayor 
conocimiento de los mecanismos por los que ejercen efecto en el desarrollo, crecimiento y 
progresión tumoral para poder aplicarlos como biomarcador en cáncer y como blancos 
terapéuticos. Al ser uno de los primero estudios en describir los microRNA´s claves en el 
Nefroblastoma con anaplasia y Nefroblastoma sin anaplasia nos permite formar más 
incógnitas sobre estos y su comportamiento oncogénico en este tumor. 
16. LIMITACIONES DEL ESTUDIO 
 
 Que no exista los bloques de parafina y/o laminillas teñidas con hematoxilina y 
eosina. 
 90% de necrosis en el material estudiado 
 Muestras con material genético insuficiente. 
 
17. CRONOGRAMA. 
Cronograma de actividades del protocolo de Investigación 
SEMESTRE1 2 3 4 
Obtención de insumos X 
Inclusión de pacientes X 
Estandarización de técnica X 
Arreglos de baja densidad X 
Análisis de los arreglos y selección de 
miRs relevantes 
X X 
RT-qPCR de miRs seleccionados en la 
muestra total 
 X 
Hibridación in situ, sondas LNA X X 
Análisis in silico de RNAm blanco X 
Presentación de resultados X X 
Elaboración de manuscritos X 
Publicación X 
 
 
 
 
 
 
 
 
18. BIBLIOGRAFÍA. 
 
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