Regulacion-del-acetiloma-y-proteoma-por-sir2--una-va-mediadora-del-envejecimiento-cognicion-y-neurodegeneracion

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PRESENTA 
 
 KARINA SÁNCHEZ ALEGRÍA 
 
 DIRECTORA DE TESIS: 
 DRA. SHADAY MICHÁN AGUIRRE 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE PSICOLOGÍA 
 
“REGULACIÓN DEL ACETILOMA Y PROTEOMA POR SIR2: UNA VÍA 
MEDIADORA DEL ENVEJECIMIENTO, COGNICIÓN 
Y NEURODEGENERACIÓN” 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: 
LICENCIADA EN PSICOLOGÍA 
 
 
MÉXICO D.F., 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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A mi Abba Padre 
A mis padres Rufina Alegría y Antonio Sánchez 
 
“Una bella ancianidad, es ordinariamente la recompensa de una bella vida” 
Pitágoras 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, casa magna de estudios. 
A la Dra. Shaday Michán Aguirre por su valiosa instrucción y apoyo en mi formación 
académica, por darme la oportunidad de crecer profesionalmente con el conocimiento 
que me impartió día con día, por enseñarme con el ejemplo la pasión, entrega, 
compromiso y humildad que un investigador debe tener, por sus críticas tan valiosas 
durante el desarrollo de este proyecto. 
Al Dr. James Bruce por permitirnos realizar la parte experimental en su laboratorio en 
la Universidad de Washington. 
A todos los doctores que participaron en la realización del cultivo celular con la técnica 
SILAC y el análisis por espectrometría de masas: Shaday Michán, Arti Navare, Juan 
Chavez, Chunxiang Zheng y Xia Wu. 
Al Dr. Jimmy Eng por su asesoría en la integración de datos obtenidos del análisis de 
espectrometría de masas mediante el software Iprophet. 
Al Dr. Gabriel Gutiérrez Ospina por permitirnos desarrollar parte del proyecto en su 
laboratorio en el Instituto de Investigaciones Biomédicas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
 
A Dios, mi Abba Padre, por su amor y fidelidad, por formarme como ser, por darme 
aliento de vida, por ser mi inspiración y quien da sentido a mi vida. 
A mi madre Rufina, por ser herramienta perfecta para formar mi carácter, porque 
siempre estuvo ahí motivándome a continuar, por mostrarme su amor todos los días, 
por ser una mujer que inspira, por esos consejos y palabras llenas de sabiduría que me 
forjaron como ser humano, por ser testimonio de que lo imposible se hace posible. 
A mi padre Antonio por su cariño y amor, por apoyarme en todo momento para que 
pudiera continuar con mis estudios. Porque pese a las tribulaciones que pasamos 
nunca dejó de apoyarme ni me negó los recursos para mi formación. 
A ambos gracias, porque gracias a ustedes he logrado esto, y sé que lograré más con 
su apoyo incondicional. Los amo a los dos. 
A mis hermanos Hugo, Paty y Nancy por su apoyo incondicional, su cariño y amor. Por 
la compañía y complicidad, por lo consejos y paciencia. 
A mis sobrinos Gisela y Leonel, por motivarme con sus risas y travesuras. Por 
enseñarme con sus preguntas inquietantes y llenas de curiosidad. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE ................................................................................................................. 1 
ABREVIATURAS ................................................................................................. 4 
RESUMEN ......................................................................................................... 6 
INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 7 
CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES ........................................................................ 9 
1.1 ENVEJECIMIENTO ........................................................................................ 9 
1.1.1 Inestabilidad genómica .......................................................................... 9 
1.1.2 Desgaste de los telómeros .................................................................... 9 
1.1.3 Alteraciones epigenéticas ...................................................................... 10 
1.1.4 Desregulación en detección de nutrientes ............................................ 10 
1.1.5 Disfunción mitocondrial ......................................................................... 10 
1.1.6 Senescencia celular .............................................................................. 11 
1.1.7 Alteración en la comunicación intracelular ............................................ 11 
1.1.8 Agotamiento de células madre .............................................................. 11 
1.2 LA PROTEOSTASIS ..................................................................................... 12 
1.3 EL ACETILOMA ........................................................................................... 13 
1.4 LAS SIRTUINAS ........................................................................................... 15 
1.5 EL IMPACTO DE LAS SIRTUINAS EN LA REGULACIÓN DEL ................... 17 
ACETILOMA 
1.6 EL EFECTO DE LAS SIRTUINAS EN LA NEURODEGENERACIÓN Y ....... 19 
COGNICIÓN. 
1.7 LA LEVADURA: UN MODELO SENCILLO PARA IDENTIFICAR ................. 22 
MECANISMOS MOLECULARES CONSERVADOS EN LAS 
NEURONAS HUMANAS 
 
CAPÍTULO 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................... 24 
2.1 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 24 
2.2 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 25 
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 25 
2.4 HIPÓTESIS ................................................................................................. 25 
2 
 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA ......................................................................... 26 
3.1 CEPAS ........................................................................................................ 26 
3.2 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ................................................. 273.3 CULTIVOS CELULARES ............................................................................. 28 
3.4 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS .......................................................... 29 
3.5 ANÁLISIS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS ........................................... 31 
3.6 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................... 32 
 
 
CAPÍTULO 4. RESULTADOS ....................................................................... 34 
4.1 ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN EL PROTEOMA DE ............................... 34 
 LA LEVADURA EN UNA MUTANTE SIR2 
4.2 CONSERVACIÓN EVOLUTIVA DE PROTEÍNAS REGULADAS .................. 40 
POR SIR2 
4.3 LAS 78 PROTEÍNAS REGULADAS POR SIR2 Y EL ................................... 40 
ENVEJECIMIENTO CELULAR 
4.4 REGULACIÓN POR SIRTUINAS DE LAS 78 PROTEÍNAS ........................... 42 
 REGULADAS POR SIR2 
4.5 FUNCIÓN POTENCIAL DE LAS PROTEÍNAS REGULADAS ....................... 43 
 POR SIR2 EN PROCESOS DE NEURODEGENERACIÓN 
 Y COGNICIÓN 
4.6 FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS CONSERVADAS ..................... 45 
EN MAMÍFEROS SIN ANTECEDENTES EN NEURODEGENERACIÓN 
Y/O REGULACIÓN POR SIRTUINAS QUE PARTICIPAN EN 
ENVEJECIMIENTO CELULAR 
4.7 ANÁLISIS DEL ACETILOMA DE LA LEVADURA .................................................... 46 
4.8 CAMBIOS DEL ACETILOMA POR AUSENCIA DE SIR2 EN LA LEVADURA .......... 52 
. 
 
CAPÍTULO 5. DISCUSIÓN .................................................................................. 54 
5.1 MODIFICACIÓN DEL PROTEOMA DE LA LEVADURA POR SIR2 .............. 55 
3 
 
5.2 REGULACIÓN DE LA HISTONA H4 POR SIR2 ............................................ 59 
5.3 OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA PARA UNA MEJOR COBERTURA ......... 61 
 
CAPÍTULO 6. CONCLUSIÓN .............................................................................. 62 
 
REFERENCIAS .................................................................................................... 64 
 
ANEXOS .............................................................................................................. 92 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
ABREVIATURAS 
 
AceCS-1 Acetil coenzima A sintasa 1 
Acetil-CoA Acetil coenzima A 
CRTC2 Coactivador 2 de transcripción regulado por CREB 
elF2alfa Factor de iniciación eucariota 2 alfa 
eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial 
GNAT N-acetiltransferasas relacionadas a GCN5 
HML Alelo MAT oculto de lado izquierdo 
HMR Alelo MAT oculto de lado derecho 
HSF-1 Factor de transcripción de choque térmico 1 
Hst Homólogos de Sir2 
JNK Quinasas c-Jun N-terminal 
KAT Lisinas acetiltransferasas 
KDAC Lisinas desacetiltransferasas 
MYOD Proteína 1 de diferenciación miogénica 
MYST Familia de histonas acetiltransferasas por sus siglas: MOZ, 
YBF2 y SAS2 de levadura, y TIP60 
NAD Nicotinamida adenina dinucleótido 
NF-kB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de 
las células B activadas 
PAR-1 Receptor activado por proteasa 1 
5 
 
PGC-1α Receptor gamma coactivador 1 alfa activado por peroxisoma 
PTEN Fosfatidilinositol-3, 4, 5-trifosfato 3-fosfatasa 
Ras-GRF1 Factor 1 de intercambio de nucleótido de guanina ras 
SREBP-1 Proteína de unión al elemento de respuesta a esteroles 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
RESUMEN 
El envejecimiento biológico es un proceso ubicuo en los seres vivos que se 
caracteriza por la disminución progresiva de las capacidades funcionales con la 
acumulación de la edad. La pérdida de la proteostasis es uno de los indicadores 
celulares asociados al envejecimiento y al desarrollo de diferentes enfermedades 
incluyendo la neurodegeneración, pérdida de la capacidad cognitiva, ansiedad y 
depresión. La acetilación reversible del proteoma (acetiloma), está emergiendo 
como un mecanismo importante de la regulación proteica. La familia de 
desacetilasas dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+), 
conocidas como sirtuinas, forma parte de la maquinaria que regula el acetiloma. 
Las sirtuinas están presentes desde bacterias hasta humanos y alteraciones en 
estas proteínas tienen efectos en la esperanza de vida de varias especies desde 
levadura hasta ratones y en el curso de enfermedades como Alzheimer, 
Parkinson, y Huntington. En la actualidad se han reportado centenares de 
proteínas diana de las sirtuinas; sin embargo, se han realizado pocos estudios 
sobre el impacto que estas desacetilasas tienen en la regulación global del 
acetiloma y tampoco se ha estudiado la dinámica del acetiloma en el 
envejecimiento. En este trabajo utilizamos el modelo eucarionte más simple, la 
levadura Saccharomyces cerevisiae, para estudiar cómo las sirtuinas regulan el 
acetiloma y modifican la proteostasis celular en un estado posmitótico. 
Analizamos las diferencias en el proteoma y acetiloma entre una cepa silvestre y 
una mutante en la sirtuina 2 (Sir2), colectadas en etapa estacionaria, mediante el 
uso de diferentes técnicas proteómicas incluyendo el marcaje de aminoácidos con 
isótopos estables (SILAC), en combinación con la espectrometría de masas y el 
uso de herramientas bioinformáticas. Los resultados de este proyecto nos 
permitieron identificar 78 dianas reguladas por Sir2 en el proteoma global y la 
proteína histona H4 con mayor cambio en sus niveles de acetilación. De las 78 
proteínas del proteoma global, analizamos su conservación evolutiva e 
identificamos que 52 se encuentran conservadas en mamíferos, de las cuales 10 
tienen una función potencial en procesos de neurodegeneración y cognición. 
7 
 
INTRODUCCIÓN 
Se estima que entre el periodo del 2006 al 2050 el número de personas mayores 
de 60 años de la población mundial se duplicará de 650 millones a 2 mil millones, 
lo cual corresponderá al 22% del total de seres humanos que habitarán nuestro 
planeta (Liu y Sun, 2011). Este fenómeno demográfico conllevará a un incremento 
mundial en la incidencia de enfermedades asociadas al envejecimiento, por lo que 
resulta prioritario el entender los mecanismos biológicos que subyacen a este 
proceso, con el fin de utilizar el conocimiento para implementar estrategias que 
permitan alargar la esperanza de vida saludable de los seres humanos (Pallàs et 
al., 2008). 
En las últimas décadas ha habido importantes avances en la biogerontología, 
área de la ciencia que se encarga de estudiar las bases biológicas del 
envejecimiento desde las moléculas que forman a los seres vivos hasta el 
organismo íntegro (Michan y Castillo, 2011). El conjunto de investigaciones en 
este campo han permitido identificar nueve indicadores del envejecimiento celular: 
1) inestabilidad genómica, 2) desgaste de los telómeros, 3) alteraciones 
epigenéticas, 4) desregulación en detección de nutrientes, 5) disfunción 
mitocondrial, 6) senescencia celular, 7) alteración en la comunicación intracelular, 
8) agotamiento de células madre y 9) pérdida de proteostasis. Todos estos 
indicadores cumplen con los criterios de manifestarse durante el envejecimiento 
normal y de acelerar o retrasar este proceso como resultado de su manipulación. 
No obstante, aún se requiere de un mayor conocimiento sobre cada uno de ellos y 
de cómo estos interaccionanpara identificar cómo intervenirlos para fines 
terapéuticos (López-Otín et al., 2013). 
Este trabajo se enfoca al estudio del último indicador, la proteostasis en donde las 
modificaciones postraduccionales del proteoma desempeñan un papel clave. 
Dentro de éstas, la acetilación reversible, proceso regulado por lisinas 
acetiltransferasas y lisinas desacetiltransferasas, está emergiendo como un 
regulador importante del proteoma y la fracción de proteínas que experimentan 
este tipo de regulación se conoce como acetiloma. Las acetilasas y desacetilasas, 
8 
 
presentes desde bacterias hasta humanos, regulan la homeostasis del acetiloma 
(Kim y Yang, 2011). Las sirtuinas son una familia de desacetilasas que requieren 
de NAD+ y también están conservadas evolutivamente. Estas enzimas suprimen 
la transcripción, pero también sobreregulan algunas proteínas involucradas en el 
metabolismo energético y en mecanismos de sobrevivencia (Zhang et al., 2011). 
Las alteraciones en los niveles de las sirtuinas modifican la esperanza de vida en 
organismos desde levadura hasta ratones y participan en el desarrollo de 
enfermedades relacionadas con la edad, como cáncer, diabetes, cardiopatías y 
neurodegeneración (Srivastava y Haigis, 2011). Además, cambios en los niveles 
de las sirtuinas se relacionan con modificaciones significativas en el acetiloma de 
mamíferos pero se sabe muy poco sobre el impacto de esta regulación en el 
envejecimiento y el grado en el que cada una de las sirtuinas media este 
mecanismo. 
Existen dos tipos de células en los humanos, las mitóticas y las posmitóticas, las 
primeras conservan su capacidad de división celular mientras que las segundas 
no se dividen. Por ejemplo, el cerebro es un órgano conformado en su mayoría 
por células posmitóticas y por lo mismo es más vulnerable a daños acumulados 
con la edad que otros órganos constituidos por células mitóticas como la piel o el 
hígado (Grune et al., 2005). Sin embargo, se desconoce las diferencias de los 
mecanismos que subyacen al envejecimiento de ambos tipos celulares. La fase 
posmitótica de la levadura Saccharomyces cerevisiae es el modelo eucarioto 
experimental más sencillo y ampliamente caracterizado, el cual asemeja las 
condiciones encontradas en otras células más complejas que no se dividen como 
las neuronas (Longo y Fabrizio, 2012). Por lo tanto, en este trabajo utilizamos el 
modelo posmitótico de levadura para estudiar la dinámica del acetiloma, su 
regulación por las sirtuinas y el impacto de esto en la proteostasis. Los hallazgos 
de este trabajo permitieron descubrir dianas conservadas evolutivamente y 
nuevas vías reguladas por acetilación reversible en células similares pero más 
complejas como las neuronas humanas y analizar su función potencial en 
procesos de neurodegeneración y cognición. 
9 
 
CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES 
 
1.1 ENVEJECIMIENTO 
El envejecimiento es un proceso que afecta a todos los organismos y se 
caracteriza por la pérdida de la integridad fisiológica y la disminución de las 
capacidades funcionales con la acumulación de la edad. Gracias a los avances de 
la biogerontología se han descrito nueve indicadores del envejecimiento: 1) 
inestabilidad genómica, 2) desgaste de los telómeros, 3) alteraciones 
epigenéticas, 4) desregulación en detección de nutrientes, 5) disfunción 
mitocondrial, 6) senescencia celular, 7) alteración en la comunicación intracelular, 
8) agotamiento de células madre y 9) pérdida de proteostasis (López-Otín et al., 
2013). 
1.1.1 Inestabilidad genómica 
La inestabilidad del genoma se considera un factor causal del envejecimiento. La 
integridad y estabilidad del ADN se ve afectada continuamente por agentes 
físicos, químicos y biológicos exógenos, así como por alteraciones en los 
sistemas encargados del mantenimiento del genoma, generando mutaciones que 
dan lugar a fenotipos asociados con el envejecimiento (Vijg y Suh, 2013). Dentro 
del sistema nervioso, se observó que la inestabilidad genómica reduce un 
cincuenta por ciento la población de células madre neural de la zona cerebral sub-
ventricular y se asocia con un envejecimiento acelerado (Maslov et al., 2004). 
1.1.2 Desgaste de los telómeros 
El acortamiento de los telómeros se ha asociado con la senescencia celular así 
como con la tumorigénesis y el cáncer. Por lo tanto, la longitud de los telómeros 
es considerado como un marcador del envejecimiento biológico de las células 
(Bekaert et al., 2005). Este acortamiento de telómeros sucede en cada división 
celular hasta que éstos alcanzan una división crítica y la célula entra en 
senescencia y finalmente en apoptosis (Fyhrquist y Saijonmaa, 2012). Este 
10 
 
biomarcador del envejecimiento ha sido asociado con enfermedades 
cardiovasculares y signos fisiológicos del estrés psicológico (Epel et al., 2006). 
1.1.3 Alteraciones epigenéticas 
Las alteraciones epigenéticas son definidas como cambios en la remodelación de 
la cromatina pero sin alteraciones en la secuencia de ADN que afectan la 
expresión genética y función celular. Se ha reportado que las alteraciones 
epigenéticas inician fenotipos de cáncer, envejecimiento y enfermedades del 
sistema nervioso contribuyendo a la progresión de dichos fenotipos (Gonzalo, 
2010). 
1.1.4 Desregulación en detección de nutrientes 
Evidencias indican que la desregulación en la detección de nutrientes es una 
característica del envejecimiento acelerado, mientras que la restricción de 
nutrientes se ha asociado con la extensión de la esperanza de vida (Fontana et 
al., 2010). Varias son las vías desreguladas por nutrientes que se asocian al 
envejecimiento. Por ejemplo, la vía de señalización activada por la insulina o por 
el factor de crecimiento 1 (IIS) participa en la detección de glucosa. El sistema de 
la diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR) participa en la detección 
de concentraciones altas de aminoácidos. La proteína quinasa activada por AMP 
(AMPK) detecta bajos niveles de energía mediante la detección de AMP mientras 
que las sirtuinas dependen de altos niveles de NAD+ (Houtkooper et al., 2010). 
1.1.5 Disfunción mitocondrial 
Evidencias muestran que la acumulación de la edad en mamíferos se correlaciona 
con la acumulación de mutaciones somáticas en el ADN mitocondrial y con 
disminución en la eficacia de la cadena respiratoria. Estos cambios generan un 
aumento en las especies reactivas de oxígeno y una reducción en la generación 
de ATP lo que afecta a células de diferentes tejidos como el corazón, el músculo 
esquelético y neuronas (Trifunovic y Larsson, 2008). 
 
 
11 
 
1.1.6 Senescencia celular 
La senescencia celular es un proceso en respuesta al estrés y daño celular que 
consiste en la detención irreversible en la proliferación celular que en un principio 
se describió como un mecanismo de supresión al limitar la proliferación aberrante 
como sucede en el cáncer. Sin embargo, ahora se sabe que también contribuye a 
los procesos fisiológicos de envejecimiento normal (Jeyapalan y Sedivy, 2012). Se 
ha demostrado que la senescencia de las células madre neuronales es de gran 
importancia para el envejecimiento del sistema nervioso central (Dong et al., 
2014), así mismo se ha correlacionado la senescencia celular de la microglía con 
la enfermedad de Alzheimer (Flanary, 2005). 
1.1.7 Alteración en la comunicación intracelular 
Evidencias muestran que el envejecimiento implica alteraciones en la 
comunicación intracelular, incluyendo comunicación endocrina, neuroendocrina y 
neuronal. La señalización neurohormonal tiende a ser desregulada en el 
envejecimiento y esto se asocia a un aumento en procesos inflamatorios, 
afectando la funcionalidad de todos los tejidos (López-Otín et al., 2013). 
1.1.8 Agotamiento de células madre 
Estudios recientes indican que una de las posibles causas del envejecimiento es 
el agotamiento de las células madres que rigen larenovación de los tejidos. La 
disminución de células madres puede deberse a los daños que sufre el ADN 
(Ruzankina y Brown, 2007). El agotamiento de las células madres neurales 
produce la disminución de la neurogénesis con la edad. En mamíferos las células 
madre disminuyen con la edad especialmente en la zona subventricular del 
ventrículo lateral y la zona subgranular de la circunvolución dentada en el 
hipocampo, generando pérdida gradual de la función olfativa y cognitiva 
respectivamente (Liu y Rando, 2011). 
La pérdida de proteostasis es considerado otro marcador del envejecimiento en el 
que se centra este trabajo y el cual se explica con más detalle en el siguiente 
apartado. 
12 
 
1.2 LA PROTEOSTASIS 
El total de las proteínas de un organismo conforman el proteoma que está 
dinámicamente regulado a nivel de su síntesis por los ribosomas, de su 
plegamiento por chaperonas y de su degradación por dos sistemas proteolíticos: 
el lisosoma y ubiquitina-proteosoma. Un adecuado funcionamiento de todos estos 
mecanismos garantiza la homeostasis del proteoma o proteostasis y promueve la 
vida saludable de los organismos, mientras que un desequilibrio se ha asociado 
no solo con un envejecimiento acelerado sino también a una variedad de 
patologías como cáncer, enfermedades del sistema inmune, neurodegenerativas 
y cardiopatías (Schmidt y Finley, 2013) (Fig.1). Las modificaciones 
postraduccionales son cambios químicos que ocurren después de la síntesis de 
las proteínas, los cuales alteran la estructura original de la proteína. Actualmente 
se han descrito 300 modificaciones postraduccionales (Lee, 2013) y muchas de 
ellas incluyen la unión covalente de moléculas pequeñas a residuos de 
aminoácidos específicos como la ubiquitinación de la lisina, fosforilación de la 
serina y treonina, metilación de la lisina y arginina, ribosilación de la lisina y la 
acetilación de la lisina (Michan, 2013). 
 
13 
 
 
Figura 1. Esquema de la regulación del proteoma. El proteoma está regulado 
dinámicamente a nivel de su síntesis por los ribosomas, a nivel de su plegamiento por las 
chaperonas y a nivel de degradación por dos sistemas proteolíticos: el lisosoma y 
ubiquitina-proteosoma. Un adecuado funcionamiento de estos sistemas garantiza la 
proteostasis y promueve un organismo saludable, mientras que un desequilibrio en la 
regulación del proteoma, genera estados patológicos y promueve el envejecimiento 
acelerado. 
 
1.3 EL ACETILOMA 
Existen dos tipos de acetilación: la acetilación del grupo alfa-amino al residuo 
amino terminal y la acetilación del grupo épsilon-amino de los residuos de lisina 
de las proteínas. El primer tipo es un proceso co-traduccional irreversible que 
consiste en la adición de un grupo acetilo de la acetil coenzima A en el residuo 
amino-terminal de las proteínas (Allfrey et al., 1964). El segundo tipo de 
acetilación consiste en un proceso post-traduccional reversible donde intervienen 
las lisinas acetiltranferasas (KATs) y las lisinas desacetilasas (KDACs). Las KATs 
catalizan la transferencia de un grupo acetilo de la acetil coenzima A al grupo 
épsilon-amino del residuo de lisina y las KDACs eliminan el grupo acetilo de la 
acetil-lisina generando nicotinamida y 2’O-Acetil-ADP-ribosa como bioproductos 
14 
 
(Yang y Seto, 2007) (Fig. 2). En este trabajo nos centramos en la acetilación 
reversible que es la encargada de mantener la homeostasis del acetiloma. 
 
Figura 2. Esquema de la regulación reversible del acetiloma. La flecha gris muestra 
la acetilación mediada por una acetil-transferasa en la que se transfiere un grupo acetilo 
de la acetil coenzima A al residuo de lisina. Las flechas negras muestran la desacetilación 
de un residuo de lisina mediante dos mecanismos diferentes. Las desacetilasas de la 
clase I y II utilizan zinc y generan acetato. Las sirtuinas son dependientes de NAD+ y 
producen 2’-O acetil ADP ribosa. 
 
En mamíferos existen 20 KATs y 18 KDACs, las KATs se subdividen en MYST, 
GNAT y p300/CBP de acuerdo a sus dominios catalíticos, mientras que las 
KDACs se subdividen en las clases I, II, III y IV de acuerdo a la similitud de su 
secuencia. Las sirtuinas se encuentran clasificadas en la clase III de las KDACs y 
a diferencia de las otras clases, utilizan NAD+ como cofactor para la reacción de 
desacetilación y generan como subproductos acetil-ADP-ribosa y nicotinamida 
(Mischerikow y Heck, 2011). 
El acetiloma está regulado por factores como la radiación (Bennetzen et al., 
2013), los ritmos circadianos (Masri et al., 2013) y la dieta. Un alto consumo de 
15 
 
grasas induce la acetilación del proteoma (Choudhury et al., 2011), mientras que 
la restricción calórica, que se define como la disminución del consumo de calorías 
sin malnutrición, disminuye la acetilación (Schwer et al., 2009). 
A la fecha se han reportado 7151 sitios de acetilación en aproximadamente 3311 
proteínas de varias especies que se acetilan de manera reversible en los residuos 
de lisina, conformando el acetiloma (Liu et al., 2013). Sin embargo, sólo se ha 
realizado un estudio del acetiloma en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Ahí 
se encontraron 4000 lisinas acetiladas, todas conservadas evolutivamente. Con el 
uso de herramientas bioinformáticas se identificó que una fracción mayoritaria de 
las proteínas a las que pertenecen esas lisinas conservadas participan en el 
metabolismo celular, la síntesis de proteínas y el plegamiento de las proteínas. 
Además, este estudio incluyó a una mutante en la desacetilasa Rpd3 
perteneciente a la Clase I y diferente a las sirtuinas, lo cual permitió la 
identificación de nuevos posibles sustratos para esta enzima (Henriksen et al., 
2012). 
1.4 LAS SIRTUINAS 
Las sirtuinas son proteínas conservadas en la evolución desde bacterias hasta el 
ser humano. En la levadura Sacchromyces cerevisiae se describió la primera 
sirtuina, Sir2, a la cual se le atribuyó una función de silenciamiento génico en los 
loci de tipo de apareamiento, alelo MAT oculto de lado izquierdo (HML) y alelo 
MAT oculto de lado derecho HMR, así como el silenciamiento de los genes 
cercanos a los telómeros (Ivy et al., 1986). Posteriormente se encontró que Sir2 
actúa como una histona desacetilasa dependiente de NAD+ (Imai et al., 2000). 
Estudios sobre el efecto de las alteraciones en la dosis genética de Sir2 
demostraron que esta proteína modifica la duración de la esperanza de vida en 
esta levadura. Este efecto también se observó en el gusano Caenorhabditis 
elegans y la mosca Drosophila melanogaster (Morris, 2013). Posteriormente se 
identificaron cuatro sirtuinas adicionales en levadura: Hst1, Hst2, Hst3 y Hst4, 
todas con actividad desacetilasa. Hst1, reprime la transcripción génica por medio 
la desacetilación de histonas; Hst2 disminuye el silenciamiento en los telómeros 
16 
 
dependiente de Sir2; y Hst3 y Hst4 estabilizan el genoma durante el ciclo celular. 
De las cinco sirtuinas de levadura, Sir2 es la mejor caracterizada en cuanto a su 
función y naturaleza de desacetilasa dependiente de NAD+ (Wierman y Smith, 
2013). 
En los mamíferos se han descrito siete tipos de sirtuinas SIRT1-SIRT7. A pesar 
de que presentan diversas actividades enzimáticas, todas requieren NAD+ (Bao y 
Sack, 2010). SIRT1 se encuentra en el núcleo y citoplasma, SIRT2 en el 
citoplasma, SIRT3-SIRT5 son mitocondriales y SIRT6-SIRT7 se encuentran 
también en el núcleo. SIRT1 es un regulador clave de varios procesos celulares 
como el metabolismo, la estabilidad genómica, y la proteostasis; SIRT2 regula el 
ciclo celular; SIRT3-SIRT5 participan en la producción de ATP, el metabolismo, la 
apoptosis, y la señalización intracelular; SIRT6 juega un papel clave en la 
reparación del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica y SIRT7 regula 
la transcripción de proteínas (Villalba y Alcaín, 2012). 
SIRT1 es la sirtuina mayormente estudiada en mamíferos, porser la sirtuina 
humana con mayor similitud a Sir2 de levadura en términos de secuencia y 
actividad enzimática de tipo desacetilasa (Verdin et al., 2010) (Fig. 3). En los 
mamíferos las sirtuinas regulan procesos como la longevidad, reparación del 
ADN, silenciamiento de genes, estabilidad del genoma, biogénesis mitocondrial, 
senescencia, homeostasis energética, apoptosis, división celular y autofagia 
(Michan, 2013). 
17 
 
 
Figura 3. Esquema que representa la homología entre Sir2 y las sirtuinas en 
mamíferos. En la parte superior se observa la estructura tridimensional de los dominios 
básicos de las sirtuinas de Sir2 y tres de las sirtuinas en mamíferos. El residuo de 
histidina catalítica se resalta en color rosa. En la parte inferior se observa la similitud en la 
secuencia de Sir2 y las sirtuinas en mamíferos, los residuos de aminoácidos altamente 
conservados (sombreados en azul) y el residuo de histidina catalítica (encerrado en color 
rosa) (Imagen tomada de Verdin, 2010). 
 
1.5 EL IMPACTO DE LAS SIRTUINAS EN LA REGULACIÓN DEL ACETILOMA 
Se han reportado diversas dianas citoplásmicas para SIRT1 como eNOS que 
influye en vasodilatación y aumenta los nutrientes en tejido, proteínas que 
promueven autofagia, y AceCS-1 que disminuye los niveles de Acetil-CoA. En el 
núcleo, algunas de sus dianas son: i) FOXOs y CRTC2 que intervienen en la 
gluconeogénesis y adaptación al estrés oxidativo; ii) SREBP-1 y LXR, con 
actividad en el anabolismo de lípidos; y iii) PGC-1α y p53 en respiración 
mitocondrial. Otros dianas de SIRT1 descritos son HSF-1, NF-KB, MYOD, HDAC-
1, PAR-1, INK4A, RasGRF1, ARNmi, PTEN y JNK (Morris, 2013), cuya 
desacetilación disminuye la apoptosis y aumenta la resistencia al estrés (Porcu y 
Chiarugi, 2005). Por otra parte, dianas de SIRT1 cuya desacetilación promueve 
18 
 
un efecto neuroprotector son NF-KB, α-secretasa, TOR, ROCK1, ARNmi, PER2, 
RAR-β, ATG5, BMAL-1 (Morris, 2013) (Fig. 4). 
 
Figura 4. Esquema del impacto de SIRT1 en la regulación del acetiloma. En el 
esquema se muestra la localización (color rosa) de las proteínas reguladas por SIRT1 
(color verde), así como el impacto que tiene en algunos procesos biológicos (color azul). 
 
Sólo se han realizado contados estudios para analizar la regulación del acetiloma 
por sirtuinas. Experimentos con ratones knockout de SIRT3 indican que esta 
sirtuina regula de manera importante el acetiloma mitocondrial, al observarse que 
una reducción en la actividad de SIRT3 se asocia con la hiperacetilación de 
proteínas mitocondriales en el hígado de ratones que fueron sometido a una dieta 
alta en grasas (Kendrick et al., 2011). 
También se realizó un estudio a gran escala para determinar el efecto de deletar 
SIRT1 en la acetilación de proteínas de células embrionarias del fibroblasto de 
ratones, en el que se encontraron 4623 sitios de acetilación de lisina en 1800 
proteínas regulados por SIRT1 en diversas vías celulares. De acuerdo al análisis 
realizado con Gene Ontology, éstos blancos de SIRT1 son proteínas nucleares, 
19 
 
implicadas en procesos biológicos como transcripción, expresión génica y 
empalme del ARNm (Chen et al., 2012). 
1.6 EL EFECTO DE LAS SIRTUINAS EN LA NEURODEGENERACIÓN Y 
COGNICIÓN. 
El cerebro es uno de los órganos que experimentan un declive significativo de la 
integridad funcional a causa del envejecimiento. Múltiples estudios muestran que 
la acción de las sirtuinas tiene un papel neuroprotector (Duan, 2013). 
Las sirtuinas que se han identificado en el cerebro son SIRT1 y SIRT2. SIRT1 se 
expresa en las neuronas de la corteza, hipocampo, el cerebelo, sustancia blanca 
y el hipotálamo, mientras que SIRT2 se expresa mayormente en oligodendrocitos 
y en las neuronas olfativas y del hipocampo (Zhang et al., 2011). Diversas 
investigaciones revelan que la actividad de desacetilasa de SIRT1 puede 
disminuir los signos de enfermedades neurodegenerativas como Parkinson, 
Huntington, Alzheimer y Esclerosis Lateral Amiotrófica (De Oliveira et al., 2010). 
La sobre-expresión de SIRT1 en neuronas de ratón in vitro con agregados de 
beta-amiloide, característica fisiopatológica de la enfermedad de Alzheimer, activa 
la α-secretasa mediante la inhibición de ROCK1, ofreciendo una vía alternativa de 
corte de la proteína precursora amiloidea, y genera que no se produzca más beta-
amiloide, disminuyendo la muerte neuronal especialmente en regiones cortico-
hipocampal (Qin et al., 2006). 
Por el contrario, en cultivos celulares de neuronas de ratón, se observó que la 
deficiencia de SIRT1, impide la ubiquinación de tau e incrementa los niveles de 
tau fosforilada, posiblemente mediante el bloqueo de la degradación mediada por 
proteasoma, generando aumento en los niveles de tau acetilada, una 
característica de taupatías neurodegenerativas como parkinsonismo, demencia 
frontotemporal y la enfermedad de Alzheimer (Min et al., 2010). 
 
20 
 
En un ratón transgénico A53T que expresa una forma mutada humana de α-
sinucleína la cual se acumula en el cerebro y es un elemento fisiopatológico de la 
enfermedad de Parkinson, se observó que la sobreexpresión de SIRT1 previene 
la agregación de α-sinucleína en el cerebro, SIRT1 desacetila y activa el factor de 
choque térmico 1 (HSF1), el cual afecta la vía reguladora de chaperonas 
moleculares al activar la proteína de choque térmico 70 KDa (Hsp70), protegiendo 
a las células cerebrales de la toxicidad generada por α-sinucleína (Donmez et al., 
2012). 
En un estudio con ratones transgénicos VSC4.1 SOD1G93A, modelos con 
fisiopatologías de esclerósis lateral amiotrófica, encontraron que la 
sobreexpresión de SIRT1 inducida por resveratrol, protege a las motoneuronas de 
la toxicidad provocada por la mutante de superóxido dismutasa al inhibir la 
elevación de los niveles celulares de ATP mediante la biogénesis mitocondrial, 
evitando la degeneración de neuronas motoras (Wang et al., 2011). 
Por otra parte, en otro estudio se utilizó ratones transgénicos que expresan la 
mutante de huntingtina y sobreexpresan SIRT1 especialmente en áreas corticales 
y estriado del cerebro. Se observó que SIRT1 desacetila el co-activador de 
transcripción 1 regulado por CREB (TORC1) y activa la transcripción del factor 
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) mediante la mejora de la actividad 
transcripcional de CREB-TORC1. Aumentando la supervivencia de neuronas 
corticales que se habían visto afectadas por la toxicidad de la mutante de la 
huntingtina (Jeong et al., 2012). 
Como ya se mencionó anteriormente SIRT1 se expresa en hipocampo, estructura 
importante para el aprendizaje y memoria. Un estudio en un modelo de ratón 
reveló que la deficiencia de SIRT1 produce deterioro de las capacidades 
cognitivas como la memoria inmediata, el condicionamiento clásico, el aprendizaje 
espacial y la memoria asociativa a corto y largo plazo. Por el contrario, se 
encontró que la sobreexpresión de SIRT1 favorece la plasticidad sináptica y la 
memoria. Además, se realizó un análisis morfométrico de las espinas dentríticas 
en las neuronas piramidales CA1 y se observó que la deficiencia de SIRT1 
21 
 
produce una disminución significativa en la arborización de las espinas dendríticas 
en las neuronas (Michan et al., 2010). Se ha considerado a SIRT1 como una 
nueva vía que regula los procesos llamados de orden superior, entre ellos el 
aprendizaje, la memoria y la plasticidad sináptica (Gao et al., 2010). 
En células granulares del cerebelo de un modelo murino con fisiopatología de la 
degeneración walleriana, se observó el papel protector de SIRT2 al desacetilar la 
tubulina que es el principal componente de los microtúbulos, generando 
resistencia a la degeneración axonal (Suzuki y Koike, 2007). 
El mecanismo mediante el cual algunos fármacos inhiben la actividad de las 
sirtuinas, aún no ha sido totalmente comprendido. Sin embargo, en contraste con 
SIRT1, la inhibiciónde SIRT2 parece tener un efecto neuroprotector. En el modelo 
de ratón R6/2 con elementos fisiopatológicos de la enfermedad de Huntington la 
inhibición farmacológica con AK-7 de SIRT2 reduce los agregados de la 
huntingtina mutada, mejorando el comportamiento motor de los ratones (Chopra 
et al., 2012), mientras que la inhibición de esta sirtuina con AGK2 y AK-1, reduce 
los agregados de α-sinucleína en el modelo Drosophila melanogaster de la 
enfermedad de Parkinson (Outeiro et al., 2007). 
Se han utilizado diferentes modelos para el desarrollo de estas investigaciones, 
como por ejemplo el gusano Caenorhabditis elegans, la mosca Drosophila 
melanogaster, distintos modelos de ratones, mono Rhesus y células de cerebro 
humano. Sin embargo, la levadura Saccharomyces cerevisiae que utilizamos en 
este trabajo resulta un modelo sencillo, económico y práctico en el que se han 
logrado reproducir diversos elementos fisiopatológicos de enfermedades 
neurodegenerativas como la toxicidad celular mediada por proteínas mal 
plegadas, apoptosis, estrés oxidativo y agregado de proteínas. Por lo tanto es un 
modelo eficaz para realizar investigaciones bioquímicas y moleculares de los 
procesos comunes que comparten todas las células eucariontas, incluyendo las 
neuronas que forman el complejo sistema nervioso de los humanos. 
 
22 
 
1.7 LA LEVADURA: UN MODELO SENCILLO PARA IDENTIFICAR 
MECANISMOS MOLECULARES CONSERVADOS EN LAS NEURONAS 
HUMANAS 
 
La bacteria Escherichia coli y la levadura Saccharomyces cerevisiae son 
organismos unicelulares que han servido como modelo para investigaciones 
moleculares. La Escherichia coli ha permitido entender procesos como 
transcripción, replicación y traducción de la información genética, sin embargo, la 
extrapolación a células eucariontas está aún limitada en este organismo 
(Cameron et al., 2015). A diferencia de la levadura que ha servido como modelo 
de estudio para enfermedades humanas, incluyendo patologías asociadas al 
sistema nervioso (Miller-Fleming et al., 2008). 
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un organismo eucarionte cuya 
organización celular es similar a la de las células que conforman los tejidos de los 
humanos. La quinta parte de los genes de levadura comparten genes ortólogos 
asociados a enfermedades humanas por lo que este microorganismo se ha 
convertido en un modelo óptimo para investigaciones, desde las relacionadas con 
diversos procesos básicos celulares hasta los estudios de enfermedades 
humanas (Heinicke et al., 2007). Es importante mencionar que en este modelo se 
han logrado reproducir y estudiar varias características como la formación de 
agregados de proteínas, la toxicidad celular mediada por proteínas mal plegadas, 
el estrés oxidativo y la apoptosis (Miller-Fleming et al., 2008) en el contexto de 
varias enfermedades neurodegenerativas como en el Alzheimer, (Pimentel et al., 
2012), Huntington (Pereira et al., 2012) y los efectos celulares de la alfa-
sinucleína característica de la enfermedad de Parkinson (Outeiro y Lindquist, 
2003). 
En estudios proteómicos, la levadura ha servido como un organismo modelo para 
el uso de técnicas innovadoras como el marcaje de aminoácidos con isótopos 
estables acompañados del análisis por espectrometría de masas, las cuales 
23 
 
pretenden responder a preguntas que atañen a varios tipos celulares (De Godoy 
et al., 2006). 
Debido a su genoma y proteoma bien caracterizado, y a la facilidad de su 
manipulación genética, la levadura Saccharomyces cerevisiae ha servido como un 
modelo para identificar vías que regulan el envejecimiento conservadas en 
mamíferos (Longo et al., 2012) como las sirtuinas, la vía de señalización de TOR, 
Ras/adenilato ciclasa/PKA y la vía de señalización de la insulina/IGF-1. Por 
ejemplo, la proteína Sir2 inhibe la transcripción, reduce la inestabilidad genómica 
y aumenta la supervivencia tanto en levaduras como en células humanas 
(Wierman y Smith, 2013). La disminución o inactivación en los niveles de TOR 
aumenta la esperanza de vida en varias especies incluyendo el ratón (Kapahi et 
al., 2010). La vía de Ras promueve resistencia al estrés oxidativo, mientras que 
en la vía de señalización activada por la insulina o por el factor de crecimiento 
(IGF-1), activa en el núcleo el factor de transcripción Daf-16 promoviendo 
resistencia al estrés y aumento en la longevidad (Lian et al., 2013). Además, 
diversos estudios muestran que estas vías conservadas regulan la sobrevivencia 
de células posmitóticas de mamíferos como las cardiacas y las neuronas (Longo y 
Fabrizio, 2012). 
Algunas investigaciones se han realizado con el uso de cepas mutantes en 
sirtuinas con el objetivo de analizar el impacto de la proteína en algunos procesos, 
por ejemplo, cepas mutantes en Sir2 en el estudio del proceso de envejecimiento 
(Orozco et al., 2012); mutaciones en SIRT1 y su impacto en procesos metabólicos 
(Seifert et al., 2012), cáncer (Lin y Fang, 2013) y enfermedades 
neurodegenerativas (Marques et al., 2012). En este trabajo se utilizó una cepa 
mutante en Sir2 de la levadura Saccharomyces cerevisiae que consiste en el 
reemplazo de la secuencia responsable del silenciamiento génico de Sir2 (Ypl5) 
con la secuencia del gen TRP1 (Mills et al., 1999). 
En la levadura Saccharomyces cerevisiae se han propuesto dos modelos de 
envejecimiento, el replicativo y el cronológico. El envejecimiento replicativo se 
refiere al número máximo de células en el que una célula madre se puede dividir 
24 
 
antes de que la división celular se detenga definitivamente, mientras que el 
envejecimiento cronológico se refiere al tiempo máximo que sobreviven las 
células después de que cesa su división celular. Se ha considerado que este 
último modelo asemeja más las condiciones de envejecimiento en células 
complejas como las neuronas (Longo et al., 2012). 
Con base en todos estos antecedentes, en este trabajo estudiamos cómo Sir2 
regula el acetiloma y la proteostasis celular utilizando el modelo posmitótico de la 
levadura Saccharomyces cerevisiae con el fin de identificar nuevas posibles vías 
reguladas por acetilación reversible y dianas de Sir2 con funciones relevantes en 
procesos de neurodegeneración y cognición que pudieran estar conservadas en 
células posmitóticas más complejas. 
 
CAPÍTULO 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
2.1 JUSTIFICACIÓN 
El acetiloma está emergiendo como un mecanismo de regulación celular con 
relevancia en el envejecimiento y enfermedades asociadas con la edad; sin 
embargo, los estudios sobre su regulación aún son limitados y se desconoce el 
papel que desempeña el acetiloma en el mantenimiento global de la homeostasis 
proteica. A pesar de que la actividad desacetilasa de Sir2 se describió por primera 
vez en levadura en 1999, a la fecha no se han realizado estudios a gran escala 
para determinar el grado en el que esta sirtuina regula el proteoma celular. 
Realizar estos estudios en el modelo posmitótico de levadura nos permitirá 
aproximarnos a entender, en un modelo eucarioto sencillo, cómo Sir2 regula la 
dinámica del acetiloma y la proteostasis celular. Además este estudio nos 
permitirá identificar nuevas vías reguladoras de la homeostasis del proteoma 
dependientes de las sirtuinas y nuevas dianas reguladas por Sir2 que pudieran 
estar conservadas en células posmitóticas más complejas como las neuronas 
25 
 
humanas y que por medio de la acetilación reversible regulan funciones 
importantes asociadas a la sobrevivencia celular, neurodegeneración y cognición. 
 
2.2 OBJETIVO GENERAL 
Estudiar el impacto de las sirtuinas en la regulación del acetiloma y la 
modificación de la proteostasis celular en el modelo posmitótico de la levadura 
Saccharomyces cerevisiae mediante el análisis de las diferencias en el proteoma 
y acetiloma entre una cepa silvestre y una mutante de Sir2. 
 
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
1.- Analizarlas diferencias en el proteoma entre una cepa silvestre y una mutante 
de Sir2 en el modelo posmitótico de la levadura. 
2.- Identificar las diferencias en el acetiloma entre una cepa silvestre y una 
mutante de Sir2 en el modelo posmitótico de la levadura. 
3. Identificar las dianas con los mayores cambios en los niveles de acetilación 
regulada por Sir2. 
4. Analizar la función potencial de las dianas identificadas en procesos de 
neurodegeneración y cognición. 
 
2.4 HIPÓTESIS 
Sir2 regula la homeostasis del acetiloma al desacetilar los residuos de lisina de 
las proteínas, por lo tanto se espera que en el modelo posmitótico de la levadura 
Saccharomyces cerevisiae, una cepa mutante en Sir2, revele un cambio en la 
acetilación global de proteínas en comparación con la cepa silvestre y que estos 
26 
 
cambios en el acetiloma tengan un impacto significativo en la proteostasis, 
alterando la composición del proteoma. 
 
CAPÍTULO 3. METODOLOGÍA 
Como autora de la tesis participé en el diseño de este proyecto, el diseño 
experimental, análisis e interpretación de datos. Sin embargo la parte 
experimental fue realizada por la doctora Shaday Michán en colaboración con 
investigadores de la Universidad de Washington. El cultivo de células fue 
realizado por la doctora Shaday Michán en el laboratorio del doctor James Bruce 
de la Universidad de Washington. En el mismo laboratorio se llevó a cabo la 
espectrometría de masas por los doctores Shaday Michán, Arti Navare, Juan 
Chavez, Chunxiang Zheng y Xia Wu. La integración de los datos obtenidos de la 
espectrometría de masas mediante el software Iprophet se realizó bajo la 
asesoría del doctor Jimmy Eng, autor del motor de búsqueda Sequest. A 
continuación se explica con detalle la metodología del proyecto. 
 
3.1 CEPAS 
Se utilizó una cepa silvestre y una mutante en Sir2 de la levadura Saccharomyces 
cerevisiae del fondo genético BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0, ura3Δ0). 
La auxotrofía de lisina requiere de la suplementación exógena de este aminoácido 
al medio para el crecimiento de la levadura, lo que permite marcar de forma 
diferencial las proteínas de dos cepas. 
La mutante de Sir2 consiste en el reemplazo de la secuencia responsable del 
silenciamiento génico de Sir2 (Ypl5) por la secuencia del gen TRP1 (Mills et al., 
1999). 
 
 
27 
 
3.2 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO 
Se preparó medio líquido de dextrosa sintético completo (DSC) en el que se 
controló la suplementación de los aminoácidos que fueron añadidos. El medio 
constó de 1.7 g/l de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos ni acetato de 
amonio (DIFCO-233520 /Becton, Dickins), 5 g/l de acetato de amonio granular y 
1.4 g/l de la mezcla de aminoácidos sin lisina. La mezcla de aminoácidos estuvo 
compuesta por los siguientes compuestos: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se colocó el medio de cultivo en autoclave para esterilización con vapor saturado 
a alta presión a una temperatura entre 121-134 °C por 15-20 minutos. 
Posteriormente, se agregó solución de dextrosa estéril (20g/L). El medio se 
dividió en dos lotes para suplementarlo con 0.15 g/l de L-lisina 2HCL ligera (N14) 
o marcada con el isótopo pesado N15 (Cambridge Isotope, CNML-291-H). 
 
 
Componente g/l 
Adenina 0.019 
Arginina 0.019 
Ácido aspártico 0.096 
Ácido glutámico 0.096 
Histidina 0.019 
Isoleucina 0.077 
Leucina 0.077 
Lisina 0.058 
Metionina 0.019 
Fenilalanina 0.048 
Serina 0.384 
Treonina 0.192 
Triptófano 0.077 
Tirosina 0.058 
Uracilo 0.019 
Valina 0.144 
28 
 
3.3 CULTIVOS CELULARES 
El marcaje de aminoácidos con isótopos estables en cultivo celular (SILAC), 
consiste en cultivar dos poblaciones de células en medios de cultivos idénticos 
excepto que uno de ellos contiene un aminoácido marcado con un isótopo ligero y 
el otro con un isótopo pesado. Durante el crecimiento de las células, se incorpora 
el aminoácido marcado en su totalidad de proteínas. La ventaja de esta técnica es 
que las dos poblaciones de células pueden ser combinadas y analizadas al mismo 
tiempo por espectrometría de masas para detectar diferencias en la abundancia 
de proteínas entre las dos poblaciones de células. En este trabajo, se crecieron 
alternadamente las cepas en presencia de L-lisina N14 o N15, de tal forma que 
durante el crecimiento las levaduras incorporen la lisina correspondiente en sus 
proteínas (Fig. 5). 
Se hicieron las siguientes cuatro combinaciones que incluyen dos muestras 
experimentales y dos controles (Fig. 6). 
Experimentales: 
1) (N15) cepa silvestre - (N14) cepa mutante en Sir2 (Experimental 1) 
2) (N14) cepa silvestre - (N15) cepa mutante en Sir2 (Experimental 2) 
Controles: 
3) (N15) cepa silvestre - (N14) cepa silvestre (Control 1) 
4) (N15) cepa mutante en Sir2- (N14) cepa mutante en Sir2 (Control 2) 
En todos los casos se crecieron 30 ml de levadura en DSC a 30°C, 250 rpm. El 
crecimiento del cultivo se monitoreó por medio de la lectura de absorbancia en el 
espectrofotómetro y una vez alcanzada la fase estacionaria a las 72 h, las 
levaduras se colectaron por centrifugación. El botón de células se lavó tres veces 
con agua destilada 4°C y se congeló a -70°C (Fig. 5). 
 
29 
 
3.4 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 
Las levaduras se descongelaron y resuspendieron en 300 ul de amortiguador 50 
mM Tris–HCl, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 8M urea, coctel inhibidor de proteasas 
(Roche) e inhibidores de desacetilasas (150 mM NaCl, 1uM TSA, 20 mM NAM, 10 
mM butirato de sodio). Las células se rompieron mecánicamente con perlas de 
vidrio (500 um) agitadas en vortex a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y 
cuantificó la proteína de cada muestra. Después, las células se digirieron con 
tripsina (Promega V511C) 0,1 ug / ul con una proporción de 1:200 a 37°C para 
generar fragmentos de péptidos. La tripsina se inactivó con ácido acético hasta 
alcanzar un pH=2. Los péptidos se purificaron en columnas Sep-Pak Vac 1cc 
Waters (Wat054955). Una fracción de la solución de péptidos (100 µg) se analizó 
por espectrometría de masas para detectar los cambios globales del proteoma 
entre las diferentes cepas. El resto de la fracción de péptidos se utilizó para 
purificar el acetiloma. Se utilizó el anticuerpo acetil-lisina (ImmunoChemistry) 
diluído a una relación de 1:1000 para inmunoprecipitar el acetiloma, lo cual se 
confirmó por Western Blot con el anticuerpo anti-acetil (Cell Signaling Technology, 
9441) (Fig. 6). 
30 
 
 
Figura 5. Diagrama de la técnica SILAC y el crecimiento de las células de levadura. 
Células de la levadura Saccharomyces cerevisiae mutante de Sir2 y silvestre fueron 
crecidas en cultivos con la técnica de SILAC. Se crecieron alternadamente las cepas en 
presencia de L-lisina N14 (ligera) o N15 (pesada), durante el crecimiento las levaduras 
incorporaron la lisina correspondiente en sus proteínas. Las levaduras se colectaron en 
etapa estacionaria, fase posmitótica de la célula correspondiente al modelo de 
envejecimiento cronológico y las dos poblaciones de células se combinaron y analizaron 
al mismo tiempo por espectrometría de masas. 
31 
 
 
Figura 6. Diagrama del diseño experimental para la identificación de diferencias en 
el proteoma y acetiloma entre una cepa silvestre y una mutante de Sir2 en el 
modelo posmitótico de la levadura. Se realizaron cuatro réplicas biológicas con distinta 
combinación de marcaje. Las proteínas se digirieron y una fracción se utilizó para analizar 
el proteoma global, y la otra para inmunoprecipitar el acetiloma, lo cual se confirmó por 
Western blot. Ambas fracciones de péptidos se analizaron por espectrometría de masas. 
 
3.5 ANÁLISIS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS 
Las muestras de péptidos a analizar se resuspendieron en 70% acetonitrilo, 0.5% 
de ácido trifluroacético durante 10 minutos tres veces. Posteriormente se 
analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución y un espectrómetro 
de masas Velos-FT en faseinversa (HPCL-MS, por sus siglas en inglés), las 
mezclas de péptidos fueron separadas en la columna C18 y mediante la técnica 
electrospray o electronebulización las muestras fueron ionizadas, los iones 
generados fueron atraídos y enfocados hacia el interior del analizador mediante la 
aplicación de un potencial eléctrico. Posteriormente mediante la acción del anillo 
generador de radiofrecuencias se expulsaron los iones de manera secuencial 
hacia el detector, el cual nos proporcionó información sobre los espectros de 
32 
 
fragmentación en función de su masa para posteriormente ser identificados. Se 
realizaron tres réplicas técnicas (Yang et al., 2011). 
 
3.6 ANÁLISIS DE DATOS 
Para la identificación de los péptidos se utilizaron tres motores de búsqueda 
diferentes: SEQUEST, MASCOT y XTANDEM. SEQUEST fue el primer motor de 
búsqueda disponible, considera péptidos digeridos e identifica cada espectro de 
masas en tándem de forma individual en bases de datos de proteínas (EST) y en 
bases de secuencias de levadura (López-Ferrer et al., 2004). MASCOT considera 
sólo los péptidos digeridos y utiliza una puntuación de probabilidad algorítmica 
para la búsqueda del péptido correspondiente al espectro de masa de los iones, 
en tres bases de datos (SwissProt, NCBInr y EST) (Hirosawa et al., 1993). 
XTANDEM es el motor de búsqueda más rápido, considera péptidos semi-
digeridos y también utiliza una puntuación de probabilidad pero realiza la 
búsqueda en seis bases de datos (GPMDB, pSYT, SNAP, MRM, PEPTIDE, HOT) 
(Muth et al., 2010). 
Posteriormente, se hizo una integración de los datos obtenidos en los tres 
motores de búsqueda con el programa Iprophet. Iprophet es una nueva 
herramienta para el análisis de datos de proteómica, que combina los diferentes 
resultados encontrados por múltiples motores de búsqueda, en este caso por 
MASCOT, XTANDEM y SEQUEST, permitiendo una integración precisa y eficaz 
(Shteynberg et al., 2011). 
Se realizó la cuantificación de las diferencias de las combinaciones 
experimentales utilizando Xpress, software que permite cuantificar las 
proporciones de las diferencias en la abundancia relativa entre las dos 
combinaciones de péptidos marcados con la técnica SILAC (Han et al., 2001). 
El análisis de datos se realizó en Excel 2010. Seleccionamos las proteínas que 
tuvieran una puntuación de probabilidad mayor a 0.8 de acuerdo a los resultados 
33 
 
de Iprophet, sacamos log2 del valor de Xpress para normalizar los datos y 
disminuir la variabilidad existente. Obtuvimos promedio y desviación estándar del 
valor de log2 (Xpress), sacamos desviación estándar relativa para normalizar los 
datos del promedio de log2 (Xpress). Para el caso de la réplica biológica cepa 
silvestre (ligera)-cepa mutante (pesada) se invirtió el valor de Xpress para 
homologar los datos al marcaje SILAC de la otra muestra biológica. 
Posteriormente realizamos un histograma para seleccionar las proteínas que 
mostraron tener mayor abundancia. Con el objetivo de identificar las proteínas 
que tuvieran diferencias estadísticamente significativas en su abundancia, 
aplicamos una prueba estadística de t-student de dos colas. En el arreglo de 
réplicas experimentales y réplicas controles, seleccionamos a las proteínas que 
tuvieran un nivel de significancia p < 0.05. Para identificar los cambios regulados 
por Sir2, analizamos la reproducibilidad de las réplicas experimentales, aplicando 
t-student pero ahora seleccionamos las proteínas que tuvieran un nivel de 
significancia p > 0.05. 
Se realizaron diagramas de Venn para hacer un resgistro de todos los péptidos y 
proteínas identificados a nivel de proteoma y acetiloma en las tres réplicas 
técnicas realizadas con el análisis de espectrometría de masas, así como para 
observar la reproducibilidad de las tres réplicas técnicas. 
Se analizó la conservación evolutiva de las proteínas que mostraron diferencias 
estadísticamente significativas, mediante el software eggNOG versión 4. 
Realizamos una búsqueda en la base de datos de literatura PubMed que 
permitiera identificar trabajos previos en los que se hubiera reportado aquellas 
proteínas que participan en alguno de los nueve marcadores biológicos del 
envejecimiento celular, que son reguladas por sirtuinas y/o que participen en 
procesos de neurodegeneración y cognición. 
Utilizamos el software Gene Ontology Consortium para identificar los procesos 
biológicos de las proteínas cuyo campo de estudio es muy pobre y que pueden 
34 
 
desempeñar un papel importante en envejecimiento, neurodegeneración y 
cognición. 
 
CAPÍTULO 4. RESULTADOS 
 
4.1 ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN EL PROTEOMA DE LA LEVADURA EN 
UNA MUTANTE SIR2 
Con el objetivo de analizar los cambios en el proteoma de la levadura inducidos 
por la falta de Sir2, utilizamos una cepa silvestre y una mutante en Sir2 de la 
levadura Saccharomyces cerevisiae, ambas auxótrofas de lisina. Esta 
característica nos permitió implementar la técnica SILAC para crecer cada cepa 
en presencia de isótopos de lisina diferentes —N14 (ligera) y N15 (pesada) — y 
marcar diferencialmente las proteínas. Las células se crecieron y colectaron al 
alcanzar la etapa estacionaria, fase posmitótica de la célula asociada al modelo 
de envejecimiento cronológico. Posteriormente extrajimos las proteínas de cada 
cepa. La ventaja de utilizar SILAC es que podemos combinar las proteínas de 
cada cepa y analizarlas simultáneamente por espectrometría de masas ya que 
están marcadas diferencialmente. Así que mezclamos las proteínas en una 
proporción 1:1 para obtener cuatro muestras biológicas con las siguientes 
combinaciones: 
1) (N15) cepa silvestre - (N14) cepa mutante en Sir2 
2) (N14) cepa silvestre - (N15) cepa mutante en Sir2 
3) (N15) cepa silvestre - (N14) cepa silvestre 
4) (N15) cepa mutante en Sir2- (N14) cepa mutante en Sir2 
Las dos primeras mezclas corresponden a réplicas experimentales y las últimas 
dos a controles (Fig.6). Las mezclas de proteínas se digirieron con tripsina con 
una proporción de 1:200 a 37°C para generar fragmentos de péptidos. Una 
35 
 
fracción de la solución de péptidos (100 µg), se analizó en un espectrómetro de 
masas Velos-FT en fase inversa y fueron separados en la columna C18 y 
mediante la técnica electrospray las muestras fueron ionizadas (Yang et al., 
2011). Los péptidos de cada muestra biológica se analizaron por triplicado en el 
espectrómetro de masas, obteniendo así los datos de tres replicas técnicas para 
cada muestra biológica. 
Posteriormente utilizamos tres motores de búsqueda para la identificación de los 
péptidos: MASCOT, XTANDEM y SEQUEST. Los datos de los péptidos obtenidos 
por los tres motores de búsqueda se integraron para obtener un único juego de 
datos global por cada una las tres réplicas técnicas de cada muestra biológica. 
Iprophet reveló un total de 10471 péptidos y 4306 proteínas identificadas en el 
análisis global del proteoma de la levadura. En las condiciones control se 
identificaron 1042 y 1091 proteínas, mientras que en las experimentales se 
identificó 1064 y 1109 proteínas. En la Fig. 7 se muestra la reproducibilidad de las 
réplicas biológicas experimentales y controles con un número similar de proteínas 
en cada una de ellas. La reproducibilidad técnica entre las tres réplicas de cada 
muestra biológica fue alrededor del 50% como lo muestran los diagramas de 
Venn de la Fig. 8, en los que se observa el número de proteínas identificadas 
únicamente en cada réplica técnica; el número de proteínas que coinciden entre 
las réplicas técnicas uno y dos, dos y tres, tres y uno y el número de proteínas 
que coinciden en las tres réplicas técnicas. De igual manera se indica el 
porcentaje con respecto al número total de proteínas identificadas en las tres 
réplicas técnicas. 
36 
 
 
Figura 7. Gráfica de número de proteínas identificadas. La gráfica muestrael número 
total de proteínas identificadas en cada una de las cuatro muestras biológicas 
 
4306 
1064 1109 1042 1091 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
N
úm
er
o 
de
 p
ro
te
ín
as
 id
en
tif
ic
ad
as
 
Experimentos 
37 
 
 
Figura 8. Identificación del proteoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae. 
Los diagramas de Venn muestran la reproducibilidad que hubo entre las réplicas técnicas 
de cada uno de las cuatro muestras biológicas. Se observa el número y porcentaje de 
proteínas que se identificaron sólo en una réplica técnica, las que coinciden en dos 
réplicas técnicas y las que coinciden en las tres réplicas técnicas. 
 
 
A continuación realizamos un análisis de distribución de frecuencias para 
identificar las proteínas con mayor abundancia. El histograma de la Fig. 9 revela 
que las cuatro muestras biológicas tienen distribuciones similares, es decir no se 
evidencian diferencias notables en la abundancia de proteínas entre las réplicas 
experimentales y controles. No obstante, para identificar aquellas proteínas que 
pudieran presentar alteraciones en abundancia entre las réplicas controles y 
38 
 
experimentales, se eligió un nivel representativo de abundancia relativa contenido 
en un intervalo de -1 a +1 para utilizarlo como filtro. Con base en este criterio, de 
las 4306 proteínas identificadas al inicio se seleccionaron 1567 proteínas que 
estuvieron representadas mayoritariamente. 
 
 
 
Figura 9. Histograma de proteínas de acuerdo a su abundancia relativa. Se observa 
una distribución de abundancia relativa de proteínas similar entre las muestras 
biológicas y experimentales. Las líneas punteadas indican el intervalo de selección de 
proteínas de -1 a +1 donde se concentró la abundancia de las proteínas. 
 
A las 1567 proteínas seleccionadas anteriormente las sometimos a un análisis 
estadístico (t-student de dos colas), para comparar de los dos arreglos, el de las 
dos réplicas biológicas controles y el de las dos réplicas biológicas 
39 
 
experimentales, con la finalidad de eliminar los falsos positivos e identificar los 
péptidos con diferencias reales y estadísticamente significativas. 
Los resultados obtenidos en la prueba t-student mostraron 164 proteínas con un 
nivel de significancia menor del 5% (p < 0.05), esto es 164 proteínas presentan 
diferencias estadísticamente significativas en su abundancia entre las réplicas 
controles y las experimentales (Anexo 1). 
Para evaluar la magnitud de los cambios regulados por Sir2, primero analizamos 
la reproducibilidad entre las réplicas experimentales de esas 164 proteínas. Para 
esto, aplicamos nuevamente la prueba t-student pero a diferencia de lo anterior 
seleccionamos los productos con un nivel de significancia mayor al 5% (p > 0.05). 
De las 164 proteínas, 78 cumplieron el criterio de reproducibilidad (Anexo 2). 
Posteriormente, determinamos los cambios en la abundancia de estas 78 
proteínas en las cepas mutantes en Sir2 en comparación con las cepas silvestres. 
Como se muestra en la figura 10, la proteína SEC4 aumentó 1.6% en la mutante 
Sir2, mientras que las otras 77 proteínas disminuyeron más del 50% en la cepa 
mutante en comparación con la silvestre. 
 
Figura 10. Gráfica de variaciones en la abundancia de las proteínas en cepas 
mutantes en Sir2 en comparación con las cepas silvestres. De las 78 proteínas en las 
cepas mutantes en Sir2 en comparación con las cepas silvestres, la proteína SEC4 
mostró un ligero aumento, mientras que todas las demás disminuyeron 
considerablemente. 
 
 
40 
 
4.2 CONSERVACIÓN EVOLUTIVA DE PROTEÍNAS REGULADAS POR SIR2 
Para evaluar el grado de conservación de las 78 proteínas identificadas como 
reguladas por Sir2, se realizó un análisis bioinformático en la base de datos 
eggNOG versión 4. La conservación de estas proteínas se determinó mediante la 
alineación de secuencias de proteínas de la levadura con los ortólogos de 
diversas especies eucariontes y procariontes. Nuestros resultados mostraron que 
de las 78 proteínas reguladas por Sir2, 20 son exclusivas del reino fungi y 52 
están conservadas en mamíferos (incluyendo humanos). Solo cuatro están 
conservadas en protozoarios, y dos no pudieron ser identificadas (Anexo 3). 
 
4.3 LAS 78 PROTEÍNAS REGULADAS POR SIR2 Y EL ENVEJECIMIENTO 
CELULAR 
Para evaluar el papel que podrían desempeñar las 78 proteínas reguladas por 
Sir2 en el envejecimiento celular, se realizó un análisis bibliográfico en la base de 
datos PubMed. Por este medio identificamos a las proteínas reportadas con una 
función en algún proceso biológico asociado a los marcadores del envejecimiento 
celular: 1) inestabilidad genómica, 2) desgaste de los telómeros, 3) alteraciones 
epigenéticas, 4) desregulación de nutrientes, 5) disfunción mitocondrial, 6) muerte 
celular, 7) alteración en la comunicación intracelular, 8) agotamiento de células y 
9) pérdida de proteostasis. (López-Otín et al., 2013). Los resultados obtenidos 
muestran que de las 78 proteínas reguladas por Sir2, 38 participan en procesos 
reconocidos como marcadores del envejecimiento celular (Fig. 11). 
Varias de estas 38 proteínas participan en senescencia celular (ej. tiorredoxina2, 
superóxido dismutasa y elF2alfa); inestabilidad genómica (ej. espermidina sintasa, 
superóxido dismutasa y alcohol deshidrogenasa); alteraciones epigenéticas (ej. 
aldehído deshidrogenasa, proteína trifuncional para la biosíntesis de histidina y 
succinato deshidrogenasa); y alteraciones mitocondriales (ej. superóxido 
dismutasa y aldehído deshidrogenasa). Un número menor de proteínas participan 
en agotamiento de células madres (ej. arginina-ARNt ligasa, asparagina-ARNt 
41 
 
ligasa y superóxido dismutasa); desgaste de telómeros (ej. proteína trifuncional 
para la biosíntesis de histidina, tiorredoxina2 e IGP sintasa); desregulación de 
detección de nutrientes (ej. piruvato descarboxilasa isoenzima 3 y lisina- ARNt 
ligasa); alteraciones en la comunicación intracelular (ej. superóxido dismutasa y 
lisina-ARNt ligasa); y finalmente en la pérdida de proteostásis (ej. superóxido 
dismutasa y succinato deshidrogenasa) (Anexo 4). 
 
 
Figura 11. Gráfica de las funciones de las 78 proteínas reguladas por Sir2. De estas, 
38 participan en envejecimiento celular. En la gráfica se muestra el número de proteínas 
que participan en cada marcador biológico del envejecimiento celular de acuerdo a una 
búsqueda realizada en la base de datos PubMed. 
 
Los resultados del análisis bibliográfico muestran que las proteínas más 
estudiadas en relación a envejecimiento celular son superóxido dismutasa y 
succinato deshidrogenasa. Sin embargo, de 40 proteínas no se encontraron 
reportes relacionados con un papel en el envejecimiento celular. 
 
42 
 
4.4 REGULACIÓN POR SIRTUINAS DE LAS 78 PROTEÍNAS REGULADAS 
POR SIR2 
Con el objetivo de analizar si las 78 proteínas que nosotros encontramos 
reguladas por Sir2 ya habían sido anteriormente reportadas como proteínas 
reguladas por sirtuinas, realizamos una búsqueda en la base de datos PubMed. El 
criterio de búsqueda constó de una relación entre cada una de las 78 proteínas y 
Sir2 o cualquiera de las otras siete sirtuinas en mamíferos SIRT1-SIRT7. Los 
resultados obtenidos muestran que de las 78 proteínas reguladas por Sir2, sólo 
12 han sido reportadas previamente por sirtuinas (Fig. 12). De esas 12 proteínas, 
11 han sido reportadas como dianas de sirtuinas en mamíferos, principalmente 
por SIRT1 (ej. tiorredoxina, elF2alfa, argininosuccinato sintasa). Mientras que tres 
son reguladas por Sir2 en levadura (ej. asparagina-ARNt ligasa y tiorredoxina), de 
esas tres dos también son reguladas por alguna sirtuina en mamíferos (Anexo 5). 
 
Figura 12. Gráfica de proteínas identificadas como dianas potenciales de Sir2 
previamente reportadas como reguladas por otras sirtuinas. De las 78 proteínas que 
identificamos en estetrabajo, tres se han sido descritas previamente como blancos de 
Sir2 en levadura y once como reguladas por alguna de las sirtuinas en mamíferos a 
excepción de SIRT4, SIRT5 y SIRT7. Datos de la búsqueda en la base de datos PubMed. 
 
43 
 
Estos datos muestran que de las 78 proteínas reguladas por Sir2, solamente se 
ha estudiado la regulación de 12 proteínas por sirtuinas. Los resultados de este 
estudio sugieren que las 66 proteínas restantes identificadas con alteraciones en 
abundancia en la cepa mutante Sir2, pudieran también estar reguladas por 
sirtuinas. 
 
4.5 FUNCIÓN POTENCIAL DE LAS PROTEÍNAS REGULADAS POR SIR2 EN 
PROCESOS DE NEURODEGENERACIÓN Y COGNICIÓN 
Con el objetivo de evaluar la función potencial en procesos de neurodegeneración 
y cognición que pudieran tener las 52 proteínas que identificamos en este estudio 
como reguladas por Sir2 y que además están conservadas evolutivamente en 
mamíferos, se realizó una búsqueda en la base de datos PubMed de los reportes 
sobre estas proteínas y su relación con procesos de neurodegeneración y 
cognición. Los resultados muestran que de las 52, sólo 10 se han reportado 
previamente que participan en procesos de neurodegeneración. No se encontró 
ninguna asociada a procesos de cognición. 
Los resultados indican que la deficiencia de la proteína argininosuccinato sintasa 
(Kuhara et al., 1985), la fosforilación de elF2alfa (Chang et al., 2002; Devi y 
Ohno, 2010; Kim et al., 2010; Moreno et al., 2012) y la inactivación de 
hexoquinasa-1 (Saraiva et al., 2010), se relacionan con el desarrollo de la 
enfermedad de Alzheimer. Se encontró que la proteína tiorredoxina 2 funge como 
marcador del estrés oxidativo y la esquizofrenia (Zhang et al., 2013). La proteína 
ribosomal 40S, S12, participa en la degeneración de las células ganglionares de 
la retina (Finnegan et al., 2010). Mutaciones en los genes que codifican para la 
proteína lisina-ARNt ligasa se ha relacionado con el desarrollo de la enfermedad 
Charcot-Marie-Tooth, caracterizada por el trastorno de los nervios periféricos y 
alteraciones en las funciones motora distal y sensorial (McLaughlin et al., 2010). 
En contraste, se encontró que algunas proteínas desempeñan un papel 
neuroprotector; por ejemplo, la subunidad reguladora del proteosoma 26S, 
44 
 
RPN12, suprime la progresión de enfermedades neurodegenerativas asociadas 
con la edad (Tonoki et al., 2009). La superóxido dismutasa tiene un efecto 
antioxidante (Braidy et al., 2013; Iglesias-González et al., 2012). La proteína de 
choque térmico STI1 participa en el proceso de neuritogénesis (Roffé et al., 2010) 
y la actividad de la proteína succinato deshidrogenasa previene enfermedades 
neurodegenerativas, principalmente neuromusculares (Van Vranken et al., 2014) 
(Fig. 13). De estas 10 proteínas se ha reportado que SIRT1 regula 
arginosuccinato sintasa (Leung et al., 2012), elF-2-alfa (Ghosh et al., 2011), 
tiorredoxina 2 (Wallenborg et al., 2009), superóxido dismutasa y subunidad 
reguladora del proteosoma 26S, RPN12 que también es regulada por SIRT2 
(Dryden et al., 2003). SIRT3 regula hexoquinasa 1 (Shulga et al., 2010) y 
succinato deshidrogenasa (Finley et al., 2011). 
 
 
45 
 
 
Figura 13. Esquema de proteínas reguladas por Sir2 conservadas en mamíferos 
con funciones potenciales en procesos de neurodegeneración. De acuerdo a la 
búsqueda que se realizó en la base de datos PubMed, diez proteínas de las que 
identificamos reguladas por Sir2 participan en procesos de neurodegeneración. En los 
recuadros color naranja se muestra el nombre de las proteínas reguladas por Sir2 
conservadas en mamíferos. En los recuadros color verde se muestra el proceso de 
neurodegeneración o neuroprotección al que se asocia cada proteína. 
 
4.6 FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS CONSERVADAS EN 
MAMÍFEROS SIN ANTECEDENTES EN NEURODEGENERACIÓN Y/O 
REGULACIÓN POR SIRTUINAS QUE PARTICIPAN EN ENVEJECIMIENTO 
CELULAR 
De las 78 proteínas identificadas en este estudio, 36 están conservadas 
evolutivamente en mamíferos pero de acuerdo a la base de datos PubMed no 
existen antecedentes que las impliquen en neurodegeneración y/o que indiquen 
46 
 
que se regulan por sirtuinas. Para evaluar el papel potencial de estas 36 proteínas 
en el envejecimiento, analizamos las funciones biológicas de las mismas con el 
software Gene Ontology Consortium. Los resultados de este análisis muestran 
que las proteínas participan en diversos procesos como biosíntesis de proteínas, 
regulación de procesos catabólicos, mantenimiento del genoma mitocondrial, 
transporte de ARN, así como biogénesis y degradación de células (Anexo 6). 
Toda vez que estas funciones biológicas son indispensables para los procesos del 
sistema nervioso y el envejecimiento, es posible que las proteínas reguladas por 
Sir2 que identificamos en este estudio, que están conservadas evolutivamente en 
mamíferos y que no han sido aún estudiadas en estos contextos, desempeñen 
una función potencial en los procesos de neurodegeneración, cognición y 
envejecimiento. 
De las 36 proteínas, la espermidina sintasa que participa en la biosíntesis de 
poliamina es un candidato con alta probabilidad de participar en procesos de 
neurodegeneración y cognición. La poliamina es una molécula que afecta el 
crecimiento y la proliferación celular y se ha reportado una asociación entre el 
aumento de la biosíntesis de poliamina y la carcinogénesis, así como la muerte 
neuronal (Cervelli et al., 2014). Esto sugiere que pudiera existir una relación entre 
la espermidina sintasa con procesos neurodegenerativos. Por otra parte, la 
espermidina sintasa también participa en los procesos de alteración genómica y 
senescencia celular, que son marcadores del envejecimiento celular. Aún queda 
por entender la relación entre las alteraciones genómicas, el desarrollo de 
enfermedades cerebrales y la senescencia celular. 
 
4.7 ANÁLISIS DEL ACETILOMA DE LA LEVADURA 
Con el objetivo de identificar las proteínas acetiladas en la levadura utilizamos el 
mismo diseño experimental que se explicó con detalle en la parte anterior del 
análisis del proteoma global. Con la excepción de que una fracción de péptidos se 
utilizó para purificar el acetiloma por medio de inmunoprecipitación con el 
47 
 
anticuerpo acetil-lisina (ImmunoChemistry) diluido a una relación de 1:1000, lo 
cual se confirmó por Western Blot con el anticuerpo anti-acetil (Cell Signaling 
Technology, 9441) (Fig. 14). 
 
 
Figura 14. Western blot de proteínas acetiladas. A. Membrana del inmunoblot 
mostrado en el panel B que muestra las proteínas totales de la levadura Saccharomyces 
cerevisiae teñida con colorante Ponceau. B. Western blot del acetiloma 
inmunoprecipitado con un anticuerpo contra acetil-lisina y detectado con el otro 
anticuerpo similar. 
 
De acuerdo a los resultados de los tres motores de búsqueda integrados por el 
software Iprophet, se identificaron un total de 2670 péptidos acetilados en todas 
las muestras biológicas. En condiciones experimentales se identificaron 765 y 576 
péptidos acetilados, mientras que en condiciones control 636 y 693 péptidos 
acetilados (Fig. 15). 
Para analizar la reproducibilidad que se tuvo en las réplicas técnicas, se realizó 
una representación por medio de diagramas de Venn de los péptidos identificados 
en cada réplica técnica, los diagramas muestran que hubo una reproducibilidad en 
cuanto al número de productos identificados del 10% (Fig. 16) mostrando baja 
cobertura en la identificación de los péptidos. 
A B 
48 
 
 
 
 
 
2670 
765 
576 636 
693 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Número de 
péptidos 
acetilados 
Experimentos 
Figura 15. Número de péptidos identificados de acuerdo a Iprophet. La gráfica 
muestra el número total de péptidos identificados en las muestras biológicas. 
49 
 
 
Figura 16 Reproducibilidad de las réplicas técnicas en el análisis del