Regulacion-de-RNA-mensajeros-mediada-por-AG01-y-microRNAs-en-frijol-Phaseolus-vulgaris

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS 
 
 
 
 
Regulación de RNA mensajeros mediada por AGO1 y 
microRNAs en frijol (Phaseolus vulgaris) 
 
 
 
TESIS 
 
Para Obtener el Grado Académico de 
Doctor en Ciencias Biomédicas 
 
PRESENTA 
 
Cecilia Contreras Cubas 
 
Directores de Tesis: 
Dra. Alejandra A. Covarrubias Robles 
y 
Dr. José Luis Reyes Taboada 
 
 
 
 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
2012 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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RECONOCIMIENTOS 
 
 
AL POSGRADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO (UNAM). 
 
A LOS APOYOS RECIBIDOS POR EL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y 
TECNOLOGÍA (CONACYT) CON NÚMERO DE BECARIO 203284. 
 
A LOS MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DRA. ALEJANDRA A. COVARRUBIAS 
ROBLES, DR. JOSÉ LUIS REYES TABOADA, DRA. BERENICE GARCÍA PONCE DE 
LEÓN Y DR. MIGUEL ÁNGEL CEVALLOS GAOS. 
 
 
A LOS MIEMBROS DEL JURADO, POR LA LECTURA Y CORRECCIÓN DE LA 
PRESENTE TESIS: 
PRESIDENTE DR. FÉLIX RECILLA TARGA 
SECRETARIO DRA. ALEJANDRA A. COVARRUBIAS ROBLES 
VOCAL DRA. ADRIANA GARAY ARROYO 
VOCAL DR. ENRIQUE MERINO PÉREZ 
VOCAL DR. MARIO ALBERTO ARTEAGA-VÁZQUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
A LOS DRES. ALEJANDRA A. COVARRUBIAS ROBLES Y JOSÉ LUIS REYES 
TABOADA POR HABERME ACEPTADO COMO ALUMNA Y HABERME APOYADO 
SIEMPRE EN TODO. 
 
EN ESPECIAL AL DR. JOSÉ LUIS REYES TABOADA POR HABER SIDO UN 
EXCELENTE TUTOR (A PESAR DE TODOS LOS INCONVENIENTES 
ADMINISTRATIVOS), HABERME BRINDADO LA OPORTUNIDAD DE FORMAR 
PARTE DE SU GRUPO DE TRABAJO Y SOBRE TODO POR TODO EL INVALUABLE 
CONOCIMIENTO QUE ME BRINDO DURANTE ESTE TIEMPO. 
 
A LA DRA. ALEJANDRA A. COVARRUBIAS POR PERMITITME TRABAJAR Y 
FORMARME EN SU LABORATORIO. POR TODO EL APOYO QUE SIEMPRE ME 
BRINDO, SUS ENSEÑANZAS Y SOBRE TODO POR INCITARME A SER SIEMPRE 
CRITICA EN MI TRABAJO. 
 
A LA DRA. CATALINA ARENAS HUERTERO Y AL LIC. FERNANDO A. RABANAL 
MORA, QUIENES COMENZARON CON EL TRABAJO DE pvu-miR159a.2. EN 
ESPECIAL RECONOZCO EL TRABAJO Y ENORME DEDICACIÓN DE FERNANDO 
EN ESTE PROYECTO. 
 
A LA LIC. ROSA MARIA SOLORZANO MENIER POR TODA SU AYUDA Y 
ENSEÑANZA EN LAS TECNICAS DE DETECCION DE PROTEINAS. 
 
AL QBP GABRIEL GUILLEN SOLIS POR SU APOYO Y ENSEÑANZA PARA LA 
REALIZACIÓN DE LOS EXPERIMENTOS DE ESTABLECIMIENTO DE GENES DE 
REFERENCIA DE microRNAs EN FRIJOL, TRABAJO QUE SE LLEVA A CABO EN 
COLABORACIÓN CON EL LABORATORIO DEL DR. FEDERICO SÁNCHEZ. 
 
A TODOS LOS MIEMBROS DEL LABORATORIO POR TODO SU APOYO Y 
COMENTARIOS CRITICOS A LO LARGO DE LA REALIZACIÓN DE ESTE 
PROYECTO. 
 
 
 
 
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Resumen 
Las plantas como organismos sésiles se encuentran expuestas al constante cambio 
del medio en el que habitan. La limitación de agua, molécula vital para los procesos 
biológicos, es uno de los principales problemas con los que las plantas han tenido que 
contender durante el proceso de adaptación. Las respuestas de las plantas al déficit 
hídrico están reguladas en múltiples niveles, entre los que se encuentran la regulación 
de la expresión genética a nivel post-transcripcional. Uno de los mecanismos de 
regulación a este nivel es mediado por los microRNAs, que son RNAs pequeños de 
aproximadamente 21 nucleótidos de longitud que inhiben la traducción de RNAs 
mensajeros (RNAm) mediante complementariedad de secuencia. En plantas, este 
reconocimiento y la consecuente inhibición de la expresión del RNAm son mediados 
por la proteína Argonauta 1 (AGO1) dentro del complejo multiprotéico conocido como 
RISC (por sus siglas en inglés: RNA-induced Silencing Complex). 
En el presente trabajo se utilizaron distintos anticuerpos para realizar experimentos de 
inmunoprecipitación (IP) de la proteína AGO1 con el fin de identificar tanto a los 
microRNAs como a los RNAm blanco que participan en la respuesta al déficit hídrico 
en Phaseolus vulgaris. Además, esta estrategia se utilizó para la caracterización 
funcional de un microRNA cuya acumulación se induce durante la sequía (pvu-
miR159a.2) y que está codificado en el mismo precursor de miR159a, una situación 
única en plantas, por lo que la IP de AGO1 ha sido una herramienta complementaria 
para la caracterización de los microRNAs en P. vulgaris. 
Los microRNAs participan en un sin número de procesos biológicos: desde procesos 
de desarrollo hasta la respuesta a diferentes tipos de estrés. Por esta razón, la 
identificación y estudio de los microRNAs involucrados en la respuesta al déficit hídrico 
en P. vulgaris así como los mensajeros regulados por esta vía, es importante para el 
entendimiento de dicho mecanismo de respuesta y adaptación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Abstract 
As sessile organisms plants have to cope with the ever-changing conditions of the 
environment where they live. Water deficit is one of the main problems that plants have 
to contend with. Post-transcriptional gene regulation is a crucial regulatory mechanism 
that allows plants to modulate responses to water deficit conditions. Recently identified 
as post-transcriptional regulators, microRNAs are small RNAs of approximately 21 
nucleotides in length that regulate the stability of messenger RNAs (mRNAs) by 
sequence complementarity. In plants, microRNA regulation is mediated by the 
Argonaute 1 protein (AGO1) within a larger ribonucleoprotein complex known as RISC 
(RNA-induced Silencing Complex). 
Here we established conditions to perform AGO1 immunoprecipitation (IP) assays with 
different antibodies in order to gain more information about the microRNAs that are 
differentially expressed and their regulated targets during water deficit in Phaseolus 
vulgaris. In addition, using this strategy we confirmed that the drought-induced 
microRNA (pvu-miR159a.2), present as a second microRNA in a single precursor, is 
loaded into AGO1-containing silencing complexes. By this means, AGO1-RNA co-
immunoprecipitation assays are a helpful biochemical tool in the characterization of 
microRNAs and their targets in P. vulgaris. 
microRNAs regulate many biological processes, from development to different kinds of 
stress or disease responses. This wide range of participation makes these small RNAs 
a very interesting mechanism of regulation during water deficit conditions in crop plants 
such as P. vulgaris. The identification and study of microRNAs and their targets 
present during water deficit conditions will help to better understand the response and 
adaptation to this kind of stress. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Índice 
Abreviaturas�������������������������������...8 
I. Introducción���������������������..........����...��10 
 I.1 Domesticación de plantas para consumo humano �������������10 
 I.2 Phaseolus vulgaris�����������������������............ 11 
 I.3 Déficit hídrico�����������������������..................... 13 
 I.3.1 Adaptación a nivel molecular ������..�����������.��16 
 I.3.2 Regulación genética����������..������������.... 19 
 I.4 RNA como molécula reguladora����������������.����..22 
 I.4.1 RNAs pequeños no-codificantes en plantas ����������..��.. 23 
 I.4.1.2. siRNAs heterocromáticos (hcsiRNAs)..�������................... 25 
 I.4.1.3 trans-acting siRNAs (tasiRNAs) ������������............ 26 
 I.5 ¿Qué es un microRNA? ����������..�������������.. 28 
 I.5.1 Precursores de microRNAs �����������.�������...� 29 
 I.6 Proteínas Argonauta: AGO1���������������������..... 32 
 I.7 RNAm blancos de microRNAs en plantas ���������������.� 37 
 I.8 Estrategias para identificar microRNAs y RNAm blanco en P. vulgaris ���... 40 
II. Hipótesis ������������������������.......................... 43 
III. Objetivos Generales �������������������������... 43 
 III.1 Objetivos Particulares �������..����������������..43 
IV. Materiales y Métodos������������������������..... 44 
 IV.1 Plantas y condiciones de crecimiento���������������..�. 44 
 IV.2 Transformación transitoria de raíces peludas de frijol���������.... 45 
 IV.3 Análisis de expresión de microRNAs��������..��������.. 46 
 IV.3.1RT-PCR tallo-asa para microRNAs�����������.����. 46 
 IV.3.2 RT-qPCR para microRNAs����������������...�... 46 
 IV.3.3 Experimentos tipo northern para microRNAs����������� 47 
 IV.4 Experimentos tipo Southern �����������������..���. 48 
 IV.5 5´ RACE modificado�����������������������..... 49 
 IV. 6 Construcción de bibliotecas de RNAs pequeños para secuenciación 
 masiva Illumina��������...���������.............................. 49 
 IV. 7 Anticuerpos anti-AtAGO y anti-PvAGO1������������....��. 51 
 IV. 8 Inmunopurificación de anticuerpo anti-PvAGO����..��������. 52 
 IV.9 Inmunoprecipitaciones (IP) ���������������.������ 52 
 IV. 10 Experimentos tipo Western�������������������.�. 53 
 IV. 11 Ensayo de competencia del anticuerpo anti-PvAGO1����..����.. 53 
 IV.12 Análisis bioinformático�����������.�����������.. 53 
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 IV.13 Construcción de las bibliotecas de cDNA a partir de RNAm����...�� 53 
V. Resultados������������������������....................... 55 
 V.1 Generación de raíces aéreas sobre-expresoras de c-Myc-AtAGO1���.�. 55 
 V.1.1 RT-PCR para microRNAs utilizando oligonucelótidos con estructura 
 tallo-asa�������������...��......................................... 57 
 V.2 Anticuerpo anti-AtAGO1��������������..�����..��.... 60 
 V.3 Diseño y caracterización del anticuerpo anti-Pv-AGO1������.��...... 64 
 V.3.1 Experimento de sequía en plantas adultas de frijol de la variedad 
 Pinto villa. ��������������............................................. 73 
 V.3.2 Realización de la biblioteca de RNAs pequeños para 
secuenciación masiva por 
Illumina�����������������������.... 75 
 V.3.3 Determinación de los RNAm asociados a AGO1 mediante la 
realización de una biblioteca de RNAm blanco provenientes de 
muestras de 
IP��������������������������� 80 
 V.4 ¿pvu-miR159a.2 un segundo microRNA proveniente de pvupremiR159? 
 Utilización de la estrategia de IP de PvAGO1 para su 
comprobación��������..�����...������������.. 83 
VI. Discusión��������������������������................. 91 
VII. Conclusiones������������������������............... 100 
VIII. Perspectivas������������������������................ 101 
IX. Referencias������������������������................... 102 
XII. Anexos 
 XII.1 Tabla de oligonucleótidos utilizados 
 XII.2 Estandarización del ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) para la 
detección y cuantificación de microRNAs 
 XII.3 Artículo: “The Phaseolus vulgaris miR159a precursor encodes a second 
 differentially expressed microRNA.” 
 XII.4 Revisión: “Non-coding RNAs in the plant response to abiotic stress” 
 
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Abrevituras 
-ABA: Ácido abscísico (por sus siglas en inglés: Abscisic Acid) 
-ABRE: Elementos de Respuesta a ABA (por sus siglas en inglés: ABA Responsive 
Elements) 
-ACR: Regiones Alternativas Conservadas(por sus siglas en inglés: Alternative 
Conserved Region) 
-AGO: proteína Argonauta 
-AMP: Adenosin Monofosfato 
-ARF: Factor de Respuesta a Auxinas (por sus siglas en inglés: Auxin Response 
Factor) 
-CDK: Cinasas Dependientes de Ciclinas (por sus siglas en inglés: Cyclin-Dependent 
Kinases) 
-CMT3: Cromometil-transferasa 3 
-DCL: proteína tipo Dicer (por sus siglas en inglés: Dicer Like Protein) 
-DMS3: Deficiente en Silenciamiento en Meristemos 3 (por sus siglas en inglés: 
Defective in Meristem Silencing 3) 
-DNA: ADN (por sus siglas en inglés: Deoxyribonucleic Acid) 
-DRE: Elementos de Respuesta a Sequía (por sus siglas en inglés: Drought 
Responsive Elements) 
-DRD1: Deficiente en Metilación de DNA mediada por RNA (por sus siglas en inglés: 
Defective in RNA-Directed DNA Methylation 1) 
-DRM2: Metil-transferasa 2 de Dominios de Re arreglo (por sus siglas en inglés: 
Domains Rearranged Methyltransferase 2) 
-FT: Factores de Transcripción 
-Gly: glicina 
-hcsiRNAs: siRNAs heterocromáticos 
-HSP90: proteína de choque térmico 90 (por sus siglas en inglés: Heat-Shock Protein 
90) 
-HYL1: Hojas Hiponoclásticas 1 (por sus siglas en inglés: Hyponoclastic Leaves 1) 
-IP: ensayo de inmunoprecipitación 
-kDa: kilo Daltones 
-KYP: Kriptonita 
-LEA: proteínas Abundantes en Embriogénesis Tardía (por sus siglas en inglés: Late 
Enmbryogenesis Abundant proteins) 
-LOX: lipo-oxigenasa 
-MET1: Metil-transferasa 1 
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-microRNA*: microRNA estrella (secuencia reversa complementaria al microRNA) 
-MID: Dominio Intermedio (por sus siglas en inglés: Middle Domain) 
-ORF: Marco Abierto de Lectura (por sus siglas en inglés: Open Reading Frame) 
-PAZ: Dominio PAZ (por sus siglas en inglés: Piwi/Argonaute/Zwille) 
-PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (por sus siglas en inglés: Polymerase 
Chain Reaction) 
-PIWI: proteína PIWI (por sus siglas en inglés: P Element-induced Wimpy Testis) 
-Pol II: RNA Polimerasa II 
-Pol IV: RNA Polimerasa IV 
-Pol V: RNA Polimerasa V 
-pre-microRNA: precursor del microRNA 
-qPCR: PCR cuantitativa 
-RDM1: Requerida para la metilación de DNA 1 (por sus siglas en inglés Required for 
DNA Methylation 1) 
-RDR: RNA polimerasa dependiente de RNA (por sus siglas en inglés: RNA-
dependent RNA polymerase) 
-RISC: Complejo de Silenciamiento Inducido por RNA (por sus siglas en inglés: RNA-
Induced Silencing Complex) 
-RNA: Ácido Ribonucleico (por sus siglas en inglés: Ribonucleic Acid) 
-RNAm: RNA mensajero 
-RT: Transcripción Reversa (por sus siglas en inglés: Reverse Transcription) 
-SGS3: Supresor del Silenciamiento de Genes 3 (por sus siglas en inglés: Suppressor 
of Gene Silencing 3) 
-siRNA: RNAs pequeños de interferencia (por sus siglas en inglés: small interfering 
RNA) 
-tasiRNA: trans-acting siRNA 
-UTR: Región no codificante (por sus siglas en inglés: Untranslated Region) 
-ZF-HD: Homeodominio de Dedos de Zinc (por sus siglas en inglés: Zinc-Finger 
Homeodomain) 
 
 
 
 
 
 
 
 
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I. Introducción 
Desde la formación de la tierra hace aproximadamente 4.5 billones de años, el medio 
ambiente se encuentra en un constante cambio que se ha acelerado a un ritmo 
elevado especialmente en las últimas décadas. Los organismos se han adaptado a 
estos cambios, incluso los organismos sésiles como las plantas que han logrado 
colonizar medios adversos como desiertos, zonas con hielo y zonas con alta salinidad. 
Esta amplia capacidad de adaptación es indicativa de la enorme diversidad genética 
de los organismos, que ha dado como resultado el desarrollo ciclos de vida y órganos 
reproductivos especializados como es el caso de la flor en las angiospermas, el grupo 
más numeroso y diverso de las plantas terrestres que cuenta con cerca de 260,000 
especiesdescritas (1). El fósil de las angiospermas más antiguo data de Cretácico 
temprano entre 130 y 136 millones de años y en lo que respecta al primer hábitat de 
las angiospermas se considera que éste pudo haber sido terrestre con presencia de 
plantas maderables o acuático siendo éstas de tipo herbáceo (2). Tomando en cuenta 
el paso de un hábitat acuático a uno de tipo terrestre se considera que las plantas 
tuvieron que desarrollar una serie de mecanismos de respuesta al ambiente y de 
adaptación a las nuevas condiciones. 
Las plantas se encuentran expuestas a distintos tipos de estrés en el medio ambiente 
en el que habitan, los cuales pueden estar dados por el ataque de organismos 
patógenos u organismos herbívoros que inducen enfermedades per se, conocido 
como estrés biótico, o por el medio ambiente que las rodea en cuyo caso se conoce 
como estrés abiótico. Entre las causas que producen estrés abiótico se encuentra el 
congelamiento, salinidad, sequía, presencia de metales pesados, exposición a luz UV, 
intensidad luminosa, etc. 
 
I.1 Domesticación de plantas para consumo humano. 
Otro factor que ha influido en la adaptación de las plantas que ahora ocupan la 
superficie terrestre es la selección para su cultivo por el ser humano. La domesticación 
de las plantas de cultivo se basa en la selección de aquellas plantas silvestres que 
expresen caracteres que favorezcan diferentes propiedades ventajosas para su uso o 
consumo por el ser humano, como son su capacidad productiva o rendimiento 
(semillas, hojas o raíces), calidad nutricional, sabor, etc. Con base en esto, las plantas 
domesticadas presentan características que les permiten adaptarse mejor al medio 
ambiente y que las hacen atractivas para la agricultura, como en el caso de los 
cereales que producen semillas y frutos más grandes y resistentes, inhibición de la 
dispersión de semillas de manera que sean más fáciles de cosechar, así como un 
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crecimiento de la planta robusto pero limitado en tamaño que permita que los cultivos 
ocupen menor espacio (3,4). Registros arqueológicos sugieren que existieron varios 
centros de domesticación independientes, en donde se llevaron a cabo distintas 
prácticas agrícolas que seleccionaron plantas ventajosas para el consumo humano 
pero que disminuyeron la diversidad genética de éstas (4). Cabe resaltar que la 
pérdida de diversidad no se produjo de manera uniforme en los genomas de las 
plantas domesticadas, i.e., los genes que no influyen en el fenotipo deseado (llamados 
genes neutros) no perdieron tanta diversidad como los que influyen, ya que las plantas 
que aportaban dichos alelos contribuyeron a la progenie y los otros alelos fueron 
eliminados de las poblaciones (4). 
 
I.2 Phaseolus vulgaris 
El frijol (P. vulgaris) es una planta del orden Fabales y es de origen mesoamericano. 
Se encuentra distribuido principalmente en la zona sudamericana de los Andes, 
Centroamérica y México, en donde ha sido domesticada desde hace alrededor de 
ocho mil años principalmente para consumo humano, aunque también se consume 
abundantemente en el continente africano y asiático, ya que constituye la principal 
fuente de ingesta de proteína (5,6). 
El frijol silvestre se distribuye desde el norte de México (Chihuahua) hasta el noreste 
de Argentina (5,7). Los híbridos entre plantas silvestres y domesticadas son fértiles y no 
hay impedimento de introgresión y cambio favorable de alelos y QTLs (por sus siglas 
en inglés Quantitative Trait Loci) (5,8). Al ser domesticada, la planta de frijol presenta 
algunos cambios como son: el paso de un crecimiento indeterminado (enredadera) a 
uno determinado (arbusto), de ser sensible a fotoperiodos largos a ser insensible, y de 
presentar hojas, vainas y semillas pequeñas a grandes (5). Dos características en 
especial son atribuidas al síndrome de domesticación, i.e., aquellas características que 
distinguen a las semillas y frutos de las plantas de cultivo con respecto a las de sus 
progenitores, que en el frijol son la pérdida de dispersión y la dormancia de las 
semillas, ya que ambas características son importantes para su adaptación al medio 
en el que son cultivadas (4,9). Por lo general, el frijol presenta raíces fibrosas que en 
temperaturas subtropicales desarrollan nódulos inducidos por la simbiosis con 
bacterias capaces de fijar nitrógeno algunas semanas antes de comenzar la floración 
(5). La formación de nódulos es una característica particular de las raíces de las 
leguminosas (10). Estas estructuras surgen de la asociación simbiótica con bacterias 
fijadoras de nitrógeno de la familia Rhizobiaceae. Estas bacterias fijan nitrógeno 
atmosférico en el nódulo, produciendo amonio que es asimilado por la planta, mientras 
que la planta provee a la bacteria de compuestos de carbono producidos a partir de la 
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fotosíntesis (9). Se conoce que un grupo de genes de ambos organismos son 
requeridos para el establecimiento y funcionamiento óptimo de la relación simbiótica. 
La fijación de nitrógeno ha sido crucial en los sistemas de cultivo de frijol desde su 
domesticación, ya que un factor limitante para su crecimiento es la disponibilidad de 
nitrógeno en el suelo, el cual puede ser provisto de manera artificial como óxidos de 
nitrógeno presentes en los fertilizantes que son altamente contaminantes, ya que 
producen gases que causan efecto invernadero y contaminan suelos y agua (9). 
La mayoría de las especies del género Phaseolus son diploides con cromosomas 
pequeños y presentan 22 cromosomas (5,6). Dentro de los cultivares descritos, existen 
algunos con crecimiento determinado y otros con crecimiento indeterminado, por lo 
que se decidió clasificar los hábitos de crecimiento en cuatro clases principales 
tomando en cuenta el tipo de brote terminal (vegetativo o reproductivo), la resistencia 
del tallo (débil o fuerte), la habilidad para trepar (enredadera o arbusto) y los patrones 
de crecimiento de los frutos (solamente en la parte basal de la planta, a lo largo de la 
planta o solamente en la parte alta de la planta) (Tabla 1) (5,11). 
 
Tipo de crecimiento Descripción 
Tipo I Hábito de crecimiento determinado 
Brotes terminales reproductivos 
Tallos y ramas fuertes 
Guía terminal ausente 
Vainas distribuidas a lo largo del tallo 
Tipo II Hábito de crecimiento indeterminado 
Brotes terminales vegetativos 
Tallos y ramas fuertes 
Guía terminal ausente o intermedia 
Vainas distribuidas a lo largo del tallo 
Tipo III Hábito de crecimiento indeterminado 
Brotes terminales vegetativos 
Tallos y ramas débiles con poca o nula habilidad trepadora 
Guía terminal pequeña o larga 
Vainas distribuidas principalmente en la parte basal 
Tipo IV Hábito de crecimiento indeterminado 
Brotes terminales vegetativos 
Tallos y ramas débiles con elevada habilidad trepadora 
Guía terminal larga o muy larga 
Vainas distribuidas a lo largo del tallo y principalmente en la parte alta 
Tabla 1. Diferentes criterios de clasificación del frijol de acuerdo a su hábitat de crecimiento y su 
descripción. Tomado y modificado de 12. 
 
 
 
 
 
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Los climas moderadamente fríos favorecen el crecimiento y desarrollo de la mayoría 
de las variedades de frijol, las cuales completan su ciclo de crecimiento de la 
germinación a la maduración de la semilla en un promedio de 70 a 120 días bajo 
temperaturas promedio de 18 a 22ºC y días largos (12 horas fotoperiodo) (5). 
Debido a que en los últimos años han aumentado los periodos de sequía de manera 
drástica, es imprescindible contar con plantas de cultivo que sean resistentes a la 
limitación de agua. Es por esta razón, que una mejor caracterización de la fisiología de 
estas plantas a nivel molecular permitiría contar con marcadores moleculares que 
permitan a los agricultores realizar una mejor selección de variedades. 
Se ha registrado un aumento drástico en la temperatura global de la tierra, lo que 
ocasionaque las plantas de cultivo, que de alguna manera ya tienen bien establecidas 
sus estrategias de adaptación, se vean expuestas a condiciones adversas con más 
frecuencia, como por ejemplo, periodos de sequía más prolongados. También se debe 
de tomar en cuenta el factor del crecimiento poblacional ya que los cultivos de alto 
consumo humano como el maíz, arroz y trigo entre otros más, son día a día de mayor 
demanda. Lo anteriormente expuesto lleva a la necesidad urgente de encontrar 
plantas de cultivo que sean más tolerantes a la sequía. 
La sequía es el desastre natural más costoso causando una perdida anual de $6-$8 
mil millones de dólares a nivel mundial afectando a una parte considerable de la 
población humana (13). 
 
I.3 Déficit hídrico 
Uno de los tipos de estrés abiótico más importante es el déficit hídrico, el cual implica 
una disminución en el potencial hídrico en la planta, ya sea por salinidad en el suelo, 
congelamiento o sequía. Ante dicho tipo de estrés, las plantas han desarrollado 
mecanismos de percepción, señalización, respuesta y adaptación (Figura 1). 
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*Regulación del cerrado 
y apertura de estomas 
 
*Síntesis de osmolitos 
 
* Sistemas de transporte 
para desintoxicación de 
iones 
Respuestas 
fisiológicas Reconocimiento 
del estrés 
Transducción 
 de señal 
 
Proteínas 
de 
respuesta 
*Hidrofilinas 
*LEAs 
*Chaperonas 
Respuestas 
metabólicas *Síntesis y/o liberación de ABA 
*Regulación del cerrado
y apertura de estomas 
*Síntesis de osmolitos
* Sistemas de transporte 
para desintoxicación de 
iones
Déficit Hídrico 
 
Figura 1. Respuestas al déficit hídrico. Respuesta y adaptación de la planta al déficit hídrico provocado 
por deshidratación, congelamiento y salinidad. La planta responde a distintos niveles desde el fisiológico, 
metabólico y hasta el molecular. 
 
El tipo de características que se toman en cuenta para medir la resistencia de una 
planta de cultivo al déficit hídrico son: la eficiencia de uso del agua (cantidad de 
materia seca o producción en la cosecha por unidad de agua utilizada), la morfología y 
anatomía de las raíces y la capacidad de evitar la concentración elevada de osmolitos 
al mantener el flujo de agua a nivel celular. 
El gran éxito de las plantas ha sido el desarrollo de estructuras que les permiten 
contender con las adversidades del medio ambiente y también favorecer la dispersión 
de su material genético mediante la formación de estructuras florales, para la 
dispersión de polen y la formación de semillas. Durante la etapa final de maduración 
de la semilla se pierde cerca del 90% de agua, alcanzándose de esta manera la 
dormancia en donde la actividad metabólica es casi nula o muy escasa (14). Es 
importante hacer notar que durante las distintas etapas de desarrollo, el embrión no 
puede contender siempre con la desecación; la tolerancia se adquiere antes de que la 
desecación ocurra y persiste hasta el proceso de germinación de la semilla (14). 
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Una vez que la semilla ha germinado, bajo condiciones de déficit hídrico, la planta 
debe de mantener el contenido de agua y lo hace acumulando solutos en el 
citoplasma. Estos solutos, al encontrarse en altas concentraciones, no deben ser 
tóxicos ni interferir con el metabolismo de la planta, ni con la estructuración y 
funcionamiento de las proteínas y demás moléculas. Entre los solutos u osmolitos de 
tipo orgánico (osmoprotectores) se encuentran los compuestos que contienen 
nitrógeno, (prolina, glicina, poliaminas), compuestos hidroxilo (sacarosa, polioles y 
oligosacáridos), así como iones inorgánicos tales como Na+, Cl- y SO42- (15,16). Sin 
embargo, osmolitos como los iones inorgánicos en altas concentraciones son tóxicos. 
Algunos de estos compuestos, como la sacarosa y los polioles, sirven también para 
contender con el estrés oxidativo que tiene lugar durante el déficit hídrico. 
Se ha reportado que durante el estrés osmótico producido por el déficit hídrico, se 
afectan los programas de desarrollo de la planta; por ejemplo, disminuyen de manera 
considerable el crecimiento, se abortan ciertas estructuras como flores y frutos, y se 
afecta la calidad de semillas que generalmente son más pequeñas (17). En condiciones 
de déficit hídrico hay una inhibición en el crecimiento de hojas y tallos, mientras que 
las raíces continúan alargándose en busca de agua (18). La interrupción del 
crecimiento de la parte aérea se puede llegar a considerar como una estrategia para la 
retención de carbohidratos para el mantenimiento del metabolismo y como fuente de 
energía para recuperarse mejor una vez que termina el estrés (19). Otra de las 
actividades metabólicas de las plantas que disminuye en este tipo de estrés es la 
fotosíntesis, lo cual ocasiona el aborto de estructuras reproductivas tales como los 
botones florales debido a que sin los productos fotosintéticos el almidón es consumido 
y la glucosa desaparece de los ovarios y estructuras protectoras llevando a la muerte 
celular y consecuentemente al aborto de los botones florales (17). 
Las plantas regulan las respuestas al medio ambiente mediante la acción de 
hormonas tales como el ácido abscísico (ABA) el cual juega un papel central en el 
desarrollo, dormancia y germinación de la semilla, así como en la respuesta y 
adaptación al déficit hídrico (19,20). 
Las plantas muestran una gran plasticidad a la respuesta ante el medio ambiente, de 
tal manera que su crecimiento, desarrollo y producción se ven regulados en respuesta 
a éste. La actividad de los meristemos, mediante divisiones celulares y el alargamiento 
celular, determina la tasa de crecimiento de la planta. Se ha propuesto que la 
regulación del crecimiento y desarrollo durante el déficit hídrico es controlado por la 
actividad de cinasas dependientes de ciclinas (CDKs por sus siglas en inglés: Cyclin-
Dependent Kinases), las cuales disminuyen su actividad de manera considerable 
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durante el estrés, además de que existe evidencia de que el ABA induce la expresión 
de ICK1, un inhibidor de CDKs (21). 
Una de las respuestas de la planta al déficit hídrico a nivel fisiológico es el cerrado de 
estomas para evitar la perdida de agua por transpiración. Se conoce que dicho 
mecanismo es regulado por el ABA que actúa como molécula señalizadora al inducir 
el aumento en los niveles de calcio citosólico en las células guarda de los estomas, 
regulando de esta manera el flujo iónico y reduciendo la turgencia en las células 
guarda, lo que tiene como consecuencia el cerrado de los estomas (20,22). 
El estudio de los genes que responden al déficit hídrico es una estrategia poderosa 
que puede complementar eficazmente el conocimiento sobre la fisiología de la planta 
en estas condiciones de estrés y, de esta manera, permite profundizar sobre el 
entendimiento de cómo la planta responde a la limitación del agua, lo cual a su vez 
presenta un gran potencial que podría contribuir al mejoramiento de plantas de cultivo 
para consumo humano. Es por esta razón que la respuesta de las plantas a 
condiciones de estrés abiótico se ha abordado con diferentes enfoques que han 
involucrado desde la identificación y caracterización de genes cuyos transcritos 
aumentan o disminuyen bajo estas condiciones, la caracterización de mutantes con 
fenotipos de tolerancia o sensibilidad a este tipo de estrés, el análisis de plantas que 
sobre-expresan proteínas de interés hasta el estudio a gran escala utilizando las 
tecnologías masivas tales como la espectrometría de masas (proteómica), la 
hibridación DNA-RNA en microarreglos con múltiples genes o genomas completos 
(transcriptomica), secuenciación masiva, etc. Así mismo, se han incluido metodologías 
de bioinformática (biología de sistemas) que permiten integrar las distintas vías de 
respuesta al déficit hídrico, las cuales involucran grandes redes de señalización y 
regulación genética, lo que podríaayudar a una mejor comprensión de la respuesta de 
las plantas a diferentes condiciones de estrés. 
 
I.3.1 Adaptación a nivel molecular 
La caracterización de plantas transgénicas y mutantes ha permitido avanzar en el 
entendimiento de la función de los genes que participan en la respuesta al déficit 
hídrico. La integración de este conocimiento al que se obtenga de los caracteres que 
se han seleccionados durante la domesticación de las plantas de cultivo permitirá 
identificar aquellos genes que tras diferentes procesos de selección a lo largo de los 
años han resultado ventajosos para tolerar condiciones diversas de sequía en 
diferentes ambientes. 
Existen varios métodos para estudiar los genes que participan en la tolerancia a la 
deshidratación desde el estudio de plantas transgénicas o mutantes en organismos 
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que se utilizan como modelo, hasta el análisis de los efectos que causa dicho estrés 
en el campo en plantas de cultivo (14). Este último acercamiento al estudio de la 
resistencia a la sequía permite analizar en mayor detalle aquellas plantas que por 
selección humana son más o menos tolerantes y la comparación de éstas permite 
conocer los mecanismos tanto moleculares como fisiológicos que tienen lugar en 
aquellas plantas que interaccionan directamente con el medio ambiente y no se 
encuentran en condiciones de crecimiento controladas, como sucede con las plantas 
modelo. 
El análisis de la expresión global de genes mediante microarreglos, así como otros 
diversos estudios de plantas sometidas a déficit hídrico por distintos tipos de estrés 
(salinidad, deshidratación y congelamiento) muestran que existen genes de respuesta 
comunes a los tres tipos de estrés, que de manera general se pueden agrupar en 
genes cuya expresión responde a ABA y otro grupo cuya expresión es ABA-
independiente (23-25). Sin embargo, aunque su descripción inicial así lo consideró, 
estas vías no necesariamente son independientes, ya que ahora sabemos que se 
encuentran interconectadas. Ese es también el caso de los genes que inicialmente se 
habían clasificados como de respuesta a frío, a salinidad o a estrés osmótico, y que en 
realidad pueden expresarse de manera común dependiendo de las condiciones 
particulares de aplicación de las condiciones de estrés. De ahí que se sugiera que 
esta respuesta es una respuesta común, resultado de una red constituida por múltiples 
y diversas interacciones entre los productos de estos genes (26). En un análisis 
detallado de los diferentes estudios de microarreglos utilizando RNAs de plantas de 
Arabidopsis thaliana que fueron crecidas bajo déficit hídrico, se observó que 
solamente un grupo pequeño de genes se ve modificado en los tres tipos de estrés. 
En este estudio se detectaron 27 genes que se inducen y 1 que se reprime, los cuales 
se clasificaron en seis categorías dependiendo de sus funciones en: metabolismo, 
transporte, señalización, transcripción, proteínas hidrofílicas y de función desconocida 
(27). Aún y cuando es difícil encontrar vías de respuesta y adaptación en común en los 
distintos tipos de estrés aplicados, este tipo de estudios pueden dar un primer 
acercamiento sobre el tipo de genes involucrados en esta respuesta. En general, se 
observa que existen dos tipos de genes de respuesta, de manera general; los que 
están involucrados en la señalización del estímulo ambiental y en la regulación, o 
genes ‘reguladores’, y los genes ‘funcionales’ responsables de los cambios 
metabólicos o fisiológicos que finalmente permiten la adaptación al déficit hídrico. 
Entre los genes que responden de forma común a estas tres condiciones de déficit 
hídrico se encuentran miembros de los factores de transcripción DREB (por sus siglas 
en inglés: Dehydration Responsive Element Binding proteins), los ERF (por sus siglas 
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en inglés: Ethylene Response Factor), las proteínas con dedos de zinc, los WRKY, los 
MYB, así como miembros de la familia NAC [por sus siglas en inglés: NAM(no apical 
meristem), ATAF, CUC (cup-shaped cotyledon)] (26). Otros de los transcritos que se 
acumulan de manera abundante durante el déficit hídrico son los que codifican las 
proteínas LEA (por sus siglas en inglés: Late-Embryogenesis Abundant Proteins) que 
son proteínas de bajo peso molecular (9-35 kDa) que se acumulan de manera 
abundante durante la etapa de desecación del embrión en la semilla (28,29). Estas 
proteínas pertenecen al grupo de las hidrofilinas que son proteínas que se 
caracterizan por tener varios residuos de aminoácidos hidrofílicos como Gly (contenido 
mayor a 6%), un índice de hidrofilicidad mayor a 1 y por ser proteínas intrínsecamente 
desordenadas (30,31). En varias especies de plantas se ha observado que durante el 
déficit hídrico ocurre la acumulación de estas proteínas en tejido vegetativo y varios 
estudios evidencian que estas proteínas protegen a otras manteniendo su estructura, 
conformación y función durante la escasez de agua (32-35). Algunos miembros de los 
distintos grupos de LEAs se inducen por ABA, ya que presentan elementos de 
respuesta a ABA (ABRE por sus siglas en inglés: ABA-responsive element) en sus 
promotores como se observó por primera vez en el grupo LEA 2 en Oryza sativa (31,36). 
No obstante, como sucede con la mayoría de los genes de respuesta y adaptación al 
déficit hídrico, la expresión de algunas proteínas LEA es dual, i.e., su expresión en 
respuesta al estrés es mediada por más de una vía que puede o no ser dependiente 
de ABA (31). En este aspecto, se han tratado de caracterizar los distintos elementos de 
regulación en cis y en trans que inducen la expresión de los genes de respuesta a 
déficit hídrico, ya sea dependientes o independientes de ABA. Dentro de los 
elementos cis, se puede mencionar a las regiones promotoras ABRE que son 
dependientes de ABA y a los elementos de respuesta a deshidratación (DRE por sus 
siglas en inglés: Dehydration-Responsive Element) que son independientes de ABA 
(14,26). Los elementos ABRE contienen un motivo palindrómico CACGTG con una caja 
GACGT como componente principal (14). Por su parte los DRE contiene un repetido de 
9 pb (TACCGACAT) y la respuesta a condiciones de deshidratación, salinidad y 
congelamiento ocurre a corto plazo (14). Se han identificado varios factores de 
transcripción (FTs) que se unen a las secuencias promotoras ABRE y DRE, y se ha 
visto que la transcripción de estos FTs también se induce por el déficit hídrico, como 
es el caso de factores de unión a secuencias ABRE (ABF por sus siglas en inglés: 
ABRE Binding Factors) cuya expresión es inducida por ABA pero sus patrones de 
inducción varían entre los distintos tipos de ABFs (37). En general, los FTs que se unen 
a las regiones promotoras ABRE contienen un dominio de unión a DNA con estructura 
de motivo básico con cierre de leucina (bZIP por sus siglas en inglés: basic 
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domain/Leu zipper) y tres regiones conservadas en el extremo N terminal (38). Sin 
embargo, también existen genes de respuesta a sequía y ABA como el gen rd22 en 
Arabidopsis que contiene sitios de reconocimiento a FTs tipo hélice-asa-hélice básicos 
(bHLH por sus siglas en inglés: Basic Helix-Loop-Helix), así como a proteínas 
relacionadas a MYB que funcionan como activadores transcripcionales bajo 
condiciones de sequía o por tratamientos con ABA (38). 
Por otro lado, los FTs que responden a sequía de manera ABA-independiente son los 
CBF/DREB (por sus siglas en inglés: Cold-Binding Factor/Dehydration Responsive 
Element Binding proteins) y los tipo NAC y ZF-HD (por sus siglas en inglés: Zinc-
Finger Homeodomain) (39). 
Estudios en mutantes insensibles a ABA (abi) y deficientes de ABA (aba) han 
permitido dilucidar algunas de las vías de respuesta. En general las vías de respuesta 
ABA-dependientes e –independientes no se pueden ver como dos vías de respuesta 
totalmente excluyentes ya que existe una retroalimentacióne intercomunicación entre 
los distintos componentes de las cascadas de señalización. Esto se ha determinado ya 
que varios genes que se inducen por frío y sequía contienen en sus regiones 
promotoras tanto elementos DRE/CRT (C-repeat element) como ABRE. Un ejemplo de 
retroalimentación entre las dos vías es el gen rd29A de Arabidopsis que se induce en 
condiciones de deshidratación, salinidad, frío y tratamiento con ABA. Dicho gen 
presenta una región promotora de 120 pb en la que se encuentran secuencias 
promotoras DRE/CRT y ABRE. Mediante ensayos de deleción de las secuencias 
promotoras, así como de ensayos de retardo de DNA se observó que existe una 
interdependencia entre los elementos DRE y ABRE, ya que los FTs DREB1s/CBFs y 
DREB2s se unen primero a la región promotora DRE y ésto permite que el motivo 
central DRE junto con los FTs ABREBs/ABFs se puedan unir a la región promotora 
ABRE, induciéndose de esta manera la expresión del gen rd29A (40). 
 
I.3.2 Regulación genética. 
La regulación genética en los eucariontes se lleva a cabo a distintos niveles. En 
general se conocen los siguientes niveles de regulación: i) transcripcional, ii) post-
trancripcional, iii) traduccional y iv) post-traduccional (Figura 2). 
 
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Figura 2. Regulación genética. La regulación genética se lleva a cabo a distintos niveles, los cuales se 
encuentran finamente regulados. Entre los distintos niveles de regulación se encuentran el transcripcional, 
post-transcripcional, traduccional y post-traduccional. Tomado y modificado de 41. 
 
Dentro de la regulación a nivel transcripcional se encuentran los elementos cis, como 
las secuencias promotoras, y los elementos trans, como los FT, activadores o 
represores. También existe la regulación a nivel epigenético, es decir, aquellas 
modificaciones en el DNA, que no ocurren a nivel de secuencia, o bien en proteínas 
que interactúan con el DNA que afectan su estructura o accesibilidad y que producen 
cambios que son heredables. En este aspecto, las plantas se caracterizan por tener 
DNA metilado, es decir, la presencia de 5-metil citosinas (citosina con un grupo metilo 
en el quinto carbono; m5C); así como, por la presencia de enzimas encargadas de 
dicha metilación (42). Entre estas enzimas se encuentra la metiltransferasa de 
mantenimiento MET1 (Methyltransferase 1) que metila sitios CG durante la replicación 
y post-replicación de DNA (43). Por otra parte, la cromometilasa CMT3 
(Chromometyltransferase 3) es la enzima que metila sitios CHG y su actividad también 
es de mantenimiento (44). Se conoce que interactúa con la metiltransferasa de histonas 
Kriptonita (KYP por sus siglas en inglés: KRYPTONYTE) la cual se une a las m5C 
metiladas previamente por CMT3 y metila la lisina 9 de la histona H3 (H3K9) que se 
encuentra en ese sitio (45). Se ha observado que durante el déficit hídrico se modifica 
el estado de la cromatina, principalmente por cambios en los residuos de ciertos 
aminoácidos de algunas histonas (46). 
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Así de esta manera, tanto la metilación del DNA como las diferentes modificaciones de 
residuos de histonas (e.g., metilación, acetilación) se encuentran coordinadas y 
regulan el estado de la cromatina, al evitar o permitir la transcripción de los distintos 
genes. Esta regulación a nivel transcripcional es altamente compleja, ya que en 
plantas se ha asociado a la acción de RNAs pequeños de interferencia (siRNAs, por 
sus siglas en inglés: small interfering RNAs) que provienen de regiones altamente 
repetitivas así como de elementos transponibles. Por otro lado, la compleja red de 
señalización a nivel de secuencias promotoras y FTs regulan igualmente la 
transcripción de manera fina (47). 
La regulación a nivel post-transcripcional también se lleva a cabo con la participación 
de secuencias en el RNA reconocidas por ciertas proteínas que modulan su vida 
media o su procesamiento a un RNA mensajero maduro. Comúnmente las secuencias 
que participan en este tipo de regulación se encuentran en los extremos 5´ y 3´ no 
traducidos (5´ y/o 3´ UTR por sus siglas en inglés: Untranslated Regions), y en 
ocasiones en las secuencias traducibles o con marco de lectura (ORF por sus siglas 
en inglés: Open Reading Frame). La regulación del procesamiento de los intrones de 
los RNAm, i.e., el “splicing”, permite que un transcrito determinado se encuentre en su 
forma madura y se traduzca en mayor o menor cantidad. 
Ahora sabemos que otro mecanismo que regula la vida media de un RNAm o su 
traducción se da a través de RNAs pequeños no codificantes como son los 
microRNAs, tema central de este trabajo de tesis. Este grupo de moléculas de RNA 
son parte de un conjunto que se caracteriza, entre otras cosas, por no ser traducidos a 
proteína. Ejemplos de este tipo de moléculas de RNAs son los microRNAs, tRNAs 
(RNAs de transferencia), rRNAs (RNAs ribosomales), snoRNA (RNAs pequeños 
nucleolares), snRNAs (RNAs pequeños nucleares) y lncRNAs (RNAs no-codificantes 
largos). 
A nivel de traducción puede existir otro nivel de regulación. En este caso, secuencias 
en el RNAm permiten la unión de factores de inicio y elongación de la traducción y de 
otras proteínas que favorecen o no el inicio o la elongación de este proceso. 
Adicionalmente, la traducción se puede modular a diferentes niveles a través de 
distintas moléculas, tanto de RNAs (ribosomales y de transferencia) como de 
proteínas necesarias para el ensamblaje adecuado de los ribosomas. 
Finalmente, cabe mencionar aunque sea brevemente, la regulación a nivel pos-
traduccional, la cual se da mediante modificaciones de las proteínas por adiciones de 
grupos químicos en residuos de amino ácidos específicos, catalizadas por enzimas 
especializadas, como lo son las fosforilaciones (Tyr, Ser y Thr), la ubiquitinación, la 
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metilación, la acetilación, glicosilación, etc (48). Estas modificaciones modulan la 
actividad de una proteína determinada, ya sea positiva o negativamente. 
Con todo lo anteriormente mencionado, es importante hacer énfasis en el cambio 
conceptual sobre la regulación de la expresión genética; ya que, este proceso es 
capaz de modular la expresión a diferentes niveles por mecanismos cada vez más 
sofisticados, que llegan a regular la producción de más de una proteína a partir del 
mismo gen y, por otro lado, llamar la atención sobre el hecho de que un gen no 
necesariamente tendrá como producto final una proteína, sino que puede generar una 
molécula de RNA que no será traducida y, que a su vez, deja de ser sólo un 
intermediario pues es capaz de regular la expresión de otros genes. 
 
I.4.1 RNA como molécula reguladora 
En los últimos años diversos tipos de moléculas de RNA han tomado importancia 
como moléculas reguladoras, ya que anteriormente no se consideraba más que un 
intermediario entre el DNA y el producto final, la proteína. Inicialmente el dogma 
central de la biología molecular, planteado en 1958 por Francis Crick, consideró el 
paso secuencial de información por transferencia de residuo por residuo y consideraba 
al RNAm como intermediario (49). Esta consideración no siempre permitía explicar 
muchos de los procesos celulares. No obstante, el llamado “junk” DNA o la materia 
obscura del genoma comenzó a tener importancia cuando se descubrió que el RNA no 
solamente sirve como intermediario sino que es una molécula reguladora per se, como 
sucedió con los experimentos de Howard Temin en los que se encontró que el RNA 
viralservía como templado para la síntesis de DNA (50). Este descubrimiento llevó a un 
replanteamiento incluso del dogma central en el que se contaba ya con evidencia de 
transferencia de RNA a DNA (51). 
Anteriormente se conocía que la molécula de RNA presentaba actividad reguladora 
como en el caso de los ‘riboswitches’ y ribozimas; sin embargo, no se consideraba una 
molécula importante en la regulación fina de procesos celulares. De manera 
interesante, se encontró que un alto porcentaje de los genomas eucariontes se 
transcriben; así por ejemplo, en humanos y roedores se llegan a transcribir hasta el 
93% de los nucleótidos de los respectivos genomas si se consideran diferentes tipos 
celulares (52). Este alto porcentaje de transcripción no coincidía con el número de 
proteínas predichas, por lo que se consideró que el RNA podría estar llevando a cabo 
funciones en la célula, adicionales a las exclusivamente codificantes, i.e., funciones 
regulatorias. De esta manera se encontró que RNAs de distintos tamaños participan 
en la regulación de procesos celulares pero también en procesos de respuesta y 
adaptación de los organismos. 
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Plantas crecidas en condiciones de déficit hídrico muestran un cambio evidente en el 
metabolismo del RNA que se ha estudiado mediante el análisis de mutantes, 
principalmente en la planta modelo A. thaliana. Existen algunos ejemplos de proteínas 
con dominios de unión a RNA que se sobre-expresan o participan en la tolerancia a la 
sequía y salinidad como es el caso de FIERY2 que es una proteína con dos motivos 
de unión a RNA de doble hebra y cuya mutante (fry2) presenta tolerancia a estrés 
salino e insensibilidad a ABA durante la germinación (53). Por otro lado, recientemente 
se caracterizó la mutante fry1, la cual resulta ser más tolerante a la sequía y presenta 
cambios en la arquitectura de la raíz. FIERY1 codifica una enzima con actividad de 3´ 
(2´) 5´-bifosfato nucleótido fosfatasa, la cual convierte al 3´-poliadenosine 5-fosfato 
(PAP) en adenosin monofosfato (AMP) y fosfato inorgánico (Pi). Se conoce que PAP 
inhibe a las enzimas exo-ribonucleasas XRN, incluyendo a las encargadas de la 
degradación de microRNAs, y cuyas mutantes comparten el fenotipo de fry1 (54,55). La 
expresión de FIERY1 es específica del cilindro vascular y de los meristemos de la raíz. 
El hecho de que es posible complementar los fenotipos de las mutantes fry1 y de la 
triple mutante xrn a través de ensayos con injertos provenientes de plantas silvestres 
ha llevado a la propuesta de que la tolerancia a la sequía en estas mutantes no se 
debe al cambio en la arquitectura de la raíz sino que se confiere primero en la roseta, 
en tanto que el cambio de morfología de las raíces se complementa por una 
regulación a larga distancia (56). Otra mutante con hipersensibilidad a ABA durante la 
germinación es HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1), la cual es una de las proteínas con 
motivos de unión a RNA de doble hebra que participa en la biogénesis de microRNAs 
y que se describirá más adelante en detalle. Los ejemplos anteriormente expuestos 
muestran la existencia de una regulación que, aún y cuando es mediada por proteínas, 
involucra a la molécula del RNA que podría estar adquiriendo mayor estabilidad 
mediante su unión a proteínas o servir de puente en algún complejo ribonucleoprotéico 
que puede a su vez participar en la regulación genética. 
Sin embargo, la regulación genética mediada por RNAs no-codificantes aporta un 
nuevo nivel de regulación, tanto transcripcional como post-transcripcional, y que no 
sólo es crítico a lo largo del desarrollo de la planta, sino que también es importante 
durante la adaptación y respuesta ante diferentes tipos de estrés. 
 
I.4.1 RNAs pequeños no-codificantes en plantas 
Los organismos eucariontes presentan una organización celular que permite una 
regulación genética en distintos organelos. Las plantas cuentan con mecanismos de 
regulación genética que les permite responder de manera rápida a los distintos 
cambios del ambiente en el que habitan. A diferencia de los animales, las plantas 
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presentan una mayor diversidad de RNAs pequeños no codificantes que actúan a 
distintos niveles de regulación genética, entre los que se encuentran los RNAs 
pequeños interferentes (siRNAs), microRNAs y trans-acting siRNAs (tasiRNAs). Estos 
RNAs pequeños presentan una serie de características en común tales como la 
participación de enzimas RNasa tipo III que participan en su procesamiento. En 
general, la biogénesis de los RNAs pequeños no-codificantes comienza con transcritos 
producidos por una RNA polimerasa, Pol II en el caso de los microRNAs y Pol IV en el 
caso de los siRNAs (57,58). Posteriormente, son procesados por enzimas conocidas 
como proteínas tipo Dicer, llamadas DCL (Dicer-like proteins, en inglés), las cuales 
presentan la peculiaridad de dejar extremos 3´ con dos nucleótidos sobresalientes (59) 
que, posteriormente, reciben la adición de un grupo metilo en el extremo 3´ (Figura 3). 
 
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Figura 3. Distintas vías de biogénesis de RNAs pequeños en plantas. Las vías de a) hcsiRNAs y b) 
microRNAs y tasiRNAs en plantas presentan características en común tales como las proteínas DCL y 
AGO. Sin embargo, la enorme plasticisidad en plantas permite la especialización de las vías a través de 
las distintas proteínas accesorias que son espacio y tiempo específicas. Existe de igual manera una 
intercomunicación entre las vías lo cual aumenta el nivel de complejidad y fineza de la regulación por 
RNAs pequeños. Tomada y modificada de 60. 
 
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El genoma de la planta modelo A. thaliana contiene cuatro proteínas DCL (DCL 1-4) 
que participan de manera especializada en las diferentes vías de RNAs pequeños, las 
cuales se detallarán más adelante. 
La presencia de un grupo metilo en el extremo 3´ es una característica común a los 
diferentes RNAs pequeños, el cual es agregado por la proteína metil-transferasa 
HEN1 (Hua Enhancer 1), después de que el RNA pequeño ha sido procesado y se 
encuentra en forma de dúplex. La secuencia complementaria reversa al microRNA o al 
siRNA que se encuentra en el dúplex se denomina microRNA o siRNA estrella y se 
anota con un asterisco superíndice (microRNA/microRNA* y siRNA/siRNA*) (61). Los 
RNAs pequeños en su forma madura se caracterizan por tener dos nucleótidos 
sobresalientes, un grupo fosfato en el extremo 5´y un grupo OH en el extremo 3´ (62). 
Las reacciones anteriormente mencionadas se llevan a cabo en el núcleo y, 
posteriormente, en el caso de los microRNAs y tasiRNAs, éstos son exportados al 
citoplasma mediante la proteína HASTY la cual es el homólogo en plantas de la 
proteína Exportina 5 de animales; mientras que los siRNAs permanecen en el núcleo 
en donde llevan a cabo su función de represión transcripcional modulando la 
metilación de DNA y/o la modificación de las histonas (63-65). 
Otra de las características en común de los RNAs pequeños es su incorporación en 
proteínas efectoras Argonauta (AGO), formando complejos ribonucleoproteícos para 
llevar a cabo su función (66). Aunque al principio no se tomaron en cuenta las 
diferencias entre cada uno de los distintos RNAs pequeños en plantas, características 
tan sutiles como el tamaño, la estructura de la molécula de RNA de la que provienen, 
así como las distintas proteínas que participan en su biogénesis son de suma 
importancia, de tal manera que se han establecido criterios que toman en cuenta estas 
características para definir cada uno de los diferentes tipos de RNAs pequeños. 
 
I.4.1.1 siRNAs heterocromáticos (hcsiRNAs). 
LossiRNAs son los RNAs pequeños más abundantes en las plantas. Dentro de los 
siRNAs endógenos que se han descrito en Arabidopsis, existen por lo menos tres 
clases de siRNAs que varían en origen y tamaño: los siRNAs de 21 nts que son 
inducidos por ataque por patógenos, los siRNAs de 21 y 24 nts que se producen a 
partir de regiones repetidas y de elementos transponibles y que actúan en cis para 
silenciar estas regiones a nivel transcripcional, y los tasiRNAs de 21 nts que son 
dependientes de la vía de microRNAs y de los que se hablará detalladamente más 
adelante. 
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En general, los siRNAs regulan principalmente la transcripción induciendo y 
manteniendo la metilación de DNA y marcas en histonas de heterocromatina, por lo 
que se denominan hcsiRNAs. 
En general, la metilación de DNA mediada por RNA (RdDM por sus siglas en inglés: 
RNA-dependent DNA Methylation) comienza con la transcripción por la Pol IV de una 
zona altamente repetitiva o rica en transposones, de la que se genera un transcrito. 
Posteriormente, la RNA polimerasa dependiente de RNA (RDR2 por sus siglas en 
inglés: RNA-dependent RNA Polymerase 2) sintetiza la hebra complementaria 
generándose de esta manera RNA de doble hebra que es sustrato de DCL3, la cual 
se encarga de producir los hcsiRNAs de 24 nts de longitud (67,68). Los hcsiRNAs son 
incorporados en AGO4, AGO6 ó AGO9, dependiendo del tejido y etapa de desarrollo 
de la planta, formándose un complejo de silenciamiento (65,69-71). De manera 
independiente a Pol IV y asistida por el complejo DDR, compuesto por DRD1 (por sus 
siglas en inglés Defective in RNA-Directed DNA Methylation1), DMS3 (Defective in 
Meristem Silencing 3) y RDM1 (por sus siglas en inglés: Required for DNA Methylation 
1 ), Pol V genera transcritos in cis que son reconocidos por el hcsiRNA, incorporado 
en el complejo de silenciamiento, y evento que induce la metilación de novo del DNA 
por un mecanismo aún desconocido (72) (Figura 3a). La enzima encargada de la 
metilación de novo es la metiltransferasa DRM2 (por sus siglas en inglés: Domains 
Rearranged Methyltransferase 2), la cual probablemente es reclutada por el complejo 
DDR ya que se ha encontrado que RDM1 interactúa tanto con AGO4 como con DRM2 
(73). La metilación de DNA mediada por hcsiRNAs se puede dar en todos los contextos 
de secuencias metilables, i. e., CG, CHG y CHH (en donde H representa cualquier 
nucleótido excepto G). En A. thaliana aproximadamente el 30% de la metilación de 
DNA es mediado por hcsiRNAs (74,75). Asimismo, se conoce que el complejo de 
silenciamiento mediado por hcsiRNAs recluta también enzimas remodeladoras de la 
cromatina como la desacetilasa de histonas HDAC6 entre otras más (76). 
 
I.4.1.2 trans-acting siRNAs (tasiRNAs) 
Vázquez y colegas encontraron otro tipo de siRNAs cuya producción es dependiente 
de proteínas de la vía de microRNAs pero también de RDR6 (por sus siglas en inglés: 
RNA-dependent RNA polymerase 6) y SGS3 (por sus siglas en inglés Suppressor of 
Gene Silencing 3) (77). Lo que hace interesantes a estos siRNAs a diferencia de los 
hcsiRNAs o de los inducidos por infección viral, es que regulan RNAm blanco en trans, 
por lo que fueron denominados trans acting siRNAs (tasiRNAs); generalmente, los 
blancos son varios miembros de una familia génica (77). Otra característica especial es 
que dependen de la vía de los microRNAs por lo que su producción involucra dos vías 
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de biogénesis que se encuentran intercomunicadas y que dan un nivel más de 
complejidad a la regulación genética a través de RNAs pequeños en las plantas (78). 
Básicamente, la vía consiste en el corte de un RNAm blanco no codificante 
denominado TAS por un microRNA, mediado por una proteína AGO y una vez que el 
RNAm TAS ha sido cortado, éste sirve de sustrato para una RNA polimerasa 
dependiente de RNA (RDR6), la cual amplifica RNA de doble hebra que a su vez es 
sustrato para la proteína DCL4 que genera a los tasiRNAs que finalmente son 
incorporados en la proteína AGO1 o AGO7 para reconocer a su RNAm blanco (77,79) 
(Fig. 3b). 
En la actualidad se han descrito cuatro transcritos TAS en Arabidopsis, de los cuales 
para TAS1, 2 y 3 se conoce la vía de biogénesis con detalle. TAS1 y 2 tienen un sitio 
de reconocimiento para miR173, ambos son incorporados en AGO1 y los tasiRNAs 
producidos silencian a su vez a varios RNAm entre los que se encuentran los que 
codifican varias proteínas que contienen repetidos de pentatricopéptidos (PPR 
proteins en inglés) (80,81). Por otro lado, TAS4 es cortado por miR828 y los tasiRNAs 
producidos silencian a varios RNAm que codifican proteínas de la familia de factores 
de transcripción tipo MYB, diferentes a los blancos de miR159 (82). Finalmente, el caso 
más interesante es el de TAS3a que presenta dos sitios de reconocimiento para 
miR390. Tomando en cuenta el sentido 5´ y 3´ del transcrito de TAS3, el primero es un 
sitio imperfecto al microRNA en la región semilla con interacciones G:U en los sitios 9 
y 11, y en desapareamiento en el sitio 10. El segundo sitio muestra 
complementariedad total a miR390, el cual a diferencia de la mayoría de los 
microRNAs que se asocian con AGO1, es incorporado en AGO7 que también presenta 
actividad catalítica o de “slicer” (80,83). Los tasiRNAs provenientes de TAS3 silencian a 
transcritos de los factores de transcripción de respuesta a auxinas (ARFs por sus 
siglas en inglés: AUXIN RESPONSE FACTORS) ARF2, 3 y 4. Es interesante 
mencionar que la incorporación de miR390 en AGO7 le da especificidad para la 
generación de tasiRNAs; i.e., si se carga en AGO1, aún y cuando esta proteína tiene 
actividad de “slicer”, no se recluta a RDR6 y DCL4 y no hay producción de tasiRNAs. 
Pero ¿qué tan importantes son estos RNAs pequeños en la biología de las plantas? 
Aún y cuando los tasiRNAs generados de TAS1, 2 y 4 solamente se han reportado en 
Arabidopsis, lejos de ser estos RNAs pequeños un artefacto se han encontrado 
homólogos de TAS3 en otras especies como arroz, frijol e incluso en el musgo 
Physcomitrella patens, por lo que se predice que estos RNAs pequeños se han 
conservado a través de la evolución como un mecanismo de regulación genética (82,84-
86). Los tasiRNAs generados de TAS3 regulan el desarrollo y la formación de las 
� �
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hojas, así como el crecimiento de raíces laterales al regular negativamente, de manera 
espacio-temporal, a ARF2, 3 y 4 (87,88). 
 
I.5 ¿Qué es un microRNA? 
Debido a que existe una gran diversidad de RNAs pequeños reguladores de la 
expresión genética en plantas, se han establecido una serie de criterios que definen a 
los microRNAs (89). Un microRNA maduro proviene primeramente de un transcrito 
primario denominado pri-microRNA que es procesado dando lugar a un precursor con 
estructura tallo-asa. Por su parte, los siRNAs y tasiRNAs provienen de RNA de doble 
cadena larga. Las proteínas que participan en su biogénesis son DCL1, HYL1, SE (90) 
(Fig. 3b). Otro de los criterios a tomar en cuenta es la detección del microRNA*, ya 
que ha diferencia de los siRNAs, en algunos casos el microRNA* es funcional, y por lo 
general su vida media permite su detección en algunas ocasiones por experimentos 
tipo northern y cuando son poco abundantes por técnicas más sensibles como la 
secuenciación masiva o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus 
siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction). 
Los microRNAs en plantas son los RNAs pequeños menos abundantes y regulan una 
gran cantidad de procesos biológicos desde el desarrollo de la planta hasta la 
respuesta y adaptación de ésta a diferentes tipos de estrés (91,92). Actualmente se 
conoce que los microRNAs de 21 nucleótidos llevan a cabo el silenciamiento post-
transcripcional, ya sea por corte y consecuente degradación del RNAm blanco o por 
inhibición de la traducción (93), mientras que los microRNAs de 22 nucleótidos de 
longitud participan en labiogénesis de tasiRNAs (94,95). 
En un principio se pensó que los microRNAs eran altamente conservados entre 
especies e incluso se tomaba como un criterio para la caracterización de microRNAs. 
Sin embargo, con la secuenciación masiva de RNAs pequeños de un mayor número 
de especies se ha observado que muy pocas familias son altamente conservadas, y 
que la mayoría de las familias de microRNAs no conservados parecen haber 
aparecido recientemente en la escala evolutiva (92,96). Algunos microRNAs se 
encuentran en P. patens, lo cual indica que son microRNAs antiguos que se han 
conservado hasta las plantas actuales, tanto en monocotiledóneas como 
dicotiledóneas. Entre los microRNAs más conservados se encuentran mir-156, mir-
160, mir-319 y mir-390 (97). 
Los microRNAs antiguos no son necesariamente rígidos, i.e., su evolución no ha sido 
estática sino que de acuerdo a cada una de las características de los distintos tipos de 
plantas tanto la interacción microRNA:RNAm blanco como la expresión del gen del 
microRNA varían. Se ha observado que la secuencia del microRNA que es importante 
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para el reconocimiento del RNAm es la región semilla que comprende los nucleótidos 
2-8 del microRNA (98). Mediante estudios cristalográficos de complejos ternarios de 
proteínas AGO se ha observado que esta es la región que interactúa con el RNAm 
mediante interacciones Watson-Crick (99). 
 
I.5.1 Precursores de microRNAs 
Como se mencionó anteriormente uno de los criterios para definir un microRNA en 
plantas es el que proceda de un precursor con estructura tallo-asa. Los pre-
microRNAs de plantas, a diferencia de los de animales, varían en tamaño y estructura 
secundaria ya que éstos miden varias kilobases, llegando a ser de tres a más veces 
mayores en longitud en comparación con los pre-microRNAs de animales (91). Sin 
embargo, es importante señalar que aunque las diferencias en tamaño producen a su 
vez diferencias en la estructura secundaria, ésta se conserva entre microRNAs de una 
misma familia y la mayoría de los pre-microRNAs de plantas presentan características 
importantes como: a) el microRNA y el microRNA* provienen de partes opuestas del 
tallo-asa, de tal manera que el dúplex presenta dos nucleótidos sobresalientes en el 
extremo 3´; b) el apareamiento entre la región del precursor del que proviene el 
microRNA y la opuesta es muy amplio a lo largo de la estructura tallo asa habiendo 
mínimo cuatro bases desapareadas; c) los desapareamientos asimétricos en el dúplex 
son mínimos en número (una o dos bases) y en frecuencia (una vez máximo) (89,100). 
El corte de DCL1 se lleva a cabo aproximadamente cada 21 nucleótidos, lo cual 
corresponde a dos vueltas de hélice, aparentemente el espaciado necesario para la 
asociación de las proteínas con motivo de unión a RNA de doble hebra HYL1, SE y 
DDL son proteínas que al posicionarse en el precursor ayudan al corte correcto y 
preciso de DCL1 (101-104). 
En plantas se han encontrado, al menos, dos microRNAs altamente conservados que 
se caracterizan por provenir de precursores de mayor tamaño, miR159 y miR319, los 
cuales se encuentran conservados, al igual las estructuras atípicas de sus 
precursores, en la escala evolutiva desde las briofitas (96,105). Las secuencias maduras 
de miR159 y miR319 son ambas de 21 nts de longitud y 17 de dichos nucleótidos 
están compartidos entre ambos miRNAs. No obstante, ambos microRNAs se expresan 
diferencialmente entre tejidos y en el tiempo. Aunque sus secuencias maduras están 
conservadas en un 81% y los cambios de bases no se encuentran en la región semilla, 
sus RNAm blanco no son los mismos (106). miR159 tiene como RNAm blanco a 
algunos miembros de la familia de factores de transcripción MYB, mientras que 
miR319 tiene como RNAm blanco a miembros de la familia de factores de 
transcripción TCP (107,108). 
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Otra característica interesante de estos precursores de microRNAs es el hecho de que 
en su tallo largo hay ciertas regiones que se encuentran altamente conservadas. Una 
de ellas es la región en donde se encuentra la secuencia del microRNA y el 
microRNA* y la otra se encuentra en el tallo 21-22 nts arriba de ésta que se denomina 
como la región alternativa conservada 5´ y 3´ (ACR por sus siglas en inglés: 
Alternative Conserved Region) (105) (Figura 4a). 
pvupremiR159a athpremiR172a athpremiR319a athpremiR159a 
pvu-m
iR
159.2 
pvu-m
iR
159a 
ath-m
iR
159a 
ath-m
iR
319a 
ath-m
iR
172a 
D
C
L1 
DD
H
YL1 
SE 
D
C
L1
 
H
YL
1 
SE
 
b) a) 
at
h-
m
iR
17
2*
 
at
h-
m
iR
31
9*
 
at
h-
m
iR
15
9*
 
 
 A
C
R
5 
ó 
 
at
h-
m
iR
15
9.
2*
 
A
C
R
5 
 
 A
C
R
5 
ó 
 
at
h-
m
iR
15
9.
2*
 
pv
u-
m
iR
15
9*
 
at
h-
m
iR
1
 A
C
R
3 ó 
ath-m
iR
159.2 
 
Figura 4. Estructura de los pre-microRNAs en plantas. a) Estructuras de los precursores de ath-
miR319, ath-miR159a y pvu-miR159a. En todas las estructuras el dúplex miR/miR* se encuentran a lo 
largo de la base del precursor, mientras que las especies ACR se encuentran cerca del asa y separadas 
del dúplex por ∼ 21 nts (24 en Arabidopsis). En el caso de estos precursores largo el procesamiento se 
lleva en la dirección contraria, i.e., del asas hacia la base. b) Estructura de pre-miR172 de Arabidopsis. El 
dúplex microRNA y microRNA* se encuentra en la parte cercana al asa del precursor. En este caso el 
procesamiento se lleva a cabo de la base al asa. En todos los precursores el microRNA se resalta con un 
rectángulo color naranja. 
 
A diferencia de las plantas, en animales el transcrito primario del microRNA o pri-
microRNA es procesado por proteínas especializadas, la RNasa tipo III Drosha y su 
proteína accesoria, DGCR8 en humanos y Pasha en Drosophila, con motivos de unión 
a RNA de doble hebra que forman el complejo microprocesador, dando lugar a un pre-
microRNA de ∼70 nts de longitud (91,109). 
Mediante ensayos de corte in vitro, se observó que los nucleótidos que se encuentran 
en la base del pri-microRNA sirven para que se ancle el microprocesador, 
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particularmente DGCR8 que a su vez posiciona a Drosha 11 nts, una vuelta de hélice, 
adelante del comienzo del tallo del pri-microRNA (de la transición de RNA de hebra 
sencilla a RNA de doble hebra) en donde se lleva el corte endonucleolítico, dando 
como resultado un pre-microRNA con un tallo de ∼22 nts, más los nucleótidos que 
forman el asa (110). Este procesamiento da como resultado un tamaño homogéneo 
característico en los pre-microRNAs de animales además de asegurar el corte preciso 
de Dicer en el citoplasma. En la mayor parte de los precursores de miRNAs en 
animales, la secuencia del microRNA maduro se encuentra en el inicio del extremo 5´ 
o en el final del extremo 3´ (según sea el caso de la posición microRNA en el 
precursor) y Dicer corta cerca del asa liberando el dúplex micorRNA/microRNA* de 
∼22 nts y de esta manera definiendo el otro extremo del microRNA (111). 
En plantas, el procesamiento tanto del pri-microRNA como del pre-microRNA se lleva 
a cabo en el núcleo por DCL1/HYL1/SE/DDL, en donde como en animales, los pre-
microRNAs se procesan de la base del tallo hacia el asa. Tres estudios 
independientes en los que se determinó el corte de distintos pre-microRNAs muestran 
que las estructuras secundarias ubicadas 15 nts arriba del comienzo del tallo y en la 
parte superior del dúplex microRNA/microRNA* son esenciales para que se lleve a 
cabo el corte correcto. En general en estas regiones se observa la presencia de 
desapareamientos de bases que son de suma importancia para que se lleve a cabo el 
corte correcto del pre-microRNA (112-114). De esta manera, se generaliza que en la 
mayoría de los pre-microRNAs de plantas se lleva a cabo el corte del tallo hacia el asa 
(Figura 4b). Sin embargo, para el caso de los dos precursores largos conservados 
miR159a y miR319a, se observó que el procesamiento se llevaa cabo en la dirección 
contraria, i. e., del asa al tallo. Estudios de procesamiento por 5´ RACE y mutagénesis 
de pre-miR319 y pre-miR159a de Arabidopsis muestran la existencia de cuatro 
productos del corte del pre-microRNA y demuestran que el primer corte se lleva a 
cabo por debajo del asa terminal que mide ∼16 nts liberándola, para que después 
DCL1 realice tres cortes consecutivos cada 20-22 nts hasta llegar a la base del 
precursor, liberándose así el microRNA maduro (115). Puesto que en la mutante de hyl1 
no se produce el microRNA maduro de miR159a ni de miR319a, aún cuando éste se 
llega a sobre-expresar a partir del promotor fuerte viral 35S, se ha sugerido que, al 
igual que Drosha/Pasha en animales, HYL1 determina el posicionamiento de DCL1 
para el corte adecuado del pre-microRNA. Al parecer el procesamiento para este tipo 
de precursores está conservado; ya que, en el degradoma de Arabidopsis, O. sativa y 
P. patens se han detectado intermediarios similares provenientes del precursor de 
miR319a (116), lo que indica que en todos los casos el procesamiento se lleva a cabo 
del asa hacia el tallo, generándose tres dúplex de ∼21 nts de los cuales se pueden 
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generar potencialmente otros RNAs pequeños. Además, los homólogos tanto de los 
microRNAs maduros como de los pre-microRNAs reportados en Arabidopsis, en O. 
sativa y P. patens se encuentran altamente conservados no solamente a nivel de 
secuencia sino también a nivel de la estructura secundaria del precursor (117). Al 
analizar la expresión de miR159/319 en las bases de datos provenientes de 
secuenciación masiva de veinte especies distintas, Li y colegas encontraron que, en la 
mayoría de los casos, las especies más abundantes son miR159 y miR319, y que los 
miR* así como ACR 5 y 3´ son menos abundantes, mientras que las regiones 
espaciadoras (los ∼21 nts entre microRNA maduro y la región ACR) no son 
detectables o son muy poco abundantes. No obstante que en algunas especies, en 
estadios de desarrollo particulares o en tejidos particulares, los RNAs pequeños ACR5 
y/o ACR3 son más abundantes; como en el caso de inflorescencias de plantas de A. 
thaliana de cinco semanas, en donde ACR3 y miR* se expresan en mayor abundancia 
(105). En el caso particular del licopodio Selaginella moellendorffii, los RNAs pequeños 
tipo ACR5 son los más abundantes, lo cual es consistente con el tipo de estructura 
secundaria de los pre-microRNAs en esta especies (105). Debido a que en mutantes de 
la vía de los hcsiRNAs como dcl3, rdr2, así como en la triple mutante dcl2/dcl3/dcl4 se 
observa la acumulación de las especies ACR en plántulas de Arabidopsis de cinco 
semanas, se ha planteado que probablemente los pre-microRNAs son regulados de 
manera post-transcripcional y que esto puede dar lugar a la acumulación diferencial de 
los productos de corte de los pre-microRNAs (105). Estos productos a su vez podrían 
llegar a ser funcionales dependiendo del contexto celular. 
 
I.6 Argonauta: AGO1 
Los componentes más importantes de los complejos de silenciamiento son las 
proteínas Argonauta, proteínas de alto peso molecular de ∼100 kDa que presentan 
dos dominios principales: un dominio PAZ (por sus siglas en inglés 
Piwi/Argonaute/Zwille) y un dominio PIWI (por sus siglas en inglés: P ELEMENT-
INDUCED WIMPY TESTIS) (118,119). 
En general las proteínas que presentan dominio PIWI se dividen en tres subfamilias 
(120). La primera incluye a las proteínas Piwi que se encuentran en células germinales 
de animales y unen RNAs de ∼30 nucleótidos de longitud que son conocidos como 
piRNAs (por sus siglas en inglés Piwi-interacting RNAs) los cuales participan en el 
silenciamiento de regiones repetidas y transposones (121). La segunda subfamilia 
comprende a las proteínas del nemátodo Caenorhabditis elegans conocidas como 
Wago y que también participan en el silenciamiento de regiones repetidas y 
transposones (122). La tercera subfamilia conocida como Ago que está conformada por 
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las proteínas Argonauta, de las cuales la proteína AGO1 de A. thaliana fue la primera 
en describirse (123). AGO1 fue descubierta en una búsqueda de mutantes en genes 
involucrados en el desarrollo en donde se observó que la mutante nula ago1 
presentaba un fenotipo pleiotrópico caracterizado por presentar hojas con forma 
tubular que asemeja los tentáculos de un molusco del género Argonauta por lo que se 
le asignó dicho nombre a esta proteína (123). En plantas existe una gran variedad de 
proteínas AGO y, aún cuando se encuentran especializadas de acuerdo a la vía de 
RNAs pequeños en la que participe cada una de ellas y su expresión espacio-
temporal, presentan algunas veces redundancia llegando a complementar la falta de 
alguna de las proteínas AGO. Ejemplo de ello es la complementación de la mutante 
ago1 por AGO10, en donde ésta puede reemplazar a AGO1 y regular al RNAm de 
PHABULOSA por la acción de miR165 que participa en el establecimiento de la 
morfología de la hoja (124). En A. thaliana hay 10 proteínas AGO mientras que en O. 
sativa hay 18 (125,126). En Arabidopsis las proteínas AGO se dividen en tres clados de 
acuerdo a su filogenia y función. El primer clado está conformado por AtAGO1, 
AtAGO5 y AtAGO10 que participan en la vía de microRNAs; el segundo por AtAGO2, 
AtAGO3 y AtAGO7 las cuales participan en la vía de siRNAs virales y en tasiRNAs; 
por último, el tercer clado está conformado por las proteínas AGO que participan en el 
silenciamiento transcripcional mediado por los hcsiRNAs que son AtAGO4, AtAGO6, 
AtAGO8 y AtAGO9 (127). 
Estas proteínas AGO presentan tres dominios funcionales el dominio PAZ, el dominio 
MID (por sus siglas en inglés: middle) y el dominio PIWI (Figura 5 A) (127,128). 
 
��������������	��
��
����
�������
a) b) 
 
 Figura 5. Especificidad de las proteínas AGO en plantas. a) Las proteínas AGO se caracterizan por 
presentar un dominio PAZ que une el extremo 3´ del microRNA, un dominio MID que une al extremo 5´ 
del microRNA y el dominio PIWI que presenta actividad catalítica en AGO1, AGO4 y AGO10. b) Las 
� ���
distintas proteínas AGO de A. thaliana presentan una incorporación preferencial de RNAs pequeños tanto 
por su naturaleza como por el nucleótido que presentan en el extremo 5´. En el esquema se denotan los 
RNAs pequeños, el tamaño y el nucleótido en su extremo 5´ que se cargan preferencialmente en AGO1, 
AGO2, AGO4, AGO5 y AGO7. Tomado y modificado de 129. 
 
El primer dominio es característico tanto de las proteínas AGO como de las proteínas 
Dicer y une de manera inespecífica el extremo 3´ de los RNA pequeños, ya que 
reconoce los dos nucleótidos sobresalientes que se encuentran en dicho extremo (130). 
Por otra parte, el extremo 5´ de los RNAs pequeños es reconocido de manera 
específica por una cavidad que se ubica en el dominio MID conocida como “binding 
pocket”, la cual es una región altamente conservada y su plegamiento es el mismo que 
el de las proteínas AGO homólogas en arqueas y bacterias (99,131). La cristalización del 
dominio MID de la proteína AGO2 de humano en complejo con nucleósidos 
monofosfato (AMP, CMP. GMP y UMP) permitió dilucidar la preferencia de las distintas 
proteínas AGO por la unión de nucleótidos específicos. Se observó que el grupo 
fosfato del nucleótido que se encuentra en el extremo 5´ del RNA pequeño forma un 
puente de hidrógeno con los residuos de los aminoácidos altamente conservados que 
se encuentran en el “binding pocket” (Y529, K533, Q545 y K570) y, en específico, 
hAGO2 une de manera preferente RNAs pequeños que comienzan con uracilo ya que 
las interacciones son más fuertes y por lo tanto el dominio MID presenta una mayor 
afinidad por dicho nucleótido (132). De manera interesante, dicha preferencia por el 
nucleótido en el extremo 5 ´ se observa en las proteínas AGO de A. thaliana y 
Drosophila. Esta preferencia además de tener bases bioquímicas y estructurales