Relacion-estructura-funcion-de-la-enzima-Fosfatidilcolina-Sintasa-de-Sinorhizobium-Meliloti

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
RELACIÓN ESTRUCTURA-FUNCIÓN DE LA ENZIMA
FOSFATIDILCOLINA SINTASA DE Sinorhizobium meliloti.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
PRESENTA
IBQ ROSA LIDIA SOLÍS OVIEDO
TUTOR: DR. CHRISTIAN SOHLENKAMP.
CUERNAVACA, MOR. 2012
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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ÍNDICE.
RESUMEN ..............................................................................................................................................................3
ABSTRACT ............................................................................................................................................................5
INTRODUCCIÓN..................................................................................................................................................6
1. Fosfatidilcolina. ...................................................................................................................................................7
2. Biosíntesis de fosfatidilcolina en eucariotas........................................................................................................7
2.1. La ruta de la metilación. ....................................................................................................................................8
2.2 La ruta de CDP-colina. .....................................................................................................................................10
3. Fosfatidilcolina en procariotas............................................................................................................................12
3.1 Presencia de fosfatidilcolina en bacterias. ........................................................................................................12
3.2 Biosíntesis de fosfatidilcolina en bacteria. .......................................................................................................13
3.2.1 Ruta de la metilación. ...................................................................................................................................14
3.2.2. Ruta de fosfatidilcolina sintasa....................................................................................................................15
3.2.3 Evidencia de la ruta de CDP-colina..............................................................................................................16
3.3. Función de fosfatidilcolina en procariotas.......................................................................................................17
JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................................................21
HIPÓTESIS...........................................................................................................................................................23
OBJETIVOS .........................................................................................................................................................23
MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................................................25
1. Cepas bacterianas y plásmidos. ..........................................................................................................................25
2. Alineamiento de las secuencias de fosfatidilcolina sintasa. ...............................................................................25
3. Construcción de mutantes de sitio dirigido. .......................................................................................................26
4. Expresión in vivo de Pcs en E. coli. ...................................................................................................................27
5. Ensayos in vitro de la actividad de fosfatidilcolina sintasa (Pcs). ......................................................................27
5.1. Ensayos in vitro de la actividad de fosfatidilcolina sintasa (Pcs) bajo condiciones de sustrato saturantes. ....27
5.2. Ensayos in vitro para el análisis del comportamiento cinético de la Pcs silvestre y de las mutantes T23S y
D81N en extractos crudos. .....................................................................................................................................28
6. Inmunodetección de la Pcs. ................................................................................................................................28
6.1. Inmunodetección de la Pcs con colas de histidina (His-Pcs o Pcs-His). .........................................................28
6.2. Inmunodetección de la Pcs con la proteína de unión a maltosa (MBP-Pcs)....................................................29
7. Construcción de las fusiones de Pcs–PhoA y Pcs–LacZ. ...................................................................................29
8. Procedimientos para la obtención del modelo topológico de Pcs.......................................................................30
8.1. Determinación de actividades de fosfatasa alcalina y actividades β-galactosidasa.........................................30
8.2. Determinación de la localización de la región N-terminal de Pcs sinorhizobial. ............................................30
9. Clonación del gene pcs en el vector pMal-c2x...................................................................................................31
10. Expresión y purificación del complejo Pcs-MBP.............................................................................................31
RESULTADOS .....................................................................................................................................................33
1. Residuos de aminoácidos importantes para la Pcs de Sinorhizobium meliloti...................................................33
1.1. Identificación de los residuos de aminoácidos conservados en fosfatidilcolina sintasa (Pcs) de diferentes
organismos..............................................................................................................................................................33
1.2. Residuos de aminoácidos importantes para la actividad in vivo de la Pcs de Sinorhizobium meliloti. ...........37
1.3. Ensayos enzimáticos in vitro sobre los residuos de aminoácidos identificados como importantes para la
actividad de la Pcs de S. meliloti. ...........................................................................................................................41
1.4. Análisis del comportamiento cinético de la Pcs silvestre y de las mutantes T23S y D81N en extractos
crudos. ....................................................................................................................................................................42
2. Topología de la enzima Pcs de Sinorhizobium meliloti......................................................................................43
3. Purificación de la enzima Pcs de Sinorhizobium meliloti...................................................................................48
DISCUSIÓN ..........................................................................................................................................................51PERSPECTIVAS..................................................................................................................................................58
REFERENCIAS. ..................................................................................................................................................61
PROTOCOLOS ....................................................................................................................................................69
ARTÍCULO PUBLICADO..................................................................................................................................79
TABLAS SUPLEMENTARIAS ..........................................................................................................................91
2
3
RESUMEN
La enzima Pcs pertenece a la superfamilia de las CDP-alcohol fosfotransferasas. La Pcs cataliza la
formación de PC y CMP en un paso a partir de CDP-diacilglicerol y colina. Las CDP-alcohol
fosfotransferasas presentan un patrón de aminoácidos conservado que implica similitudes estructurales
como en los mecanismos de reacción. El estudio del mecanismo de reacción de Pcs se ha visto
obstaculizado por la dificultad de purificar esta proteína, dado que es una proteína integral de
membrana. Empleando como modelo la Pcs de Sinorhizobium meliloti, se estudió la relación entre la
estructura y la función de esta enzima. Con el fin de identificar los residuos de aminoácidos
importantes para la actividad de la Pcs, se alinearon las secuencias de aminoácidos de las enzimas de
Pcs y se identificaron los residuos conservados. Se realizó un escaneo de alanina en 55 de estos
residuos, de los cuales tres residuos de alanina se reemplazaron por glicina. La mutación en nueve de
los residuos conservados (H20, T23, D56, D59, G60, G77, D81, D85 y Y123) provocó una pérdida
drástica (< 20% con respecto a la del tipo silvestre) o completa de la actividad in vivo de la Pcs. Seis de
éstos (H20, T23, D56, D59, D81 y D85) se sometieron a estudios de mutagénesis adicionales en los
que se sustituyeron por aminoácidos con cargas o tamaños similares. Las mutantes de Pcs donde los
residuos D56, D59, D81 y D85 se sustituyeron con asparagina (N) o glutamato (E) son incapaces de
producir PC, en tanto que las mutantes H20L y T23S recuperaron los niveles de PC en un 30 y 60 % de
la actividad in vivo respecto a la Pcs silvestre, respectivamente. Por otra parte, se eligieron quince
mutantes que tuvieron menos del 50 % de actividad in vivo respecto a la Pcs silvestre y sus actividades
in vitro se analizaron bajo condiciones saturantes de sustrato. Las mutantes H20L, R64A, L80A, D81N
y D81E mostraron una mayor actividad de Pcs bajo condiciones in vitro que las observadas bajo
condiciones in vivo. Con el fin de conocer mejor el papel bioquímico de los residuos de aminoácidos
esenciales para su actividad, se elucidó el modelo topológico de la Pcs con base en datos
experimentales obtenidos por el método de fusiones entre la región N-terminal de fragmentos de Pcs y
las enzimas reporteras fosfatasa alcalina (PhoA) y β- galactosidasa (LacZ). Con este método se
examinó la orientación en la membrana de los residuos esenciales para la actividad de Pcs y los
resultados obtenidos se complementaron con el método de sustitución y accesibilidad de cisteínas
(SCAM™). El modelo topológico propuesto para la Pcs de S. meliloti presenta ocho hélices
transmembranales, con los sitios C- y N- términales localizados en el citoplasma. La mayoría de los
residuos conservados se encuentran localizados en las asas citoplásmicas o bien en el lado citoplásmico
de la membrana, lo cual es congruente para una enzima que emplea un sustrato soluble y otro asociado
a la membrana. Con los resultados obtenidos en el presente trabajo, se identificaron los residuos
esenciales para la actividad de Pcs así como su orientación en la membrana. Estos resultados son
discutidos para proponer un posible mecanismo catalítico en la enzima Pcs.
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5
ABSTRACT
Phosphatidylcholine (PC) is the major phospholipid of the plasmatic membrane in eukaryotes and is
estimated to be present in about 15% of eubacteria. It can be synthesized in bacteria by either of two
pathways, the phospholipid N-methylation pathway or the phosphatidylcholine synthase (Pcs) pathway.
Pcs belongs to the CDP-alcohol phosphotransferase superfamily. Pcs synthesizes PC and CMP in one
step via condensation of CDP-diacylglycerol with choline. CDP-alcohol phosphotransferases have a
conserved amino acid pattern which implicates structural and mechanistic similarities. Understanding
the mechanism of Pcs function has been hindered by the difficulty of purifying this integral membrane
protein. Using Sinorhizobium meliloti Pcs we studied the relation between structure and function. Our
aim was to identify amino acid residues important for Pcs activity. In this study, we aligned sequences
of characterized Pcs enzymes to identify conserved amino acid residues. Alanine scanning mutagenesis
was performed on 55 of these conserved residues, while three alanine residues were replaced by
glycine residues. The mutation of nine residues (H20, T23, D56, D59, G60A, G77, D81, D85 y Y123),
caused a drastic to complete loss (< 20% of wild type activity) of Pcs activity in vivo. Six of these
essential residues (H20, T23, D56, D59, D81 y D85) were subjected to further mutagenesis studies
replacing them by amino acids with similar properties with respect to charge or size. Pcs mutants with
asparagine or glutamate substituting for D56, D59, D81, and D85, were unable to produce PC, while in
the mutants H20L and T23S in vivo Pcs activity recovered to 30 and 60% relative to the wild type,
respectively. Fifteen mutants that had less than 50% in vivo activity compared to the wild type protein
were chosen and their Pcs activities were analyzed also in vitro under conditions of saturating substrate
concentrations. Mutants H20L, R64A, L80A, D81N and D81E showed higher relative Pcs activity
under in vitro conditions than in vivo. To better understand the biochemical role of amino acid residues
essential for its activity, we examined the membrane orientation of these essential residues in Pcs, by
translational fusions between the N-terminal region of Pcs fragments and the enzymes reporter alkaline
phosphatase (PhoA) and β-galactosidase (LacZ). The substituted cysteine accessibility method
(SCAM™) was chosen as a complementary approach. The topological analysis of sinorhizobial Pcs
showed the presence of eight transmembrane helices, with the C- and N-terminus located in the
cytoplasm. The majority of the conserved residues are predicted to be either located within the
cytoplasmic loops or on the cytoplasmic side of the membrane, which can be expected for an enzyme
using one soluble and one membrane-associated substrate. These results are discussed and a possible
catalytic mechanism in the Pcs enzyme is proposed.
6
7
INTRODUCCIÓN
1. Fosfatidilcolina.
La fosfatidilcolina (PC, figura 1) es el fosfolípido mayoritario de la membrana en células eucariotas,
constituyendo aproximadamente la mitad del total de los lípidos de la membrana; en particular se
encuentra en una proporción más alta en la capa externa de la membrana citoplasmática. Además del
rol estructural de PC en las membranas, sirve como modulador de una amplia variedad de funciones
celulares (Kent, 1990; LeBlanc et al., 1998; Exton, 1994; Zeisei y Blusztajn, 1994). Por otro lado, la
PC es encontrada en las membranas bacterianas, se estima que quizás se encuentre en un 15% de las
especies procariotas. De manera opuesta a lo que se observa para células eucariotas, se conoce muy
poco sobre el rol de PC en procariotas (Sohlenkamp et al., 2003; Aktas et al., 2010).
Figura 1. Estructura de fosfatidilcolina. La fosfatidilcolina (PC) es un glicerofosfolípido, esto quiere decir que
es una molécula de glicerol donde los carbonos 1 y 2 están esterificados a ácidos grasos y elcarbono 3 a un
grupo fosfato, que a su vez se encuentra esterificado a una molécula de colina.
2. Biosíntesis de fosfatidilcolina en eucariotas.
En eucariotas, la PC es sintetizada por dos rutas, una es la vía de biosíntesis a través de tres
metilaciones sucesivas a partir de fosfatidiletanolamina (PE) denominada ruta de la metilación, la otra
ruta biosintética es la ruta de citidina difosfato–colina (CDP–colina) o ruta de Kennedy, la cual usa
colina como precursor de la síntesis de PC. En la ruta de la metilación la PC es sintetizada de novo,
mientras que en la ruta de CDP–colina, la colina precursora para formar PC puede provenir de la
hidrólisis de otras moléculas que contienen colina en su estructura.
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2.1. La ruta de la metilación.
La ruta de metilación se encuentra presente en levaduras, plantas y en mamíferos. Esta ruta de
biosíntesis de fosfatidilcolina emplea como precursor la fosfatidiletanolamina la cuál sufre tres
transmetilaciones consecutivas hasta formar fosfatidilcolina, siendo los compuestos intermediarios
monometilfosfatidiletanolamina (MMPE) y dimetilfosfatidiletanolamina (DMPE). Las reacciones son
catalizadas por las enzimas fosfolípido N-metiltransferasas (Pmt). Las enzimas Pmt usan S-
adenosilmetionina (SAM) como donador de grupos metilo desplazando S-adenosilhomocisteina (SAH)
como otro producto resultante de la metilación (Bremen y Greenberg, 1959; Vance y Ridgway, 1988;
Ridgway et al., 1989).
La fosfatidiletanolamina es sintetizada a partir de la condensación de CDP-diacilglicerol con serina
para formar fosfatidilserina (PS), la reacción es catalizada mediante la enzima fosfatidilserina sintasa
(Pss); la molécula de fosfatidilserina (PS) sufre una descarboxilación mediante la enzima
fosfatidilserina decarboxilasa (figura 2, Kent, 1995). En las levaduras Saccharomyces cerevisiae y en
Schizosaccharomyces pombe, se ha demostrado que dos enzimas Pmt son requeridas para la biosíntesis
de fosfatidilcolina mediante esta ruta, las cuales son altamente hidrofóbicas (Kodaki y Yamashita,
1987) y se encuentran localizadas en el retículo endoplasmático (Kuchler et al., 1986). Estas enzimas
son la metiltransferasa de clase II (PEMT1/Cho2p) de 101 kDa, y la fosfolípido metiltransferasa de
clase I (PEMT2/Opi3p) de 23 kDa, los genes que las codifican son CHO2 y OPI3, respectivamente
(Kodaki y Yamashita, 1987; Kodaki et al., 1991; Kanipes y Henry, 1997; Kanipes et al., 1998).
Estudios en S. cerevisiae mostraron que la enzima de clase II fosfatidiletanolamina metiltransferasa
(PEMT1/CHO2) cataliza la primera reacción de la metilación formando MMPE. La segunda y la
tercera transmetilación se llevan a cabo mediante la acción de la enzima fosfolípido metiltransferasa de
clase tipo I (PEMT2/OPI3). De manera adicional esta enzima también es capaz de catalizar la
metilación de PE con menor eficiencia que la Pmt de clase tipo II (figura 2, Kodaki y Yamashita, 1987;
Kanipes y Henry, 1997).
Las plantas no metilan PE a MMPE (Marchall y Kates, 1973; Willians y Harwood, 1994), pero se ha
detectado la actividad de enzimas que llevan a cabo los últimos dos pasos de la ruta de la metilación de
MMPE vía DMPE a PC en los extractos crudos de diversas plantas (Kinney, 1993; Bolognese y
McGraw, 2000). Por lo anterior, un paso para la biosíntesis de PC en plantas por esta vía, es la
metilación de fosfoetanolamina (P-EA) a monometilfosfoetanolamina (P-MEA). La MMPE es
sintetizada de P-MEA vía CDP-MEA por una citidiltransferasa. Las siguientes transmetilaciones
pueden ocurrir a nivel de fosfo-base (espinaca), a nivel de fosfatidil-base (soja) o en ambos (zanahoria),
dependiendo de la especie (Darko y Mudd, 1988; Nuccion et al., 2000; Charron et al., 2002).
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Figura 2. Formación de fosfatidiletanolamina (PE) y la ruta de metilación en levaduras para la biosíntesis
de fosfatidilcolina (PC). Imagen adaptada de Sohlenkamp et al 2003. Los tres pasos de la metilación de
fosfatidiletanolamina (PE) son catalizados por fosfolípidos N-metiltransferasas. El primer paso es catalizado por
una metiltransferasa de tipo II (PEMT1), los dos últimos pasos se catalizan por N-metiltranferasas de clase I
(PMT2). Abreviaciones son: monometilfosfatidiletanolamina (MMPE), dimetilfosfatidiletanolamina (DMPE), S-
adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteina (SAH). Ver detalles en el texto.
La ruta de metilación en mamíferos según los estudios realizados hasta la fecha es similar al esquema
de la misma ruta en levaduras. Los mamíferos poseen solo un gen codificante para una fosfolípido
metiltransferasa (PEMT) de 20 kDa (Rigway y Vance, 1987), esta enzima cataliza los tres pasos de
transmetilación. Fosfatidiletanolamina (PE) y los intermediarios metilados (MMPE y DMPE), así
como SAM, se unen a la enzima mediante el sitio de unión específico para el sustrato y se disocia el
SAH en cada una de las transmetilaciones (Rigway y Vance, 1988; Rigway y Vance, 1992; Vance et
al., 1997).
10
2.2 La ruta de CDP-colina.
La ruta de CDP-colina, también es conocida como ruta de Kennedy en honor al doctor Eugene Patrick
Kennedy quien la descubrió (1956; figura 3; Kennedy y Weiss, 1956; Weiss et al., 1958; Kennedy,
1989; Hosaka et al., 1989; Yamashita y Hosaka, 1997). En esta vía de CDP-colina para la biosíntesis de
fosfatidilcolina, la colina es libre es obtenida por la acción de fosfolipasas C o D las cuales median la
hidrólisis de PC o derivados de fuentes exógenas. La incorporación de colina en las células es mediada
por transportadores para esta molécula (Kent, 1990). Los mecanismos mediante los cuales la colina es
transportada aun no han sido completamente elucidados. Sin embargo, se conocen tres sistemas
mediados por proteínas: el sistema de alta afinidad, dependiente del transporte de Na+, de baja afinidad
a través de difusión facilitada, y el sistema de afinidad intermedia, independiente del transporte de Na+
(Michel et al., 2006). Una vez que ha sido incorporada la colina al interior de la célula, la colina es
inmediatamente fosforilada formando colina fosfato, reacción que cataliza la enzima colina cinasa
(Cki1p) (figura 3). Como paso siguiente una molécula de citidina trifosfato (CTP) es condensada con
colina fosfato mediante la enzima CTP: fosfocolina citidiltransferasa (Pct1p/Cpt1p) para formar CDP-
colina. Finalmente, la fosfocolina de CDP-colina es transferida a 1,2-diacilglicerol para formar PC.
Este paso final es catalizado a través de la CDP-colina: 1,2 diacilglicerol colina fosfotransferasa
(Cpt1p).
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Figura 3. La ruta de CDP-colina o ruta de Kennedy para la biosíntesis de fosfatidilcolina (PC). Adaptada
de Kent (1990). Tres pasos son llevados a cabo una vez incorporada la colina al interior de la célula para formar
PC. Abreviaciones: trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP), trifosfato de citidina (CTP),
difosfato de citidina (CDP), monofosfato de citidina (CMP), pirofosfato (PPi), diacilglicerol (DAG) y alquil-
acilglicerol (AAG). Descripción detallada en el texto.
12
3. Fosfatidilcolina en procariotas.
3.1 Presencia de fosfatidilcolina en bacterias.
Por lo general las bacterias contienen fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG) y cardiolipina
(CL) como fosfolípidos mayoritarios en su membrana. Históricamente se sabía que bacterias fotótrofas
y algunas bacterias que viven en asociación con eucariotas contienen fosfatidilcolina (PC) como
fosfolípido de membrana (Golfine, 1984). Estudios más recientes sobre las secuencias del genoma de
bacterias, sugieren que la presencia de PC es más extensa (López-Lara y Geiger, 2001; Sohlenkamp et
al., 2003). Especies que contienen PC se encuentran en grupos distantes como son del tipo Gram-
negativas como proteobacterias de tipo alfa, beta y gamma, citófagas, flavobacterias, bacteroides,
espiroquetas y en bacterias Gram-positivas como Cellulomonas, Hongia, Kribella y
Saccharomonospora (figura 4).
Figura 4. La presencia de PC en distintas bacterias. Árbol filogenético basadoen la identidad entre las
secuencias 16S de rRNA en bacterias, donde se indica la presencia (+) o la ausencia (-) de PC. La lista general
de especies que contienen PC no está completamente representada en este árbol (tomado de Sohlenkamp, 2003).
13
La cantidad de PC detectada en las distintas especies es variable y depende de las condiciones de
cultivo, desde un pequeño porcentaje de los lípidos totales de membrana como es el caso en
Pseudomonas aeruginosa la cual posee alrededor de 4% de PC (Golfine, 1984), a un porcentaje alto
como en Acetobacter aceti donde PC representa el 74% de los lípidos totales en su membrana (Hanada
et al., 2001). La cantidad de PC en porcentaje de lípidos totales, que ha sido medida en bacterias se
resume en la tabla 1.
3.2 Biosíntesis de fosfatidilcolina en bacteria.
En bacterias se ha demostrado que existen dos rutas para la biosíntesis de fosfatidilcolina: la ruta de la
metilación y la vía de biosíntesis directa por el enzima fosfatidilcolina sintasa (Pcs). Sin embargo,
existe evidencia de que para la biosíntesis de fosfatidilcolina en la bacteria espiroqueta T. denticola se
emplea la ruta de CDP-colina o ruta de Kennedy (Kent et al., 2004). La ruta de la metilación como la
ruta de Kennedy se encuentran tanto en organismos eucariotas y procariotas. La ruta de Pcs hasta ahora
solo ha sido encontrada en procariotas. Se ha visto que ciertas bacterias patógenas tienen la enzima Pcs
como única vía para la formación de PC, este es el caso para P. aeruginosa, B. abortus y Borrelia
burgdorferi (Wilderman et al., 2002, Martínez-Morales et al., 2003; Comerci et al., 2006). También se
han encontrado bacterias, que además de la vía Pcs poseen la ruta de la metilación (figura 5), tales son
S. meliloti, A. tumefaciens, Rhizobium leguminosarum, Mesorhizobium loti y L. pneumophila (de
Rudder et al., 1997; de Rudder et al., 1999; Sohlenkamp et al., 2000; Martínez-Morales et al., 2003).
14
Figura 5. Representación de las dos vías para la biosíntesis de PC en bacterias. La ruta de la metilación
catalizada por las enzimas fosfolípido metiltransferasas (Pmt) y la vía catalizada mediante la enzima
fosfatidilcolina sintasa (Pcs) que condensa directamente citidina difosfato diacilglicerol (CDP-DAG) y colina,
formando PC y SAH. Abreviaciones: S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteina (SAH). Ver detalles
en el texto.
3.2.1 Ruta de la metilación.
La ruta de la metilación es similar a la descrita previamente en este trabajo como una de las rutas para
formar PC en eucariotas. PC se forma a partir de tres transmetilaciones de PE. Estas reacciones son
catalizadas por las enzimas fosfolípido N-metiltransferasas (Pmt), y emplean SAM como el donador de
los grupos metilo, siendo los intermediarios en esta vía de síntesis MMPE y DMPE. Las enzimas Pmt
de procariotas y eucariotas catalizan la misma reacción, la diferencia entre estas enzimas se encuentra
en su secuencia y la estructura. La mayoría de las Pmt en procariotas son citosólicas, mientras que en
eucariotas se encuentran asociadas a la membrana. En bacterias hasta ahora se han identificado tres
familias de Pmt, éstas se diferencian en las especificidades por sus substratos. Un tipo de Pmt llamado
PmtA presente en Sinorhizobium es homóloga con las enzimas metilasas de rRNA se denomina PmtA
tipo S. melliloti, codifica para proteínas de 22 kDa y pueden ser funcionalmente expresadas en E. coli,
genes pmtA similares al tipo de S. meliloti son encontrados en B. japonicum, B. abortus y A.
tumefaciens (Minder et al., 2000; Comerci et al., 2006; Conde-Alvarez et al., 2006; Wessel et al.,
2006). El otro tipo de enzima PmtA, fue encontrado por primera vez en Rhodobacter y por lo cual le
15
denomina PmtA tipo Rhodobacter, es similar a las enzimas UbiE que participan como metiltransferasas
en la biosíntesis de ubiquinona/menaquinona (Arondel et al., 1993). La pmtA rhodobacterial es una
proteína de 22.9 kDa y no muestra similitud significativa con la secuencia de aminoácidos de las
metiltransferasas conocidas en levadura o mamíferos. Miembros de la familia de las PmtA de este tipo
rhodobacterial son encontrados en A. aceti y L. pneumophila (Hanada et al., 2001; Martínez-Morales et
al., 2003). El tercer tipo que se ha encontrado es una enzima Pmt en Zymomonas mobilis esta enzima
forma un homodímero de subunidades de 42 kDa (Tahara et al., 1986; Tahara et al., 1987b; Tahara et
al., 1994). La ruta de la transmetilación en Z. mobilis es la única vía para la biosíntesis de PC en esta
bacteria. Algunas bacterias poseen dos o más metiltransferasas involucradas en los diferentes pasos de
la metilación. Bradyrhizobium japonicum tiene cuatro fosfolípido N-metiltransferasas, que se expresan
diferencialmente para llevar a cabo la transmetilación de PE a MMPE, y la presencia de un segundo
fosfolipido N-metiltransferasa (PmtX) es requerida para la metilación de MMPE a PC (Hacker S et al.,
2008). Otras bacterias en las cuales se involucra probablemente mas de una enzima Pmt son: M. loti, R.
leguminosarum y Rhodopseudomonas palustris. Una característica compartida entre los tres tipos de
Pmt en procariotas que también se encuentra en las Pmt de eucariotas es que todas tienen el motivo (V-
L-E/D-X-G-X-G-X-G) (Haydock et al., 1991), el cual se ha discutido que es el sitio de unión a SAM
(Ingrosso et al., 1989).
3.2.2. Ruta de fosfatidilcolina sintasa.
La Pcs cataliza la condensación de CDP-diacilglicerol y colina, dando lugar a la formación de
fosfatidilcolina y citidina monofosfato (CMP) (figura 3, de Rudder et al., 1999; Sohlenkamp et al.,
2000). La enzima Pcs así como las enzimas fosfatidilinositol sintasa, fosfatidilglicerol sintasa,
fosfatidilserina sintasa tipo II, cardiolipina sintasa tipo II, amino alcohol fosfotransferasa y colina
fosfotransferasas son encargadas de la biosíntesis de fosfolípidos que forman parte de la superfamilia
CDP-alcohol fosfotransferasas (Dryden y Dowhan, 1999; Jackson et al., 2000; Qi et al., 2003;
Sandoval-Calderón et al., 2009; Sohlenkamp et al., 2004; Williams y McMaster, 1998). La información
estructural disponible para los miembros de las CDP-alcohol fosfotransferasas es escasa. Se ha descrito
un motivo de aminoácidos conservado para esta superfamilia: DGX2ARX8GX3DX3D, en las enzimas
de Pcs este motivo se encuentra modificado como: DGX2ARX12GX3DX3D (Sohlenkamp et al., 2000).
Estudios sobre las enzimas colina fosfotransferasa (Cpt1p) de S. cerevisiae (Williams y McMaster,
1998) y alcohol amino fosfotransferasa (AAPT1) de Brassica napus (Qi et al., 2003) que se limitaron a
estudiar los residuos de aminoácidos conservados en el motivo de la superfamilia, han confirmado la
importancia de estos residuos para llevar a cabo la biosíntesis de los fosfolípidos.
16
La enzima Pcs se identificó por primera vez en S. meliloti (de Rudder et al., 1999; Sohlenkamp et al.,
2000). S. meliloti es una bacteria capaz de fijar nitrógeno en simbiosis con plantas de los géneros
Medicago, Melilotus o Trigonella. La Pcs de S. meliloti (SmPcs) es una proteína altamente hidrofóbica
con 241 aminoácidos, se predice que Pcs tiene entre 4 y 8 hélices transmembranales dependiendo de
programa empleado. Se han descrito condiciones para realizar ensayos de actividad enzimática de Pcs
in vitro en extractos celulares de S. meliloti (de Rudder et al., 1999). La SmPcs muestra una actividad
óptima a pH 8.0, donde la presencia de Mn2+ o Mg2+ es requerida, y su actividad in vitro es dependiente
del detergente Tritón X-100.
Mutantes de S. meliloti y A. tumefaciens deficientes de la ruta de la transmetilación crecidas en medios
que contienen colina, acumulan niveles de PC similares a los de estas bacterias del tipo silvestre (de
Rudder et al., 1997; Wessel et al., 2006). En S. meliloti, se ha probado que para la biosíntesis de PC por
la ruta de Pcs la colina puede ser obtenida de su huésped (de Rudder et al., 1999). Asimismo se
encontró que posee un transportador de tipo ABC de alta afinidada colina, el cual es expresado en
bacteroides (Dupont et al., 2004). Los eucariotas (plantas y animales) contienen considerables
cantidades de colina en sus fluidos corporales (Shear et al., 1986) por lo que patógenos como P.
aeruginosa, B. abortus y L. neumophila pueden obtener colina para la biosíntesis de PC directamente
de su huésped. Las fosfolipasas C y D de los patógenos tienen el potencial de destruir las membranas
de su huésped eucariota liberando así moléculas de fosfocolina y colina. En P. aeruginosa la colina
induce la producción de fosfatasa ácida y fosfolipasa C (Lisa et al., 1984; Lucchesi et al., 1989), la
acción coordinada de estas dos enzimas escinde los fosfolípidos que contienen colina para liberarla. P.
aeruginosa incorpora posteriormente la colina mediante sistemas de alta y baja afinidad (Salvano et al.,
1989).
3.2.3 Evidencia de la ruta de CDP-colina.
Los operones licI y lic de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, respectivamente
(Weiser et al., 1997; Zhang et al., 1999), contienen genes licA a D, codificando para una parte de la
ruta de CDP-colina o ruta de Kennedy (figura 4). El gen licA codifica para fosfocolina citidiltransferasa
(CCT), que convierte fosfocolina a citidina fosfocolina, y el gen licC codifica para colina cinasa (CK)
la cual cataliza la conversión de colina a fosfocolina, siendo el gen licD quien dona la fosfocolina a un
oligosacárido formando fosfocolina glicoconjugada (Weiser et al., 1997; Zhang et al., 1999; Hannun et
al., 2001; Raetz et al., 2007). El gen licB actúa independientemente como un transportador de colina.
Las proteínas CCT de procariota no tienen una estructura primaria similar a las CCT de eucariotas
(Campbell y Kent, 2001; Rock et al., 2001). Análisis genómicos revelan que algunas bacterias poseen
un gen que resulta ser un híbrido de los genes licC y licA, el cual se denominó como gen licCA, donde
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la región licC se encuentra en el extremo amino terminal y la región licA hacia el sitio carboxilo
terminal. En Treponema denticola se ha demostrado que el gen híbrido licCA puede codificar para una
proteína, la cual tiene ambas funciones CK y CCT. Aunque no se ha encontrado el gen responsable
para la actividad de CDP-colina: 1, 2-diacilglicerol colina fosfotransferasa cuya función sea convertir
CDP-colina y DAG a PC, una mutante deficiente de este gen híbrido licCA en T. denticola causa la
pérdida de PC, dando por primera vez la evidencia de la existencia de la ruta de CDP-colina como vía
para la biosíntesis de fosfatidilcolina en organismos procariotas. Se han encontrado genes con un alto
porcentaje de identidad a licCA de Treponema denticola en bacterias como: Treponema phagedenis
bacteria no patógena con la cual posee un 70% de identidad a nivel de aminoácidos (70%), Treponema
pallidum (59%) causante de la sífilis, Fusobacterium nucleatum (30%) la cual está involucrada en
enfermedades periodontales y Clostridium perfrigens (25%) causante de gangrena.
3.3. Función de fosfatidilcolina en procariotas.
Se sabe que por lo general la composición lípidica de una membrana es un factor crítico para su
integridad y el crecimiento celular (Raetz y Dowhan, 1990). La composición de las membranas
bacterianas muchas veces se adapta a los cambios en el medio ambiente, como por ejemplo: la
temperatura, la tensión de oxígeno, la salinidad o el suministro de nutrientes (Tang y Hollingsworth,
1998; Medeot et al., 2007). Sin embargo, la función que desempeña la presencia de ciertos fosfolípidos,
así como la mayoría de los mecanismos de regulación que controlan la biosíntesis de lípidos de la
membrana es desconocida (Schujman y de Mendoza, 2005; Pech-Canul et al., 2011).
Estudios sobre mutantes deficientes de fosfatidilcolina (PC) en algunas bacterias simbiontes o
patógenas, han revelado la importancia de PC para poder establecer dicha interacción con su
hospedero. La presencia de PC en el simbionte S. meliloti ha mostrado ser crítica para su supervivencia
(de Rudder et al., 2000), ya que mutantes deficientes de la biosíntesis de PC muestran un reducido
crecimiento en comparación con la cepa silvestre y son incapaces de producir nódulos que fijen
nitrógeno en las raíces de su planta hospedera Medicago sativa; la misma incapacidad para formar
nódulos funcionales se encontró en mutantes de Bradyrhizobium japonicum deficientes de PC (Minder
et al., 2001; Hacker et al., 2008). Un estudio reciente sobre el transcriptoma de las mutantes deficientes
de PC en B. japonicum revela que existen cambios en la expresión de un conjunto limitado de genes,
dichos genes codifican para proteínas que se encuentran en la membrana citoplasmática o que están
asociados con funciones de membrana (Hacker et al., 2008).
Se han realizado estudios sobre la importancia de PC en los patógenos A. tumefaciens, B. abortus, L.
pneumophila y P. aeruginosa. En A. tumefaciens, un patógeno de plantas, es capaz de inducir la
formación de tumores en una gran variedad de especies de plantas dicotiledóneas (Beiersbergen y
18
Hooykaas, 1994). Mutantes que no pueden formar PC no mostraron un defecto aparente en el
crecimiento en medio líquido, no obstante mostraron defectos dramáticos sobre la virulencia, que se
basa en la falta de expresión de los genes virB y virD que codifican para mecanismos de secreción tipo
IV (Wessel et al., 2006). Este sistema de secreción es responsable de transferir los efectores de
virulencia: el DNA oncogénico (T-DNA) y las proteínas Vir, a las células de la planta durante la
infección (Christie y Cascales, 2005; Winans, 1992). Este resultado demuestra que PC en la membrana
de A. tumefaciens es un prerrequisito para establecer un proceso de infección con su planta hospedera.
Brucella abortus es una bacteria Gram negativa, patógeno intracelular de mamiferos causante de la
brucelosis la cual provoca una disminución en la producción de leche y abortos (Cheville et al., 1993).
La fosfatidilcolina (PC) de B. abortus es sintetizada únicamente por la ruta de fosfatidilcolina sintasa.
Las mutantes carentes de PC son capaces de replicarse intracelularmente en macrófagos murinos de
manera similar a las cepas silvestres que contienen PC, lo que indica que la ausencia de este fosfolípido
no altera la capacidad de Brucella para invadir y replicarse en su huésped. Sin embargo, al analizar la
virulencia entre la B. abortus silvestre y la carente de PC, una característica distintiva de la infección
por Brucella conocida como esplenomegalia se vio reducida en los ratones que recibieron la cepa
mutante (sin PC) en comparación con la silvestre. Este resultado indica que la PC en la superficie
celular de B. abortus es necesaria directa o indirectamente para causar un proceso de infección eficiente
en ratones (Comerci et al., 2006; Conde-Alvarez et al., 2006). Las mutantes deficientes de PC en B.
abortus muestran un aumento en la sensibilidad a antibióticos, ya sea de carácter hidrofílico como la
penicilina y la cefalotina, o bien, de carácter hidrofóbico como la eritromicina; contrariamente se
observó un aumento en la sensibilidad a péptidos policatiónicos bactericidas. Se ha descartado que
existan cambios en los niveles de lipopolisacárido, por lo que se ha sugerido que existe un conjunto de
alteraciones sobre la membrana externa, ya sea en las porinas que pueden introducir este tipo de
compuestos o una alteración de la permeabilidad en la membrana externa provocada por la deficiencia
de PC (Conde-Álvarez, 2006).
Estudios más detallados sobre los efectos de virulencia en una mutante deficiente de PC se han
realizado en Legionella pneumophila, bacteria Gram negativa patogena de mamíferos. L. pneumophila
en su estado silvestre posee alrededor del 30 % de PC con respecto a sus fosfolípidos totales (Hindahl y
Iglewski, 1984), estos estudios muestran de manera similar a Brucella abortus que la presencia de PC
en L. pneumophila es importante para mantener el mecanismo de virulencia, ya que en elcaso de L.
pneumophila deficiente de PC, se ha visto afectada la función del sistema de secreción tipo IV llamado
Dot/Icm, que se encarga de incorporar los sustratos necesarios para el crecimiento intracelular en el
citosol de las células infectadas; en segundo lugar, hay una deficiente adhesión de macrófagos durante
la infección bacteriana con las mutantes, posiblemente debido a la pérdida de PC o a que algún
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derivado de PC en la bacteria sea reconocido por la célula huésped. Por último, las cepas que carecen
de PC tuvieron bajos niveles de la proteína flagelina, lo que se ha asociado previamente con un déficit
en los fenotipos de la citotoxicidad y la baja adhesión celular (Conover et al., 2008).
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, patógeno oportunista de mamíferos. Un
estudio analizó la importancia de la presencia de fosfatidilcolina (PC) en la bicapa lipídica de P.
aeruginosa. La formación de PC es debida únicamente a la ruta de Pcs y posee únicamente alrededor
del 4% de PC de los fosfolípidos de su membrana. Se reportó que la presencia de este fosfolípido
contribuye a la viabilidad celular bajo condiciones de estrés, en este caso después de almacenarlas a -80
ºC (Wilderman et al., 2002). Sin embargo, la ausencia de PC no afecta los fenotipos de motilidad o
virulencia (Malek et al., 2012).
Pseudomonas putida es una bacteria de interés industrial debido a su potencial de degradación de
compuestos aromáticos y xenobióticos, que presenta la capacidad de colonizar el sistema radicular de
plantas y formar biopelículas. P. putida se cultivaron con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (TTAB)
en la presencia o ausencia de AlCl3 y se analizó la composición de los fosfolípidos. El TTAB es un
agente antiséptico efectivo contra bacterias y hongos. Los resultados mostraron que cuando P. putida,
es cultivada bajo la presencia de TTAB y AlCl3, la cantidad de PC aumenta (tres veces) y al analizar
los extractos celulares estos contienen aproximadamente tres veces más actividad de Pcs a diferencia de
los extractos obtenidos de P. putida cultivada en ausencia de AlCl3, lo que indica que el nivel de PC es
dependiente de la activación de la Pcs y que PC probablemente está involucrado en la respuesta celular
a la unión de Al3+ para permitir una utilización más eficiente de la TTAB por P. putida (Boeris et al.,
2009).
Un estudio realizado sobre la composición fosfolípidica del protozoario tripanosomatido Crithidia
deanei y su endosimbionte (aun sin nombrar), mostró controversialmente que dicho endosimbionte
posee como lípido mayoritario fosfatidilcolina cuando se encuentra dentro de su huésped. Sin embargo,
cuando es crecido luego de 3 horas en vida libre la cantidad de PC se ve reducida dramáticamente,
siendo PE el lípido mayoritario en su membrana. En este estudio se discute sobre evidencia que sugiere
que esta bacteria endosimbiótica puede formar PC a partir de algún precursor obtenido de su huésped,
una hipótesis planteada es que el precursor puede ser colina que a través de la enzima Pcs podría
condensarse con el CDP-DAG presente en la membrana del endosimbionte para formar PC (Azevedo-
Martins et al., 2007).
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JUSTIFICACIÓN
Phosphatidilcolina (PC) es encontrada en cantidades significativas en membranas de diversas
bacterias. Existen dos rutas para la biosíntesis de PC bacteriano, la ruta de la metilación y la ruta de
fosfatidilcolina sintasa (Pcs). En la primera, fosfatidiletanolamina sufre tres metilaciones sucesivas para
formar PC, estas reacciones son catalizadas por una o diversas fosfolípido metiltransferasas; mientras
que en la segunda ruta, la enzima Pcs cataliza la la formación de PC y citidina monofosfato (CMP) a
partir de CDP-DAG y colina. La Pcs es miembro de la superfamilia de las CDP-alcohol
fosfotransferasas, la cual conserva el motivo [DG(X)2AR(X)8G(X)3D(X)3D]. En Pcs este motivo esta
modificado: [DG(X)2AR(X)8P(X)3G(X)3D(X)3D]. Estudios sobre las enzimas colina fosfotransferasa
(Cpt1p) de S. cerevisiae (Williams y McMaster, 1998) y alcohol amino fosfotransferasa (AAPT1) de B.
napus (Qi et al., 2003) se limitaron al análisis de los residuos conservados en el motivo de la
superfamilia, confirmado la importancia de estos residuos para llevar a cabo la biosíntesis de los
fosfolípidos. Entre las secuencias de las Pcs hasta ahora reportadas, existen residuos conservados fuera
del motivo descrito. La mayoría de estos residuos se encuentran localizados entre los primeros 140
residuos de la secuencia de la Pcs sinorhizobial y se predice que se encuentran orientados hacia la
región citoplasmática. Así mismo mediante alineamientos se encontraron residuos que podrían estar
conservados entre las secuencias de todas las CDP-alcohol fosfotransferasas. Lo anterior indica que
probablemente existen residuos fuera del motivo que son importantes para la función de la Pcs e
inclusive podrían ser esenciales para la actividad de las CDP-alcohol fosfotransferasas. Por lo anterior,
en este trabajo se presenta un enfoque donde se analizan los residuos de aminoácidos conservados entre
las Pcs que no se restringen al motivo descrito para las CDP-alcohol fosfotransferasas empleando como
modelo la Pcs de S. meliloti. Este análisis es importante para tener un conocimiento mas amplio de los
residuos implicados en el mecanismo catalítico de la Pcs sinorhizobial. La Pcs de S. meliloti es una
proteína altamente hidrofóbica con 241 aminoácidos, se predice que la Pcs sinorhizobial tiene entre 4 y
8 hélices transmembranales dependiendo de programa empleado. Se pronostica que los algoritmos que
realizan predicciones topológicas, tienen una posibilidad de error mayor o igual al 30 % ya que no se
puede predecir con precisión la existencia de asas reentrantes, que son aquellas que se encuentran
embebidas parcialmente en la membrana sin atravesarla (Elofsson y von Heijne, 2007). Por lo que para
obtener un buen modelo topológico para la Pcs se requiere de datos experimentales. Conocer la
topología de la Pcs es un requisito para estudios estructurales y de función. La topología de una
proteína suele ser empleada como una referencia en el futuro diseño de una estructura tridimensional.
De lo anterior se resume que identificar los residuos de aminoácidos esenciales y la topología de la
membrana de la Pcs de S. meliloti es un paso importante en la comprensión del mecanismo catalítico.
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HIPÓTESIS
Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad de la enzima fosfatidilcolina sintasa (Pcs)
permanecen conservados para la familia de las CDP-alcohol fosfotransferasas y no se restringen a los
residuos presentes en el motivo para esta familia.
OBJETIVOS
1. Identificar cuáles son los residuos de aminoácidos indispensables para la actividad de la enzima
fosfatidilcolina sintasa (Pcs).
2. Determinar la topología de la Pcs.
3. Purificar la Pcs hasta la homogeneidad para permitir estudios estructurales, e identificar
residuos de aminoácidos del sitio activo y de la unión a sus sustratos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
1. Cepas bacterianas y plásmidos.
Las cepas bacterianas y plásmidos usados en el presente trabajo son listadas en la tabla 2.
Las cepas de Escherichia coli BL21(DE3)∙pLysS (Novagen) se crecieron en medio Luria-Bertani (LB)
a 30 ºC (Sambrook et al., 2001, Miller et al., 1992). Las cepas de E. coli CC118 (Manoil et al., 1985)
que contienen los plásmidos pECD636 o pECD637 (Aguilera et al., 2004), se cultivaron a 30 °C en
medio LB antes de la inducción. Dependiendo del o de los plásmidos presentes en las cepas, se añaden
los antibióticos a las siguientes concentraciones: kanamicina 50 μg/mL (Km50), carbenicilina 100
μg/mL (Cb100), cloranfenicol 20 μg/mL (Cm20). Las técnicas de DNA recombinante se realizaron de
acuerdo a protocolos estándar (Sambrook et al., 2001) utilizando E. coli DH5α como cepa hospedera
(Hanahan et al., 1983).
2. Alineamiento de las secuencias de fosfatidilcolina sintasa.
La secuenciade aminoácidos de Pcs de S. meliloti (Clave de acceso AAF27310) se alineó con las
secuencias de Pcs de otros organismos cuya actividad ha sido demostrada: A. tumefaciens C58
(AAK87563), R. leguminosarum bv. viciae 3841 (CAK07860), B. abortus str. 2308 (ZP_05869013),
M. loti MAFF303099 (BAB48080), P. aeruginosa PAO1 (ZP_04930085), L. pneumophila
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(YP_123866), y B. burgdorferi B31 (NP_212383). Este alineamiento se realizó empleando el programa
CLUSTALW (www.expasy.ch).
De la misma manera, se realizó un alineamiento entre las secuencias de aminoácidos de las Pcs
mencionadas con otros miembros de la superfamilia de las CDP-alcohol fosfotransferasas. Para ello se
emplearon las proteínas de fosfatidilserina sintasa (Pss) provenientes de S. meliloti (CAC45701),
Bacillus subtilis (NP_388109), Helicobacter pylori (ADU81255), Agrobacterium sp. 31749
(AAL01116), la arqueol serina sintasa de Methanobacterium thermoautotropicum (Ass; O27106), la
fosfatidilglicerol fosfato sintasa (Pgps) de Rhodobacter sphaeroides (AAC44003), Roseobacter sp.
MED193 (ZP_01057646), A. tumefaciens (AAK86931), Agrobacterium vitis (YP_002549120) y E. coli
(ABG69853), la fosfatidil inositol sintasa (Pis) de Candida tropicalis MYA-3404 (XP_002549758),
Candida albicans (EEQ44990), Pichia pastoris (XP_002491623), Saccharomyces cerevisiae
(AAA34876), colina fosfotransferasa (Cpt1p; CAA96012) y la etanolamina fosfotransferasa (Ept1p;
NP_011991) de S. cerevisiae, la amino alcohol fosfotransferasa de Arabidopsis thaliana (AAPT1;
AEE29034) y la colina/etanolamina fosfotransferasa de Homo sapiens (Cept1; CAI19367).
3. Construcción de mutantes de sitio dirigido.
El gen pcs de S. meliloti se subclonó con los sitios de restricción NdeI/BamHI del vector pTB2559
(Sohlenkamp et al., 2000) en el vector de expresión pET16b (Novagen) generando el plásmido pCI2 el
cual expresa Pcs con una etiqueta de histidinas en la región N-terminal (His-Pcs). Una vez que se
comprobó que la expresión de His-Pcs en E. coli catalizara la formación de PC, el plásmido pCI2 se
utilizó como templado para la mayoría de las reacciones de mutagénesis de sitio dirigido. De manera
adicional, se ocupó el vector pRS01 como templado para la construcción de mutantes donde se
reemplazaron residuos especificos por cisteínas para emplear el método de sustitución y accesibilidad
de cisteínas (SCAM™, Zhang et al., 2005; Bogdanov et al., 2005; Bogdanov et al., 2010) y poder
determinar la orientación en la región N-terminal de la Pcs. Para la construcción del vector pRS01 el
gen pcs de S. meliloti fue amplificado de manera que el gen careciera del codón de paro. Se emplearon
los oligonucleótidos NdeI_Pcs (5′-GAATAAAGCTTTCGCATATGAAGTTCTTCAATTACA
GACGC-3′) y Pcs_BamHI (5′-AAACGGATCCGACGCGGCACGCCCGAGTTTCGGGAAGAT-3′),
y el vector pTB2559 como templado (Sohlenkamp et al., 2000). El producto de PCR se digirió con las
enzimas NdeI y BamHI, y se clonó en los mismos NdeI y BamHI en el plásmido pET22b (Novagen).
Después de mostrar que la Pcs-His es capaz de formar PC, se empleó el plásmido pRS01 como
templado en la reacción de mutagénesis para obtención de tres mutantes de sitio dirigido. Todas las
mutantes se construyeron por medio del kit para mutagénesis Quickchange II (Stratagene). Los oligos
empleados para la mutagénesis se eligieron empleando el programa “Quickchange primer design”
www.expasy.ch
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(Stratagene). Todas las mutaciones se confirmaron por secuenciación tipo Sanger (Eurofins
Medigenomix, Ebersberg, Alemania). Las versiones de Pcs mutadas, se nombraron con el nombre de la
mutación introducida (letra del residuo reemplazado, posición de dicho residuo y letra del residuo que
lo reemplaza).
4. Expresión in vivo de Pcs en E. coli.
E. coli se eligió como huésped heterólogo para la expresión de Pcs, ya que esta bacteria es conocida por
ser capaz de formar el precursor CDP-diacilglicerol como intermediario en la biosíntesis de los
fosfolípidos fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE) y cardiolipina (CL), pero no sintetiza
fosfatidilcolina (PC). Además, E. coli es capaz de importar colina del medio hacia al interior de las
células (Comerci et al., 2006; Wessel et al., 2006; Wang et al., 2004). Se analizó la formación de PC
mediante marcajes de todos los lípidos in vivo con [14C]-acetato, en la cepa de expresión de E. coli
BL21(DE3)∙pLysS la cual contiene el plásmido pCI2, el plásmido pRS01 o sus derivados
mutagenizados. Los fosfolípidos se extrajeron de acuerdo al protocolo establecido por Bligh y Dyer
(1959) y separaron por cromatografía de capa delgada empleando el sistema 1-propanol/ácido
propiónico/cloroformo/agua (3:2:2:1, v/v). Se detectaron las señales de radiactividad mediante el
equipo Storm 820 Phosphorimager (Beckman Coulter). Se cuantificaron las señales de formación de
PC y de los otros fosfolípidos (PE, PG y CL) usando el programa ImageQuant TL (GE Healthcare
LifeSciences). La cantidad relativa de PC en los ensayos in vivo se determinó dividiendo la
radiactividad presente en PC entre la cantidad total de radiactividad presente en PC, PG, PE y CL. Este
análisis permite realizar conclusiones acerca de la funcionalidad de las enzimas codificadas. Los
experimentos se repitieron al menos tres veces.
5. Ensayos in vitro de la actividad de fosfatidilcolina sintasa (Pcs).
5.1. Ensayos in vitro de la actividad de fosfatidilcolina sintasa (Pcs) bajo condiciones de sustrato
saturantes.
Se obtuvieron los extractos crudos a partir de 100 mL de cultivo de E. coli BL21(DE3)∙pLysS que
contiene el plásmido pCI2 o sus derivados mutagenizados y se determinó la concentración de proteína
en los extractos de acuerdo al protocolo establecido por Dulley y Grieve (1975). Se realizaron ensayos
estándar para determinar la actividad de Pcs in vitro bajo condiciones de sustrato saturantes descritas
por de Rudder et al., 1999 (protocolo en la sección 9), para los cuales se empleó [14C]-colina como
sustrato para marcar la PC formada. Los fosfolípidos se extrajeron de acuerdo al protocolo establecido
por Bligh y Dyer (1959) y se separaron por cromatografía de capa delgada (Skipski et al., 1964)
empleando el sistema 1-propanol/ácido propiónico/cloroformo/agua (3:2:2:1, v/v). Se detectaron las
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señales de PC radiactiva mediante el equipo Storm 820 Phosphorimager (Beckman Coulter). Se
cuantificaron las señales de formación de PC usando el programa ImageQuant TL (GE Healthcare
LifeSciences). Posteriormente se determinó la cantidad de PC radioactiva donde la formación de PC de
la Pcs silvestre se considera como el 100%. Los ensayos se repitieron al menos tres veces.
5.2. Ensayos in vitro para el análisis del comportamiento cinético de la Pcs silvestre y de las
mutantes T23S y D81N en extractos crudos.
Se realizaron ensayos in vitro con los extractos crudos de las cepas BL21(DE3)∙pLysS que expresan la
Pcs silvestre y las mutantes T23S y D81N. Los experimentos se llevaron a cabo empleando [14C]-colina
como sustrato y bajo las condiciones de sustrato saturantes anteriormente descritas (de Rudder et al.,
1999), con la variación en las concentraciones de los sustratos colina y CDP-DAG, así como del
cofactor manganeso, se tomarón alicuotas a través del tiempo (durante los primeros 30 minutos de la
reacción). Lo anterior, con la finalidad de calcular los parámetros cinéticos KM y VMAX aparentes de las
mutantes para los sustratos así como para el Mn2+. La concentración de colina se varió en un intervalo
de 8 a 100 μM, para el CDP-DAG de 5 a 343 μM, mientras que para el cofactor Mn2+ la cinética se
midió entre concentraciones de 0 a 100 μM. Los fosfolípidos se extrajeron de acuerdo al protocolo
establecido por Bligh y Dyer (1959) y separaron por cromatografía de capa delgada (Skipski et al.,
1964) empleando el sistema 1-propanol/ácido propiónico/cloroformo/agua (3:2:2:1, v/v). Se detectaron
las señales de PC radiactivas mediante el equipo Storm 820 Phosphorimager (Beckman Coulter). Se
cuantificaron las señalesde formación de PC usando el programa ImageQuant TL (GE Healthcare
LifeSciences). Los ensayos se repitieron tres veces. Se calcularon las velocidades iniciales de
formación de PC a diferentes concentraciones de los sustratos con respecto al tiempo y se empleó el
método gráfico de Eadie-Hofstee para el cálculo de los parámetros KM y VMAX aparentes.
6. Inmunodetección de la Pcs.
6.1. Inmunodetección de la Pcs con colas de histidina (His-Pcs o Pcs-His).
Para excluir que la pérdida de actividad sea causada por la ausencia de proteína, las versiones mutadas
de His-Pcs o bien Pcs-His fueron analizadas por Western blot. Extractos crudos celulares se prepararon
como se describe en la sección 5.1. Alícuotas (100 μg) de cada extracto proteico se mezclaron con la
solución amortiguadora (conocida por su nombre en inglés como buffer) de tratamiento 2× (50 mM
Tris–HCl, pH 6.8, 10% glicerol (v/v), 2% SDS (p/v), 5% 2-mercaptoetanol (v/v), azul de bromofenol al
0.05% (w/v)) y la mezcla se trató a 37 ºC por 30 min. Posteriormente, las proteínas se separaron por
SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nailon (Hybond C-Extra, GE Healthcare
LifeSciences) usando ea solución amortiguadora buffer de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina
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y 20% metanol). Las membranas se bloquearon con 5% (p/v) de leche sin grasa en buffer de Tris-sodio
(TBS) durante una noche, y se lavaron por 30 minutos con TBS conteniendo Tween 20 al 0.05% (p/v)
(TBS-T) (Sigma). Incubaciones con anticuerpo primario y secundario se realizaron en buffer TBS. Se
realizó la incubación con el anticuerpo primario anti-His6 de ratón, diluido 1:1000 (GE Healthcare
LifeSciences) durante 2 horas. La membrana se lavó posteriormente en mismas condiciones del lavado
anterior con PBS-T y se incubó durante 1 hora en la presencia del anticuerpo secundario diluido
1:1000, este anticuerpo es anti-ratón IgG conjugado a peroxidasa de rábano (sheep anti-mouse
horseradish peroxidase conjugated, GE Healthcare LifeSciences). Los experimentos tipo Western blot
se revelaron con tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma).
6.2. Inmunodetección de la Pcs con la proteína de unión a maltosa (MBP-Pcs).
El procedimiento para la detección de la Pcs con fusión a MBP en la región N-terminal es el mismo
que el seguido para la identificación de la Pcs con histidinas, la única diferencia consiste en el
anticuerpo primario el cual es anti-MBP monoclonal (Sigma) de origen murino diluido en una
proporción 1:10,000 e incubado durante 2 horas.
7. Construcción de las fusiones de Pcs–PhoA y Pcs–LacZ.
Un método común para el estudio de la topología de proteínas integrales de membrana consiste en la
construcción de fusiones entre fragmentos de la proteína de estudio (en este caso fosfatidilcolina sintasa
de S. meliloti) y una enzima reportera, cuya actividad depende de su localización. Por ejemplo: la
actividad de la enzima fosfatasa alcalina (PhoA) solo se observa cuando está fusionada a un domino de
la proteína de interes orientado hacia el espacio periplasmático, mientras que los dominios de la
proteína de membrana muestran actividad enzimática de β-galactosidase (LacZ) cuando se encuentran
orientados hacia el domino citoplasmático (Aguilera et al., 2004, Nies et al., 1998). Como un punto
inicial para el análisis de la topología de Pcs, se alinearon los modelos predichos por los programas:
TOPPRED II (Claros y Heijne, 1994), TMHMM 2.0 (Krogh et al., 2001), HMMTOP 2.0 (Tusnady y
Simon, 2001), OCTOPUS (Viklund y Elofsson, 2008), DAS (Cserzo et al., 1997), PHDhtm (Rost et al.,
1996) y SOSUI (Mitaku et al., 1999). Los sitios donde se truncó la proteína Pcs en el extremo C-
terminal para fusionarse a las enzimas reporteras PhoA y LacZ, se eligieron con base en los dominios
periplasmáticos y citoplasmáticos predichos por los diferentes programas. Los fragmentos de DNA de
diferentes longitudes del gen pcs sinorhizobial se amplificaron por PCR (por sus siglas en inglés)
empleando oligos que incorporaron los sitios KpnI y XbaI. Se empleó el mismo oligonucleótido de
sentido directo para todas las reacciones y se denominó M1, mientras que los oligonucleótidos
antisentido fueron distintos en cada reacción (tabla suplementaria 2). Los fragmentos se digirieron con
30
las enzimas KpnI y XbaI y se clonaron en los mismos sitios presentes los vectores pECD636 (que
expresa LacZ) y pECD637 (que expresa PhoA) (Aguilera et al., 2004, Nies et al., 1998). En estos
plásmidos, las fusiones se encuentran bajo el control del promotor RNA polimerasa T7. Las secuencias
de los productos de PCR y los marcos de lectura correctos en los sitios de fusión se confirmaron por el
método de secuenciación tipo Sanger (Eurofins Medigenomix, Ebersberg, Alemania).
8. Procedimientos para la obtención del modelo topológico de Pcs.
8.1. Determinación de actividades de fosfatasa alcalina y actividades β-galactosidasa.
Para medir las actividades de las proteínas reporteras en Pcs–LacZ y Pcs–PhoA, los plásmidos que las
expresan (pECD636 y pECD637) se transformaron a la cepa de E. coli CC118 (deficiente en lacZ y
phoA) (Manoil et al., 1985) con el plásmido pGP1-2 (Tabor et al., 1985). El plásmido pGP1-2 contiene
el gen que codifica para la RNA polimerasa T7 bajo el control del protomotor λPL inducible por calor a
42 ºC. Los cultivos (2 mL) se crecieron a 30 °C y se indujeron a una D.O. de 0.4 leída a 620 nm de
absorbancia (DO620). Las actividades de PhoA y LacZ se midieron bajo los protocolos basados en los
métodos de Brickman y Beckwith (1975) y de Miller (1992), respectivamente. Las actividades de PhoA
y LacZ se determinaron empleando los sustratos cromogenicos p-nitrofenil fosfato y o-nitrofenil-β-D-
galactopiranosido. Las actividades se expresaron en unidades de actividad arbitraria para E. coli,
descritas en ambos métodos (Manoil, 1991) y se normalizaron empleando los valores mas altos
medidos como 100% (Tse et al., 2009; Islam et al., 2010; Jiménez-Mejía et al., 2006). Se calcularon las
aproximaciones de al menos tres ensayos.
8.2. Determinación de la localización de la región N-terminal de Pcs sinorhizobial.
Los datos obtenidos por el método descrito anteriormente, no permitieron determinar la localización de
la región N-terminal de la Pcs. Por lo tanto, se determinó la topología de la región N-terminal de Pcs
por medio del método de sustitución y accesibilidad de cisteínas (SCAM™). En el caso de SCAM™, el
análisis topológico de las proteínas integrales de membrana está basado en la permeabilidad de la
membrana para una molécula marcada derivada de maleimido, la cual es capaz de introducirse hacia el
periplasma pero no hacia el espacio citoplasmático. El reactivo de maleimido unido a dos moléculas de
polietilenglicol y a una biotina (MPB2) (EZ-Link Maleimide-PEG-2-Biotin, Pierce), reacciona
biotinilando los residuos de cisteínas que se encuentran en al espacio periplasmático, y en el caso de las
células lisadas reacciona con todas las cisteínas que se encuentran presentes (Bogdanov et al., 2005;
Bogdanov et al., 2010; Zhang et al., 2005; Zhu et al., 2007). Dado que la Pcs silvestre sinorhizobial, no
contiene residuos de cisteína, no se requirió excluir dichos residuos de la secuencia. Para este estudio se
realizaron tres mutantes en el plásmido pRS01, las mutantes V68C y S155C, cuya orientación se
31
conoce por el método de las fusiones con PhoA y LacZ, y la mutante S18C que se encuentra en la
región N-terminal. Se analizó la formación de PC de las tres mutantes mediante marcajes in vivo con
[14C]-acetato en las cepas de E. coli BL21(DE3).pLysS. Se concluyó que las mutantes tienen una
actividad similar a la de la Pcs silvestre. Posteriormente se empleó el protocolo del método SCAM™
propuesto por Bogdanov et al., 2010, se purificaron las proteínas a través de una columna de níquel en
condiciones desnaturalizantes. Las Pcs biotiniladas se detectaron de manera similar al procedimiento
seguido para la inmunodetección, utilizando unconjugado de la avidina ligada a peroxidasa de rábano
(avidina-HRP; ImmunoPure Avidin, Horseradish, Thermo, PIERCE). El conjugado fue diluido 1:5000
con TBS e incubado durante 2 horas, posteriormente se lavó la membrana durante 30 minutos con
TBS-T. Los Western blot se revelaron con tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma). Se
recopilaron los datos obtenidos y se dibujó el modelo de la estructura secundaria para la Pcs
sinorhizobial por medio del programa TOPO2 (http://www.sacs.ucsf.edu/TOPO2, Johns 2005).
9. Clonación del gene pcs en el vector pMal-c2x.
El gen de pcs de S. meliloti se amplificó por PCR usando los oligos: 5′- GAATATCGAATTCATG
AAGTTCTTCAATTACAGACGC-3′ y 3′-GGGCTTTGAGCCCGCACGGACTTTCGAAGCTAAA-5
y como templado el plásmido pCI2 (pET16b con el gen de pcs). El fragmento amplificado se clonó en
los sitios EcoRI y HindIII del vector pMALc2x resultando en el plásmido pMALc2x-Pcs. Dicho
plásmido se transformó en BL21(DE3)∙pLysS (Novagen).
10. Expresión y purificación del complejo Pcs-MBP.
Para purificar el complejo de las proteínas Pcs-MBP, se realizaron extractos crudos a partir de cultivos
de 500 mL crecidos en medio LB en presencia de Cb100 Cm50 con 0.2 % de glucosa, en condiciones de
30 ºC agitación a 250 revoluciones por minuto (rpm). Se recuperaron las membranas mediante
ultracentrifugación del sobrenadante a 150,000 xg por 1 hora. Las membranas se resuspendieron en
buffer Tris–HCl 20 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM en presencia de 1% Tritón X-100 (p/v),
la membrana resuspendida se ultracentrifugó nuevamente a 150,000 xg durante 1 hora, con la finalidad
de recuperar los complejos de Pcs-MBP que se encuentren solubilizados por el Tritón X-100. El
sobrenadante se pasó por la columna de amilosa para purificar Pcs-MBP, las fracciones se analizaron
por SDS–PAGE e igualmente por Western blot. Se realizaron ensayos estándar para determinar la
actividad de Pcs in vitro bajo condiciones de sustrato saturantes descritas por de Rudder et al., 1999,
para los cuales se empleó [3H]-colina como sustrato para marcar la PC formada. Los fosfolípidos se
extrajeron de acuerdo al protocolo establecido por Bligh y Dyer (1959) y se cuantificaron las señales de
PC radiactiva mediante un contador de centelleo. Los ensayos se repitieron al menos tres veces.
http://www.sacs.ucsf.edu/TOPO2
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33
RESULTADOS
1. Residuos de aminoácidos importantes para la Pcs de Sinorhizobium meliloti.
1.1. Identificación de los residuos de aminoácidos conservados en fosfatidilcolina sintasa (Pcs) de
diferentes organismos.
El gen pcs que codifica para la enzima fosfatidilcolina sintasa (Pcs) de S. meliloti se identificó a través
de mutantes en la cepa IML101 que carecieron de actividad de Pcs (Sohlenkamp et al; 2000). Durante
este escaneo se identificarón siete mutantes deficientes en la formación de fosfatidilcolina (Tabla 3). En
dos de las mutantes se produjeron versiones truncadas de Pcs (CS01 y CS06), en otras dos mutantes
(CS09 y CS10) se presentó el mismo cambio en el residuo de aspartato en la posición 59 por una
asparagina (D59N). Casualmente dicho residuo forma parte del motivo conservado en la familia CDP-
alcohol fosfotransferasa (Qi et al., 2003; Sohlenkamp et al., 2004; Williams y McMaster, 1998).
Finalmente las otras tres mutaciones causaron cambios en residuos de aminoácidos que no se
encuentran dentro del motivo conservado, esto se consideró un indicio de que los residuos importantes
para la función de la enzima Pcs, no solo se encuentran restringidos dentro del motivo conservado para
la familia de las CDP-alcohol fosfotransferasas.
Tabla 3. Mutaciones presentes en el gen pcs deficientes de la actividad de Pcs, aisladas de una población de S.
meliloti IML101 mutagenizada químicamente por Sohlenkamp et al., 2000.
Mutantes del gen pcs deficientes de la actividad de Pcs, aisladas de una
población de S. meliloti IML101 mutagenizada químicamente.
Mutantes deficientes de actividad de Pcs Mutación
CS01 Codón de paro en W75
CS02 G229D
CS03 L72R
CS06 Codón de paro en W213
CS07 G77D
CS09 D59N
CS10 D59N
Por lo anterior, en el presente trabajo se realizó el alineamiento entre las secuencias de las enzimas de
Pcs de las cuales se identificaron los residuos conservados (figura 6). Se identificaron 60 residuos de
aminoácidos conservados incluyendo los presentes en el motivo descrito para la familia de las CDP-
alcohol fosfotransferasas. Alineamientos entre todos los miembros de la de la familia de las CDP-
alcohol fosfotransferasas y las secuencias de Pcs, muestran que un residuo de treonina (residuos T23 en
la secuencia de Pcs) se encuentra conservado hacia la región N-terminal, a excepción del caso de la
34
arqueol serina sintasa de Methanobacterium thermoautotrophicum donde se alinea una serina en lugar
de treonina (figura 7). Dichos alineamientos entre las secuencias de las CDP-alcohol fosfotransferasas
también revelaron que todos los miembros de la familia presentan el motivo DGX2ARX8GX3DX3D a
excepción de las secuencias de Pcs que presentan 12 residuos de aminoácidos entre la arginina y la
glicina en lugar de 8 (DGX2ARX12GX3DX3D) (figura 8). Curiosamente se encontró que en todos los
miembros de la familia de las CDP-alcohol fosfotransferasas incluyendo Pcs existe un residuo de
aspartato conservado fuera del motivo descrito, el cual se encuentra dos residuos corriente arriba de
donde inicia el motivo. Este aspartato hasta ahora ha sido excluido en los estudios previos sobre las
proteínas pertenecientes a esta familia (Qi et al., 2003; Sohlenkamp et al., 2004; Williams y McMaster,
1998), por lo que se propone en este trabajo que este residuo sea incluido dentro del motivo siendo
DX2DGX2ARX8GX3DX3D para las CDP-alcohol fosfotransferasas y para Pcs
DX2DGX2ARX12GX3DX3D. Al observar el alineamiento entre las secuencias de Pcs con las secuencias
pertenecientes a fosfatidilserina sintasa de diversos organismos y la de la arqueol serina sintasa de M.
thermoautotrophicum, se pudo observar que en todos los casos se encuentra una prolina conservada 8
residuos corriente abajo del motivo conservado, no siendo así para los demás miembros de la familia de
CDP-alcohol fosfotransferasa.
35
Figura 6. Identificación de los residuos de aminoácidos conservados entre las fosfatidilcolina sintasas cuya
función ha sido demostrada. Las secuencias de Pcs de S. meliloti 1021 (AAF27310), A. tumefaciens C58
(AF410774), R. leguminosarum bv. viciae cepa 3841 (CAK07860), B. abortus 2308 (BA20693), M. loti
MAFF303099 (BAB48080), P. aeruginosa PAO1 (PA3857), L. pneumophila (YP_123866) y B. burgdorferi
B31 (BB0249), se alinearon empleando el programa CLUSTALW. Residuos idénticos son marcados en negro y
los residuos similares son marcados en gris. Los residuos de aminoácidos del motivo conservado para la
superfamilia de las CDP-alcohol fosfotransferasas (DGX2ARX12GX3DX3D) son marcados por asteriscos (*). Los
residuos conservados seleccionados para reemplazarse por mutagénesis de sitio dirigido son indicados por
cabezas de flecha (▼) y numerados.
36
Figura 7. Alineamiento de la región N-terminal de las secuencias de aminoácidos de las enzimas Pcs con otros
miembros de la superfamilia de las CDP-alcohol fosfotransferasas donde se representa un residuo de carácter
hidroxilado (serina o treonina) marcado por asteriscos (*). Los residuos idénticos son marcados de negro y los
residuos similares son marcados de gris. El programa empleado fue CLUSTALW. Los residuos conservados en
las secuencias de Pcs, reemplazados por mutagénesis de sitio dirigido son indicados por cabezas de flecha (▼) y
numerados.
37
Figura 8. Alineamiento parcial de las secuencias de aminoácidos de las enzimas Pcs con otros miembros de la
superfamilia de la CDP-alcohol fosfotransferasas donde se representa el motivo conservado. Los residuos
idénticos son marcados de negro y los residuos similares son marcados de gris. Los residuos de aminoácidos del
motivo conservado para la superfamilia de las CDP-alcoholfosfotransferasas (DGX2ARX12GX3DX3D) son
marcados por asteriscos (*). El residuo de aspartato conservado que se propone debe incluirse en el motivo se
marca con una cabeza de flecha (˅). El programa empleado fue CLUSTALW.
1.2. Residuos de aminoácidos importantes para la actividad in vivo de la Pcs de Sinorhizobium
meliloti.
Se identificaron 60 residuos de aminoácidos conservados entre las secuencias de las Pcs, de los cuales
30 residuos son idénticos incluyendo los pertenecientes al motivo de la familia de las CDP-alcohol
fosfotransferasas y los otros 30 tuvieron similitud. Se realizaron 55 mutantes de sitio dirigido sobre los
residuos identificados como conservados. Las mutantes se construyeron empleando como templado el
plásmido pCI2 que contiene la Pcs sinorhizobial. Los aminoácidos conservados se cambiaron a alanina,
con excepción de los residuos de alanina que se mutaron a glicina.
Las mutantes sitio dirigido de Pcs se expresaron in vivo heterólogamente en E. coli BL21(DE3).pLysS,
ya que esta bacteria carece de PC. Los lípidos se marcaron con [14C]-acetato, se extrajeron y se
38
separaron mediante cromatografía de capa delgada. Se midió el porcentaje de formación de
fosfatidilcolina (PC) con respecto a los lípidos totales, dicho porcentaje se comparó considerando la
formación de PC de la Pcs silvestre como 100%. Se analizaron mutantes de sitio dirigido sobre 55
residuos conservados. El análisis mostró que 23 mutantes tuvieron un nivel de formación de PC similar
a la Pcs silvestre, otras 23 mutantes causaron una disminución en la formación de PC de entre 20 y
80%. De las nueve mutantes restantes de E. coli, siete no formaron PC: H20A, T23A, D56A, D59A,
G60A, D81A y D85A, mientras que dos de ellas: G77A y Y123A mostraron una disminución de mas
del 80% en la cantidad de PC formada en comparación con los niveles formados por la cepa que
expresa la Pcs silvestre (Figura 9).
Entre las proteínas de Pcs mutantes no funcionales, en cuatro (D59A, G60A, D81A y D85A) el residuo
mutagenizado se encontró dentro de los residuos pertenecientes descritos para motivo conservado de la
familia de las CDP-alcohol fosfotransferasas. Ademas, se identificaron cinco residuos no incluidos en
el motivo cuya mutación causa la pérdida de actividad de Pcs, los cuales son: el residuo de D56
localizado a una distancia de dos residuos corriente arriba, propuesto para ser incluido dentro del
motivo; el residuo de T23 cercano al extremo N-terminal de la Pcs el cual se mencionó anteriormente
permanece conservado al alinearse en todos los miembros de la familia CDP-alcohol fosfotransferasa;
el residuo de H20 y la Y123 los cuales únicamente permanecen conservados entre las secuencias de
Pcs. Para mostrar que la ausencia en la formación de PC no se debe a la inestabilidad de la enzima Pcs
mutante, se analizó mediante Western blot la presencia de la Pcs silvestre y sus versiones mutadas en
los extractos crudos de E. coli (Figura 10). La cantidad de PC formada se normalizó con la cantidad de
proteína presente. La formación de PC en las proteínas mutadas en comparación con la proteína
presente es detectada en cantidades similares a la de la Pcs silvestre en todos los casos excepto en la
mutante Y123A, donde la pérdida de actividad corresponde a la disminución de proteína presente
(Tabla 4). Los residuos de aminoácidos H20, T23, D56, D59, D81 y D85 fueron identificados como
probablemente esenciales para la actividad de Pcs, y se eligieron para ser reemplazados por
aminoácidos con características que permitan evaluar el efecto del tamaño o la carga.
39
Figura 9. Actividades de las mutantes de Pcs sinorhizobial expresadas en porcentaje relativo. La formación de
PC de la Pcs silvestre (WT) es designada como 100%. Las barras de error representan la desviación estándar de
al menos tres experimentos independientes. Las versiones mutantes de Pcs fueron agrupadas en tres clases: las
que presentan más de 80% de PC ( ), las que tienen entre 20 y 80% ( ), y las que poseen menos del 20% de
la actividad en comparación a la Pcs silvestre ( ). El color indica la clase en que se agruparon las versiones
mutadas.
Figura 10. Detección por Western blot de His-Pcs silvestre (WT) y sus versiones mutadas. Se emplearon como
muestras los extractos crudos de E. coli que expresa la Pcs silvestre o sus versiones mutadas. El control negativo
(C-) es el extracto de E. coli carente de la enzima Pcs. El marcador del peso molecular (M.M) indicado coincide
con el tamaño del complejo (His-Pcs).
40
Tabla 4. Actividad normalizada del porcentaje de formación de PC con respecto a la fracción de proteína
detectada en la cepa Pcs silvestre y sus versiones mutantes.
Los cuatro residuos de aspartato se cambiaron a asparagina generando un cambio de carga a positiva, al
igual se cambiaron a residuos de glutamato los cuales poseen un grupo metileno extra con respecto al
aspartato. La actividad de la Pcs no pudo ser detectada cuando los residuos de aspartato en las
posiciones 56, 59 y 85 se mutaron ya sea a asparagina o a glutamato. Solo en el caso de las mutantes
D81N y D81E se detecto poca cantidad de PC (Figura 11). El residuo conservado de histidina en la
posición 20 (H20) se sustituyó por leucina de carácter inerte, con similitud a la histidina por su tamaño.
La mutante H20L mostró 32% en la formación de PC con respecto a la proteína silvestre.
El residuo T23 se cambió a serina, otro aminoácido hidroxilado cuya diferencia es un grupo metileno
menos que la treonina, lo que le confiere un carácter más polar. La mutante T23S mostró 63% en la
formación de PC con respecto a la Pcs silvestre.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
WT H20L T23S D56N D56E D59N D59E D81N D81E D85N D85E
%
 d
e 
fo
rm
ac
ió
n 
de
 P
C
Figura 11. Actividades de las mutantes de Pcs sinorhizobial expresadas en porcentaje. La formación de PC de la
Pcs silvestre (WT) es designada como 100%. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos
tres experimentos independientes.
41
1.3. Ensayos enzimáticos in vitro sobre los residuos de aminoácidos identificados como
importantes para la actividad de la Pcs de S. meliloti.
En el apartado anterior se identificaron 15 mutantes de Pcs expresadas en E. coli con actividad in vivo
menor al 50% en comparación con la Pcs silvestre. La actividad reducida de Pcs se puede deber a la
disminución a la afinidad por uno de sus sustratos. Algunos de ellos podrían exhibir una mayor
actividad en el ensayo in vitro a concentraciones de sustrato saturantes (de Rudder et al., 1999). Por lo
tanto, se analizaron las mutantes comparando su porcentaje de formación de PC con el de la Pcs
silvestre, bajo las condiciones descritas para ensayos in vitro para la Pcs en condiciones de exceso de
sustrato (de Rudder et al., 1999).
El comportamiento de las versiones mutadas Pcs se divide en tres grupos diferentes: aquellos que
muestran actividades relativas similares tanto in vivo como in vitro T23A, T23S, D56N, D56E, D59N,
D59E, G60A, L72A, V83A, D85N, y D85E (Figura 12). Las mutantes Y86A, Y89A y W142A
muestran actividad in vivo, pero bajo condiciones in vitro carecen de actividad. En el tercer grupo se
incluyen las mutantes H20L, R64A, L80A, D81N, y D81E las cuales muestran mayor actividad de Pcs
bajo condiciones in vitro que las observadas in vivo. Una posible explicación al comportamiento de este
último grupo es que bajo condiciones in vitro la concentración de los sustratos y del cofactor se ven
incrementadas.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
W
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H
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L
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 P
C
in vitro
in vivo
Figura 12. Porcentajes de actividad in vitro e in vivo, de la Pcs silvestre y sus mutantes. Las barras de error
representan las desviaciones estándar de al menos tres ensayos.
42
1.4. Análisis del comportamiento