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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS OBTENCIÓN DE DOS PROTEÍNAS SINTÉTICAS CONFORMADAS POR DOS Y TRES MÓDULOS VARIABLES DE ANQUIRINA MEDIANTE UN DISEÑO POR CONSENSO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : KARLA DANIELA RODRÍGUEZ BASURTO DIRECTORA DE TESIS: DRA. ITZHEL GARCÍA TORRES COTUTORA: DRA. GLORIA HERNÁNDEZ ALCÁNTARA Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ii Hoja de Datos del Jurado 1. Datos del alumno Rodríguez Basurto Karla Daniela 56190365 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 311013247 2. Datos del tutor Dra. Itzhel García Torres Dra. Gloria Hernández Alcántara 3. Datos del Sinodal 1 Dr. Arturo Carlos II Becerra Bracho 4. Datos del Sinodal 2 Dra. Laura Kawasaki Watanabe 5. Datos del Sinodal 3 Dr. Sergio Enríquez Flores 6. Datos del trabajo escrito Obtención de dos proteínas sintéticas conformadas por dos y tres módulos variables de anquirina mediante un diseño por consenso. 77 p. 2018 iii Agradecimientos académicos Esta tesis se realizó bajo la dirección de la Dra. Itzhel García Torres en el grupo de estudio de Biomoléculas y Salud Infantil del Laboratorio de Errores Innatos del Metabolismo y Tamiz del Instituto Nacional de Pediatría. Así mismo, la Dra. Gloria Hernández Alcántara del Laboratorio de Péptidos y Proteínas del departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina, UNAM fungió como co-tutora. Esta tesis forma parte del proyecto titulado “Desarrollo de una biblioteca de proteínas de alta afinidad que reconozcan blancos biológicos para el diagnóstico oportuno de enfermedades de relevancia en salud pública”, apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT, México) con número de registro 221583, y por Recursos Federales del Instituto Nacional de Pediatría con número de registro 053/2014. Así mismo, para la elaboración del proyecto sustentado en la presente tesis se recibió apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPPIT) de la UNAM, con número de proyecto IA204816 En la última etapa de la elaboración de este trabajo de tesis se contó con una beca de licenciatura otorgada por CONACyT con número de registro 26648. iv Dedicatoria A mi mamá y mi hermana por darme su apoyo incondicional. A mi papá por haber sido un gran ejemplo de honradez y perseverancia. A mi tía Rosa y mi tío Ale por estar presentes en cada momento. v Tabla de contenido ABREVIATURAS ................................................................ .................................... 1 ................................................................ .............................................. 2 1.1 Anquirinas: una familia de proteínas repetitivas .................................. 3 1.2 Características estructurales de las repeticiones de anquirina ........... 5 1.3 Proteínas diseñadas a partir de repeticiones de anquirina. ............... 10 1.4 Anquirinas diseñadas como herramientas de diagnóstico y terapia 13 1.5 Anquirinas sintéticas para la co-cristalización de otras proteínas ... 17 2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 18 3. OBJETIVOS ................................................................................................... 19 3.1 Objetivo general ..................................................................................... 19 3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 19 4. METODOLOGÍA ............................................................................................. 20 4.1 Consenso de secuencias de anquirinas reportadas en el PDB y diseño de D2 y D3 ............................................................................................ 20 4.2 Diseño del gen sintético D5 .................................................................. 22 4.3 Obtención de D2 y D3 a partir del gen sintético D5 ............................ 23 4.4 Subclonación de D2 y D3 en el plásmido de expresión pET-3a HisTEV .............................................................................................................. 28 4.5 Secuenciación de D2 y D3 ..................................................................... 29 4.6 Sobreexpresión de D2 y D3 en cepas de E. coli .................................. 29 4.7 Evaluación de la sobreexpresión y pureza de las proteínas D2 y D3 31 4.8 Purificación de D2 y D3 ......................................................................... 32 4.9 Determinación de la concentración de D2 y D3 .................................. 33 4.10 Digestión de D2 y D3 con la proteasa del virus del tabaco (TEVp) ... 34 4.11 Determinación de la estructura secundaria de D2 y D3 mediante dicroísmo circular ............................................................................................ 35 4.12 Evaluación de la estabilidad térmica de D2 y D3 mediante dicroísmo circular………. .................................................................................................. 36 5. RESULTADOS ............................................................................................... 36 5.1 Obtención de las secuencias de DNA codificantes para D2 y D3 a partir del gen sintético D5 ............................................................................... 36 5.2 Subclonación de las secuencias que codifican para D2 y D3 en un plásmido de sobrexpresión pET-3a HisTEV .................................................. 39 5.3 Secuenciación por el método de Sanger de D2 y D3 .......................... 41 RESUMEN Javier Texto escrito a máquina Javier Texto escrito a máquina INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................3 Javier Texto escrito a máquina vi 5.4 Sobreexpresión de D2 y D3 en diferentes cepas de E. coli. ............... 49 5.5 Purificación mediante el método IMAC ................................................ 53 5.6 Estructura secundaria de D2 y D3 ........................................................ 54 5.7 Estabilidad térmica de D2 y D3 ............................................................. 56 6. DISCUSIÓN .................................................................................................... 58 7. CONCLUSIÓN ................................................................................................ 65 8. PERSPECTIVAS ............................................................................................ 65 9. REFERENCIAS .............................................................................................. 66 10. ANEXOS ........................................................................................................ 741 ABREVIATURAS DMSO - Dimetilsulfóxido ADN – Ácido desoxirribonucléico DTT - Ditiotreitol EDTA - Ácido etilendiaminotetraacético EP-PCR - Reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores Her2 - Receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano IgE – Inmunoglobulina E IPTG- Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido LB- Luria-Bertani KCl – Cloruro de potasio kDa - Kilodaltones KH2PO4 - Fosfato de potasio monobásico NaCl – Cloruro de sodio PCR – Reacción en cadena de la polimerasa PMSF - Fluoruro de fenilmetilsulfonilo SDS - Dodecilsulfato sódico Tris - Tris(hidroximetil)aminometano UV– Ultravioleta V – Voltios 2 RESUMEN Las anquirinas diseñadas, son proteínas basadas en uno de los tipos de proteínas más abundantes en la naturaleza: presentan en su secuencia motivos repetitivos de alrededor de 33 aminoácidos, de los cuales siete son variables; dichos motivos presentan cubiertas en sus extremos amino y carboxilo terminal las cuales contribuyen a la estabilidad y solubilidad de la proteína. Se considera que estas proteínas se encuentran, al menos, virtualmente en todas las especies e incluso en agentes virales. Son de especial importancia ya que tienen la función específica de mediar interacciones proteína-proteína, esenciales para llevar a cabo de manera correcta diferentes procesos biológicos. Se han realizado diversos trabajos con el propósito de obtener de forma sintética este tipo de proteínas y utilizarlas como herramientas de diagnóstico, tratamiento e investigación, siendo una posible alternativa al uso de anticuerpos ya que involucra menor tiempo de producción y menor costo. Este trabajo se basó en la utilización de una secuencia consenso de anquirinas sintéticas depositadas en la base de datos del Protein Data Bank (PDB), hasta agosto 2016. Para lo cual, se tomaron en cuenta aquellas proteínas que presentaran ambas cubiertas y cuyos motivos repetitivos presentaran la secuencia más común entre las anquirinas; se identificaron los aminoácidos con mayor frecuencia en las siete posiciones variables, dichos aminoácidos se incorporaron en las secuencias codificantes para dos proteínas con dos y tres módulos de anquirina, respectivamente. Con base en lo anterior, se sintetizó un gen en el que se incluyeron ambas secuencias, flanqueadas con sitios de restricción con la finalidad de obtener de manera independiente cada secuencia. Posteriormente, estas secuencias se clonaron de manera independiente en el plásmido de expresión pET-3a HisTEV. Con las clonas seleccionadas y confirmado el correspondiente gen por secuenciación, se realizaron pruebas de sobreexpresión en diferentes cepas de Escherichia coli. Así mismo, ambas proteínas fueron purificadas a homogeneidad mediante cromatografía de afinidad y se analizó la pureza de las proteínas. Finalmente, mediante dicroísmo circular se determinó su estructura secundaria y se evaluó la temperatura media de desnaturalización. Como resultado de este trabajo se obtuvieron dos anquirinas sintéticas bajo un nuevo diseño por consenso, las cuales se expresan en forma soluble bajo condiciones fisiológicas, presentan una estructura secundaria típica de este tipo de proteínas y tiene alta estabilidad térmica. 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Anquirinas: una familia de proteínas repetitivas A partir de los trabajos realizados, principalmente, por Vann Bennett (Bennett y Stenbuck, 1979) se purificó y caracterizó una proteína de carácter hidrofóbico que fue denominada anquirina (del griego ankyra -ancla-), dicha proteína se localizó en el citoplasma de los eritrocitos humanos y se observó que era responsable de una asociación de gran afinidad entre la proteína espectrina (componente mayoritario del citoesqueleto del eritrocito) y la superficie interna de la membrana celular, cumpliendo así una función estructural esencial. Posteriormente, se observó que proteínas parecidas a anquirinas (ankyrin-like molecules) también estaban presentes en células no eritroides, así como en diversos tejidos, tales como el cerebro, riñón, músculo estriado y músculo cardiaco, de otros mamíferos y aves (Bennet y Davis, 1981; Lambert et al., 1990; Moon et al., 1985). En 1987, Breeden y Nasmyth se percataron que, en algunas de las proteínas codificadas por levaduras, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans se podía encontrar la misma secuencia repetitiva de aproximadamente 33 residuos de aminoácidos (Michaely y Benett, 1992; Sedgwick y Smerdon, 1999). Tres años más tarde, Lambert y colaboradores (1990) aislaron de una serie de clonas obtenidas a partir de una biblioteca de cDNA de reticulocitos, el cDNA de la anquirina con el fin de analizar su secuencia de aminoácidos; se reportaron 23 unidades repetitivas, cada una conformada por 33 aminoácidos, el alineamiento de la secuencia de cada unidad permitió identificar 18 residuos de aminoácidos altamente conservados. Un análisis somero de la estructura secundaria de la anquirina sugería que se trataba de una proteína globular, lo cual concordaba con el trabajo realizado en 1987 por Bennet y Hall. Los reportes antes mencionados, en conjunto con el descubrimiento previo de que proteínas parecidas a la anquirina se pueden encontrar en distintos tipos celulares 4 y tisulares de vertebrados, indicaba la posibilidad de que este tipo de proteínas estuvieran codificadas por un gen ancestral común de diferentes organismos y, por tanto, que estuviera ampliamente distribuida entre las especies (Lambert et al., 1990). Lo anterior, se consolidó por una serie de trabajos realizados en años posteriores en los cuales se encontraron una gran variedad de proteínas, en distintos phyla, constituidas por unidades repetitivas, conformadas por el mismo motivo conservado de 33 aminoácidos que se había observado en la anquirina de los eritrocitos (Michaely y Bennett, 1992; Bork, 1993); incluso se comenzaron a reportar diversas proteínas virales con este motivo. Además, dentro de dicho motivo, se encontraron algunas posiciones específicas en donde podía encontrarse casi cualquier residuo de aminoácido (Michaely y Bennett, 1992; Bork, 1993; Sedgwick y Smerdon, 1999), las cuales se denominaron “posiciones variables” y que, como se confirmaría más adelante, tienen gran importancia para la unión a sus blancos. Otras particularidades en estas proteínas es que el número de unidades repetitivas es variable, desde dos hasta más de veinte (Sedgwick y Smerdon, 1999; Kohl et al., 2003). Pocas son las proteínas con una sola repetición (Mosavi et al. 2004), y mayoritariamente se han encontrado con dos a seis repeticiones. El motivo conservado de las anquirinas fue llamado por algunos investigadores como repeticiones de anquirina o repeticiones ANK (Michaely y Bennett, 1992; Sedgwick y Smerdon, 1999). Las investigaciones hechas hasta ese momento indicaban que aquellas proteínas con repeticiones de anquirina, llamadas también proteínas AR (Kohl et al., 2003; Mosavi, Minor y Peng, 2002), tenían como función principal el reconocimiento específico de proteínas blanco, así como llevar a cabo interacciones entre proteínas (Bork, 1993; Davis y Bennett, 1990; Michaely y Bennett, 1992). También se observó que diferentes repeticiones de anquirina encontradas en la misma proteína podían interactuar con distintos blancos (Davis y Bennett, 1990; Michaely y Bennett, 1992), ello hace que puedan actuar como 5 proteínas de andamiaje o scaffolds, los cuales son importantes para el funcionamiento y evolución de las vías de señalización (Mosavi et al., 2004). El constante estudio de estas proteínas ha derivado en el descubrimiento de más de 20 familias de proteínas que contienen unidades repetitivas especializadas en mediar interacciones proteína-proteína. De entre las familias de proteínas repetitivas que se encuentran en lanaturaleza, podemos mencionar a las repeticiones ricas en leucina (LRR), repeticiones armadillo (ARM) y repeticiones de tetratricopéptidos (TPR); sin embargo, la familia de proteínas con repeticiones de anquirina es una de las más abundantes en la naturaleza tan solo después de las inmunoglobulinas (Forrer et al., 2003; Li et al., 2006) y, por consiguiente, una de las más comunes entre los phyla. Según estudios filogenéticos, las anquirinas se encuentran mayoritariamente en organismos eucariontes y se cree que debido a múltiples eventos de transferencia horizontal de genes es posible encontrarlas en procariontes y virus (Andrade, 2001; Mosavi et al., 2004). Estas proteínas se han hallado en ambientes diversos, por ejemplo, la superficie interna de la membrana plasmática, el núcleo, el citosol e incluso en el espacio extracelular (Kohl et al., 2003; Michaely y Bennett, 1992). Además, su función en la naturaleza también es variada, pueden participar como receptores, canales iónicos, factores de transcripción, inhibidores o activadores de tumores o intermediarios en procesos de transducción de señales (son especialmente importantes en el inicio y el desarrollo de la respuesta inmune) (Mosavi et al., 2004; Voroin et al., 2008). De hecho, de entre todas las funciones posibles reportadas para estas proteínas la actividad enzimática es la única con la que no se han asociado hasta ahora. 1.2 Características estructurales de las repeticiones de anquirina Michaely y Bennett propusieron en 1992, uno de los primeros modelos de la estructura terciaria de las repeticiones de anquirina, predijeron que una sola repetición se conformaba por dos hélices alfa, seguidas por un asa y una beta- 6 plegada corta. De acuerdo con este modelo, la serie de repeticiones se debía encontrar empaquetada para aportar estabilidad a la proteína (Bork, 1993; Michaely y Bennett, 1992). No fue sino hasta 1996 cuando se logró determinar, por difracción de rayos X, la primera estructura terciaria de una proteína con repeticiones ANK (Gorina y Pavletich, 1996). Dicha estructura, así como las que se determinaron posteriormente, indicaban que las repeticiones se conformaban por pares de hélices-α antiparalelas, apiladas por los lados y conectadas por medio de giros-β, también antiparalelos (Sedgwick y Smerdon, 1999). Los residuos de aminoácidos hidrofóbicos, asociados a las hélices- α, se exponen hacia la superficie externa de tal manera que son las interacciones no polares las que median la unión entre las repeticiones. Además de ello, existen otros residuos altamente conservados que pueden formar puentes de hidrógeno entre las repeticiones adyacentes otorgándole estabilidad a todo el conjunto (Fig. 1a) (Andrade, Perez y Ponting, 2001; Sedgwick y Smerdon, 1999). Figura 1. Representación en listones de tres repeticiones de anquirinas pertenecientes a la primera proteína ANK cristalizada por difracción de rayos X (PDB: 1YSC), modificada con PyMOL. (a) Interacciones polares inter e intracadena de las repeticiones ANK (negro), residuos conservados que ayudan a estabilizar el conjunto (magenta). (b) Vista lateral de tres repeticiones de anquirina donde se observa la diferencia de longitud entre ambas hélices-α, la proyección del giro-β que les da forma de L, y la unión de un asa (posiciones 31-33) con el giro-β de la repetición adyacente (verde claro) (Sedgwick y Smerdon, 1999). 7 Sedgwick y Smerdon consideraron la estructura del motivo ANK como: giro β- hélice-asa-hélice. La segunda hélice- α es más larga que la primera ya que posee dos residuos de aminoácidos más. Una repetición se une con el giro-β de la siguiente por medio de una pequeña asa que se encuentra después de la segunda hélice- α, es decir, las posiciones 31-33 se conectan con las posiciones 1-3 de la siguiente repetición, dicho giro-β forma un ángulo aproximado de 90° con respecto a la α-hélice, por lo cual se considera que una repetición de anquirina tiene una forma de L (Fig. 1b). Estructuralmente, los residuos conservados aportan la formación y la estabilidad de cada una de las unidades repetitivas; aunque también se ha encontrado que la estabilidad en proteínas AR puede variar según los residuos que se encuentren en las posiciones variables, mientras que otros son importantes para el reconocimiento y la unión a moléculas blanco (Sedgwick y Smerdon, 1999) siendo, por lo general, los residuos encontrados en las posiciones variables (Moody et al., 2014). Por ejemplo, entre los giros β de repeticiones adyacentes se forman puentes de hidrógeno gracias al ácido aspártico que se encuentra al inicio del motivo, a la glicina de la posición 4 y a residuos hidrofílicos de las posiciones 3 y 5, que son variables (Fig. 2a) (Kohl et al., 2003; Sedgwick y Smerdon, 1999). Los residuos TPLH, ubicados en las posiciones 6-9, altamente conservados en estas proteínas, forman parte del giro-β y dan inicio a la primer hélice-α de la repetición; la treonina forma puentes de hidrógeno con el residuo de histidina, mientras que la prolina da inicio a la hélice y la leucina forma una interacción hidrofóbica hacia el interior de la hélice antiparalela de la misma repetición (Fig. 2b) (Kohl et al., 2003). Las alaninas que se encuentran en las posiciones 11 y 12 permiten, debido a su tamaño pequeño, que una repetición presente forma cónica, es decir, amplia en la parte superior y más estrecha hacia la parte inferior (Fig. 2c) (Binz et al., 2003); además de ello cerca del asa que conecta a ambas α-hélices se encuentran residuos de aminoácidos lo suficientemente grandes como para hacer a las 8 repeticiones mantener una distancia entre ellas de tal forma que el resto de los residuos no impiden la potencial interacción de otros con un blanco (Binz et al., 2003). Figura 2. Representación en listones de una proteína sintética con módulos de anquirina (PDB: 1JM0), modificada con PyMOL. (a) Representación en varas de los residuos conservados Asp y Gly y los residuos variables (verde) que establecen puentes de hidrógeno (negro) entre los giros β de cada repetición. (b) Ubicación del motivo conservado ThrProLeuHis en una repetición de anquirina (naranja), representado en varas se encuentran los residuos treonina e histidina que establecen puentes de hidrógeno que forman y estabilizan la estructura de la primer hélice-α. (c) Representación en varas (púrpura) de los residuos de aminoácidos que le dan forma cónica a cada repetición ANK. 9 Mosavi et al. (2004) señalan que las repeticiones dan como resultado una estructura ligeramente curvada como consecuencia de las interacciones entre los diferentes residuos en la posición 10, que deben tener una cadena lateral pequeña que permite que las hélices cortas estén más juntas, mientras que las hélices largas se encuentran más separadas entre sí debido a las posiciones 17 y 18 que presentan residuos de aminoácidos con cadenas laterales más grandes (Fig. 3a y 3b). En cuanto a la masa molecular, se ha determinado que un módulo o repetición tiene una masa de alrededor de 3.5 kDa, ya que la mayoría de las anquirinas encontradas en la naturaleza se compone de dos a seis repeticiones, su masa varía entre 14 y 21 kDa (Stumpp et al., 2008). Los trabajos realizados con dichas proteínas indican que no existe un elemento particular de la estructura que siempre esté participando en la interacción con Figura 3. Región D34 de la anquirina humana (PDB:1N11), modificada con PyMOL. (a) Representación en trazo de tres módulos, en varas anaranjadas se encuentran los residuos de aminoácidos con cadenas laterales pequeñas ubicados en la posición 10 de cada módulo y en varas púrpuras los residuos de aminoácidos con cadenas laterales grandes ubicados en las posiciones 17 y 18 de cada módulo. (b) Representación en listones de 11 módulos ANK que muestranla estructura curvada como resultado de las interacciones entre los residuos de las posiciones 10, 17 y 18 de cada repetición. 10 otras proteínas (Sedgwick y Smerdon, 1999), de igual manera tampoco hay un motivo estructural o una secuencia que sea reconocida de manera genérica por las repeticiones AR (Mosavi, Minor y Peng, 2002). Por otro lado, las repeticiones pueden presentarse como una proteína de un solo dominio o junto con varios dominios en la misma proteína (Mosavi et al., 2004). 1.3 Proteínas diseñadas a partir de repeticiones de anquirina. El diseño de proteínas permite mejorar diversas propiedades biofísicas de éstas, es por ello que el diseño de proteínas AR puede derivar en moléculas de unión con potencial aplicación en los campos biotecnológico, biomédico y de investigación. Mosavi y colaboradores realizaron, en 2002, el primer ejercicio de diseño de proteínas AR (Mosavi, Minor y Peng, 2002). Mediante un análisis estadístico de las secuencias ya existentes se tomó como base la frecuencia de los 33 residuos de aminoácidos en ellas para el diseño del motivo; los residuos de aminoácidos altamente conservados permanecieron invariables, mientras que los restantes fueron integrados según la naturaleza con los aminoácidos que más frecuentemente se encontraban en determinadas posiciones. Una vez hecho el consenso, sintetizaron proteínas compuestas de una hasta cuatro repeticiones idénticas de anquirina. Aquéllas de un módulo resultaron ser poco estables, mientras que las de dos a cuatro módulos fueron solubles, termoestables y con un plegamiento correcto que resultó en una estructura casi idéntica a la encontrada en la naturaleza. Casi a la par del trabajo antes mencionado, se publicaron otros en el 2003, en donde también se realizó el diseño de proteínas AR con el fin de crear una biblioteca de proteínas de unión (Kohl et al., 2003, Binz et al., 2003). En ambos trabajos la secuencia de 33 residuos de aminoácidos se obtuvo analizando diferentes bases de datos y se utilizaron cubiertas N-terminal y C-terminal para proteger las repeticiones en un medio soluble y así darles mayor estabilidad. Kohl 11 y colaboradores generaron las secuencias y las estructuras de proteínas AR tomando como base las interacciones hidrofóbicas y los puentes de hidrógeno en los que cada residuo de aminoácido interviene; de esta forma, se diseñaron proteínas AR con cuatro, cinco y seis repeticiones. Por su parte, el trabajo de Binz tomó como base la secuencia obtenida por Sedgwick y Smerdon (1999), por medio de diferentes ciclos de alineamientos se generó una secuencia consenso que fue afinada mediante un análisis estructural comparando a las secuencias obtenidas con 10 proteínas cuyas coordenadas cristalográficas se encontraban en el PDB, para así tratar de definir los residuos de aminoácidos que se ven mayoritariamente involucrados en las interacciones de unión a blancos. Durante el análisis de la estructura tridimensional realizado por Binz et al. (2003) se observó que dentro de la secuencia consenso, las posiciones involucradas en las interacciones proteína-proteína son aquéllas en las cuales puede haber casi cualquier residuo de aminoácido, las excepciones son glicina, prolina y cisteína, ya que pueden provocar modificaciones no deseadas a la estructura. A nivel de proteína, se realizaron análisis biofísicos entre los cuales se incluyen ensayos de expresión y distribución celular, determinación de la estructura secundaria por dicroísmo circular, ensayos de desnaturalización térmica y cristalografía que indicaron que estas proteínas se expresan como proteínas solubles, en grandes cantidades utilizando como sistema de expresión Escherichia coli. Su rendimiento de purificación por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) es alto, y se expresan como proteínas monoméricas altamente termoestables cuya estructura secundaria corresponde a la de las proteínas AR naturales. Los resultados obtenidos en los trabajos antes mencionados indican que las proteínas diseñadas son más estables que las naturales, incluso con pocas repeticiones en su estructura. Además, cumplen con las propiedades consideradas ideales para las proteínas que pretenden utilizarse como potenciales 12 elementos de unión (Forrer et al. 2003, 2004): una superficie diversa, alta estabilidad térmica, estabilidad bajo condiciones reductoras u oxidantes, plegamiento y expresión eficientes. Estas proteínas han sido utilizadas en aplicaciones en biomedicina para lo cual, las proteínas diseñadas deben presentar alta estabilidad para ser almacenadas por largos períodos de tiempo, así como baja inmunogenicidad (Stumpp et al., 2008; Wetzel et al. 2008). Estas propiedades están basadas principalmente en los anticuerpos, ya que son las moléculas de unión más utilizadas para interacciones de alta afinidad, sin embargo, tanto éstos como otras proteínas de unión presentan limitantes que las proteínas AR no, principalmente el tiempo necesario para expresarlas en grandes cantidades e inestabilidad en condiciones reductoras, similares a las encontradas en el medio intracelular (Forrer et al., 2003, 2004). Además de las propiedades antes mencionadas, es importante destacar algunas otras características que colocan a las proteínas AR como una alternativa con ventajas notables con respecto a los anticuerpos, entre las cuales se encuentran el bajo costo de producción, su sencilla expresión in vitro en grandes cantidades (alrededor de 200 mg/L), (Plückthun, 2015), la producción en tiempos cortos con respecto a la obtención de anticuerpos donde se requieren esquemas de inmunización (Schilling, Schöppe y Plückthun, 2014); su nula agregación y su ausencia de puentes disulfuro, que les permiten ser expresadas en el citoplasma bacteriano. Por último, el hecho de que no posean cisteínas, crea la posibilidad de introducir este residuo o algún otro para su conjugación con fármacos u otros reactivos derivatizantes de cisteínas (Binz et al., 2004; Forrer et al., 2004; Stumpp et al., 2008; Tamaskovic et al., 2012). Los primeros trabajos realizados para probar la especificidad y afinidad de las proteínas AR diseñadas indicaron que la interacción específica con las moléculas blanco presentaba una alta afinidad en concentraciones en el rango nanomolar (Binz et al, 2004; Forrer et al., 2004). 13 1.4 Anquirinas diseñadas como herramientas de diagnóstico y terapia En años posteriores, se continuó con la generación de bibliotecas de proteínas diseñadas a partir de repeticiones de anquirina con la finalidad de probar su actividad contra distintos blancos como cinasas y proteasas (Binz et al, 2004; Kohl et al. 2005), cuyo objetivo principal era inhibir la función de éstas en condiciones intracelulares (Parizek et al., 2012). Estudios llevados a cabo con proteínas de membrana (Voguel et al., 2007), demostraron que estas anquirinas diseñadas son capaces de modular la función de proteínas de transporte (Seeger et al., 2013). Vogel y colaboradores (2007) probaron por primera vez a estas proteínas sintéticas dirigidas contra inmunoglobulinas, usando como modelo el anticuerpo monoclonal murino anti-IgE humano. Los resultados, al igual que con los blancos anteriores (cinasas y proteasas), fueron favorables en concentraciones nanomolares; por otro lado, se comparó la actividad entre las proteínas diseñadas y la del antígeno para dicho anticuerpo y se concluyó que ambos presentaban los mismos epítopes ya que competían directamente por la unión al anticuerpo determinado. Incluso, se han hecho comparaciones de actividad en tratamientos ya establecidos, como por ejemplo el fármaco Omalizumab (Xolair®) de Novartis Farmacéutica S.A. de C.V., un anticuerpo monoclonal anti-IgE usado para tratar asma severa de origen alérgico. Se ha demostrado que laafinidad de las proteínas diseñadas con anquirinas por la IgE es incluso mayor que la de este fármaco, usando menores dosis, abriendo una gran posibilidad para su uso como tratamiento para enfermedades atópicas, con la ventaja de ser más barata que varios tratamientos actuales (Baumann et al., 2010). En 2007, Zahnd et al. decidieron probar la afinidad por el receptor Her2 de varias proteínas AR sintéticas de dos módulos, generadas por medio de EP-PCR. Este receptor está involucrado en el desarrollo de cáncer en diversos tejidos y, por ello, es un importante blanco para terapia. En estos ensayos las proteínas mostraron especificidad y alta afinidad por su blanco, por primera vez, en rangos de 14 concentración picomolar. A partir de este trabajo han surgido más en los cuales se han seleccionado este tipo de proteínas con dicha afinidad. De acuerdo con Stumpp y colaboradores (2008) las proteínas diseñadas con módulos de anquirina pesan aproximadamente un tercio de lo que pesa un fragmento Fab, lo cual las hace ideales para lograr penetrar tejidos, esto, en conjunto con sus características ya mencionadas, estimula al desarrollo in vitro e in vivo de pruebas diagnósticas de la expresión de diversos blancos, así como para el uso de estas proteínas como terapia (Zahnd et al., 2007; Stumpp et al., 2008). Stumpp y colaboradores (2008) han señalado que para la administración por diferentes vías se necesita de grandes cantidades de proteína estable lo cual, en el caso de las proteínas AR diseñadas, no es una limitante ya que se pueden producir y purificar gramos de este tipo de proteínas en pocos días, más aún, a temperatura ambiente y en suero humano a 37°C (ex vivo) se puede detectar la actividad de estas proteínas después de más de 60 días. El desarrollo de fármacos basados en las proteínas con módulos de anquirina puede ocurrir ya sea en su forma monovalente, como agentes antagonistas o agonistas, o conjugadas, tanto con proteínas del mismo tipo como con distintas moléculas. También pueden ser potenciales neutralizantes de toxinas ya que logran remover moléculas que están en circulación de manera relativamente rápida debido a que los complejos que estos forman se eliminan por el riñón; aunque su farmacocinética puede ser modulada para ralentizar su excreción (Stumpp et al., 2008). Se ha demostrado que estas proteínas son eficaces marcadores tumorales ya que además de lograr penetrar el tejido tumoral, se ha logrado regular su tiempo de circulación y acumulación en el tumor, derivando en potenciales fármacos que pueden administrarse en mayores cantidades que otros utilizados con el mismo fin (Zahnd et al., 2010). 15 Dentro de la terapia génica, las proteínas diseñadas con repeticiones de anquirina se han unido a lentivirus y adenovirus con el fin de aumentar su afinidad como marcadores tumorales siendo más eficaces que los fragmentos variables de anticuerpos de cadena sencilla (scFv), comúnmente probados en este tratamiento (Boersma y Plückthun, 2011; Münch et al., 2011). Debido a que estas proteínas sintéticas se logran expresar bien en condiciones intracelulares, se han conjugado con fluoróforos para probarlas como biosensores proporcionando tanto información analítica como cuantitativa de analitos específicos en tiempo real (Plückthun, 2015), lo que ha resultado útil en el campo de las ciencias bioanalíticas y diagnósticas (Brient et al., 2010). Por ejemplo, Theurillat et al., (2010) han comparado la eficiencia de estas proteínas como alternativa a los anticuerpos en pruebas inmunohistoquímicas, en donde se determinó que muestran una sensibilidad similar a la de los anticuerpos con una mayor afinidad. Debido a que las proteínas AR se componen de varias repeticiones que pueden presentar diferentes grupos funcionales para el reconocimiento de distintos elementos pueden emplearse como elementos biespecíficos, o bifuncionales, así como ligandos multivalentes (Hollenbeck et al., 2012); aparte, su conjugación con diferentes reactivos o dominios puede incrementar su funcionalidad de manera selectiva (Moody et al., 2014), incluso es posible extender su vida media al conjugarlas con albúmina sérica o polietilenglicol (PEG) (Plückthun, 2015). Recientemente, se han hecho pruebas para conjugarlos a fármacos citotóxicos y dirigirlos contra tumores, similar a lo hecho con anticuerpos acoplados a fármacos citotóxicos o ADCs, buscando avanzar en las fases preclínicas (Merten et al., 2015). En 2015, Hammill y colaboradores las conjugaron con receptores de antígenos quiméricos (CARs) y las evaluaron como mediadoras de la unión entre éstos y Her2, reemplazando a los scFv para dicho reconocimiento antigénico. Los resultados obtenidos han sido exitosos obteniendo la expresión de complejos CAR-proteína AR tanto en linfocitos T murinos como humanos, además de tener 16 capacidades equivalentes a las de los scFv para inducir la producción de algunas citosinas y efectos citotóxicos. Jost y Plückthun (2014) apuntan que las principales limitantes de estas proteínas son: su forma cóncava, poca flexibilidad y una superficie de unión aleatoria; ello puede limitar la variedad de epítopes a los que estas proteínas pueden unirse. La creación de una nueva generación de proteínas AR sintéticas en 2014, ha logrado superar las limitantes mencionadas por medio del reemplazo del giro β por un asa más alargada (19 residuos de aminoácidos) que presenta diez posiciones con residuos aleatorios, a estas proteínas se las ha denominado “Loop-DARPins” y gracias a esta modificación la proteína adquiere un mayor grado de flexibilidad y superficie de interacción sin perder las propiedades que le caracterizan (Schilling, Schöppe y Plückthun, 2014). De las proteínas repetitivas consideradas como las mejores alternativas a otras proteínas de unión con interés clínico, las basadas en anquirinas, son actualmente, las más estudiadas y varias de ellas forman parte de ensayos clínicos (Jost y Plückthun, 2014). Se han probado como tratamiento para enfermedades visuales como edema macular diabético y degeneración macular relacionada con la edad mostrando ser, hasta ahora, seguras y bien toleradas por los pacientes. Con mucho más interés, se han continuado las pruebas para terapias contra el cáncer, siendo el principal modelo el cáncer de mama, haciendo énfasis en el receptor Her2 como blanco principal (Plückthun, 2015; Sokolova et al., 2016). De acuerdo con Plückthun (2015), las proteínas diseñadas con módulos de anquirina también han sido usadas para estudiar el proceso de apoptosis y la polimerización de tubulina. También se han utilizado como agentes antivirales que bloqueen la unión de la glicoproteína gp120 (encontrada en la superficie de VIH), al correceptor CD4 o bien alterando las funciones de otras proteínas virales que impidan la replicación del virus (Praditwongwan et al., 2014). De igual manera, se 17 han usado para unir enzimas modificando el espacio entre ellas, así como su orientación logrando aumentar su sinergia (Cunha, Hatem y Barrick, 2016). De hecho, estas proteínas han sido seleccionadas contra más de 170 proteínas plegadas, fragmentos de DNA, péptidos y moléculas pequeñas con alta afinidad en rangos de concentración picomolar o nanomolar (Bieli et al., 2016). 1.5 Anquirinas sintéticas para la co-cristalización de otras proteínas Si bien los módulos de anquirina han sido probados primordialmente para fines diagnósticos y terapéuticos también han sido utilizadas en investigación para la co-cristalización de proteínas por difracción de rayos X. A pesar de que continuamente se desarrollan técnicas que permiten determinar la estructura de dichas biomoléculas, esta tarea continúa siendo compleja debido a la dificultad para lograr que aquellas proteínas con estructura flexible, mantengan la suficienteestabilidad para la formación de cristales (Batyuk et al., 2016; Sennhauser y Grütter, 2008). Aún es más complicado la cristalización de proteínas de membrana debido a que, para la obtención de cristales, es necesaria su agregación, lo que se ve impedido por una superficie que no es lo suficientemente hidrofílica para mantener estables las interacciones proteína-proteína (Huber et al., 2007). Por lo anterior, se comenzaron a usar anquirinas sintéticas como «chaperonas» que contribuyeran a mantener la estabilidad necesaria para este proceso (Sennhauser y Grütter, 2008). De esta forma al tener una estructura rígida se espera que se forme un complejo por medio de interacciones no covalentes que estabilicen las proteínas de interés y en consecuencia se favorezca su cristalización (Batyuk et al., 2016; Plückthun, 2015). En el caso de las proteínas de membrana, la unión de las proteínas AR incrementan el área hidrofílica lo que favorece la formación de uniones estables entre éstas sin alterar su estructura intrínseca durante el proceso de cristalización, lo que hace posible la obtención de cristales de alta calidad (Huber et al., 2007; Schilling et al., 2014). Actualmente se han determinado alrededor de 30 estructuras cristalográficas con proteínas 18 diseñadas con módulos de anquirina como chaperonas (Batyuk et al., 2016). De acuerdo con Plückthun (2015) esta característica de las proteínas AR es lo que ha permitido acelerar su desarrollo para fines específicos ya que las interacciones moleculares se pueden analizar a detalle gracias a la estructura cristalográfica. Batyuk et al. (2016) señalan que una de las desventajas en el uso de estas proteínas es que al ser de tamaño pequeño es común que no logren crear los contactos suficientes que permitan la cristalización, sin embargo, esta limitante puede superarse al conjugar a las cubiertas N- o C-terminal de las proteínas AR con otros dominios proteicos. Huber et al. (2007) mencionan que por cada proteína que se pretende cristalizar es necesario generar una nueva molécula de unión, de manera que, una vez más, el bajo costo y la menor complejidad de producción de las anquirinas sintéticas resulta conveniente. Además, a un solo tipo de proteína AR se le pueden conjugar diferentes dominios intercambiando las cubiertas terminales, aumentando el abanico de posibles proteínas útiles para la co-cristalización (Batyuk et al., 2016). 2. JUSTIFICACIÓN Por la gran versatilidad de las proteínas con repeticiones de anquirinas, en los últimos 15 años se han hecho trabajos para obtenerlas de manera sintética y utilizarlas en el área biomédica. En diversos estudios, la mayor cantidad de anquirinas sintéticas que han presentado resultados favorables son aquéllas con dos y tres módulos de repetición, por ello en el presente trabajo se busca obtener dos proteínas con dos y tres módulos de anquirina diseñadas a partir de un consenso de las proteínas sintéticas cuyas estructuras cristalográficas se encuentran en la base de datos del Protein Data Bank con el fin de analizar la contribución de los aminoácidos variables resultantes del consenso en estas dos proteínas y observar si ambas tienen algún uso potencial como proteínas de unión. 19 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general Obtener dos proteínas sintéticas conformadas por dos y tres módulos de anquirina a través de un diseño por consenso. 3.2 Objetivos específicos 1) Diseñar dos proteínas con dos (D2) y tres (D3) módulos de anquirina, respectivamente, utilizando los aminoácidos variables obtenidos mediante un consenso de las estructuras cristalográficas depositadas en la base de datos del Protein Data Bank para proteínas diseñadas con repeticiones de anquirina. 2) Diseñar el gen (D5), que contiene las secuencias codificantes para D2 y D3, flanqueadas por los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción NdeI y BamHI para ser sintetizado comercialmente. 3) Aislar los fragmentos de DNA que codifican para D2 y D3 a partir de D5 por medio de reacciones de digestión utilizando las enzimas de restricción NdeI y BamHI. 4) Subclonar los genes que codifican para D2 y D3 en el plásmido de expresión pET-3a HisTEV. 5) Verificar la presencia del inserto que codifica para D2 y D3 en las clonas positivas mediante secuenciación de Sanger. 6) Estandarizar la sobreexpresión de D2 y D3. 20 7) Purificar y evaluar la estructura secundaria de las proteínas D2 y D3 mediante dicroísmo circular. 8) Evaluar la termoestabilidad de D2 y D3 mediante dicroísmo circular. 4. METODOLOGÍA 4.1 Consenso de secuencias de anquirinas reportadas en el PDB y diseño de D2 y D3 Con el objetivo de obtener dos proteínas sintéticas con diferente número de módulos de anquirina se llevó a cabo un diseño por consenso, para lo cual se hizo una búsqueda de las estructuras cristalográficas de proteínas diseñadas con módulos de anquirina en el Protein Data Bank (PDB). En total, y hasta la fecha de la búsqueda (agosto 2016), se encontraron 50 estructuras cristalográficas reportadas. Se obtuvo la secuencia de cada una y se analizó cuáles de ellas presentaban el arreglo establecido por Binz et al. (2003), esto es, una cubierta N- terminal, determinado número de módulos variables (basado en la secuencia consenso establecida por Sedgwick y Smerdon en 1999) y una cubierta C- terminal. De las 50 proteínas, 15 presentaron dicho arreglo, de las cuales 3 correspondieron a proteínas de dos módulos y 12 a proteínas de tres módulos. Con las secuencias obtenidas se realizó un alineamiento múltiple de todos los módulos de anquirina de las proteínas reportadas utilizando el programa Clustal Omega (1.2.1). Con el resultado del alineamiento se analizaron las posiciones variables en cada uno de los módulos (42 en total), para cada una de ellas se ordenaron de forma descendiente los residuos de aminoácidos según la frecuencia encontrada. En la Tabla 1, se muestran los aminoácidos presentes en cada una de las siete posiciones variables (1, 3, 4, 6, 14, 15 y 27) de los módulos de anquirina analizados, seguido de su frecuencia de aparición, en este consenso se determinó que la primera posición corresponde al residuo de aminoácido ubicado en los giros 21 β y el cual conecta a un módulo con otro. Derivado de este análisis, se seleccionaron los aminoácidos que conformarían las secuencias de la anquirina con dos y tres repeticiones (D2 y D3, respectivamente), siendo el principal criterio de selección su frecuencia; en segundo lugar, que hubiera suficiente variabilidad en cada módulo, así como en toda la proteína en general. También, se evitó que en estas posiciones se incluyeran residuos con cadenas laterales voluminosas (anillos aromáticos) que pudieran causar modificaciones a la estructura proteica debido a impedimento estérico con los residuos adyacentes conservados o semiconservados. En caso de que el aminoácido con mayor frecuencia, pudiera causar un impedimento estérico o modificaciones en la estructura, este residuo fue sustituido por el siguiente en frecuencia, buscando siempre la suficiente variabilidad en cada módulo (Fig. 4). Tabla 1. Frecuencia de los residuos de aminoácidos en las posiciones variables. 1 (1) 2 (3) 3 (4) 4 (6) 5 (14) 6 (15) 7 (27) A7 N8 D12 Y11 Y8 W8 H18 K5 V5 T6 D4 F7 Y7 N14 S5 E4 S4 H4 K5 F5 A9 V5 S4 F4 T4 R3 S4 Y2 T4 L4 A4 M4 L3 E4 L3 A3 Y2 F3 M2 N3 N3 K3 L2 W3 D2 T3 M3 R3 I2 V2 E2 I2 H2 D2 V1 L2 S2 V2 I2 I2 K1 S2 T2 D1 Y2 H1 M1 I1 I2 H1 D1 F1 E1 N1 A1 M1 E1 W1 K1 W1 Con colores sombreados, se muestran los aminoácidos considerados para formar parte de las secuencias de D2 y D3. Los aminoácidos de mayor frecuencia se muestran en color amarillo, los segundos más frecuentes en verde y los terceros en frecuencia en rojo. Para la sexta posición variable se muestraen color morado un aminoácido en cuarto lugar de frecuencia. 22 4.2 Diseño del gen sintético D5 Una vez que se identificaron las secuencias nucleotídicas de los aminoácidos de los módulos variables, se agregaron las secuencias de las cubiertas amino y carboxilo terminal que los flanquean, en este caso las cubiertas no contuvieron ninguna modificación con respecto a las reportadas por Binz et al., 2003 y que se basaron originalmente en la anquirina GABPβ1 de ratón (PDB: 1AWC). Figura 4. Representación en código de una letra de los aminoácidos variables incorporados en cada uno de los módulos variables de D2 y D3. Se señala la naturaleza de cada aminoácido con un color distinto; rojo, polar; verde, alifático (no polar); rosa, ácido (polar); azul claro, aromático (polar); azul, aromático (no polar) y púrpura, básico (polar). Figura 5. Secuencias nucleotídicas de D3 (Arriba) y D2 (Abajo), en las que resaltan los aminoácidos seleccionados a partir de la Tabla 1, flanqueadas por las cubiertas amino (cian) y carboxilo terminal (verde obscuro). 23 Posterior a esto, se diseñó un gen (D5) constituido de tal manera que fuera posible obtener la secuencia nucleotídica de ambos genes mediante reacciones con enzimas de restricción. Toda la construcción D5 fue flanqueada con el sitio para la enzima de restricción HindIII. Con la finalidad de insertar de manera independiente los dos genes que codifican para ambas proteínas en un vector de expresión, cada una se flanqueó con los sitios para las enzimas de restricción NdeI y BamHI (Fig. 6). 4.3 Obtención de D2 y D3 a partir del gen sintético D5 Una vez diseñada la construcción con todos los sitios de restricción, la secuencia de nucleótidos se tradujo a secuencia de aminoácidos utilizando el servidor ExPASy (https://www.expasy.org/) con el fin de verificar que se encontraran correctamente todos los módulos variables y las cubiertas amino y carboxilo terminal en los sitios correspondientes. Posteriormente, en el servidor Webcutter (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) se revisó que los sitios de restricción estuvieran en el orden esperado y que no se generaran sitios de restricción adicionales en la secuencia. La secuencia final del gen D5 (Fig. 7) se envió a la compañía GenScript (Piscataway, NJ) para sintetizar el gen, el cual fue insertado en el vector de clonación pUC57. Este gen fue transformado en la cepa TOP10 de E. coli con el fin de almacenarlo, así como para crecer cultivos para posteriormente extraer DNA. Figura 6. Arreglo de las secuencias que conforman al gen D5. https://www.expasy.org/) http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ 24 Dado que el gen sintetizado D5 estaba en papel filtro, se recortó en pequeños pedazos, que se depositaron en un tubo para microcentrífuga con la intención de eluir el DNA utilizando 100 µL de agua precalentada a 60°C. Se agitó durante 10 minutos para después eliminar el papel filtro mediante centrifugación a 12,000 r.p.m. en una microcentrífuga (Eppendorf). El DNA D5/pUC57 se obtuvo a partir del sobrenadante. Con este DNA, se transformaron células competentes de E. coli (TOP10) por el método de choque térmico, utilizando 100 ng y plaqueando en una caja Petri con medio LB suplementado con ampicilina a una concentración final de 100 µg/mL, se dejaron crecer las colonias a 37°C durante 12 horas. Posteriormente, se resembró una colonia en otra caja petri con ampicilina y se incubó por 12 horas a 37°C. A partir de este cultivo, se aisló y purificó el DNA de acuerdo al protocolo establecido del Kit Gene JET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific), basado en el método de lisis alcalina. Para verificar la pureza del DNA obtenido se tomaron 3 µL y se cargaron en un gel de agarosa al 1% en presencia de gel Red (Biotium), para llevar a cabo una Figura 7. Secuencia del gen D5 con los sitios de restricción para HindIII, que flanquean a toda la secuencia (mayúsculas color azul), para NdeI, al inicio de las cubiertas N-terminal (mayúsculas color anaranjado) y para BamHI, al final de las cubiertas C-terminal (mayúsculas color gris). 25 electroforesis (20 minutos, 100 V). Como referencia se utilizó el marcador de peso molecular 1Kb Plus (Invitrogen), el resultado se observó en un transiluminador de luz UV. Con el DNA D5/pUC57 purificado se llevaron a cabo reacciones de digestión para obtener los fragmentos de D2 y D3 por separado. Según el mapa de restricción de este DNA plasmídico existen tres sitios de reconocimiento para la enzima NdeI, uno de ellos pertenece al vector y dos al gen D5, y dos sitios para BamHI, ambos pertenecientes a D5. Se decidió primero hacer una restricción con NdeI y después con BamHI con la finalidad de apreciar mejor el peso molecular de cada fragmento a obtener. De esta forma, de la reacción de digestión con NdeI se esperan obtener 3 fragmentos: uno de 311 pb, que inicia en el sitio NdeI del plásmido y termina en el sitio NdeI que da inicio a D3; un segundo fragmento de 492 pb, que flanquea el inicio de D3 y termina en el sitio NdeI en el inicio de D2 y un tercer fragmento que corresponde desde el inicio de D2 incluyendo todo el resto del plásmido (2810 pb). Cuando el fragmento de 2810 pb se digiere con BamHI, resulta en un fragmento de 369 pb correspondiente a la secuencia de D2, asimismo la secuencia de 492 pb al ser digerida con BamHI resultará en un fragmento de 468 pb correspondiente con el peso de D3 (Figura 8). 26 Para obtener el DNA que codifica a las proteínas D2 y D3 a partir de D5/pUC57 se llevaron a cabo reacciones de digestión con la enzima NdeI en el Amortiguador 0 (Thermo Scientific), durante 1 hora de incubación a 37°C, utilizando las siguientes relaciones: DNA D5/pUC57 (100 ng)…….….…....1.5 µL NdeI (10 U/L).…….………………......0.5 µL Amortiguador 0 (10X)….………..…..…1.0 µL H2O………………..……………….....….7.0 µL Total………………….………...……….10.0 µL Figura 8. Esquema del mapa de restricción del plásmido pUC57 que contiene el gen D5, creada con SnapGene®. Se indica la localización de los sitios de reconocimiento para las enzimas HindIII, NdeI y BamHI. Los fragmentos esperados cuando se digiere con NdeI se representan con colores distintos y se señala su peso: 1°, primer fragmento esperado de 311 pb (rojo); 2°, segundo fragmento esperado de 492 pb (azul); 3°, tercer fragmento esperado de 2810 pb (amarillo). 27 Estas muestras se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% (40 minutos a 90 V), a cada muestra se le añadió 2 L de Gel Red (Biotium) Se extrajeron las bandas del gel de agarosa que contienen a D2 (2810 pb) y a D3 (492 pb), y los fragmentos de DNA se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (Thermo Scientific). Para eliminar las secuencias restantes del plásmido se llevaron a cabo reacciones de digestión con la enzima BamHI en amortiguador BamHI (Thermo Scientific). Utilizando las siguientes relaciones, las muestras se incubaron durante 1 hora a 37°C: DNA D2….………………..........4.0 µL BamHI (10 U/L).…………..….0.5 µL Amortiguador BamHI (10X)…..1.0 µL H2O……………………………...4.5 µL Total………………………...…10.0 µL DNA D3…………………………5.0 µL BamHI (10 U/L).……………...0.5 µL Amortiguador BamHI (10X)….1.0 µL H2O……………………………...3.5 µL Total…………………………...10.0 µL Los fragmentos de DNA obtenido de estas digestiones se purificaron utilizando el kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN). También se llevaron a cabo digestiones con las enzimas NdeI y BamHI del plásmido pET-3a HisTEV, vector en el que posteriormente cada gen fue subclonado. Este vector contiene la secuencia de reconocimiento para la proteasa del virus del tabaco (TEVp) y una etiqueta de seis residuos de histidinas (His-tag) en el extremo amino terminal (Enríquez-Flores et al., 2011). El plásmido utilizado cuenta con la secuencia que codifica para la aldolasa de Giardialamblia, que se encuentra flanqueada por los sitios de reconocimiento para NdeI y BamHI. De esta forma, al digerir con dichas enzimas se liberará el gen que codifica para la aldolasa (969 pb). Así, al observar que se libera de manera correcta el fragmento que codifica para esta enzima, suponemos que el vector se encuentra linearizado y digerido adecuadamente con ambas enzimas de restricción. 28 4.4 Subclonación de D2 y D3 en el plásmido de expresión pET-3a HisTEV Con la finalidad de insertar las secuencias en el vector de expresión, se realizaron ligaciones de D2 y D3 en el plásmido pET-3a HisTEV (Anexo 1) digerido previamente con NdeI y BamHI. Las reacciones de ligación se llevaron a cabo de la siguiente manera: pET-3aHisTEV (NdeI, BamHI).………..……………………………….4.0 µL DNA D2 …...……………………………….……………………….......12.0 µL T4 DNA Ligasa 5 U/L (Thermo Scientific)…………………...…..…..1.0 µL Buffer T4 DNA Ligasa10x (Thermo Scientific)………………….…….2.5 µL H2O……………………………………….………………………..……...5.5 µL Total…………………………………….……...…………………..……25.0 µL pET-3aHisTEV (NdeI, BamHI)……….……………………….…….......2.0 µL DNA D3.......…….…………………………………………….………….15.0 µL T4 DNA Ligasa 5 U/L (Thermo Scientific).……............................….1.0 µL Buffer T4 DNA Ligasa 10 x (Thermo Scientific)…..............................2.0 µL Total……………………………………...…….…………………….......20.0 µL Las muestras se colocaron en un termociclador y se incubaron a 22°C durante 2 horas. Pasado este tiempo, se retiraron las muestras y se colocaron en hielo, para una posterior transformación, por choque térmico en células competentes de E. coli (TOP10). La mezcla de transformación se sembró en un medio de cultivo LB sólido con ampicilina (100 µg/mL) y se incubó por 12 horas a 37°C. Posteriormente, las clonas transformantes se resembraron en medio LB sólido suplementado con ampicilina (100 µg/mL) y a partir de las colonias resultantes se purificaron el DNA plasmídico con D2 ó D3/pET-3aHisTEV mediante el método de lisis alcalina con el kit previamente mencionado, después de ello se realizó una digestión doble con NdeI y BamHI en amortiguador Tango (Thermo Scientific), para verificar cuáles de ellas presentaron el inserto. Cada muestra se preparó de la siguiente manera: 29 DNA plasmídico D2 o D3.………………......2.5 µL NdeI (10 U/L)….…………….…..................0.5 µL BamHI (10 U/L).………….……..................0.5 µL Amortiguador Tango (10X)…………….……1.0 µL H2O…………………………………….………5.5 µL Total……………………………….….……...10.0 µL Las muestras se incubaron durante 1 hora a 37°C y los resultados fueron verificados mediante una electroforesis (90 V, 40 minutos) en gel de agarosa al 1.5% para D2 y al 1% para D3, ambos teñidos con Gel Red (Biotium). Aquellas clonas que mostraron tener el inserto se resembraron en medio sólido LB suplementado con ampicilina. 4.5 Secuenciación de D2 y D3 Las muestras donde se confirmó la presencia del inserto D2 o D3/pET-3aHisTEV mediante electroforesis, se prepararon para su secuenciación por el método de Sanger en la Unidad de Síntesis y Secuenciación de DNA del Instituto de Biotecnología, UNAM. Se mezclaron 600 ng de D2 o D3/pET-3aHisTEV con el oligonucleótido T7 Promotor o T7 Terminador (31.89pmol/µL) en un volumen final de 16 µL. DNA D2 o D3/pET-3aHisTEV…………………..……..………...8 µL T7 Promotor o Terminador (200 ng/mL)…….…………...……..1 µL H2O...………………..……………………………...…….………...7 µL Mediante los electroferogramas resultantes se verificó que la secuencia nucleotídica de la proteína D2 o D3 en cada muestra fuera correcta. 4.6 Sobreexpresión de D2 y D3 en cepas de E. coli Con el fin de sobreexpresar las proteínas contenidas en las clonas denominadas D2 L2.2 y D3 L2.14, con el DNA de estas clonas se llevaron a cabo transformaciones por choque térmico de células competentes de cinco diferentes cepas de E. coli (cuyas características se encuentran en el Anexo) compatibles con el plásmido de sobreexpresión en el que se encuentran D2 y D3: 30 ▪ BL21(DE3) pLysS ▪ BL21-Gold (DE3) pLysS ▪ BL21-Codón Plus (DE3) RIL ▪ Origami B(DE3) pLysS ▪ BL21-AI Las muestras transformadas se plaquearon en cajas de Petri con LB adicionando antibióticos (100 µg/mL). Para BL21-AI y BL21-Gold (DE3) pLysS se agregó ampicilina, mientras que para BL21(DE3) pLysS y BL21-Codón Plus (DE3) RIL se añadieron ampicilina y cloranfenicol y para Origami B(DE3) pLysS se adicionaron ampicilina, cloranfenicol, kanamicina y tetraciclina (Anexo 2). De las células transformantes obtenidas se aislaron 2 colonias por cada cepa. Se incubó a 37°C por 12 horas y posteriormente, cada colonia aislada se resembró en medio sólido que se dejó crecer 12 horas a 37°C. Las diferentes cepas con D2 o D3 se resuspendieron con 200 µL de LB, enseguida, se agregaron 50 µL de cada una de las clonas resuspendidas a diferentes tubos con 20 mL de medio LB y antibiótico correspondiente, se dejó en agitación a 37 ºC y después de algunas horas se midió su densidad óptica (D.O.) a 600 nm. Al llegar a una D.O. de 0.8, cada cultivo se indujo con IPTG (0.5 mM) y a la cepa BL21-AI se le adicionó además arabinosa al 2.5% como inductor. Para los cultivos de cada cepa se probaron dos temperaturas diferentes de incubación, 25°C y 37°C con agitación a 180 r.p.m. durante toda la noche. Posterior a ello, se tomaron alícuotas de 100 µL de cada cultivo y se centrifugaron a 3000 r.p.m. durante 10 minutos y luego se le retiraron 90 µL del sobrenadante; las pastillas celulares se resuspendieron con 7 µL de Solución de Digestión 2x (Tris-HCl 0.125 M, pH 6.8; SDS al 5%, glicerol al 25% y azul de bromofenol al 0.02%) adicionado con β-mercaptoetanol al 2% y se cargaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 16%, de acuerdo con la técnica de von Jagow. A dichos geles se les aplicó un voltaje de 80 V durante 1 hora y posteriormente a 130 V durante 3 horas. Finalizada la electroforesis los geles se 31 tiñeron con azul de Coomassie durante toda la noche y luego se destiñeron con agua destilada. 4.7 Evaluación de la sobreexpresión y pureza de las proteínas D2 y D3 Para determinar si D2 y D3 se encontraban en la parte soluble (sobrenadante) o insoluble (pastilla) de las células, una vez lisadas, se tomaron los cultivos inducidos de las clonas y se centrifugaron a 4000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C. Se decantó el sobrenadante, las pastillas celulares se resuspendieron con 5 mL de amortiguador de lisis (KH2PO4 50 mM, KCl 300 mM, Imidazol 10 mM y pH 8.0) para después lisar las células mediante 10 ciclos de sonicación de 15 segundos con intervalos de descanso de 2 minutos. Se tomó una alícuota de 20µL de cada muestra lisada de D2 y D3, y se centrifugaron a 12000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C, se separó el sobrenadante en otros tubos y las pastillas celulares se resuspendieron con 1.5 mL del amortiguador de lisis. En geles desnaturalizantes de poliacrilamida (von Jagow) al 16% se cargaron los lisados, sobrenadantes y pastillas celulares obtenidos, dichos geles se corrieron a 80 V durante 1 hora y luego a 130 V por 3 horas. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie coloidal durante toda la noche y luego se destiñeron con agua destilada. Una vez identificada la fracción donde se localizaban las anquirinas D2 y D3, se realizaron precultivos de 20 mL de medio LB con ampicilina (100 µg/mL) con ambas proteínas sobreexpresadas en la cepa BL21-AI, se incubaron a 37°C a 180 r.p.m. durante 12 horas. Con la pastilla obtenida de estos precultivos y resupendida en medio LB con ampicilina, se inocularon cultivos de 500 mL de LB con ampicilina comenzando con una densidad óptica a 600 nm de 0.1 y se incubaron en las mismas condiciones anteriores durante 3 horas. Después de ello 32 se indujeron los cultivos con arabinosa (2.5%) e IPTG (0.5 mM) y se incubaron bajo las condiciones ya mencionadas durante toda lanoche. 4.8 Purificación de D2 y D3 Cada cultivo crecido e inducido se centrifugó a 6000 r.p.m. durante 20 minutos. Se desechó la mayor parte del sobrenadante y con el restante se resuspendió cada pastilla celular. Todas las muestras resuspendidas de D2 se colectaron en un solo tubo y todas las de D3 en otro tubo. Posteriormente, para concentrarlas, ambas muestras se centrifugaron de nuevo con las mismas condiciones Se desechó el sobrenadante y cada pastilla bacteriana se resuspendió en 30 mL de amortiguador de lisis (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8.0) suplementado con PMSF 2mM (previamente disuelto en 500 µL de DMSO). Las dos muestras se lisaron por sonicación con el sonicador ultrasónico de tipo sonda Branson Sonifier 450 (7 ciclos de 45 segundos con intervalos de descanso de 2.30 minutos), se tomó una alícuota de 100 µL de cada lisado y el restante de ellos se centrifugó durante 40 minutos a 6000 r.p.m. De cada sobrenadante (SN) se tomó una alícuota de 100 µL, y el resto se utilizó para purificar a las proteínas de interés por medio de cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC), se utilizó la resina de níquel Profinity™ IMAC Resin (BIO-RAD). En las columnas de purificación, previamente equilibradas con 60 mL de amortiguador de lisis, se agregaron, por separado, el sobrenadante con D2 y el sobrenadante con D3 y se incubaron en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se colectó de manera independiente la muestra que pasó por cada la columna, es decir, la fracción no unida a la columna que se denominó como NU. Se realizó un lavado (Lav) con 60 mL de amortiguador Tris 50 mM y NaCl 50 mM (pH 8), colectado en otros tubos. Finalmente, D2 y D3 se eluyeron utilizando 30 mL del amortiguador anterior con imidazol 200 mM (pH 8) y se incubó con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cada muestra eluída se transfirió a un tubo Amicon Ultra- 33 15 (EMD Millipore), con un paso de corte de 10 kDa, se centrifugó a 3800 r.p.m. durante 20 minutos y así subsecuentemente hasta concentrar la muestra. Con la finalidad de digerir cada proteína con la proteasa TEV y eliminar así la etiqueta de His, a cada eluído concentrado se le agregó amortiguador de digestión (Tris 50 mM, EDTA 0.5 mM, pH 8), el cual permite la adecuada reacción de la TEVp. Posteriormente, se centrifugaron en los tubos amicon en las condiciones antes descritas para finalmente colectar la muestra concentrada en el amortiguador de digestión. 4.9 Determinación de la concentración de D2 y D3 Debido a la ausencia de residuos de aminoácidos que puedan absorber la luz a 280 nm (denominados fluoróforos), para estimar la concentración de las proteínas se utilizó el método de ácido bicinconínico (BCA) (Smith et al., 1985), adicionalmente, mediante este método se estimó la concentración de proteína de las alícuotas colectadas en los pasos de purificación descritos. Para lograr esto, se realizó una curva patrón con albúmina sérica bovina (BSA) de la siguiente manera: Tubo H2O (µL) BSA [1mg/mL] (µL) BSA [1mg/mL] (mg/mL) BCA (Reactivo A+B (50:1)) 1 50 0 0 950 µL 2 46 4 .004 3 42 8 .008 4 34 16 .016 5 26 24 .024 6 18 32 .032 7 10 40 .040 Las muestras de la purificación de ambas proteínas se prepararon como se muestra a continuación: 34 Tubo Muestra (µL) H2O (µL) BCA (Reactivo A+B (50:1)) 1 Lisado 2.5 47.5 950 µL 2 5 45 3 Sobrenadante (SN) 2.5 47.5 4 5 45 5 NU 2.5 47.5 6 5 45 7 Lavado (Lav) 2.5 47.5 8 5 45 9 D2 o D3 concentradas 2.5 47.5 10 5 45 Todos los tubos se incubaron a 37°C durante 30 minutos y se cuantificaron en un espectofotómetro (VarianCary 50 Bio) a una longitud de onda de 562 nm. 4.10 Digestión de D2 y D3 con la proteasa del virus del tabaco (TEVp) Con los resultados obtenidos, se calculó la cantidad de proteína total para D2 y D3 con el fin de añadir la cantidad correspondiente de TEVp (18.2 mg/mL) a una relación de 1:25 (TEVp: D2 ó D3) en el amortiguador de digestión y en presencia de 1mM de DTT. La TEVp remueve la etiqueta de His localizada en el extremo amino de ambas proteínas mediante el reconocimiento de la secuencia de corte específico para esta proteasa. Las dos mezclas de digestión de D2 y D3 +TEVp se incubaron a temperatura ambiente durante 16 horas. Transcurrido este tiempo se tomó una alícuota de 20 µL de ambas muestras, al volumen restante, se le agregó 13 mL de trietanolamina (100 mM, pH 7.4) para diluir el amortiguador de digestión, el DTT y el EDTA. La resina de afinidad con níquel inmovilizado fue previamente equilibradas con 60 mL del amortiguador de trietanolamina 100 mM pH: 7.4, para después incubar las mezclas de digestión de ambas proteínas con agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de ello, se colectaron las dos proteínas y se 35 transfirieron a tubos Amicon Ultra-4 (paso de corte de 10 kDa), se centrifugaron a 3800 r.p.m. por 15 minutos para concentrarlas. Se visualizaron los resultados de la purificación y la digestión con TEVp por medio de electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (von Jagow) al 16%. Para ello se realizaron los cálculos pertinentes, con base en los resultados de la cuantificación, para cargar 25 µg de cada muestra (Lisado, SN, NU, Lav y D2 o D3+TEVp), y diferentes concentraciones de las proteínas purificadas y concentradas. Los geles se corrieron a 80 V durante 1 hora y posteriormente a 120 V por 2 horas. Posteriormente se tiñeron con azul de Coomassie durante toda la noche y enseguida se destiñeron con agua destilada. 4.11 Determinación de la estructura secundaria de D2 y D3 mediante dicroísmo circular Con el fin de evaluar la estructura secundaria de cada proteína, se llevaron a cabo ensayos de dicroísmo circular (DC) en el UV lejano con un espectropolarímetro Jasco J-810. Con las proteínas previamente cuantificadas, se prepararon soluciones de cada una de ellas a una concentración final de 250µg/mL en 300µL con amortiguador de fosfato de sodio (25 mM, pH 7.4) Los espectros de dicroísmo circular se llevaron a cabo en una celda de cuarzo de 0.1 cm de paso de luz. Cada muestra se analizó por separado haciendo un barrido de 288 a 190 nm a 25 °C y determinar así su estructura secundaria. Otros parámetros seleccionados para la obtención de los espectros de dicroísmo circular son los siguientes: resolución 0.1 nm, escaneo continuo, velocidad de barrido de 20 nm / min, respuesta 2s, amplitud de la banda 2.0 nm, acumulación 4. 36 Las mediciones se hicieron por duplicado y los resultados se analizaron en el software OriginPro 8. 4.12 Evaluación de la estabilidad térmica de D2 y D3 mediante dicroísmo circular Una vez finalizada la lectura para determinar la estructura secundaria de ambas proteínas, se sometió cada una de ellas a una prueba de estabilidad térmica con el objetivo de determinar su temperatura media de desnaturalización (Tm), esto se hizo a una longitud de onda de 222 nm, y un aumento constante de temperatura (24ºC / hora) iniciando a 25°C y hasta 90°C, sensibilidad estándar, respuesta 2 s, amplitud de la banda 1.0 nm. Una vez alcanzados los 90°C se bajó la temperatura hasta regresar a los 25°C, luego de ello se determinó de nuevo la estructura secundaria, bajo las condiciones mencionadas en el apartado anterior, con el fin de observar la capacidad de replegamiento de D2 y D3. Ésta última prueba se hizo por duplicado. Todos los resultados se analizaron en el software OriginPro 8. 5. RESULTADOS 5.1 Obtención de las secuencias de DNA codificantes para D2 y D3 a partir del gen sintético D5 Del consenso realizado se obtuvo el gen denominado D5 con una longitud de 903 pb, el cual contiene a las secuencias que codifican para D3 (468 pb) y para D2 (369 pb). Ambas secuencias se encuentranflanqueadas por las cubiertas amino y carboxilo terminal, así como por las secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción NdeI y BamHI (Fig 6). Una vez obtenido el gen D5 inserto en el vector pUC57, el DNA plasmídico se purificó y se evaluó su integridad mediante electroforesis en geles de agarosa utilizando GelRed™ para la tinción del DNA (Fig. 9). 37 Con el plásmido D5/pUC57 purificado se llevaron a cabo reacciones de digestión con la enzima NdeI y se visualizó el resultado por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %. Se observaron los tres fragmentos esperados (Fig. 10), uno de entre 300 y 400 pb, el cual sólo contiene secuencia del plásmido; el segundo fragmento que debería contener la secuencia que codifica para D3 se encuentra por encima del peso esperado (492 pb). A este respecto, se ha reportado que el tinte fluorescente GelRed™ puede alterar la migración de los fragmentos de DNA, en consecuencia, su posición en el gel puede llegar a discrepar con respecto a la posición esperada (Biotium, 2015). El tercer fragmento, en el cual debe estar contenida la secuencia codificante para D2, presenta un peso mayor a 2000 pb, que corresponde con lo esperado (2810 pb). Se cortaron aquellos fragmentos que presentaban las secuencias de interés y se purificaron (Figura 10B). Posteriormente dicho DNA purificado se digirió con la enzima de restricción BamHI para eliminar las secuencias que no pertenecen a D2 y D3 (Fig. 11). Figura 9. DNA plasmídico que codifica para el gen D5 insertado en el plásmido pUC57. Electroforesis de la purificación de DNA plasmídico en gel de agarosa al 1%. Carriles: MPM, Marcador de Peso Molecular 1Kb Plus (Invitrogen); D5/pUC57, DNA plasmídico purificado del gen D5 inserto en pUC57. 38 De esta forma y de acuerdo con el mapa de restricción para D5/pUC57 el fragmento de 2810 pb al ser digerido con BamHI, resulta en un fragmento de 369 pb correspondiente a la secuencia de D2. De igual manera, al digerir la secuencia de 492 pb con BamHI resulta en un fragmento de 468 pb correspondiente con el peso de D3. En la electroforesis, para la reacción de digestión del fragmento de 2810pb se observan dos fragmentos: uno ubicado en la parte superior del gel que corresponde a secuencia del plásmido pUC57, el segundo fragmento se encuentra entre 400 y 500 pb, que debe corresponder a la secuencia de D2 (Figura 11A). Por otro lado, en la reacción de digestión del fragmento de 492pb D3, se observa entre las bandas del marcador de peso molecular de 500 y 600 pb, debido también a la alteración del corrimiento del Gel Red. Este fragmento debería corresponder al DNA que codifica para D3 (Figura 11B). Figura 10. Digestión del plásmido D5/pUC57 con la enzima de restricción NdeI. (A) Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% en el cual se observan los fragmentos esperados como resultado de la reacción de digestión con NdeI, delimitados en un rectángulo rojo se encuentran los fragmentos que deben contener las secuencias de interés; MPM, Marcador de Peso Molecular; ND, muestra de D5/pUC57 no digerida; D, muestras de D5/pUC57 digeridas. B) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los fragmentos de 492 pb y 2810 pb purificados. 39 5.2 Subclonación de las secuencias que codifican para D2 y D3 en un plásmido de sobrexpresión pET-3a HisTEV El vector de sobreexpresión denominado pET-3a HisTEV (~4700 pb) también se digirió utilizando las enzimas de restricción NdeI y BamHI con la finalidad de que contara con extremos cohesivos y purificarlo para ser utilizado posteriormente en reacciones de ligación independientes, con los fragmentos de D2 y D3 digeridos previamente con las mismas enzimas de restricción (Fig. 12). Figura 11. Digestión de los fragmentos que deben contener a D2 y D3, con la enzima de restricción BamHI. (A) Electroforesis en gel de agarosa al 1%de los fragmentos de 2810 pb. (B) Electroforesis en gel de agarosa al 1.5%de los fragmentos de 492 pb. Se indica con una línea anaranjada la posición en la cual se esperaba observar los fragmentos correspondientes a D2 y D3. 40 De la ligación de D2 se obtuvieron 8 clonas y para D3 se obtuvieron 20 clonas, se extrajo el DNA de dichas clonas y se digirieron simultáneamente con las enzimas de restricción NdeI y BamHI con el propósito de comprobar que el DNA codificante para ambas proteínas se encontrara en el vector de sobreexpresión. Para D2, resultaron positivas dos clonas, L1.3 y L2.2, se puede observar que en cada una de ellas existe un fragmento que se encuentra alrededor de los 400 pb, peso cercano al de la secuencia de DNA de D2 (369 pb) (Fig. 13). Para D3, sólo una clona resultó positiva, L2.14. En la figura 14 se puede apreciar que sólo esta clona presenta un fragmento de peso molecular aproximado a los 500 pb. El peso estimado para la secuencia de DNA que codifica para D3 es de 468 pb. Figura 12. Fragmentos de DNA digeridos con NdeI, BamHI y purificados para usar en la subclonación. Electroforesis en geles de agarosa al 1% de las purificaciones de: A) fragmento que se espera corresponda a D2 (D2P), B) fragmento que se espera corresponda a D3 (D3P) y C) vector de subclonación pET-3a His-TEVp. 41 5.3 Secuenciación por el método de Sanger de D2 y D3 Para corroborar que los fragmentos de DNA en estas clonas positivas correspondieran con las secuencias diseñadas se secuenciaron mediante el método Sanger. Se obtuvieron los correspondientes electroferogramas en los cuales fueron encontradas las secuencias diseñadas para D2 y para D3 (Fig. 15- 17). Figura 13. Digestión doble con NdeI y BamHI del DNA plasmídico de las clonas resultantes de las reacciones de ligación de D2 en pET-3aHisTEV. Electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, en caracteres rojos se señalan las clonas positivas, en un rectángulo anaranjado se señalan los fragmentos esperados de la digestión, adicionalmente se indica el peso correspondiente a D2 (anaranjado). MPM, marcador de peso molecular; ND, muestra de la ligación no digerida; L1, ligación 1; L2, ligación 2, seguido del número de clona. Figura 14. Digestión doble, con NdeI y BamHI, del DNA plasmídico de las clonas resultantes de las ligaciones de D3 en pET-3aHisTEV.Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en color rojo se señala la clona positiva, adicionalmente se indica el peso correspondiente a D3 (anaranjado). MPM, marcador de peso molecular; L1, ligación 1; L2, ligación 2, seguido del número de clona. 42 F ig u ra 1 5 . E le c tr o fe ro g ra m a d e l a s e c u e n c ia q u e c o d if ic a p a ra l a p ro te ín a D 2 p re s e n te e n l a c lo n a L 1 .3 .S e s e ñ a la n l a s s e c u e n c ia s d e re c o n o c im ie n to p a ra N d e I (r e c tá n g u lo a n a ra n ja d o ) y B a m H I (r e c tá n g u lo g ri s ); c o n l ín e a s a m a ri lla s s e m a rc a e l in ic io y e l fi n a l d e l a s e c u e n c ia d e 3 6 9 p b c o rr e s p o n d ie n te c o n e l d is e ñ o d e D 2 ; c o n u n a l ín e a v e rd e s e d iv id e a u n m ó d u lo d e l o tr o . 43 F ig u ra 1 6 . E le c tr o fe ro g ra m a d e l a s e c u e n c ia q u e c o d if ic a p a ra l a p ro te ín a D 2 p re s e n te e n l a c lo n a L 2 .2 . S e s e ñ a la n l a s s e c u e n c ia s d e re c o n o c im ie n to p a ra N d e I (r e c tá n g u lo a n a ra n ja d o ) y B a m H I (r e c tá n g
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