Obtencion-de-marcadores-qumicos-para-su-identificacion-por-CLAE-en-la-especie-medicinal-Alnus-acuminata-subsp -arguta-Betulaceae

Vista previa del material en texto

NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
OBTENCIÓN DE MARCADORES QUÍMICOS PARA SU 
IDENTIFICACIÓN POR CLAE EN LA ESPECIE 
MEDICINAL Alnus acuminata subsp. arguta (Betulaceae). 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
P R E S E N T A : 
MARCELA ANGÉLICA 
DE LA FUENTE HERNÁNDEZ 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2010
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
PRESIDENTE: Dra. Yolanda Caballero Arroyo 
VOCAL: Dra. María Isabel Aguilar Laurents 
SECRETARIO: Dra. Mabel Clara Fragoso Serrano 
PRIMER SUPLENTE: Dr. José Fausto Rivero Cruz 
SEGUNDO SUPLENTE: Dra. Isabel Del Carmen Rivero Cruz 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ LA TESIS 
 
LABORATORIO 125, DEPARTAMENTO DE FARMACIA, CONJUNTO “E”, 
DIVISIÓN DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE QUÍMICA, 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
ASESOR 
 
 
DRA. MARÍA ISABEL AGUILAR LAURENTS 
 
 
 
SUSTENTANTE 
 
 
MARCELA ANGÉLICA DE LA FUENTE HERNÁNDEZ 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la oportunidad de 
pertenecer a ella y estudiar una carrera universitaria así como todos los beneficios 
otorgados durante mi permanencia. Es un orgullo ser egresado de la UNAM 
 
A la Facultad de Química de la UNAM por todos los conocimientos, aptitudes, 
habilidades, actitudes y valores que me brindó e impartió a través de su cuerpo 
docente, aulas, y servicios, para servir a la sociedad como una profesionista. 
 
A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) por el apoyo 
económico otorgado a través de una beca (Proyecto IN210709). 
 
Al personal académico de la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación 
(USAI), especialmente a la Dra. Nuria Esturau, M. en C. Rosa Isela Del Villar, Q. 
Margarita Guzmán, Q. Georgina Duarte, Q. F. B. Marisela Gutiérrez y Q. 
Alejandrina Acosta por el registro de los espectros para los análisis 
espectroscópicos y espectrométricos de los compuestos obtenidos. 
 
Al Dr. Andrés Navarrete Castro por proporcionar la materia prima para el 
desarrollo de esta investigación. 
 
A los sinodales Yolanda Caballero y Mabel Fragoso por el tiempo otorgado para la 
revisión del manuscrito de esta tesis y las pertinentes correcciones efectuadas. 
 
Un especial agradecimiento a la Dra. Isabel Aguilar, mi tutora, por haberme 
permitido el desarrollo de este tema en el laboratorio a su cargo, por todas las 
recomendaciones, acertados comentarios y conocimientos que aportó durante la 
realización y revisión del proyecto, sin olvidar el apoyo que siempre me otorgo en 
diversos sentidos y sobre todo por su gran calidad humana. Muchas Gracias. 
 
A mis compañeros de laboratorio que hicieron muy agradables los días largos y 
agotadores de trabajo con sus comentarios, compañía y ocurrencias, muy 
especialmente a Marco, Irías y Arturo que fueron mi equipo de trabajo durante un 
largo tiempo y a quienes auguro mucho éxito, sin olvidar a Celia, Marisol, Ileana, 
Alfredo, a los “niños Breatoff”, a los “Elenitas” y a todos aquellos que conocí 
durante la realización de mi tesis, con los cuales tuve una gran convivencia. 
 
DEDICATORIAS Y AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
 
A Dios por estar siempre a mi lado y permitirme concluir esta etapa de mi vida. 
 
A mi mamá, por todo tu esfuerzo, cariño, apoyo, confianza, regaños, expectativas 
y consejos. Siempre te preocupas porque nunca me falte lo necesario y siempre 
haces cuanto puedes para que realice mis proyectos y sueños. Hoy en día la 
persona que soy es gracias a ti. Te amo y dedico mi esfuerzo. 
 
A mis hermanos Mayra, Vero y José, por ser un ejemplo para mí. Gracias por 
soportar esa etapa de mi vida, a veces de gran ausentismo y de poco tiempo para 
estar juntos. Ustedes, junto con mi mamá, son el motor que me impulsa a seguir 
siempre adelante y quiero que sepan que aunque este es un pequeño logro en mi 
vida, fue posible gracias a cada uno de nosotros. Los quiero y siempre están en 
mis pensamientos. 
 
A mi abue Carlota, mi ejemplo a seguir. Simplemente eres la persona más bella y 
maravillosa que he conocido. Te quiero muchísimo. Dios no me permitió conocer a 
mis abuelitos paternos, pero vaya que se lució al compensarme con una abuelita 
como tú y con mi abuelito Carlos, al cual extraño demasiado. 
 
A todos mis tíos que en momentos difíciles siempre han demostrado que 
contamos con ellos y que por eso somos una familia. Espero algún día 
compensarles lo mucho en lo que nos han ayudado a mí y mis hermanos. Los 
quiero muchísimo. Una mención especial a mi tío Gustavo quien la ha hecho de 
padre y a quien quiero como tal. Estoy en deuda con ustedes. 
 
A Luis, mi gran amigo, cómplice y compañero. ¿Quién mejor que tú puede conocer 
como fue de largo y agotador estos años?, Gracias por tu apoyo, cariño, 
complicidad, comprensión y consejos. Por las largas y tantas noches de desvelo, 
de estudio, las palabras de aliento, los momentos difíciles, los días enteros en la 
 
escuela, por soportar mi personalidad estresante y darme la estabilidad que 
muchas veces necesité para no rendirme en el intento. Eres una persona 
importante en mi vida y por todo eso también es tuyo este logro. Ya sabes cuánto 
te quiero. 
 
Al Sr. Luis Velasco, quien me brindó apoyo económico durante toda mi carrera sin 
razón alguna. Mi mamá y yo estamos muy agradecidas. 
 
A todos aquellos amigos, casi hermanos, con los que pase ratos interminables en 
la escuela, muchas veces más tiempo que el que podría haber estado en mi casa. 
Gracias a todos ustedes por permitirme conocerlos en especial a Luis, Rodolfo, 
Quique, Alex, Alina, y Emma, por su amistad, asesorías, ayuda en la escuela, 
consejos, compañía, tardes, noches, madrugadas de estudio y porque 
simplemente hicieron que todo se hiciera más llevadero, sin olvidar a tantas 
personas que conocí durante la carrera y que sería imposible mencionarlas pero 
que ahora forman parte de mi vida. A mis grandes amigos de la vida que siempre 
han estado conmigo. Este solo es el comienzo. 
 
 
 
 
“La vida no es fácil para ninguno de nosotros. Pero… ¡Que importa! Hay 
que perseverar y, sobre todo, tener confianza en uno mismo. Hay que 
sentirse dotado para realizar alguna cosa y que esa cosa hay que alcanzarla, 
cueste lo que cueste.” 
 
Marya Sklodowska 
 
 
 
 
 
 
"El sentido de las cosas no está en las cosas mismas, 
 sino en nuestra actitud hacia ellas" 
 
Antoine De Saint Exupery 
 
 
 
 
 
 
“Hermoso es lo que vemos. Más hermoso es lo que sabemos. 
Pero mucho más hermoso es lo que no conocemos” 
 
Niels Steensen
ÍNDICE 
 
 
ÍNDICE 
 Pagina 
Índice I-IV 
Lista de esquemas V 
Lista de figuras VI 
Lista de tablas VII 
Abreviaturas VIII-X 
1. Justificación 1 
2. Antecedentes 3 
2.1 Generalidades de Alnus acuminata subsp. arguta 3 
2.1.1 Familia Betulacea 3 
2.1.2 Género Alnus 3 
2.1.3 Alnus acuminata subsp. arguta 4 
2.1.3.1 Descripción 5 
2.1.3.2 Usos 8 
2.1.3.3 Usos Medicinales Populares 8 
2.2 Composición Química 9 
2.2.1 Terpenos 10 
2.2.1.1Síntesis de Terpenos 11 
2.2.1.2 Triterpenos 13 
2.2.1.3 Familias de Triterpenos 13 
2.3 Cromatografía 15 
2.3.1 Clasificación 15 
2.3.2 Cromatografía líquida 18 
2.3.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución 19 
2.3.3.1 Funcionamiento general 19 
2.3.3.2 Instrumentación 20 
3. Objetivos 24 
3.1 Objetivo general 24 
3.2 Objetivos particulares 24 
4. Material, equipo y reactivos 25 
4.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 25 
4.1.1 Fragmentación 25 
4.1.2 Columna de percolación 25 
4.1.3 Columna preparativa 25 
4.2 Purificación de los metabolitos secundarios aislados 25 
4.3 Identificación molecular de los metabolitos 26 
4.4 Desarrollo del método por cromatografía de líquidos de alta 
resolución 
26 
5. Metodología 27 
ÍNDICE 
 
 
5.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 27 
5.1.1 Recolección 27 
5.1.2 Secado 27 
5.1.3 Fragmentación 27 
5.1.4 Extracción 27 
5.1.5 Fraccionamiento cromatográfico 28 
5.2 Purificación de los metabolitos secundarios aislados 29 
5.2.1 Recristalización 29 
5.2. 2 Placas preparativas 30 
5.3 Identificación molecular de los metabolitos 30 
5.4 Desarrollo del método por cromatografía de líquidos de alta 
resolución 
32 
5.4.1 Optimización de la obtención de la muestra 32 
5.4.2 Preparación de los estándares 33 
5.4.3 Obtención del cromatograma de líquidos del extracto 
diclorometánico 
33 
5.4.4 Cambio de columna 34 
5.4.5 Obtención del cromatograma de los estándares 34 
5.4.5 Identificación de los estándares en el cromatograma del 
extracto 
35 
5.4.6 Obtención del cromatograma con los siete estándares 
obtenidos. 
35 
6. Resultados y discusión 37 
6.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 37 
6.1.1 Obtención del extracto hexánico y fraccionamiento 
cromatográfico 
37 
6.2 Purificación de metabolitos secundarios aislados 38 
6.3 Identificación molecular de los metabolitos 39 
6.3.1 Identificación de 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-
eno (A2) 
40 
6.3.2 Identificación de 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona (A) 
(Taraxerona) 
42 
6.3.3 Identificación de 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al (B) 44 
6.3.4 Identificación de 3 - Lup-20(29)-en-3-ol (D) 46 
6.3.5 Identificación de 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al (E) 48 
6.3.6 Identificación de -sitosterol (F) 50 
6.3.7 Identificación de 3 - Lup-20(29)-en-diol (G) 52 
6.4 Desarrollo del método de cromatografía de líquidos de alta 
resolución 
54 
6.4.1 Optimización de la obtención del extracto 54 
ÍNDICE 
 
 
6.4.2 Preparación de los estándares 55 
6.4.3 Obtención del cromatograma de líquidos del extracto 
diclorometánico 
56 
6.4.4 Cambio de columna 59 
6.4.5 Obtención del cromatograma de los estándares 60 
6.4.5 Identificación de los estándares en el cromatograma del 
extracto 
63 
6.4.6 Obtención del cromatograma con los siete estándares 
obtenidos. 
66 
7. Conclusiones 67 
8. Perspectivas 68 
9. Bibliografía 69 
Anexo I (Espectros) 74 
1. IR del compuesto 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno 75 
2. RMN 1H del compuesto 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-
eno 
76 
3. RMN 13C del compuesto3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-
eno 
77 
4. HSQC del compuesto 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-
eno 
78 
5. HMBC del compuesto3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno 79 
6. COSY del compuesto 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-
eno 
80 
7. EMIE del compuesto3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno 81 
8. IR del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 82 
9. RMN 1H del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 83 
10. RMN 13C del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 84 
11. HSQC del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 85 
12. HMBC del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 86 
13. COSY del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 87 
14. EMIE del compuesto 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 88 
15. RMN 1H del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 89 
16. RMN 13C del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 90 
17. HSQC del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 91 
18. HMBC del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 92 
19. COSY del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 93 
20. EMIE del compuesto 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 94 
21. IR del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 95 
22. RMN 1H del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 96 
ÍNDICE 
 
 
23. RMN 13C del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 97 
24. HSQC el compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 98 
25. COSY el compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 99 
26. EMIE del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-3-ol 100 
27. IR del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 101 
28. RMN 1H del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 102 
29. RMN 13C del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 103 
30. HSQC del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 104 
31. HMBC del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 105 
32. COSY del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 106 
33. EMIE del compuesto 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al 107 
34. IR del compuesto -sitosterol 108 
35. RMN 1H del compuesto -sitosterol 109 
36. RMN 13C del compuesto -sitosterol 110 
37. HSQC del compuesto -sitosterol 111 
38. HMBC del compuesto -sitosterol 112 
39. COSY del compuesto -sitosterol 113 
40. EMIE del compuesto -sitosterol 114 
41. IR del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 115 
42. RMN 1H del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 116 
43. RMN 13C del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 117 
44. HSQC del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 118 
45. HMBC del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 119 
46. COSY del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 120 
47. NOESY del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 121 
48. EMIE del compuesto 3 - Lup-20(29)-en-diol 122 
Anexo II (Cromatogramas) 123 
1. n-Propanol 124 
2. Tetrahidrofurano 124 
3. Extracto Hexánico 125 
4. Coelución de los estándares “A” y “D” en n-propanol. 125 
Anexo III (Glosario) 126 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
LISTA DE ESQUEMAS 
 
 Página 
2.1 Biosíntesis de metabolitos secundarios. 8 
2.2 Síntesis de Terpenos 12 
2.3 Síntesis de la molécula de escualeno. 14 
2.4 Familias de triterpenos con conformación silla-silla-silla-bote. 15 
2.5 Tipos de cromatografía según la naturaleza de la fase móvil y 
estacionaria. 
17 
5.1 Desarrollo general del procedimiento de aislamiento e identificación 
de los metabolitos secundarios 
31 
 5.2 Metodología para la obtención del estándar del extracto CH2Cl2 32 
5.3 Etapas del desarrollo del método para la identificación de los 
metabolitos secundarios por CLAE. 
36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 Página 
2.1 Distribución de Alnus acuminata subsp. Arguta en América. 4 
2.2 Distribución de la especie Alnus acuminata en la República 
Mexicana. 
5 
 2.3 Alnus acuminata subsp arguta (Cd. Universitaria, UNAM). 7 
2.4 Estructura de la molécula de isopreno. 10 
2.5 Principales componentes de un Cromatógrafo de Líquidos 20 
5.1. Corteza de Alnus acuminata 27 
5.2Columna de percolación. Columna cromatografica. 28 
5.3 Cromatógrafo de líquidos utilizado para el desarrollo del método 35 
6.1 Cromatograma de extracción con hexano y con DCM 54 
6.2 Cromatoplaca de los 7 estándares con sus respectivos Rf. 55 
6.3 Cromatograma de líquidos del extracto DCM a 254 nm. 57 
6.4 Cromatograma de líquidos del extracto DCM a 233 nm. 57 
6.5 Cromatograma de líquidos del extracto DCM a 200 nm. 57 
6.6 Cromatograma de líquidos del extracto DCM a 200 nm con el 
sistema de gradiente elegido 
58 
6.7 Cromatograma de líquidos del extracto DCM bajo las nuevas 
condiciones. 
59 
6.8 Cromatograma del estándar 3 -O-acetil-13 metil-27-norolean-14-
eno. 
60 
6.9 Cromatograma del estándar 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona. 60 
6.10 Cromatograma del estándar 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al. 61 
6.11 Cromatograma del estándar 3 - Lup-20(29)-en-3-ol. 61 
6.12 Cromatograma del estándar 3 -Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al. 61 
6.13 Cromatograma del estándar-sitosterol. 62 
6.14 Cromatograma del estándar 3 - Lup-20(29)-en-diol. 62 
6.15 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 3 -
O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno. 
63 
6.16 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 
13 - -27-norolean-14-en-3-ona. 
64 
6.17 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 3 -
Acetiloxi-olean-12-en-28-al. 
64 
6.18 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 3 - 
Lup-20(29)-en-3-ol. 
64 
6.19 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 3 -
Hidroxi-lup-20(29)-en-28-al. 
65 
6.20 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar -
sitosterol. 
65 
6.21 Cromatograma del extracto DCM en coelución con el estándar 
3 - Lup-20(29)-en-diol. 
65 
 6.22 Cromatograma de la coelución de los 7 estándares en n-Propanol. 66 
 
ÍNDICE 
 
 
LISTA DE TABLAS 
 Página 
5.1 Sistema de elución del fraccionamiento cromatográfico 28 
5.2 Fraccionamiento primario del extracto hexánico de A. acuminata 29 
5.3 Condiciones cromatográficas iniciales para la separación de los 
componentes del extracto diclorometánico de A. acuminata. 
33 
5.4 Condiciones cromatográficas para el gradiente en la separación 
de los componentes del extracto diclorometánico de A. acuminata 
34 
5.5 Condiciones establecidas en la nueva columna 34 
 6.1 Metabolitos secundarios presentes en el fraccionamiento primario 
del extracto hexánico de A. acuminata. 
37 
6.2 Compuestos obtenidos del fraccionamiento cromatográfico del 
extracto hexánico y su rendimiento. 
38 
6.3 Solubilidad de los metabolitos secundarios aislados frente a 
distintos disolventes. 
38 
6.4 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “a2” 41 
6.5 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “A” 43 
6.6 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “B” 45 
6.7 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “D” 47 
6.8 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “E” 49 
6.9 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “F” 51 
6.10 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “G” 53 
6.11 Elección del disolvente adecuado para la preparación de los 
estándares 
55 
6.12 Gradiente utilizado en la separación de los componentes del 
extracto DCM de A. acuminata. 
58 
 
ABREVIATURAS 
 
VIII 
 
ABREVIATURAS 
 
% Porciento 
max Frecuencia máxima 
°C Grados Celsius 
Å Armstrong 
AcOEt Acetato de etilo 
AIST Advanced Industrial Science and Technology 
C Carbono 
CC Cromatografía en columna 
CCF Cromatografía en capa fina 
CDCl3 Cloroformo deuterado 
CG Cromatografía de gases 
CL Cromatógrafo de Líquidos 
CP Cromatografía en papel 
CH2Cl2 Diclorometano 
CHCl3 Cloroformo 
CH3CN Acetonitrilo 
CLAE Cromatografía de líquidos de alta eficiencia 
cm Centímetros 
COSY Espectroscopía Bidimensional de Correlación 
Homonuclear 
CP Cromatografía en papel 
 Unidades de desplazamiento químico 
d Doblete 
dd Doble de dobles 
DCM Diclorometano 
DMAPP Dimetilalil difosfato 
DMSO Dimetil sulfóxido 
EM Espectrometría de Masas 
EMIE Espectro de masas por impacto electrónico 
Et al Y otros 
FM Fase móvil 
ABREVIATURAS 
 
IX 
 
FPP Farnesil difosfato 
g Gramos 
GGPP Geranil geranil difosfato 
GPP Geranil difosfato 
H Hidrógeno 
h Horas 
HCl Ácido clorhídrico 
Hex Hexano 
H2O Agua 
HMBC Espectroscopía Bidimensional de Correlación 
Heteronuclear de Múltiples Ligaduras 
HPLC Espectroscopia de correlación heteronuclear 
de carbono-hidrogeno 
Hz Hertz 
Int. Rel. Intensidad Relativa 
IPP Isopentenil difosfato 
IR Infrarrojo 
J Constante de acoplamiento 
kg Kilogramos 
Lit Literatura 
m Metros 
M Multiplete 
MEP Metileritritol fosfato 
min Minutos 
mg Miligramos 
MHz MegaHertz 
mL Mililitros 
mm Milímetros 
mV MiliVoltz 
m/z Relación masa-carga 
L Microlitros 
m Micrómetros 
nm Nanómetros 
ABREVIATURAS 
 
X 
 
NOESY Espectroscopía Bidimensional Incrementada 
por el Efecto Nuclear Overhauser 
OH Hidroxilo 
OMS Organización Mundial de la Salud 
P. f. Punto de fusión 
ppm Partes por millón 
R. A. Reactivo Analítico 
Rf Factor de retención 
RMN Resonancia Magnética Nuclear 
s Singulete 
Td Triplete dobleteado 
TMS Tetrametilsilano 
t. r. Tiempo de retención 
THF Tetrahidrofurano anhidro 
UV Ultravioleta 
v/v Relación volumen-volumen 
(NH4)4Ce(SO4)42H2O Sulfato cérico amoniacal 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
 
1 
 
1. JUSTIFICACIÓN 
 
Más del 80% de la población mundial depende de las plantas silvestres para la 
atención de sus enfermedades. México es un país con amplia tradición en el uso 
de preparados medicinales provenientes de plantas, para el alivio de 
enfermedades, sin embargo, éstas no son inocuas y en la mayoría de los casos su 
utilización no está respaldada por los estudios pertinentes implicando un riesgo 
para el consumidor (De Smet, 1997; Hersh, 1996; Lozoya, 1993). 
 
Dentro de las plantas medicinales de amplio uso en nuestro país, se 
encuentra Alnus acuminata subsp. arguta (popularmente llamada “Aile”), 
perteneciente a la familia Betulaceae. Esta especie, distribuida principalmente en 
el sureste de México, es apreciada por las propiedades antiinflamatorias y 
antiescrofulosas que exhiben los preparados de su corteza (Argueta, 1994; De la 
Cruz, 1962; Miranda, 1952). De hecho, existen una patente y varias invenciones 
registradas en nuestro país para diversos tratamientos como para la psoriasis, 
diabetes y vitíligo. A la fecha, en nuestro laboratorio se han realizado estudios 
farmacológicos que sustentan el uso de esta planta como antiinflamatoria (Gómez, 
2007), y por otra parte, estudios preliminares sobre la composición química de la 
misma (Illescas, 2008). 
El análisis de la composición química de una planta medicinal permite 
obtener información acerca de su contenido metabólico secundario, y 
alternativamente de su comportamiento farmacológico, mediante los estudios 
químicos y farmacológicos pertinentes. Sin embargo, para el aprovechamiento 
racional de una materia prima vegetal medicinal, es necesario realizar pruebas de 
control de calidad que aseguren la composición de los contenidos químicos de las 
mismas. Esto se logra mediante el desarrollo y validación de métodos analíticos 
apropiados. La cromatografía de líquidos de alta eficiencia (CLAE) es una 
herramienta contemporánea, idónea para la cuantificación de principios químicos 
(marcadores) presentes en extractos de plantas, una vez que éstos se han aislado 
e identificado químicamente. 
JUSTIFICACIÓN 
 
 
2 
 
El conocimiento generado a partir de dichos estudios se puede emplear en 
la elaboración de una monografía farmacopéica, en este caso de Alnus acuminata, 
de acuerdo a los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 
1998) y a futuro, basándose en estudios que comprueben su eficacia y seguridad, 
la especie vegetal puede ser utilizada en el desarrollo de un producto medicinal 
herbolario para el tratamiento de algunos de los padecimientos para los que se 
prescribe. 
 ANTECEDENTES 
3 
 
2. ANTECEDENTES 
 
2.1 GENERALIDADES DE Alnus acuminata subsp. arguta 
2.1.1 Familia Betulacea 
A esta familia pertenecen plantas leñosas, árboles o arbustos dicotiledóneos 
caducifolios y monoicos que se encuentran preferentemente en regiones 
templadasy frías de zonas de montaña en los trópicos. 
(http://alergomurcia.com/pdf/01BETULA.pdf) 
 
Su clasificación botánica es: 
 Subreino: Tracheobionta 
 División: Magnoliophyta 
 Clase: Magnoliopsida 
 Subclase: Hamamelidae 
 Orden: Fagales 
 Familia: Betulaceae 
 
Los géneros pertenecientes a esta familia son: 
 Alnus 
 Betula 
 Carpinus 
 Corylus 
 Ostrya 
 Ostryopsis 
 Palaeocarpinus 
 
2.1.2 Género Alnus 
Este género contiene 25 especies en todo el mundo. La clasificación de las 
especies presentes en México es un tanto confusa. Rzedowski describe al género 
Alnus con 6 especies: A. acuminata, A. arguta, A. alabrata, A. jorullensis, A. 
firmifolia y A. lutea. Furlow da otra clasificación: A. acuminata subsp. arguta, A. 
http://es.wikipedia.org/wiki/Dicotiled%C3%B3nea
http://es.wikipedia.org/wiki/Caducifolio
http://es.wikipedia.org/wiki/Monoico
http://es.wikipedia.org/wiki/Tracheobionta
http://es.wikipedia.org/wiki/Divisi%C3%B3n_%28biolog%C3%ADa%29
http://es.wikipedia.org/wiki/Magnoliophyta
http://es.wikipedia.org/wiki/Clase_%28biolog%C3%ADa%29
http://es.wikipedia.org/wiki/Magnoliopsida
http://es.wikipedia.org/wiki/Hamamelidae
http://es.wikipedia.org/wiki/Orden_%28biolog%C3%ADa%29
http://es.wikipedia.org/wiki/Fagales
http://es.wikipedia.org/wiki/Familia_%28biolog%C3%ADa%29
http://es.wikipedia.org/wiki/Alnus
http://es.wikipedia.org/wiki/Betula
http://es.wikipedia.org/wiki/Carpinus
http://es.wikipedia.org/wiki/Corylus
http://es.wikipedia.org/wiki/Ostrya
http://es.wikipedia.org/wiki/Ostryopsis
http://es.wikipedia.org/wiki/Palaeocarpinus
 ANTECEDENTES 
4 
 
acuminata subsp. glabrata, A. jorullensis subsp. jorullensis y A. jorullensis subsp. 
lutea. El mismo Furlow sugiere la necesidad de profundizar más en la 
investigación taxonómica del género. 
(http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/9-
betul1m.pdf) 
 
2.1.3 Alnus acuminata subsp. arguta 
La planta medicinal Alnus acuminata subsp. arguta es conocida con el nombre 
común Aile (proviene del vocablo náhuatl a-yli), Abedul (Tamaulipas, Veracruz, 
Oaxaca y Chiapas), Aliso (Sinaloa, Hidalgo, Veracruz, Oaxaca, Chiapas y 
Tamaulipas), Elite (Tamaulipas, Veracruz, Oaxaca, Chiapas y Chihuahua) y Palo 
de águila (Oaxaca) (Martínez, 1937). 
Alnus acuminata es una especie originaria de México y Centroamérica. Se 
extiende desde el noroeste de México, Guatemala, Panamá, Ecuador, Costa Rica 
hasta el norte de Argentina, los Andes de Perú y de Bolivia (Figura 2.1) (CATIE, 
1995). 
 
Figura 2.1 En gris, distribución de Alnus acuminata subsp. arguta en América. 
 ANTECEDENTES 
5 
 
2.1.3.1 Descripción 
Hábitat 
El género Alnus es propio de cañadas y laderas húmedas aunque se puede 
encontrar en laderas montañosas muy inclinadas con condiciones secas. Vive en 
cualquier terreno, de tierra húmeda, barreal, arenosa y arcillos, en lomas, laderas, 
barracas junto a los arroyos y ríos. Se desarrolla en áreas de nubosidad, con 
neblina frecuente. Su rango de temperatura va de 4 a 27 ºC y puede soportar 
temperaturas que bajen temporalmente a 0 ºC. Se distribuye altitudinalmente 
desde los 1400 – 3200 m sobre el nivel de mar. Dentro de México se encuentra en 
los estados de Durango, Chihuahua, Sinaloa, Sonora, Jalisco, Hidalgo, Morelos, 
San Luis Potosí, Veracruz, Michoacán, Nayarit, Puebla, Guerrero, Tlaxcala, 
Querétaro, Oaxaca, Chiapas y el Distrito Federal (Figura 2.2). 
(http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/9-
betul1m.pdf; Miranda, 1952). 
 
 
 
 
 
Figura 2.2 En gris se representa la distribución de la especie Alnus acuminata en la República 
Mexicana. 
 
http://es.winelib.com/wiki/Ca%C3%B1adas
http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/9-betul1m.pdf
http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/9-betul1m.pdf
 ANTECEDENTES 
6 
 
Árbol. 
Árbol perennifolio / caducifolio, de 20 m hasta 30 m de altura. Algunos individuos 
llegan a superar los 42 m de altura en plantaciones. Tronco de color gris cilíndrico 
o ligeramente ovalado, con un diámetro de 35 a 40 cm de grosor. Generalmente 
con varios troncos. De sexualidad monoica. 
 
Corteza. 
Corteza lisa o ligeramente rugosa, escamosa en individuos viejos, con frecuencia 
marcada con arrugas transversales o constricciones circundantes. 
 
Hojas. 
Hojas alternas con la lámina ovada o elíptica, de 6 a 15 cm de largo y 3 a 8 cm de 
ancho, los nervios laterales paralelos bien marcados y bordes agudamente 
aserrados (Miranda, 1952). 
 
Flor. 
Flores unisexuales, masculinas y femeninas sobre un mismo árbol, pero en 
inflorescencias diferentes. Flores masculinas agrupadas en amentos de 5 a 10 cm 
de largo, generalmente en agrupaciones de 3. Flores femeninas con brácteas 
formando un cono estrobiliforme, 3 a 4 en racimos, de 3 a 8 mm de largo en 
antesis; conos de 11 a 28 mm de largo y de 8 a 12 mm de diámetro. La flor es 
blanca y en forma de gusano. 
 
Fruto. 
Fruto elíptico a obovado, papiráceo a coriáceo, marrón oscuro cuando están 
maduros, con el margen alado y estilo persistente. Las alas angostas de 2 a 2.3 
mm de largo y 0.2 a 1 mm de ancho, el cuerpo de 1.5 a 3 mm de largo y 1.5 a 1.8 
mm de ancho. 
 
Raíz. 
Sistema radical poco profundo (de 1 a 2 m), amplio y extendido (2 a 3 m). 
 
http://es.winelib.com/wiki/Inflorescencia
http://es.winelib.com/wiki/Br%C3%A1ctea
http://es.winelib.com/wiki/Estr%C3%B3bilo
 ANTECEDENTES 
7 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.3 Alnus acuminata subsp arguta (Cd. Universitaria, UNAM). 
 
Flor 
Fruto 
Raíz 
Hoja 
Corteza 
 ANTECEDENTES 
8 
 
2.1.3.2 Usos 
La madera se emplea en la fabricación de varios artículos artesanales, puertas, 
pisos, cercas, muebles rústicos, cabos de fósforos, lápices, madera en rollo, 
aserrío, embalajes, mangos para herramientas, ebanistería, instrumentos 
musicales y como pulpa para fabricación de papel. Resulta un buen combustible y 
en construcción se emplea para puentes y pilotes (Miranda, 1952). La corteza 
contiene taninos que suelen emplearse en el curtido de cueros, además de teñir la 
lana de color marrón y las hojas dan un color amarillo. 
(http://aty.hipatia.net/elgg/news/weblog/2342.html). 
Es una especie forestal que tiene la propiedad de mejorar la fertilidad del suelo 
debido a que sus raíces fijan el nitrógeno atmosférico por lo que gracias a su 
rápido crecimiento y ventajas ecológicas, tiene un enorme potencial entre las 
especies leñosas y le da la facultad de colonizar suelos pobres (Marulanda, 2006). 
 
2.1.3.3 Usos Medicinales Populares 
Combatir las escrófulas, afecciones cutáneas y las enfermedades venéreas como 
sífilis (Miranda, 1952). La decocción de los frutos se utiliza para quitar la calentura, 
para desinflamar la garganta (Argueta, 1994), disminución del peristaltismo 
durante episodios de diarrea, disentería y para tratar la dispepsia (De la Cruz, 
1552, 1962). 
Las hojas maceradas se usan en aplicaciones medicinales para dolores 
musculares y de articulaciones, reumatismo e infecciones cutáneas. Como 
infusión se recomienda como parte de un tratamiento para la inflamación de 
próstata. Las hojas molidas y combinadas con grasa sirven para contener las 
hemorragias y cicatrizar heridas. Las hojas tiernas en infusión son recomendables 
para reumatismo y resfríos. Para el dolor de cabeza por insolación se colocan 
hojas en la frente y sien, sujetas con una venda. Para malestares antes del parto 
se toma un vaso caliente del cocimiento de la corteza (Argueta, 1994). Existe una 
patente y varias “invenciones de preparados farmacéuticos” a base de A. 
acuminata, para tratamientos de psoriasis, vitíligo y diabetes (PA/a/2004/007567). 
 
http://aty.hipatia.net/elgg/news/weblog/2342.html
 ANTECEDENTES 
9 
 
2.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA 
Las plantas destinan una cantidad significativa del carbono asimilado y de la 
energía a la síntesis de una amplia variedad demoléculas orgánicas que no 
parecen tener una función directa en procesos fotosintéticos, respiratorios, 
asimilación de nutrientes, transporte de solutos o síntesis de proteínas, 
carbohidratos y lípidos, que se denominan metabolitos secundarios. Estos 
compuestos derivados del metabolismo se distribuyen diferencialmente entre 
grupos taxonómicos; muchos de ellos presentan propiedades biológicas, otros 
desempeñan funciones ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos e 
importante valor medicinal o económico como en la industria cosmética, 
alimentaria, farmacéutica entre otros. Estos compuestos reciben también el 
nombre de productos naturales. El Esquema 2.1 representa un modelo 
simplificado de la biosíntesis de los metabolitos secundarios (Vanaclocha, 2003). 
 
Esquema 2.1 Biosíntesis de metabolitos secundarios. 
 ANTECEDENTES 
10 
 
El género Alnus biosintetiza diversos tipos de metabolitos secundarios como 
taninos, terpenos, azúcares, flavonoides, esteroles, saponinas y compuestos 
fenólicos (Illescas, 2008). 
 
2.2.1 Terpenos 
Constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios. La ruta 
biosintética de estos compuestos da lugar tanto a metabolitos primarios como 
secundarios. Entre los metabolitos considerados primarios se encuentran 
hormonas (giberelinas, ácido abscísico y citoquininas), carotenoides, clorofilas y 
plastoquinonas (fotosíntesis), ubiquinonas (respiración) y esteroles (ergosterol, 
sitosterol, colesterol de gran importancia en las estructura de membranas) 
(http://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf). 
Los terpenos son moléculas muy abundantes en los vegetales, suelen ser 
insolubles en agua y derivan todos ellos de la unión de unidades de isopreno (5 
átomos de C) (Figura 2.4). 
 
Figura 2.4 Estructura de la molécula de isopreno. 
 
De esta forma, los terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno 
(C5) que contienen: 
 
a) Monoterpenos: Terpenos de 10 átomos de carbono que contienen dos 
unidades de isopreno. Son ejemplos los aceites esenciales de muchas plantas 
a las que dan su olor y sabor característicos como el mentol, geraniol, 
limoneno, pineno, alcanfor etc. 
http://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf
 ANTECEDENTES 
11 
 
b) Sesquiterpenos: Terpenos de 15 átomos de carbono con tres unidades de 
isopreno. Entre ellos se encuentran el ácido abscísico que tiene un papel 
importante en la defensa de la planta debida a su sabor amargo. 
c) Diterpenos: Terpenos de 20 átomos de carbono por lo que tienen cuatro 
unidades de isopreno. Es de destacar las giberelinas y el fitol, un diterpeno de 
cadena abierta que forma parte de la estructura de las clorofilas. Las vitaminas 
A, E y K también son diterpenos. Uno de los diterpenos más importantes en 
aplicaciones médicas es el taxol por sus propiedades anticancerígenas. 
d) Triterpenos: Terpenos de 30 átomos de carbono que poseen seis unidades 
de isopreno, como ejemplos tenemos esteroides y esteroles derivados del 
escualeno. 
e) Tetraterpenos: Terpenos de 40 átomos de carbono con 8 estructuras de 
isopreno. En este grupo son abundantes las xantofilas y carotenos, pigmentos 
vegetales amarillo y anaranjado respectivamente. Dan color a los frutos, raíces 
como la zanahoria, flores, etc. 
f) Politerpenos: Cuando las moléculas contienen más de 8 unidades de 
isopreno. Son los hidrocarburos de alto peso molecular. La gutapercha y el 
caucho contienen varios miles de unidades de isoprenos y se usan en la 
fabricación de objetos de goma. 
 
2.2.1.1 Síntesis de Terpenos 
Se sintetizan a partir de metabolitos primarios por dos rutas: La del ácido 
mevalónico, activa en el citosol, en la que tres moléculas de acetil-CoA se 
condensan para formar ácido mevalónico que reacciona hasta formar isopentenil 
difosfato (IPP), o bien la ruta del metileritritol fosfato (MEP) que funciona en 
cloroplastos y genera también IPP. El isopentenil bifosfato y su isómero dimetilalil 
difosfato (DMAPP) son los precursores activados en la biosíntesis de terpenos en 
reacciones de condensación catalizadas por prenil transferasas para dar lugar a 
prenil bifosfatos como geranildifosfato (GPP), precursor de monoterpenos, farnesil 
difosfato (FPP) precursor de sesquiterpenos y geranilgeranil difosfato (GGPP) 
precursor de diterpenos (Esquema 2.2) (Ávalos, 2009). 
 ANTECEDENTES 
12 
 
 
Esquema 2.2 Síntesis de Terpenos 
 
 
erpenoides 
 
 ANTECEDENTES 
13 
 
2.2.1.2 Triterpenos 
Los triterpenos son una familia de terpenos que contienen 30 átomos de carbono, 
procedentes de la incorporación biosintética de seis unidades de isoprenilo. Se 
han descrito provenientes de fuentes naturales, más de 40 triterpenos cíclicos con 
fórmula C30H50, alrededor de 150 con fórmula C30H50O y además numerosos 
compuestos relacionados. Se piensa que tienen un origen biosintético resultado de 
la ciclación enzimática de escualeno (C30H50) o del óxido de escualeno (C30H50O) y 
se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza tanto en animales, 
vegetales y microorganismos (Rosellon, 2005; Dewick, 2002; 
http://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf) (Esquema 
2.3). Los triterpenos constituyen un interesante grupo de moléculas naturales, no 
solo por su relativa ubicuidad, su fácil extracción y aislamiento, sino también por 
sus actividades biológicas y aplicaciones. 
 
 
 
2.2.1.3 Familias de Triterpenos 
Dentro de los triterpenoides se encuentran distintas familias de compuestos como: 
Prostotanos, Lanostanos, Curcubitanos, Cicloartanos (con configuración silla-bote-
silla-bote), Dammaranos, Shionanos, Germanicanos, Taraxasteranos, Lupanos 
Oleananos, Taraxeranos, Phyllanthanos, Ursanos, Glutinanos, Friedelanos, 
Baueranos (con conformación silla-silla-silla-bote) (Esquema 2.4). 
Esquema 2.3 Síntesis de la molécula de escualeno 
http://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf
 ANTECEDENTES 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Óxido de 
escualeno 
silla – silla - silla- bote 
Dammaranos Bacarenos 
Lupanos 
Oleananos 
Germanicanos Taraxasteranos 
a 
b 
A 
 
-H
+ 
 
Ursanos 
b 
Phyllanthanos Taraxeranos 
Friedelanos Glutinanos Baueranos 
Esquema 2.4 Familias de triterpenos con conformación silla-silla-silla-bote. 
 ANTECEDENTES 
15 
 
2.3 CROMATOGRAFÍA 
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de 
los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o 
estacionaria y otra móvil (Skoog, 1994). Los componentes de la mezcla son 
transportados por la fase móvil (gas o líquido), y retenidos selectivamente por la 
fase estacionaria (líquido o sólido). Ambas fases son inmiscibles entre ellas 
(FEUM, 2008). Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 
1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa 
escritura a color. Tswett llevó a cabo la extracción de una mezcla de pigmentos de 
hojas verdes utilizando éter de petróleo y descubrió que era capaz de separar los 
pigmentos al hacer pasar el extracto a través de una columna rellenada con 
carbonato de calcio. Tswett utilizó como detector del experimento la simple 
observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era posible detectar 
bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando 
que la clorofila es sólo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las 
hojas de las plantas (Rubinson, 2001; Skoog, 2001). 
En la cromatografía, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad 
de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la 
estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, 
masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, afinidad por un sustrato 
y/o sus potencialesredox. 
Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la 
separación de una sustancia, según el mecanismo de separación y según el 
estado de la fase móvil (Skoog, 2001). 
 
2.3.1 Clasificación 
La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, 
mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. 
 
 
 
 ANTECEDENTES 
16 
 
Según el mecanismo de separación 
 Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un sólido en el que los 
componentes de la mezcla son retenidos de acuerdo a su diferente afinidad de 
adsorción sobre la superficie del sólido activo. La fase móvil puede ser un 
líquido o un gas (Fuerzas de Van der Waals). 
 
 Cromatografía de reparto (partición): Depende de la diferente solubilidad de 
los componentes de la mezcla en la fase estacionaria o fase móvil. 
 
 Cromatografía de exclusión (o de geles): La fase estacionaria es un gel 
formado por polímeros no iónicos porosos que retienen las moléculas según 
su tamaño y habilidad de penetrar en la matriz. La cromatografía de exclusión 
por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de 
macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de 
polímeros orgánicos sintéticos. 
 
 Cromatografía de intercambio iónico. La separación depende de la 
diferente afinidad para el intercambio de iones y la adsorción reversible de 
moléculas cargadas de los componentes de las muestra, a una resina con 
grupos iónicos de carga opuesta (fuerzas electrostáticas). Puede ser de dos 
tipos según la naturaleza electrostática de la fase sólida. 
 Intercambio iónico. La fase estacionaria con carga positiva, une 
aniones. 
 Intercambio catiónico. La fase estacionaria con carga negativa, une 
cationes. 
 
 Cromatografía de afinidad. La separación se basa en la especificidad 
biológica entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la fase 
estacionaria. En este tipo de cromatografía existen interacciones altamente 
específicas. 
 
 ANTECEDENTES 
17 
 
Según el estado de la fase móvil (Esquema 2.5) 
 Si es un líquido 
 Cromatografía liquido−liquido: Ambas fases son líquidas. Es una 
cromatografía de partición o reparto. 
 Cromatografía líquido−sólido: La fase estacionaria es sólida. Es una 
cromatografía de adsorción, intercambio iónico, exclusión y afinidad. 
 
 Si es un gas 
Es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e 
inorgánicos térmicamente estables y volátiles (Skoog, 2001). 
 Cromatografía gas−líquido: La fase estacionaria es líquida. Es una 
cromatografía de reparto o partición. 
 Cromatografía gas−sólido: La fase estacionaria es un sólido. Es una 
cromatografía de adsorción. 
 
 Si es un fluido supercrítico (fluido calentado a una temperatura superior a la 
temperatura crítica y simultáneamente comprimido a una presión mayor que 
su presión critica): Puede ser de partición o de adsorción 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Plana 
Esquema 2.5 Tipos de cromatografía según la naturaleza de la fase móvil y estacionaria. 
GAS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO 
Líquido Sólido 
 
 
 
Líquido Líquido Sólido 
 
 
 
Sólido 
 
 
 Adsorbente Tamices 
Moleculares 
Resina de intercambio 
iónico 
Adsorbente Tamices 
Moleculares 
Columna Columna Columna Columna Columna Columna Columna Columna 
 ANTECEDENTES 
18 
 
2.3.2 Cromatografía líquida 
La cromatografía de líquidos puede llevarse a cabo en columnas o sobre 
superficies planas 
 
Cromatografía plana 
Los métodos de cromatografía plana incluyen la cromatografía en papel (CP) y la 
cromatografía en capa fina (CCF) (Skoog, 1994). 
 
 Cromatografía en papel: El papel actúa como soporte de la fase estacionaria.. 
Es una forma combinada de cromatografías de partición y adsorción en la que 
la fase estacionaria es un disolvente absorbido presente en el papel. La fase 
móvil es una solución que consiste de un disolvente o de una mezcla de varios 
(Skoog, 2001) 
 
 Cromatografía en capa fina: La fase estacionaria es una capa de adsorbente 
de unos milímetros de espesor, fijado sobre un soporte sólido generalmente de 
aluminio, plástico o vidrio. Por ella se desplaza el eluyente transportando los 
componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos 
dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción 
(Rubinson, 2001; Skoog, 2001). 
 
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con 
relación a la distancia recorrida por la fase móvil. El grado de retención en 
cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de retención (Rf). 
 
 
 
El frente del disolvente es el límite alcanzado por la fase móvil y representa la 
distancia de desplazamiento del disolvente. El valor de Rf depende de las mismas 
 ANTECEDENTES 
19 
 
condiciones experimentales como lo es la composición de la fase móvil, el tipo de 
fase estacionaria, la temperatura y el tipo de compuestos separados. 
 
Cromatografía en columna 
Fue la forma original de cromatografía líquida realizada por primera vez por 
Tswett. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque con propiedades 
adsorbentes que van desde la alúmina, gel de sílice, tierra de diatomeas, hasta 
resinas sintéticas y derivados polisacáridos (Rouessac, 2000). 
La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente 
pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o por aplicación de presión. 
Se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el 
disolvente elegido, recogiéndose las fracciones salientes. 
 
2.3.3 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (CLAE) 
Este método es el más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, utiliza 
columnas con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia y la alta 
presión permite usar relleno de tamaño de partícula reducido para lograr la 
separación de los componentes a flujos razonables. 
http://www.jascofrance.fr/pdf/hplc.pdf 
 
2.3.3.1 Funcionamiento General 
La bomba envía al disolvente a través de tuberías de diámetro pequeño, 
generalmente de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. El analito pasa a 
través de la columna bombeando la fase móvil líquida con alta presión. La muestra 
se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil. Luego de que 
se produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla llegan al 
detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y 
esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de intensidad en función 
del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico 
corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula el área 
correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia. 
http://www.jascofrance.fr/pdf/hplc.pdf
 ANTECEDENTES 
20 
 
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los 
productos que salen de él (Rubinson, 2001; Skoog, 2001). 
 
2.3.3.2 Instrumentación 
Este sistema está compuesto básicamente de un reservorio de fase móvil, bomba, 
inyector, columna de separación y detector (Figura 2.5). 
 
Figura 2.5 Principales componentes de un Cromatógrafo de Líquidos 
Bombas 
La bomba tiene la función de proveer un flujo continuo del eluyente a través del 
inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son: 
- Rango de flujo: de 0.01 a 10 mL/min 
- Rango de presión: de 1 a 5000 psi 
 
Existen distintos tipos de bombas: 
- De presión constante: Fáciles de usar y bajo mantenimiento, evitan los 
pulsos de presión. Requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que 
las variaciones pueden producir fallos. 
- De flujo constante: Capaces de mantener el flujo. 
 
Fase 
Móvil Bomba 
Inyector 
Columna 
Residuos 
Procesador de Datos 
DetectorANTECEDENTES 
21 
 
Reservorios de disolvente 
Se pueden tener varios reservorios dependiendo del número de disolventes con el 
que se conforma la fase móvil. Van acompañados de filtros de acero inoxidable 
poroso que evitan la entrada de sólidos a la columna. 
La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes. Cuando 
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome disolventes 
de diferentes botellas en una proporción determinada y realice la mezcla en una 
cámara de mezclado generando una elución en gradiente en la cual varía la 
composición en forma continua o mediante etapas escalonadas. 
Si durante toda la separación se utiliza siempre el mismo disolvente o una mezcla 
de composición constante de varios disolventes, se denomina elución isocrática. 
 
Inyectores 
Los inyectores introducen muestras líquidas en un rango de volumen de 5 L a 
500 L con una alta precisión y alta presión. Normalmente se usan inyectores que 
poseen válvulas de 6 puertos con un serpentín que permite la inyección de 
muestra, la purga del sistema y la eliminación de burbujas. 
 
Columnas 
Las columnas de HPLC están hechas de acero inoxidable, con un diámetro interno 
de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del diámetro de las 
micropartículas que contiene la columna, que puede ser de 3- 10µm. Existe una 
gran variedad de materiales de relleno de las columnas según las distintas 
separaciones (generalmente sílice, aluminio o resina). 
 
Según la polaridad de columna a utilizar se tiene: 
 
 Cromatografía de fase Normal 
La fase estacionaria es polar (grupos ciano, amino y diol). El componente 
menos polar de la mezcla es el que eluye primero. 
 
 
 ANTECEDENTES 
22 
 
 Cromatografía de fase Reversa 
Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase 
estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar. La fase 
estacionaria típica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una cadena 
lineal con un grupo alcalino. Algunas consisten en silicatos alcalinos. El 
componente más polar de una mezcla es el primero en eluir. 
 
Termostatos de columna: 
Controlan la temperatura desde la cercana al ambiente hasta 150 ºC. Son 
importantes para mantener la columna a una temperatura constante durante todo 
el análisis puesto que las variaciones de temperatura pueden cambiar la 
viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido. 
 
Detectores 
Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la 
muestra. 
 Detectores selectivos: Responden a una propiedad del soluto en disolución. 
Son los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y 
detector electroquímico. 
o De fluorescencia: Es el detector más usado y el más preciso. Las 
sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en 
longitudes de onda en el espectro ultravioleta únicas para cada sustancia. 
o Electroquímicos: Se basa en la reacción de oxidación/reducción del analito 
con un electrodo, el nivel de reacción es proporcional a la concentración de 
analito, midiendo esto y comparándolo con el electrodo de referencia, da 
datos que se pueden usar para cuantificar. 
o De luz visible/ultravioleta: El detector es básicamente un espectrofotómetro 
que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, 
midiendo la absorbancia de las sustancias. 
 
 ANTECEDENTES 
23 
 
 Detectores universales: Responden cuando una propiedad de la fase móvil 
es cambiada por la presencia de un soluto. Son el detector del índice de 
refracción (RI) y el detector de conductividad. 
o De índice de refracción: La detección implica la medida del cambio del 
índice de refracción de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre 
el índice de refracción de la fase móvil y la muestra. 
o De conductividad electrolítica: El flujo pasa a través de un capilar con dos 
electrodos, la conductividad varía en función de la composición del eluyente 
y se obtiene una lectura. Es muy común en combinación con el HPLC de 
intercambio iónico. (García 2008; Rubinson, 2001; Skoog, 2001; 
(http://www.library4science.com/eula.html).
 OBJETIVOS 
24 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo general 
Determinar la estructura química de los componentes mayoritarios (marcadores) 
presentes en la corteza de la especie medicinal Alnus acuminata subsp. arguta 
(Betulaceae) para su identificación cromatográfica por CLAE. 
 
3.2 Objetivos particulares 
1. Aislar los metabolitos mayoritarios (marcadores químicos) presentes en la 
corteza de la planta Alnus acuminata subsp. arguta a partir del extracto 
hexánico. 
 
2. Comprobar y elucidar la estructura molecular de los marcadores químicos 
aislados por medio de métodos espectroscópicos y espectrométricos. 
 
3. Obtener el perfil cromatográfico del extracto hexánico de A. acuminata por 
CLAE. 
 
4. Identificar a los marcadores químicos dentro del extracto hexánico. 
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 
 
25 
 
4. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 
 
4.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 
4.1.1 Fragmentación 
Molino de cuchillas modelo Thomas Willey 4. 
Tamiz malla 5 mm de diámetro. 
4.1.2 Columna de percolación 
Columna de vidrio con una longitud de 75 cm x 5 cm de diámetro. 
Balanza gravimétrica OHAUSR modelo ScoutTM Pro. 
Cámaras de elución. 
Hexano destilado. 
Hexano RA. 
Acetato de Etilo RA. 
4.1.3 Columna preparativa 
Columna de vidrio con una longitud de 110 cm x 13 cm de diámetro. 
Sílica gel (0.063-0.200 nm) Merck®. 
Cromatoplacas de aluminio (0.20 mm Sílica gel 60 con indicador UV254 
fluorescente) MN®, Macherey-Nagel. Cromatografía analítica. 
Rotaevaporador BÜCHI Waterbath modelo B-480. 
Cámaras de elución. 
Hexano RA. 
Acetato de etilo RA. 
Solución reveladora de (NH4)4Ce(SO4)42H2O 
Lámpara de luz UV Spectroline 
 
4.2 Purificación de los metabolitos secundarios aislados 
Placas de vidrio preparativas con 0.250 mm de Sílica gel 60 con indicador 
fluorescente UV 254 Merck
®, 20x20 cm. 
Placa de vidrio preparativa con 0.250 mm de Sílica gel 60 con indicador 
fluorescente UV 254 Merck
®, 12x20 cm. 
 
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 
 
26 
 
4.3 Identificación molecular de los metabolitos 
Análisis Infra Rojo: Espectrofotómetro FTIR-Modelo Spectrum RX –I Perkin Elmer. 
Resonancia Magnética Nuclear: 1H: VARIAN INOVA 400MR Mod; 13C: VARIAN 
INOVA 400/100.5 VNMRS Mod. 
Cromatografía de gases/Espectrometría de Masas: Thermo electron corporation. 
Trace GC Ultra. High Resolution Magnetic Sector M3DFS; Leco Pagasos III. 
Agilent Tecnologies 689DN Network GC System. 
Software MestRec para el análisis de espectros. 
Medidor de punto de fusión Fisher-Jhons. 
 
4.4 Desarrollo del método por cromatografía de líquidos de alta 
resolución 
Filtro GHP 0.45 m Pall Corporation. 
Sonicador Sonicor modelo SC200TH. 
Centrífuga LABNET modelo 2200. 
Controlador Automated Gradient Controller WATERS-MILLIPORE. 
Bombas WATERS modelo 515. 
Termostato modelo TCM WATERS-MILLIPORE. 
Horno BECSA modelo 403099. 
Inyector Jassco AS-2055 Plus. 
Columna PrincetonSPHER-100 C18 100 Å 150 x 4.6 mm. 
Columna Simmetry C18 250 x 4.6 mm Waters. 
Detector Waters modelo 2487 Dual absorbance. 
Balanza analítica modelo Sartorius analítica. 
Equipo de cómputo con el software Millennium32. 
Matraces aforados de 5, 2 y 1 mL. 
Isopropanol grado HPLC. 
Acetonitrilo grado HPLC. 
n-Propanol grado RA. 
Tetrahidrofurano grado RA. 
METODOLOGÍA 
 
27 
 
5. METODOLOGÍA 
 
5.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 
5.1.1 Recolección 
Se obtuvo una muestra de corteza de la planta medicinal Alnus acuminata subsp. 
arguta recolectada en el municipio de Huistán, Chiapas (Figura 5.1). La 
identificación del material vegetal fue realizada por el Dr. Mario Ishihara del 
Herbario del Colegio de la Frontera Sur en Chiapas, donde se encuentra 
depositada unamuestra de referencia. El material vegetal fue donado por el Dr. 
Andrés Navarrete Castro. 
 
5.1.2 Secado 
El material vegetal se sometió a un proceso de secado a temperatura ambiente y 
bajo la sombra. 
 
5.1.3 Fragmentación 
La materia prima se trituró en un molino de cuchillas empleando como tamiz una 
malla de 5 mm de diámetro. 
 
Figura 5.1. Corteza de Alnus acuminata 
5.1.4 Extracción 
1162 g de la materia vegetal se empacaron en una columna de vidrio y se sometió 
a percolación por la acción sucesiva de hexano destilado a temperatura ambiente 
hasta agotar la extracción (Figura 5.2). 
METODOLOGÍA 
 
28 
 
Figura 5.2 
Columna de percolación (izquierda). 
Columna cromatografica (derecha). 
El extracto hexánico resultante se concentró a presión reducida hasta sequedad, 
obteniendo un residuo de 13.071 g, de los cuales se reservaron 240 mg para 
pruebas posteriores de actividad antimicrobiana. 
 
5.1.5 Fraccionamiento cromatográfico 
Partiendo de 12.831 g del extracto hexánico se realizó una columna preparativa 
abierta (Figura 5.2) con una relación de 1 g de extracto para 15.6 g sílica gel, 
empleando el siguiente sistema de elución y obteniéndose un total de 212 
fracciones. 
 Tabla 5.1 Sistema de elución del fraccionamiento 
cromatográfico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se aplicaron a cromatoplacas analíticas, cada uno de los eluatos para el 
monitoreo de la columna, utilizando como revelador sulfato cérico amoniacal 
(NH4)4Ce(SO4)42H2O y se juntaron aquellos que mostraron poseer los mismos 
componentes mayoritarios para obtener las siguientes fracciones primarias. 
 
 
Sistema de elución Relación Eluatos (100 mL) 
Hexano 100 1-11 
Hexano/AcOEt 95:5 12-60 
Hexano/AcOEt 90:10 61-98 
Hexano/AcOEt 85:15 99-123 
Hexano/AcOEt 70:30 124-145 
Hexano/AcOEt 65:35 146-165 
Hexano/AcOEt 60:40 166-173 
Hexano/AcOEt 50:50 174-182 
Hexano/AcOEt 40:60 183-186 
Hexano/AcOEt 20:80 187-190 
AcOEt 100 191-199 
CHCl3 100 200-207 
Acetona 100 208-212 
METODOLOGÍA 
 
29 
 
Tabla 5.2 Fraccionamiento primario del extracto hexánico de A. acuminata 
 
Eluatos Fracciones 
1-7 I 
8-19 II 
20-29 III 
30-32 IV 
33-37 V 
38-40 VI 
41-58 VII 
59-64 VIII 
65-69 IX 
70-77 X 
78-84 XI 
85-90 XII 
91-101 XII 
102-111 XIV 
112-121 XV 
122-126 XVI 
127-132 XVII 
133-139 XVIII 
140-154 XIX 
155-158 XX 
159-169 XXI 
170-187 XXII 
188-193 XXIII 
194-202 XXIV 
202-212 XXV 
 
 
5.2 Purificación de los metabolitos secundarios aislados 
5.2.1 Recristalización 
De la gran cantidad de los componentes presentes en el extracto hexánico, los 
compuestos “A2”, “A”, “B”, “D”, “E”,” F” y “G” cristalizaron espontáneamente de las 
fracciones agrupadas. Esos cristales se purificaron por recristalización 
METODOLOGÍA 
 
30 
 
principalmente por par de disolventes hexano-acetato de etilo. Su pureza se 
analizó por cromatografía en capa fina. 
Los compuestos “A2”, “E” y “F” se purificaron de manera independiente por CCF 
preparativa. 
El compuesto H se intento aislar por reacciones de acetilación, no obteniéndose 
un resultado satisfactorio. 
 
5.2. 2 Placas preparativas 
Para aislar “A2”, fue necesario realizar una placa preparativa que ayudó a 
separarlo de una parte de “A”, por lo que se utilizó una placa de 0.250 mm de 
espesor con sílica gel 60 con una aplicación de 18 cm (122 mg de mezcla). Se 
dejó correr con una fase móvil compuesta de cloroformo 100%. Posteriormente se 
rasparon las bandas con Rf 0.75 y 0.50; se desadsorbieron de la gel de sílice con 
CH2Cl2 para su posterior separación de la sílica por filtración obteniendo “A2” y 
“A”, respectivamente. 
 
Adicionalmente, para lograr la separación adecuada entre “E “y “F” se realizó una 
placa preparativa del mismo espesor con una aplicación de 10 cm (20 mg). Se 
dejó correr por duplicado utilizando como fase móvil cloroformo 100%. Después 
los compuestos con Rf 0.7 y 0.8 fueron raspados y desadsorbidos con CH3Cl para 
posteriormente concentrarlos obteniendo “E” y “F” respectivamente. 
 
5.3 Identificación molecular de los metabolitos 
Los compuestos obtenidos se analizaron por métodos espectroscópicos, y por 
cromatografía de gases/espectrometría de masas para elucidar su estructura 
molecular. 
En el esquema 5.1 se resume el procedimiento general que se siguió para la 
extracción, aislamiento, purificación e identificación estructural de los metabolitos 
contenidos en el extracto hexánico de A. acuminata. 
 
 
METODOLOGÍA 
 
31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esquema 5.1 Desarrollo general del procedimiento de aislamiento e identificación de los 
metabolitos secundarios 
 
Colecta e identificación 
botánica de la planta Alnus 
acuminata subsp arguta. 
Fragmentación de 
la corteza. 
Secado de la corteza. 
Obtención del 
extracto hexánico 
por percolación. 
Aislamiento de los componentes 
mayoritario del extracto por procesos 
cromatográficos. 
Purificación de los componentes obtenidos 
en el extracto (cristalización, CCF y CCP). 
Determinación de la estructura 
molecular de los compuestos. 
Desarrollo del método por HPLC 
para la identificación de los 
componentes. 
CG 
Métodos 
espectroscópicos.
 
Métodos 
espectrométricos.
 
METODOLOGÍA 
 
32 
 
5.4 Desarrollo del método por cromatografía de líquidos de alta resolución 
5.4.1 Optimización de la obtención de la muestra 
Se pesaron por duplicado 5 g de la corteza de A. acuminata triturada y tamizada 
por malla 5 de mm de diámetro. Se le agregaron 65 mL de hexano y 65 mL de 
CH2Cl2 de manera independiente. Se sometió a sonicación por 30 min. Los 
extractos obtenidos fueron concentrados hasta sequedad a presión reducida. De 
los extractos sólidos obtenidos se pesaron por separado 25 mg de cada uno en 
matraces volumétricos de 5 mL, se disolvieron y aforaron con n-propanol. Estas 
soluciones se filtraron con un Filtro GHP 0.45 m y se inyectaron al CL (10 L) 
para identificar los componentes del extracto. La extracción se comparó por CCF 
(Figura 6.1) y posteriormente por inyección al CL (Cromatograma 3). De acuerdo a 
los resultados obtenidos, se eligió al CH2Cl2 como el disolvente idóneo para 
trabajar. (Esquema 5.2) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esquema 5.2 Metodología para la obtención del estándar del extracto CH2Cl2 
 
 
 
5000 mg de 
Materia Prima 
65 mL de 
CH2Cl2 
Sonicar 
30 min 
Evaporar 
a presión 
reducida 
Pesar 25 
mg del 
extracto 
Aforar con n-propanol a 
5 mL 
 
METODOLOGÍA 
 
33 
 
5.4.2 Preparación de los estándares 
De cada uno de los compuestos de referencia obtenidos por purificación se 
prepararon estándares de concentración (1 mg/mL) los cuales fueron disueltos en 
el disolvente más apropiado (en el que presentaron una solubilidad total dentro de 
isopropanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano y n-propanol) y éstos se inyectaron al CL 
(10 L) previa filtración con un Filtro GHP 0.45 m. 
 
5.4.3 Obtención del cromatograma de líquidos del extracto diclorometánico 
Para desarrollar el método cromatográfico (Figura 5.3) fue preciso determinar las 
condiciones ideales en las que se trabajaría el extracto. 
Como primer paso se realizó una búsqueda bibliográfica sobre métodos para 
cuantificar o identificar por HPLC compuestos triterpénicos parecidos a los 
obtenidos en este trabajo y que ayudaran en la toma de decisiones sobre las 
condiciones en las que se trabajaría. 
 
Tabla 5.3 Condiciones cromatográficas iniciales para la separación de los 
componentes del extracto diclorometánico de A. acuminata. 
 
Variables Condiciones 
Columna PrincetonSPHER-100 C18 100A 3u 150 x 4.6 mm 
200 nm 
Modo de inyección Isocrático 
Fase móvil CH3CN 100% 
Flujo 0.6 mL/min 
Temperatura 40°C 
 
 
A partir de los cromatogramas obtenidos,se propuso el generar un gradiente para 
mejorar la separación, la resolución de los picos y acotar su tiempo de retención. 
Las condiciones cromatográficas y el gradiente con que se trabajó se muestran 
en las tablas 5.4 y 5.5 respectivamente. 
 
METODOLOGÍA 
 
34 
 
Tabla 5.4 Condiciones cromatográficas para el gradiente en la separación de los 
componentes del extracto diclorometánico de A. acuminata 
 
Variables Condiciones 
Columna PrincetonSPHER-100 C18 100A 3u 150 x 4.6 mm 
200 nm 
Modo de inyección gradiente 
Fase móvil CH3CN: H2O (95:5) 
Temperatura 40°C 
 
5.4.4 Cambio de columna 
Debido a la poca reproducibilidad e inconsistencias que se presentaron a lo largo 
del tiempo trabajando con la columna PrincetonSPHER-100 C18 100A 3u 150 x 
4.6mm, se propuso el cambiar a una Symmetry C18 250 x 4.6 mm y reajustar el 
método ya antes propuesto a esta nueva columna. Las condiciones para esta 
columna se reportan en la tabla 5.5. 
 
Tabla 5.5 Condiciones establecidas en la nueva columna 
 
Variables Condiciones 
Columna Symmetry C18 250 x 4.6 mm 
200 nm 
Modo de inyección Isocrático 
Fase móvil CH3CN 100% 
Flujo 1 mL/min 
Temperatura 40°C 
 
 
5.4.5 Obtención del cromatograma de los estándares 
Una vez obtenidas las condiciones ideales para la obtención del cromatograma del 
extracto y que este fuera reproducible, se procedió a la obtención de los 
cromatogramas correspondientes a cada uno de los estándares de los metabolitos 
aislados (A2, A, D, E, F y G) a las condiciones determinadas anteriormente. 
 
 
METODOLOGÍA 
 
35 
 
5.4.5 Identificación de los estándares en el cromatograma del extracto 
Se registró el cromatograma de líquidos de cada uno de los metabolitos aislados 
por cromatografía en columna abierta y posteriormente se realizó la coinyección 
de las mezcla 1 a 1 v/v (10 L) de los mismos sobre una muestra del extracto 
preparado según el apartado 5.4.1. 
 
5.4.6 Obtención del cromatograma con los siete estándares obtenidos. 
Se obtuvo un cromatograma que presentó solo los siete estándares para lo cual se 
realizó una solución con 20 L de cada uno de los estándares cuya concentración 
es de 1 mg/mL. Posteriormente se inyectaron (10 L) y se confirmaron los tiempos 
de retención. 
 
 
Figura 5.3 Cromatógrafo de líquidos utilizado para el desarrollo del método. 
 
A continuación, en el esquema 5.3, se muestra la metodología general utilizada 
para el desarrollo del método para la identificación de los metabolitos secundarios 
por cromatografía de líquidos de alta resolución. 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esquema 5.3 Etapas del desarrollo del método para la identificación de los metabolitos 
secundarios por CLAE. 
Desarrollo del método por cromatografía 
de líquidos de alta resolución. 
Optimización de la 
obtención del extracto 
Determinación de 
la solubilidad para 
la preparación de 
los estándares. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Búsqueda bibliográfica 
de las condiciones. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Selección de columna, 
fase móvil, velocidad 
de flujo, temperatura y 
longitud de onda. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Obtención del 
perfil 
cromatográfico 
del extracto 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Determinación del 
cromatograma de 
cada uno de los 
estándares 
aislados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Obtención y mejoramiento 
del cromatograma del 
extracto utilizando modo 
gradiente de elución. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Identificación de cada uno de los estándares 
en el cromatograma del extracto por medio de 
coeluciones. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
37 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
6.1 Obtención de los metabolitos secundarios mayoritarios 
6.1.1 Obtención del extracto hexánico y fraccionamiento cromatográfico 
El objetivo principal de este trabajo es la determinación de la estructura química de 
los componentes mayoritarios (marcadores) presentes en la corteza de la especie 
medicinal Alnus acuminata. Es por esto que 1162 g de materia prima se 
sometieron a percolación a temperatura ambiente con hexano destilado 
obteniéndose 13.07 g de extracto hexánico seco, del cual 12.83 g se fraccionaron 
en sus componentes a través de una columna abierta de gel de sílice. En la Tabla 
6.1 se muestran los resultados obtenidos del fraccionamiento, el número de 
fracciones reunidas, así como las claves de los metabolitos encontrados. La Tabla 
6.2 muestra los rendimientos de los mencionados compuestos. 
 
Tabla 6.1 Metabolitos secundarios presentes en el fraccionamiento primario del 
extracto hexánico de A. acuminata. 
 
Eluatos Fracciones 
 
Compuesto 
presente 
 
Eluatos Fracciones 
 
Compuesto 
 presente 
1-7 I Ceras 85-90 XII D 
8-19 II Ac. Grasos 91-101 XIII D, E 
20-29 III A2 + A 102-111 XIV E, F 
30-32 IV A 112-121 XV F 
33-37 V A, B 122-126 XVI F 
38-40 VI A, B 127-132 XVII F, G 
41-58 VII A, B, C 133-139 XVIII G 
59-64 VIII A, B, C 140-154 XIX G, H 
65-69 IX C, D 155-158 XX G, H 
70-77 X D 159-169 XXI H 
78-84 XI D 170-202 XXII-XXV - 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
38 
 
Tabla 6.2 Compuestos obtenidos del fraccionamiento cromatográfico del extracto 
hexánico y su rendimiento. 
 
Compuesto Cantidad recuperada (mg) Rendimiento (%) 
(mg recuperados/mg extracto x100) 
 
A2 6 0.046 
A 234 1.823 
B 23 0.179 
D 1012 7.887 
E 14 0.109 
F 20 0.156 
G 79 0.616 
 
 
6.2 Purificación de metabolitos secundarios aislados 
Para purificar los compuestos obtenidos reportados en la tabla 6.1, se hizo uso de 
técnicas de recristalización, lavados con diferentes disolventes grado R. A. y con 
el uso de placas preparativas, obteniéndose los siguientes resultados en cuanto a 
solubilidad de los metabolitos mayoritarios. 
 
Tabla 6.3 Solubilidad de los metabolitos secundarios aislados frente a distintos 
disolventes. 
DISOLVENTE A2 A B D E F G 
Hexano ++ + + - - - - 
AcOEt ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 
CH3CN + + +++ ++ ++ ++ ++ 
Isopropanol + + ++ +++ ++ ++ ++ 
n-Propanol ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ 
CH2Cl2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 
CDCl3 ++ ++ ++ ++ ++ ++ + 
 
-: Insoluble; 
+: Poco soluble; 
++: Medianamente soluble; 
+++: Totalmente soluble 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
39 
 
6.3 Identificación molecular de los metabolitos 
Una vez purificados los metabolitos aislados, se tomaron muestras de cada uno 
para realizar análisis espectroscópicos (IR), espectrométricos (RMN-1H, 13C, y 
experimentos COSY, HSQC, HMBC y NOE) y cromatografía de gases acoplada a 
espectrometría de masas para llevar a cabo la elucidación de su estructura 
molecular. 
Los compuestos aislados de las fracciones de menor polaridad, consistieron en 
ceras y ácidos grasos de acuerdo con sus características físicas y 
espectroscópicas (IR y RMN-1H). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
40 
 
6.3.1 Identificación de 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno (A2) 
De las fracciones primarias 30 a 32, se aisló un sólido cristalino con punto de 
fusión 289-291 °C que fue caracterizado de acuerdo a las siguientes constantes 
espectroscópicas (Tabla 6.4): 
1. En el espectro de IR (Espectro 1) se observan absorciones para grupo 
carbonilo de éster (1729 cm -1) , en 2924, 1560, 1460 cm-1, bandas para 
grupos C-H alifáticos, en 1266 y 1121 cm -1, bandas intensas para la vibración 
C-O. 
2. El espectro de RMN de carbono 13 (Espectro 3), mostró 30 señales, que 
sugirieron la presencia de un compuesto triterpenoide. En estas señales, de 
acuerdo a las correlaciones encontradas en el espectro HSQC (Espectro 4) se 
observaron señales para 8 metilos, 10 metilenos, 5 metinos y el resto (8) 
debían corresponder a carbonos cuaternarios. En esas señales se corroboró 
el carbonilo de éster (170.9ppm), un doble enlace trisubstituído (157.9 ppm, 
carbono singulete y 116 ppm carbono doblete con H 5.532). En 81.0 ppm se 
localizó un carbono doblete ( H 4.46) asignado a un carbono base de un 
oxígeno de éster. En el espectro de RMN-1H (Espectro 2) en la zona entre 
0.821 y 1.091 ppm se apreciaron 8 señales singulete intensas de grupos 
metilo. De acuerdo a las señales observadas en el espectro HMBC y COSY 
(Espectro 5 y 6 respectivamente), el doble enlace debía estar situado entre las 
posiciones 14 y 15 de la molécula, por sus correlaciones con los metilos 26 y 
27 y con el metileno en 16 ( H 1.957 y 1.64). El esquema de señales en los 
espectros sugirió la estructura de un compuesto con esqueleto de tipo 
oleanano y el espectro de masas corroboró el peso molecular del 3 -O-acetil-
13 metil- 27-norolean-14-eno (A2) (M+ 468) y coincidió para una fórmula 
molecular de C32H52O2, además de corroborar las pérdidas de un grupo metilo 
en m/z 453 (M+ - 15) y el grupo acetilo en m/z 393 (M+ - 60) (Tabla 6.3, 
espectro 7). Las características físicas y espectroscópicas resultaron de 
acuerdo con lo encontrado en la literatura (Beaton, 1955; AIST). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
41 
 
Tabla 6.4 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “A2” 
A2. 3 -O-acetil-13 metil- 27-norolean-14-eno 
 
 
 
C32H52O2 
 
P. f. experimental = 289-291°C 
(303-305 °C lit.) 
 
R máx (pastilla KBr) cm
-1 (Espectro 1): 3419, 2924, 1729, 1605, 1560, 1460, 
1354, 1266, 1121, 969 y 721. 
 
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) ppm (Espectro 2), : 5.53 (1H, dd, J = 3.4, 8.2 Hz, H-
15), 4.46 (1H, dd, J = 5.8, 9.8 Hz, H-3), 2.04 (3H, s, CH3-CO-), 1.95 (1H, dd, J = 
3.0, 14.4 Hz, Ha 16), 1.64 (m, H-b16), 1.58 (m, H-2), 1.09 (3H, s, CH3), 0.95 (6H s, 
CH3), 0.90 (3H, s, CH3), 0.90 (3H, s, CH3), 0.87 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, s, CH3) 
0.82 (3H, s, CH3). 
 
RMN 13C (CDCl3) ppm (Espectro 3): 170.9 (CH3CO-), 157.9 (C-14), 116.9 (C-15), 
81.0, 55.6, 49.1, 48.7, 41.2, 37.8, 37.6, 37.5, 37.3, 36.6, 35.7, 35.1, 33.6, 33.3, 
33.0, 29.9, 29.8, 29.7, 28.8, 27.9, 25.9, 23.4, 21.3, 21.2, 18.6, 17.5, 16.5 y 15.5. 
 
CG: 14.44 min 
 
EMIE m/z (Int. Rel) (Espectro 7): 468 [M+] (8.3), 453 (11.1), 393 (19.4), 365 (11.1) 
344 (38.8), 329 (27.7), 316 (11.1), 284 (22.2), 269 (55.5), 257 (16.6), 241 (13.8), 
231 (11.1), 218 (22.2), 205 (36.1), 204 (100), 189 (52.7), 175 (22.2), 161 (22.2), 
147 (36.1), 133 (50), 121 (41.6), 107 (36.1), 95 (27.7), 81 (19.4), 69 (19.4), 55 
(11.1). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
42 
 
6.3.2 Identificación de 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona (A) (Taraxerona) 
De la fracción primaria IV se aisló un sólido cristalino (P. f. 232-335 °C) que se 
purificó por recristalización de hexano-acetato de etilo. Este compuesto también se 
identificó por CCF como componente en mezcla hasta la fracción 64. Su estructura 
química se confirmó por las siguientes constantes espectroscópicas (Tabla 6.5). 
1. En el espectro de IR (Espectro 8) se observaron bandas intensas para 
numerosos grupos hidrocarbonados alifáticos en 3048, 2939, 2863 y 2853, así 
como en 1473, 1463 cm-1, entre otros. En este mismo espectro se observa 
una banda en 1709 cm-1 para la vibración de grupo carbonilo de cetona. La 
banda en 3048 cm-1 denotó la presencia de dobles enlaces. 
2. El espectro de carbono-13 (Espectro 13) mostró 30 señales lo que sugirió una 
estructura triterpenoide. De acuerdo a las correlaciones encontradas en el 
espectro HSQC (Espectro 11) se observaron señales para 8 metilos, 10 
metilenos, 4 metinos y el resto (8) debían corresponder a carbonos 
cuaternarios. Este mismo espectro corroboró la existencia de un grupo cetona 
( C 217.4), un doble enlace trisubstituído (de acuerdo a sus correlaciones en el 
espectro HSQC), en 157.5 y 117.1 ( H.5.56). El espectro de RMN-
1H (Espectro 
9), mostró además un grupo metileno alílico en 1.653 (Hb) y 1.923 (Ha) ppm y 
un metileno vecino a un carbonilo en 2.57 ppm. El doble enlace en el 
esqueleto se situó entre las posiciones 14 y 15, debido a que en el espectro de 
masas correspondiente (Espectro 14) se observaron fragmentos de gran 
intensidad en m/z 300 (pico base) y 204 que en la literatura se describen como 
diagnósticos para la fragmentación de un esqueleto de tipo taraxerano 
(Yamaguchi, 1970) El espectro de masas estuvo de acuerdo para una fórmula 
molecular de C30H48O. El análisis de las características anteriores condujo a la 
confirmación de la estructura de la 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 
(taraxerona) para el compuesto A. Las características físicas y 
espectroscópicas están de acuerdo con lo encontrado en la literatura (Nobuko, 
1987; Ueda, 1961; Valente, 2004). 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
43 
 
Tabla 6.5 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “A” 
A. 13 -Metil-27-norolean-14-en-3-ona 
 
C30H48O 
 
P. f. experimental= 232-235°C 
(240-241 °C lit.) 
 
R máx (pastilla KBr) cm
-1 (Espectro 8): 3400, 3048, 2939, 2863, 2853, 
1709,1640, 1473, 1463, 1450, 1385, 1376, 995. 
 
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) ppm (Espectro 9), : 5.56 (2H, dd, J = 2.8, 6.62 Hz, H-
15), 2.57 (1H, m, H-2), 2.32 (1H, m, H-1), 2.03 – 2.12 y 1.1 – 1.85 (m, H- restantes 
en la molécula), 1.92 (m, Ha-16), 1.86 (1H, m, H-5), 1.65 (1H, m, Hb-16), 1.14 (3H, 
s, CH3-26(27)), 1.08 (s CH3-23(24)), 1.06 (s CH3-23(24)), 0.95 (3H, s, CH3), 0.91 
(3H, s CH3-26(27)), 0.83 (s CH3). 
 
RMN 13C (CDCl3) ppm (Espectro 10): 217.4 (C-3), 157.5 (C-14), 117.1 (C-15), 
55.7, 48.7, 48.5, 47.5, 40.6, 38.8, 38.3, 37.6, 37.5, 36.6, 35.7, 35.0, 34.1 (C-1), 
33.5, 33.3, 33.0, 29.9, 29.8, 29.6, 28.7, 26.1, 25.5, 21.4, 21.3, 19.9, 17.4 y 14.8. 
 
CG: 11.80 min 
 
EMIE m/z (Int. Rel) (Espectro 14): 424 [M+] (28), 409 (26), 300 (100), 285 (72), 
272 (14), 257 (12), 243 (10), 217 (16), 204 (84), 189 (24), 175 (10), 161 (14), 149 
(22), 133 (54), 121 (28), 109 (32), 95 (30), 81 (22), 69 (28), 55 (20). 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
44 
 
6.3.3 Identificación de 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al (B) 
El compuesto “B” se aisló de las fracciones primarias V a VIII agrupadas en 4 
cosechas de cristales (Tabla 6.1). Se encontró en mezclas con los compuestos “A” 
y “C” para purificarse mediante sucesivos lavados en caliente con hexano y 
acetato de etilo al tratar de aislar el compuesto “A”, quedando como remanente en 
las aguas madres y se identificó de la forma siguiente. 
1. Al estar en mínima concentración en el extracto (6 mg), no se realizó espectro 
de IR (Tabla 6.6). Sin embargo, el espectro de 13C (Espectro 16), mostró 
señales para 32 átomos: 8 metilos, 10 metilenos, 5 metinos y el resto (8) se 
asignaron a carbonos de tipo cuaternario. Dos señales se asignaron a grupos 
carbonilo ( C.207.5 y 171.0), adjudicados a un carbonilo de aldehído o cetona 
y a un grupo éster (acetilo por su desplazamiento químico en RMN-1H: 2.02 
ppm). La confirmación del aldehído se mostró en el espectro 15 
correspondiente de RMN-1H ( H.9.37). Un doble enlace trisubstituído se 
encontró por las señales en 5.32 ppm y en C.142.9 y 123.1), mismas que 
correlacionaron en el Espectro HSQC (Espectro 17). Las posiciones relativas 
tanto del grupo aldehído en C-28 como del acetilo en C-3 y el doble enlace 
entre C-12 y C-13, se elucidaron mediante la observación del espectro HMBC 
(Espectro 18) y la estructura para el compuesto B correspondió al 3 -acetiloxi-
olean-12-en-28-al. Las características físicas y espectroscópicas están de 
acuerdo con lo encontrado en la literatura (Kim, 2004; Shamma, 1959) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
45 
 
Tabla 6.6 Datos físicos y espectroscópicos del compuesto “B” 
B. 3 -Acetiloxi-olean-12-en-28-al 
 
C32H50O3 
 
P. f. experimental= 232-235°C 
(225-228 °C lit.) 
 
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) (Espectro 15), : 9.37 (1H, s, -CHO), 5.32 (1H, m, H-
12), 4.46 (dd, J = 8, 8.4 Hz, H-3), 2.60 (1H, dd, J = 4.2, 13.8, H-18), 2.02 (3H, s, 
CH3-CO-), 1.11 (3H, s, CH3-27), 0.91 (s,