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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA OBTENCIÓN DE MIMÓTOPOS DEL ANTÍGENO P24 DIAGNÓSTICO DE LA TENIASIS CAUSADA POR Taenia solium T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE : QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO P R E S E N T A : A L F O N S O O D I N P É R E Z R U I Z MÉXICO D.F 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO PRESIDENTE: Abel Gutiérrez Ramos VOCAL: Alejandro Camacho Cruz SECRETARIO: Abraham Landa Piedra 1er. SUPLENTE: Beatriz Ruiz Villafán 2° SUPLENTE: José Cordero Hernández SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: EL PRESENTE TRABAJO DE TESIS SE REALIZÓ EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE Taenia solium DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNAM, BAJO LA DIRECCIÓN DEL DR. ABRAHAM LANDA PIEDRA. ESTE TRABAJO DE INVESTIGACION FUE APOYADO POR EL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA (CONACyT) CON EL CONTRATO 80134-M (DESARROLLO DE FÁRMACOS BIOLÓGICOS CONTRA LA Taenia solium.). EL ALUMNO ALFONSO ODIN PÉREZ RUIZ RECIBIÓ BECA DEL PROYECTO CONACyT 80134-M CON NÚMERO DE BECARIO 15100. ASESOR DEL TEMA: ______________________________ Dr. Abraham Landa Piedra SUSTENTANTE: __________________________________ Alfonso Odin Pérez Ruiz A Magali Ruiz Herrera quien después de darme la vida sin importar nada, siempre me lo ha dado todo. A Brenda y Diana Alfonso y Mara AGRADECIMIENTOS A la UNAM, que me ha dado la oportunidad de seguir adelante durante todos estos años, en donde he vivido cosas que jamás olvidare, he hecho cosas que jamás creí posibles, y he conocido gente que siempre será parte de mí. A la Facultad de Química, en donde descubrí que las oportunidades hay que tomarlas, y que rendirse no es una opción. Al Dr. Abraham Landa Piedra, quien me dio la oportunidad de realizar este trabajo, me brindó su apoyo y amistad. A Alicia Ochoa Sánchez un agradecimiento muy especial. Sin todo el tiempo, paciencia, ayuda, enseñanzas, consejos y tips que me brindaste, esto no sería posible por ningún motivo. Muchas muchas muchas muchas Gracias Alice!! A Marco Romo, por aguantar todo este tiempo y echarle ganas. A mi madre Magali Ruiz Herrera, quien simplemente ha hecho todo lo posible e imposible por que esto suceda y sea una realidad. Gracias y esto es para ti! A mis hermanas Brenda y Diana, quienes con sus palabras, chistes y amor me dieron fuerzas para demostrarles que si uno lo quiere, por más trabajo que cueste lo puede obtener. Espero que esto sea un aliciente para ustedes, saben que siempre cuentan conmigo! A mi papá Alfonso Pérez y Mara Padilla, quienes han esperado por esto siempre, creyendo en mi. A mis abuelitas Juana y María, por todo su amor, todos sus abrazos y todos sus besos. A mis abuelos Adolfo y Roberto, por darme un ejemplo a seguir siempre y por darme estos genes viajeros, soñadores, y pata de perro. A Carmela Ruiz por su apoyo incondicional y ser mediadora en aquellos malos momentos que todos tenemos. Por ser mi segunda mamá y entenderme. A Jacqueline Cornejo Dávila, por tu amor, tu cariño, tu sabiduría, tus besos, tus brazos. Por todo lo que me has dado, por todo lo que hemos recorrido juntos, por todo lo que significas para mí en la vida, gracias siempre amore, por hacerme soñar y siempre querer más. A mi tío Víctor por todo el apoyo que siempre me ha dado, por que la distancia no nos aleja. A mi tía Maluchi, Brianda y Pablo Adolfo, por toda esa alegría y entusiasmo que siempre los embarca y me han compartido cuando estoy con ustedes. A mi tío Adolfo y mi tía Mariana por recibirme en su casa siempre, aguantar mis travesuras y darme todo su cariño. A mis primos Tony y Adolfo, por ser mis mejores amigos en esas largas vacaciones que pasaba con ustedes. A mi tío José María por su amistad, sus palabras y su forma tan especial de ser. A mi tía Yola y mi tío Andrés por aguantarme y quererme como uno más de sus hijos. A mi tía Betty, mi tío Tomás y mis primas Betty, Gaby y Eli quienes siempre se preocuparon y me apoyaron para obtener este logro. A mi primo Andrés por todo el tiempo, experiencias, situaciones, etc, etc, etc etc, que hemos vivido juntos. Eres lo mas cercano a un hermano que he tenido, gracias. A Laura Dávila, Víctor Cornejo, Yolita y Fermín por recibirme en su familia como si fuera la mía y brindarme todo su cariño desde el primer día que nos conocimos. A mis amigos Víctor, Josué y Omar, quienes con sus palabras y amistad, no solo me hicieron reír, también me hicieron abrir los ojos muchas veces y regresar al camino adecuado, gracias por sus consejos amistad y sabiduría. A Alejandra García Hernández porque fuiste parte de mi aprendizaje, de mi crecimiento y siempre te lo voy a agradecer. A Jocabed por tu amistad incomparable. A Adriana Nava por que tu amistad no se compara con ninguna otra cosa, porque siempre me apoyaste sin importar lo que pasara o sucediera o aconteciera, porque tú también me impulsaste siempre a hacer esto, a hacer lo que yo quisiera. A mis amigos de Logos y de la Chavitos Daniel, Chets, Mich, Santiago, Sánchez, Memelas, Changuito, Tops, Marin, Guzmi, Piliar, Arlene, Armando Gutiérrez (Barney), David Cervantes, Alejandra Cordero, Frida, Daniel (Felipe), Chichi Ortiz, Javier Castañeda, Federico Hulverson, Montserrat Morales. A mis amigos de la Facultad de Química López, Toro, Ana, Emilio, Temoc, César, Paola, Wendy, Laura, Joanna, Cangas, Ivette, Bola, Elechi, Ingemar, Ricardito, Charles Ortínez, Phill, Abril. A todos en el laboratorio, Richie, Oscar, Omar, Vera Teresa, Aramis, Julián. A mis amigos Jorge, Adrián, Calis, Beto y Juán. Gracias a todos todos todos los que durante esta eternidad estuvieron conmigo y me apoyaron. ESTO ES GRACIAS A Y USTEDES, POR USTEDES Y PARA USTEDES 1 ÍNDICE ABREVIATURAS……………………………………………………………………………….………..4 RESUMEN……………………………………………………………………………………….…….……5 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….…………………6 1.1. Taenia solium………………………………………………………………….……..8 1.1.1. Clasificación científica…………………………………………………..8 1.1.2. Generalidades del parásito………………………………….……….8 1.1.2.1. Morfología………………………………….………………………………….9 1.1.2.1.1. Huevo…………..………………………………………………………9 1.1.2.1.2. Larva o Cisticerco…………..…………………………………10 1.1.2.1.3. Gusano adulto..…………………………………………………12 1.1.2.2. Sistema de transporte y excreción/secreción……….….13 1.1.2.3. Sistema nervioso………………………………………………………..16 1.1.2.4. Sistema reproductivo……………………………………….…………17 1.1.3. Ciclo de vida…………………………………………………………….…18 1.1.4. Manifestacionesclínicas………………………………………………20 1.1.4.1. Teniasis………………………………………………………………….…..21 1.1.4.2. Cisticercosis………………………………………………………………..21 1.1.5. Diagnóstico…………………………………………………………….…..23 1.1.5.1. Teniasis………………………………………………………………….……23 1.1.5.2. Cisticercosis…………………………………………………………………24 1.1.6. Tratamiento…………………………………………………………………25 1.1.6.1. Teniasis……………………………………………………………………….25 1.1.6.2. Cisticercosis………………………………………………………………..27 1.1.7. Medidas de control………………………………….………………….29 1.2. Antígenos de Excreción/Secreción……………………………………….31 1.2.1. Antígeno diagnóstico P24 y mimótopos…………………….32 1.3. Despliegue de fagos (PhD12)……………………………………….…….33 2 1.3.1. Fagos filamentosos M13..……………………………………….….35 1.3.1.1. Proteína III (p3)……………………………………………….…………36 1.3.1.2. Proteína VIII (p8).……………………………………………….…….37 1.3.1.3. Genoma del fago M13KE…………………………………………….37 2. HIPOTESIS………………………………………………………………………………….………39 3. OBJETIVO……………………………………………………………………………………………39 3.1. Objetivos particulares……………………………………………………….…39 4. REACTIVOS QUIMICOS, EQUIPO Y REACTIVOS BIOLOGICOS.........40 4.1. Reactivos químicos y equipo………………………………………….……40 4.2. Reactivos biológicos…………………………………………………….….……40 4.2.1. Escherichia coli TG1……………………………………………………41 5. MÉTODOS GENERALES……………………………………………………………….……..42 5.1. Gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS- PAGE)…………………………………………………………………………….……………..42 5.2. Inmunoelectrotransferencia (IET)……………………………….………43 5.3. Adsorción y elución de anticuerpos…………………………………….44 5.4. Purificación de inmunoglobulinas (IgG)…………..………….……..45 5.5. Titulación de fagos……………………………………………………………….45 6. PROCEDIMIENTO………………………………………………….………..…………….…..47 6.1. Obtención de tenias……………………………………………………….…...47 6.2. Obtención de antígenos de Excreción/Secreción (AgE/S)...47 6.3. Obtención de suero hiperinmune α-AgE/S…………………….…..48 6.4. Obtención de anticuerpos α-P24………………………………………...48 6.5. Selección de mimótopos con ayuda del despliegue de fagos……………………………………………………………………………………………..49 6.5.1. Cultivos bacterianos………………………………………….……….49 6.5.2. Sensibilización y unión fago-anticuerpo……………….…..50 6.5.3. Elución y amplificación de fagos……………………………..…51 6.6. Aislamiento de clonas y preparación de ADN para secuenciación…………………………………………………………………………….….52 3 6.7. Secuenciación de ADN…………………………………………………….……53 6.8. Análisis y selección de clonas……………….…………………………....54 6.9. Obtención de anticuerpos α-mimótopos.…………………………….55 6.10. Purificación de IgG de conejo e inmunoelectrotransferencia de anticuerpos α-mimótopos…………………………………………………….…55 7. RESULTADOS………………………………………………………………………………………56 8. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………62 9. CONCLUSIONES……………………………………………………………………………….…64 10. ANEXOS………………………………………………………………………………………….65 10.1. Preparación de soluciones……………………………….………………….65 10.2. Imágenes………………………………………………………………………………69 11. REFERENCIAS…………………………………………………………………………………71 4 Abreviaturas °C Grados Celsius µL Microlitro µm Micrómetro aa Aminoácidos Ac Anticuerpo ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario ADNcs Acido desoxirribonucleico cadena sencilla Ag Antígeno AgE/S Antígenos de Excreción Secreción BSA Albúmina sérica bovina EDTA Ácido etilendiaminotetraacético ELISA Ensayo inmunoenzimático H2Odd Agua doblemente destilada IET Inmunoelectrotransferencia IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido kDa Kilodaltones LB Medio Luria-Bertani M Molar ml Mililitro mm Milímetro mM Milimolar NCC Neurocisticercosis ng Nanogramo nm Nanómetro PBS Amortiguador salino de fosfatos pH 7.4 PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEG Polietilenglicol 8000 pfu Unidad formadora de placa pH Potencial de hidrógeno pmol Picomoles RM Resonancia Magnética rpm Revoluciones por minuto SDS Dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico TBE Amortiguador Tris/Ácido Bórico/ EDTA TBS Amortiguador Tris-HCl/NaCl TBST TBS + Tween 0.1% TC Tomografía Computarizada TE Amortiguador Tris-HCl/EDTA pH 7.4 TED Amortiguador Trietanolamina/EDTA/ditiotreitol TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina V Voltios X-gal 5-bromo4-cloro-3indolil-β-D-galactósido 5 RESUMEN La teniasis y la cisticercosis son parasitosis causadas por Taenia solium (cestodo). La cisticercosis es causada por la larva del parásito, mientras que la teniasis es causada por la forma adulta del mismo. Las dos parasitosis tienen sintomatologías completamente diferentes, y aunque en el tratamiento se utilizan los mismos fármacos, las dosis y el periodo del tratamiento son diferentes. En el diagnóstico de estas parasitosis también se presenta diferencia, mientras que la cisticercosis se diagnostica con mucha precisión mediante técnicas como la Resonancia Magnética y la Tomografía Computarizada. El diagnóstico de la teniasis es muy subjetivo y difícil, ya que se realiza por observación directa al microscopio de los huevos y sus proglótidos, existiendo siempre la posibilidad de identificar inadecuadamente los parásitos debido a la similitud que existe entre las formas adultas de T. solium, T. saginata y T. asiatica. Los huevos de estas tres especies son iguales, además la mala preservación de sus proglótidos y la dificultad de encontrar el escólex, no permiten el diagnóstico de especie. En la actualidad se están investigando nuevas técnicas para hacer un diagnóstico de la teniasis por T. solium, como son el uso de antígenos específicos para detectar anticuerpos en sueros de pacientes. El objetivo de este trabajo fue identificar péptidos mimótopos de la proteína diagnóstica P24 que puedan ser reconocidas por los anticuerpos de pacientes. La P24 es específica de los extractos de Excreción Secreción (E/S) del adulto de T. solium y en este trabajo se aisló dicha proteína y con ésta se produjeron anticuerpos en hámsteres, que se utilizaron para la selección de los mimótopos a partir de una biblioteca de péptidos desplegados en fagos M13KE. Se obtuvieron tres clonas con las que se obtuvieron anticuerpos en conejos que reconocen específicamente a la proteína diagnóstica P24. 6 1. INTRODUCCIÓN La teniasis y la cisticercosis son parasitosis causadas por el mismo agente etiológico, T. solium (cestodo). La cisticercosis es causada por la larva (metacéstodo) del parásito, mientras que la teniasis es causada por la forma adulta del mismo. La teniasis es un problema de salud pública a nivel mundial que afecta principalmente a los países en desarrollo, aunque actualmente es considerado también un problema en aquellos países con un alto índice de migración1-4. La cisticercosis representa un problema de salud mucho mayor que la teniasis para las personas infectadas, es importante considerar que, en el ciclo de vida del parásito, la teniasis es la infección que puede provocar la cisticercosis, por lo cual si se puede controlar eficazmente la teniasis, los casos de cisticercosis serian consecuentemente disminuidos. Los efectos en el ser humano de la cisticercosis pueden ser fatales y dejar daños irreversibles en las personas infectadas, mientras que las personas que tienen una teniasis, muchas veces la cursan asintomáticamente y los daños a la salud no son tan graves en comparación con los provocados por la cisticercosis. Así mismo el tratamiento farmacológico de una cisticercosis puede durar varios meses y aun así dejar daños irreversibles, mientras que el tratamiento de una teniasis es muy simple, rápido, barato y eficaz. Mientras que la neurocisticercosis (NCC) puede ser detectada por medio de técnicas de imagenología y ser diagnosticada adecuadamente, el diagnóstico para la teniasis es difícil de realizar debido a la similitudmorfológica entre algunos parásitos, sus huevos y a que el diagnóstico es visual y por lo tanto subjetivo, puede no ser 100% adecuado. También hay que mencionar que la toma de muestra para el diagnóstico de la teniasis, muchas veces tiene que llevarlo a cabo el paciente, quien 7 en la mayoría de los casos desconoce los procedimientos adecuados para una correcta toma de muestra de las heces, las cuales pueden estar contaminadas con alguna fuente externa o simplemente mal recolectadas. Debido a esto, se considera que un diagnóstico fácil, rápido, barato y eficaz para la teniasis puede ser de mucha ayuda en el tratamiento de dicha parasitosis, con la consecuencia inmediata de interrumpir el ciclo de vida del parásito en su forma adulta (teniasis) y de esta manera evitar la cisticercosis que es de mucho mayores consecuencias. En la actualidad se están desarrollando métodos diagnósticos fundamentados en las técnicas de biología molecular, muchos se han enfocado en las proteínas contenidas en los extractos de excreción/secreción producidos por los parásitos, produciendo métodos serológicos para la detección de anticuerpos producidos por el hospedero en contra de estas mismas proteínas. Estos métodos diagnósticos tienen el propósito de identificar de manera sensible y especifica al estadio larvario o adulto del parásito. La confiabilidad de la prueba aumentaría también debido a que la toma de muestra, que en este caso es sangre, es realizada por un profesional evitando así tanto la mala toma de muestra como el mal manejo de la misma. Este tipo de pruebas serológicas ya existen en el mercado para el diagnóstico rápido de diferentes enfermedades, padecimientos y alteraciones fisiológicas y metabólicas, demostrando ser muy efectivas y tener una relación costo beneficio muy alta. 8 1.1. Taenia solium 1.1.1. Clasificación científica5 Phylum: Platyhelminthes Clase: Cestoda Subclase: Eucestoda Orden: Cyclophyllidea Familia: Taeniidae Género: Taenia Especie: Taenia solium 1.1.2. Generalidades del parásito Taenia solium (Lineo 1758) tiene dos estadios en su ciclo de vida, el larvario y el adulto. El adulto carece de boca y aparato digestivo como todos los cestodos lo cual los diferencia de los nematodos y trematodos. Tiene un cuerpo segmentado que puede llegar a medir de 2 a 5 metros, y tiene un escólex con cuatro ventosas y un rostelo con doble corona de ganchos (Figura 1). La larva es una vesícula (mide entre 4 y 20 mm) cubierta por una pared constituida por un tegumento y un parénquima, en donde se puede observar el escólex de la larva invaginado en esta pared (Figura 3)6, 7. 9 Figura 1. Micrografía electrónica de barrido en la que se muestra el escólex de T. solium. Se observan las 4 ventosas y el rostelo con la doble corona de ganchos. Tomada y modificada de Bogtish, Burton J. Human Parasitology, 2005. 1.1.2.1. Morfología 1.1.2.1.1. Huevo Los huevos de T. solium son de forma esférica y están conformados por la capa externa llamada embrióforo que es la principal defensa de los embriones, está compuesto por una proteína similar a la queratina la cual tiene características que le dan propiedades protectoras y funcionales al mismo tiempo. Es impermeable y muy resistente, proporcionando así la posibilidad de sobrevivir en condiciones desfavorables. Así mismo las proteínas se conforman en forma de bloques que son unidos por proteínas cementantes que son susceptibles a la degradación enzimática, lo cual les permite en condiciones favorables, una vez ingeridos por el huésped, ser digeridas por lo jugos gástricos y así liberar a la oncósfera al separarse el embrióforo. La oncósfera o embrión hexacanto se encuentra dentro del huevo, y es la 10 forma infectiva para causar cisticercosis al humano y cerdo. Está oncósfera presenta tres pares de ganchos que se pueden observar al microscopio (Figura 2). Una vez liberada la oncósfera es activada por las mismas enzimas y sales biliares, atraviesa la pared intestinal y entra al torrente sanguíneo en donde puede transportarse hacia zonas favorables para su fijación y desarrollo como son musculo esquelético, sistema nervioso central, tejido subcutáneo, lengua y ojos, en donde evolucionará hacia su forma de larva o cisticerco6, 7. Figura 2. Huevo de Taenia sp. Se pueden observar los tres pares de ganchos y el embrióforo radiado. Tomado de http://www.wadsworth.org/parasitology/Images/06-M.jpg 1.1.2.1.2. Larva o Cisticerco La forma larvaria de la T. solium es conocida también como cisticerco. Se conocen dos clases de cisticercos, el celuloso y el racemoso8. El cisticerco celuloso es una vesícula ovalada cubierta por una membrana transparente que tiene un tamaño de entre 4 y 20 mm de longitud, a través de su membrana se puede observar el escólex 11 invaginado, el cual ya cuenta con cuatro ventosas y dos hileras de ganchos (Figura 3). El interior del cisticerco contiene fluido, el cual está compuesto por carbohidratos proteínas y lípidos. Cuando el cisticerco, después de haber sido ingerido por el huésped y expuesto a los jugos gástricos, llega al intestino, donde este evagina el escólex y con la doble corona de ganchos y cuatro ventosas se adhiere al intestino. El cisticerco racemoso es de mayor tamaño al cisticerco celuloso, teniendo un tamaño de hasta 90mm9, 10. Es de forma irregular y rugoso con lobulaciones, su membrana es irregular debido a adelgazamientos y engrosamientos llamados excrecencias, su capa basal contiene vellosidades y contiene líquido en su interior, y no tiene escólex. Este cisticerco tiene una afinidad mayor por el tejido nervioso central y se encuentran generalmente en la base del cerebro. Figura 3. Se observa el escólex de color blanco opaco en los cisticercos. 12 1.1.2.1.3. Gusano adulto La tenia en su fase adulta, puede medir desde 1.5m hasta unos 5m de longitud. El cuerpo de la tenia en su fase adulta (gusano) está conformado por el escólex, cuello y estróbilo (Figura 4). El escólex se encuentra en uno de los dos extremos del gusano, mide aproximadamente 1mm de diámetro, tiene 4 ventosas y un rostelo armado con una doble corona de ganchos (entre 25 y 30) que le sirven como instrumento de sujeción al intestino (Figura 1). El cuello se encuentra unido al escólex, es corto y delgado, está formado por células germinales que dan origen al estróbilo, formado por segmentos llamados proglótidos que están unidos y forman una cadena. Los proglótidos que se encuentran cercanos al cuello se denominan inmaduros, debido a que aun no tienen los órganos sexuales. Los proglótidos más distantes al cuello, se denominan maduros ya que han desarrollado sus órganos sexuales y los que ya tienen huevos del parásito en su interior se denominan proglótidos grávidos, éstos son los que se encuentran en la parte más distal del gusano. Los proglótidos grávidos, contienen entre 30,000 y 50,000 huevos cada uno11, estos proglótidos grávidos se desprenden del estróbilo y son transportados al exterior en un número de entre 2 y 5 segmentos en la materia fecal del huésped, en un promedio de 2 a 3 veces por semana. Debido a su tamaño de entre 5 mm y 20 mm, estos pueden ser observados en la materia fecal. Una vez expulsados los proglótidos, se destruyen y vierten su contenido de huevos al medio ambiente en el que se encuentren6, 7, 11-18. 13 Figura 4. Regiones del cuerpo de la forma adulta de T. solium. (a) Escólex y región del cuello, (b) Proglótidos inmaduros, (c) Proglótidos maduros y (c) Proglótidos grávidos. Tomada de Bogtish, Burton J. Human Parasitology, 2005. 1.1.2.2. Sistema de transporte y excreción/secreción T. solium al igual que todos los cestodos, carecen órganos digestivos, por lo que su alimentación y excreción de deshechos esllevada a cabo a través del tegumento, el cual se encuentra en la superficie del gusano (Figura 5). El tegumento está compuesto por microvellosidades conocidas como microtricas que son proyectadas hacia el exterior, delimitadas por una membrana tegumental. A diferencia de las microvellosidades, las microtricas tienen una punta densa en electrones, separadas de la región basal por placas multi-laminares, estas puntas le otorgan al parásito resistencia en contra de los movimientos peristálticos y al mismo tiempo cuando el parásito se mueve, agita los fluidos intestinales y de este modo aumenta el acceso a los nutrientes y secreta los desechos del mismo parásito. Cubriendo la membrana tegumental se encuentra una capa de macromoléculas que contienen 14 carbohidratos llamada glicocálix que tiene varias funciones entre las cuales está proteger al parásito de las enzimas digestivas del huésped, aumentar la absorción de nutrientes y mantener la estructura del parásito junto con proteínas del citoesqueleto. El tegumento está compuesto de dos regiones citoplasmáticas, la distal y la proximal. En la región distal del citoplasma se encuentra una gran cantidad de mitocondrias alineadas en una banda ancha basal, así como varios tipos de vesículas producidas por los citones subtegumentales, en la región proximal del citoplasma de este citón se encuentran complejos de Golgi, mitocondrias, retículo endoplásmico y otros organelos involucrados en la síntesis de proteínas. Las proteínas producidas en los citones son traslocadas a la región distal del citoplasma a través de microtúbulos. Por debajo de la región distal del citoplasma se encuentran dos capas de músculos, la capa exterior tiene fibras contráctiles orientadas en patrones circulares mientras que la capa interior está compuesta de fibras contráctiles ordenadas longitudinalmente. El sistema de transporte de T. solium, también conocido como sistema osmoregulatorio, consiste de dos componentes, canales colectores y células flama. Tiene cuatro canales colectores alineados lateralmente, dos dorsales y dos ventrales, los cuales se extienden a través de todo el estróbilo, mientras que un solo canal transversal conecta los canales ventrales al final de cada proglótido. Los canales ventrales llevan fluido fuera del escólex hacia los proglótidos, mientras que los canales dorsales llevan fluido hacia el escólex. En los proglótidos se encuentran vesículas excretoras en las cuales los canales ventrales vierten su contenido. Las células flama están asociadas a los canales ventrales, estas células colectan fluidos que pasan a través de túbulos secundarios hacia los canales ventrales7, 10, 12. 15 Figura 5. (a) Tegumento de cestodos. (b) Sistema de transporte y excreción/secreción. Tomada y modificada de Bogtish, Burton J. Human Parasitology, 2005. 16 1.1.2.3. Sistema nervioso El sistema nervioso de T. solium es relativamente complejo, comienza en el escólex en donde se encuentra el ganglio cefálico que es un conjunto de tejido nervioso a partir del cual se forma un sistema de nervios cortos anteriores y posteriores que inervan diferentes regiones del escólex como fibras motoras, y recibe fibras sensoriales del rostelo, ventosas y tegumento. Varios pares de nervios longitudinales se extienden desde el escólex y a lo largo del estróbilo, paralelamente a los canales de transporte de la tenia. En los proglótidos los nervios se unen en conexiones cruzadas horizontalmente (Figura 6). Los órganos reproductivos y la musculatura son inervados por pequeñas fibras nerviosas motoras que emanan de los nervios laterales y las conexiones cruzadas, mientras que el tegumento es inervado por nervios sensoriales que se unen con los cordones y conexiones nerviosas7. Algunas partes como son el escólex, sistema reproductivo y ventosas, se encuentran mayormente inervadas. Figura 6. Sistema nervioso de Cestodos. Tomada y modificada de Bogtish, Burton J. Human Parasitology, 2005. 17 1.1.2.4. Sistema reproductivo Este sistema en T. solium es hermafrodita, es decir que tiene tanto órganos masculinos como femeninos en el mismo parásito. Los órganos masculinos están compuestos por cientos de testículos que se encuentran distribuidos a través de la región medular del proglótido. El ovario consiste de dos lóbulos prominentes y uno lóbulo central de tamaño pequeño. El oviducto comienza en donde se unen los tres lóbulos del ovario y continúa formando el saco uterino. La vitelaria es de forma compacta y se encuentra en la parte basal del proglótido justo debajo del ovario. El poro genital se encuentra ubicado en la parte lateral del proglótido, usualmente a la mitad de cada proglótido, los proglótidos siguientes pueden tener el poro genital alternado de lado o ubicados unilateralmente. Una vez que los huevos son producidos, son empujados hacia el saco uterino, el cual forma ramas laterales a medida que la producción de huevos aumenta. El número de ramas laterales ha servido como forma de identificación entre T. solium que tiene de 7 a 12 ramas laterales mientras que T. saginata presenta más de 12 ramas laterales. Figura 7. Proglótido maduro de T. solium. Tomado y modificado de Bogtish, Burton J. Human Parasitology, 2005. 18 1.1.3. Ciclo de vida En el ciclo de vida de T. solium podemos encontrar a dos huéspedes mamíferos en los que ocurren diferentes estadios del parásito y los cuales están involucrados de diferentes maneras en el ciclo de vida del mismo, estos huéspedes son el humano y el cerdo. El ciclo de vida (Figura 8) comienza cuando el cerdo ingiere huevos o proglótidos grávidos de T. solium que han sido depositados en los lugares en donde el cerdo se alimenta, principalmente por efecto de la práctica de fecalismo al aire libre. Una vez que el cerdo ingiere los huevos, estos sufren ataque enzimático, el cual degrada las proteínas de el embrióforo, liberando al embrión, el cual atraviesa la mucosa intestinal y llega al torrente sanguíneo en donde viajará hasta instalarse en diferentes tejidos para desarrollarse a la forma larvaria. El ciclo de vida del parásito continúa cuando el humano ingiera carne infectada con cisticercos. Los cerdos infectados con cisticercos son matados y vendidos en zonas en las que el control de la carne no es adecuado. Los cisticercos pueden sobrevivir en carne refrigerada a 4°C durante un mes. La carne de cerdo con cisticercos puede ser cocida adecuadamente y así eliminar a los cisticercos viables, los cuales mueren a temperaturas entre 45°C y 50°C, pero debido a diferentes formas de cocinar la carne de cerdo, ésta en muchas ocasiones, deja viables a cisticercos que se encuentran en el centro de los trozos de carne19. De este modo el humano consume los cisticercos, los cuales en el intestino y por efecto de los jugos gástricos y sales biliares, evaginan el escólex, el cual se fija firmemente a la musculatura del intestino por medio de las cuatro ventosas y la corona de ganchos que tiene escólex evaginado del cisticerco. Es aquí en el intestino en donde el cisticerco de T. solium se desarrolla en el gusano adulto que es conocido como 19 solitaria, provocando la parasitosis conocida como Teniasis. El gusano adulto al crecer, madurar y desarrollarse, va a producir huevos, los cuales serán liberados en el proglótido o solos en la materia fecal, y es en este momento cuando debido a circunstancias principalmente económicas, las personas que incurren en la práctica del fecalismo al aire libre, dejan los huevos a disposición para que el cerdo los ingiera y de esta manera cerrar y comenzar el ciclo una vez más. El ciclo de vida del parásito tiene una vía paralela, en la cual el humano puede ingerir de forma accidental los huevos. Esto puede deberse a varias causas, la principal es la falta de higienedel huésped infectado quien puede llevar los huevos directamente del ano a la boca por medio de la mano. Otra posibilidad es la contaminación, ya sea del agua de riego para algunas verduras o frutas, o la contaminación directa del área de cultivo y cosecha debido a la práctica, como se mencionó anteriormente, del fecalismo al aire libre. El huevo una vez ingerido por el humano, sufre la degradación enzimática del embrióforo, liberando de esta manera la oncósfera de la misma manera que en el cerdo. La oncósfera es capaz de atravesar la mucosa y llegar al torrente sanguíneo, en donde en el humano será llevado principalmente a musculo esquelético, tejido nervioso (principalmente cerebro) y al ojo, en donde se desarrollara como cisticerco, provocando la parasitosis conocida como cisticercosis en el humano. 20 Figura 8. Ciclo de vida de T. solium. Tomada de http://www.dpd.cdc.gov/dpdx 1.1.4. Manifestaciones clínicas Las dos enfermedades causadas por T. solium son muy diferentes entre si, tienen diferentes manifestaciones clínicas y diferentes sitios en los que se ubica el parásito, dañan diferentes órganos y la cisticercosis puede tener efectos muy graves en la salud de las personas. 21 1.1.4.1. Teniasis La teniasis es la enfermedad provocada por el adulto de T. solium, conocido como solitaria. El parásito una vez que se adhiere a la musculatura del intestino20, provoca en algunos casos una inflamación leve que puede ser inadvertida por el huésped. Aquí se desarrolla en su forma adulta obteniendo sus nutrientes del huésped, a través del tegumento. En un periodo comprendido entre 2-3 meses, el gusano ya se ha desarrollado completamente. En algunos casos extremos los gusanos adultos pueden llegar a medir, hasta 10 metros de longitud. La tenia absorbe muchos de los nutrientes del huésped, y en casos en los que la tenia es de gran tamaño puede provocar en el huésped desnutrición y pérdida de peso. Otros síntomas son malestar general y pérdida del apetito. En algunas ocasiones se puede presentar diarrea o constipación, dolor abdominal y nauseas matutinas. 1.1.4.2. Cisticercosis La cisticercosis es causada por la forma larvaria del parásito. Si el cisticerco se localiza en zonas que no sean el cerebro, se le conoce comúnmente como cisticercosis y en el caso de que el cisticerco se localice en el sistema nervioso central (cerebro) se le conoce como neurocisticercosis21. Las manifestaciones clínicas de la cisticercosis no son muy específicas y es de expresión clínica polimórfica, puede ser desde asintomática hasta incapacitante y en algunos casos mortal. El daño que causa el parásito en el cuerpo humano depende del número y localización del mismo. La cisticercosis subcutánea puede presentarse como pequeños nódulos, movibles, que se presentan generalmente en los brazos y 22 pecho, sin ser dolorosos. Los nódulos pueden presentar inflamación y suavizarse después de varios años y gradualmente desaparecer. En algunos casos raros, se presenta infestación masiva de cisticercos, la cual se puede observar en el agrandamiento de los miembros infestados (pseudohipertrofia muscular). El corazón también puede sufrir de infección y aunque son pocos los casos, aprox. 5%, hasta ahora se reporta como asintomática la cisticercosis cardiaca. Aunque la infección del ojo es menos frecuente que la NCC (aprox. 1-3%), esta forma intraocular es común. El parásito se puede encontrar flotando libremente en el humor vítreo o en el espacio subretinal, los daños que producen a la vista pueden ser variados dependiendo del daño retinal o el daño al nervio óptico. En algunos casos el daño visual puede ser causado por efectos de los cisticercos en el cerebro14, 16, 22. Las manifestaciones clínicas de la NCC están relacionadas directamente a las diferencias individuales en el número y tamaño de los cisticercos así como en la topografía de las lesiones y la fuerza con la que el sistema inmunológico reacciona a la parasitosis. Los síntomas y signos son variados y no específicos. Los episodios epilépticos presentan la manifestación clínica más recurrente, entre el 50-80% de las personas con NCC presentan episodios epilépticos. En algunos casos se puede presentar aumento de la presión intracraneal, dependiendo de la localización del parásito y si este bloquea la circulación del fluido cerebroespinal. En los casos en los que el cisticerco crece más de lo normal (1-2cm), el cisticerco puede actuar como un tumor, presionando varias regiones del cerebro, causando aumento de la presión intracraneal y por lo mismo puede tener efectos en las funciones motoras y de los sentidos, esto dependiendo la zona en la que el cisticerco se encuentre. 23 1.1.5. Diagnóstico El diagnóstico de ambas enfermedades es muy diferente, sin embargo el desarrollo en el área del inmunodiagnóstico ha tenido un gran auge, ya que se están desarrollando métodos para diagnosticar ambas enfermedades basados en métodos serológicos23-27. 1.1.5.1. Teniasis El diagnóstico principal de la teniasis se realiza por la identificación de los proglótidos expulsados en la materia fecal del huésped, estos proglótidos deben de ser observados al microscopio para realizar su identificación y conocer si la especie es, T. solium o T. saginata basados en la observación y conteo de las ramas laterales en los proglótidos. Del mismo modo, si el escólex puede ser observado, la diferenciación puede ser más exacta, ya que el escólex de T. solium cuenta con la doble corona de ganchos mientras que el escólex de T. saginata carece de la misma. Ya que los huevos de ambas especies son iguales, la identificación de estos no se realiza para identificar la especie del parásito. Se han desarrollado pruebas que consisten en la captura de antígenos del parásito en la materia fecal24, estandarizados en pruebas de ELISA28. La desventaja de estas pruebas es que no son capaces de distinguir entre las especies T. solium y T. saginata. Actualmente se están buscando alternativas que sean capaces de distinguir entre las dos especies con la ayuda de anticuerpos29 específicos de las especies30 y anticuerpos monoclonales, así como anticuerpos locales y sistémicos31, de esta forma se podrían realizar pruebas diagnosticas que serían rápidas, sensibles y especificas29, 32. 24 La amplificación de secuencias especificas de ADN mitocondrial también se está realizando para la identificación del parásito por medio de hibridación33. Las técnicas de identificación genética, tendrán mayor auge cuando el genoma completo de T. solium sea conocido34. Aunque estas últimas técnicas aun se encuentran en desarrollo y no se encuentran en el mercado por ser muy costosas. 1.1.5.2. Cisticercosis La cisticercosis se diagnostica por técnicas de neuroimagen, una vez que se han presentado síntomas que indiquen la posible parasitosis, y en algunos casos como pueden ser infecciones en musculo liso en las que no hay sintomatología, el diagnóstico puede ser fortuito. La tomografía computarizada (TC), y la Resonancia Magnética (RM) son las técnicas de imagen más efectivas utilizadas para el diagnóstico de la NCC. La TC se posiciona como la mejor herramienta de diagnóstico para la NCC debido a que ha demostrado tener una sensibilidad y especificidad mayor al 95%. En la TC se puede observar la lesión como una imagen hipodensa, con límites bien definidos y comúnmente se puede observar el escólex en el interior del cisticerco. La sensibilidad de la TC es mucho menor para aquellos casos en los que el cisticerco se encuentra en los ventrículos o en las cisternas cerebrales, en las que solo se puede observar deformación o agrandamiento de la zona. La RM es la herramienta más precisa para determinar el grado de lesión, la localización y las etapas evolutivas del parásito.En la RM se pueden observar los cambios degenerativos, así como cisticercos pequeños, y aquellos localizados en los ventrículos, cerebelo, ojo y los cisticercos racemosos basales13, 14, 16, 22, 35-39. 25 Las técnicas serológicas de diagnóstico son de mucha ayuda cuando se trata de diagnosticar NCC40, 41. En muchos casos la presencia de eosinófilos en fluido cerebroespinal, sugiere el diagnóstico de NCC. La técnica de ELISA es la más utilizada para buscar anticuerpos42, y aunque tiene reacción cruzada con los cestodos Hymenolepis nana y Echinococcus granulosus, es mucho más útil cuando se hace la prueba con fluido cerebroespinal que con suero43, aunque la desventaja es que la punción lumbar es un procedimiento doloroso e invasivo44. El inmunoblot con un complejo de glicoproteínas del parásito es una prueba que ha reportado una especificidad del 100% y una sensibilidad del 98%23, 45-50. Los anticuerpos pueden estar presentes aun después de la calcificación del parásito, por lo que una prueba positiva no se debe de interpretar como la presencia de parásitos vivos2, 47, 51-53. Se han establecido criterios de diagnóstico, basados en la combinación de las pruebas serológicas, de imagen neurológica, y estudios epidemiológicos para obtener diferentes grados de certeza en el diagnóstico54-57. 1.1.6. Tratamiento 1.1.6.1. Teniasis Para el tratamiento de la Teniasis en humanos existen tres fármacos que se han investigado ampliamente: Niclosamida, Praziquantel y Albendazol. Y aunque hay mucha controversia en el uso de alguno de estos tres, se ha demostrado que los tres son efectivos58. 26 Niclosamida. Ha sido el fármaco de elección durante varios años, y es muy efectivo en contra de la forma adulta. Tiene efecto en general en contra de los cestodos y actúa directamente sobre los proglótidos y el escólex inhibiendo la fosforilación oxidativa. Se administra en una sola toma de 2 g, pudiendo repetir el tratamiento una semana después si es necesario. La Niclosamida no tiene ningún efecto sobre los cisticercos ni sobre los huevos, por lo que se ha sugerido que este medicamento puede poner en riesgo al paciente de contraer cisticercosis, ya que destruye los proglótidos y libera los huevos a la luz intestinal, por este motivo, el uso de un laxante una o dos horas después de administrada la Niclosamida es obligatorio, así como la disposición adecuada de las heces. Aunque este medicamento es muy eficaz, no está disponible en México. Praziquantel. Es el segundo medicamento de elección para el tratamiento de la teniasis, actúa sobre los canales iónicos del parásito, principalmente en el de calcio, tanto en la forma adulta como larvaria. Se ha sugerido que este medicamento puede activar la NCC en algunos pacientes asintomáticos cuando son tratados para teniasis. Este medicamento se utiliza para tratar varias parasitosis en el humano, la dosis para el tratamiento de la teniasis es de 5-25mg/Kg por vía oral en una sola toma. Este medicamento está disponible en México59-62. El Albendazol es el tercer medicamento de elección, es muy bien tolerado y produce efectos secundarios mínimos. La ventaja de este medicamento es que actúa no solo en contra de Taenia sp. Si no que también actúa en contra de helmintos y nematodos frecuentes, por lo que se encuentra actualmente en varios antiparasitarios de venta comercial63. El albendazol causa daños en el tegumento, uniéndose a la tubulina, inhibiendo la polimerización y ensamblaje de los microtúbulos. La dosis recomendada de Albendazol para el tratamiento de la teniasis 27 es una dosis de 400mg por vía oral, aunque también se han presentado esquemas con una dosis de 400mg cada 24 horas, durante tres días22. 1.1.6.2. Cisticercosis El tratamiento para la cisticercosis, está definido en cuanto a las características del diagnóstico de la misma. Es decir, que para su tratamiento hay que tomar en cuenta varias características del desarrollo de la enfermedad, como la localización del parásito, el estado biológico del mismo, el número de cisticercos, etc. Hasta ahora, los dos medicamentos de mayor uso y que han mostrado la mayor efectividad son el praziquiantel y el albendazol. Praziquantel. Se ha demostrado que dosis tan bajas como 5-10 mg/Kg/día han tenido algún efecto sobre los cisticercos y dosis tan altas como 50-75 mg/Kg/día han sido bien toleradas59. Una terapia de 50mg/Kg/día durante dos semanas ha sido adoptada por la mayoría de los médicos64-67. Albendazol. El albendazol ha demostrado ser un medicamento altamente efectivo para el tratamiento de la cisticercosis, con una alta efectividad en el caso de NCC, ya que ha demostrado tener una mayor penetración en el fluido cerebroespinal que el praziquantel. Se ha determinado que una dosis de 15mg/Kg/día ha sido efectiva para el tratamiento y que no conlleva efectos secundarios marcados. Este medicamento tiene menor costo que el praziquantel. Esteroides. Entre el segundo y quinto día de la terapia antiparasitaria, generalmente se observa un aumento de los síntomas neurológicos, atribuidos a la muerte del parásito y a la reacción 28 inflamatoria que hay en la zona de infección. Por tal motivo cuando se administran el praziquantel o el albendazol, también se administra una terapia con esteroides, con el fin de disminuir la inflamación, el edema y la hipertensión intracraneal causada por los fármacos. Los fármacos más utilizados son la dexametasona en dosis de entre 4.5 y 12 mg/Kg/día y la prednisona en dosis de 1mg/Kg/día en casos de que se requiera una terapia a largo tiempo. En algunos casos se utiliza también manitol para disminuir la hipertensión intracraneal aguda en dosis de 2g/Kg/día. Los medicamentos antiepilépticos son también utilizados en los casos que son necesarios y se obtienen resultados muy favorables cuando hay crisis epilépticas causadas por la NCC. En los casos en que los cisticercos se encuentran calcificados, son recurrentes los episodios epilépticos. En varios casos se administran medicamentos analgésicos para el control de la cefalea causada por la parasitosis. Cirugía. Anteriormente, la cirugía para extraer los cisticercos del cerebro y de los ventrículos era el método más utilizado de tratamiento, aunque con la investigación de los medicamentos este método fue disminuyendo en su práctica y actualmente está indicado para los casos en los que el parásito se encuentra en los ventrículos del cerebro, considerando que actualmente se cuenta con la cirugía neuroendoscópica para la recesión de los cisticercos ventriculares, la cual es menos invasiva. 29 1.1.7. Medidas de control La teniasis, siendo una parasitosis exclusivamente humana, hace al hombre el único responsable de su difusión y al mismo tiempo lo hace uno de los principales blancos cuando se intenta detener o erradicar esta parasitosis. Los principales factores que hay que considerar en la transmisión de la enfermedad son: • El contacto de los cerdos con las heces humanas contaminadas con huevos. • La deficiencia en la inspección de la carne de cerdo, la cual en muchos casos es vendida ilegalmente, ya sea por costumbres de los consumidores, quienes la solicitan con estas características o por los criadores quienes no quieren perder dinero por los animales parasitados. • El consumo de la carne cruda o mal cocida. En muchos casos la carne es consumida cruda o mal cocida debido a las costumbres de algunos pueblos en los cuales la carne se cuece en trozos muy grandes y el centro queda sin cocer conteniendo cisticercos vivos. Hay comunidades en las que la carne de cerdo con cisticercos es solicitada por las personas para ser consumida, debido a que las características de esta carne es del agrado de muchas personas, sin saber que se trata de carne parasitada que con unaalta probabilidad provocara la teniasis en el humano. • La falta de higiene de las personas al ir al baño y sobre todo en comunidades en las que existe la práctica del fecalismo al aire libre y las condiciones sanitarias son inadecuadas. Se han hecho investigaciones en las que se cree que las parasitosis causadas por T. solium pueden ser erradicadas68, no solo de las zonas 30 de mayor incidencia, sino también del mundo entero. Se han hecho estudios en cuanto a las implicaciones económicas de realizar terapias masivas69 y con educación para erradicar el parásito en algunas localidades70. Aunque se han obtenido resultados momentáneos (3-5 años), el parásito y las parasitosis son diagnosticadas nuevamente. Los principales puntos que se han investigado en la búsqueda de la erradicación del parásito tienen que ver con el ciclo de vida del mismo, debido a que el huésped definitivo es el humano y también es la fuente de infección para el huésped intermediario, cerdo. Basados en estos dos principios, se busca erradicar al parásito principalmente aplicando terapias farmacológicas masivas con el fin de terminar con los huéspedes intermediarios y así interrumpir su ciclo de vida. Para esto se necesitan herramientas de diagnóstico adecuadas y fármacos que sean seguros para el humano y eficaces. Tomando en cuenta el ciclo de vida del parásito, también se está intentando detener la transmisión del mismo en el cerdo, que es el huésped intermediario. En este caso se ha considerado que la crianza de los cerdos tiene que ser más controlada y estar en constante observación. Así mismo se han desarrollado fármacos que en los cerdos tienen una muy alta eficacia antiparasitaria, por lo cual se han propuesto esquemas de terapia masiva. Se han desarrollado algunas vacunas en contra de la teniasis en humanos 71 aunque, la vacunación en cerdos ha tenido un mayor desarrollo tecnológico, aun no se tiene una vacuna barata que pueda ser una gran herramienta para el control de la T. solium72-76. El otro punto a considerar en el control de la T. solium es el factor humano, en este caso no como huésped. El control de los rastros y la inspección de la carne es un factor que puede ayudar mucho en el 31 control de la T. solium, por lo que la calidad de los rastros y la inspección de la carne debe ser del máximo nivel, para evitar así la venta, compra y consumo de carne infectada. Es deber del humano también, aumentar las medidas de higiene en todos los lugares, no solo en los que exista la posibilidad de infección por T. solium, esto puede ser con campañas educativas de concientización de las personas y campañas para dar a conocer el ciclo del parásito, ya que en muchos lugares no es conocida77-85. 1.2. Antígenos de Excreción/Secreción La investigación en el área del diagnóstico de T. solium está en continuo desarrollo, ya que como se ha mencionado, el diagnóstico adecuado y a tiempo de la parasitosis es fundamental para el control de la misma. En esta área se ha encontrado que tanto en el adulto como la larva de T. solium, se pueden encontrar antígenos que se pueden clasificar de varias maneras, algunos son específicos para el género pero no para la especie, se han encontrado antígenos que son específicos para los cestodos, y algunos que son específicos para los estadios de T. solium86. Es decir que se han encontrado antígenos específicos tanto para la larva como para el adulto del parásito. Los antígenos de excreción/secreción (AgE/S), son antígenos que por la naturaleza misma del parásito, son liberados al medio en el que este se encuentra. Se han encontrado varios AgE/S los cuales se han investigado para saber si pueden ser buenos antígenos para la identificación específica del parásito. Dentro de estos antígenos se encuentran el AgB, la proteína 29 (P29), ES38, ES33 32 y los AgE/S 72, 48, 36 y 2486. Estos Antígenos han sido investigados, utilizando diferentes métodos como son las pruebas de ELISA y la Inmunoelectrotransferencia (IET) para conocer su especificidad y sensibilidad. Los AgE/S son muy utilizados en el área de investigación para el diagnóstico de la NCC, sin embargo han sido poco investigados para el diagnóstico de teniasis50, 86-97. 1.2.1. Antígeno diagnóstico P24 y mimótopos El antígeno P24 obtenido a partir de los antígenos de excreción/secreción de la forma adulta de T. solium, ha demostrado ser un antígeno muy especifico y con amplias posibilidades de ser utilizado como un antígeno diagnóstico ya que, solo se ha detectado en los AgE/S de la forma adulta y no en los AgE/S del cisticerco del parásito. También se ha encontrado que este antígeno no presenta reacción cruzada con otros cestodos, características que le otorgan propiedades particulares y de interés, para su investigación en el área del diagnóstico de la teniasis causada por T. solium86, 105. Los mimótopos son secuencias cortas de aminoácidos (7-15) que mimetizan secuencias de aminoácidos en las proteínas. Estas regiones en las proteínas pueden ser antigénicas y se denominan epítopos. Por lo que un mimótopo es una secuencia de aminoácidos que mimetiza un epítopo. Debido a esto, los mimótopos son reconocidos por los paratopos en los anticuerpos de la misma manera que el epítopo al que mimetizan. 33 1.3. Despliegue de fagos (PhD12) El despliegue de fagos en una técnica que se ha empleado en el área de Biología Celular, Inmunología y Farmacología desde que fue descrita en 1985 por George P. Smith. Ésta tecnología se ha ido modernizando y actualizando de manera muy amplia y rápida, por lo que en la actualidad es utilizada en muchas áreas de la investigación. En un principio en esta tecnología se utilizan fagos filamentosos que infectan a Escherichia coli (M13, fd y f1) para expresar diversas secuencias peptídicas o proteínas como parte de las proteínas de cubierta del fago, para que de este modo pudieran interactuar con los blancos a los cuales fueran enfrentados. Siendo este el fundamento de la técnica, las posibilidades que existen para identificar y caracterizar las interacciones de péptidos de cualquier tipo con sus blancos, la hacen una herramienta muy poderosa y con amplias posibilidades en la investigación molecular98-102. En esta técnica, los péptidos expresados en el fago, son enfrentados a los blancos (anticuerpos) para que interactúen y se unan a los sitios del blanco, después se eliminan los fagos que no estén unidos al blanco, posteriormente se eluyen los fagos unidos al blanco de interés y se amplifican para realizar nuevamente la unión, a este procedimiento se le denomina panning. 34 Figura 9. Selección de fagos o Panning. Tomado y modificado de Ph.D. ™ Phague Display Libraries, New England BioLabs, 2009. 35 1.3.1. Fagos filamentosos M13 El fago filamentoso M13 que se utiliza en el despliegue de fagos, es un fago que infecta a E. coli utilizando el pili de la bacteria como receptor para la infección. Estos fagos filamentosos tienen una cadena circular de ADN de cadena sencilla (ADNcs), la cual consiste de 11 genes. Una vez que la proteína III (p3) del fago entra en contacto con la proteína TolA del pili de la bacteria, el genoma del fago es introducido al citoplasma de la bacteria en donde las proteínas replicativas de la bacteria convierten el genoma de cadena sencilla en ADN de doble cadena, la cual es la forma replicativa (RF). Este ADN de doble cadena o RF sirve como templado para la expresión de los genes del fago y también es replicado para formar las nuevas cadenas de ADNcs que formaran parte de los nuevos virus. Un fago viable expresa 2700 copias de la proteína VIII (p8) para formar una cubierta de aproximadamente 900 nm de largo y 5 copias de las proteínas VI (p6), VII (p7), IX (p9) y III (p3), las cuales conforman los extremos delfago, acomodándose las proteínas p7 y p9 en el extremo romo del fago y las proteínas p6 y p3 en el extremo infectivo del fago. La infección de la bacteria con el fago M13 no es del tipo lítica, por lo que la bacteria permanece viable aun estando infectada, sin embargo, la tasa de crecimiento de las bacterias infectadas disminuye considerablemente debido al uso de sus enzimas para la formación de los fagos, observándose en estos casos placas turbias en medios sólidos que son el producto de la liberación de los fagos al medio a través de las membranas de la bacteria. En estas placas se encuentran los fagos liberados en concentraciones aproximadas de 108 fagos98, 99, 101, 102. 36 Figura 10. Genoma y estructura del fago M13. Los genes se encuentran identificados con color de acuerdo a las proteínas que forman para dar estructura al fago. Tomada y modificada de http://www.wwnorton.com/college/biology/microbiology2/ch/11/etopics.aspx 1.3.1.1. Proteína III (p3) La proteína III (p3) es fundamental en el despliegue de fagos, ya que por medio de la manipulación genética, los péptidos son unidos a esta proteína en su extremo N-terminal para que queden expuestos al medio y puedan interactuar con los blancos que les sean presentados. La proteína p3 está constituida de 406 residuos de aminoácidos y en el fago se encuentran solamente 5 copias. La proteína p3 en su porción C- terminal interactúa con la proteína p6 y se mantiene unida a esta, mientras que la proteína p6 está unida a las proteínas p8 que forman la estructura de la cápside del fago. La inserción de péptidos en el extremo N-terminal de la proteína p3 no interfiere con la interacción que hay entre la proteína p3 del fago y la proteína TolA del pili de la bacteria. La 37 inserción de los péptidos al extremo N-terminal de la proteína p3 se puede hacer de diferentes formas, como son agregar el péptido flanqueado por secuencias específicas, y agregar el péptido flanqueado por cisteínas que formen puentes disulfuro y de este modo el péptido pueda ser expuesto en una asa que se forma98, 99, 101, 102. 1.3.1.2. Proteína VIII (p8) La p8, es la principal proteína en el fago M13, ya que es la que conforma el cuerpo del fago, envuelve al genoma de la bacteria y es la que se encuentra en mayor número, aproximadamente 2700 copias. La p8 es una proteína de 50 residuos de aminoácidos y su expresión esta directamente determinada por el tamaño del genoma. En su forma nativa, el fago expresa aproximadamente 2700 copias de la p8 que sirven para envolver el genoma de 6.5Kb. De la misma manera que se pueden expresar polipéptidos unidos a la p3 por medio de manipulación genética, se pueden expresar a la p8 en su extremo N-terminal, aunque en este caso hay que considerar que el número de copias de la p8 es muy alto, por lo que la expresión de los polipéptidos en la p8 debe de ser limitada y distribuida a lo largo del cuerpo del fago98, 99, 101, 102. 1.3.1.3. Genoma del fago M13KE En el despliegue de fagos, la biblioteca de péptidos Ph.D.12™ esta expresada en fagos M13KE los cuales tienen diferencias con el fago M13 nativo. Las dos principales diferencias son que se le han insertado sitios de clonación (Acc65I) en el extremo 5’ al final del genIII para expresar secuencias cortas de péptidos fusionadas al extremo N-terminal de la p3 y la presencia del gen LacZα con el objetivo de poder llevar a cabo una 38 α-complementación y seleccionar las clonas con IPTG/X-Gal. El genoma del fago M13KE está contenido en una secuencia de 7,222 nucleótidos, formando una cadena sencilla de ADN (Figura 11). Figura 11. Genoma del fago MK13. Se observa en rojo la inserción del sitio de unión en el cual se introduce la secuencia de aminoácidos que será expresada en el extremo N- terminal de la proteína p3. También se observa el gen lacZα, que ha sido insertado para que se pueda llevar a cabo la α-complementación. Tomada de www.neb.com 39 2. HIPÓTESIS Los anticuerpos producidos en conejos en contra de los mimótopos de la proteína P24 diagnóstica de teniasis causada por T. solium, tendrán la capacidad de reconocer a dicha proteína de forma específica sin encontrar reacciones cruzadas con otras proteínas del mismo parásito. 3. OBJETIVO • Aislamiento y caracterización de mimótopos obtenidos a partir del antígeno P24. 3.1. Objetivos particulares • Obtención de los antígenos de Excreción-Secreción (Ag E/S) del adulto de T. solium. • Preparación de Anticuerpos específicos contra la P24. • Aislamiento y análisis de las clonas de mimótopos. • Producción y caracterización de anticuerpos anti-mimótopos por inmunoblot. 40 4. REACTIVOS QUIMICOS, EQUIPO Y REACTIVOS BIOLOGICOS 4.1. Reactivos químicos y equipo Todos los materiales y reactivos químicos utilizados en esta tesis, así como sus especificaciones han sido incluidos en la descripción del método en que fueron requeridos. Las centrifugaciones menores a 3700rpm se hicieron en una centrifuga modelo Centra CL2 de IEC, y las mayores a 10000rpm en una microcentrífuga modelo 5415 Eppendorf. 4.2. Reactivos biológicos En los experimentos que se realizaron para esta tesis, el uso de animales de laboratorio fue fundamental para poder obtener los resultados buscados, y los animales fueron tratados responsablemente y con todas las consideraciones necesarias para evitar su sufrimiento en todo el tiempo (NOM-062-ZOO-1999 Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio y las legislaciones éticas de la UNAM). Los cisticercos de T. solium que se utilizaron para infectar los hámsteres fueron obtenidos a partir de cerdos cisticercosos infectados naturalmente. Los cisticercos fueron separados del músculo esquelético, lavados en PBS frío y estéril. Se utilizaron hámsteres dorados Mesocricetus auratus hembras de 8 semanas de edad y conejos hembras de 3 meses de edad, de la cepa New Zeland, los cuales fueron proporcionados por el bioterio de la Facultad de Medicina de la UNAM. 41 4.2.1. Escherichia coli (TG1) Las bacterias que se utilizaron en este experimento fueron de la cepa E. coli TG1, ya que esta cepa es la recomendada para el despliegue de fagos. Esta cepa tiene característica genéticas que son muy importantes e indispensables para el experimento. La primera, es la presencia del plásmido F que da la característica del pili a las bacterias. Esta característica es necesaria ya que como se menciono antes, el fago M13 se une al pili por medio de la interacción de la proteína p3 del fago y el receptor TolA del pili para poder llevar a cabo la infección. Otra característica fundamental de esta cepa, es que se le ha deletado la parte que codifica para el fragmento alfa del gen lacZ (Δ(lacZ)M15)), por lo que la β-galactosidasa no se forma completamente ya que aunque el gen lacZΩ si se encuentra, esta proteína no es funcional si no están las dos subunidades presentes. El fago M13KE en el que esta expresada la biblioteca de péptidos, tiene el gen lacZα, por lo que al llevarse a cabo la infección del fago a la bacteria este gen es transferido a la bacteria en un proceso llamado α-complementación y la subunidad LacZα es transcrita y traducida a partir del gen lacZα y la β-galactosidasa es formada correctamente. 42 5. METODOS GENERALES Estos métodos fueron utilizados en forma recurrente y se describen a continuación, ya que serán mencionados en el procedimiento. 5.1. Gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS- PAGE) El SDS-PAGE es una técnica de biología molecular que consiste en la separación de proteínas, basándose en su peso molecular103, 104. Las proteínas que se van a analizar, son tratadas previamente con amortiguador de cargado (Tris-HCl 100mM pH 6.8,SDS 4%, azul de Bromofenól 0.2% y glicerol 20%) en relación 1:1, el cual también sirve como indicador del frente de corrida y calentadas a 100°C durante 5 minutos. En éste caso el amortiguador de carga también contiene 2- Mercaptoetanol (1%) que rompe los puentes disulfuro. Una vez que los geles son preparados (Anexo), se carga en cada pozo la proteína o proteínas que se quieran separar en una concentración de 2 µg por cada milímetro que tenga de ancho cada pozo, utilizando el primer pozo para los pesos moleculares. El gel se corre en una cámara de electroforesis (MiniProtean II) (BioRad) durante 60 minutos aproximadamente, con un voltaje de 100V. La electroforesis en este caso en particular dura aproximadamente 60 minutos y se detiene cuando el frente de corrida llega a aproximadamente 3 mm del final del gel. Estos geles pueden ser utilizados para observar las proteínas directamente en el gel, tiñéndolo con azul de Coomassie al 0.1% durante 8-12 horas y después destiñéndolos en Ácido Acético durante 8-12 horas, o hasta que el fondo 43 sin teñir se haya limpiado y las proteínas se observen en el gel. Los geles también pueden ser utilizados en IET. 5.2. Inmunoelectrotransferencia (IET) La IET es una técnica utilizada para trasferir las proteínas separadas en el gel de SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa mediante la aplicación de una diferencia de potencial, y posteriormente poder identificarlas utilizando los anticuerpos deseados. El procedimiento consiste en colocar la membrana de nitrocelulosa (Hybond-C) (Accesolab) en contacto con el gel, entre papel filtro por ambos lados y luego entre dos fibras también por ambos lados, todo esto en forma de “sándwich”. El “sándwich” es colocado en un casete especial y luego puestos en la cámara de IET (MiniTransBlot) (BioRad) junto con un casete de hielo para evitar el calentamiento durante una hora con una diferencia de potencial de 100V. Posteriormente las membranas se separan del gel y se cortan tiras de aproximadamente 1mm de ancho. En este punto las membranas pueden ser guardadas entre papel filtro y con PBS en una bolsa a 4°C. Cuando se desea hacer la prueba con los anticuerpos, las membranas son colocadas en recipientes especiales que tienen 8 canales en los que se coloca una tira en c/u. Las membranas son bloqueadas con leche descremada al 5% durante 40 minutos y agitación, para evitar que los anticuerpos se unan inespecíficamente a la membrana en las zonas que no hay proteínas. Posteriormente se agregan los anticuerpos que quieren ser probados en proporciones entre 1:10 y 1:500 durante 1 hora con agitación moderada. Pasada la hora, las membranas son lavadas 3 veces con PBS-Tween 0.3% durante 5 minutos, tirando la 44 solución de lavado entre cada lavado, de este modo quitamos los anticuerpos que no se hayan unido específicamente a las proteínas. Después se añade el 2° anticuerpo (anti-IgG de conejo acoplado a peroxidasa, hecho en cabra de la casa Life Technologies) en una concentración 1:2000 diluido en PBS-Tween 0.3% durante una hora con agitación moderada. Transcurrida la hora, se lavan las membranas con PBS-Tween 0.3% durante 5 minutos, tres veces y se hace un último lavado con PBS durante 5 minutos. El revelado de los anticuerpos unidos a la membrana, se realiza con una solución de 100µL de diaminobencidina (50mg/mL) disueltos en 10mL de PBS + 1µL de H2O2 al 0.3% durante tres minutos y después lavado en H2Odd 4 veces durante 5 minutos cada vez . 5.3. Adsorción y elución de anticuerpos Con el propósito de separar los anticuerpos, éstos son unidos específicamente a la proteína contra la cual fueron producidos, posteriormente se lavan los anticuerpos que no estén unidos y finalmente los anticuerpos son separados realizando una elución ácida. Para este método se tienen que hacer membranas de nitrocelulosa con la proteína deseada mediante una SDS-PAGE y posteriormente transfiriendo la proteína del gel a la membrana de nitrocelulosa por los métodos anteriormente descritos. Una vez que se tiene la membrana de nitrocelulosa con la proteína deseada (puede ser solo una región de la membrana cortada previamente), ésta se incuba durante una hora a temperatura ambiente con el suero, en el que hay anticuerpos en contra de muchas proteínas diferentes. Posteriormente la membrana es lavada 3 veces con PBS- 45 Tween durante 5 minutos. La elución acida se lleva a cabo con Glicina Acida (Glicina 0.1M, NaCl 0.15M, pH 2.6) durante tres minutos con agitación, e inmediatamente se transfiere la glicina ácida a PBS 10X en volumen suficiente para equilibrar el pH a 7. 5.4. Purificación de inmunoglobulinas (IgG) Las IgG se purificaron en una columna de afinidad, utilizando como matriz Proteína A-Sepharosa. La columna fue estabilizada haciendo pasar por ella 5mL de fosfato de sodio 0.02M pH 7.0 (solución I). Se diluyeron 5mL de suero con 5mL de la solución I, después se pasaron 2mL del suero diluido por la columna tres veces. Posteriormente se lavó la columna con 15mL de la solución I. Las IgG se eluyeron con 5mL de Glicina 1M pH 3.0, recibiendo el eluido en 5mL de Tris-HCl 1M pH 9.0 en baño de hielo para neutralizarla. La columna se estabilizo con 15mL de solución I antes de utilizarla nuevamente. Se realizó este procedimiento para los 8mL restantes de suero diluido. Se realizó este procedimiento para los otros 2 sueros. Cuando la columna no se utilizó ese mismo día, fue guardada con 2mL de solución I a 4°C. 5.5. Titulación de fagos Para la titulación de fagos se utilizaron cajas de Petri de 10 cm de diámetro con medio LB sólido (Anexo) y un cultivo de E. coli TG1 de 8 horas de incubación a 37°C con agitación. La titulación de fagos es un procedimiento en el cual se hacen diluciones seriadas de la biblioteca y/o la amplificación que se desea titular y cada una de estas diluciones se les adiciona la bacteria y se 46 inocula en una caja de Petri para posteriormente contar las unidades formadoras de placa (ufp) y así conocer la concentración de fagos en la muestra. El procedimiento consistió en preparar las diluciones seriadas en el rango de 10-2-10-12 con un factor de dilución de 10-2 entre cada dilución. Posteriormente se incubaron 300µL del cultivo de E. coli TG1 con 10µL de cada una de las diluciones en un tubo de microcentrífuga para cada dilución a 37°C en una incubadora de baño seco durante 5 minutos. Inmediatamente después, el contenido de cada de uno de estos tubos de microcentrífuga fue pasado a un tubo de vidrio con 5mL de TOP-LB (Anexo) fundido y a la temperatura adecuada para no solidificarse ni que matara a las bacterias cuando se le adicionaron, a los cuales se les añadieron 20µL de IPTG 0.1M y 40µL de X-gal 2%, este tubo se agitó en el vortex rápidamente y fue vaciado cada uno a una caja con Agar LB a temperatura ambiente y se realizó un movimiento circular para que el TOP-LB con las bacterias se distribuyeran por toda la superficie del Medio LB. Las cajas se dejaron a temperatura ambiente durante media hora para que el TOP-LB solidificara y después fueron puestas en incubadora a 37°C durante toda la noche. Se observaron las cajas y a partir de las que tuvieron aproximadamente 100 ufp se contaron las mismas, con este dato se hizo el calculo para obtener el título con la formula: # de ufp*100*FD-1= ufp/mL, en donde ufp es el número de placas visibles en la caja, FD-1 es el inverso de la dilución a partir de la cual fue inoculada la caja y ufp/mL es el título de la muestra. 47 6. PROCEDIMIENTO 6.1. Obtención de tenias La producción de la forma adulta del parásito T. solium, se llevó a cabo en hámsteres dorados, los cuales fueron desparasitados con Praziquantel (3mg/hámster) previamente a la infección. Los hámsteres fueron infectados, cada uno, con 8 cisticercosviables extraídos de la carne de cerdo infestada por vía oral. En este momento se inmunosuprimieron los hámsteres con Depomerol (metil prednisolona) en dosis de 2mg/hámster por vía intraperitoneal, y esta dosis fue administrada cada 15 días durante el periodo que duro la infección. Después de 4 ½- 5 semanas de la infección, los hámsteres fueron sacrificados mediante la administración de 3mg/Kg de peso de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal. El intestino delgado de los hámsteres fue extirpado y lavado en PBS. Una vez lavado, fue abierto con cuidado longitudinalmente para extraer las tenias del mismo. Las tenias fueron lavadas con PBS-Antibióticos (1x106 U/L de Penicilina y 2 g/L de Estreptomicina) (Sigma). 6.2. Obtención de antígenos de Excreción/Secreción (AgE/S) Las tenias se colocaron en cajas de Petri con medio RPMI con antibióticos 1x106 U/L de Penicilina y 2 g/L de Estreptomicina) 105, 106. Los AgE/S de la forma adulta de la T. solium fueron obtenidos recolectando el medio de cultivo de las tenias cada 8 horas durante las primeras 24 horas y después cada doce horas durante 4 días. La integridad de las tenias es indispensable en este procedimiento por lo que las tenias fueron examinadas regularmente, observando 48 principalmente su morfología y motilidad al microscopio estereoscópico. El medio recolectado durante este tiempo fue dializado en PBS y posteriormente concentrado en un equipo AMICON (Millipore) aproximadamente 20X, utilizando una membrana de PM 3000 (Millipore). Estos AgE/S fueron cuantificados por el método de Lowry y visualizados en un PAGE-SDS. 6.3. Obtención de suero hiperinmune α-AgE/S El suero en contra de los AgE/S se obtuvo en hámsteres hembras, a los cuales se les inmunizo con 100µg de los AgE/S a cada uno. Las inmunizaciones se hicieron cada 15 días y fueron tres en total. Antes de la primera inmunización se tomó una muestra de sangre para ser utilizada como control negativo en las IET. A los 15 días de la última inmunización se tomo una muestra de sangre para comprobar la presencia de anticuerpos en IET, y una vez comprobada hacer la titulación de los mismos. Ya comprobada la presencia de anticuerpos α- AgE/S y cuantificados, los hámsteres fueron sangrados a blanco y se obtuvo el suero por centrifugación que fue guardado a -20°C. 6.4. Obtención de anticuerpos α-P24 Para poder separar los anticuerpos α-P24 del suero Hiperinmune α-AgE/S, se requirió hacer SDS-PAGE de los AgE/S y posteriormente transferirlos a membranas de nitrocelulosa con los procedimientos anteriormente descritos. Con ayuda de los pesos moleculares en las membranas de nitrocelulosa, se recortó la región de 24kDa dejando un espacio pequeño pero considerable hacia arriba y hacia debajo de la región mencionada. Esta región fue incubada con el suero hiperinmune 49 α-AgE/S durante una hora a 37°C y agitación moderada. Siguiendo el procedimiento descrito en 5.3, lo que hizo posible separar los anticuerpos α-P24 del suero hiperinmune α-AgE/S. 6.5. Selección de mimótopos con ayuda del despliegue de fagos El despliegue de fagos es una técnica que comprende varios procesos diferentes, aquí se describen en tres grandes partes y en orden cronológico de experimentación. 6.5.1. Cultivos bacterianos. Para propagar la bacteria en un principio fue necesario hacerlo en medio mínimo M9 (Anexo) con la finalidad de que la bacteria expresara el pili, este cultivo se hizo en caja de Petri con medio sólido e inoculando la caja con la bacteria con la técnica de estriado para obtener colonias aisladas y se repitió el procedimiento con una sola colonia para que todas las bacterias fueran iguales, esta caja de medio mínimo fue el stock de bacterias que se utilizaron durante el experimento y se guardo a 4°C sellada con parafilm durante el experimento. En el experimento se utilizaron tres tipos de cultivos de bacteria, uno para la amplificación de fagos, otro para la titulación de fagos y el tercero para la infección con los fagos. El cultivo para la amplificación de fagos se hizo en 200ml de medio LB (Anexo) a una temperatura de 37°C durante 8 horas y en 5 ml de LB a temperatura de 37°C durante toda la noche (12-18 horas) para la titulación de las bacterias e infección con fagos. Los cultivos se incubaron con agitación en las condiciones mencionadas. 50 6.5.2. Sensibilización de placas y unión fago-anticuerpo Se preparó el anticuerpo α-P24, en concentración de 50µg/mL, en un amortiguador de fosfatos (NaHCO3 0.1M, pH8.6). Se colocaron en cada uno de los 8 pozos de la placa (Costar) 150µL de esta solución y se agitó con la mano para que la mayor parte de la superficie quedara en contacto con la solución. Las placas se guardaron en cámara húmeda a 4°C durante toda la noche para utilizarlas el día siguiente, aunque se pueden guardar a 4°C manteniendo la humedad dentro del recipiente hasta por una semana. Se hizo una dilución de la biblioteca de péptidos de 12 aa. desplegados en el fago MK13KE (Ph.D. 12, New England Biolabs), que representara en 100 veces el número de clonas codificadas en la misma, en este caso la biblioteca tiene una complejidad del orden 109 clonas, por lo que la dilución en este caso fue de 1x1012 fagos/mL. El título de la biblioteca se obtuvo con el método antes mencionado. A la placa de 8 pozos ya sensibilizada, se le retiro el anticuerpo y se recolecto en un tubo de microcentrífuga para su posterior uso. Se le agregó a cada pozo 150 µL de amortiguador de bloqueo (Leche descremada 0.5%-Tween 0.1%) y se incubaron durante 1 hora a 4°C. Una vez transcurrido el tiempo, se retiro el amortiguador de bloqueo con un movimiento fuerte para tirar el líquido y se colocó sobre papel adsorbente rápidamente. Las placas se lavaron 4 veces con TBST (Anexo) durante 5 minutos y con agitación a temperatura ambiente. Se agregaron 100µL de la biblioteca diluida previamente (1011 fagos) a cada pozo y se dejaron incubando a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente se retiro el anticuerpo con una micropipeta y se recolecto en un tubo de microcentrífuga para su posterior uso. La placa se lavó con 150 µL de TBST y agitación durante 5 minutos 3 veces c/u. 51 6.5.3. Elución y amplificación de fagos. Los fagos se eluyeron con 100µL de Glicina-HCl 0.2M pH2.2, los cuales fueron colocados en cada pozo durante 10 minutos sin agitación a temperatura ambiente y después recolectados con micropipeta en tubo de microcentrífuga conteniendo 400 µL de amortiguador de Tris- HCl 1M pH9 para neutralizar y se agitaron en el vortex brevemente. La amplificación de los fagos se realizó colocando 500 µL del eluido neutralizado en un tubo de microcentrífuga y agregando 1mL de cultivo de bacterias para infección, incubando por 25-30 minutos a 37°C en una incubadora de baño seco. Posteriormente estos 1.5 mL se agregaron al matraz con 200mL de cultivo para su amplificación, incubando a 37°C con agitación vigorosa durante 10-12 horas. El cultivo de la amplificación se pasó a tubos de centrifuga de 50mL y se centrifugó durante 30 minutos a 3800 rpm y temperatura de 4°C. El sobrenadante se pasó a tubos nuevos colocando aproximadamente 40 mL en cada uno, por lo que se obtuvieron 5 tubos con aproximadamente 40mL c/u. Los fagos en el sobrenadante se precipitaron con 7mL de PEG 20% NaCl 2.5M durante toda la noche a 4°C. Los tubos se centrifugaron a 3800 rpm durante 30 minutos a 4°C y se tiró el sobrenadante. El pellet que contiene los fagos se resuspendió agregando 200 µL de TBS a cada tubo y se recolectaron en un tubo de microcentrífuga, haciendo un lavado final a cada tubo con 75 µL de TBS y juntándolo con el resuspendido en el mismo tubo. Este tubo se centrifugo a 14,000 rpm durante 10 minutos y se traspaso el sobrenadante a un tubo nuevo. Se titulan estos fagos con
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