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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACUL TAD DE QUíMICA 
"OBTENCiÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE ALFALFA 
(Medicago sativa L.): REGULACiÓN .DE LA EMBRIOGÉNESIS 
SOMÁTICA y COMPARACiÓN DE DOS MÉTODOS DE 
TRAN FO RMACIÓN GEN ÉTICA" 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE QUíMICO EN ALIMENTOS 
PRESENTAN: 
IVÁN RAMíR'EZ CANO 
JAVIER SANCHEZ CRUZ 
MEXICO, D.F. 2010 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO 
Presidente: RAUL GENARO AGUILAR CABALLERO 
Vocal: FRANCISCO RUIZ TERAN 
Secretario: TERESA DE JESÚS OLIVERA FLORES 
1er Suplente: ISMAEL BUSTOS JAIMES 
2do Suplente: ANA VALERIA MARTINEZ SILVA 
Trabajo realizado en los laboratorios 116 y 114. Conjunto "E". 
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química. UNAM 
Asesor del Tema: 
M. en C. TERESA DE JESÚS OLIVERA FLORES 
Supervisor Técnico: 
Biol. MARíA DE JESÚS JIMÉNEZ VILLALOBOS 
Sustentantes: 
IVÁN RAMíREZ CANO 
JAVIER SÁNCHEZ CRUZ 
AGRADECIMIENTOS 
A la UNAM y a la Facultad de Química. 
Al laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales y al laboratorio 114 por el 
espacio y apoyo para la realización de este proyecto. 
A mis padres, que me impulsaron y motivaron para lograr esta meta, me 
llenaron de buenos consejos y me corrigieron cuando fue necesario. 
A la M. en C. Teresa de Jesús Olivera Flores, por su gran apoyo para la 
realización del presente trabajo, su asesoramiento y amistad que estuvieron 
presentes en todo momento. 
2 
DEDICATORIAS 
A Dios por darme la fuerza y la resistencia para poder culminar con este 
proyecto, por haberme bendecido con una gran familia y muy buenas 
amistades. 
A mis padres y hermanos que en todo momento me han apoyado para poder 
lograr mis metas, por su paciencia, y porque han estado conmigo en las 
buenas y malas, me han enseñado a valorar cada momento de mi vida y me 
han inculcado buenos principios y valores. 
A ustedes papá y mamá, que han sido buenos consejeros, son el pilar de este 
trabajo y quienes me dan la fuerza para lograr mis objetivos. Por esto el 
proyecto esta principalmente dedicado a ustedes Juan y Valeria. 
A mis amigos del CCH que me han hecho pasar momentos agradables, con 
quienes he vivído cosas muy agradables, a ustedes: Adriana, Angélica, Martha, 
Cesar, Luis. 
A mis amigos de la Facultad con quienes he compartido los últimos años de mi 
vida: Mitzi, Roger, Paco, Iván, Hazael, Memo, Rebeca, Neto, Itzel, Kyke, Ale, 
Magali, Brenda, Tere, Juan, Oscar, Mauricio. 
A mis compañeros y amigos del laboratorio de Cultivo de Tejidos y del 114 que 
me apoyaron cuando lo necesité: Arita, Luis, Moni, Mari, Carlos, Tavo, Dr. Pilo. 
Javier Sánchez Cruz 
DEDICATORIAS 
• A TODOS LOS SERES QUE HAN CONFIADO CIEGAMENTE EN MI, 
ELLOS SABEN QUIENES SON, GRACIAS. 
AGRADECIEMIENTOS 
• A LO MÁS IMPORTANTE; A MI FAMILIA Y A DIOS. 
• A mi MADRE ya mi PADRE, a mis HERMANOS; por estar siempre 
conmigo. 
• A mayte y a marY'por darme la oportunidad. 
• A mis compañeros del laboratorio 116 
Ramírez Cano Iván. 
5 
ABREVIATURAS 
RESUMEN GENERAL 
íNDICE DE CONTENIDO 
CAPITULO 1. REGENERACiÓN DE ALFALFA (Medicago Sativa L) 
RESUMEN. 
I.INTRODUCCIÓN 
11. ANTECEDENTES DE LA ALFALFA 
2.0 Información taxonómica 
2.1 Alfalfa. Origen y distribución 
2,2 Fisiolog ía y crecimiento 
2.3 Enfermedades y plagas 
2.4 Valor nutritivo de la alfalfa 
2.5 Adaptabilidad de la alfalfa 
2.6 Aprovechamiento de la alfalfa 
Henificacíón 
Ensilado 
Deshidratación y fraccionamiento de la alfalfa 
Pastoreo de la alfalfa 
2.7 Selección y mejora 
111. ANTECEDENTES DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 
3.0 Cultivo de tejidos vegetales 
3.1 Procesos Morfogenéticos 
3.1.1 Organogénesis 
3.1.2 Embriogénesis somática 
3.2 Regulación de la Embriogénesis somática 
3.2.1 Medio de cultivo 
3.2.2 Reguladores de crecimiento 
3.2.3 Explante 
3.2,4 Luz 
3.2.5 Potencial hidrógeno o pH 
3.2.6 Estrés 
3.2.,7 Temperatura 
3.3 Embriogénesis somática en alfalfa 
111. HIPÓTESIS 
IV OBJETIVOS 
4.0 OBJETIVO GENERAL 
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4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS 
V MATERIALES Y MÉTODOS 
5.0 METODOLOGíA 
5.1 Material biológico 
5.2 Preparación de Medios de cultivo 
5.3 Desinfección de semillas 
5.4 Germinación de la semilla 
5.5 Condiciones de incubación 
6.0 Inducción, formación de embriones y regeneración de plantas. 
6.1 Protocolo CTV 
6.2 Protocolo 111 (Nagarajan. 1985) 
6.3 Parámetros de evaluación en cada etapa 
6.3.1 Germinación 
6.3.2 Oxidación 
6.3.3 Inducción de embriones 
6.3.4 Regeneración 
VI RESULTADOS y DISCUSiÓN 
6.1 Desinfección de la semilla de alfalfa 
6.2 Oxidación del callo en los diferentes. protocolos 
6.3 Proliferación de callo en los protocolos III y CTV 
6A Regeneración de alfalfa 
VI.I CONCLUSIONES 
CAPITULO II TRANSFORMACiÓN GENÉTICA DE ALFALFA (Medicago 
Sativa L.) 
RESUMEN 
1. INTRODUCCiÓN 
II ANTECEDENTES 
2.0 Transformación genética 
3.0 Métodos de transformación genética 
3.1 Métodos directos 
3.1.1 Electroporación 
3.1.2 Polietilenglicol (PEG) 
3.1.3 Microinyección 
3.1.4 Biobalística 
3.2 Métodos indirectos 
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3.2.1 Liposomas 
3.2.2 Virus fitopatógenos 
3.2.3 Agrobacteríum tumefacíens 
4.0 VECTORES DE CLONACiÓN 
4.1 Plásmidos 
4.2 Bacteriófagos 
4.3 Cósmidos 
4.4 Cromosomas artificiales 
5.0 PROMOTORES 
6.0 GENES DE SELECCiÓN Y GENES REPORTEROS 
6.1 Genes reporteros 
6.2 Genes de selección 
Neomicin Fosfotransferasa II (N PT 11) (npt 11) 
Higromicin fosfotransferasa (HPT) (hpf¡ 
Fosfinotricin N- acetiltransperasa (PAn (pat y bar) 
7.0 PLANTAS TRANSGÉNICAS DE ALFALFA. 
8.0 Legislación y bioética 
9.0 Algunos mitos sobre los alimentos transgénicos 
111. HIPÓTESIS 
IV OBJETIVOS 
4.0 Objetivo General 
4.1 Objetivos Particulares 
V. MATERIALES y MÉTODOS 
5.0 Material biológico 
5.1 Determinación de la tolerancia de la alfalfa al Basta® 
5.2 Determinación de la tolerancia de la alfalfa a la Higromicina® 
5.3 Amplificación de los plásmidos a utilizar 
5.4 Transformación genética 
5.4.1 Transformación por biobalística 
5.4.2 Preparación de la mezcla de balas y ADN para el bombardeo 
5.4.3 Bombardeo de callos y peciolos con el plásmído pCambía 3301 
5.4.4 Ensayos de la expresión del gen gus 
5.4 .. 5 Bombardeo de callos y peciolos con el plásmido pCambia 1302 
5.4.6 Determinación de la presencia de la proteína gfp 
5.4.7 Transformación mediada por Agrobacterium tumefacíens 
VI. RESULTADOS y DISCUSiÓN 
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8 
6.0 Curva de tolerancía al Basta® (Glufosinato de amonio) 95 
6.1 Curva de tolerancía a higrornicina@ 97 
6.2 Amplificación de los plásmidos pCambia 1302 y pCambia 3301 99 
6.3 Transformación genética 99 
6.3.1 Bombardeo de callos y pecíolos con el plásmido pCambia 3301 99 
6.3.2 Bombardeo de callos y peciolos con el plásmído pCambia 1302 105 
6.3.3 Transformación genéticapor Agrobacterium tumefaciens 107 
6.3.3.1 Infección con la cepa que contenía el plásmido 3301 107 
6.3.3.2 Infección con la cepa que contenía el plásmido 1302 108 
VII. CONCLUSIONES 109 
XI. BIBLIOGRAFíA. 11.0 
X. ANEXOS 126 
9 
ABREVIATU RAS 
Reguladores del crecimiento vegetal: 
2,4-0: Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético. 
Cinetina: 6-Furfurilaminopurina. 
Medios de cultivo: 
MS: Medio nutritivo creado por Murashige & Skoog (1962) 
SH: Medio nutritivo creado por Schenk y Hildenbrant (1972) 
Blaydes: Medio creado por Blaydes (1966) 
Peso: 
IJg: microgramos 
mg: miligramos 
.g: gramos 
Volumen: 
IJL: microlitros 
mL: mililitros 
L:litros 
Longitud: 
IJm: micrómetros 
nm: nanometros 
mm. milímetros 
cm: centímetros 
Concentración: 
IJM: micromolar 
mM. milimolar 
M: Molar 
N: Normal 
Varios: 
VE: Extracto de levadura 
ADN: Ácido desoxirribonucleico 
CaMV-35S: Secuencia promotora de la transcripción del virus del mosaico de la 
coliflor 
gus: gen que codifica para la enzima ¡3-glucoronidasa 
gfp: gen que codifica para la proteína verde fluorescente 
npt 1/: gen que codifica para la neomicina fosfotransferasa II 
IJMSO: Dimetilsulfóxido 
X-gluc: 5-Bromo-4-Cloro-3.lndolil- ¡3-ácído glucorónico 
0.0: Densidad óptica 
pH: Potencial de Hidrógeno 
'C: grados Celsius 
mm Hg: milímetros de mercurio 
psi: Unidades de presión en el sistema inglés de medidas, 14.7 psi o Ib.plg-2=1 
atmósfera 
W.m-2 : Unidades de intensidad luminosa Watt por metro cuadrado. 
10 
RESUMEN GENERAL. 
El presente trabajo se realizó en dos etapas, en la primera parte el objetivo fue 
regular la Embriogénesis Somática y establecer un protocolo de regeneración 
in vitro de alfalfa (Medícago satíva L.). Se compararon dos protocolos de 
regeneración; uno propuesto por Nagaradjan en 1986 Y el segundo una 
modificación del establecido por Castañeda y Gil en el 2003 (al cual se 
denominó como CTV por sus siglas Cultivo de Tejidos Vegetales). Estos 
protocolos difieren en la cantidad de nitrógeno y reguladores de crecimiento 
utilizados en los medios de cultivo. También se evaluó la respuesta de dos 
diferentes explantes, pecíolo y tallo, para ver cual de estos presentaba mayor 
proliferación celular. Estos explantes se obtuvieron a partir de seis diferentes 
variedades de alfalfa para determinar si el genotipo influía en la respuesta 
embriogénica del explante. Los resultados obtenidos mostraron que el mejor 
protocolo fue el protocolo CTV, así como que el explante pecíolo y la variedad 
Aragón mostraron los mejores resultados. 
En la segunda parte se llevo a cabo la transformación genética y regeneración 
de plantas de alfalfa. Los métodos empleados fueron Biobalística y la infección 
con Agrobacterium tumefacíens utilizando los plásmidos pCambia 1302 y 
pCambia 3301. Previo a la transformación se determinaron las concentraciones 
a emplear de los agentes de selección para eliminar las células no 
transformadas y permitir el crecimiento de las transformadas, encontrando que 
para el caso del Basla® fue de 3 mgL'1 y para la higromicina® fue de 10 mgL'1. 
Se lograron obtener plantas transformadas a partir del bombardeo con el 
plásmido 3301 y se mantuvieron líneas de callos transformados mediante 
biobalistica con el plásmido 1302. 
11 
CAPíTULO 1: REGENERACiÓN DE ALFALFA (Medicago Saliva L) 
RESUMEN 
La alfalfa es considerada un producto fundamental en la alimentación animal, 
ya que contiene varias fuentes de nutrientes esenciales para el desarrollo 
óptimo del ganado, Esta leguminosa se cultiva a lo largo de varios estados de 
la República Mexicana para la elaboración de concentrados alimenticios para 
el ganado, La desventaja de esta cuestión radica en la calidad de las semillas, 
ya que deben ser compradas en el extranjero teniendo costos adicionales, es 
por esto que a través del Cultivo de Tejido Vegetales se estudian nuevas 
formas de mejoramiento de estas variedades por la vía de la Embriogénesis 
Somática, La Embriogénesis Somática es un complejo programa de desarrollo 
en el cual células somáticas son inducidas y dirigidas hacia la formaGÍón de 
células embriogénicas totipotentes capaces de germinar y formar plantas 
completas, Por lo tanto a través de estas bases el presente trabajo estableció 
las características necesarias para obtener un protocolo de regeneración de 
alfalfa a través de varios factores que modulan el crecimiento celular. Se 
probaron dos protocolos diferentes en cuanto a componentes orgánicos e 
inorgánicos en las diferentes etapas de desarrollo, el primero fue nombrado 
protocolo 111 y fue desarrollado por Nagaradjan, 1986; el segundo protocolo se 
llamó CTV por sus siglas Cultivo de Tejidos Vegetales y fue una modificación 
del protocolo propuesto por Castañeda y Gil, 2003; esto para evaluar la 
capacidad regenerativa través de la embriogénesis somática de alfalfa, así 
mismo se probaron diferentes variedades de alfalfa las cuales fueron Aragón, 
Atlixco, Moapa, San Miguel, Oaxaca y Velluda Peruana para seleccionar la que 
presentara una mejor respuesta regenerativa así como seleccionar el mejor 
12 
explante, pecíolo o tallo. Los resultados demostraron que el protocolo de CTV 
es más eficiente para la obtención de plantas regeneradas, la variedad Aragón 
y el explante pecíolo presentan los mejores resultados respecto a las demás 
variedades evaluadas y el tallo respectivamente. Con estos resultados también 
se demostró que la fuente de nitrógeno, el genotipo y el explante, así como los 
reguladores de crecimiento, son factores que modulan la expresión de la 
embriogénesis somática y que su manejo adecuado permite contar con un 
buen protocolo para la regeneración de alfalfa. 
13 
1. INTRODUCCiÓN. 
Por su alta calidad nutritiva, la alfalfa se considera como un recurso alimenticio 
fundamental para la producción agropecuaria. La perennidad y la capacidad de 
fijación de nitrógeno, hacen de la alfalfa una especie esencial para el 
desarrollo de dietas animales a manera de forrajes; es por esto que la alfalfa 
es la leguminosa forrajera más utilizada en la alimentación de ganado en 
México y los Estados Unidos (Nelson, 2003). El cultivo de alfalfa se extiende 
ampliamente a lo largo del territorio mexicano. Se estima que se cultivan 
alrededor de 390,000 hectáreas de alfalfa bajo condiciones de riego en todo el 
país, sobresaliendo los estados de Guanajuato, Chihuahua, Hidalgo, Puebla, 
Oaxaca, Querétaro, Michoacán, Jalisco y Baja Califomia (SIAP, 2008). En el 
centro y norte de México, la alfalfa es un cultivo muy popular entre los 
agricultores, teniendo un papel muy importante en la producción de leche y en 
la elaboración de concentrados para alimentos de ganado. Aún cuando la 
importancia de la alfalfa es grande, la generación de variedades e híbridos de 
mayor calidad no se lleva a cabo en México por lo que es necesario comprar la 
semilla mejorada enel extranjero. Es por ello que surge la necesidad imperante 
de utilizar técnicas biotecnológicas para producir nuestras propias variedades. 
El Cultivo de Tejidos Vegetales permite la regeneración de plantas, siendo una 
herramienta fundamental en la generación de plantas transgénicas. La 
adecuación de las condiciones de inducción, proliferación y regeneración 
(fuente de nitrógeno, reguladores de crecimiento, etc.) es fundamental para el 
desarrollo de la planta, por ello la primera parte del presente trabajo tuvo como 
objetivo establecer un protocolo de regeneración in vitro de alfalfa a través de 
la embriogénesis somática indirecta, 
14 
11. ANTECEDENTES DE LA ALFALFA. 
2.0 Información taxonómica. 
La alfalfa es una leguminosa forrajera que está clasificada taxonómica mente 
como se describe a continuación: 
REINO: Plantae 
DIVISiÓN: Magnolíophyta 
CLASE: Magnoliopsida 
ORDEN: Fabales 
FAMILIA: Fabaceae 
GÉNERO: Medicago L. 
ESPECIE: Medicago satíva L. 
Asimismo, existen varias formas de clasificar a la alfalfa, una de ellas es enbase a sus características agronómicas como precocidad al comienzo de la 
estación de crecimiento temprano, medio y tardío, también por la forma de la 
planta, rapidez de rebrote, resistencia al frío, resistencia a enfermedades y 
resistencia a las sequías (Musiera et al., 1991). 
2.1 Alfalfa. Origen y distribución. 
Actualmente la alfalfa se encuentra extendida prácticamente en todo el mundo, 
pero su origen se sitúa en Asia menory el sur del Cáucaso, abarcando la zona 
geográfica de Turquía, Siria, Irán, Irak, Afganistán, parte occidental de Pakistán 
y Cachemira, los reportes más antiguos proceden de Turquía y Babilonia, 
siendo el tráfico marítimo lo que contribuyó a su distribución (Michaud, 1988). 
En el siglo IV a.C., Teófrates describió su introducción a Grecia donde le dieron 
el nombre de médica, que recogido por los romanos se ha conservado hasta 
15 
nuestro días como denominación de su género botánico. La llegada a México 
se produjo en el año de 1519, posteriormente fue trasladada a Perú, Chile y 
Argentina por el Pacífico (Hendry, 1923; citado por D 'Attellis, 2005). 
2.2 .Fisiologia y crecimiento. 
El crecimiento y desarrollo de la alfalfa está determinado en parte por las 
condiciones ambientales y además por factores genéticos. Sin embargo, en 
general se pueden reconocer las siguientes etapas de crecimiento: 
1. Etapa de germinación. Aparece la plántula a partir de la semilla. La planta 
utiliza las reservas para el crecimiento y poder mantener su metabolismo. 
2. Etapa de crecimiento. Asimila carbohidratos a través de las partes verdes, lo 
cual hace crecer tallos, raíces, hojas y se reconstruye la reserva de la planta, 
3, Etapa de floración. Comienza la etapa de reproducción donde el ápice del 
tallo cambia de fase vegetativa a fase reproductiva. Se pueden localizar los 
botones florales y termina con la floración. La raíz alcanza su máxima 
concentración de reservas, pero los tejidos son menos eficientes en la función 
fotosintética, son mayores las necesidades de reproducción de la planta. 
4. Etapa de fructificación: Esta fase se caracteriza por el comienzo de la 
fecundación y termina con la maduración de semilla (Musiera et al., 1991). 
2.3 Enfermedades y plagas 
En el cultivo de la alfalfa, como en la mayoría de los cultivos, es atacada por 
varias plagas, parásitos y presenta varias enfermedades que tienen una gran 
repercusión en la cosecha; se han identificado varios grupos de insectos 
16 
involucrados en el ataque a las coseohas de alfalfa, algunos de ellos se 
presentan en la Tabla 1 (Musiera et al" 1991), 
COLEMBOLOS Sminthurus vírídís L (pulguilla de la alfalfa) 
Aphís craccívora Koch, Alphis medícag/nís Koch, A laburni Koch, 
Teríoaphís maculata Burton y Acyrlosiphon písum Harris 
HEMíPTEROS (pulgones,) 
Nezara vírídula L (chinche verde) 
Lygus pratensis, 
Laphigma exigua Hb, (gardama), 
Prodenia /ituria F, (rosquilla negra), 
LEPIDÓPTEROS Agrotís segetís Hb, (rosquillas, gusanos grises), 
Loxoxtege sticticalis L (palomillas), 
Díchomerís lotellus Comst y Phlyctaenodes stíctícalís L 
(palomillas) 
Phytonomus variabílís Herbst (gusano verde), 
Colaspídema atrum lart, (cuca, gusano negro), 
COLEÓPTEROS Apíon písi F y A africans Herbest (apión) , 
Tychius medicaginis Bris (gorgojo), 
Sítona línea tus, 
DIPTEROS Contarínía medícagínís Kieff, Dasyneura ignorata Wachtl y 
Asphondylía mikí (moscas), 
. 
Tabla 1. Plagas mas Importantes en el cultiVO de alfalfa (Del Pozo, 1977), 
2.4 Valor nutritivo de la alfalfa. 
Uno de los problemas en la alimentación animal es el origen o fuente de los 
nutrimentos y la oantidad que aportan, La alfalfa es un alimento que 
proporciona elevados niveles de dichos nutrimentos como lo son las proteínas, 
fibra, vitaminas y minerales, se sabe que es una excelente fuente de minerales 
como el caloio, fósforo, potasio, magnesio, azufre entre otros (Llorca et al" 
1999). Comparando a la alfalfa con otras leguminosas como la esparceta, el 
trébol violeta y el trébol blanco, el oontenido en materia nitrogenada es más 
elevado, aunque comparando su valor energétioo y su digestibilidad respecto a 
la alfalfa es menor. La ventaja de la alfalfa con respecto a las otras plantas 
leguminosas es que contiene una alta concentración proteica y por esto tiene 
una demanda alta en el ámbito ganadero, Para el buen aprovechamiento de la 
17 
alfalfa se tiene que considerar su composición química, ingestión voluntaria por 
el animal, la digestibilidad de la materia orgánica y el aprovechamiento en el 
estómago del animal (Musiera et al., 1991). 
Al comparar la composición de la alfalfa con otros forrajes, es posible 
comprobar el alto contenido proteico que posee, en la Tabla 2 esta la 
comparación de algunas plantas utilizadas como alimento para el ganado. 
Porcentaje Alfalfa verde Maíz verde Trigo verde Habas 
Grano 
Materia seca (MS) 28.0 33.2 21.8 86.6 
Proteína bruta (PB) 18.7 8.2 13.0 18.5 
Energía digerible (ED) 2.7 --- - 3.7 
Fibra bruta (FB) 33.3 30.3 30.2 17.7 
Materia orgánica (MO) 62.7 --- 89.6 90.9 
.. 
Tabla 2. Valor nutntlvo de algunos forrajes (Llorca et al" 1999). 
2.5 Adaptabilidad de la alfalfa 
Esta planta puede crecer en una amplia variedad de suelos y climas. Está 
adaptada a suelos alcalinos bien drenados y profundos. Ya que la acidez 
puede limitar su supervivencia, es necesario que crezca en suelos con un pH 
superior a 5.6 para. Entre 15'C y 25'C durante el d ía y 10'C Y 20'C en la 
noche es su temperatura óptima de crecimiento. También es importante 
mencionar que la alfalfa tiene gran resistencia a las sequías debido a la 
longitud y profundidad de sus raíces, las cuales hacen que la planta obtenga 
agua de partes más profundas en la tierra (Musiera et al., 1991). 
2.6 Aprovechamiento de la alfalfa 
Existen diferentes técnicas de aprovechamiento de la alfalfa como las 
siguientes: 
18 
Henificación 
El principal objetivo de la henificación es obtener el mínimo de pérdidas de 
materia seca y de nutrientes. Existe una gran cantidad de alfalfa que es 
utilizada en forma de heno, aunque hay factores como la lluvia, temperaturas 
bajas y falta de iluminación que disminuyen su calidad. También puede existir 
una pérdida de hojas las cuales son la parte más digerible, disminuyendo así el 
valor nutritivo. Las pérdidas están dadas por el tipo de maquinaria, almacenaje, 
manejo y clima (Cofré, 2008). El empacado tiene pocas pérdidas de material en 
comparación a otros sistemas aunque se debe estar muy pendiente de la 
temperatura ya que algunas veces se pueden dar pérdidas por calentamiento y 
enmohecimiento. Si la temperatura aumenta alrededor de los 40'C, existe un 
cambio en la coloración del forraje de verde a marrón, lo cual significa que 
existe una disminución de la digestibilidad de la proteína así como los hidratos 
de carbono. (Musiera et al., 1991). 
Ensilado 
El ensilaje es en esencia un proceso destructivo pues se pierden nutrientes a 
través de cambios químicos. El valor alimenticio del ensilado es inferior que el 
del forraje original y las prácticas de manejo que se utilicen determinaran la 
extensión de esas pérdidas (Garcia, 2006). Cuando se ensila un forraje muy 
tierno con una humedad mayor al 70%, se produce una fermentación no 
adecuada. Al hacer esta técnica se recomienda una desecación previa para 
evitar ciertos riesgos y problemas. El contenido de carbohidratos en la alfalfa 
hace que las fermentaciones sean más lentas y se añaden productos ricos en 
carbohidratos como melazas en proporción del 1 al 5% para mejorar la 
fermentación de alfalfa (MUsiera et al., 1991). 
19 
Deshidratación y fraccionamiento de la alfalfa 
otra manera de contener el valor proteico de la alfalfa es la deshidratación 
rápida, la cual reduce pérdidas de caroteno, xantofila, provitamina A, entre 
otras y se obtiene un producto de alta calidad en forma de harina que puede 
emplearse en la alimentación de cualquiertipo de ganado. Las desventajas de 
la deshidratación son los costos en relación al combustible que gastan las 
máquinas, es por esto que se han buscado otros procesos como el llamado 
fraccionamiento de la alfalfa el cual tiene un gran interés recientemente, 
reduciendo los costos. Su objetivo trata de la segregación de los componentes 
de la alfalfa, donde se obtiene un concentrado de riqueza proteica de 50-60% 
(Musiera et al., 1991). 
Pastoreo de la alfalfa 
Un sistema económico de aprovechamiento es el llamado pastoreo aunque 
este tiene algunos inconvenientes que reducen su producción y 
mantenimiento, como los daños que causan los animales al pisotear el cultivo 
así como efectos colaterales en la ingestión de alfalfa como el meteorismo. 
Aunque existen estos riesgos se pueden solucionar mediante un cuidadoso 
manejo y adaptación de la duración e intervalo entre los pastoreos a las 
necesidades fisiológicas de la planta (Musiera et al., 1991) 
2.7 Selección y mejora 
Los objetivos de selección y mejora de la alfalfa son muy importantes y 
variados, los cuales entran en distintos campos científicos, algunos de estos 
son incrementar la producción de la planta, mejorar la resistencia y adaptación 
a las condiciones ambientales en la siembra, resistencia a enfermedades y 
plagas (Musiera et al., 1991). 
20 
111. ANTECEDENTES DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. 
3.0 Cultivo de tejidos vegetales. 
El cultivo de tejidos vegetales es un conjunto de técnicas mediante las cuales 
es posible la regeneración de una planta completa a partir de un explante 
(parte separada de una planta, por ejemplo: hoja, tallo, protoplasto, pecíolo, 
raíz, la misma semilla). Estos tejidos se cultivan asépticamente en medios en 
los que se controla la composición y cantidad de nutrientes, pH, temperaturas 
de incubación y condiciones de foto periodo. El cultivo de tejidos es utilizado en 
diversas aplicaciones que van desde una simple propagación in vitro hasta 
estudios de fisiología y genétíca, sistemas de bioconversión, producción de 
meta bolitas secundarios entre otros. La obtención de un resultado satisfactorio 
depende en gran medida del tipo de explante, por esto se deben utilizar 
explantes con la mayor cantidad de células meristemáticas para una 
producción apropiada de callos (conjunto de células aglomeradas y 
desdiferenciadas), Son pocas las especies que como Nicotiana tabacum 
permiten el uso de una gran variedad de explantes para producir callo y lograr 
su regeneración; entre estas especies también se encuentran Daucus carota, 
Brassica napus, Medicago sativa y Trifulíum repens (Roca, 1991), 
La regeneración de las plantas es posible mediante dos rutas: la organogénesis 
o la embriogénesis somática, estas vías son utilizadas en cultivos in vitro, 
3.1 Procesos Morfogenéticos. 
El término morfogénesís abarca los cambios estructurales que se producen a 
través del desarrollo de un organismo, y puede ser definido a partir de los 
procesos de formación, expansión y muerte de órganos (Chapman y Lemaire, 
21 
1993). La organogénesis y la embriogénesis somática son los procesos 
morfogenéticos que presentan las plantas para su propagación y regeneración. 
3.1.1 Organogénesis. 
la organogénesis es un evento morfogenético que se caracteriza por la 
formación de una estructura unipolar, el desarrollo de yemas o meristémos a 
partir de una sección de la planta o a partir de callo. White en 1939 fue el 
primero en observar la formación de raíces qdventíc;;ias Para que la 
organogénesis ocurra a partir de un callo, se deben producir callos que lleven a 
la organización celular. Torphe en 1980 propuso que este proceso involucra 
diferenciación celular, interacción y reacción a señales específicas. 
3.1.2 Embriogénesis somática. 
La embriogénesis somática es un complejo programa de desarrollo en el cual 
células somáticas son inducidas y dirigidas hacia la formación de células 
embriogénicas totipotentes capaces de germinar y formar plantas completas. El 
desarrollo de embriones somáticos in vitro fue observado por primera vez 
l,Itilizando cultivos de Zanahoria (Steward et al., 1958). Se han determinado 
dos patrones en el proceso de la embriogénesis somática reportados por Sharp 
et al., 1980 los cuales son: 
A) Embriogénesis somática directa, donde el origen de los embriones se deriva 
directamente a del tejido sin presencia ni proliferación de callo. Ya que ex.isten 
células pre-embriogénicas determinadas las cuales formarán embriones a 
través del desarrollo celular. 
22 
B) Embriogénesis somática indirecta, en la cual es necesario la formación de 
callo el cual es un requisito obligatorio para la formación de embriones, el 
proceso ocurre en células diferenciadas no embriogénicas o células 
determinadas e inducidas embriogénicamente (Jiménez, 2006). 
El proceso de la embriogénesis somática comienza con la inducción de un 
embrión somático cuando una célula somática se convierte en embriogénica. A 
continuación se da el desarrollo de las estructuras embrionarias seguido de la 
proliferación, maduración del embrión, germinación y termina con la 
regeneración de una planta completa (Gómez-Kosky, 1998 citados por Rivera, 
2006). El cambio de células somáticas a células embriogénicas también es 
acompañado por la síntesis de ADN y ARN, así como de cambios en el pH, 
actividad enzimática elevada y la actividad de conversión de ATP a ADP 
(Suprasanna, 2005). 
En estudios recientes se han identificado genes que se relacionan con algunos 
estados de la embriogénesis somática los cuales fueron identificados en 
cultivos de células embriogénicas, estos genes han sido agrupados en cinco 
clases: 
1. Genes cuya función se requiere durante el crecimiento normal de la 
planta: Lec1 y Lec2 (del ingles Leafy Cotyledon). 
2. Genes específicos del embrión y que se suspenden su actividad antes 
de la germinación: Lec1 y Lec2. 
3. Genes que se expresan en la embriogénesis temprana. Lec1 y Lec2. 
4. Genes que se expresan durante la fase de expansión y maduración del 
cotiledón: LEAs (del ingles Late Embriogenesis Abundant). 
23 
5. Genes expresados durante la embriogénesis tardía hasta la germinación 
temprana: WUS. 
(Suprasanna, 2005). 
Los embriones somáticos son una estructura bipolar producida de manera 
asexual, es decir, no contienen un nuevo juego de genes, sino que, conservan 
los genes de la célula progenitora. Estas estructuras son capaces de germinar 
y convertirse en plantas completas. Además los embriones somáticos no tienen 
conexión vascular con el tejido madre y es por esta característica que los 
embriones se pueden distinguir de los brotes producto de la organogénesis, 
también se pueden diferenciar de los brotes adventicios por presentar dos 
polos definidos de crecimiento, uno hacia la raíz y otro hacia el brote aéreo. 
3.2 Regulación de la Embriogénesis somática. 
La regulación de la embriogénesis somática está modulada por varios factores. 
Algunos autores se han enfocado en el campo biomolecular (Takahara et al., 
2004), otros en el fisiológico (Godbole et al., 2004; Konradova et al:, 2004) y 
otros en el bioquímico (Sharma et al., 2004; Ramarosandratana y Stade, 2004) 
para estudiar los aspectos de la embriogénesis somática. Existen factores en la 
embriogénesis somática en los cuales es importante su estudio como lo son: la 
densidad celular (Bellincampi y Morpurgi, 1989; Vries et al., 1988; Osuga y 
Komamine 1994; Higashi et al., 1998), la concentración de oxígeno disuelto en 
el ambiente (Kessell y Carr 1972; Jay et al., 1992; Archambault et al., 1994; 
Shimazu y Kurata 1999), pH del medio (Hofmann et al., 2004), composición de 
nutrientes, hormonas en el medio de cultivo (Jimenez 2001) y la concentración 
de humedad (Meskaoui y Tremblay 1999; Bomal yTremblay 1999). 
24 
3.2.1 Medio de cultivo. 
Los medios de cultivo que se utilizan para el cultivo de células vegetales in vitrose componen de tres grupos básicos: 
A) Elementos esenciales o minerales, suplementados como mezclas de sales 
complejas. 
B) Un suplemento orgánico a base de vitaminas y/o aminoácidos. 
C) Una fuente de carbono usualmente en forma de sacarosa. 
De acuerdo con los requerimientos de la planta, los nutríentes se clasifican en: 
1) Macronutrientes: se requieren en altas concentraciones para un óptimo 
crecimiento y desarrollo de la planta. Se consideran como macro nutrientes al 
nitrógeno (N2), fósforo (P), potasio (K), magnesio (Mg
2+), calcio (Ca2+) y azufre 
(S). El nitrógeno es comúnmente suplementado como una mezcla de nitratos 
de potasio (KN03) y amonio (NH 4N03). El fósforo se agrega al medio de cultivo 
como iones fosfato de amonio (NH 4HP04), sodio (Na2P04) o potasio (K2P04) 
2) Micronutrientes: estos elementos sólo se requieren en trazas para el 
desarrollo de la planta, manganeso (Mn), yodo (1 2), cobre (Cu
2+), cobalto (C0 2+), 
boro (B), molibdeno (Mb), hierro (Fe 2+) y zinc (Zn 2+). 
3) Compuestos orgánicos: Algunos aminoácidos son comúnmente incluidos 
en el medio de cultivo, el más usado es la glicina, aunque también se han 
utilizado arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, tiamina, prolina 
y glutamina. La caseína hidrolizada es también usada como una mezcla de 
aminoácidos, 
Otros suplementos que se suelen agregar al medio son las vitaminas, aunque 
sólo dos vitaminas son consideradas como esenciales, la tiamina y el mio-
inositol que aunque no es una vitamina, su efecto es similar. 
25 
4) Fuente de carbono: La sacarosa es la fuente de carbono más empleada en 
cultivo in vitro debido a su bajo costo y fácil asimilación, pero en algunos casos 
se emplean otros carbohidratos como glucosa, maltosa galactosa y sorbitol. A 
continuación se presentan en la Tabla 3 algunos elementos que son 
fundamentales para las funciones fisiológicas de la planta y esenciales en él 
cultivo in vitro (Slater, 2008). 
Elemento Función 
Nitrógeno Forma parte de las proteínas, ácidos nucleicos y algunas 
coenzimas 
Potasio 
Calcio 
Regulador del potencial osmótico y principal catión inorgánico 
Síntesis de pared celular, funciones de membrana 
Cofactor de enzimas, componente de la clorofila Magnesio 
Fósforo Componente de ácidos nucleicos, intermediarios en respiración y 
fotosíntesis, transferencia de energía 
Azufre Componente de algunos aminoácidos (metionina y cisteína) y 
cofactores 
Cloro Se requiere para fotosíntesis 
Hierro Transferencia de electrones y como componente de citocromo 
Manganeso Cofactor de enzimas 
Cobalto Componente de algunas vitaminas 
Cobre Cofactor de enzimas, transferencia de electrones 
Zinc Cofactor de enzimas, biosíntesis de clorofila 
Molibdeno Cofactor de enzimas, componente de nitrato reductasa 
Tabla 3. Funciones de los elementos en el desarrollo fisiológico de la planta. (Slater, 
2008). 
3.2.2 Reguladores de crecimiento. 
Cuando se habla de reguladores de crecimiento se hace referencia a 
compuestos sintéticos que se asemejan en su estructura a las hormonas 
endógenas de la planta y que en cultivo de tejidos se agrega a los medios de 
cultivo para dirigir la morfogénesis de la planta. De acuerdo con su función, los 
reguladores de crecimiento se dividen en 6 familias: auxinas, citocininas, 
giberelinas, ácido abscísico, brasinoesteroides y etileno (Taiz el al., 1991). 
26 
La presencia de auxinas es esencial para la iniciación de la embriogénesis y de 
acuerdo con Gaj, 2004, se requiere de auxinas en combinación con citocininas. 
La auxina más comúnmente utilizada en cultivo de tejidos es el ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D). Otra auxina utilizada para la inducción de la 
embriogénesis somática es el ácido Indol Acétlco (AlA) y se ha visto una 
correlación entre altas concentraciones de AlA endógeno y el incremento de 
respuesta embriogénica, estos resultados se han observado en especies como 
Medicago sativa (lvanova et al., 1994), Pennicetum purpureum (Rajasekaran et 
al., 1987a), y Oactylis glomerata (Wenck et al., 1988). Sin embargo en algunos 
casos la adición únicamente de citocininas es suficiente para generar 
embriones somáticos. Las citocininas que son más frecuentemente utilizadas 
son: N6-bencilaminopurina (BAP), cinetina, zeatina y más recientemente el 
tidiazuron (Bronner et al., 1994; lantcheva et al., 1999). 
Las hormonas de crecimiento pueden ser usadas para las condiciones de 
estrés. Dudits y colaboradores en 1991 reportaron que altas concentraciones 
de 2,4-D en un corto periodo en células meristemáticas de alfalfa inducen a la 
embriogénesis somática. 
27 
REGULADOR 
DE CRECIMIENTO 
Auxina 
Citocininas 
Giberelinas 
Brasinoesteroides 
Ácido Abscísico 
Etileno 
DONDE SE 
PRODUCE 
EN LA PLANTA 
Embriones de las 
semillas, yemas de 
meristemo apical y 
hojas jóvenes 
Se sintetizan en la 
raices y se 
transportan a los 
demás órganos. 
En los meristemos de 
las yemas apicales y 
ra ices, hojas jóvenes 
y embriones de las 
semillas. 
Semillas, frutos, 
ápices, hojas y 
yemas florales. 
Hojas, tallos, raices y 
frutos verdes 
Frutos en 
maduración, nudos 
de los tallos, hojas 
viejas y flores . 
PRINCIPALES FUNCIONES 
A bajas concentraciones estimulan la elongación del tallo, inducen la 
diferenciación celular y la ramificación, regulan el desarrollo del fruto, 
aumenta la dominancia apical, regula el fototropismo y el gravitropismo, 
promueve la diferenciación del Xilema y retarda la abscisión de hojas. 
Afecta la diferenciación y crecimiento de la raiz, estimula la división y 
crecimiento de las células, estimula la germinación y retarda la 
senescencia. 
Promueven la germinación de semillas y la brotación de yemas, la 
elongación de los tallos y el crecimiento de las hojas. Estimulan la 
floración y el desarrollo de frutos, afecta el crecimiento y diferenciación 
de las ra ices. 
Inhiben el crecimiento de las raices, retardan la abscisión de hojas y 
promueven la diferenciación del Xilema. 
Inhibe el crecimiento, cierra las estomas durante el stress hidrico, 
promueve la dormancia de semillas. 
Promueve la maduración de frutos, efectos opuestos a las auxinas, 
promueve o inhibe el crecimiento y desarrollo de las raíces, hojas y 
flores dependiendo de la especie. 
Tabla 4. Reguladores de crecimiento vegetal (Sahsbun y Ross, 1992) . 
EJEMPLOS 
AlA, AIB. 2,4-D, 
ANA, Dicamba, 
Picloram 
2-ip, BAP, 
Cinetina, 
Zeatina 
AG3, AG4, AG7 
28 
Con este tratamiento las células de alfalfa avanzan de la fase G1 a la fase S en 
el ciclo celular, la exposición a auxinas sirve como un catalizador para la 
inducción a la división celular en las células epidérmicas y promover la 
diferenciación a embriones somáticos. 
El efecto de las giberelinas en la embriogénesis somática es variado y un tanto 
controversial dependiendo de las especies. El más comúnmente utilizado es el 
ácido giberélico (AG3). Se ha visto que el AG3 estimula la embriogénesis en 
cultivos de garbanzo, Iris germanica, Mer;ficago satíva, pero por otro lado inhibe 
este evento en zanahoria, mandarina y naranja (Rudus et al., 2002). En la 
Tabla número 4 se muestran algunas hormonas y reguladores de crecimiento y 
su función. 
3.2.3 Explante. 
En algunas especies se puede tomar cualquier parte de la planta (fitosoma) 
para llevar a cabo el proceso de la embriogénesis como en el caso de la 
zanahoria, pero en otras especies se necesita una parte específica para el 
desarrollo de embriones como en las gramíneas donde los mejores explantes 
son las anteras o los embriones inmaduros (Lu et al., 1983). 
3.2.4 Luz. 
Los primeros estudios a cerca de los efectos que son causados por la luz en la 
embriogénesis somática fueron hechos por Ammirato y Steward (1971). La luz 
induce una germinación normal de los embriones. Pero existen especies que 
requieren obscuridad debido a que se desarrollan mejor (Ammirato, 1973). 
Ha sido difícil estudiar los efectos de la calidadde la luz sobre la embriogénesis 
somática debido a problemas generados por sistemas de luz convencionales 
equipados con tubos fluorescentes y filtros de luz usados en tales estudios y 
29 
por último la diferente intensidad de luz aplicada, los cuales hacen diffcil el 
aislamiento de los efectos morfológicos que son causados debido a factores 
fotosintéticos (Takanori, 2005), Algunos fenómenos propios del desarrollo de 
las plantas (germinación, floración, etc,) pueden ser activados por el número de 
horas diarias de luz que recibe la planta, El número de horas de luz que recibe 
el explante cultivado in vitre puede afectar a su desarrollo, Los parámetros que 
generalmente se emplean para las condiciones de fotoperiodo son de 16 horas 
en luz por 8 horas en oscuridad (http://www.etsea2.udLes/invítro/indlce.htm). 
3.2.5 Potencial hidrógeno o pH. 
Para un buen crecimiento de las células vegetales el medio debe contener un 
pH balanceado entre lo alcalino y lo ácido, ya que en un medio sumamente 
alcalino la toma de nutrientes es pobre y viceversa en un medio ácido, La 
acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5 
(Sharp et al., 1980; Hu y Wang, 1986), 
Una vez ajustado el pH del medio, éste sufrirá una ligera acidificación durante 
el proceso de esterilización en autoclave, para después variar nuevamente 
durante el tiempo del cultivo, de forma que habitualmente se irá acidificando 
progresivamente como resultado de la absorción diferencial de algunos 
componentes del medio de cultivo, así como de la excreción de exudados por 
parte del explante (h!tp:l/www.etsea2.udLes/invitro/indice.htm). 
3.2.6 Estrés. 
Este fenómeno se da cuando existen cambios drásticos en el medio ambiente 
celular, tales como una administración inferior de nutrientes y de reguladores 
de crecimiento, depende del estado fisiológico de la planta y del nivel de estrés, 
Sobre el nivel de estrés se puede mencionar que si es bajo, éste estimula el 
30 
metabolismo e induce el mecanismo de adaptación de las células vegetales, en 
cambio si el nivel es alto las células no lo toleran y mueren. En la adaptación 
está incluida la reprogramación de la expresión genética, los cambios en el 
metabolismo celular y en la fisiología celular (Von Arnold et al., 2002). 
3.2.7 Temperatura. 
La temperatura a la que está expuesto el explante que se cultiva de manera in 
vitro afecta a la mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un 
factor fundamental a controlar. En general, cada especie tiene un intervalo de 
temperaturas en el que se produce el crecimiento óptimo, este intervalo varia 
en función del genotipo, el órgano del que se ha obtenido el explante, la época 
del año, la edad del tejido, el fotoperiodo, etc. Para la mayoría de las especies, 
se pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubación 
que oscilan entre los 20 y 28 oC. 
3.3 Embriogénesis somática en alfalfa 
La capacidad de la embriogénesis somática es una propiedad muy notable en 
el cultivo de tejidos, este fenómeno se da en las células somáticas que sufren 
cambios en el desarrollo morfológico, por lo cual son ideales para entender el 
desarrollo temprano de la planta en especial en el género Medicago. 
El género Medicago ha sido por mucho tiempo una buena fuente de estudios 
genéticos, celulares y moleculares gracias a su capacidad regenerativa in vitro. 
El primer reporte de regeneración en M.sativa fue por embriogénesis somática 
(Sanders y Bingham, 1972). Desde ese entonces han aparecido una gran 
cantidad de reportes y estudios alrededor de esta especie en especial de la 
31 
embriogénesis somática indirecta (Bingham et al., 1988; Arcioni et al., 1990; 
McKersier y Brown 1996; Barbulova et al., 2002). 
En Medícago sativa se ha observado que la respuesta embriogénica es 
dependiente del genotipo, esta dependencia genotípica fue reportada por Seitz 
y Bingham, 1988; Mitten et al., 1984; Chen et al., 1987; Nagaradjan et al., 1986; 
Barbulova et a., 2002; Ivanova et al., 1994. Aunque se debe remarcar que la 
variabilidad de la inducción y la frecuencia de embriones está ligada a la 
diversidad en las especies de Medícago y también en los individuos de la misa 
especie (Brown y Atanassov 1985; Chen et al., 1987). 
El tipo de explante es un factor importante para obtener un protocolo óptimo de 
regeneración. En alfalfa se han probado diferentes explantes teniendo éxito en 
una gran cantidad de éstos como hoja (Meijer y B.rown, 1987; Barbulova et al., 
2002), pecíolo (Lai y McKersie, 1994), internudo (Parrott y Bailey, 1993), 
embrión Inmaduro (Ninkovic et al., 1995), hipocótilo (Meijer y Brown, 1987; Kim 
et al., 2004), células en suspensión y protoplastos (Atanassov Brown, 1984). 
Algunos explantes incluyen zonas meristemáticas activas tales como hipocótilo, 
cotiledón, pecíolo y segmentos de tallo. La embriogénesis somática indirecta en 
alfalfa está caracterizada por una secuencia de eventos bien definidos incluidos 
la estimulación para la proliferación de células, diferenciación, adquisición 
competitiva embriogénica y la inducción a embriogénesis. El tratamiento con 
una auxina, en especial el 2,4-0, es primordial para las primeras etapas del 
sistema, con la consecuente remoción para el desarrollo del embrión 
(McKersie, 1995). 
Existen varias auxinas que llevan a cabo distintos efectos en los diferentes 
explantes de la alfalfa los cuales son: 
32 
a) Ninguna respuesta. 
b) Inducción de callo. 
c) Inducción de callo y embriones somáticos. 
d) Inducción directa de embriones somáticos (sin callo). 
Desde luego algunos explantes tienen mayor respuesta que otros debido al 
contenido celular como se muestra en la Tabla 5. 
Auxina Callo/pecíolo (mg) Embrión/pecíolo (#) Embriones! callo (#/g) 
AlA O O O 
AIB O O O 
AIP O O O 
ANA 36.5 O O 
ACP 47.6 O O 
2,4-0 87.7 50.5 583 
2,4,5-T 53.1 26.0 489 
. . .. 
Tabla 5, Efecto de diferentes auxlnas en la producclon de callo y embriones somatlcos 
en alfalfa (McKersie, 1995). 
La necesidad de las auxinas para llevar a cabo la embriogénesis somática es 
crucial y absoluta, ya que ningún otro compuesto ha podido remplazar a éstas. 
Aunque existen algunas sustancias que pueden aumentar el efecto y la 
capacidad de inducción de embriones en la alfalfa tales como la prolina, la 
tioprolina y el potasio (McKersie, 1995). 
Strickland en 1983 y Stuart et al. en 1985, reportaron que ciertos aminoácidos 
interactúan can el amonio en el medio para aumentar la cantidad de embriones 
somáticos en alfalfa. En particular una estimulación de prolina muestra una 
interacción sinérgica con el amonio. En presencia de prolina, el número de 
embriones puede ser incrementado en un 40% en medio SH como resultado de 
la optimización en la concentración de amonio y prolina simultáneamente. La 
33 
! 
interacción de arginina y el amonio es también aditiva al igual que la 
asparagina, lisina y serina. 
También se ha observado un sinergismo entre aminoácidos íunto al medio de 
inducción para aumentar el número de embriones por explante como se 
muestra en la Tabla 6. 
Tratamiento Número de embriones porexplante 
Control 7 
25 mM prolina 13 
0.5 mM tioprolina 19 
Prolina + tioprolina 26 
, . 
"' . . Tabla 6. Efecto de algunos amlnoacldos en la formaclon de embriones somatlcos en 
alfalfa (Shetty y McKersie, 1993). 
34 
111. HIPÓTESIS. 
Si la Embriogénesis somática es un evento modulado por fac!oresintrínsecos y 
extrínsecos de la planta, entonces el genotipo y el tipo de explante son 
determinantes para la respuesta embriogénica mientras que los factores 
ambientales sólo modulan este evento en alfalfa. 
35 
IV OBJETIVOS. 
4.0 OBJETIVO GENERAL. 
Regular a través de diferentes genotipos, tejidos y compuestos orgánicos e 
inorgánicos la .embriogénesis somática en alfalfa. 
4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS. 
a) Seleccionar a partir de seis variedades de alfalfa:Aragón, Atlixco, 
Moapa, Oaxaca, San Miguel y Velluda Peruana, la que presente una óptima 
regeneración de la planta. 
b) Comparar dos protocolos de regeneración de alfalfa diferentes en cuanto 
a componentes orgánicos e inorgánicos y etapas de desarrollo, y verificar 
cuál de ellos es el mejor. 
c) Evaluar la capacidad regenerativa de dos explantes, pecíolo y tallo de 
las diferentes variedades de alfalfa. 
36 
V MATERIALES Y MÉTODOS. 
5.0 METODOLOGíA. 
La primera parte de este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Cultivo de 
Tejidos Vegetales de la Facultad de Química, UNAM y consistió en la 
regeneración de la alfalfa (Medicago sativa L), estableciendo cultivos in vitro. 
La metodología se desarrolló según el siguiente diagrama: 
Germinación de seis variedades de 
semillas bajo condiciones asépticas. 
"'\../ 
Inducción de la embriogénesis 
somática. 
~ 
Ensayo 1. Inducción y proliferación Ensayo 2. Inducción y proliferación 
de callo, probando el protocolo CTV de callo, probando el protocolo 111 
con dos explantes (Peciolo y Tallo) (Nagarajan, 1985) con dos 
explantes (Peciolo y Tallo) 
V "'\../ 
Formación de embriones Formación de embriones. 
V "'\../' 
Regeneración y obtención de planta Regeneración y obtención de planta 
completa. completa. 
Figura 1. Diagrama de procedimiento. 
37 
5.1 Material biológico. 
Se emplearon seis variedades de alfalfa: Aragón, Atlixco, Moapa, Oaxaca, San 
Miguel y Velluda peruana. Las variedades Aragón y Moapa se tenían en el 
laboratorio almacenadas a 4'C. Por otra parte las variedades restantes se 
obtuvieron con un proveedor de un centro de acopio de semillas ubicado en la 
delegación V. Carranza, Distrito Federal, México. 
5.2 Preparación de Medios d.e cultivo. 
Los medios de cultivo se prepararon a partir de soluciones concentradas 100X, 
es decir, donde se realizaron distintos medios como el SH (Schenk y 
Hildebrant, 1972), Blaydes (Blaydes, 1966) y MS (Murashige y Skoog, 1962). 
Los medios fueron suplementados con sacarosa comercial, reguladores de 
crecimiento, aminoácidos, vitaminas y como agente gelificante Gellan® en 
diferentes concentraciones como se especificará en cada etapa. 
Respecto al pH de los medios, éste se ajustó en un rango de 5.70-5.95 según 
el medio utilizado, adicionando NaOH 0.1 N Y 1.0N ó HCI 0.1 N Y 10N. Este 
medio se dosificó a razón de 30 mL por frasco de alimento infantil con una 
posterior esterilización en autoclave vertical a 1220 C, 1.2 Kg*cm,2 durante 18 
minutos. 
5.3 Desinfección de semillas. 
Primeramente se prepararon los siguientes agroquímicos: 
Agrimicín 500'E1 - a una concentración de 4 gL,1 
BenomH@ - a una concentración de 4 gL,1 
38 
Se esterilizaron por medio de un autoclave a las condiciones mencionadas 
anteriormente (éstos tienen que estar listos y fríos antes de la desinfección). 
Se utilizó el siguiente material estéril para la desinfección de semillas: 
1 probeta de 250mL 
2 vasos de precipitado de 500mL 
1 agitador 
1 cuchara larga 
1 coladera 
Se pesaron aproximadamente 2 g de cada variedad de alfalfa y se empezó 
con la desinfección de éstas de la siguiente manera: 
Las semillas (en condiciones de asepsia) se embebieron en alcohol al 70 % de 
pureza por un minuto, a lo cual le siguió tres enjuagues con agua desionizada 
estéril por tres minutos (cada enjuague). Después se lavaron con una mezcla 
de solución de hipoclorito de sodio comercial al 50 % (con 6 % de ingrediente 
activo) más cinco gotas de Tween 20'E1 o de Tritón x·100® más quince gotas de 
Microdín®, todo esto en un volumen de 250 mL por quince minutos, en seguida 
se retiró la solución dejando las semillas en el vaso de precipitado y se colocó 
Agrimicin 500® alrededor de quince minutos, lo mismo se hizo con la solución 
de Benomil@ (no olvidar retirar la solución previa de lavado de la semilla en 
cada ocasión). Luego de añadir la solución de Benomil® se trataron las semillas 
con cuatro enjuagues de agua desionizada estéril por tres minutos cada uno. Al 
terminar estas operaciones se sembraron las semillas de cada variedad en el 
medio MS (Murashige y Skoog, 1962) ayudándose con una cuchara estéril. 
39 
5.4 Germinación de la semilla 
El objetivo de esta etapa fue el de obtener plantas in vítro de Medícago satíva 
L en condiciones estériles. Las semillas de seis variedades de alfalfa 
(Medicago satíva L) se germinaron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) 
sin hormonas. Se preparó 1.5 L de medio de germinación MS y se repartió en 
36 frascos tipo alimento infantil 3ra etapa, después se esteriHzó por medio de 
una autoclave vertical a 1220 C, 12 Kg*cm-2 durante 18 minutos. 
5.5 Condiciones de incubación. 
Todos los cultivos se incubaron en un cuarto de incubación a 25 ± 20 C y un 
fotoperiodo de 16 horas luz a una intensidad de 50-60 I-lmol m-2 s-1 por 8 horas 
de oscuridad. 
6.0 Inducción, formación de embriones y regeneración de plantas. 
Se compararon dos protocolos de regeneración de alfalfa para observar cual de 
ellos era el mejor, a continuación se describe estos dos protocolos y sus 
detalles. 
6.1 Protocolo CTV 
Este protocolo esta basado en el protocolo propuesto por Castañeda y Gil, 
2003. La diferencia está en que el medio SH que en esta ocasión se empleó 
fue modificado con una mayor cantidad de vitaminas para tener una mayor 
cantidad de nitrógeno en el medio. Se tomaron tres frascos de cada variedad 
con alfalfa a los quince días de germinación. Las plantas contenidas en los 
frascos se disectaron separando los pecíolos y tallos lo cuales fueron 
sembrados en frascos de alimento infantil con medio SH (Schenk y Hildebrant, 
1972) suplementado con 20 mL*L-1 de vitamina SH, 112 mg*L-1 de 2,4-D, 02 
40 
g*L-1 de cinetina, 0.96 g*L-1 de L-prolina más 0.053 g*L-1 de tioprolina, también 
se agregaron 30 g*L-1 de sacarosa y se solidifico el medio con 3.0 g*L-1 de 
gellan® ajustando el pH a 5.7 para su inducción (este medio SH suplementado 
se llamo SH CTV), se manejaron tres subcultivos cada dos semanas y después 
de este tiempo se pasaron los explantes al mismo medio pero con la diferencia 
de que el regulador de crecimiento 2,4-0 se adicionó a la mitad de la 
concentración inicial como lo muestra la Tabla 8, al siguiente subcultivo se 
pasaron a medio MS sin hormonas para ayudar a la germinación de los 
embriones formados a través de la embriogénesis somática indirecta inducida. 
6.2 Protocolo 111 (Nagaradjan, 1986) 
Se tomaron tres frascos de cada variedad con alfalfa a los quince días de 
germinación y se pusieron en oscuridad por quince días, después de este 
tiempo los explantes tallo y pecíolo se colocaron (por separado) en frascos de 
alimento infantil con medio SH (Schenk y Hildebrant, 1972) suplementado con 
11.2 mg*L-1 de 2,4-0, 1.08 mg*L-1 de cinetina, 3.0 g*L-1 de gellan® y 30 g*L-1 de 
sacarosa, ajustando a un de pH 5.95 para su inducción. A los ocho días de este 
subcultivo se colocaron los explantes en el medio Blaydes (Blaydes, 1966) 
suplementado con 2 g*L-1 de extracto de levadura, 100 mg*L-1 de myoinositol, 
30 g*L-1 de azúcar, 3.2 g*L-1 de gellan y a un pH 5.9 en las condiciones de 
fotoperiodo ya mencionadas. Se manejaron tres subcultivoscada dos semanas 
y por último se pasaron a un medio de regeneración el cual fue Blaydes 
suplementado con 10 g*L-1 de sacarosa, 3.2 g*L-1 de gellan® y un pH 5.9 en las 
condiciones de fotoperiodo ya mencionadas. 
Las etapas de cada protocolo, así como los medios de cultivo se presentan en 
la Tabla número 7. 
41 
Tabla 7. Etapas de désarrollo de los cultivos embriogénicos de alfalfa y medios de cultivo de cada protocolo. 
Medio de Cultivo Condiciones de 
Periodo 
Medio de Cultivo Condiciones de 
Periodo 
Protocolo 111 Incubación Protocolo CTV Incubación 
2S'C con un SH, 11 .2mg*L" 2,4-D 2S'C con un 
SH, 112mg*L'1 2,4-0 foto periodo de 16 + 0.2 mg*L'1 KN + fotoperiodo de 16 
+ 1 .08mg*L'1 KN + 30 horas luz/8 horas 
Una 
0.96 g*L'1L-prolina + horas luz! 8 horas 
Seis 
1. Inducción g*L'1 sacarosa + de oscuridad y una 0.OS3 g*L'1 \ioprolina + de oscuridad y 
3.0g*L,1 gellan, intensidad 
semana 30 g*L't sacarosa + una intensidad 
semanas 
pH S.9S luminosa de 24 3.0 g*L't gellan, luminosa de 24 
W ,2 pH S.7 W ,2 .m .m 
2S'C con un SH,5.6 mg*L'-' 2,4-0 + 2S'C con un 
BLAYOES + 2 g*L't fotoperiodo de 16 02 mg*L,1 KN + 0.96 fotoperiodo de 16 
2. Formación de 
VE + 100mg*L-1 horas luz! 8 horas 
Seis 
g*L't L-pro.lina + 0.053 horas luz/ 8 horas 
Una 
embriones 
mioinositol + 30 g*L't de oscuridad y una 
semanas 
g*L'1 tioprolina de oscuridad y 
semana sacarosa + 3.0 g*L't intensidad + 30 g*L't sacarosa + una intensidad 
gellan, pH S.9S luminosa de 24 3.0 g*L,1 gellan, luminosa de 24 
W ,2 pH S.7 W ,2 .m .m 
2S'C con un 2S'C con un 
fotoperiodo de 16 SH, 0.2mg*L't KN + fotoperiodo de 16 
3. Regeneración 
BLAYDES + 10 g*L'1 horas luz/ 8 horas 
Tres 
0.96 g*L'1 L-prolina + horas luz/ 8 horas 
Una sacarosa + 3.0 g*L-1 de oscuridad y una 0.053 g*L-t tioprolina de oscuridad y 
de plantas 
gellan, pH S.90 intensidad 
semanas 
+ 3.0 g*L'1 gellan, una intensidad 
semana 
luminosa de 24 pH S.7 luminosa de 24 
W ,2 W ,2 .m .m 
KN: Klnetlna VE: Extracto eje levadura SH: Schenk y Hlldebrant, 1972. 
42 
6.3 Parámetros de evaluación en cada etapa. 
6.3.1 Germinación. Después de la desinfección de las semillas de alfalfa en 
las distintas variedades, se llevó a cabo un conteo de contaminación en cada 
frasco germinado de alfalfa, para observar la eficiencia de este método. Esto se 
hizo a través de la revisión de cada frasco en cada repetición para determinar 
la presencia o ausencia de contaminación por hongos, bacterias u otros 
factores. 
6.3.2 Oxidación. A la mitad del proceso de regeneración de alfalfa en los dos 
protocolos se llevó a cabo una determinación del porcentaje de oxidación en el 
callo producido para observar cual de los dos protocolos tenía mejores 
condiciones para tal regeneración. 
6.3.3 Inducción de embriones. Casi al final de la regeneración de alfalfa en 
las distintas variedades, se pesó el callo formado para medir el crecimiento 
celular que puede promover cada protocolo para determinar cuál de estos dos 
genera mayor crecimiento celular y así tener una mayor formación de 
embriones somáticos. 
6.3.4 Regeneración. Por último se realizó un conteo de aquellas variedades 
con sus diferentes explantes de las cuales logró la regeneración de plantas de 
alfalfa. 
43 
VI RESULTADOS y DISCUSiÓN 
6.1 Desinfección de la semilla de alfalfa. 
Las semillas de las seis variedades fueron sembradas en medio MS 
(Murashige y Skoog). De un total de seis repeticiones de cada variedad. se 
logró obtener un 100% de germinación. En la Tabla 8 se pueden observar los 
datos obtenidos después de dos semanas de crecimiento. 
---------_,,_ Repetición 1 2 3 4 5 6 
Variedad -------------------
Aragón ./ ./ ./ ./ ./ ./ 
Atlixco le ./ ./ ./ ./ ./ 
Moapa ./ ./ ./ ./ ./ ./ 
Oaxaqueña J< ./ ./ ./ ./ J< 
San Miguel ./ ./ ./ le ./ ./ 
Velluda Peruana ./ ./ le ./ ./ ./ 
.. 
./ Sin contarrunaclon le Contaminados 
Tabla 8. Condiciones de desinfección de las semillas de alfalfa. 
Algunas variedades de alfalfa tuvieron contaminación, que en general se 
manifestó por presencia de hongo, dicha .contaminación se debió posiblemente 
a varios factores tales como la presencia de un alto contenido de carga 
microbiana, las condiciones de cultivo en las que se obtuvieron las semillas y el 
manejo post cosecha. Esto se confirma con los resultados mostrados en la 
tabla 9 donde las variedades Aragón y Moapa, no presentan contaminación en 
ninguna repetición, en comparación con el resto de las variedades las cuales 
presentan contaminación en por lo menos una repetición 
44 
El porciento bajo de contaminación junto con el porciento alto de germinación 
se deben a los agentes antimicrobianos que se utilizaron. En primer lugar el 
etanol es un agente con propiedades antisépticas el cual inhibe a la mayor 
parte de los microorganismos dañando la membrana celular (fosfolípidos), 
como consecuencia desnaturalizando las proteínas celulares. Además, esta 
sustancia tiene el efecto de disolver las grasas de la semilla ayudando a una 
mejor incorporación del agua y el hipoclorito de sodio (Mejia et al., 1998). 
En cuanto al efecto del hipoclorito de sodio, es un desinfectante que actúa 
sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos por oxidación de los 
grupos sulfhidrilo, amino e indo les. La forma activa de este agente, es el ácido 
hípocloroso (HCIO) y el cloro (CI 2), los cuales se forman por la disociación del 
hipoclorito en medio acuoso (Henao et al., 2003). 
Los agroquímicos Benomíl@ y Agrimicin 500@ fueron eficientes en su función 
puesto que inhibieron la presencia de hongo en prácticamente todas las 
semillas. El benomil@ actúa inhibiendo la síntesis de ADN la mitosis y el 
mecanismo de transmisión de mensajes genéticos de ADN al ARN. 
(hltp:l/www.tragusa.com/esint/cata logo/ficha. ph p?prod ucto =ij ) 
De acuerdo con Quirós-Roldán (2001), el Agrimicín 500@ es un bacteri.cida 
compuesto por estreptomicina y oxitetraciclina, la estreptomicina que posee 
un amplío espectro de actividad antimicrobiana se une al fragmento 16S del 
ARN ribosomal (ARNr) provocando la inhibición de la síntesis proteica al igual 
la oxitetraciclina siendo un bacteriostático de amplio espectro que actúa de la 
misma manera. 
(http :J/www.farmacopedia.es/princi pi os _ activos/mecan ismo _ de _ a ccio n/oxitetr 
acicli na _ clorh id rato. htm 1). 
45 
6.2 Oxidación del callo en los diferentes protocolos. 
A las dos semanas de colocar los explantes en el medio de inducción se llevó a 
cabo una revisión del porcentaje de oxidación de las seis variedades de alfalfa. 
70 
1: 60 
'o 
'¡j 
50 " " ';¡ o 40 .. 
" .. 30 
'(i -1: 20 .. 
I::! 
o 10 o.. 
o 
Aragón Atlixco San Mguel 
• Protocolo 111 • Protocolo eN 
Figura 2. Porcentaje de oxidación de los protocolos. 
- 1 
V~luda 
PerlJana 
Como se puede observar en la Figura 2, existe una gran diferencia sobre la 
oxidación entre los dos protocolos. En el protocolo CTV la oxidación se 
presentó de forma mínima, siendo en la variedad Aragón y el explante pecíolo 
los que reportaron una menor oxidación ya que fue de tan solo 6 %. Por otro 
lado en el protocolo 111, el porcentaje de oxidación fue muy alto puesto que se 
llegó a obtener hasta un 58 % de oxidación (en el caso de San Miguel) y un 
mínimo de 36 %, esto no es muy conveniente puesto que la oxidación 
representa una pérdida de material celular. Dicha oxidación se debe a factores 
como: una elevada presencia de oxigeno en el medio, formación de radicales 
libres, oxidación de compuestos fenólicos, entre otros (Amiot et al., 1996, Bray 
et al., 2000). 
46 
6.3 Proliferación de callo en los protocolos 111 y CTV. 
En esta etapa se realizó una comparación de la formación de callo y su 
proliferación en los dos protocolos evaluados, así como entre los diferentes 
explantes. En la Figura 3 se presentan los porcentajes de proliferación de callo 
obtenidos en esta etapa. 
100 
c: 
'o 
'C 
[!! 80 
~ 
e 60 c. 
~ 40 al 
'ffi' 
1: 
~ 20 
& 
o 
kagón Atlixco Mo~a 3Jl migJel 
Variedades 
• A"otocolo 111 • A"otooolo crv 
Figura 3. Porcentaje de proliferación de callo en los protocolos. 
Velluda 
Peruana 
Además, se reportó la cantidad de callo formado por los diferentes explantes a 
las siete semanas, que corresponde al tiempo en el cual se dio la inducción, 
formación de embriones y proliferación celular. En la Tabla 9 se muestran los 
datos de la cantidad de callo formado, y se puede ver en éstos una diferencia 
clara entre la cantidad de callo formado en el protocolo CTV respecto al 
protocolo 111. Observando los datos podemos ver que el protocolo CTV después 
de las siete semanas, generó entre 19.85 y 56.17 gramos de callo en las 
diferentes variedades evaluadas.Por otro lado, el protocolo 111 generó tan sólo 
entre 0.39 Y 12.42 gramos de callO para las diferentes variedades. Estos 
47 
resultados se deben a que el protocolo CTV contiene los nutrientes necesarios 
para un mayor crecimiento celular ya que la cantidad y tipo de nutrientes que 
se emplean favorecen la proliferación del callo y la formación de embriones. 
Esto se reafirma con lo reportado por Stuart y Strickland en 1985, quienes 
dicen que la prolina muestra un sinergismo con el amonio lo cual ayuda en la 
proliferación y formación de los embriones. También Shetty y McKersie (1993), 
concuerdan que al agregar una concentración óptima de estos dos 
aminoácidos aumenta el número de embriones por explante. 
Si analizamos la formación de callo por variedad, es notable que Aragón sea la 
que produce una mayor cantidad de callo en el protocolo CTV en comparación 
con el resto de las variedades donde se observa que Oaxaca es la variedad 
que presenta la menor formación de callo. Este resultado sugiere que la 
proliferación celular es altamente dependiente del genotipo para el caso de la 
alfalfa como lo mencionan Seitz y Bingham, 1988; Mitten el al., 1984; Chen et 
al., 1987; Nagaradjan et al., 1986; Barbulova et al., 2002; Ivanova et al., 1994. 
Los resultados que se dan en la Tabla 9 también muestran que el pecíolo fue el 
mejor explante para la proliferación celular, aunque la diferencia con el tallo no 
es tan marcada Esta capacidad de proliferación celular se debe a la cantidad y 
tipo de zonas meristematicas que posee cada explante, en el caso del pecíolo, 
contiene meristémos marginales y meristémos intercalares por lo cual hay una 
mayOJ proliferación de células vegetales respecto al tallo (Ramos, 2006). Estos 
mismos resultados fueron reportados por Castañeda y Gil en el 2003, quienes 
obtienen en sus resultados que el pecíolo produce mayor formación de callo 
respecto al tallo. 
48 
Variedad Aragón Atlixco Moapa Oaxaqueña San Miguel Velluda Peruana 
Protocolo 111 3.29 2.06 15.77 1.93 5.05 1.48 
(Nagaradjan, Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo 
1986) 
2.52 0.77 1.44 0.62 3.35 12.42 0.39 1.54 0.45 4.6 0.94 0.54 
Protocolo 92.87 86.04 64.82 61.28 89.99 69.25 
CTV Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo Pecíolo Tallo 
56.17 36.70 47.01 39.03 36.30 24.52 31.85 29.43 52.12 37.87 42.18 27.07 
Tabla 9. Gramos de callo obtenidos por ex plante en las diferentes variedades. 
49 
Además de la presencia de los aminoácidos prolina y tioprolina, otro factor 
importante que favoreció al crecimiento celular fue la presencia del regulador de 
crecimiento 2,4-0 puesto que a concentraciones de 11.2 mg*L-1 se observa mayor 
producción de callo. Se ha visto que altas concentraciones de 2,4-0 
intracelularmente, favorecen la embriogénesis somática en el género Medicago y 
esto se traduce en una alta frecuencia de formación de embriones. La 
concentración del 2,4-0 juega un rol importante en la desdiferenciación y 
diferenciación celular in vitro (Oenchev y Atanassov, 1988). 
En el caso del protocolo CTV, la presencia de 2,4-0 durante un mayor periodo 
favoreció al aumento de masa celular lo que se traduce en una mayor cantidad de 
embriones somáticos y por lo tanto una mayor cantidad de plantas regeneradas, 
situación que no se registró en el protocolo 111. Este efecto se puede observar en la 
tabla 9, donde se muestran datos de una mayor cantidad de masa célular en el 
protocolo CTV en comparación con el protocolo 11.1 en el cual el 2,4-0 es retirado 
después de una semana. La fuente de nitrógeno es un factor importante para la 
proliferación de callo y la formación de embriones somáticos. Se sabe que los 
nitratos y las sales de amonio promueven la formación del embrión. En la Figura 4 
esta la comparación del crecimiento de callo del protocolo CTV y la diferencia del 
crecimiento de callo entre los dos protocolos propuestos en la Figura 5. 
50 
Fig. 4. Comparación de formación de callo entre diferentes variedades. Crecimiento 
de callo a partir de pecíolo en el protocolo CTV A) Aragón, B) Atlixco, e) Moapa, D) 
San Miguel, E) Oaxaca, F) Velluda Peruana. 
e 
Fig. 5 Formación de callo a partir de pecíolo en dos protocolos evaluados. A) 
Aragón, protocolo 111; B) Aragón, Protocolo eTV; C) Velluda Peruana, Protocolo 111; D) 
Velluda Peruana, Protocolo eTV. 
Si comparamos los medios de cultivo utilizados para la regeneración de alfalfa, se 
puede observar que el medio Blaydes (1966) contiene una concentración superior 
de nitrógeno total en el caso de los macronutrientes respecto al medio SH (Schenk 
51 
y Hildebrant, 1972) el cual fue modificado adicionando mayor cantidad de 
vitaminas y fuentes de nitrógeno y al que fue Uamado SH CTV. Este factor es 
importante para el desarrollo del embrión, pero no es el único. Estos datos se 
pueden ver más claramente en la TabJa 10. 
Medio de cultivo Total N mg*L- NH/ mg*L- NH/rrotal N 
Blaydes(1966) 
(Protocolo 111) 547.4 225 0.411 
SH CTV 
(Protocolo CTV) 382.2 46.8 0.122 
.. 
Tabla 10. Concentraclon de fuente de mtrogeno de macronutnentes de los medios de 
cultivo. 
Sin embargo, si se observa la Tabla 11, donde se presenta la concentración de 
vitaminas de cada medio, se puede ver una gran diferencia de cantidad de fuente 
de nitrógeno orgánico que contiene el medio SH CTV con respeclo al medio 
Blaydes (1966), por lo cual se puede determinar que el medio SH CTV tiene mayor 
fuente de nitrógeno en general, contando macronutrientes, micronutrientes y fuente 
de vitaminas. Por si esto no fuese poco se debe tomar en cuenta que el medio SH 
CTV contiene sustancias como la L-prolina y la tioprolina, mientras que el medio 
Blaydes sólo contiene extracto de levadura y aunque es una fuente rica en 
vitaminas en especial del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento, 
no puede superar la cantidad contenida por el medio SH CTV. 
52 
Medio de cultivo Tiamina Mio- Ác. Piridoxina L-prolina Tioprolina 
inositol nicot1nico 
Blaydes(1966) 0.1 ---- 0.5 0.1 
(Protocolo 111) 
SH CTV 100 2000.0 10.0 1.0 960 80 
(Protocolo CTV) 
" . Tabla 11. Concentraclon de compuestos organlcos en los medios de cultivo. (Las 
concentraciones estan dadas en mg"L"'). 
Entonces se puede decir que el medio SH CTV comparado con el medio Blaydes 
(1966) contiene una mayor cantidad de fuentes de nitrógeno lo que lo hace un 
medio más apropiado para la formación de callo y de embriones somáticos. Esto 
sugiere que las células tienen más fuentes de nutrimentos para realizar la 
biosíntesis de compuestos fundamentales para su crecimiento como proteínas y 
ácidos nucleicos. En el protocolo CTV el medio que se emplea para la 
embriogénesis somática es el medio SH CTV, en comparación con el protocolo 1I1 
donde el medio empleado es el Blaydes, el cual tiene una menor cantidad de 
nitrógeno. 
6.4 Regeneración de alfalfa. 
Al término de los dos protocolos se evaluó la capacidad regenerativa de ambos 
sistemas para cada variedad. Los resultados muestran que la variedad Aragón 
tiene un mayor porcentaje de regeneración, en comparación con las demás 
variedades. Asímismo, comparando el protocolo CTV con el protocolo Il!, tenemos 
53 
que los compuestos que contienen los medios de cultivo empleados en el protocolo 
CTV favorecen la regeneración de plantas de alfalfa. Por el contrario los 
compuestos presentes el el protocolo III no permiten una regeneración tan 
abundante como en el caso del protocolo CTV (vease Tabla 12). 
% de regeneración de planta* 
Variedad Protocolo 111 Protocolo CTV 
Aragón O 66.6 
Atlixco 16.65 33.3 
Moapa O 33.3 
Oaxaca O 33.3 
San Miguel O 33.3 
Velluda Peruana O 16.65 
Tabla 12. Porcentaje de regeneración de plantas por variedad. 
Con estos datos se puede ver que la embriogénesis somática esta influenciada por 
e.1 genotipo, es decir, el material genético de cada variedades detenminante para 
que se lleve a cabo la regeneración de plantas de alfalfa. 
En los dos sistemas se realizaron tres repeticiones para cada una de las 
variedades y explantes y se contabilizó el número de repeticiones que formaron 
plantas como se muestra en la Tabla 13. 
54 
% de regeneración de planta' 
Variedad Explante Protocolo III Protocolo eTV 
Aragón Pecíolo O 66.6 
Tallo O 66.6 
Atlixco Peciolo O O 
Tallo 33.3 66.6 
Moapa Peciolo O 66.6 
Tallo O O 
Oaxaca Peciolo O O 
Tallo O 66.6 
San Miguel Pecíolo O 66.6 
Talló O O 
Velluda Peruana Pecíolo O 33.3 
Tallo O O 
• . . Tabla 13. Porcentaje de plantas reg.eneradas. Se llevaron a cabo tres repeticiones de 
cada variedad y se determinó cuantos frascos hablan regenerado. 
Los datos de la tabla anterior muestran una mayor regeneración en el protocolo 
CTV respecto al protocolo 111, ya que en todas las variedades empleadas hubo por 
lo menos una repetición con plantas regeneradas en alguno de los ex plantes, en 
cambio, en el protocolo 111 sólo se obtuvo regeneración para la variedad Atlixco en 
una de sus repeticiones, en este caso en tallo. Asimismo, al observar los 
resultados se aprecia que la variedad Aragón presentó regeneración de la planta 
en los dos explantes evaluados, del total de repeticiones realizadas, el 66.6 % 
presentó formación de planta. Por lo que se puede concluir que la embriogénesis 
55 
somática en alfalfa está determinada por el genotipo y el explante; mientras que su 
interacción con el medio ambiente, esto es, los componentes del medio de cultivo 
como las sales inorgánicas, fuente de nitrógeno orgánico, así como los reguladores 
de crecimiento (2,4-0, en este caso), modúlan la expresión genética. Es decir la 
variedad o el genotipo da la información genética necesaria para que se lleve a 
cabo la desdiferenciación celular con la consecuente formación embrional y el tipo 
de explante da la cantidad de células meristemáticas, las cuales favorecen la 
multiplicación de callo y la probabilidad de un crecimiento embrionario a través del 
fenómeno de la totipotencia. A continuación se muestran en la Figura 6 las 
diferentes etapas de regeneración de alfalfa que se lograron observar en un 
periodo de tres meses aproximadamente. 
Fig. 6 Diferentes etapas en la regeneración de alfalfa de la variedad Aragón. A) 
Diferenciación de los embriones en callos, B) Germinación del embrión, C) Aislamiento 
de plántula, O) Planta desarrollada de alfalfa, E) Crecimiento abundante de plantas de 
alfalfa. 
56 
VII CONCLUSIONES 
• El método de desinfección tuvo una eficiencia del 86%. 
• Se reguló la Embriogénesis somática en alfalfa con éxito a través del 
protocolo de regeneración llamado CTV. 
• El genotipo es determinante para la regeneración de alfalfa. 
• La mejor capacidad de regeneración se observó en la variedad Aragón. 
• El explante que presentó mayor proliferación ceular fue el pecíolo. 
• Se demostró que la fuente y cantidad de nitrógeno es importante en la 
regeneración de alfalfa. 
• En el caso de alfalfa, la presencia del regulador de crecimiento 2,4-0, fue 
un factor importante para llevar a cabo la embriogénesis somática. 
• Se llevó a cabo la regeneración de alfalfa (Medicago satíva L.) in vitre de 
manera exitosa. 
57 
CAPITULO 11 
TRANSFORMACiÓN GENÉTICA DE ALFALFA (Medicago Sativa L) 
RESUMEN 
A través de la transformación de plantas de interés agronómico se puede obtener 
gran cantidad de beneficios como la capacidad de resistencia a insectos, hongos, 
entre otros. Con la ayuda de la Ingeniería Genética y la Biotecnología, han logrado 
establecer protocolos que aseguren una buena transformación de especies 
vegetales. En el presente trabajo se probaron dos métodos de transformación 
genética en alfalfa, Biobalística y la infección con Agrobacterium tumefacíens para 
lo cual se emplearon los plásmidos pCambia1302, que confiere resistencia a la 
higromicina®, y pCambia 3301, que le da la resistencia al glufosinato de aminio 
cuyo nombre comercial es Basta@. Previamente se determinaron las 
concentraciones de los agentes selectivos para cada plásmido empleado 
encontrando que para el agente selectivo Basta® es requerida una concentración 
de 3 mg.L-1 y para la Higromicina® se requirió una concentración de 10 mg.L-1 con 
las cuales fueron seleccionadas las células vegetales que contenían el material 
genético foráneo. Por último se realizaron una serie de ensayos histoquímicos y 
microscópicos en plantas transformadas y regeneradas obtenidas a partir del 
bombardeo con el plásmido pCambia 3301 donde se logró observar la expresión 
del gen reportero gus. Para el caso del bombardeo con el plásmido 1302 se logró 
ver la expresión del gen gfp que codifica para la proteína verde fluorescente a nivel 
de callo. Mediante el método de Agrobacterium se logró observar la expresión 
transitoria de células transformadas con el plásmido pCambia 3301 a nivel de callo. 
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1. INTRODUCCiÓN. 
La transformación de plantas es una herramienta muy útil e indispensable en la 
investigación de la función de los genes, así como en el mejoramiento de algunas 
de sus características (Hansen, 1999; Birch, 1997; Komari et al., 1998). Estos 
mejoramientos pueden ser difíciles de conseguir con los procedimientos 
convencionales, es por esto que se requieren métodos alternos para la 
transformación de plantas. La transformación genética podría permitir la obtención 
de plantas mejoradas de forma discreta por ejemplo resistencia a un determinado 
herbicida, toxicidad frente a insectos, plantas usadas como biorreac!ores 
productores de anticuerpos y algunas vacunas en beneficio de la humanidad 
(ht!p ://www.jic.bbsrc.ac.ukJscience/molbíolindex.htm ). 
Con esta tecnología se pueden mejorar variedades de gran interés agronómico, y 
consecuentemente económico, introduciendo genes que confieran una ventaja sin 
modificar ningún otro carácter. Para la aplicación de la mayoría de estas técnicas 
genéticas a la mejora vegetal, se requiere una regeneración de novo eficiente de 
plantas a partir de células y cultivo de tejidos (Petri, 2005). 
Como las células vegetales comparten procesos biosintéticos básicos con células 
animales, es posible alterar genéticamente a las plantas para que sinteticen 
proteínas de origen animal o proteínas de patógenos que normalmente infectan 
tanto a los humanos como a los animales. Si estas proteínas pueden usarse luego 
de un procesamiento simple, aún cuando el costo inicial de manipulación genética 
sea alto, la producción a gran escala será barata. Aún más, la célula vegetal puede 
actuar como un sistema natural de encapsulamiento: las capas de pared celular, 
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membrana celular y membrana interna encapsulan y protegen al antígeno de la 
barrera gástrica y favorecen la activación del sistema inmune intestinal (Bégué, 
2006) 
Por esto en el capitulo 11 del presente trabajo se estableció un protocolo de 
transformación genética de alfalfa mediante las vías de bi.obalística y 
Agrobacteríum tumefaciens para un posterior empleo como modelo biológico en la 
producción de vacunas orales. 
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11 ANTECEDENTES. 
2.0 Transformación genética. 
El desarrollo y mejoramiento de protocolos para la transformación genética en 
plantas de interés agronómico inició en 1983; la combinación de técnicas de 
biologia molecular, cultivo de tejidos e ingenieria genética, representa una 
herramienta muy poderosa para introducir nuevas características de gran interés a 
diferentes especies, lo cual incluye las plantas. La ingenieria genética o 
transformación .genética, permite introducir en plantas genes provenientes no sólo 
de otras especies vegetales sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. 
(Herrera - Estrella et al., 1983). 
La transformación genética de plantas es una tecnologia que aporta variabilidad 
genética conocida sin alterar el fondo genético. El germoplasma transgénicoes 
posteriormente