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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CELULAR Y BIOCATÁLISIS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS BIOQUIMICAS P R E S E N T A Biol. Adriana Espinosa Cantú Director de Tesis: Dr. Lorenzo Segovia Forcella Cuernavaca, Mor., 2010. “Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas.” UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. El presente trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Lorenzo Segovia en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México. Durante la realización del mismo se recibió una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). A mi madre y abuela, quienes lo hacen todo posible. A los que luchan por la igualdad de oportunidades. AGRADECIMIENTOS A Lorenzo Segovia por brindarme la oportunidad de estar en su grupo de trabajo, orientarme y apoyarme. Al comité tutoral de la maestría: Dra. Gloria Saab Rincón, Dr. León Martínez Castilla y Dr. Lorenzo Segovia. A los miembros del jurado: Presidente Dr. Guillermo Gosset Secretaro Dra. Marcela Ayala Vocal Dr. Miguel Ángel Cevallos Suplente Dr. Alejandro Sosa Peinado A mis compañeros del laboratorio 8 habidos y en existencia por su apoyo, sus consejos académicos y por los buenos ratos. A Claudia Martínez por su apoyo en los experimentos y revisión del texto. A Jesús Banda por los datos del análisis de SCA y ayuda para programar. A Iliana Escamilla por sus vectores y oligos. A Viviana Escobar, Areli Morán, Mariana Peimbert y Ernesto Perez-Rueda por su constante apoyo. A la Dra. Brenda Valderrama, al Dr. Enrique Rudiño y a la Dra. Gloria Saab por su guía. A Joel Osuna y Humberto Flores por su apoyo académico. A las personas encargadas de la Unidad de Síntesis y Secuenciación de ADN: Paúl Gaytán, Eugenio López, Jorge Yánez y Santiago Becerra; A la Universidad Nacional Autónoma de México. A los que hicieron posible la tesis anímica-, económica-, intelectual- y espiritualmente hablando (gracias). ÍNDICE RESÚMEN 1 PREFACIO 2 ANTECEDENTES 6 MODELO DE ESTUDIO 15 HIPÓTESIS 20 OBJETIVOS 21 MATERIAL Y MÉTODOS 22 Construcción de las quimeras de un sitio de recombinación 22 Construcción de las quimeras de dos sitios de recombinación 26 Concentración mínima inhibitoria (CMI) 27 Expresión y Western Blot 27 Ensayo de complementación 28 Actividad in vitro 30 RESULTADOS 33 Construcción de las enzimas quiméricas 33 Evaluación de la solubilidad de las quimeras por resistencia a cloranfenicol. 34 Ensayo de complementación 36 Actividad enzimática 40 DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN 44 PERSPECTIVAS 47 REFERENCIAS 49 ANEXOS 53 1. Modelo estructural de AroE de B. subtilis y análisis: y análisis de la conservación de residuos críticos. 53 2. Análisis de las interfaces de AroE de E. coli y de B. subtilis 63 3. Modelos estructurales y análisis de las quimeras. 70 APÉNDICES 74 I. Secuencias de aminoácidos de las proteínas templado y quiméricas. 74 II. Alineamiento estructural de AroE de E. coli y B. subtilis. 75 III. Abreviaciones utilizadas. 75 IV. Índice de cuadros. 76 V. Índice de figuras. 76 VI. Índice de tablas. 77 Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 1 RESÚMEN Los dominios proteicos son las unidades evolutivas del proteoma. El estudio de los alcances y de las restricciones en la exploración del espacio de secuencia y en la generación de plegamientos por la recombinación de dominios es esencial para entender los mecanismos evolutivos e imprescindible para reforzar el conocimiento en el campo de la ingeniería de proteínas. En este trabajo se analiza el plegamiento y la función de cuatro quimeras producto de la recombinación entre dos proteínas homólogas con el 35 % de identidad: las shikimato deshidrogenasas de Escherichia coli (E) y de Bacillus subtilis (B). Las quimeras BE y EB (dominio N-terminal de B, C-terminal de E y dominio N-terminal de E, C-terminal de B, respectivamente) son producto de la recombinación en un solo sitio, mientras BEB y EBE (dominio N-terminal de B, C-terminal de E, cola o α9-α10 de B y dominio N-terminal de E, C- terminal de B, cola de E, respectivamente) son producto de la recombinación en dos sitios. EB y BEB no se lograron expresar en Escherichia coli. BE fue la quimera más insoluble y no presentó función. EBE presentó actividad in vivo por complementación a una cepa ∆aroE e in vitro por la producción de NADPH a partir de NADP+ y shikimato (SA). Los parámetros cinéticos calculados para EBE, E y B son muy similares entre sí (Km(SA) µM = 1.09, 1.09 y 1.00; kcat(SA) min-1 = 7.07x106, 5.85x106 y 1.25x106, respectivamente). EBE corresponde a la quimera activa reportada producto de la recombinación entre homólogos con el más bajo porcentaje de identidad. Adriana Espinosa Cantú 2 PREFACIO La base de las reacciones químicas y de la estructura de los sistemas vivos está mediada mayoritariamente por proteínas. Es, por lo tanto, de sumo interés conocer los mecanismos por los cuales se genera la diversidad de las proteínas en la naturaleza, la cual posibilita la amplia gama de funciones en los seres vivos. Por otra parte, el papel de las proteínas en industrias como las farmacéuticas, alimentarias y biotecnológicas es cada vez mayor. Lo anterior hace imperante la optimización de los métodos de ingeniería de proteínas que permiten la obtención de proteínas con características deseables. LA RECOMBINACIÓN DE DOMINIOS. La recombinación de dominios, entre los mecanismos que generan variación en las proteínas, es un fenómeno recurrente en la naturaleza y un recurso creciente en la ingeniería de proteínas (Cuadro 1). La definición de dominio varía según el campo de estudio. En este estudio un dominio se define como la parte de una proteína que tiene una historia evolutiva independiente con respecto al resto de la cadena [Ponting y Russell, 2002]. Los dominios también se definen como unidades funcionales y unidades de plegamiento, ya que los dominios suelen conferir una función o pueden constituir estructuras independientes con más interacciones dentro de sí mismas que con cualquier otra parte de la cadena polipeptídica en la cual se encuentran [Janin y Wodak, 1983]. Hay proteínas de un solo dominio y proteínas multidominio. De las proteínas caracterizadas, 2/3 de las procarióticas y 4/5 de las eucarióticas son multidominio [Apic, Gough y Teichmann, 2001]. En una proteína multidominio cada dominio puede aportar una función, se puede presentar modulación, cooperación o sinergia entre éstos, o se puede generar una nueva función de distinta complejidad y/o especificidad [Carbone y Arnold, 2007]. Las proteínas multidominio son productode la duplicación de dominios y de su posterior recombinación y divergencia (Figura 1). Además de la ventaja evolutiva que cada dominio pueda aportar a la función, la relativa independencia estructural de éstos reduce las restricciones evolutivas sobre el plegamiento del producto final de una recombinación [Bashton y Chothia, 2007]. Por la frecuencia de la recombinación de dominios en la naturaleza y sus implicaciones funcionales y estructurales, los dominios se consideran la unidad evolutiva del proteoma [Thornton et al., 1999]. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 3 Figura 1. Modelo de evolución de proteínas por duplicación y recombinación de dominios. En el modelo, un dominio proteíco se duplica y fusiona por duplicación y fusión de la secuencia de DNA que lo codifica. El nuevo gen presenta ciclos de mutación y selección resultando en la optimización de la interfaz entre los dominios. Posteriormente, por procesos en el DNA, la proteína multidominio se duplica y diversifica y sus dominios se pueden recombinar, generando versatilidad por combinaciones entre dominios. (La imagen del modelo evolutivo es modificación de Höcker, Claren y Sterner, 2004.) Cuadro 1: RECOMBINACIÓN: tipos y mecanismos. Las proteínas evolucionan por mutaciones, duplicaciones o arreglos (como permutaciones circulares o recombinaciones) en el DNA. La recombinación se considera como el fenómeno evolutivo principal en la generación de versatilidad en las proteínas debido a que permite una amplia exploración del espacio de secuencia y posibilita la generación de nuevos plegamientos [Vogel y Morea, 2006; Bogarad y Deem, 1999]. La recombinación puede producirse entre dos o más genes que a su vez pueden ser homólogos o no homólogos. Entre más varíen los genes recombinados, más distintos serán los genotipos y fenotipos resultantes. Bogarad y Deem, en 1999, analizaron por modelos moleculares el potencial de exploración de secuencia y el potencial evolutivo -medido por una función de la energía de la proteína resultante- de los distintos fenómenos mutagénicos. Las mutaciones presentaron el menor potencial de exploración del espacio de secuencia. La recombinación entre secuencias homólogas (también conocido como barajeo de genes), posibilita una mayor exploración del área de secuencia que las mutaciones y puede repercutir en mejorías adaptativas en el plegamiento original. En la recombinación entre secuencias no homólogas, entre más pozas genéticas (más secuencias) se incluyan, mayor es la posibilidad de generar nuevos plegamientos [Bogarad y Deem, 1999]. Las recombinaciones son resultado principalmente de la fusión y eliminación de segmentos de DNA al final de un marco de lectura abierto [Weiner, Moore y Bornberg-Bauer, 2008]. Este mecanismo concuerda con la observación de que la mayoría de los dominios versátiles son dominios codificados hacia el extremo terminal del gen [Weiner, Moore y Bornberg-Bauer, 2008]. La recombinación también puede ser resultado de transposiciones, recombinaciones sitio-específicas, deleciones, inserciones e inversiones de fragmentos de DNA, en eucariontes del barajeo de exones [Riechmann y Winter, 2000] o de transferencia horizontal [Vogel, Teichmann y Pereira-Leal 2005]. Por fines prácticos, en la introducción se menciona únicamente la recombinación de elementos correspondientes a dominios proteícos, pero la recombinación puede duplicación y fusión optimización de la interfaz duplicación y diversificación recombinación Adriana Espinosa Cantú 4 ser de desde un par de bases hasta las suficientes bases correspondientes a toda una proteína multidominio. No, obstante, los elementos que más se han identificado en eventos de recombinación son motivos y dominios. Así como en la introducción se presentan antecedentes de la recombinación de dominios, existen antecedentes que muestran eventos de recombinación de elementos menores a dominios en la naturaleza y en la ingeniería de proteínas [Graziano et. al., 2008; Riechmann y Winter, 2000; Bogarad y Deem, 1999]. No todos los dominios se recombinan con la misma frecuencia. La mayoría de las superfamilias de dominios (Cuadro 2) se presentan en combinación al menos con otra superfamilia. Puesto en números, de las 97,178 estructuras de dominios conocidas hasta el año 1997 agrupadas en 1,439 superfamilias, únicamente 86 no se combinan con otras superfamilias [Orengo et al. 1997]. De las superfamilias que se combinan, se han identificado unas superfamilias denominadas versátiles, las cuales constituyen la minoría, y que, como su nombre lo indica, se presentan en combinación con muchas otras superfamilias [Apic, Gough y Teichmann, 2001]. Corolario: Hay más combinaciones posibles de dominios de las que se han identificado en la naturaleza. Aunque lo anterior puede deberse en parte a un muestreo poco representativo de la diversidad natural de combinaciones de dominios, emergen inmediatamente una serie de preguntas: ¿Por qué no existen todas las posibles combinaciones entre los dominios? ¿No existen porque no pueden existir o por la historia evolutiva de los dominios mismos? ¿Cuáles son las restricciones principales en la función y estructura del producto de una recombinación? ¿Qué alcances, en cuanto a diversidad funcional y estructural, puede tener la recombinación de dominios? Cuadro 2: CLASIFICACIÓN DE DOMINIOS. Los dominios se pueden clasificar bajo el mismo “Sistema Naturae” que Linneo planteó para la clasificación de los seres vivos basándose en sus relaciones evolutivas y la similitud de sus características [Ponting y Russell, 2002]. Hoy en día existen diversas bases de datos para la clasificación y el almacenamiento de los dominios identificados. Cada base de datos utiliza distintos métodos para la delimitación de las secuencias conformando los dominios y para su posterior clasificación en grupos. En la base de datos CATH [Orengo et al., 1997], por ejemplo, los dominios se dividen clases, arquitecturas, topologías, superfamilias y familias. La clase está determinada por la composición de estructuras secundarias y el empacamiento de éstas. Las principales clases son: a) principalmente de α- Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 5 hélices; b) principalmente de hojas-β; y c) α/β. La arquitectura se define por el orden y orientación de las estructuras secundarias, conformando, por ejemplo, barriles ó sándwiches. La topología se define por la forma y conectividad de las estructuras secundarias en el centro del dominio. Las superfamilias están conformadas por dominios con un hipotético ancestro en común y comparten similitud de secuencia mayor al 35% y sobreposición estructural del 60% (u otras combinaciones similares entre similitud de secuencia y estructura). Por último, las familias de dominios están conformadas por secuencias con mínimo el 35% de similitud y el 80% de sobreposición estructural (u otras características similares). SCOP [Murzin et al., 1995] es otra base de datos curada manualmente que clasifica los dominios por clases con los mismos criterios que los expuestos, plegamientos, que incluye los criterios de arquitectura y topología de CATH, superfamilias y familias. En el texto de este escrito se utiliza la nomenclatura de la clasificación según SCOP. En la tabla debajo se muestra la clasificación de SCOP de los dos dominios que conforman a la enzima shikimato deshidrogenasa. Dominio Rossmann de unión a NAD(P) CLASE α/β PLEGAMIENTO Rossmann fold dependiente de NAD(P) SUPERFAMILIA Rossmann fold dependiente de NAD(P) FAMILIA Aminoácido deshidrogenasas, C-terminal DOMINIO Shikimato deshidrogenasa, C-terminal Dominio catalítico o de unión a sustrato. CLASE α/β PLEGAMIENTO Aminoácido deshidrogenasas-tipo, N-terminal SUPERFAMILIAAminoácido deshidrogenasas-tipo, N-terminal FAMILIA Shikimato deshidrogenasas-tipo, N-terminal DOMINIO Shikimato deshidrogenasa, N-terminal El patrón de combinaciones entre dominios se ha tratado de explicar mediante tres enfoques principalmente, no necesariamente excluyentes: al azar, la selección natural y por la definición de las características de los dominios versátiles. El patrón de combinaciones entre superfamilias de dominios se puede estudiar como una red, la cual presenta una distribución del tipo de la ley de potencias. En los sistemas biológicos, las redes con este tipo de distribución suelen explicarse por la incidencia de fenómenos azarosos. En el caso de las redes de combinación entre dominios, se espera que los nuevos nodos o superfamilias de dominios tengan más probabilidad de unirse a nodos previamente recombinados por ser más abundantes o más viejos [Koonin, Wolf y Karev, 2002; Vogel y Morea, 2006]. La distribución de combinaciones entre dominios se ha explicado por selección natural ante características funcionales o estructurales de los dominios en una combinación. Por ejemplo, existen pocos Adriana Espinosa Cantú 6 dominios cuya función y/o estructura puede ser combinada con otras y no ser deletérea o, en el mejor de los casos, pueda ser ventajosa. En una analogía gramatical, hay pocas letras que poniéndose juntas forman palabras [Ponting y Russell, 2002]. Por último, se ha observado que los dominios versátiles suelen ser pequeños, estar al final de las cadenas polipeptídicas o presentarse individualmente en éstas formando proteínas de un dominio. Estas características aumentan la probabilidad de que ocurra el fenómeno de la recombinación en las secuencias de DNA que codifican para estos dominios y facilitan su posterior fijación en el genoma [Weiner, Moore y Bomberg-Bauer, 2008]. Se conoce poco sobre las características que determinan el éxito de una combinación de dominios. A continuación se presentan algunos antecedentes que hay sobre el análisis de las características determinantes en la interacción física entre dominios y sobre el alcance de la recombinación de dominios en modificaciones o novedades fenotípicas (estructurales o funcionales). ANTECEDENTES DETERMINANTES EN LA INTERACCIÓN FÍSICA ENTRE DOMINIOS. Delimitación de dominios e Importancia del sitio de recombinación. La definición de los límites de los dominios en una cadena polipeptídica no es trivial. Las bases de datos (como SCOP, CATH, FSSP y 3Dee, por ejemplo) delimitan los dominios por alguno de los siguientes métodos: análisis estructural, en el cual se define un dominio por la independencia y lo compacto de una región de la secuencia polipeptídica y cuya principal limitación es la definición de dominios en proteínas con dominios discontiuos o muy compactos entre éstos; comparación entre secuencias, por búsqueda de homología con PSI- Blast o por la generación de perfiles HMM (Hidden Markov models) de familia de dominios; o por métodos ab initio en los cuales se delimitan a los dominios por predicción de estructura secundaria y predicción de centros de hidrofobicidad [Heringa, 2005]. Con el objetivo de circunvalar la problemática de la delimitación de los dominios, en la ingeniería de proteínas se han desarrollado enfoques dedicados a la elección de sitios de recombinación para optimizar la función y la estructura de las proteínas quimérica diseñadas. Voigt et al., (2002) desarrollaron un algoritmo llamado SCHEMA para graduar el número de contactos atómicos Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 7 nativos perjudicados en una quimera resultante de recombinación de dominios homólogos. La utilidad de este algoritmo se comprobó al generar bancos de quimeras a partir de dos y tres β-lactamasas [Meyer et al., 2003 y 2006, respectivamente] y de dos y tres citocromos P450 [Otey et al., 2004 y 2006] en los cuales se corroboró que las proteínas plegadas y funcionales correspondían a aquellas con los mejores calificaciones de SCHEMA. Otros enfoques permiten la predicción del éxito de la recombinación a partir de estructuras no homólogas (simulaciones Montecarlo por Bogarad y Deem, 1999), de proteínas sin estructuras determinadas (STAR por Bauer et al., 2006), con la ponderación de las mutaciones en los templados y en las quimeras (IPRO, de Saraf et al., 2006) o por análisis de la probabilidad de que se presenten choques entre los rotámeros de las quimeras (SIRCH, de Moore y Maranas, 2003). Por otra parte, se ha utilizado la información contenida en un alineamiento múltiple para estudiar la covarianza entre aminoácidos, y, con esto, predecir sitios de importancia energética en la interacción entre elementos dentro de una proteína (dominios, motivos o estructuras secundarias, por ejemplo) [Socolich et al., 2005]. Este enfoque, llamado SCA por sus siglas en inglés (Statistical Coupling Analysis; Análisis de Acoplamiento Estadístico), podría ser útil para predecir sitios de recombinación que no interfieran con la red que forman los residuos de alta covariación, implícita en aspectos basales de la función. Halabi y et al., por ejemplo, identificaron residuos importantes para el movimiento y la coordinación entre dominios en distintas proteínas con dominios PAS y SH2 [Halabi et al., 2009]. Interfaz y conector. Una interfaz entre dominios proteícos se define como el conjunto de residuos que interactúan entre los dominios. La interacción entre los residuos, a su vez, se define por una reducción en el área de la superficie accesible al solvente (ASA) en un residuo al formarse el complejo entre dos dominios (generalmente considerada > 1 Å2 de ASA), por la distancia entre los átomos de carbono alfa (de 4.0 - 6.0 Å) de los mismos, o por la distancia mínima entre cualquier átomo de un residuo de un dominio y otro átomo de un residuo del dominio complementante [Tsai et al., 1996; Jones, Marin y Thorton, 2000; Laskowski, 2001]. Los aminoácidos en las interfaces proteícas tienden a estar más conservados en secuencia y estructura que los aminoácidos en las superficies de las proteínas; mientras más adentrados en el ambiente hidrofóbico de la interfaz, más se conservan [Caffrey et al., 2004]. Por otra parte, se sabe que las proteínas multidominio homólogas que presentan del 30 al 40% de Adriana Espinosa Cantú 8 identidad de secuencia presentan la misma geometría en la interfaz (es decir, el mismo ángulo y distancia entre los dominios) [Aloy et al., 2003]. Sin embargo, existen casos de homólogos con hasta del 70% de identidad en los cuales no se conserva la geometría de la interfaz [Han et al. en el 2006]. La conservación de la geometría de la interfaz con pérdida en la estructuración de la misma (tipo de estructuras secundarias conformándola) es el resultado de restricciones funcionales en la geometría, como es el caso de las deshidrogenasas cuyo sitio activo está en la interfaz o de las tRNAs sintetasas en las cuales la orientación de los dominios es determinante para su función [Han et al., 2006]. La pérdida tanto de la geometría como de la estructuración de la interfaz se observa en proteínas con pocas restricciones evolutivas en la interfaz por la presencia de conectores (péptidos que conectan los dominios en una proteína multidominio) largos y poco estructurados o cortos pero muy flexibles [Han et al., 2006]. El número de cambios observados en la geometría de la interfaz en una familia de dominios se ha asociado linealmente con la promiscuidad en combinaciones con distintos dominios [Littler y Hubbard, 2005]. Los conectores o “linkers” no suelen conservarse en una superfamilia de dominios pero si entre los miembros de una familia [Bashton y Chothia, 2002]. Cooperatividad o independencia en el plegamiento. Hasta la fecha se conoce poco cómo afectala interacción entre los dominios y el plegamiento de una proteína. Se sabe que el conector es determinante en la interacción. Por ejemplo, se ha observado que la cooperatividad en el plegamiento de los dominios de espectinas puede ser eliminada tanto por mutaciones en alguno de los dominios (interaccion específica) como por mutaciones en el conector (interacción inespecífica) [Batey et al., 2005]. Por otra parte, en un análisis comparativo entre dominios para los cuales se había estudiado su plegamiento individual y como parte de una proteína multimérica, Han et al., en el 2007, observaron una tendencia al plegamiento independiente si las interfaces que se presentan son pequeñas y flexibles y una tendencia al plegamiento cooperativo si éstas son muy hidrofóbicas y densas [Han et al., 2007]. MODIFICACIÓN O INNOVACIÓN EN ESTRUCTURA O FUNCIÓN POR RECOMBINACIÓN DE DOMINIOS. Modificaciones fenotípicas: estabilidad, afinidad, velocidad. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 9 Muchos de los antecedentes de recombinación de dominios se han realizado con la finalidad de identificar los residuos, los motivos o las estructuras que confieren la termoestabilidad en las proteínas. Un ejemplo de esto es el trabajo de Lebbink y et al., 1995, en el cual generaron dos quimeras de glutamato deshidrogenasas a partir de los ortólogos de Pyrococcus furiosus (termofílica) y Clostridium difficile (mesofílica), con el 52% de identidad de secuencia. Una de las quimeras, compuesta del dominio N-terminal de C. difficile y del dominio C-terminal de P. furiosus, aunque soluble, no presentó actividad. La quimera inversa sí presentó actividad, aunque con menor afinidad al sustrato y al cofactor, menor eficiencia catalítica a 25 °C y menor termoestabilidad que la proteína parental de C. difficile. Por otro lado, la quimera presentó más del doble de resistencia a la desnaturalización e inactivación por cloruro de guanidina y mayor termoactividad que la enzima de C. difficile. A partir de estos resultados concluyeron que un dominio termoestable no es suficiente para la obtención de una proteína multidominio termoestable y que la termoestabilidad puede estar determinada por el dominio menos estable o más flexible de la proteína. Infirieron que los sitios de recombinación elegidos para la generación de las quimeras pudieron no haber sido los ideales por no haber considerado una estructura secundaria perteneciente al dominio N-terminal codificada al final de la secuencia, característica de las aminoácido deshidrogenasas [Lebbink et al., 1995]. Goihberg et al., en el 2010, también intercambiaron dominios de proteínas de la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas para estudiar los determinantes de la termoestabilidad. Generaron tres quimeras a partir de las alcohol deshidrogenasas de Entamoeba histolytica (E), Thermoanaerobacter brokii (T) y Clostridium beijerinckii (C): TET, CTC y TCT, en donde las primeras dos letras corresponden al organismo parental al que corresponde el dominio N-terminal y C-terminal, respectivamente, y la última a la fracción perteneciente al dominio N-terminal codificada al final de la secuencia (que no consideraron Lebbink et al.). La quimera TET presentó una estabilidad a temperatura muy baja. TCT presentó mayor estabilidad que C pero en menor grado que la parental termoestable, mientras que CTC mantuvo el fenotipo de termoestabilidad en estructura y en actividad que la parental termoestable. La diferencia entre TCT y CTC la adjudicaron a pérdida desigual de interacciones cooperativas. La inestabilidad de TET se adujo a la imposibilidad de multimerizarse. Mutaciones puntuales en residuos de la interfaz permitieron la oligomerización e incrementaron la termoestabilidad en esta quimera, por lo cual concluyeron Adriana Espinosa Cantú 10 que la oligomerización puede ser un factor determinante en la termoestabilidad de este tipo proteínas [Goihberg et al., 2010]. Otros trabajos de recombinación de dominios se han centrado en observar la contribución de los dominios en una función en específico o mejorar su catálisis. Aliverti et al. en el 2004 intercambiaron los dominios de dos isoformas de NADP-ferrodoxina reductasa de la misma especie de planta con el objetivo de disectar la contribución a la catálisis de cada uno de los dominios. Las proteínas utilizadas, con 48% de identidad de secuencia, eran isoformas de la hoja y de la raíz. El dominio N-terminal de las enzimas corresponde a un barril β que une FAD como cofactor. El C-terminal es un dominio Rossmann no canónico que une NADP(H). La quimera en que se recombinó el dominio N-terminal de la isoforma de raíz con el C-terminal de la isoforma de la hoja fue difícil de expresar y no presentó actividad. La recombinante inversa, aunque con un decremento en la estabilidad, adquirió mayor afinidad por NADP(H) y mayor eficiencia catalítica como diaforasa (transferencia de protones) dependiente de NADP(H) que cualquiera de las isoformas silvestres. La disminución de la estabilidad en la quimera, medida por pérdida de función a temperatura creciente, la explicaron por reducción de contactos entre ambos dominios y la sustitución de aminoácidos contribuyentes al ambiente característico de las interfaces de cada isoforma. Por otra parte, al aumentar la afinidad por el cofactor y la actividad catalítica en la quimera hoja-raíz, infirieron que el dominio de unión a sustrato ayuda a posicionar la coenzima NADP en el sitio activo, actividad que generalmente se le confiere únicamente al dominio C-terminal, el Rossmann fold [Aliverti, Pandini y Zanetti, 2004]. En el 2007, Tripura y Podile generaron una quimera de glucosa deshidrogenasa dependiente de pirrol quinolina quinona (PQQ). La enzima tiene importancia industrial y se utiliza como biosensor de glucosa y para solubilizar fosfatos minerales. En la búsqueda de variantes naturales con características óptimas para su utilización industrial, encontraron una variante de Serratia marcescens eficaz solubilizando fosfatos pero con una expresión deficiente. La quimera resultante de la unión del dominio N-terminal de E. coli (transmembranal) con el dominio C-terminal de S. marcescens (de unión PQQ) pudo expresarse en E. coli con mayor resistencia a temperatura y con mayor afinidad por el cofactor. Posteriormente, con la inclusión de mutaciones puntuales en las regiones Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 11 conservadas en alineamientos múltiples, se extendió la afinidad de las quimeras a distintos sustratos [Tripura y Podile, 2007]. Sharkey y Engle en el 2009 recombinaron dos glutamato deshidrogenasas con el fin de determinar la autonomía de los dominios. Las proteínas, provenientes de Clostridium symbiosum (C) y E. coli (E) presentan el 54% de identidad de secuencia. Tres de las cuatro quimeras que se construyeron (EC, CE y ECE, con la nomenclatura como la descrita anteriormente para el antecedente de Goihberg et al.) no fueron solubles y no se pudieron caracterizar. La quimera restante, CEC, insoluble de inicio, pudo caracterizarse después de la optimización del sistema de expresión con vectores más regulables, menores temperaturas de expresión y con la coexpresión de la chaperonina GroEl/Es. La quimera presentó valores menores de Km para todo sustrato y cofactor estudiado y valores de Vmax mayores para la mayoría de éstos. Como se mencionó, en las aminoácido deshidrogenasas la unión al sustrato se adjudica al dominio N-terminal y al dominio C-terminal la unión al cofactor. Con estos resultados se concluyó que la afinidad por los sustratos y por el cofactor no puede estar determinada por los dominios individuales (o no tan mayoritariamente, como se considera normalmente) [Sharkey y Engle,2009]. Novedades fenotípicas. A) Cambio de especificidad: El prototipo de cambio de especificidad por recombinación de dominios es el de las proteínas de reconocimiento de dos o más dominios que, cuando se combinan, resultan en una nueva especificidad. Ejemplo de esto se muestra en un trabajo en el 2006 de Giesecke et al., con los dominios dedos de zinc Cis2His2, los cuales se encuentran generalmente en tandem en proteínas que median interacción con DNA, RNA y otras proteínas. Giesecke et al. recombinaron dominios de unión a proteínas constituyentes de ocho factores de transcripción (provenientes de Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Locusta migratoria, y Helobdella triserialis). Lograron generar una librería con nuevos sitios de reconocimiento a proteínas y propusieron un mecanismo de interacción entre los dímeros de este tipo de proteínas [Giesecke, Fang y Joung, 2006]. Peisajovich et al., en el 2010 realizaron la modificación de las redes metabólicas a partir de 11 proteínas en la vía de reproducción de apareamiento en levaduras. Generaron Adriana Espinosa Cantú 12 66 quimeras compuestas por un dominio regulador y otro catalítico. Las recombinaciones resultaron en una mayor diversidad de respuestas en la vía que la generada a partir de la duplicación de los genes o de los dominios individualmente. Con algunas quimeras se presentó mayor eficiencia reproductiva que con las proteínas nativas de la vía. Concluyen, de una manera novedosa y contundente, que la recombinación de dominios preexistentes puede ser un mecanismo importante en la evolución de redes de proteínas y en la generación de nuevos comportamientos fenotípicos [Peisajovich et al., 2010]. La obtención de novedades fenotípicas por recombinación de dominios no se limita a proteínas de reconocimiento o de regulación. En 1994, Kataoka et al., realizaron un trabajo con aminoácido deshidrogenasas en el cual se recombinó el dominio N-terminal de la fenilalanina deshidrogenasa de Thermoactinomyces intermedius con el dominio C-terminal de la leucina deshidrogenasa de Bacillus stearothermophilus. La quimera opuesta no se pudo expresar. Las enzimas presentan un 47% de similitud de secuencia. La fenilalanina deshidrogenasa utiliza como sustrato preferencialmente a la L-fenilalanina y a la L-tirosina mientras la leucina deshidrogena actúa casi exclusivamente con L-leucina y otros L- aminoácidos ramificados. La quimera presentó los mismos valores de Km para la fenilalanina y la leucina que la proteína parental fenilalanina deshidrogenasa y una menor actividad específica ante fenilalanina como sustrato; sin embargo, presentó mayor actividad frente a isoleucina y valina. Con estos resultados se concluyó que ambos dominios se pueden plegar independientemente y que la combinación genera un nuevo sitio activo consistente con la nueva especificidad [Kataoka et al., 1994]. B) Novedad funcional por suma de actividades: Existen varios antecedentes en donde se reporta la suma de actividades al juntar dos o más dominios, cada uno con una función [Pavoor, Cho y Shusta, 2009; Doi y Yanagawa, 1999]. Por razones de espacio solamente se presenta uno, elegido por su actualidad y la trascendencia que puede tener en el campo de la bioingeniería. Wheeldon, Campbell y Banta, en el 2009, publicaron un trabajo en donde se reporta la combinación de tres dominios que no se presentan juntos en la naturaleza: una aldo-ceto reductasa termoestable, dos dominios zipper α−hélice de leucina que forman hidrogel y un dominio randomly-coiled. La quimera resultante presentó la formación de hidrogel y actividad de reductasa comparable con la parental, generando un biomaterial activo, lo que se considera un avance importante Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 13 para áreas de la biotecnología como la ingeniería de tejidos, la bioelectrocatálisis y la generación de biosensores [Wheeldon, Campbell y Banta, 2009]. C) Novedad funcional o recuperación de actividad: Segatori et al., en el 2004, realizaron el intercambio del dominio de la tioredoxina de DsbC con el de DsbA. Ambas proteínas participan en la formación de enlaces disulfuro en las proteínas de membrana. En E. coli, DsbA forma los nuevos enlaces por su función oxidativa, mientras DsbC no oxida in vivo pero isomeriza los enlaces y presenta función de chaperona. Ambas proteínas comparten un dominio de tioredoxina homólogo, DsbC además presenta un dominio de dimerización. Segatori et al. generaron la quimera del dominio de dimerización de DsbC con el de tioreductasa de DsbA, generando una proteína con función tanto de DsbA como de DsbC. Lo sorprendente de este trabajo es que el dominio de dimerización no contribuye a la catálisis, contribuye a la interacción de DsbC con otra proteína en la vía que permite su reducción constante. La inclusión del dominio de dimerización a DsbA permitió la recuperación de actividad de DsbC por la interacción con otras proteínas [Segatori et al., 2004]. Más adelante, en el 2008, en el mismo grupo se construyeron quimeras con el dominio de DsbA de la tioredoxina y los dominios de dimerización no homólogos al de DsbC. Una de estas quimeras, obtenida a partir de la unión de un dominio de dimerización Fkp cis/trans isomerasa y DsbA, presentó eficiencias catalíticas in vivo comparables a la enzima DsbC. Con ambos trabajos se concluyó que la adición de dominios es un mecanismo evolutivo importante para la formación de vías cada vez más complejas y que, en el caso de las tioredoxinas, es la organización estructural y no la identidad de los dominios la determinante de la función [Segatori et al., 2004; Arredondo et al., 2008]. Otro ejemplo de la obtención de novedades funcionales es la generación de 11 quimeras a partir de un sitio de recombinación entre una farnesil difosfato sintasa y una crisantemil difosfato sintasa con el 75% de identidad. Ambas enzimas parentales sintetizan isoprenoides por reacciones de elongación, ciclopropanación y ramificación. Las quimeras sintetizaron isoprenoides por ciclobutanización, mecanismo ausente en las enzimas parentales. El análisis permitió sugerir que la enzima que naturalmente tiene esta función evolucionó a partir de las sintasas de isoprenoides [Thulasiram, Ericsson y Poulter, 2007]. Adriana Espinosa Cantú 14 Las conclusiones de estos trabajos, entre los muchos otros que hay sobre el tema, permiten afirmar que la recombinación de dominios posibilita generar nuevas superficies de contacto que optimizan la función preexistente o la modifican hasta el grado de generar nuevas afinidades o nuevas catálisis. Por otra parte, se evidencía que la recombinación de dominios puede resultar en la formación de condiciones inestables en las interfaces. Como se puede observar, la mayoría de los antecedentes se basan en la recombinación de proteínas homólogas. Hay tres principios que sustentan la recombinación de proteínas homólogas como un buen modelo en la ingeniería de proteínas: 1) La recombinación de proteínas homólogas permite utilizar el material preexistente en la naturaleza e imitar el fenómeno evolutivo para investigar los determinantes de la función y el plegamiento de las proteínas; 2) Proteínas con el mismo plegamiento pueden presentar distintas funciones, lo que posibilita aumentar la diversidad de fenotipos en las quimeras; y 3) La recombinación homóloga potencia la exploración del área de secuencia (posibles genotipos) en comparación con otros métodos mientras aumenta la probabilidad de la obtención de proteínas plegadas y funcionales [Carbone y Arnold, 2007]. En la mitad de los antecedentes presentados se utilizaron deshidrogenasas como objetos de estudio y, en la mayoría de éstos, específicamente miembros de la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas dependientesde NAD(P). Las deshidrogenasas dependientes de NAD(P) son un modelo valioso porque implican un dominio versátil y antiguo, el plegamiento Rossmann, porque presentan la función en la interfaz de los dos dominios y, por otra parte, porque tienen importancia industrial. En el presente trabajo se utilizó una shikimato deshidrogenasa perteneciente a la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas dependientes de NAD(P). A continuación se presentan las características de la enzima. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 15 MODELO DE ESTUDIO La enzima shikimato 5-deshidrogena. Las shikimato 5-deshidrogenasas (AroE) catalizan la reducción del 3-dehidroshikimato a shikimato (EC 1.1.1.25) (Figura 2). La reacción constituye el cuarto paso en la vía del shikimato, en la cual, a partir de fosfoenolpiruvato y 4-eritrosa fosfato, se produce corismato, el precursor de los aminoácidos aromáticos y de algunos metabolitos secundarios aromáticos (Figura 3). AroE es esencial para el metabolismo; cepas ∆aroE son auxotróficas para los tres aminoácidos aromáticos Trp, Phe y Tyr [Pittard y Wallace, 1966]. Las enzimas shikimato deshidrogenasas están presentes en bacterias, arqueas, plantas, hongos y parásitos del orden apicomplexa [Herrmann y Weaver, 1999]. La caracterización de la estructura y de la función de la enzima shikimato deshidrogenasa ha sido de principal interés para la generación de antimicrobiales, herbicidas y antiparasitarios dirigidos a esta enzima o a otras en la misma vía, así como para su utilización como materia prima en la síntesis de inhibidores de neuroaminidasas como el oseltamivir (tamiflú). Figura 2. Actividad de la shikimato 5-deshidrogenasa. A) Representación de las estructuras del 3- dehidroshikimato y del shikimato B) Representación de la estructura del cofactor nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+). Adriana Espinosa Cantú 16 Figura 3. Vía del shikimato. Se muestran los sustratos de la vía del shikimato, cuyo producto final es el corismato del cual derivan productos aromáticos y el ácido fólico, entre otros metabolitos. (Imagen modificada de http://www-abell.ch.cam.ac.uk/research/Shikimate.html.) En este trabajo se utilizaron las enzimas shikimato deshidrogenasa de Escherichia coli y de Bacillus subtilis. La enzima shikimato deshidrogenasa de Escherichia coli (AroEEc) es monomérica y constituye una cadena polipeptídica de 271 aminoácidos con un peso molecular de 29380 Da [Anton y Coggins, 1988]. Los dos dominios que la componen forman βαβ sándwiches (Figura 4a). El dominio N-terminal (M1-T101) es un dominio de la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas dominio N-terminal interrumpido por el dominio C-terminal y completado por una cola de 34 aminoácidos (G237-S271). Consiste de seis hojas-β y seis α-hélices en un orden 2-1-3-5-6-4, con la hojas-β 5 antiparalela a las demás. El dominio C-terminal (G103-F236) es un dominio Rossmann dependiente de NAD(P), uno de los dominios más versátiles (se encuentra en combinación con varios dominios) y más antiguos que se conocen (Cuadro 3). Está compuesto de seis hojas-β paralelas en orden 3- 2-1-4-5-6 y α-hélices a ambos lados. La tercera y cuarta α-hélices están reemplazadas por asas irregulares, por lo cual es de los Rossmann NAD(P) más pequeños [Michel et al., 2003; Padyana y Burley, 2003]. Los dominios interactúan por intercalamiento de cadenas hidrofóbicas: α5 interactúa con la β10, β11 y α6 (numeradas por la posición final en la enzima con ambos dominios) y α4 interactúa con α6 y α7 [Michel et al., 2003]. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 17 Figura 4. Shikimato deshidrogenasa (AroE) de E. coli. A) Representación de la estructura de la shikimato deshidrogenasa de E. coli con NADP como cofactor. A la derecha el dominio de unión a sustrato; a la izquierda el dominio Rossmann. B) Cambio conformacional entre una enzima activa (conformación cerrada) e inactiva (conformación abierta). En rojo AroE en la conformación cerrada; en azul, YdiB, parálogo de AroE, en la conformación abierta. En verde se representa a AroE en una conformación intermedia. Se representa al cofactor NADP y se indican los dos residuos que actúan como bisagra, T101 y Q244. Figura extraída de Michel et al., 2003. El sitio activo, como en todas las aminoácido deshidrogenasas, lo constituye una hendidura profunda conformada por dos α-hélices en la interfaz entre ambos dominios y en la cual se une el sustrato por residuos principalmente del domino N-terminal y el cofactor por residuos del dominio C-terminal [Michel et al., 2003]. Ante la unión del sustrato y el cofactor hay un movimiento de los dominios de una estructura abierta a una cerrada (Figura 4b). El movimiento corresponde a una rotación de ~25° por el eje que pasa por los residuos Q26 y D102, lo que genera que la punta del dominio N-terminal recorra una distancia de ~14 Å (Figura 4b) [Michel et al., 2003]. Los residuos implicados en la formación de los puentes de hidrógeno que se modifican ante el movimiento conformacional son N86, T101, y Q244, T87 y N59. Los tres primeros residuos (N86, T101 y Q244) están altamente conservados en la familia de shikimato deshidrogenasa, T87 en el 92% de las secuencias y N59 en el 60%. En la conformación abierta, Q244 forma puentes de hidrógeno con las cadenas laterales de N59 y T101. Cuando se une el sustrato y se adquiere la conformación cerrada, Q244 genera nuevas interacciones con N86 y mantiene aquellas con T101 [Michel et al., 2003]. Una vez formado el sitio activo, el C3 del 3-dehidroshikimato se posiciona a 3 Å de distancia para recibir el hidrógeno del C4 del anillo nitrogenado de NADPH. El mecanismo de acción propuesto plantea que la transferencia de hidruros y la protonación del C3 del dehidroshikimato ocurren de manera concertada. . La K65 funciona como un ácido/base Adriana Espinosa Cantú 18 general. El protón de la K65 es recuperado o liberado posteriormente del o hacia el agua presente en el sitio activo por coordinacion con otro residuo, D102 [Gan et al., 2007]. La molécula de agua, los residuos que unen al sustrato y los que intervienen en la reacción están conservados en toda la familia de shikimatos deshidrogenasas. Hay un único residuo en el dominio Rossmann que pudiera estar interviniendo en la unión del sustrato (Y215), conservado en el 64% de los miembros de la familia [Sinhg et al., 2008]. Se ha planteado que intervenga en la estabilización del intermediario más que en la unión al sustrato [Han et al., 2009]. La enzima presenta inhibición lineal competitiva por producto que se compensa por la sobreexpresión del gen [Draths, Know y Frost, 1999]. En condiciones de sobreexpresión, por otra parte, AroEEc puede producir quinato a partir del 3-dehidroshikimato [Draths, Know y Frost, 1999]. En E. coli, AroEEc presenta un parálogo, YdiB, con el cual comparte el 28% de identidad y el 50% de similitud de secuencia. YdiB utliliza 3- dehidroshikimato y 3-dehidroquinato como sustrato y, a diferencia de AroEEc, prefererentemente NADH como cofactor [Benach et al., 2003; Michel et al., 2003]. La enzima shikimato deshidrogenasa de Bacillus subtilis (AroEBs) no se encuentra igualmente caracterizada a su paráloga en E. coli. La proteína, codificada por el gen aroD, está consitutida por 280 aminoácidos. Presenta conservación de los residuos de unión a sustrato y a cofactor identificados en otras shikimato deshidrogenasas [Padyana y Burley, 2003; Ye et al., 2003] y se pueden identificar por su secuencia los dos dominios estructurales. Probablemente forme dímeros como en otras proteínas homólogas. A diferencia de E. coli, B. subtilis no presenta parálogos de la shikimato deshidrogenasa [Benach et al., 2003]. Hay una patente de ingeniería de vías metabólicaspara la optimización de la producción de shikimato en Bacillus subtilis [Iomantas et al., 2002]. La familia shikimato deshidrogenasa. La familia de shikimato deshidrogenasas (SDH) se puede dividir funcionalmente en 4 grupos: Sdh, YdiB, RifI y Sdh-l [Singh et al., 2008]. Cada grupo se puede identificar por motivos característicos de importancia putativa en el reconocimiento del sustrato y por los motivos que determinan la especificidad por NADPH o NADH; varios de los residuos que componen a los motivos están altamente conservados en todas las SDH [Singh et al., 2008]. El grupo Sdh comprende a las enzimas AroE, cuyo prototipo, la shikimato deshidrogenasa de E. coli, se describió en la sección anterior. El grupo de YdiB se define como quinato/shikimato Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 19 deshidrogenasas, ya que pueden utilizar tanto dehidroquinato como dehidroshikimato como sustratos. Algunos de los miembros de este grupo, como la YdiB de E. coli, parecen ser producto de la transferencia horizontal y neofuncionalización de enzimas SDH de α- proteobacterias (Firmicutes). Los homólogos del grupo RifI son parte de la vía biosintética aminoshikimato, que conlleva a la biosíntesis del antibiótico rifamicina B. Por último, el grupo Sdh-l está constituido por enzimas con mucha menor actividad que la SDH de E. coli con shikimato o quinato como producto. Cuadro 3: EL DOMINIO ROSSMANN. Los dominios Rossmann se encuentran en proteínas con una amplia gama de actividades catalíticas como oxidoreductasas, hidrolasas, liasas e isomerasas. Corresponde a uno de los dominios más antiguos, versátiles y abundantes en la naturaleza. Se encuentran, por ejemplo, en el 1% de las proteínas eucarióticas y en el 3% de las procarióticas [Kallberg y Persson, 2006]. Está compuesto de dos motivos estructurales que unen mononucleótidos formados por una estructura secundaria βαβαβ. Se piensa que los dominios Rossmann dependientes de NAD(P) evolucionaron por duplicación y fusión de genes codificantes de motivos de unión a mononucleótidos sin homología entre sí formando un dominio de seis hojas-β con α-hélices intercaladas en un orden relativo 321456 [Carugo y Argos, 1997]. Hay dos características en secuencia y una estructural conservadas en los dominios Rossmann dependientes de NAD(P): un asa rica en glicinas (motivo-G) que interactúa con el grupo bifosfato del NAD, un residuo al final de la β2 implicado en la identificación al cofactor (NAD, NADP o FAD) y una molécula de agua presente en la apoenzima que estabiliza al asa y al cofactor en su conformación extendida y pudiera contribuir entálpicamente a la energía libre de la unión del cofactor [Kallberg y Persson, 2006; Bottoms, Smith y Tanner, 2002; Carugo y Argos, 1997]. Estructura secundaria y topología típica del dominio Rossmann dependiente de NAD(P). Entre β1 y αA (o α1) se encuentra el asa rico en glicinas; al final de β2 se posiciona el residuo que generalmente dicta la especificidad entre NAD (Asp o Glu) y NADP (Arg). Figura de Bottoms, Smith y Tanner, 2002. Los dominios Rossmann dependientes de NAD(P) se presentan en combinación con dominios de 7 superfamilias distintas, nombrados dominios dominios de unión a sustrato o dominios catalíticos. Una de estas suprfamilias es la de el dominio de Adriana Espinosa Cantú 20 aminoácido deshidrogenasas N-terminal, con el que se encuentra combinado el dominio Rossmann en las shikimato deshidrogenasas. En cada combinación con las distintas superfamilias de dominios de unión a sustrato se conserva: 1) la posición de dominios en la proteína, ya sea en el extremo amino o carboxilo de la proteína, embebido en el dominio Rossmann o éste embebido en los dominios catalíticos; y 2) el ángulo y orientación entre ambos dominios. La conservación de la posición de los dominios en la cadena polipeptídica parece ser el resultado de que para cada combinación se presentó un solo evento de recombinación al que le siguió la divergencia que generó la variación dentro de la superfamilia [Bashton y Chothia, 2002]. JUSTIFICACIÓN Las shikimato deshidrogenasas de E. coli y de B. subtilis son de las deshidrogenasas más pequeñas, presentan menos de 300 residuos. El estudio de la recombinación de sus dominios es un caso especial al presentar su sitio activo en la interfaz entre los dominios. El dominio Rossmann está embebido en el dominio N-terminal, por lo que resulta interesante estudiar la optimización de las interfaces entre los dominios en la divergencia dentro de la familia y la relativa independencia estructural y funcional de los dominios. Además, el estudio permitirá complementar el conjunto de datos que se han obtenido previamente de la recombinación de dominios en proteínas que presentan un dominio Rossmann dependiente de NAD(P). La shikimato deshidrogenasa de E. coli y de B. subtilis presentan el 35 % de identidad de secuencia. El reporte de la recombinación de dominios entre estas dos proteínas representará, entre los antecedentes, la recombinación de dominios entre proteínas con un Rossmann dependiente de NAD(P) con menor porcentaje de identidad de secuencia. Por otra parte, como se mencionó anteriormente, las enzimas son de importancia industrial, mientras que el parálogo de la shikimato deshidrogenasa de E. coli, YdiB, es probablemente resultado de la transferencia horizontal de sus homólogos en Firmicutes. Las quimeras entre las shikimato de E. coli y B. subtilis podrían presentar caracterísiticas en el plegamiento y en la función útiles para la industria o pudieran presentar características remanentes al evento evolutivo que condujo a su neofuncionalización de YdiB. HIPÓTESIS La recombinación de los dominios entre dos enzimas shikimato deshidrogenasas con el 35% de identidad de secuencia resultará en quimeras activas. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 21 OBJETIVOS El objetivo del presente trabajo es analizar las restricciones y posiblidades de obtener quimeras funcionales al intercambiar los dominios de la enzimas shikimato deshidrogenasas de Escherichia coli y de Bacillus subtilis por observar los fenotipos de la función y del plegamiento de las quimeras. OBJETIVOS PARTICULARES. • Generación de cuatro quimeras producto de la recombinación en uno o dos sitios. • Comparación del plegamiento y función de las quimeras por ensayos con un reportero de plegamiento y su capacidad de recuperar su función biológica in vivo e in vitro. • Comparación de las características estructurales y de secuencia por métodos bioinformáticos de las proteínas parentales que pudieran explicar los resultados. Realización de modelos estructurales de las quimeras. Adriana Espinosa Cantú 22 MATERIALES Y MÉTODOS CONSTRUCCIÓN DE LAS QUIMERAS DE UN SITIO DE RECOMBINACIÓN. Las quimeras se generaron por el intercambio de los dominios de las enzimas shikimato deshidrogenasa de E. coli y B. subtilis (Figura 5). Figura 5. Templados y quimeras. Representación de las estructuras y secuencias de AroE de A) E. coli y B) B. subtilis. C) Representación de las secuencias de las cuatro quimeras ortólogas analizadas en este trabajo. Las quimeras BE y EB presentan en el extremo carboxílico la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa de la cual proviene el domino Rossmann dependiente de NAD(P). Las quimeras BEB y EBE presentan en el extremo carboxílico la secuencia de la proteína nativa de la cual proviene el dominio N-terminal. Las secuencias quiméricas se produjeron a partir de dos vectores pT4 construidos previamente por Iliana Escamilla con la secuencia de aroE de E. coli (AroEEc). Los vectores pT4 presentan un origen de replicación de alto número de copias (ColE1, presente en pUC), promotor pTrc fuerte, uncasete de resistencia a kanamicina (Km) y la fusión traduccional a la enzima cloranfenicol acetil transfería (CAT) como reportero de plegamiento. La actividad de resistencia cloranfenicol (Cm) depende del correcto plegamiento de CAT y de la proteína a la que se encuentra fusionada. Se muestran a continuación los dos vectores iniciales (Figura 6): pT4-E-CAT Vector de 3.5 kb con la secuencia del gen aroE con sitio de restricción NcoI al inicio, una mutación A298C (nucleótido correspondiente al último aminoácido del dominio N- Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 23 terminal y que produce una mutación N100H) que genera un sitio BstEII, y un sitio de restricción BamHI al final de la secuencia de aroE, la cual tiene una deleción en el último nucleótido (A819) para la eliminación del codón de paro. La fusión traduccional a CAT se presenta tras una secuencia conector de 12 nucleótidos. Al eliminar la secuencia de CAT mediante una digestión con BamHI y BglII queda una cola de histidinas en fase con el gen aroE. Para diferenciar su producto de la proteína AroEEc nativa, a la proteína resultante de la expresión de este vector se le determinó E, y a la proteína con la fusión E-CAT. pT4-E(C)-CAT Vector de 3.3 kb con la secuencia nucleotídica de aroE correspondiente al dominio Rossmann (considerado a partir del nucleótidos 306, aminoácido 102). Presenta un casete de 48 pb que contiene codones de término en sus seis posibles marcos de lectura, el cual disminuye el número de falsos positivos en el tamizaje. La eliminación del casete se obtiene por la digestión con MlyI. La inserción de secuencias en fase genera la mutación A298C que presenta el otro vector parental pT4-E-CAT. A su vez, también presenta el sitio de restricción BamHI al final de la secuencia y la fusión traduccional a la enzima CAT que al ser eliminada genera la cola de histidinas. Figura 6. Vectores iniciales. A) pT4-E-CAT; B) pT4-E(C)-CAT. Las secuencias del gen completo de la shikimato deshidrogenasa de Bacillus subtilis (aroEBs), el fragmento correspondiente al dominio N-terminal y el correspondiente al C- NcoI BstEII BamHI BglII A MlyI MlyI BamHI BglII B N-terminal (265-561) C-terminal (562-1069) cat (1071-1788) Km (2005- 2871) Km (1764-2630) pT4-E-CAT (3591 pb) pT4-E(C)-CAT (3350 pb) casete (264-332) C-terminal (333- 850) cat (851-1546) Adriana Espinosa Cantú 24 terminal se amplificaron directamente del DNA genómico de B. subtilis. Las secuencias se clonaron en los vectores pT4 previamente descritos. A continuación se presentan los vectores resultantes, su procedencia y la metodología para su obtención. La numeración de nucléotidos y residuos se mantiene según la secuencia de la que provienen. pT4-B-CAT La secuencia de aroEBs (A1 a T840; M1 a C280) se amplificó con los oligos Bs_aroE_N_for y BS_aroE_C_rev (TM2 y TM1). El producto resultante se digirió con BamHI se clonó en el vector pT4-E(C)-CAT previamente digerido con MlyI y BamHI. Al producto de la expresión en E. coli de este gen se le denominó B, y a su fusión B- CAT. pT4-BE-CAT La secuencia de aroEBs A1-C303 se amplificó con los oligos Bs_aroE_N_for y Bs_aroE_N_rev (Tabla 1) El producto resultante se clonó en el vector pT4-E(C)-CAT previamente digerido con MlyI de forma tal que se obtuvo la quimera BE con los nucleótidos de aroEBs A1-C303 (M1-T101) y de aroE aroEEc T306-G818 (D102-S271) (Figura 5). pT4-EB-CAT La secuencia aroEBs G304-T840 se amplificó con los oligos BS_aroE_C_for y BS_aroE_C_rev (Tabla 1). El producto resultante se digirió con BstEII y BamHI y clonado al vector pT4-E-CAT previamente digerido las mismas enzimas de forma tal que se obtuvo la quimera EB con los nucleótidos de aroEEc A1-C303 (M1-T101) y de aroEBs G304-T840 (D102-C280) (Figura 5). Amplificación por PCR. Las reacciones de PCR para amplificar aroEBs y la secuencia equivalente al domino N- terminal de aroEBs se llevaron a cabo en 15 µl con agua tetradestilada, 1x de buffer de Pfu polimerasa (Roche), 200 µM de dNTPs, 1U de Pfu polimerasa (Roche) y los oligos a 10 pmol/µl (Tabla 1). Las muestras se incubaron a 95 ºC por 5 min, 25 ciclos de 94 ºC 50 seg, Tm específica de cada par de oligos 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una incubación final de 72 °C por 10 min. Para amplificar la secuencia correspondiente al dominio C- Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 25 terminal de aroEBs se utilizaron los mismas concentraciones de Pfu, dNTPs, oligos y DNA y un programa distinto que consta en la incubación a 95 ºC por 5 min, 5 ciclos de 94 ºC 40 seg y 1.5 min a 72 ºC, 25 ciclos de 94 ºC 40 seg, 52 ºC 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una incubación final de 72 °C por 10 min. Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR (Roche). Digestión. Para la preparación de pT4-B-CAT se digirió el vector pT4-E(C)-CAT con las enzimas MlyI y BamHI en una reacción de 30 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x buffer BamHI (Biolabs), 1x BSA, 1U BamHI y MlyI (Biolabs)y 1 µg de vector y se incubó 16 h a 37 ºC. El producto de PCR, correspondiente a aroEBs, se digirió con BamHI de la misma manera. pT4-BE-CAT se obtuvo al digerir pT4-E(C)-CAT con MlyI en una reacción de 25 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x Buffer 4 (Biolabs), 1x BSA, 1U MlyI (Biolabs) y 1 µg de vector. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 ºC. pT4-EB-CAT se obtuvo a partir de la digestión del vector pT4-E-CAT. Se realizó una digestión de 30 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x buffer BamHI (Biolabs), 1x BSA, 1U BamHI (Biolabs) y 1 µg de vector y 500 ng de producto de PCR independientemente. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 ºC. Posteriormente se adicionó 1 U de BstEII (Biolabs) y se incubaron a 60 ºC por dos horas. Las digestiones se purificaron con el kit de purificación de PCR (Roche) antes de la ligación. Ligación y transformación. Las ligaciones se realizaron en una relación 4-6:1 (inserto:vector) en el vector correspondiente. Las reacciones se llevaron a cabo en 30 µl incubando 16 h a 16 ºC, con agua tetradestilada, 800 ng de vector, 1x de buffer de T4 ligasa (Roche), 1x PEG 8,000 y 1 U de ligasa T4 (Roche) para las reacciones de extremos cohesivos y 5U de ligasa para las reacciones de extremos rasos. Se transformaron 3 µl de cada reacción de ligación en 60 µl de células electrocompetentes XL1Blue-MRF (Tabla 2). Se recuperaron en 1 ml de SOC por una hora a 37 ºC y se plaquearon por duplicado en cajas de LB con 25 µg/ml de Km y en cajas de LB con 25 µg/ml de Km y 15 µg/ml de Cm a 37 ºC 16 h. Adriana Espinosa Cantú 26 CONSTRUCCIÓN DE LAS QUIMERAS DE DOS SITIOS DE RECOMBINACIÓN. Las shikimato deshidrogenasas presentan el dominio N-terminal interrumpido por el domino C-terminal. Claudia Martínez en el laboratorio realizó el intercambio de los extremos carboxílicos (correspondientes al α9 y α10, referidos también como “colas”) de las quimeras, de forma tal que se obtuvieron los siguientes vectores (Figura 5): pT4-BEB-CAT Secuencia de aroEBs A1a C303 (M1-T101) y T726 a T840 (G242-C280) y aroEEc de T306 a T708 (D102-D236). pT4-EBE-CAT Secuencia de aroEEc A1 a C303 (M1-T101) y T711-G818 (G237-S271) y aroEBs de T306 a T723 (D102-D241). La metodología para la obtención de pT4-BEB-CAT y pT4-EBE-CAT se fundamentó en dos ciclos de PCR utilizando pT4-BE-CAT y pT4-EB-CAT como templados como se detalla a continuación. La construcción de pT4-BEB-CAT consistió en la amplificación de la cola del vector pT4-EB-CAT con dos oligos (Tabla 1): 1) un oligo forward (DIIEc-coBs) que amplifica la cola de B con 24 pb de homología con el final de la secuencia correspondiente aldominio C-terminal de E y 2) un oligo reverso (cat100) que amplifica la secuencia del vector 100 pb después del final de la secuencia quimérica. Posteriormente, se realizó un segundo PCR utilizando pT4-BE-CAT como templado con un oligo forward (pT4) que amplifica desde antes del inicio del gen quimérico y el producto del primer PCR como oligo reverso de doble cadena. El producto de este PCR se digirió con NcoI y BamHI y se clonó en el vector pT4-E-CAT digerido de la misma manera. pT4-EBE-CAT se obtuvo por el mismo procedimiento utilizando los oligos DIIBs-coEc y cat100 en el primer PCR y los oligos pT4 y el producto del primer PCR en la segunda reacción (Tabla 1). El producto del segundo PCR fue digerido con HindIII y BamH1 y clonado en el vector pT4-E-CAT digerido de la misma manera. Secuenciación. Se confirmó la identidad de los vectores por secuenciaron con los oligos pT4 y pT42 o cat100 (Tabla 1) en la unidad de secuenciación del Instituto de Biotecnología, UNAM. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 27 Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados. Nombre número/año Tm experimental Tm2 secuencia (5'->3') Bs_aroE_N_for* 3550/2007 AAAAAGCTGTACGGGGTTATCGGA Bs_aroE_N_rev 3551/2007 60 TCCGACAAGCTTATCTCCCTCTCT BS_aroE_C_for 266/2008 ACCTGGGTGGTTACCATACCGATG GGGAAGGCTT BS_aroE_C_rev* 267/2008 56 63* GCTATACGGGATCCGTAACATTCTG TTCCTCCTA pT4 2004-237 GACATATAAACGGTTCTGGCA pt42 2004-238 60 GCCAGTGAATTGTAATACGAC aroE-47 5215/2009 AATCCGCGATGCCCTGAC aroE+29R 5316/2009 62 TTCCCTGTCCGGAAACTGGAT Tm experimental: temperatura de fusión utilizada en los PCRs descritos. Tm2: temperatura de fusión utilizada en la reacción con los oligos Bs_aroE_N_for y BS_aroE_C_rev. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) Con ensayos de CMI se calcula la concentración de un antibiótico a la cual la mitad de las clonas analizadas son resistentes, por lo que se considera como la concentración del antibiótico a la que una cepa dada resiste. En el sistema de la fusión traduccional a CAT como reportero de plegamiento, se espera que mientras más resistencia a cloranfenicol (Cm) presenten la clonas, mayor sea su solubilidad [Maxwell et al., 1999]. Las quimeras se transformaron en la cepa MC1061 (Tabla 2). Como control positivo se utilizó el vector pT4-E- CAT (CMICm ~150 µg/ml) transformado en la misma cepa; como control negativo la cepa MC1061 sin vector (CMICm ~5 µg/ml) y el vector pT4-E(C)-CAT (CMICm ~15 µg/ml). Se realizaron diluciones de 100 a 108 con LB a partir de cultivos incubados a 30 ºC 16 h con Km 25 µg/ml. Se sembraron 5 µl de las diluciones de cada cepa en cajas de LB Km 25 µg/ml con Cm a concentraciones de 0, 15, 30, 45, 60, 70, 90, 100, 110, 120, 150 y 160 µg/ml. Las cajas se incubaron 16 h a 30 ºC. EXPRESIÓN Y WESTERN BLOT. Para comprobar la expresión de las construcciones se hicieron cultivos por 16 h a 30 °C y 250 rpm de 3 en ml de LB con Cm 15 µg/ml en la cepa JM101 (Tabla 2). Se inocularon en dilución 1:10 10 ml de LB con las muestras y se incubaron a 30 °C hasta llegar a 1 OD600 nm. Los cultivos se centrifugaron 5 min a 4000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 500 µl de PBS 1x. Las muestras se sonicaron (Branson Sonifier 450) 10 seg 6 veces cada una, agregando 1 µl de PMSF 100 mM tras la primera sonicación. Se centrifugaron a 4000 rpm 10 min, se recuperó el sobrenadante correspondiente a la fracción soluble y se resuspendió la pastilla correspondiente a la fracción insoluble en 100 µl de buffer de carga Adriana Espinosa Cantú 28 (glicerol 2%, SDS 4%, Tris 250 mM pH 6.8, azul bromofenol 0.05% y 10% β-mercaptoetanol). Las muestras se observaron en un gel SDS/PAGE al 12.5%. Para el Western Blot las proteínas del gel SDS-PAGE de la fracción soluble se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que se bloqueó 16 h a 4 °C con solución TBST-leche 5% (TBST: tris 10mM, NaCl 159 mM y Tween 0.05%; Leche: Svelty, Nestlé). Después de lavar tres veces con TBST (10 min cada vez) la membrana se incubó 1 h con el anticuerpo ANTI-CAT (Roche) en una relación 1:3000. Se lavó tres veces más con TBST-leche 0.1% y se incubó 1 h con el anticuerpo ANTI-DIG (Roche) en relación 1:5000. Tras dos lavadas con TBST se adicionaron 15 ml de H2O con 1 ml BCIP/NTP (Zymed) 1:1 hasta observar señal, después de lo cual se enjuagó con agua. Tabla 2. Cepas utilizadas. Las células competentes se prepararon según Sambrook et al. (1989). XLI-Blue F´::Tn10 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 (rK-mK+) glnV44 relA1 lac. MC1061 F– araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 Δ(lac)X74 rpsL (Strr) hsdR2 (rk – mk+) mcrA mcrB1 JM101 F´traD36 proAB lacI Δ(lacZ)M15/ Δ(lac-proAB) glnV thi BW25113 ΔaroE: laclq rrnB T14 ΔlacZ WJ16 hsdR514 ΔaraBAD AH33 ΔrhaBADLD78 (Kmr) (Keio collection) ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN. Para observar la actividad in vivo de las quimeras ortólogas se realizaron ensayos de complementación con la cepa BW25113 (Tabla 2) con el gen aroE deletado (∆AroE) de la colección Keio de E. coli K-12 [Baba et al., 2006] donada por el laboratorio del Dr. Gosset, IBT. Eliminación del casete de resistencia a Km en la cepa ∆aroE. La cepa ∆AroE contiene un casete de resistencia a kanamicina con secuencias FRT que se localiza en la región cromosomal del gen de aroE. Para la expresión en esta cepa de las construcciones en los vectores pT4, con resistencia a kanamicina, se eliminó el casete resistencia a Km de ∆aroE. como se describe en Datsenko y Wanner 2000. Para ello se utilizó el vector BT340 donado por Filiberto Sánchez del laboratorio del Dr. Xavier Soberón, IBT. BT340 presenta un casete de resistencia a ampicilina (Amp), síntesis de la recombinasa FLP inducida por temperatura de 30 ºC y replicación a temperaturas menores a 37 ºC. Se transformó BT340 en células ∆aroE competentes y se crecieron 100 µl de las células en medio SOC a 30 °C con Amp 25 µg/ml. Las colonias se transfirieron a una placa de LB y se crecieron a 43 °C. Se seleccionaron 5 colonias resultantes y cada una se sembró en 3 lotes de 3 ml cada uno 1) LB sin antibiótico, 2) Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 29 LB con Km 25 mg/ml y 3) LB con Amp 25 mg/ml. Se seleccionaron las colonias sensibles a kanamicina y a ampicilina. La eliminación del casete de resistencia se comprobó con un PCR diagnóstico con oligonucleótidos que hibridan 47 nucleótidos anteriores al inicio del gen aroE y 29 nucleótidos posteriores al fin de aroE (aroE-47F y aroE+29R, respectivamente) (Tabla 1). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 20 µl con agua tetradestilada, 1x de Buffer de Taq polimerasa (Roche), 200 µM de dNTPs, 1U de Taq polimerasa (Roche) y los oligos a 10 pmol/µl. Las muestras fueron incubadas a 95 ºC por 5 min, 25 ciclos de 94 ºC 50 seg, 58 ºC 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una incubación final de 72 °C por 10 min. Eliminación de la fusión traduccional a CAT. Para eliminar la fusión a CAT se realizaron digestiones de los vectores pT4-E-CAT, pT4- BE-CAT y pT4-EBE-CAT con las enzimas BamHI y BglII en una reacción de 35 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x Buffer BamHI (Biolabs), 1x BSA, 1U de ambas enzimas (Biolabs) y 1 µg de vector. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 ºC. Los productos se purificaron con el kit de purificación de PCR (Roche). pT4-B-CAT, pT4-EB-CAT y pT4-BEB-CAT presentan un sitio BglII al final de la secuencia correspondiente al dominio C-terminal de aroEBs por lo cual se realizó una digestión HindII y BamHI de forma tal que la secuencia completa de los genes se pudieran traspasar a un vector pT4-E-CAT previamente digerido con HindII y BglII. Las reacciones se llevaron a cabo como las descritas anteriormente. Los productos resultantes se purificaronde gel de agarosa con el kit de purificación de PCR (Roche). Las ligaciones se realizaron en un volumen final de 30 µl incubando 16 h a 16 ºC con agua tetradestilada, 800 ng de vector, 1x de Buffer de T4 ligasa (Roche), 1x PEG 8,000 y 1 U de ligasa T4 (Roche). Se transformaron 3 µl de cada reacción de ligación en 60 µl de células MC1061. Se recuperaron en 1 ml de SOC por una hora a 37 ºC y se plaquearon en cajas de LB con 25 µg/ml de Km. Se seleccionaron clonas que no presentaran resistencia a Cm y se comprobó por PCR el tamaño del vector resultante. Los vectores se secuenciaron con los oligos pT4 o pT475 y pT42 (Tabla 1) en la unidad de secuenciación del Instituto de Biotecnología, UNAM. La expresión de las construcciones resultantes produce la proteína codificada con 6 histidinas en fase al final de la secuencia. Los vectores se identifican como pT4-E-HIS, pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE-HIS. Adriana Espinosa Cantú 30 Complementación de la cepa ∆AroE Km-. Los vectores, pT4-E-HIS, pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE- HIS se transformaron en la cepa ∆AroE Km-. Se utilizó la cepa con el vector pT4 vacío como control negativo. Las células transformadas se recuperaron una hora en LB a 37 °C y se sembraron en cajas LB Km 25 µg/ml. Una colonia correspondiente a cada construcción se creció 16 h a 30 °C y 250 rpm de 3 ml LB con Km 25 µg/ml. Los cultivos saturados se lavaron con sales M9 1x (preparado según Sambrook et al., 1989) de la siguiente manera: 400 µl de los cultivos en LB se centrifugaron 1 min a 9000 rpm. Se resuspendieron en 1 ml de sales M9 y se centrifugaron a 2 min a 5000 rpm. Se repitió dos veces el proceso y se resuspendió en 400 µl de sales M9. Se inocularon 20 µl de las células en tres distintos lotes de 2 ml de medios con Km 25 µg/ml de: 1) LB; 2) medio mínimo con vitaminas: 40 µl de ácido p-aminobenzoico 32 mg/ml, 250 µl de ácido 4- hidroxibenzoico 62 mg/ml, 72.5 µl de 2-3 dihidroxibenzoico 35 mg/ml y 250 µl de tiamina 10 mg/ml); y 3) medio mínimo con vitaminas y aminoácidos aromáticos: vitaminas en las mismas concentraciones descritas y 500 µl de Tyr (8 mg/ml) y Phe (8 mg/ml) y 250 µl de Trp (4 mg/ml). Se monitoreó su crecimiento a 30 °C por densidad óptica a 600 nm. Expresión y Western Blot. La expresión de las proteínas se comprobó como fue descrito anteriormente y se observaron por SDS/PAGE. Las proteínas de la fracción soluble se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó 16 h a 4 °C con solución PBS-leche (Svelty, Nestlé) 5%. Después de lavar tres veces con PBS (10 min cada vez) la membrana se incubó 1 hra con el anticuerpo ANTI-HIS (Roche) en una relación 1:500. Se lavó dos con PBS y se adicionaron 10 ml de TMB (Zymed) hasta visualizar las bandas, después de lo cual se enjuagó con agua. ACTIVIDAD IN VITRO AroE reduce el 3-dehidroshikimato a shikimato (SA) usando como donador de electrones al cofactor NADPH, por lo cual se puede medir la actividad enzimática siguiendo la producción de NADPH a 340 nm en la reacción de sentido contrario. Actividad de extractos totales. La actividad enzimática de los extractos proteicos de pT4-E-HIS, pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE-HIS se determinó por observar el cambio de Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 31 absorbancia a 340 nm por la reducción de NADP+ a NADP dependiente de la concentración de enzima. Las reacciones se realizaron en un espectrofotómetro (Evolution 300 UV- Visible Spectrophotometer, Thermo Scientific) a temperatura ambiente. Para ello se crecieron cultivos de 2 ml en LB Km 25 µg/ml de los vectores transformados en la cepa ∆aroE Km - a 30 °C hasta 1 OD600 nm, se centrifugaron a 4000 rpm 5 min y la pastilla se resuspendió en 500 µl de Tris-HCl 100 mM pH 9. Se sonicó, se centrifugó y se recuperó el sobrenadante como se describió anteriormente para los ensayos de expresión. Se midió la actividad de los sobrenadantes a 0, ∼ 4 y ∼10 nM de extracto total en una reacción de 100 µl de volumen final con Tris-HCl 100 mM pH 9, SA 5 mM y NADP+ 5 mM. Purificación nativa de E, B y EBE. Las enzimas que presentaron actividad (E-HIS, B-HIS y EBE-HIS) se purificaron a homogeneidad mediante una cromatografía de afinidad con una columna de níquel (Quiagen) a partir de cultivos de 1.5 L de LB Km 25 µg/ml crecidos a 28 °C hasta 1.5 OD600 nm. Los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm por 20 min y la pastilla se mantuvo a - 20 °C 6 h, tras lo cual se descongeló 15 min a temperatura ambiente y se resuspendió en 2 ml/g de peso seco en buffer de lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol, pH 8.0), 1 ml de lisozima 10 mg/ml y PMSF 10 mM. Se dejó 30 minutos a 4 °C y se sonicó (Branson Sonifier 450) en hielo 6 veces por 10 seg con 10 segundos de reposo. El lisado se centrifugó 30 min a 15000 xg a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a las columnas previamente equilibradas con buffer de lisis. Una vez adicionada la muestra se lavó las columnas con 20 ml del buffer de lavado (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 20 mM imidazol, pH 8.0). Se eluyó con 3 ml de buffer de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 250 mM imidazol, pH 8.0). Las muestras se concentraron a ∼500 µl centrifugando en Amicon® Ultra-4 (Millipore) de 10 KDa de cut-off a 7500 x g 4°C por 10 min. Cuantificación de las proteínas puras. La concentración de las proteínas se determinó usando reactivo de Bradford (Bio-rad) y albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Para la concentración de B-HIS se realizó una estimación de la concentración por análisis de imagen con el programa ImageJ (NIH) a partir de un SDS/PAGE usando la concentración determinada espectrofotométricamente Adriana Espinosa Cantú 32 Actividad de las enzimas las puras. Las velocidades iniciales de la reacción se obtuvieron midiendo la aparición de NADPH (∆Abs a 340 nm) durante el primer minuto de reacción a distintas concentraciones de sustrato con concentraciones saturantes de cofactor ([NADP+] = 5 mM). Los ensayos se realizaron por triplicado (duplicado para B-HIS) en 100 µl de volumen final de buffer Tris-HCl 100 mM pH 9.0, NADP+ 5 mM, 0.0998 nM E-HIS, 0.196 nM B-HIS ó 0.075 nM EBE- HIS y 0.3125, 0.46875, 0.635, 1.25, 2.5, 5, 6,5 y 8 mM de SA. Los valores de velocidad inicial son el resultado de las pendientes obtenidas de ∆Abs340 nm, considerando 1 min de tiempo de reacción, 0.1 ml de volúmen final, el coeficiente de extinción del NADP+ (ε = 6.18 mM-1cm-1) y la longitud de la ventana de la celda (1 cm). De tal manera que la velocidad (v) v (min-1) = ∆Abs340 / 1 min / 6.18 mM-1 cm-1 / 1 cm / [E] mM, en donode [E] es la concentración de enzima utilizada. Los parámetros cinéticos se calcularon a partir de un análisis de regresión no lineal de los datos ajustándolos a la ecuación de Michaelis-Menten usando ENZFITTER [Leatherbarrow, 1987. Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 33 RESULTADOS CONSTRUCCIÓN DE LAS ENZIMAS QUIMÉRICAS. Se realizaron cuatro quimeras a partir del intercambio de dominios entre la shikimato deshidrogenasa de Escherichia coli (AroEEc) con la shikimato deshidrogenasa de Bacillus subtilis (AroEBs). Dos de las quimeras, BE (dominio N-terminal de AroEBs y C-terminal AroEEc) y EB (dominioN-terminal de AroEEc y C-terminal AroEBs), son resultado de la recombinación en un solo sitio correspondiente al primer residuo del conector; las otras dos quimeras, BEB y EBE, consideran la discontinuidad del domino N-terminal en las enzimas AroE y se componen de la recombinación en dos sitios, a partir del primer residuo del conector y del primer residuo de la cola, compuesta por α9 y α10 (Figura 5 y Figura 7). Figura 7. Sitios de recombinación
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