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Obtencion-de-una-quimera-activa-por-la-recombinacion-de-dominios-entre-dos-shikimato-deshidrogenasas

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UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN
CIENCIAS BIOQUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
CELULAR Y BIOCATÁLISIS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOQUIMICAS
P R E S E N T A
Biol. Adriana Espinosa Cantú
Director de Tesis:
Dr. Lorenzo Segovia Forcella
Cuernavaca, Mor., 2010. 
“Obtención de una quimera activa por la
recombinación de dominios entre dos
shikimato deshidrogenasas.”
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Lorenzo Segovia en el Instituto de 
Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México. Durante la realización del 
mismo se recibió una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). 
 
 
 
 
 
 
A mi madre y abuela, quienes lo hacen todo posible. 
A los que luchan por la igualdad de oportunidades. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A Lorenzo Segovia por brindarme la oportunidad de estar en su grupo de trabajo, orientarme y 
apoyarme. 
 
Al comité tutoral de la maestría: Dra. Gloria Saab Rincón, Dr. León Martínez Castilla y Dr. Lorenzo 
Segovia. 
 
A los miembros del jurado: 
Presidente Dr. Guillermo Gosset 
Secretaro Dra. Marcela Ayala 
Vocal Dr. Miguel Ángel Cevallos 
Suplente Dr. Alejandro Sosa Peinado 
 
A mis compañeros del laboratorio 8 habidos y en existencia por su apoyo, sus consejos académicos y 
por los buenos ratos. A Claudia Martínez por su apoyo en los experimentos y revisión del texto. A 
Jesús Banda por los datos del análisis de SCA y ayuda para programar. A Iliana Escamilla por sus 
vectores y oligos. A Viviana Escobar, Areli Morán, Mariana Peimbert y Ernesto Perez-Rueda por su 
constante apoyo. 
 
A la Dra. Brenda Valderrama, al Dr. Enrique Rudiño y a la Dra. Gloria Saab por su guía. 
 
A Joel Osuna y Humberto Flores por su apoyo académico. 
 
A las personas encargadas de la Unidad de Síntesis y Secuenciación de ADN: Paúl Gaytán, Eugenio 
López, Jorge Yánez y Santiago Becerra; 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A los que hicieron posible la tesis anímica-, económica-, intelectual- y espiritualmente hablando 
(gracias). 
 
 
 
ÍNDICE 
RESÚMEN 1 
PREFACIO 2 
ANTECEDENTES 6 
MODELO DE ESTUDIO 15 
HIPÓTESIS 20 
OBJETIVOS 21 
MATERIAL Y MÉTODOS 22 
 Construcción de las quimeras de un sitio de recombinación 22 
Construcción de las quimeras de dos sitios de recombinación 26 
Concentración mínima inhibitoria (CMI) 27 
Expresión y Western Blot 27 
Ensayo de complementación 28
 Actividad in vitro 30 
RESULTADOS 33 
 Construcción de las enzimas quiméricas 33 
 Evaluación de la solubilidad de las quimeras por resistencia a cloranfenicol. 34
 Ensayo de complementación 36 
 Actividad enzimática 40 
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN 44 
PERSPECTIVAS 47 
REFERENCIAS 49 
ANEXOS 53 
1. Modelo estructural de AroE de B. subtilis y análisis: y análisis de la 
conservación de residuos críticos. 53 
2. Análisis de las interfaces de AroE de E. coli y de B. subtilis 63 
3. Modelos estructurales y análisis de las quimeras. 70 
APÉNDICES 74 
 I. Secuencias de aminoácidos de las proteínas templado y quiméricas. 74 
II. Alineamiento estructural de AroE de E. coli y B. subtilis. 75 
 III. Abreviaciones utilizadas. 75 
 IV. Índice de cuadros. 76 
 V. Índice de figuras. 76 
 VI. Índice de tablas. 77 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 1 
RESÚMEN 
 
Los dominios proteicos son las unidades evolutivas del proteoma. El estudio de los alcances 
y de las restricciones en la exploración del espacio de secuencia y en la generación de 
plegamientos por la recombinación de dominios es esencial para entender los mecanismos 
evolutivos e imprescindible para reforzar el conocimiento en el campo de la ingeniería de 
proteínas. En este trabajo se analiza el plegamiento y la función de cuatro quimeras producto 
de la recombinación entre dos proteínas homólogas con el 35 % de identidad: las shikimato 
deshidrogenasas de Escherichia coli (E) y de Bacillus subtilis (B). Las quimeras BE y EB 
(dominio N-terminal de B, C-terminal de E y dominio N-terminal de E, C-terminal de B, 
respectivamente) son producto de la recombinación en un solo sitio, mientras BEB y EBE 
(dominio N-terminal de B, C-terminal de E, cola o α9-α10 de B y dominio N-terminal de E, C-
terminal de B, cola de E, respectivamente) son producto de la recombinación en dos sitios. 
EB y BEB no se lograron expresar en Escherichia coli. BE fue la quimera más insoluble y no 
presentó función. EBE presentó actividad in vivo por complementación a una cepa ∆aroE e in 
vitro por la producción de NADPH a partir de NADP+ y shikimato (SA). Los parámetros 
cinéticos calculados para EBE, E y B son muy similares entre sí (Km(SA) µM = 1.09, 1.09 y 
1.00; kcat(SA) min-1 = 7.07x106, 5.85x106 y 1.25x106, respectivamente). EBE corresponde a la 
quimera activa reportada producto de la recombinación entre homólogos con el más bajo 
porcentaje de identidad. 
Adriana Espinosa Cantú 
 2 
PREFACIO 
 
La base de las reacciones químicas y de la estructura de los sistemas vivos está mediada 
mayoritariamente por proteínas. Es, por lo tanto, de sumo interés conocer los mecanismos 
por los cuales se genera la diversidad de las proteínas en la naturaleza, la cual posibilita la 
amplia gama de funciones en los seres vivos. Por otra parte, el papel de las proteínas en 
industrias como las farmacéuticas, alimentarias y biotecnológicas es cada vez mayor. Lo 
anterior hace imperante la optimización de los métodos de ingeniería de proteínas que 
permiten la obtención de proteínas con características deseables. 
 
LA RECOMBINACIÓN DE DOMINIOS. 
La recombinación de dominios, entre los mecanismos que generan variación en las 
proteínas, es un fenómeno recurrente en la naturaleza y un recurso creciente en la ingeniería 
de proteínas (Cuadro 1). La definición de dominio varía según el campo de estudio. En este 
estudio un dominio se define como la parte de una proteína que tiene una historia evolutiva 
independiente con respecto al resto de la cadena [Ponting y Russell, 2002]. Los dominios 
también se definen como unidades funcionales y unidades de plegamiento, ya que los 
dominios suelen conferir una función o pueden constituir estructuras independientes con más 
interacciones dentro de sí mismas que con cualquier otra parte de la cadena polipeptídica en 
la cual se encuentran [Janin y Wodak, 1983]. 
 
Hay proteínas de un solo dominio y proteínas multidominio. De las proteínas 
caracterizadas, 2/3 de las procarióticas y 4/5 de las eucarióticas son multidominio [Apic, 
Gough y Teichmann, 2001]. En una proteína multidominio cada dominio puede aportar una 
función, se puede presentar modulación, cooperación o sinergia entre éstos, o se puede 
generar una nueva función de distinta complejidad y/o especificidad [Carbone y Arnold, 
2007]. Las proteínas multidominio son productode la duplicación de dominios y de su 
posterior recombinación y divergencia (Figura 1). Además de la ventaja evolutiva que cada 
dominio pueda aportar a la función, la relativa independencia estructural de éstos reduce las 
restricciones evolutivas sobre el plegamiento del producto final de una recombinación 
[Bashton y Chothia, 2007]. Por la frecuencia de la recombinación de dominios en la 
naturaleza y sus implicaciones funcionales y estructurales, los dominios se consideran la 
unidad evolutiva del proteoma [Thornton et al., 1999]. 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 3 
Figura 1. Modelo de evolución de proteínas por duplicación y recombinación de dominios. En el 
modelo, un dominio proteíco se duplica y fusiona por duplicación y fusión de la secuencia de DNA que 
lo codifica. El nuevo gen presenta ciclos de mutación y selección resultando en la optimización de la 
interfaz entre los dominios. Posteriormente, por procesos en el DNA, la proteína multidominio se 
duplica y diversifica y sus dominios se pueden recombinar, generando versatilidad por combinaciones 
entre dominios. (La imagen del modelo evolutivo es modificación de Höcker, Claren y Sterner, 2004.) 
 
 
Cuadro 1: RECOMBINACIÓN: tipos y mecanismos. 
 
Las proteínas evolucionan por mutaciones, duplicaciones o arreglos (como 
permutaciones circulares o recombinaciones) en el DNA. La recombinación se 
considera como el fenómeno evolutivo principal en la generación de versatilidad en 
las proteínas debido a que permite una amplia exploración del espacio de secuencia 
y posibilita la generación de nuevos plegamientos [Vogel y Morea, 2006; Bogarad y 
Deem, 1999]. La recombinación puede producirse entre dos o más genes que a su 
vez pueden ser homólogos o no homólogos. Entre más varíen los genes 
recombinados, más distintos serán los genotipos y fenotipos resultantes. Bogarad y 
Deem, en 1999, analizaron por modelos moleculares el potencial de exploración de 
secuencia y el potencial evolutivo -medido por una función de la energía de la 
proteína resultante- de los distintos fenómenos mutagénicos. Las mutaciones 
presentaron el menor potencial de exploración del espacio de secuencia. La 
recombinación entre secuencias homólogas (también conocido como barajeo de 
genes), posibilita una mayor exploración del área de secuencia que las mutaciones y 
puede repercutir en mejorías adaptativas en el plegamiento original. En la 
recombinación entre secuencias no homólogas, entre más pozas genéticas (más 
secuencias) se incluyan, mayor es la posibilidad de generar nuevos plegamientos 
[Bogarad y Deem, 1999]. 
 
Las recombinaciones son resultado principalmente de la fusión y eliminación de 
segmentos de DNA al final de un marco de lectura abierto [Weiner, Moore y 
Bornberg-Bauer, 2008]. Este mecanismo concuerda con la observación de que la 
mayoría de los dominios versátiles son dominios codificados hacia el extremo 
terminal del gen [Weiner, Moore y Bornberg-Bauer, 2008]. La recombinación 
también puede ser resultado de transposiciones, recombinaciones sitio-específicas, 
deleciones, inserciones e inversiones de fragmentos de DNA, en eucariontes del 
barajeo de exones [Riechmann y Winter, 2000] o de transferencia horizontal 
[Vogel, Teichmann y Pereira-Leal 2005]. 
 
Por fines prácticos, en la introducción se menciona únicamente la recombinación 
de elementos correspondientes a dominios proteícos, pero la recombinación puede 
duplicación y 
fusión 
optimización de 
la interfaz 
duplicación y 
diversificación 
recombinación 
Adriana Espinosa Cantú 
 4 
ser de desde un par de bases hasta las suficientes bases correspondientes a toda una 
proteína multidominio. No, obstante, los elementos que más se han identificado en 
eventos de recombinación son motivos y dominios. Así como en la introducción se 
presentan antecedentes de la recombinación de dominios, existen antecedentes que 
muestran eventos de recombinación de elementos menores a dominios en la 
naturaleza y en la ingeniería de proteínas [Graziano et. al., 2008; Riechmann y 
Winter, 2000; Bogarad y Deem, 1999]. 
 
 
No todos los dominios se recombinan con la misma frecuencia. La mayoría de las 
superfamilias de dominios (Cuadro 2) se presentan en combinación al menos con otra 
superfamilia. Puesto en números, de las 97,178 estructuras de dominios conocidas hasta el 
año 1997 agrupadas en 1,439 superfamilias, únicamente 86 no se combinan con otras 
superfamilias [Orengo et al. 1997]. De las superfamilias que se combinan, se han identificado 
unas superfamilias denominadas versátiles, las cuales constituyen la minoría, y que, como su 
nombre lo indica, se presentan en combinación con muchas otras superfamilias [Apic, Gough 
y Teichmann, 2001]. 
 
Corolario: Hay más combinaciones posibles de dominios de las que se han identificado en 
la naturaleza. Aunque lo anterior puede deberse en parte a un muestreo poco representativo 
de la diversidad natural de combinaciones de dominios, emergen inmediatamente una serie 
de preguntas: ¿Por qué no existen todas las posibles combinaciones entre los dominios? 
¿No existen porque no pueden existir o por la historia evolutiva de los dominios mismos? 
¿Cuáles son las restricciones principales en la función y estructura del producto de una 
recombinación? ¿Qué alcances, en cuanto a diversidad funcional y estructural, puede tener 
la recombinación de dominios? 
 
 
Cuadro 2: CLASIFICACIÓN DE DOMINIOS. 
 
Los dominios se pueden clasificar bajo el mismo “Sistema Naturae” que Linneo 
planteó para la clasificación de los seres vivos basándose en sus relaciones 
evolutivas y la similitud de sus características [Ponting y Russell, 2002]. Hoy en día 
existen diversas bases de datos para la clasificación y el almacenamiento de los 
dominios identificados. Cada base de datos utiliza distintos métodos para la 
delimitación de las secuencias conformando los dominios y para su posterior 
clasificación en grupos. En la base de datos CATH [Orengo et al., 1997], por 
ejemplo, los dominios se dividen clases, arquitecturas, topologías, superfamilias y 
familias. La clase está determinada por la composición de estructuras secundarias y 
el empacamiento de éstas. Las principales clases son: a) principalmente de α-
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 5 
hélices; b) principalmente de hojas-β; y c) α/β. La arquitectura se define por el 
orden y orientación de las estructuras secundarias, conformando, por ejemplo, 
barriles ó sándwiches. La topología se define por la forma y conectividad de las 
estructuras secundarias en el centro del dominio. Las superfamilias están 
conformadas por dominios con un hipotético ancestro en común y comparten 
similitud de secuencia mayor al 35% y sobreposición estructural del 60% (u otras 
combinaciones similares entre similitud de secuencia y estructura). Por último, las 
familias de dominios están conformadas por secuencias con mínimo el 35% de 
similitud y el 80% de sobreposición estructural (u otras características similares). 
SCOP [Murzin et al., 1995] es otra base de datos curada manualmente que clasifica 
los dominios por clases con los mismos criterios que los expuestos, plegamientos, 
que incluye los criterios de arquitectura y topología de CATH, superfamilias y 
familias. 
 
En el texto de este escrito se utiliza la nomenclatura de la clasificación según SCOP. 
En la tabla debajo se muestra la clasificación de SCOP de los dos dominios que 
conforman a la enzima shikimato deshidrogenasa. 
 
Dominio Rossmann de unión a NAD(P) 
CLASE α/β 
PLEGAMIENTO Rossmann fold dependiente de NAD(P) 
SUPERFAMILIA Rossmann fold dependiente de NAD(P) 
FAMILIA Aminoácido deshidrogenasas, C-terminal 
DOMINIO Shikimato deshidrogenasa, C-terminal 
 
Dominio catalítico o de unión a sustrato. 
CLASE α/β 
PLEGAMIENTO Aminoácido deshidrogenasas-tipo, N-terminal 
SUPERFAMILIAAminoácido deshidrogenasas-tipo, N-terminal 
FAMILIA Shikimato deshidrogenasas-tipo, N-terminal 
DOMINIO Shikimato deshidrogenasa, N-terminal 
 
 
El patrón de combinaciones entre dominios se ha tratado de explicar mediante tres 
enfoques principalmente, no necesariamente excluyentes: al azar, la selección natural y por 
la definición de las características de los dominios versátiles. El patrón de combinaciones 
entre superfamilias de dominios se puede estudiar como una red, la cual presenta una 
distribución del tipo de la ley de potencias. En los sistemas biológicos, las redes con este tipo 
de distribución suelen explicarse por la incidencia de fenómenos azarosos. En el caso de las 
redes de combinación entre dominios, se espera que los nuevos nodos o superfamilias de 
dominios tengan más probabilidad de unirse a nodos previamente recombinados por ser más 
abundantes o más viejos [Koonin, Wolf y Karev, 2002; Vogel y Morea, 2006]. La distribución 
de combinaciones entre dominios se ha explicado por selección natural ante características 
funcionales o estructurales de los dominios en una combinación. Por ejemplo, existen pocos 
Adriana Espinosa Cantú 
 6 
dominios cuya función y/o estructura puede ser combinada con otras y no ser deletérea o, en 
el mejor de los casos, pueda ser ventajosa. En una analogía gramatical, hay pocas letras que 
poniéndose juntas forman palabras [Ponting y Russell, 2002]. Por último, se ha observado 
que los dominios versátiles suelen ser pequeños, estar al final de las cadenas polipeptídicas 
o presentarse individualmente en éstas formando proteínas de un dominio. Estas 
características aumentan la probabilidad de que ocurra el fenómeno de la recombinación en 
las secuencias de DNA que codifican para estos dominios y facilitan su posterior fijación en 
el genoma [Weiner, Moore y Bomberg-Bauer, 2008]. 
 
Se conoce poco sobre las características que determinan el éxito de una combinación 
de dominios. A continuación se presentan algunos antecedentes que hay sobre el análisis de 
las características determinantes en la interacción física entre dominios y sobre el alcance de 
la recombinación de dominios en modificaciones o novedades fenotípicas (estructurales o 
funcionales). 
 
ANTECEDENTES 
DETERMINANTES EN LA INTERACCIÓN FÍSICA ENTRE DOMINIOS. 
 
Delimitación de dominios e Importancia del sitio de recombinación. 
La definición de los límites de los dominios en una cadena polipeptídica no es trivial. Las 
bases de datos (como SCOP, CATH, FSSP y 3Dee, por ejemplo) delimitan los dominios por 
alguno de los siguientes métodos: análisis estructural, en el cual se define un dominio por la 
independencia y lo compacto de una región de la secuencia polipeptídica y cuya principal 
limitación es la definición de dominios en proteínas con dominios discontiuos o muy 
compactos entre éstos; comparación entre secuencias, por búsqueda de homología con PSI-
Blast o por la generación de perfiles HMM (Hidden Markov models) de familia de dominios; o 
por métodos ab initio en los cuales se delimitan a los dominios por predicción de estructura 
secundaria y predicción de centros de hidrofobicidad [Heringa, 2005]. Con el objetivo de 
circunvalar la problemática de la delimitación de los dominios, en la ingeniería de proteínas 
se han desarrollado enfoques dedicados a la elección de sitios de recombinación para 
optimizar la función y la estructura de las proteínas quimérica diseñadas. Voigt et al., (2002) 
desarrollaron un algoritmo llamado SCHEMA para graduar el número de contactos atómicos 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 7 
nativos perjudicados en una quimera resultante de recombinación de dominios homólogos. 
La utilidad de este algoritmo se comprobó al generar bancos de quimeras a partir de dos y 
tres β-lactamasas [Meyer et al., 2003 y 2006, respectivamente] y de dos y tres citocromos 
P450 [Otey et al., 2004 y 2006] en los cuales se corroboró que las proteínas plegadas y 
funcionales correspondían a aquellas con los mejores calificaciones de SCHEMA. Otros 
enfoques permiten la predicción del éxito de la recombinación a partir de estructuras no 
homólogas (simulaciones Montecarlo por Bogarad y Deem, 1999), de proteínas sin 
estructuras determinadas (STAR por Bauer et al., 2006), con la ponderación de las 
mutaciones en los templados y en las quimeras (IPRO, de Saraf et al., 2006) o por análisis 
de la probabilidad de que se presenten choques entre los rotámeros de las quimeras 
(SIRCH, de Moore y Maranas, 2003). Por otra parte, se ha utilizado la información contenida 
en un alineamiento múltiple para estudiar la covarianza entre aminoácidos, y, con esto, 
predecir sitios de importancia energética en la interacción entre elementos dentro de una 
proteína (dominios, motivos o estructuras secundarias, por ejemplo) [Socolich et al., 2005]. 
Este enfoque, llamado SCA por sus siglas en inglés (Statistical Coupling Analysis; Análisis de 
Acoplamiento Estadístico), podría ser útil para predecir sitios de recombinación que no 
interfieran con la red que forman los residuos de alta covariación, implícita en aspectos 
basales de la función. Halabi y et al., por ejemplo, identificaron residuos importantes para el 
movimiento y la coordinación entre dominios en distintas proteínas con dominios PAS y SH2 
[Halabi et al., 2009]. 
 
Interfaz y conector. 
Una interfaz entre dominios proteícos se define como el conjunto de residuos que interactúan 
entre los dominios. La interacción entre los residuos, a su vez, se define por una reducción 
en el área de la superficie accesible al solvente (ASA) en un residuo al formarse el complejo 
entre dos dominios (generalmente considerada > 1 Å2 de ASA), por la distancia entre los 
átomos de carbono alfa (de 4.0 - 6.0 Å) de los mismos, o por la distancia mínima entre 
cualquier átomo de un residuo de un dominio y otro átomo de un residuo del dominio 
complementante [Tsai et al., 1996; Jones, Marin y Thorton, 2000; Laskowski, 2001]. Los 
aminoácidos en las interfaces proteícas tienden a estar más conservados en secuencia y 
estructura que los aminoácidos en las superficies de las proteínas; mientras más adentrados 
en el ambiente hidrofóbico de la interfaz, más se conservan [Caffrey et al., 2004]. Por otra 
parte, se sabe que las proteínas multidominio homólogas que presentan del 30 al 40% de 
Adriana Espinosa Cantú 
 8 
identidad de secuencia presentan la misma geometría en la interfaz (es decir, el mismo 
ángulo y distancia entre los dominios) [Aloy et al., 2003]. Sin embargo, existen casos de 
homólogos con hasta del 70% de identidad en los cuales no se conserva la geometría de la 
interfaz [Han et al. en el 2006]. La conservación de la geometría de la interfaz con pérdida en 
la estructuración de la misma (tipo de estructuras secundarias conformándola) es el 
resultado de restricciones funcionales en la geometría, como es el caso de las 
deshidrogenasas cuyo sitio activo está en la interfaz o de las tRNAs sintetasas en las cuales 
la orientación de los dominios es determinante para su función [Han et al., 2006]. La pérdida 
tanto de la geometría como de la estructuración de la interfaz se observa en proteínas con 
pocas restricciones evolutivas en la interfaz por la presencia de conectores (péptidos que 
conectan los dominios en una proteína multidominio) largos y poco estructurados o cortos 
pero muy flexibles [Han et al., 2006]. El número de cambios observados en la geometría de 
la interfaz en una familia de dominios se ha asociado linealmente con la promiscuidad en 
combinaciones con distintos dominios [Littler y Hubbard, 2005]. Los conectores o “linkers” no 
suelen conservarse en una superfamilia de dominios pero si entre los miembros de una 
familia [Bashton y Chothia, 2002]. 
 
Cooperatividad o independencia en el plegamiento. 
Hasta la fecha se conoce poco cómo afectala interacción entre los dominios y el 
plegamiento de una proteína. Se sabe que el conector es determinante en la interacción. Por 
ejemplo, se ha observado que la cooperatividad en el plegamiento de los dominios de 
espectinas puede ser eliminada tanto por mutaciones en alguno de los dominios (interaccion 
específica) como por mutaciones en el conector (interacción inespecífica) [Batey et al., 2005]. 
Por otra parte, en un análisis comparativo entre dominios para los cuales se había estudiado 
su plegamiento individual y como parte de una proteína multimérica, Han et al., en el 2007, 
observaron una tendencia al plegamiento independiente si las interfaces que se presentan 
son pequeñas y flexibles y una tendencia al plegamiento cooperativo si éstas son muy 
hidrofóbicas y densas [Han et al., 2007]. 
 
MODIFICACIÓN O INNOVACIÓN EN ESTRUCTURA O FUNCIÓN POR RECOMBINACIÓN 
DE DOMINIOS. 
Modificaciones fenotípicas: estabilidad, afinidad, velocidad. 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 9 
Muchos de los antecedentes de recombinación de dominios se han realizado con la finalidad 
de identificar los residuos, los motivos o las estructuras que confieren la termoestabilidad en 
las proteínas. Un ejemplo de esto es el trabajo de Lebbink y et al., 1995, en el cual generaron 
dos quimeras de glutamato deshidrogenasas a partir de los ortólogos de Pyrococcus furiosus 
(termofílica) y Clostridium difficile (mesofílica), con el 52% de identidad de secuencia. Una de 
las quimeras, compuesta del dominio N-terminal de C. difficile y del dominio C-terminal de P. 
furiosus, aunque soluble, no presentó actividad. La quimera inversa sí presentó actividad, 
aunque con menor afinidad al sustrato y al cofactor, menor eficiencia catalítica a 25 °C y 
menor termoestabilidad que la proteína parental de C. difficile. Por otro lado, la quimera 
presentó más del doble de resistencia a la desnaturalización e inactivación por cloruro de 
guanidina y mayor termoactividad que la enzima de C. difficile. A partir de estos resultados 
concluyeron que un dominio termoestable no es suficiente para la obtención de una proteína 
multidominio termoestable y que la termoestabilidad puede estar determinada por el dominio 
menos estable o más flexible de la proteína. Infirieron que los sitios de recombinación 
elegidos para la generación de las quimeras pudieron no haber sido los ideales por no haber 
considerado una estructura secundaria perteneciente al dominio N-terminal codificada al final 
de la secuencia, característica de las aminoácido deshidrogenasas [Lebbink et al., 1995]. 
 
Goihberg et al., en el 2010, también intercambiaron dominios de proteínas de la 
superfamilia de aminoácido deshidrogenasas para estudiar los determinantes de la 
termoestabilidad. Generaron tres quimeras a partir de las alcohol deshidrogenasas de 
Entamoeba histolytica (E), Thermoanaerobacter brokii (T) y Clostridium beijerinckii (C): TET, 
CTC y TCT, en donde las primeras dos letras corresponden al organismo parental al que 
corresponde el dominio N-terminal y C-terminal, respectivamente, y la última a la fracción 
perteneciente al dominio N-terminal codificada al final de la secuencia (que no consideraron 
Lebbink et al.). La quimera TET presentó una estabilidad a temperatura muy baja. TCT 
presentó mayor estabilidad que C pero en menor grado que la parental termoestable, 
mientras que CTC mantuvo el fenotipo de termoestabilidad en estructura y en actividad que 
la parental termoestable. La diferencia entre TCT y CTC la adjudicaron a pérdida desigual de 
interacciones cooperativas. La inestabilidad de TET se adujo a la imposibilidad de 
multimerizarse. Mutaciones puntuales en residuos de la interfaz permitieron la 
oligomerización e incrementaron la termoestabilidad en esta quimera, por lo cual concluyeron 
Adriana Espinosa Cantú 
 10 
que la oligomerización puede ser un factor determinante en la termoestabilidad de este tipo 
proteínas [Goihberg et al., 2010]. 
 
Otros trabajos de recombinación de dominios se han centrado en observar la 
contribución de los dominios en una función en específico o mejorar su catálisis. Aliverti et al. 
en el 2004 intercambiaron los dominios de dos isoformas de NADP-ferrodoxina reductasa de 
la misma especie de planta con el objetivo de disectar la contribución a la catálisis de cada 
uno de los dominios. Las proteínas utilizadas, con 48% de identidad de secuencia, eran 
isoformas de la hoja y de la raíz. El dominio N-terminal de las enzimas corresponde a un 
barril β que une FAD como cofactor. El C-terminal es un dominio Rossmann no canónico que 
une NADP(H). La quimera en que se recombinó el dominio N-terminal de la isoforma de raíz 
con el C-terminal de la isoforma de la hoja fue difícil de expresar y no presentó actividad. La 
recombinante inversa, aunque con un decremento en la estabilidad, adquirió mayor afinidad 
por NADP(H) y mayor eficiencia catalítica como diaforasa (transferencia de protones) 
dependiente de NADP(H) que cualquiera de las isoformas silvestres. La disminución de la 
estabilidad en la quimera, medida por pérdida de función a temperatura creciente, la 
explicaron por reducción de contactos entre ambos dominios y la sustitución de aminoácidos 
contribuyentes al ambiente característico de las interfaces de cada isoforma. Por otra parte, 
al aumentar la afinidad por el cofactor y la actividad catalítica en la quimera hoja-raíz, 
infirieron que el dominio de unión a sustrato ayuda a posicionar la coenzima NADP en el sitio 
activo, actividad que generalmente se le confiere únicamente al dominio C-terminal, el 
Rossmann fold [Aliverti, Pandini y Zanetti, 2004]. 
 
En el 2007, Tripura y Podile generaron una quimera de glucosa deshidrogenasa 
dependiente de pirrol quinolina quinona (PQQ). La enzima tiene importancia industrial y se 
utiliza como biosensor de glucosa y para solubilizar fosfatos minerales. En la búsqueda de 
variantes naturales con características óptimas para su utilización industrial, encontraron una 
variante de Serratia marcescens eficaz solubilizando fosfatos pero con una expresión 
deficiente. La quimera resultante de la unión del dominio N-terminal de E. coli 
(transmembranal) con el dominio C-terminal de S. marcescens (de unión PQQ) pudo 
expresarse en E. coli con mayor resistencia a temperatura y con mayor afinidad por el 
cofactor. Posteriormente, con la inclusión de mutaciones puntuales en las regiones 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 11 
conservadas en alineamientos múltiples, se extendió la afinidad de las quimeras a distintos 
sustratos [Tripura y Podile, 2007]. 
 
Sharkey y Engle en el 2009 recombinaron dos glutamato deshidrogenasas con el fin 
de determinar la autonomía de los dominios. Las proteínas, provenientes de Clostridium 
symbiosum (C) y E. coli (E) presentan el 54% de identidad de secuencia. Tres de las cuatro 
quimeras que se construyeron (EC, CE y ECE, con la nomenclatura como la descrita 
anteriormente para el antecedente de Goihberg et al.) no fueron solubles y no se pudieron 
caracterizar. La quimera restante, CEC, insoluble de inicio, pudo caracterizarse después de 
la optimización del sistema de expresión con vectores más regulables, menores 
temperaturas de expresión y con la coexpresión de la chaperonina GroEl/Es. La quimera 
presentó valores menores de Km para todo sustrato y cofactor estudiado y valores de Vmax 
mayores para la mayoría de éstos. Como se mencionó, en las aminoácido deshidrogenasas 
la unión al sustrato se adjudica al dominio N-terminal y al dominio C-terminal la unión al 
cofactor. Con estos resultados se concluyó que la afinidad por los sustratos y por el cofactor 
no puede estar determinada por los dominios individuales (o no tan mayoritariamente, como 
se considera normalmente) [Sharkey y Engle,2009]. 
 
Novedades fenotípicas. 
A) Cambio de especificidad: 
El prototipo de cambio de especificidad por recombinación de dominios es el de las proteínas 
de reconocimiento de dos o más dominios que, cuando se combinan, resultan en una nueva 
especificidad. Ejemplo de esto se muestra en un trabajo en el 2006 de Giesecke et al., con 
los dominios dedos de zinc Cis2His2, los cuales se encuentran generalmente en tandem en 
proteínas que median interacción con DNA, RNA y otras proteínas. Giesecke et al. 
recombinaron dominios de unión a proteínas constituyentes de ocho factores de transcripción 
(provenientes de Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Locusta migratoria, y Helobdella 
triserialis). Lograron generar una librería con nuevos sitios de reconocimiento a proteínas y 
propusieron un mecanismo de interacción entre los dímeros de este tipo de proteínas 
[Giesecke, Fang y Joung, 2006]. 
 
Peisajovich et al., en el 2010 realizaron la modificación de las redes metabólicas a 
partir de 11 proteínas en la vía de reproducción de apareamiento en levaduras. Generaron 
Adriana Espinosa Cantú 
 12 
66 quimeras compuestas por un dominio regulador y otro catalítico. Las recombinaciones 
resultaron en una mayor diversidad de respuestas en la vía que la generada a partir de la 
duplicación de los genes o de los dominios individualmente. Con algunas quimeras se 
presentó mayor eficiencia reproductiva que con las proteínas nativas de la vía. Concluyen, de 
una manera novedosa y contundente, que la recombinación de dominios preexistentes 
puede ser un mecanismo importante en la evolución de redes de proteínas y en la 
generación de nuevos comportamientos fenotípicos [Peisajovich et al., 2010]. 
 
La obtención de novedades fenotípicas por recombinación de dominios no se limita a 
proteínas de reconocimiento o de regulación. En 1994, Kataoka et al., realizaron un trabajo 
con aminoácido deshidrogenasas en el cual se recombinó el dominio N-terminal de la 
fenilalanina deshidrogenasa de Thermoactinomyces intermedius con el dominio C-terminal 
de la leucina deshidrogenasa de Bacillus stearothermophilus. La quimera opuesta no se 
pudo expresar. Las enzimas presentan un 47% de similitud de secuencia. La fenilalanina 
deshidrogenasa utiliza como sustrato preferencialmente a la L-fenilalanina y a la L-tirosina 
mientras la leucina deshidrogena actúa casi exclusivamente con L-leucina y otros L-
aminoácidos ramificados. La quimera presentó los mismos valores de Km para la fenilalanina 
y la leucina que la proteína parental fenilalanina deshidrogenasa y una menor actividad 
específica ante fenilalanina como sustrato; sin embargo, presentó mayor actividad frente a 
isoleucina y valina. Con estos resultados se concluyó que ambos dominios se pueden plegar 
independientemente y que la combinación genera un nuevo sitio activo consistente con la 
nueva especificidad [Kataoka et al., 1994]. 
 
B) Novedad funcional por suma de actividades: 
Existen varios antecedentes en donde se reporta la suma de actividades al juntar dos o más 
dominios, cada uno con una función [Pavoor, Cho y Shusta, 2009; Doi y Yanagawa, 1999]. 
Por razones de espacio solamente se presenta uno, elegido por su actualidad y la 
trascendencia que puede tener en el campo de la bioingeniería. Wheeldon, Campbell y 
Banta, en el 2009, publicaron un trabajo en donde se reporta la combinación de tres 
dominios que no se presentan juntos en la naturaleza: una aldo-ceto reductasa termoestable, 
dos dominios zipper α−hélice de leucina que forman hidrogel y un dominio randomly-coiled. 
La quimera resultante presentó la formación de hidrogel y actividad de reductasa comparable 
con la parental, generando un biomaterial activo, lo que se considera un avance importante 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 13 
para áreas de la biotecnología como la ingeniería de tejidos, la bioelectrocatálisis y la 
generación de biosensores [Wheeldon, Campbell y Banta, 2009]. 
 
C) Novedad funcional o recuperación de actividad: 
Segatori et al., en el 2004, realizaron el intercambio del dominio de la tioredoxina de DsbC 
con el de DsbA. Ambas proteínas participan en la formación de enlaces disulfuro en las 
proteínas de membrana. En E. coli, DsbA forma los nuevos enlaces por su función oxidativa, 
mientras DsbC no oxida in vivo pero isomeriza los enlaces y presenta función de chaperona. 
Ambas proteínas comparten un dominio de tioredoxina homólogo, DsbC además presenta un 
dominio de dimerización. Segatori et al. generaron la quimera del dominio de dimerización de 
DsbC con el de tioreductasa de DsbA, generando una proteína con función tanto de DsbA 
como de DsbC. Lo sorprendente de este trabajo es que el dominio de dimerización no 
contribuye a la catálisis, contribuye a la interacción de DsbC con otra proteína en la vía que 
permite su reducción constante. La inclusión del dominio de dimerización a DsbA permitió la 
recuperación de actividad de DsbC por la interacción con otras proteínas [Segatori et al., 
2004]. Más adelante, en el 2008, en el mismo grupo se construyeron quimeras con el 
dominio de DsbA de la tioredoxina y los dominios de dimerización no homólogos al de DsbC. 
Una de estas quimeras, obtenida a partir de la unión de un dominio de dimerización Fkp 
cis/trans isomerasa y DsbA, presentó eficiencias catalíticas in vivo comparables a la enzima 
DsbC. Con ambos trabajos se concluyó que la adición de dominios es un mecanismo 
evolutivo importante para la formación de vías cada vez más complejas y que, en el caso de 
las tioredoxinas, es la organización estructural y no la identidad de los dominios la 
determinante de la función [Segatori et al., 2004; Arredondo et al., 2008]. 
 
Otro ejemplo de la obtención de novedades funcionales es la generación de 11 
quimeras a partir de un sitio de recombinación entre una farnesil difosfato sintasa y una 
crisantemil difosfato sintasa con el 75% de identidad. Ambas enzimas parentales sintetizan 
isoprenoides por reacciones de elongación, ciclopropanación y ramificación. Las quimeras 
sintetizaron isoprenoides por ciclobutanización, mecanismo ausente en las enzimas 
parentales. El análisis permitió sugerir que la enzima que naturalmente tiene esta función 
evolucionó a partir de las sintasas de isoprenoides [Thulasiram, Ericsson y Poulter, 2007]. 
 
Adriana Espinosa Cantú 
 14 
Las conclusiones de estos trabajos, entre los muchos otros que hay sobre el tema, 
permiten afirmar que la recombinación de dominios posibilita generar nuevas superficies de 
contacto que optimizan la función preexistente o la modifican hasta el grado de generar 
nuevas afinidades o nuevas catálisis. Por otra parte, se evidencía que la recombinación de 
dominios puede resultar en la formación de condiciones inestables en las interfaces. 
 
Como se puede observar, la mayoría de los antecedentes se basan en la recombinación de 
proteínas homólogas. Hay tres principios que sustentan la recombinación de proteínas 
homólogas como un buen modelo en la ingeniería de proteínas: 1) La recombinación de 
proteínas homólogas permite utilizar el material preexistente en la naturaleza e imitar el 
fenómeno evolutivo para investigar los determinantes de la función y el plegamiento de las 
proteínas; 2) Proteínas con el mismo plegamiento pueden presentar distintas funciones, lo 
que posibilita aumentar la diversidad de fenotipos en las quimeras; y 3) La recombinación 
homóloga potencia la exploración del área de secuencia (posibles genotipos) en 
comparación con otros métodos mientras aumenta la probabilidad de la obtención de 
proteínas plegadas y funcionales [Carbone y Arnold, 2007]. En la mitad de los antecedentes 
presentados se utilizaron deshidrogenasas como objetos de estudio y, en la mayoría de 
éstos, específicamente miembros de la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas 
dependientesde NAD(P). Las deshidrogenasas dependientes de NAD(P) son un modelo 
valioso porque implican un dominio versátil y antiguo, el plegamiento Rossmann, porque 
presentan la función en la interfaz de los dos dominios y, por otra parte, porque tienen 
importancia industrial. En el presente trabajo se utilizó una shikimato deshidrogenasa 
perteneciente a la superfamilia de aminoácido deshidrogenasas dependientes de NAD(P). A 
continuación se presentan las características de la enzima. 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 15 
MODELO DE ESTUDIO 
La enzima shikimato 5-deshidrogena. 
Las shikimato 5-deshidrogenasas (AroE) catalizan la reducción del 3-dehidroshikimato a 
shikimato (EC 1.1.1.25) (Figura 2). La reacción constituye el cuarto paso en la vía del 
shikimato, en la cual, a partir de fosfoenolpiruvato y 4-eritrosa fosfato, se produce corismato, 
el precursor de los aminoácidos aromáticos y de algunos metabolitos secundarios aromáticos 
(Figura 3). AroE es esencial para el metabolismo; cepas ∆aroE son auxotróficas para los tres 
aminoácidos aromáticos Trp, Phe y Tyr [Pittard y Wallace, 1966]. Las enzimas shikimato 
deshidrogenasas están presentes en bacterias, arqueas, plantas, hongos y parásitos del 
orden apicomplexa [Herrmann y Weaver, 1999]. La caracterización de la estructura y de la 
función de la enzima shikimato deshidrogenasa ha sido de principal interés para la 
generación de antimicrobiales, herbicidas y antiparasitarios dirigidos a esta enzima o a otras 
en la misma vía, así como para su utilización como materia prima en la síntesis de 
inhibidores de neuroaminidasas como el oseltamivir (tamiflú). 
 
Figura 2. Actividad de la shikimato 5-deshidrogenasa. A) Representación de las estructuras del 3-
dehidroshikimato y del shikimato B) Representación de la estructura del cofactor nicotinamida adenina 
dinucleótido fosfato (NADP+). 
Adriana Espinosa Cantú 
 16 
 
Figura 3. Vía del shikimato. Se muestran los sustratos de la vía del shikimato, cuyo producto final es el 
corismato del cual derivan productos aromáticos y el ácido fólico, entre otros metabolitos. (Imagen 
modificada de http://www-abell.ch.cam.ac.uk/research/Shikimate.html.) 
 
En este trabajo se utilizaron las enzimas shikimato deshidrogenasa de Escherichia 
coli y de Bacillus subtilis. La enzima shikimato deshidrogenasa de Escherichia coli (AroEEc) 
es monomérica y constituye una cadena polipeptídica de 271 aminoácidos con un peso 
molecular de 29380 Da [Anton y Coggins, 1988]. Los dos dominios que la componen forman 
βαβ sándwiches (Figura 4a). El dominio N-terminal (M1-T101) es un dominio de la 
superfamilia de aminoácido deshidrogenasas dominio N-terminal interrumpido por el dominio 
C-terminal y completado por una cola de 34 aminoácidos (G237-S271). Consiste de seis 
hojas-β y seis α-hélices en un orden 2-1-3-5-6-4, con la hojas-β 5 antiparalela a las demás. 
El dominio C-terminal (G103-F236) es un dominio Rossmann dependiente de NAD(P), uno 
de los dominios más versátiles (se encuentra en combinación con varios dominios) y más 
antiguos que se conocen (Cuadro 3). Está compuesto de seis hojas-β paralelas en orden 3-
2-1-4-5-6 y α-hélices a ambos lados. La tercera y cuarta α-hélices están reemplazadas por 
asas irregulares, por lo cual es de los Rossmann NAD(P) más pequeños [Michel et al., 2003; 
Padyana y Burley, 2003]. Los dominios interactúan por intercalamiento de cadenas 
hidrofóbicas: α5 interactúa con la β10, β11 y α6 (numeradas por la posición final en la 
enzima con ambos dominios) y α4 interactúa con α6 y α7 [Michel et al., 2003]. 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 17 
 
Figura 4. Shikimato deshidrogenasa (AroE) de E. coli. A) Representación de la estructura de la 
shikimato deshidrogenasa de E. coli con NADP como cofactor. A la derecha el dominio de unión a 
sustrato; a la izquierda el dominio Rossmann. B) Cambio conformacional entre una enzima activa 
(conformación cerrada) e inactiva (conformación abierta). En rojo AroE en la conformación cerrada; en 
azul, YdiB, parálogo de AroE, en la conformación abierta. En verde se representa a AroE en una 
conformación intermedia. Se representa al cofactor NADP y se indican los dos residuos que actúan 
como bisagra, T101 y Q244. Figura extraída de Michel et al., 2003. 
 
 El sitio activo, como en todas las aminoácido deshidrogenasas, lo constituye una 
hendidura profunda conformada por dos α-hélices en la interfaz entre ambos dominios y en 
la cual se une el sustrato por residuos principalmente del domino N-terminal y el cofactor por 
residuos del dominio C-terminal [Michel et al., 2003]. Ante la unión del sustrato y el cofactor 
hay un movimiento de los dominios de una estructura abierta a una cerrada (Figura 4b). El 
movimiento corresponde a una rotación de ~25° por el eje que pasa por los residuos Q26 y 
D102, lo que genera que la punta del dominio N-terminal recorra una distancia de ~14 Å 
(Figura 4b) [Michel et al., 2003]. Los residuos implicados en la formación de los puentes de 
hidrógeno que se modifican ante el movimiento conformacional son N86, T101, y Q244, T87 
y N59. Los tres primeros residuos (N86, T101 y Q244) están altamente conservados en la 
familia de shikimato deshidrogenasa, T87 en el 92% de las secuencias y N59 en el 60%. En 
la conformación abierta, Q244 forma puentes de hidrógeno con las cadenas laterales de N59 
y T101. Cuando se une el sustrato y se adquiere la conformación cerrada, Q244 genera 
nuevas interacciones con N86 y mantiene aquellas con T101 [Michel et al., 2003]. Una vez 
formado el sitio activo, el C3 del 3-dehidroshikimato se posiciona a 3 Å de distancia para 
recibir el hidrógeno del C4 del anillo nitrogenado de NADPH. El mecanismo de acción 
propuesto plantea que la transferencia de hidruros y la protonación del C3 del 
dehidroshikimato ocurren de manera concertada. . La K65 funciona como un ácido/base 
Adriana Espinosa Cantú 
 18 
general. El protón de la K65 es recuperado o liberado posteriormente del o hacia el agua 
presente en el sitio activo por coordinacion con otro residuo, D102 [Gan et al., 2007]. La 
molécula de agua, los residuos que unen al sustrato y los que intervienen en la reacción 
están conservados en toda la familia de shikimatos deshidrogenasas. Hay un único residuo 
en el dominio Rossmann que pudiera estar interviniendo en la unión del sustrato (Y215), 
conservado en el 64% de los miembros de la familia [Sinhg et al., 2008]. Se ha planteado 
que intervenga en la estabilización del intermediario más que en la unión al sustrato [Han et 
al., 2009]. La enzima presenta inhibición lineal competitiva por producto que se compensa 
por la sobreexpresión del gen [Draths, Know y Frost, 1999]. En condiciones de 
sobreexpresión, por otra parte, AroEEc puede producir quinato a partir del 3-dehidroshikimato 
[Draths, Know y Frost, 1999]. En E. coli, AroEEc presenta un parálogo, YdiB, con el cual 
comparte el 28% de identidad y el 50% de similitud de secuencia. YdiB utliliza 3-
dehidroshikimato y 3-dehidroquinato como sustrato y, a diferencia de AroEEc, 
prefererentemente NADH como cofactor [Benach et al., 2003; Michel et al., 2003]. 
 
La enzima shikimato deshidrogenasa de Bacillus subtilis (AroEBs) no se encuentra 
igualmente caracterizada a su paráloga en E. coli. La proteína, codificada por el gen aroD, 
está consitutida por 280 aminoácidos. Presenta conservación de los residuos de unión a 
sustrato y a cofactor identificados en otras shikimato deshidrogenasas [Padyana y Burley, 
2003; Ye et al., 2003] y se pueden identificar por su secuencia los dos dominios 
estructurales. Probablemente forme dímeros como en otras proteínas homólogas. A 
diferencia de E. coli, B. subtilis no presenta parálogos de la shikimato deshidrogenasa 
[Benach et al., 2003]. Hay una patente de ingeniería de vías metabólicaspara la optimización 
de la producción de shikimato en Bacillus subtilis [Iomantas et al., 2002]. 
 
La familia shikimato deshidrogenasa. 
La familia de shikimato deshidrogenasas (SDH) se puede dividir funcionalmente en 4 grupos: 
Sdh, YdiB, RifI y Sdh-l [Singh et al., 2008]. Cada grupo se puede identificar por motivos 
característicos de importancia putativa en el reconocimiento del sustrato y por los motivos 
que determinan la especificidad por NADPH o NADH; varios de los residuos que componen a 
los motivos están altamente conservados en todas las SDH [Singh et al., 2008]. El grupo Sdh 
comprende a las enzimas AroE, cuyo prototipo, la shikimato deshidrogenasa de E. coli, se 
describió en la sección anterior. El grupo de YdiB se define como quinato/shikimato 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 19 
deshidrogenasas, ya que pueden utilizar tanto dehidroquinato como dehidroshikimato como 
sustratos. Algunos de los miembros de este grupo, como la YdiB de E. coli, parecen ser 
producto de la transferencia horizontal y neofuncionalización de enzimas SDH de α-
proteobacterias (Firmicutes). Los homólogos del grupo RifI son parte de la vía biosintética 
aminoshikimato, que conlleva a la biosíntesis del antibiótico rifamicina B. Por último, el grupo 
Sdh-l está constituido por enzimas con mucha menor actividad que la SDH de E. coli con 
shikimato o quinato como producto. 
 
 
Cuadro 3: EL DOMINIO ROSSMANN. 
 
Los dominios Rossmann se encuentran en proteínas con una amplia gama de 
actividades catalíticas como oxidoreductasas, hidrolasas, liasas e isomerasas. 
Corresponde a uno de los dominios más antiguos, versátiles y abundantes en la 
naturaleza. Se encuentran, por ejemplo, en el 1% de las proteínas eucarióticas y en 
el 3% de las procarióticas [Kallberg y Persson, 2006]. Está compuesto de dos 
motivos estructurales que unen mononucleótidos formados por una estructura 
secundaria βαβαβ. Se piensa que los dominios Rossmann dependientes de NAD(P) 
evolucionaron por duplicación y fusión de genes codificantes de motivos de unión a 
mononucleótidos sin homología entre sí formando un dominio de seis hojas-β con 
α-hélices intercaladas en un orden relativo 321456 [Carugo y Argos, 1997]. 
 
Hay dos características en secuencia y una estructural conservadas en los dominios 
Rossmann dependientes de NAD(P): un asa rica en glicinas (motivo-G) que 
interactúa con el grupo bifosfato del NAD, un residuo al final de la β2 implicado en 
la identificación al cofactor (NAD, NADP o FAD) y una molécula de agua presente 
en la apoenzima que estabiliza al asa y al cofactor en su conformación extendida y 
pudiera contribuir entálpicamente a la energía libre de la unión del cofactor 
[Kallberg y Persson, 2006; Bottoms, Smith y Tanner, 2002; Carugo y Argos, 
1997]. 
 
 
Estructura secundaria y topología típica del dominio Rossmann dependiente de NAD(P). Entre 
β1 y αA (o α1) se encuentra el asa rico en glicinas; al final de β2 se posiciona el residuo que 
generalmente dicta la especificidad entre NAD (Asp o Glu) y NADP (Arg). Figura de Bottoms, 
Smith y Tanner, 2002. 
 
 
Los dominios Rossmann dependientes de NAD(P) se presentan en combinación con 
dominios de 7 superfamilias distintas, nombrados dominios dominios de unión a 
sustrato o dominios catalíticos. Una de estas suprfamilias es la de el dominio de 
Adriana Espinosa Cantú 
 20 
aminoácido deshidrogenasas N-terminal, con el que se encuentra combinado el 
dominio Rossmann en las shikimato deshidrogenasas. En cada combinación con las 
distintas superfamilias de dominios de unión a sustrato se conserva: 1) la posición 
de dominios en la proteína, ya sea en el extremo amino o carboxilo de la proteína, 
embebido en el dominio Rossmann o éste embebido en los dominios catalíticos; y 2) 
el ángulo y orientación entre ambos dominios. La conservación de la posición de 
los dominios en la cadena polipeptídica parece ser el resultado de que para cada 
combinación se presentó un solo evento de recombinación al que le siguió la 
divergencia que generó la variación dentro de la superfamilia [Bashton y Chothia, 
2002]. 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
Las shikimato deshidrogenasas de E. coli y de B. subtilis son de las deshidrogenasas más 
pequeñas, presentan menos de 300 residuos. El estudio de la recombinación de sus 
dominios es un caso especial al presentar su sitio activo en la interfaz entre los dominios. El 
dominio Rossmann está embebido en el dominio N-terminal, por lo que resulta interesante 
estudiar la optimización de las interfaces entre los dominios en la divergencia dentro de la 
familia y la relativa independencia estructural y funcional de los dominios. Además, el estudio 
permitirá complementar el conjunto de datos que se han obtenido previamente de la 
recombinación de dominios en proteínas que presentan un dominio Rossmann dependiente 
de NAD(P). La shikimato deshidrogenasa de E. coli y de B. subtilis presentan el 35 % de 
identidad de secuencia. El reporte de la recombinación de dominios entre estas dos 
proteínas representará, entre los antecedentes, la recombinación de dominios entre 
proteínas con un Rossmann dependiente de NAD(P) con menor porcentaje de identidad de 
secuencia. Por otra parte, como se mencionó anteriormente, las enzimas son de importancia 
industrial, mientras que el parálogo de la shikimato deshidrogenasa de E. coli, YdiB, es 
probablemente resultado de la transferencia horizontal de sus homólogos en Firmicutes. Las 
quimeras entre las shikimato de E. coli y B. subtilis podrían presentar caracterísiticas en el 
plegamiento y en la función útiles para la industria o pudieran presentar características 
remanentes al evento evolutivo que condujo a su neofuncionalización de YdiB. 
 
HIPÓTESIS 
La recombinación de los dominios entre dos enzimas shikimato deshidrogenasas con el 35% 
de identidad de secuencia resultará en quimeras activas. 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 21 
 
OBJETIVOS 
El objetivo del presente trabajo es analizar las restricciones y posiblidades de obtener 
quimeras funcionales al intercambiar los dominios de la enzimas shikimato deshidrogenasas 
de Escherichia coli y de Bacillus subtilis por observar los fenotipos de la función y del 
plegamiento de las quimeras. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES. 
• Generación de cuatro quimeras producto de la recombinación en uno o dos sitios. 
• Comparación del plegamiento y función de las quimeras por ensayos con un 
reportero de plegamiento y su capacidad de recuperar su función biológica in vivo e in 
vitro. 
• Comparación de las características estructurales y de secuencia por métodos 
bioinformáticos de las proteínas parentales que pudieran explicar los resultados. 
Realización de modelos estructurales de las quimeras. 
 
Adriana Espinosa Cantú 
 22 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
CONSTRUCCIÓN DE LAS QUIMERAS DE UN SITIO DE RECOMBINACIÓN. 
Las quimeras se generaron por el intercambio de los dominios de las enzimas shikimato 
deshidrogenasa de E. coli y B. subtilis (Figura 5). 
 
Figura 5. Templados y quimeras. Representación de las estructuras y secuencias de AroE de A) E. coli 
y B) B. subtilis. C) Representación de las secuencias de las cuatro quimeras ortólogas analizadas en 
este trabajo. Las quimeras BE y EB presentan en el extremo carboxílico la secuencia de aminoácidos 
de la proteína nativa de la cual proviene el domino Rossmann dependiente de NAD(P). Las quimeras 
BEB y EBE presentan en el extremo carboxílico la secuencia de la proteína nativa de la cual proviene 
el dominio N-terminal. 
 
Las secuencias quiméricas se produjeron a partir de dos vectores pT4 construidos 
previamente por Iliana Escamilla con la secuencia de aroE de E. coli (AroEEc). Los vectores 
pT4 presentan un origen de replicación de alto número de copias (ColE1, presente en pUC), 
promotor pTrc fuerte, uncasete de resistencia a kanamicina (Km) y la fusión traduccional a la 
enzima cloranfenicol acetil transfería (CAT) como reportero de plegamiento. La actividad de 
resistencia cloranfenicol (Cm) depende del correcto plegamiento de CAT y de la proteína a la 
que se encuentra fusionada. Se muestran a continuación los dos vectores iniciales (Figura 6): 
 
pT4-E-CAT 
Vector de 3.5 kb con la secuencia del gen aroE con sitio de restricción NcoI al inicio, 
una mutación A298C (nucleótido correspondiente al último aminoácido del dominio N-
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 23 
terminal y que produce una mutación N100H) que genera un sitio BstEII, y un sitio de 
restricción BamHI al final de la secuencia de aroE, la cual tiene una deleción en el 
último nucleótido (A819) para la eliminación del codón de paro. La fusión traduccional 
a CAT se presenta tras una secuencia conector de 12 nucleótidos. Al eliminar la 
secuencia de CAT mediante una digestión con BamHI y BglII queda una cola de 
histidinas en fase con el gen aroE. Para diferenciar su producto de la proteína AroEEc 
nativa, a la proteína resultante de la expresión de este vector se le determinó E, y a la 
proteína con la fusión E-CAT. 
 
pT4-E(C)-CAT 
Vector de 3.3 kb con la secuencia nucleotídica de aroE correspondiente al dominio 
Rossmann (considerado a partir del nucleótidos 306, aminoácido 102). Presenta un 
casete de 48 pb que contiene codones de término en sus seis posibles marcos de 
lectura, el cual disminuye el número de falsos positivos en el tamizaje. La eliminación 
del casete se obtiene por la digestión con MlyI. La inserción de secuencias en fase 
genera la mutación A298C que presenta el otro vector parental pT4-E-CAT. A su vez, 
también presenta el sitio de restricción BamHI al final de la secuencia y la fusión 
traduccional a la enzima CAT que al ser eliminada genera la cola de histidinas. 
 
Figura 6. Vectores iniciales. A) pT4-E-CAT; B) pT4-E(C)-CAT. 
 
Las secuencias del gen completo de la shikimato deshidrogenasa de Bacillus subtilis 
(aroEBs), el fragmento correspondiente al dominio N-terminal y el correspondiente al C-
NcoI 
BstEII 
BamHI 
BglII 
A 
MlyI 
MlyI 
BamHI 
BglII 
B 
N-terminal (265-561) 
C-terminal (562-1069) 
cat (1071-1788) 
Km (2005-
2871) Km (1764-2630) 
pT4-E-CAT 
(3591 pb) 
pT4-E(C)-CAT 
(3350 pb) 
casete (264-332) 
C-terminal (333-
850) 
cat (851-1546) 
Adriana Espinosa Cantú 
 24 
terminal se amplificaron directamente del DNA genómico de B. subtilis. Las secuencias 
se clonaron en los vectores pT4 previamente descritos. A continuación se presentan 
los vectores resultantes, su procedencia y la metodología para su obtención. La 
numeración de nucléotidos y residuos se mantiene según la secuencia de la que 
provienen. 
 
pT4-B-CAT 
La secuencia de aroEBs (A1 a T840; M1 a C280) se amplificó con los oligos 
Bs_aroE_N_for y BS_aroE_C_rev (TM2 y TM1). El producto resultante se digirió con 
BamHI se clonó en el vector pT4-E(C)-CAT previamente digerido con MlyI y BamHI. Al 
producto de la expresión en E. coli de este gen se le denominó B, y a su fusión B-
CAT. 
 
pT4-BE-CAT 
La secuencia de aroEBs A1-C303 se amplificó con los oligos Bs_aroE_N_for y 
Bs_aroE_N_rev (Tabla 1) El producto resultante se clonó en el vector pT4-E(C)-CAT 
previamente digerido con MlyI de forma tal que se obtuvo la quimera BE con los 
nucleótidos de aroEBs A1-C303 (M1-T101) y de aroE aroEEc T306-G818 (D102-S271) 
(Figura 5). 
 
pT4-EB-CAT 
La secuencia aroEBs G304-T840 se amplificó con los oligos BS_aroE_C_for y 
BS_aroE_C_rev (Tabla 1). El producto resultante se digirió con BstEII y BamHI y 
clonado al vector pT4-E-CAT previamente digerido las mismas enzimas de forma tal 
que se obtuvo la quimera EB con los nucleótidos de aroEEc A1-C303 (M1-T101) y de 
aroEBs G304-T840 (D102-C280) (Figura 5). 
 
Amplificación por PCR. 
Las reacciones de PCR para amplificar aroEBs y la secuencia equivalente al domino N-
terminal de aroEBs se llevaron a cabo en 15 µl con agua tetradestilada, 1x de buffer de 
Pfu polimerasa (Roche), 200 µM de dNTPs, 1U de Pfu polimerasa (Roche) y los oligos a 
10 pmol/µl (Tabla 1). Las muestras se incubaron a 95 ºC por 5 min, 25 ciclos de 94 ºC 
50 seg, Tm específica de cada par de oligos 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una incubación 
final de 72 °C por 10 min. Para amplificar la secuencia correspondiente al dominio C-
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 25 
terminal de aroEBs se utilizaron los mismas concentraciones de Pfu, dNTPs, oligos y DNA 
y un programa distinto que consta en la incubación a 95 ºC por 5 min, 5 ciclos de 94 ºC 
40 seg y 1.5 min a 72 ºC, 25 ciclos de 94 ºC 40 seg, 52 ºC 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una 
incubación final de 72 °C por 10 min. Los productos de PCR se purificaron con el kit de 
purificación de PCR (Roche). 
 
Digestión. 
Para la preparación de pT4-B-CAT se digirió el vector pT4-E(C)-CAT con las enzimas 
MlyI y BamHI en una reacción de 30 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x 
buffer BamHI (Biolabs), 1x BSA, 1U BamHI y MlyI (Biolabs)y 1 µg de vector y se incubó 
16 h a 37 ºC. El producto de PCR, correspondiente a aroEBs, se digirió con BamHI de la 
misma manera. pT4-BE-CAT se obtuvo al digerir pT4-E(C)-CAT con MlyI en una reacción 
de 25 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x Buffer 4 (Biolabs), 1x BSA, 1U MlyI 
(Biolabs) y 1 µg de vector. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 ºC. 
pT4-EB-CAT se obtuvo a partir de la digestión del vector pT4-E-CAT. Se realizó una 
digestión de 30 µl de volumen final con agua tetradestilada, 1x buffer BamHI (Biolabs), 
1x BSA, 1U BamHI (Biolabs) y 1 µg de vector y 500 ng de producto de PCR 
independientemente. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 ºC. 
Posteriormente se adicionó 1 U de BstEII (Biolabs) y se incubaron a 60 ºC por dos 
horas. Las digestiones se purificaron con el kit de purificación de PCR (Roche) antes de 
la ligación. 
 
Ligación y transformación. 
Las ligaciones se realizaron en una relación 4-6:1 (inserto:vector) en el vector 
correspondiente. Las reacciones se llevaron a cabo en 30 µl incubando 16 h a 16 ºC, 
con agua tetradestilada, 800 ng de vector, 1x de buffer de T4 ligasa (Roche), 1x PEG 
8,000 y 1 U de ligasa T4 (Roche) para las reacciones de extremos cohesivos y 5U de 
ligasa para las reacciones de extremos rasos. Se transformaron 3 µl de cada reacción 
de ligación en 60 µl de células electrocompetentes XL1Blue-MRF (Tabla 2). Se 
recuperaron en 1 ml de SOC por una hora a 37 ºC y se plaquearon por duplicado en 
cajas de LB con 25 µg/ml de Km y en cajas de LB con 25 µg/ml de Km y 15 µg/ml de Cm 
a 37 ºC 16 h. 
 
 
Adriana Espinosa Cantú 
 26 
CONSTRUCCIÓN DE LAS QUIMERAS DE DOS SITIOS DE RECOMBINACIÓN. 
Las shikimato deshidrogenasas presentan el dominio N-terminal interrumpido por el 
domino C-terminal. Claudia Martínez en el laboratorio realizó el intercambio de los 
extremos carboxílicos (correspondientes al α9 y α10, referidos también como “colas”) 
de las quimeras, de forma tal que se obtuvieron los siguientes vectores (Figura 5): 
 
pT4-BEB-CAT 
Secuencia de aroEBs A1a C303 (M1-T101) y T726 a T840 (G242-C280) y aroEEc de 
T306 a T708 (D102-D236). 
 
pT4-EBE-CAT 
Secuencia de aroEEc A1 a C303 (M1-T101) y T711-G818 (G237-S271) y aroEBs de 
T306 a T723 (D102-D241). 
 
La metodología para la obtención de pT4-BEB-CAT y pT4-EBE-CAT se fundamentó en dos 
ciclos de PCR utilizando pT4-BE-CAT y pT4-EB-CAT como templados como se detalla a 
continuación. La construcción de pT4-BEB-CAT consistió en la amplificación de la cola 
del vector pT4-EB-CAT con dos oligos (Tabla 1): 1) un oligo forward (DIIEc-coBs) que 
amplifica la cola de B con 24 pb de homología con el final de la secuencia 
correspondiente aldominio C-terminal de E y 2) un oligo reverso (cat100) que amplifica la 
secuencia del vector 100 pb después del final de la secuencia quimérica. Posteriormente, 
se realizó un segundo PCR utilizando pT4-BE-CAT como templado con un oligo forward 
(pT4) que amplifica desde antes del inicio del gen quimérico y el producto del primer PCR 
como oligo reverso de doble cadena. El producto de este PCR se digirió con NcoI y BamHI 
y se clonó en el vector pT4-E-CAT digerido de la misma manera. pT4-EBE-CAT se obtuvo 
por el mismo procedimiento utilizando los oligos DIIBs-coEc y cat100 en el primer PCR y 
los oligos pT4 y el producto del primer PCR en la segunda reacción (Tabla 1). El producto 
del segundo PCR fue digerido con HindIII y BamH1 y clonado en el vector pT4-E-CAT 
digerido de la misma manera. 
 
Secuenciación. 
Se confirmó la identidad de los vectores por secuenciaron con los oligos pT4 y pT42 o 
cat100 (Tabla 1) en la unidad de secuenciación del Instituto de Biotecnología, UNAM. 
 
 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 27 
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados. 
Nombre número/año Tm 
experimental Tm2 secuencia (5'->3') 
Bs_aroE_N_for* 3550/2007 AAAAAGCTGTACGGGGTTATCGGA 
Bs_aroE_N_rev 3551/2007 60 TCCGACAAGCTTATCTCCCTCTCT 
BS_aroE_C_for 266/2008 
ACCTGGGTGGTTACCATACCGATG
GGGAAGGCTT 
BS_aroE_C_rev* 267/2008 56 63* 
GCTATACGGGATCCGTAACATTCTG
TTCCTCCTA 
pT4 2004-237 GACATATAAACGGTTCTGGCA 
pt42 2004-238 60 GCCAGTGAATTGTAATACGAC 
aroE-47 5215/2009 AATCCGCGATGCCCTGAC 
aroE+29R 5316/2009 62 TTCCCTGTCCGGAAACTGGAT 
Tm experimental: temperatura de fusión utilizada en los PCRs descritos. Tm2: temperatura de fusión utilizada en la 
reacción con los oligos Bs_aroE_N_for y BS_aroE_C_rev. 
 
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) 
Con ensayos de CMI se calcula la concentración de un antibiótico a la cual la mitad de las 
clonas analizadas son resistentes, por lo que se considera como la concentración del 
antibiótico a la que una cepa dada resiste. En el sistema de la fusión traduccional a CAT como 
reportero de plegamiento, se espera que mientras más resistencia a cloranfenicol (Cm) 
presenten la clonas, mayor sea su solubilidad [Maxwell et al., 1999]. Las quimeras se 
transformaron en la cepa MC1061 (Tabla 2). Como control positivo se utilizó el vector pT4-E-
CAT (CMICm ~150 µg/ml) transformado en la misma cepa; como control negativo la cepa 
MC1061 sin vector (CMICm ~5 µg/ml) y el vector pT4-E(C)-CAT (CMICm ~15 µg/ml). Se realizaron 
diluciones de 100 a 108 con LB a partir de cultivos incubados a 30 ºC 16 h con Km 25 µg/ml. 
Se sembraron 5 µl de las diluciones de cada cepa en cajas de LB Km 25 µg/ml con Cm a 
concentraciones de 0, 15, 30, 45, 60, 70, 90, 100, 110, 120, 150 y 160 µg/ml. Las cajas se 
incubaron 16 h a 30 ºC. 
 
EXPRESIÓN Y WESTERN BLOT. 
Para comprobar la expresión de las construcciones se hicieron cultivos por 16 h a 30 °C y 250 
rpm de 3 en ml de LB con Cm 15 µg/ml en la cepa JM101 (Tabla 2). Se inocularon en dilución 
1:10 10 ml de LB con las muestras y se incubaron a 30 °C hasta llegar a 1 OD600 nm. Los 
cultivos se centrifugaron 5 min a 4000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió la 
pastilla en 500 µl de PBS 1x. Las muestras se sonicaron (Branson Sonifier 450) 10 seg 6 
veces cada una, agregando 1 µl de PMSF 100 mM tras la primera sonicación. Se centrifugaron 
a 4000 rpm 10 min, se recuperó el sobrenadante correspondiente a la fracción soluble y se 
resuspendió la pastilla correspondiente a la fracción insoluble en 100 µl de buffer de carga 
Adriana Espinosa Cantú 
 28 
(glicerol 2%, SDS 4%, Tris 250 mM pH 6.8, azul bromofenol 0.05% y 10% β-mercaptoetanol). 
Las muestras se observaron en un gel SDS/PAGE al 12.5%. Para el Western Blot las proteínas 
del gel SDS-PAGE de la fracción soluble se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que 
se bloqueó 16 h a 4 °C con solución TBST-leche 5% (TBST: tris 10mM, NaCl 159 mM y Tween 
0.05%; Leche: Svelty, Nestlé). Después de lavar tres veces con TBST (10 min cada vez) la 
membrana se incubó 1 h con el anticuerpo ANTI-CAT (Roche) en una relación 1:3000. Se lavó 
tres veces más con TBST-leche 0.1% y se incubó 1 h con el anticuerpo ANTI-DIG (Roche) en 
relación 1:5000. Tras dos lavadas con TBST se adicionaron 15 ml de H2O con 1 ml BCIP/NTP 
(Zymed) 1:1 hasta observar señal, después de lo cual se enjuagó con agua. 
 
Tabla 2. Cepas utilizadas. Las células competentes se prepararon según Sambrook et al. (1989). 
XLI-Blue F´::Tn10 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 
(rK-mK+) glnV44 relA1 lac. 
MC1061 F– araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 Δ(lac)X74 rpsL (Strr) hsdR2 (rk – 
mk+) mcrA mcrB1 
JM101 F´traD36 proAB lacI Δ(lacZ)M15/ Δ(lac-proAB) glnV thi 
 BW25113 ΔaroE: laclq rrnB T14 ΔlacZ WJ16 hsdR514 ΔaraBAD AH33 ΔrhaBADLD78 (Kmr) 
(Keio collection) 
 
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN. 
Para observar la actividad in vivo de las quimeras ortólogas se realizaron ensayos de 
complementación con la cepa BW25113 (Tabla 2) con el gen aroE deletado (∆AroE) de la 
colección Keio de E. coli K-12 [Baba et al., 2006] donada por el laboratorio del Dr. Gosset, IBT. 
 
Eliminación del casete de resistencia a Km en la cepa ∆aroE. 
La cepa ∆AroE contiene un casete de resistencia a kanamicina con secuencias FRT que 
se localiza en la región cromosomal del gen de aroE. Para la expresión en esta cepa de 
las construcciones en los vectores pT4, con resistencia a kanamicina, se eliminó el 
casete resistencia a Km de ∆aroE. como se describe en Datsenko y Wanner 2000. Para 
ello se utilizó el vector BT340 donado por Filiberto Sánchez del laboratorio del Dr. Xavier 
Soberón, IBT. BT340 presenta un casete de resistencia a ampicilina (Amp), síntesis de 
la recombinasa FLP inducida por temperatura de 30 ºC y replicación a temperaturas 
menores a 37 ºC. Se transformó BT340 en células ∆aroE competentes y se crecieron 
100 µl de las células en medio SOC a 30 °C con Amp 25 µg/ml. Las colonias se 
transfirieron a una placa de LB y se crecieron a 43 °C. Se seleccionaron 5 colonias 
resultantes y cada una se sembró en 3 lotes de 3 ml cada uno 1) LB sin antibiótico, 2) 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 29 
LB con Km 25 mg/ml y 3) LB con Amp 25 mg/ml. Se seleccionaron las colonias sensibles 
a kanamicina y a ampicilina. La eliminación del casete de resistencia se comprobó con 
un PCR diagnóstico con oligonucleótidos que hibridan 47 nucleótidos anteriores al inicio 
del gen aroE y 29 nucleótidos posteriores al fin de aroE (aroE-47F y aroE+29R, 
respectivamente) (Tabla 1). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 20 µl con 
agua tetradestilada, 1x de Buffer de Taq polimerasa (Roche), 200 µM de dNTPs, 1U de 
Taq polimerasa (Roche) y los oligos a 10 pmol/µl. Las muestras fueron incubadas a 95 
ºC por 5 min, 25 ciclos de 94 ºC 50 seg, 58 ºC 50 seg y 72 ºC 1.5 min y una incubación 
final de 72 °C por 10 min. 
 
Eliminación de la fusión traduccional a CAT. 
Para eliminar la fusión a CAT se realizaron digestiones de los vectores pT4-E-CAT, pT4-
BE-CAT y pT4-EBE-CAT con las enzimas BamHI y BglII en una reacción de 35 µl de 
volumen final con agua tetradestilada, 1x Buffer BamHI (Biolabs), 1x BSA, 1U de ambas 
enzimas (Biolabs) y 1 µg de vector. Las reacciones de digestión se incubaron 16 h a 37 
ºC. Los productos se purificaron con el kit de purificación de PCR (Roche). pT4-B-CAT, 
pT4-EB-CAT y pT4-BEB-CAT presentan un sitio BglII al final de la secuencia 
correspondiente al dominio C-terminal de aroEBs por lo cual se realizó una digestión 
HindII y BamHI de forma tal que la secuencia completa de los genes se pudieran 
traspasar a un vector pT4-E-CAT previamente digerido con HindII y BglII. Las reacciones 
se llevaron a cabo como las descritas anteriormente. Los productos resultantes se 
purificaronde gel de agarosa con el kit de purificación de PCR (Roche). Las ligaciones 
se realizaron en un volumen final de 30 µl incubando 16 h a 16 ºC con agua 
tetradestilada, 800 ng de vector, 1x de Buffer de T4 ligasa (Roche), 1x PEG 8,000 y 1 U 
de ligasa T4 (Roche). Se transformaron 3 µl de cada reacción de ligación en 60 µl de 
células MC1061. Se recuperaron en 1 ml de SOC por una hora a 37 ºC y se plaquearon 
en cajas de LB con 25 µg/ml de Km. Se seleccionaron clonas que no presentaran 
resistencia a Cm y se comprobó por PCR el tamaño del vector resultante. Los vectores 
se secuenciaron con los oligos pT4 o pT475 y pT42 (Tabla 1) en la unidad de 
secuenciación del Instituto de Biotecnología, UNAM. 
 
La expresión de las construcciones resultantes produce la proteína codificada con 6 
histidinas en fase al final de la secuencia. Los vectores se identifican como pT4-E-HIS, 
pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE-HIS. 
Adriana Espinosa Cantú 
 30 
Complementación de la cepa ∆AroE Km-. 
Los vectores, pT4-E-HIS, pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE-
HIS se transformaron en la cepa ∆AroE Km-. Se utilizó la cepa con el vector pT4 vacío 
como control negativo. Las células transformadas se recuperaron una hora en LB a 37 
°C y se sembraron en cajas LB Km 25 µg/ml. Una colonia correspondiente a cada 
construcción se creció 16 h a 30 °C y 250 rpm de 3 ml LB con Km 25 µg/ml. Los cultivos 
saturados se lavaron con sales M9 1x (preparado según Sambrook et al., 1989) de la 
siguiente manera: 400 µl de los cultivos en LB se centrifugaron 1 min a 9000 rpm. Se 
resuspendieron en 1 ml de sales M9 y se centrifugaron a 2 min a 5000 rpm. Se repitió dos 
veces el proceso y se resuspendió en 400 µl de sales M9. Se inocularon 20 µl de las 
células en tres distintos lotes de 2 ml de medios con Km 25 µg/ml de: 1) LB; 2) medio 
mínimo con vitaminas: 40 µl de ácido p-aminobenzoico 32 mg/ml, 250 µl de ácido 4-
hidroxibenzoico 62 mg/ml, 72.5 µl de 2-3 dihidroxibenzoico 35 mg/ml y 250 µl de tiamina 10 
mg/ml); y 3) medio mínimo con vitaminas y aminoácidos aromáticos: vitaminas en las 
mismas concentraciones descritas y 500 µl de Tyr (8 mg/ml) y Phe (8 mg/ml) y 250 µl de 
Trp (4 mg/ml). Se monitoreó su crecimiento a 30 °C por densidad óptica a 600 nm. 
 
Expresión y Western Blot. 
La expresión de las proteínas se comprobó como fue descrito anteriormente y se 
observaron por SDS/PAGE. Las proteínas de la fracción soluble se transfirieron a una 
membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó 16 h a 4 °C con solución PBS-leche 
(Svelty, Nestlé) 5%. Después de lavar tres veces con PBS (10 min cada vez) la 
membrana se incubó 1 hra con el anticuerpo ANTI-HIS (Roche) en una relación 1:500. Se 
lavó dos con PBS y se adicionaron 10 ml de TMB (Zymed) hasta visualizar las bandas, 
después de lo cual se enjuagó con agua. 
 
ACTIVIDAD IN VITRO 
AroE reduce el 3-dehidroshikimato a shikimato (SA) usando como donador de electrones al 
cofactor NADPH, por lo cual se puede medir la actividad enzimática siguiendo la producción de 
NADPH a 340 nm en la reacción de sentido contrario. 
 
 Actividad de extractos totales. 
La actividad enzimática de los extractos proteicos de pT4-E-HIS, pT4-B-HIS, pT4-BE-HIS, 
pT4-EB-HIS, pT4-BEB-HIS y pT4-EBE-HIS se determinó por observar el cambio de 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
 31 
absorbancia a 340 nm por la reducción de NADP+ a NADP dependiente de la 
concentración de enzima. Las reacciones se realizaron en un espectrofotómetro 
(Evolution 300 UV- Visible Spectrophotometer, Thermo Scientific) a temperatura 
ambiente. Para ello se crecieron cultivos de 2 ml en LB Km 25 µg/ml de los vectores 
transformados en la cepa ∆aroE Km - a 30 °C hasta 1 OD600 nm, se centrifugaron a 4000 
rpm 5 min y la pastilla se resuspendió en 500 µl de Tris-HCl 100 mM pH 9. Se sonicó, se 
centrifugó y se recuperó el sobrenadante como se describió anteriormente para los 
ensayos de expresión. Se midió la actividad de los sobrenadantes a 0, ∼ 4 y ∼10 nM de 
extracto total en una reacción de 100 µl de volumen final con Tris-HCl 100 mM pH 9, SA 
5 mM y NADP+ 5 mM. 
 
 Purificación nativa de E, B y EBE. 
Las enzimas que presentaron actividad (E-HIS, B-HIS y EBE-HIS) se purificaron a 
homogeneidad mediante una cromatografía de afinidad con una columna de níquel 
(Quiagen) a partir de cultivos de 1.5 L de LB Km 25 µg/ml crecidos a 28 °C hasta 1.5 
OD600 nm. Los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm por 20 min y la pastilla se mantuvo a -
20 °C 6 h, tras lo cual se descongeló 15 min a temperatura ambiente y se resuspendió 
en 2 ml/g de peso seco en buffer de lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 10 mM 
imidazol, pH 8.0), 1 ml de lisozima 10 mg/ml y PMSF 10 mM. Se dejó 30 minutos a 4 °C y 
se sonicó (Branson Sonifier 450) en hielo 6 veces por 10 seg con 10 segundos de 
reposo. El lisado se centrifugó 30 min a 15000 xg a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a 
las columnas previamente equilibradas con buffer de lisis. Una vez adicionada la 
muestra se lavó las columnas con 20 ml del buffer de lavado (50 mM NaH2PO4, 300 mM 
NaCl y 20 mM imidazol, pH 8.0). Se eluyó con 3 ml de buffer de elución (50 mM NaH2PO4, 
300 mM NaCl y 250 mM imidazol, pH 8.0). Las muestras se concentraron a ∼500 µl 
centrifugando en Amicon® Ultra-4 (Millipore) de 10 KDa de cut-off a 7500 x g 4°C por 10 
min. 
 
Cuantificación de las proteínas puras. 
La concentración de las proteínas se determinó usando reactivo de Bradford (Bio-rad) y 
albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. Para la concentración de B-HIS se realizó 
una estimación de la concentración por análisis de imagen con el programa ImageJ (NIH) 
a partir de un SDS/PAGE usando la concentración determinada 
espectrofotométricamente 
Adriana Espinosa Cantú 
 32 
 
 Actividad de las enzimas las puras. 
Las velocidades iniciales de la reacción se obtuvieron midiendo la aparición de NADPH 
(∆Abs a 340 nm) durante el primer minuto de reacción a distintas concentraciones de 
sustrato con concentraciones saturantes de cofactor ([NADP+] = 5 mM). Los ensayos 
se realizaron por triplicado (duplicado para B-HIS) en 100 µl de volumen final de buffer 
Tris-HCl 100 mM pH 9.0, NADP+ 5 mM, 0.0998 nM E-HIS, 0.196 nM B-HIS ó 0.075 nM EBE-
HIS y 0.3125, 0.46875, 0.635, 1.25, 2.5, 5, 6,5 y 8 mM de SA. Los valores de velocidad 
inicial son el resultado de las pendientes obtenidas de ∆Abs340 nm, considerando 1 min 
de tiempo de reacción, 0.1 ml de volúmen final, el coeficiente de extinción del NADP+ (ε = 
6.18 mM-1cm-1) y la longitud de la ventana de la celda (1 cm). De tal manera que la 
velocidad (v) 
 
v (min-1) = ∆Abs340 / 1 min / 6.18 mM-1 cm-1 / 1 cm / [E] mM, 
 
en donode [E] es la concentración de enzima utilizada. Los parámetros cinéticos se calcularon 
a partir de un análisis de regresión no lineal de los datos ajustándolos a la ecuación de 
Michaelis-Menten usando ENZFITTER [Leatherbarrow, 1987. 
 
Obtención de una quimera activa por la recombinación de dominios entre dos shikimato deshidrogenasas. 
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RESULTADOS 
 
CONSTRUCCIÓN DE LAS ENZIMAS QUIMÉRICAS. 
Se realizaron cuatro quimeras a partir del intercambio de dominios entre la shikimato 
deshidrogenasa de Escherichia coli (AroEEc) con la shikimato deshidrogenasa de Bacillus 
subtilis (AroEBs). Dos de las quimeras, BE (dominio N-terminal de AroEBs y C-terminal AroEEc) 
y EB (dominioN-terminal de AroEEc y C-terminal AroEBs), son resultado de la recombinación en 
un solo sitio correspondiente al primer residuo del conector; las otras dos quimeras, BEB y 
EBE, consideran la discontinuidad del domino N-terminal en las enzimas AroE y se componen 
de la recombinación en dos sitios, a partir del primer residuo del conector y del primer residuo 
de la cola, compuesta por α9 y α10 (Figura 5 y Figura 7). 
Figura 7. Sitios de recombinación

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