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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Facultad de Ciencias “Ontogenia floral comparada entre Microepidendrum subulatifolium, Barkeria uniflora, Caularthron bilamellatum y Epidendrum ciliare (Orchidaceae, Laeliinae) en el complejo de la alianza Epidendrum” T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (SISTEMÁTICA) P R E S E N T A BENJAMÍN VALENCIA NIETO TUTORA: DRA. GUADALUPE JUDITH MÁRQUEZ GUZMÁN COMITÉ TUTOR: DRA. MARÍA VICTORIA SOSA ORTEGA DRA. SONIA VÁZQUEZ SANTANA MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 4 Vmv~.DAD lIIAqO~AL AvTMHA DE MEXlC,O Dr. Isidro Ávila Martínez POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS DIVISiÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO Director General de Administración Escolar, UNAM Pr e s e nte OFICIO FCIE/DEP/382/12 ASUNTO: Oficio de Jurado Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 9 de mayo 2011 se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (SISTEMÁTICA) del (la) alumno (a) VALENCIA NIETO BENJAMíN con número de cuenta 401054170 con la tesis titulada " Ontogenia floral comparada entre Microepidendrum subulatífolium, Barkeria unlffora, Caularthron bilamellatum y Epidendrum ciliare (Orchidaceae, Laeliinae) en el complejo de la alianza Epidendrum", realizada bajo la dirección del (la) DRA. GUADALUPE JUD1TH MÁRQUEZ GUZMÁN: Presidente: Vocal: Secretario : Suplente: Suplente: ORA. MARIA VICTORIA SOSA ORTEGA M. EN C. ERNESTO AGUIRRE LEÓN DR. EDUARDO ALBERTO PEREZ GARCIA DRA. SILVIA ESPINOSA MATIAS DRA. SONIA vÁZaUEZ SANTANA Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. ,-,\p..C C-~ ..... , MCAAlMJFM/ASRI mnm __ "i:V • r.. >J ".........., " 1< Atentamente . ¡ ti~ (';.~ ' POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU' ~ m Cd. Universitaria, D.F., a 20 de agosto de ~ !1 M Cu., ~ DE~~~ Dra. Marfa del Coro Arizmendi Arriaga Coordinadora del Programa 5 AGRADECIMIENTOS Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México, por brindarme la oportunidad de realizar la Maestría en Ciencias Biológicas en el área de Sistemática, y por el apoyo económico brindado para atender el XVIII Congreso Mexicano de Botánica. Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada (CVU 294585 y no de registro del becario 225340), para la realización de este trabajo de maestría “Ontongenia floral comparada entre Microepidendrum subulatifolium, Barkeria uniflora, Caularthron bilamellatum y Epidendrum ciliare (Orchidaceae, Laeliinae) en el complejo de la alianza Epidendrum” Agradezco a los miembros de mi comité tutoral y también del jurado, a la Dra. María Victoria Sosa Ortega por todos sus consejos, recomendaciones y la fabulosa sugerencia de trabajar con Microepidendrum; también por el apoyo brindado para mejorar la parte relacionada a la taxonomía de los grupos estudiados. A la Dra. Sonia Vázquez Santana por todos sus consejos y recomendaciones, también por el apoyo brindado en las técnicas de microscopía óptica y para mejorar la parte descriptiva de la morfología. Agradezco a los miembros del jurado, a la Dra. Silvia Espinosa Matías por todos sus consejos y recomendaciones para el mejoramiento de este trabajo, y muy especialmente por todo el apoyo brindando para las observaciones y captura de imágenes realizadas a través del microscopio electrónico de barrido; por sus consejos en la parte descriptiva de la micromorfología y por echarme porras en mis momentos de estrés, cansancio y alentarme a seguir haciendo masacre de florecitas de orquídeas. Al Dr. Eduardo Alberto Pérez García por todos sus consejos y recomendaciones para el mejoramiento de este trabajo, y también muy especialmente por su amistad, por los consejos de vida y por el apoyo que me ha brindado desde la licenciatura para mejorar profesionalmente. Al M. en C. Ernesto Aguirre León por todos sus consejos y recomendaciones para el mejoramiento de este trabajo, y por compartir siempre amablemente sus conocimientos de orquídeas. Agradezco infinitamente a mi tutora la Dra. Guadalupe Judith Márquez Guzmán, “Maestra” que se le puede decir a alguien tan brillante y especial como usted, es un ejemplo a seguir tanto profesionalmente como personalmente. Usted me ha ayudado mucho a mejorar como persona, he aprendido a ser más paciente y emocionalmente inteligente; también profesionalmente me ha enseñado lo que es tener amor a lo que uno se dedica, que creo yo es lo más importante para ser exitoso en la vida. Mil gracias por aceptar y compartir el reto de estudiar y comprender mejor este extravagante, exótico y complicado mundo de las orquídeas. La quiero muchísimo¡¡ Y de nuevo gracias por decir sí para que pueda continuar haciéndome más preguntas acerca de orquídeas, como me lo planté a los 16 años cuando descubrí mi vocación en esta vida. 6 AGRADECIMIENTOS PERSONALES Primeramente agradezco a mi mamá y a mi papá por regalarme la vida y por apoyarme a lo largo de todo este proceso profesional, por soportar mi neurosis y adicción a las orquídeas, los amo. A mi amado y adorado “more” Alejando por este lustro de vida que llevamos compartiendo, su comprensión, cariño, ayuda, cuidados, enseñanzas, locura, todas sus virtudes, defectos y por toda la felicidad que me brinda. A aquellos que se fueron pero siempre están presentes en mi corazón, mi abuelo Francisco, mi tía Agustina y mi tío Mario, mis primas Lilia, Elena y mis amigos Ana y Edgar. A mi familia por todo el amor y cariño que siempre me han brindado: a Lulú y Andrés, Julieta y Brígido, a Lulita y Luis Alfonso sus retoños preciosos y súper inteligentes que quiero mucho, a Laurita, Efrén y su pequeña bebé, a Lucía y Eduardo, a Eder, a Adrianita y su retoño Max, a Carlos y Jorge, a Oliver y Tania con sus adorados latosos que quiero mucho, Chago, Rudy y “el Gordo”. A todos mis amigos, aunque por diversas circunstancias me he alejado de algunos (Kika, Lilo y …) u otros porque muchos kilómetros de distancia nos separan (Alejandra), saben que los quiero mucho son parte de mi vida, mis recuerdos y mi corazón. A mi amiga la Dra. Laurita Pliego te quiero mucho lo sabes, siempre seré tu “Guru de las orquídeas”, infinitas gracias por ayudarme siempre en todo y muy especialmente GRACIAS porque hace dos años no la hubiera contado sin ti, me ayudaste a recuperar mi salud y eso no se puede pagar con nada en la vida. A mi amigo Oscar Francke, solo te puedo decir MIL GRACIAS, eres genial¡¡, siempre me has apoyado desde que era un chamaco orquidiota, me apoyaste desde la prepa para mis proyectos de jóvenes hacia la investigación, en la carrera y ahora ya en la maestría, me ayudaste a cultivar mis Caularthron y Microepidendrum junto con todas las orquídeasque ya me vas a embargar por alquiler de espacio jajaja. Te admiro mucho como persona y como investigador, eres al igual que mi tutora un ejemplo a seguir de lo que es tener amor por lo que uno se dedica y debido a ello ser el más exitoso, tus alumnos son afortunados de tenerte como su maestro y los alacranes de que los estudies. A todos mis amigos en la Asociación Mexicana de Orquideología A.C. especialmente de la sección Atizapán: Kena, Luis, Abel, Carmen, Evelin, Ulla, Joachim, Ana María. Agradezco mucho y especialmente al Ing. Octavio Gabriel Suarez del Orquideario “la Encantada” por su apoyo para conseguir material biológico de Microepidendrum subulatifolium, por sus conocimientos y sus comentarios siempre amenos sobre las orquídeas. 7 Agradezco a Marlon Aramis González de Huimanguillo, Tabasco por la ayuda que me brindo para conseguir material biológico de Caularthron bilamellatum y las facilidades para su búsqueda en campo, así como su amistad. Agradezco muy especialmente a mis amigos guatemaltecos: el Agr. Edgar Alfredo Mo y su hermano Jaime Mo, por todas las atenciones y facilidades que me brindaron en las ocasiones que he visitado el Orquídeario Agronomía, CUNOR, USAC, Cobán, Guatemala, así como por obsequiarme material biológico de Caularthron bilamellatum. También agradezco mucho al Agr. Fredy L. Archila Morales por todas las atenciones y facilidades que me brindó en las ocasiones que he visitado la estación experimental de Orquídeas de la familia Archila en Cobán, Guatemala y por compartir sus conocimientos y comentarios de orquídeas. Al M.V. Javier Motta por todas las atenciones y facilidades que me brindó en las ocasiones que he visitado Guatemala, por su ayuda para la obtención de ejemplares de Caularthron bilamellatum, la preparación de FAA para poder conservar flores y botones de dicha especie y por la amistad que nos ha brindado. Al amigo German Padilla por todas las atenciones y facilidades que me brindó en las ocasiones que he visitado Guatemala. A todos mis amigos y compañeros del Laboratorio de Desarrollo en Plantas de la Facultad de Ciencias, UNAM; muy especialmente a los maestros Ricardo Wong, Mónica Karina Pérez y Clarita por su apoyo y consejos. A todos los maestros que tuve durante la carrera y durante la maestría, cada uno de ustedes me aportaron sus valiosos conocimientos, y ayudaron a mi formación o “deformación” como profesional. 8 A mi mamá Josefina Nieto Salazar, a mi papá Benjamín Valencia, y a mi “more” Alejandro Castañeda Sánchez, gracias por todo. 9 ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………13 1.1 Familia Orchidaceae……………………………………………………………….....................13 1.2 Clasificación taxonómica………………………………….………………………...……….....14 1.3 Tribu Epidendreae………………………………………………………………….…………...14 1.4 Subtribu Laeliinae………………………………………………………………………………15 1.5 La alianza Epidendrum………………………………………………………………………….15 II. ANTECEDENTES……………………………………………………………………………..18 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………………....19 IV. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………………..23 V. OBJETIVO……………………………………………………………………………………...24 5.1 Objetivos particulares…………….………………………………………………..…………....24 VI. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………………..25 6.1 Criterios de selección de especies clave en la alianza Epidendrum ……………………....……25 6.2 Colecta……………………………………………………………………...…………...............28 6.3 Criterios de selección de etapas….………………………...…….……………………………...29 6.4 Procesamiento del material……..………………………………………….........................…....30 6.5 Cortes anatómicos…………………………………………………………………………….....30 6.6 Microscopía electrónica de barrido……………………………………………………………..30 VII. RESULTADOS……………………………………………………………………………….32 7.1 Orden de presentación de los resultados………………………………………………………...32 7.2 Micromorfología………………………………………………………………………….......…32 7.2.1 Desarrollo de la columna y labelo………………………………………………………....32 7.2.2 Desarrollo de la antera, inflexión……………………………………………………….....34 7.2.3 Morfología de la antera ………………………………………………………...................38 7.2.4 Micromorfología de la cutícula de la epidermis de la antera……………………...............39 7.2.5 Estomas en la antera……………………………………………………….........................39 7.2.6 Caudículas………………………………………………………........................................43 7.2.7 Clinandrio y rostelo………………………………………………………..........................43 VIII. DISCUSIÓN………………………………………………………........................................49 8.1 Desarrollo de la columna y labelo…………………………………………………………....…49 8.2 La columna…………………………………………………...…………………………………50 8.3 Alas en la columna……………………………………………………………………………...51 10 8.4 Desarrollo de la antera inflexión………………………………………………………..…..51 8.5 Forma de la antera………………………………………………………...............................51 8.6 Ornamentación de la epidermis de la antera………………………………………………....52 8.7 Estomas en la antera………………………………………………………............................54 8.8 Caudículas………………………………………………………...........................................55 8.9 Clinandrio y rostelo……………………………………………………….............................56 8.10 Implicaciones filogenéticas de los caracteres del desarrollo floral…………………………57 IX. CONCLUSIONES………………………………………………………………………….59 X. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………….61 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Algunas especies de los géneros principales de la alianza Epidendrum Figura 2. Flor, labelo y columna de los géneros principales de la alianza Epidendrum Figura 3. Árbol filogenético de Laeliinae (Higgins, 2002) Figura 4. Parte del árbol de consenso de Epidendrum y géneros relacionados (Hágsater y Soto) Figura 5. Árbol de consenso de la regla del cincuenta por ciento de mayoría resultado del análisis Bayesiano de las secuencias ITS y ADN (Angulo et al., 2012) Figura 6. Árbol de consenso estricto de los cuatro árboles más parsimoniosos obtenidos de un análisis cladístico de Barkeria basado en caracteres morfológicos de (Soto-Arenas, 2005b) Figura 7. Material biológico colectado, flores y botones florales Figura 8. Desarrollo floral de la columna y labelo Figura 9. Desarrollo floral de la columna Figura 10. Inflexión de la antera Figura 11. Desarrollo de la antera Figura 12. Ornamentación estriada de la cutícula de la epidermis de la antera Figura 13. Flor en etapa de desarrollo tardía de E. ciliare, corte longitudinal de epidermis de antera Figura 14- Estomas actinocíticos en la epidermis de la parte central de las anteras Figura 15- Caudículas expuestas en el ápice de la antera al momento de la antesis Figura 16- Flor en etapa de desarrollo tardía de E. ciliare en corte longitudinal de antera Figura 17- Células del rostelo al momento de la antesis Figura 18. Morfología floral comparada de Microepidendrum subulatifolium y Alamania punicea Tabla 1. Cuadro comparativo de los caracteres en la alianza Epidendrum encontrados la presente investigación y de especies de la subtribu Laeliinae con información bibliográfica Diagrama 1. Mapeo de caracteres sinapomórficos del desarrollo floral en la alianza Epidendrum 11 RESUMEN La familia Orchidaceae exhibe una enorme diversidad morfológica, es una de las familias más numerosa de angiospermas (Dressler, 1993; Freudenstein y Rasmussen, 1999; Chase et al., 2003). Durante el siglo pasado y lo que va de este, Orchidaceae ha sido sujeta de intenso estudio taxonómico, principalmente a nivel intrafamiliar (Dressler, 1981; 1993; Chase et al., 2003). La subtribu Laeliinae ha estado sujeta a varias delimitaciones genéricas, las más recientes han sido elaboradas usando datos moleculares (van den Berg et al., 2000; van den Berg y Chase, 2004; van den Berg et al., 2009);a pesar de esto, las relaciones filogenéticas entre los grupos de la subtribu siguen sin ser resueltos, y muchos géneros dentro de Laeliinae requieren una nueva circunscripción (Chase et al., 2003; van den Berg, 2005b). Varios géneros se han agregado en alianzas. Dentro de la alianza Epidendrum están incluidas la mayor parte de las especies de la subtribu Laeliinae, los taxa hermanos al género Epidendrum son: Caularthron, Barkeria, Microepidendrum y Orleanesia (van den Berg, 2005b; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008). Microepidendrum (A. Rich. & Galeotti) W.E. Higgins es un género monotípico (Microepidendrum subulatifolium,) que ha tenido problemas de ubicación dentro y fuera de la alianza Epidendrum. Dado que en las distintas filogenias basadas en caracteres moleculares (Higgins, 2002; Higgins et al., 2003; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008; Angulo et al., 2012) Microepidendrum subulatifolium ha tenido contrastes en su ubicación y poca resolución en su relación con los otros géneros dentro de la alianza Epidendrum de la subtribu Laeliinae, se hace necesario estudiar y comparar la ontogenia floral entre algunas especies clave de los géneros Microepidendrum, Barkeria, Caularthron y Epidendrum de esta alianza. El estudio de estos géneros permitirá encontrar caracteres morfológicos informativos del desarrollo floral que permitan comprender mejor las relaciones filogenéticas entre estos géneros. Los estudios de ontogenia o desarrollo floral han demostrado ser una fuente valiosa para re-evaluar las relaciones filogenéticas de ciertos grupos de orquídeas. El objetivo de este trabajo fue describir y comparar la ontogenia de la columna (con énfasis en la antera) y el labelo, así como su grado de fusión (entre columna-labelo) de Microepidendrum subulatifolium, Barkeria uniflora, Caularthron bilamellatum y Epidendrum ciliare (Laeliinae, Orchidaceae) y discutir las posibles implicaciones de los resultados ontogenéticos sobre la ubicación de Microepidendrum subulatifolium en la alianza Epidendrum. Se colectó material biológico (flores y botones en distintas etapas del desarrollo) y se siguió la metodología de López et al. (1998) y Valencia (1998) para la observación en microscopía óptica y electrónica de barrido. Se encontraron varios caracteres distintos en M. subulatifolium (columna recta, antera con poca inflexión, forma subcúbica de la antera, ausencia de alas, estomas, caudículas, clinandrio dentado) con respecto a los encontrados en el grupo de especies formado por C. bilamellatum, B. uniflora y E. ciliare, donde se presentan varios caracteres compartidos (sinapomórficos) como lo son: la curvatura de la columna (inicialmente recta, final arqueada o ligeramente arqueada), presencia de las alas en la columna, ontogenia de la forma de la antera (inicial ovoide), ornamentación estriada muy conspicua de la cutícula de la epidermis de la pared de la antera, presencia de estomas su forma y ubicación en la antera, forma y número de caudículas, y la forma del clinandrio; estos caractéres robustecen la posición y soportan las afinidades de los géneros Caularthron, Orleanesia, Barkeria y Epidendrum dentro de la alianza Epidendrum en las hipótesis filogenéticas moleculares de van den Berg et al. (2000), Higgins (2002), Higgins et al. (2003), Hágsater y Soto-Arenas (2005a), Angulo (2008), van den Berg et al. (2009) y Angulo et al. (2012). También estos caracteres permiten considerar que la inclusión de Microepidendrum subulatifolium dentro de la alianza Epidendrum, implicaría una cantidad poco parsimoniosa de regresiones a los estados de más basales de los carácteres ontogenéticos antes mencionados soportando y robusteciendo fuertemente las hipótesis filogenéticas moleculares de Higgins (2002) y Higgins et al. (2003) en las que, Microepidendrum representa un linaje ancestral que no presenta alianzas cercanas dentro de la subtribu Laeliinae. Comparaciones someras entre M. subulatifolium y Alamania punicea dejan abierta la posibilidad de que presente afinidades con la alianza Encyclia, donde ya antes Microepidendrum había sido colocado por Dressler (1961) y Dressler y Pollard (1974) sin embargo, resulta necesario estudiar a detalle el desarrollo floral de especies clave dentro de alianza Encyclia, para poder determinar si la afinidad morfológica obedece a una cercanía filogenética o devela meramente una convergencia evolutiva. Los carácteres sinapomórficos encontrados en el desarrollo floral sirven para robustecer la posición de los géneros estudiados en las hipótesis filogenéticas moleculares de esta alianza y permiten entender la evolución de los caracteres morfológicos. Los actuales estudios filogenéticos moleculares de la familia Orchidaceae, representan el marco ideal para seleccionar especies clave y conducir sobre ellas estudios de desarrollo floral que vayan más allá de una parte meramente descriptiva. 12 ABSTRACT The Orchidaceae family is very diverse and one of the larger in numbers of species of the angiosperms, (Dressler, 1993; Freudenstein y Rasmussen, 1999; Chase et al., 2003). During the past century and in the course of the present has been subjected to an intense taxonomical study, principally at intrageneric level. (Dressler, 1981; 1993; Chase et al., 2003). Subtribe Laeliinae has been subjected to a numerous generic delimitations, recent work has been made using molecular data (van den Berg et al., 2000; van den Berg y Chase, 2004; van den Berg et al., 2009); however, the phylogenetic relations between main groups are still unsolved, and many of the genera inside Laeliinae remain with unclear location (Chase et al., 2003; van den Berg, 2005b). Many genera can be included into alliances. In Epidendrum alliance are placed most part of the species of the subtribe Laeliinae, close taxa to Epidendrum are: Caularthron, Barkeria, Microepidendrum y Orleanesia (van den Berg, 2005b; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008. Microepidendrum (A. Rich. & Galeotti) W.E. Higgins is a monotipic genus (Microepidendrum subulatifolium), which has placement problems at the outside and inside of the alliance Epidendrum. Since in the different phylogenies based on molecular characters, Microepidendrum subulatifolium has great contrasts and problems in its location in alliance Epidendrum and with others members of the Laeliinae (Higgins, 2002; Higgins et al., 2003; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008; Angulo et al., 2012), the aim of this work was to study and compare floral ontogenies with emphasis in the column and labellum between key species of Microepidendrum, Barkeria, Caularthron y Epidendrum in this alliance to find sinapomorfic characters. Scanning electron microscopy observations were conducted on Microepidendrum subulatifolium, Barkeria uniflora, Caularthron bilamellatum and Epidendrum ciliare. The images obtained from this observation allow me to find many sinapomorfic characters in the floral development. Based on the ontogenetic sinapomorfies two groups can form, one with close genera Caularthron, Barkeria and Epidendrum, this group shares actinocitic stomata in his anthers, column wings, trilobed clinandrium, similar patterns of striation of the epidermis of its anthers, initially erect column and finally arched, while Microepidendrum alone have many different forms or absence of such characters which can be considered plesiomorfic, this findings supports the phylogenetic hypothesis of Higgins (2002) y Higgins et al. (2003) in which M. subulatifolium are basal and ancestral taxa without close relationships with other genera of the subtribe Laeliinae and Epidendrum alliance. Developmental flower studies are a powerful and useful tool to reevaluate phylogenetic relations and to understand the morphological evolution of the groups. Present phylogenetic studies of the Orchidaceae family arethe ideal framework to select key species, and conduct among them ontogenetic and development studies with aims more than descriptive. 13 I. INTRODUCCIÓN 1.1 Familia Orchidaceae La familia Orchidaceae exhibe una enorme diversidad morfológica, tanto vegetativa como floral (Kurzweil, 1987). Es una de las familias más numerosa de angiospermas, estimándose entre 20 y 25 mil especies en el mundo (Dressler, 1981; 1993; Freudenstein y Rasmussen, 1999; Chase et al., 2003). Ésta familia se caracteriza por poseer flores trímeras y zigomorfas, principalmente hermafroditas, con un pétalo modificado llamado labelo. Los filamentos de los estambres y el estilo están fusionados, al menos parcialmente, formando una estructura generalmente alargada denominada columna. Los miembros de esta familia tienen una supresión de estambres en un lado de la flor; la mayoría posee un solo estambre fértil (subfamilias Orchidoideae y Epidendroideae), aunque en la subfamilia Cypripedioideae hay dos estambres fértiles y en la familia Apostasioideae puede haber dos (Apostasia) o tres estambres fértiles (Neuwidea); siendo muy relevante este carácter en la clasificación intrafamiliar de Orchidaceae. (Dressler, 1981; 1993; Arditti, 1992; Chase et al., 2003; Hágsater et al., 2005). En el extremo distal de la columna se ubica el estigma y la antera, ésta última por lo general, se encuentra asentada en un área bien definida de la columna denominada como clinandrio (Dressler, 1981; 1993; Arditti, 1992; Hágsater et al., 2005). La columna, a excepción de las orquídeas apostasiodes y algunas cypripediodes, tiene un rostelo, el cual está definido como una zona no receptiva del estigma que separa a la antera con los polinios (agregación de tétradas de polen en cuerpos más o menos sólidos) de la superficie receptiva del estigma e interviene en la dispersión de ellos. En el rostelo se encuentra el viscidio, que es una porción de naturaleza adhesiva unida al polinario (polinios más sus apéndices) que permite fijarlo al polinizador. En algunos géneros únicamente se produce una sustancia viscosa que sólo entra en contacto con los polinios mediante la intervención del polinizador siendo entonces denominado viscario (Hágsater et al., 2005). Entre los apéndices de los polinios se encuentran las caudículas, que son extensiones elásticas del polinio producidas dentro de la antera (Blackman y Yeung, 1983a; b). 14 1.2 Clasificación taxonómica Durante el siglo pasado fueron propuestas, varias clasificaciones de la familia Orchidaceae; por ejemplo, Schlechter (1926), Dressler y Dodson (1960), Garay (1960) y Dressler (1981; 1993). Estas clasificaciones reconocieron entre 3 y 6 subfamilias dentro de Orchidaceae. Recientemente Chase et al. (2003) propusieron una nueva clasificación de la familia basados en estudios filogenéticos moleculares, reconociendo 5 subfamilias: Apostasiodeae, Cypripediodeae, Vanilloideae, Epidendroideae y Orchidoideae. El reconocimiento de la subfamilia Epidendroideae se ha hecho en la mayoría de las clasificaciones de Orchidaceae, pero su circunscripción ha variado dependiendo del autor que se trate. Los caracteres morfológicos usados para determinar a los miembros de la subfamilia Epidendroideae no han sido estrictamente diagnósticos, y en el caso de usar la circunscripción de esta subfamilia basada en los análisis de ADN realizados por van den Berg (2000) y van den Berg et al. (2005), permanece el desconocimiento de una serie clara y estricta de sinapomorfías morfológicas (Chase, 2005). De acuerdo con la propuesta de Chase (2005) en Genera Orchidacearum, la subfamilia Epidendroideae se compone de 16 tribus: Tropidiae, Neottieae, Triphoreae, Gastrodieae, Xerorchideae, Nervilieae, Sobralieae, Dendrobieae, Malaxideae, Calypsoeae, Vandeae, Cymbidieae, Epidendreae, Collabieae, Arethuseae y Podochileae. 1.3 Tribu Epidendreae La tribu Epidendreae ha variado sustancialmente desde su descripción original y ha sido gradualmente delimitada (Chase et al., 2003; van den Berg, 2005a; van den Berg et al., 2005). Las investigaciones realizadas por van den Berg (2000) y van den Berg et al. (2005) con base en secuencias de genes de plástidos rbcL y matK, la región trnL-F y la región nuclear ribosomal ITS, han provisto información que ha dado como resultado la última circunscripción de la tribu, que está compuesta por entre 5 ó 6 subribus: Laeliinae, Pleurothallidinae, Ponerinae, Bletiinae, Chysinae y Coeliinae (Chase et al., 2003; van den Berg, 2005a; van den Berg et al., 2005). 15 1.4 Subtribu Laeliinae De acuerdo con van den Berg (2005b), la subtribu Laeliinae fue descrita originalmente por Bentham en 1881 y ha estado sujeta a varias modificaciones, principalmente a nivel de género. En esta subtribu, las delimitaciones de grupos más recientes han sido elaboradas usando datos moleculares (van den Berg et al., 2000; Higgins et al., 2003; van den Berg y Chase, 2004; van den Berg, 2005b; van den Berg et al., 2009). Sin embargo, a pesar de que estos trabajos moleculares generalmente aumentan la resolución o definición de los clados, las relaciones filogenéticas entre los principales grupos de la subtribu siguen sin ser resueltos, y muchos géneros dentro de Laeliinae requieren una nueva circunscripción (Chase et al., 2003; van den Berg, 2005b). No obstante, dentro de esta subtribu existen varios géneros que se han agregado en alianzas y son las siguientes: la alianza Cattleya, la alianza Epidendrum, la alianza Laelia (incluyendo Shomburgkia), la alianza Brougthonia, la alianza Scaphyglottis, la alianza Encyclia, la alianza Isabelia, Domingoa y Homalopetalum y un grupo compuesto de taxa no resueltos o que no encajan en ninguna de las alianzas mencionadas (van den Berg et al. 2000; van den Berg y Chase, 2004; van den Berg, 2005b; van den Berg et al., 2009). 1.5 La alianza Epidendrum Dentro de la alianza Epidendrum (Fig. 1A-H) están incluidas la mayor parte de las especies de la subtribu Laeliinae. El género Epidendrum (Fig. 1C y G), en sentido laxo, sigue bajo estudio para resolver la posición de sus especies y una posible segregación a nivel de géneros. Las especies del género Epidendrum se caracterizan por contar generalmente con el hábito vegetativo en forma de caña del tallo, la columna está fusionada a lo largo con el labelo formando un cunículo (Fig. 2D) y tienen dos o cuatro polinios (Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; van den Berg, 2005b; van den Berg et al., 2009). En la alianza Epidendrum, los taxa hermanos al género Epidendrum son: Caularthron (Fig. 1A y E), Barkeria (Fig. 1B y F), Microepidendrum (Fig. 1D y H) y Orleanesia (van den Berg, 2005b; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008). 16 En estos géneros, el labelo está libre en Caularthron (Fig. 2A) o solamente adpreso desde la base de la columna como en Barkeria (Fig. 2B), a diferencia de Microepidendrum donde se encuentra parcialmente fusionado (Fig. 2C) y de Epidendrum, donde el labelo está completamente fusionado con la columna (Fig. 2D). No obstante la variación en el carácter “columna-labelo” en la alianza, el hábito de crecimiento y arquitectura vegetal de los géneros Caularthron, Barkeria y Microepidendrum, tienen más parecido al que presenta Epidendrum y cuentan también con cuatro polinios (van den Berg, 2005b; Hágsater y Soto, 2005a; Angulo, 2008). Es importante mencionar que Epidendrum y sus géneros aliados pudieron experimentar una diversificación temprana en México y América Central, ya que todos los grupos formados en esta alianza excepto Orleanesia, son encontrados en esta área geográfica (Hágsater y Soto-Arenas, 2005a). También porque estos mismos géneros, están posicionados en los nodos más basales de las filogenias elaboradas por van den Berg (2005b); Hágsater y Soto-Arenas (2005a).17 Figura 1. Algunas especies de los géneros principales de la alianza Epidendrum. A: Flor de Caularthron bilamellatum (Rchb. F.) R. E. Shultes. B: Flores de Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb. C: Flores de Epidendrum ciliare L. D: Flor de Microepidendrum subulatifolium (A. Rich. & Galeotti) W.E. Higgins. E: Planta de Caularthron bilamellatum. F: Planta de Barkeria uniflora. G: Planta de Epidendrum ciliare. H: Planta de Microepidendrum subulatifolium. (Imágenes del autor). Figura 2. Flor, labelo y columna de los géneros principales de la alianza Epidendrum. A: Caularthron bilamellatum, labelo libre. B: Barkeria uniflora, labelo adpreso a lo largo de la columna, sin fusión. C: Microepidendrum subulatifolium, labelo fusionado parcialmente con la columna. D: Epidendrum ciliare, labelo fusionado con la columna formando un cunículo. Ilustraciones botánicas de Jiménez- Machorro R. 18 II. ANTECEDENTES Microepidendrum (A. Rich. & Galeotti) W.E. Higgins es un género monotípico (Microepidendrum subulatifolium, Fig. 1D y H; Fig. 2C) que ha tenido problemas de ubicación dentro de la alianza Epidendrum. Fue descrito originalmente como Epidendrum subulatifolium por A. Rich. y Galeotii, posteriormente fue transferido por Dressler (1961) y Dressler y Pollard (1974) a Encyclia subgen. Encyclia sect. Leptophyllum (Soto-Arenas, 2005a). Higgins (2002; 2006) y Higgins et al. (2003) con base en un análisis cladístico morfológico y en un análisis cladístico de las regiones de ADN nuclear ITS, así como de los genes plástidos matK y trnL-F concluyen que Epidendrum subulatifolium no forma parte del género Epidendrum, ni del género Encyclia, y validan el género Microepidendrum como monotípico concluyendo que representa un linaje ancestral que no tiene alianzas cercanas dentro de la subtribu Laeliinae (Fig. 3). Hágsater y Soto-Arenas (2005a) en un análisis cladístico, resultado de una matriz combinada de las secuencias ITS y el gene matK en Epidendrum (Fig. 4), muestran que Microepidendrum es un miembro de la alianza Epidendrum y que es un grupo hermano a Barkeria (sin soporte boostrap). Las relaciones del clado formado por Barkeria y Microepidendrum muestran una relación con el otro clado formado por Orleanesia, Caularthron y Epidendrum. Angulo (2008) en el análisis filogenético del género Barkeria, encontró que en los análisis de parsimonia combinados de ADN cloroplásmico en el 46% de los árboles más parsimoniosos, Microepidendrum subulatifolium junto con Epidendrum centropetalum aparecen en un subclado, en un grupo hermano a los taxa remanentes en la alianza Epidendrum. En el otro 54% de los árboles, Microepidendrum resulta como un taxón hermano a 11 especies dentro de la alianza Epidendrum. Angulo et al. (2012) encontraron en el análisis bayesiano en el árbol de consenso estricto de la regla del cincuenta por ciento (de las regiones ITS más ADN cloroplásmico) que Microepidendrum subulatifolium forma un clado hermano al género Barkeria y a su vez forman un clado hermano a 19 Caularthron, Orleanesia y Epidendrum (Fig. 5). Esto último concuerda con lo encontrado por Hágsater y Soto-Arenas (2005a) en su análisis cladístico y a la afinidad propuesta por Baker (1972) entre estos géneros, basado en un estudio anatómico de las hojas de los miembros de la subtribu Epidendreae. III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Dado que en las distintas filogenias basadas en caracteres moleculares (Higgins, 2002; Higgins et al., 2003; Hágsater y Soto-Arenas, 2005a; Angulo, 2008; Angulo et al., 2012) Microepidendrum subulatifolium ha tenido grandes contrastes en su ubicación y poca resolución en su relación con los otros géneros dentro de la alianza Epidendrum de la subtribu Laeliinae, se hace necesario estudiar y comparar la ontogenia floral entre algunas especies clave de los géneros Microepidendrum, Barkeria, Caularthron y Epidendrum de esta alianza. El estudio de estos géneros permitirá encontrar caracteres morfológicos informativos del desarrollo floral que permitan a su vez comprender mejor las relaciones filogenéticas entre estos géneros. 20 Figura 3. Árbol filogenético de Laeliinae, tomado de Higgins (2002). El recuadro negro señala la posición de Microepidendrum subulatifolium como un linaje ancestral que no presenta alianzas cercanas dentro de la subtribu Laeliinae, y se encuentra distante de los géneros en la alianza Epidendrum (Orleanesia y Epidendrum; recuadro punteado). 102 RostflJ~ ophiocephiJJa PlOOrolJ)sM's fscemíf10ra • •• POfIOnt ~tn'Dl" 100 62 I8OChKtJ.s maJar EpkJolt(Jrunl ~I$O EpJdsndrvm cooops8tNrJ Otle8l1&SJe amszonica OrleanssJa pteurostaCilys 12 MyrmecophHa rl'blcírNs '" 21 Loe(i" rtJtte.scen.:s 100 .. ~""'_. 2 MCNltCyJ.Yum t'Krb$UhJm Ene ......... "" AlamaniB pufliCea Enc)'Cfm son$l/ lMo 8rlJs.sfNda CiJaJtr~il 10 Scph¡onitis oomUiiI $cph¡oo1(¡S purpur.Jla 42 C .. Wloyit Iotbt}$Ü 100 90 la CiJltl6ya dorlJiNl<J RtlyndlOl8eJJa gtalJC8 2' A./1orifmI CH1IboX'O~ Oimer8fldlB ema'!jWl8t8 Sc&pI1yg1ours pu~{J Hf».908smHJ CItJI'I99i8 HeJdsea utlbrlc8ta .. Rex;hBnbachilnlh~ oonIGuJarus 80 _lo """"'" 6J Jar:qUlflr. 19n1tlfolriJ Md6m8_ lB ~ POfybltJ6on 100 17 OS 1I Dlooma poJ)tOlJIbon 100 2 Hag.s8!fNa br'8Chyc:oluml'18 Psycltlo,s rrtOCOfIne.Wae PSychlns klfJgJJ TEKfamltTiJ fÑ9giNlS 100 OuIsooeya e.I<m8i1iJ • 1110 Btoophtoni, ~sis Laeftop.sis OOmi'IQ6ilsis C.'lfl'.IOyap$I$ ,Iit)dc)rtu 17 Homo.lo9f;tltJ.lum pamiOO % tJom>1g08 oo®sa DomJl1t7OlI KiOtl,,$IÑ 56 ' .... umsu 8" 11m 1110 50 MkrMPitkndrum ~ubul(j tjfo/;um 11. eocogt'll8UKliJ Qr "'. 21 Figura 4. Parte del árbol de consenso estricto de 9900 árboles más parsimoniosos obtenido del análisis combinado de la matriz de secuencias ITS y matK de Epidendrum y géneros relacionados, tomado de Hágsater y Soto-Arenas (2005a). El recuadro señala la posición de Microepidendrum subulatifolium con respecto a la alianza Epidendrum y en esta hipótesis filogenética se encuentra como grupo hermano de Barkeria y a su vez forma con ella un clado hermano a Caularthron y Orleanesia. 22 Figura 5. Árbol de consenso de la regla del cincuenta por ciento de mayoría resultado del análisis Bayesiano de las secuencias ITS y ADN de cloroplasto combinados matK, rpl32-trnL, trnL-F IGS (los números debajo de las ramas indican las probabilidades posteriores), tomado de Angulo et al., 2012. El recuadro señala la posición de Microepidendrum subulatifolium con respecto a los géneros de la alianza Epidendrum. Al igual que en la hipótesis filogenética propuesta por Hágsater y Soto-Arenas (2005a) Microepidendrum se encuentra como grupo hermano de Barkeria y a su vez estos forman un clado hermano a Orleanesia, Caularthron y Epidendrum. Las flechas señalan la posición de Barkeria uniflora. 23 IV. JUSTIFICACIÓN Los estudios de ontogenia o desarrollo floral han demostrado ser una fuente valiosa para re- evaluar las relaciones filogenéticas de ciertos grupos de orquídeas. Ejemplo de ello es el elaborado por Kurzweil (1987) para describir la ontogenia general de las orquídeas epidendroides y vandoides; el de Freudenstein y Rassmusen (1996) para definir el número de polinios y la polaridad de este carácter en tres subfamilias de Orchidaceae; el de Kocyan y Endress (2001) donde estudian desarrollo de caracteres de las flores en el grupo basal de orquídeas apostasioides, o el de Freudenstein et al. (2002) para definir y polarizar los estados de carácter de la antera incumbente en el complejo Vandoide dentro de la subfamilia Epidendroideae. Van den Berg et al. (2005)mencionan que los estudios anatómicos-florales y de desarrollo previos dentro de la tribu Epidendreae y subtribu Laeliinae, eran meramente descriptivos y no estaban enfocados en los taxa clave propuestos por las nuevas hipótesis filogenéticas basadas en ADN. Esto conduce a realizar nuevos estudios anatómicos y de desarrollo floral enfocados en los taxa clave, que tengan como objetivo servir como punto de partida para explicar la evolución morfológica y los patrones de diversificación (van den Berg et al., 2009), así como también para refinar el marcaje de los estados de carácter que puedan complementar los análisis cladísticos combinados (ADN más morfología). En este estudio en particular, los datos de la ontogenia floral que se obtengan principalmente de las fusiones entre la columna y el labelo (Fig. 2) así como los caracteres de la antera en los géneros de la alianza Epidendrum, permitirán hacer una mejor interpretación sobre la evolución morfológica y sobre la polaridad de los caracteres; del mismo modo, se podrán establecer los estados de carácter útiles que permitan esclarecer y establecer la posición de Microepidendrum subulatifolium con respecto a los géneros Barkeria o Epidendrum en las actuales hipótesis filogenéticas de la alianza Epidendrum. 24 V. OBJETIVO Describir y comparar la ontogenia de la columna (con énfasis en la antera) y el labelo, así como su grado de fusión (entre columna-labelo) de Microepidendrum subulatifolium (A. Rich. & Galeotti) W.E. Higgins, Barkeria uniflora (La Llave & Lex.) Dressler & Halb, Caularthron bilamellatum (Rchb. F.) R. E. Shultes y Epidendrum ciliare L. (Laeliinae, Orchidaceae)*. 5.1 Objetivos particulares 5.1.1 Describir el desarrollo de la columna, labelo y su grado de fusión en Microepidendrum subulatifolium, Barkeria uniflora, Caularthron bilamellatum y Epidendrum ciliare. 5.1.2 Comparar el desarrollo de la columna y labelo de Microepidendrum subulatifolium con las demás especies de este trabajo y con especies de la subtribu Laeliinae de las que se cuente con información. 5.1.3 Discutir las posibles implicaciones de los resultados ontogenéticos sobre la ubicación de Microepidendrum subulatifolium en la alianza Epidendrum. *Ver metodología para los criterios de selección de las especies. 25 VI. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 Criterios de selección de especies clave en la alianza Epidendrum utilizadas en esta investigación En la filogenia de Soto-Arenas (2005a; b. Fig. 4; Fig. 6), Barkeria dorotheae representa el linaje hermano al resto de las todas las especies de Barkeria. Por ser más ancestral B. dorotheae sería una especie apropiada para comparar con Microepidendrum subulatifolium, debido a que presenta el menor número de autopomorfías del género Barkeria y probablemente una mayor cantidad de caracteres ancestrales (plesiomórficos) en su ontogenia; sin embargo, esta especie está amenazada (NOM-059-Ecol-2001, NOM-059-SEMARNAT-2010) y restringida a un área pequeña, es rara en colecciones biológicas y privadas por lo que es sumamente difícil la obtención de suficiente material biológico y no fue utilizada para este estudio. Barkeria uniflora, por otra parte, se encuentra entre los linajes más basales de las filogenias mencionadas y comparte el hábito cespitoso con Microepidendrum subulatifolium, éste hábito vegetativo no se encuentra en ninguna de las especies del clado B de la filogenia de Angulo (2008), ni en las especies del tercer clado de la filogenia de Soto-Arenas (2005b); por lo antes expuesto, Barkeria uniflora es la especie seleccionada para el estudio de su desarrollo floral. El género Caularthron comprende tres especies distribuidas desde México a través de Centroamérica, el Caribe, Ecuador hasta la Amazonia. El hábito vegetativo de Caularthron recuerda al de las especies con tallo en forma de caña de Epidendrum, pero sólo con las hojas terminales permanentes, el tallo es hinchado, hueco y ocupado por hormigas (mirmecofilia). Las flores de Caularthron tienen más afinidad con el género Barkeria debido a que presentan unas alas anchas extendidas a lo largo de la columna, tienen el rostelo de forma similar, es decir con forma de lengua y carente de viscidio, solo presentan viscario (van den Berg, 2005c). Caularthron bilamellatum (Fig. 1A y E; Fig. 2A) es la única especie del género que se distribuye en México, en el estado de Chiapas (Hágsater et al., 2005) por lo que fue seleccionada para el presente estudio. 26 El género Orleanesia fue excluido de este estudio a pesar de formar parte de la alianza Epidendrum, debido a que las 10 especies que lo conforman se distribuyen en Sudamérica y no fue posible conseguir material biológico. El género Epidendrum ha sido sujeto de una intensa delimitación genérica, la clasificación infragenérica más formal es propuesta por Hágsater y Soto-Arenas (2005a, b) como resultado de un análisis combinado de datos moleculares y morfológicos (Fig. 4). Se llevará a cabo el estudio del desarrollo floral de Epidendrum ciliare por su proximidad al género Barkeria en el estudio filogenético de van den Berg (2005b) y su proximidad a Microepidendrum subulatifolium en el estudio filogenético de Angulo (2008). 27 Figura 6. Árbol de consenso estricto de los cuatro árboles más parsimoniosos obtenidos de un análisis cladístico de Barkeria basado en caracteres morfológicos, tomado de Soto-Árenas (2005b). La flecha señala la posición de Barkeria uniflora. 28 6.2 Colecta Se colectó en campo y de colecciones vivas, botones florales en distintas etapas de desarrollo y flores en antesis (Fig. 7A-D) de las siguientes especies: Caularthron bilamellatum, el material biológico procedía de la colección viva del Orquídeario Agronomía, CUNOR, USAC, Cobán, Guatemala y de una planta en cultivo originalmente colectada cerca del Rio Mezcalapa en el Municipio de Huimanguillo, Tabasco. Microepidendrum subulatifolium, el material biológico procede de la colección viva del Orquídario “La Encantada” (UMA), San Andrés Huayapam, Oaxaca. Barkeria uniflora, el material biológico fue colectado en Nuevo Santo Tomás de los Plátanos, Estado de México a un km y medio sobre el camino de terracería pasando la desviación a las pinturas rupestres de dicha localidad, al llegar a una bifurcación a ambos lados del camino pueden observarse un número considerable de individuos de Barkeria uniflora creciendo sobre los árboles. También se encontraron ejemplares creciendo sobre lianas leñosas ubicadas a distintos niveles del sustrato arbóreo. El tipo de vegetación predominante en la zona es selva baja caducifolia y en las paredes de la cañada norte se pueden observar árboles de amate, cactos columnares y agaves. Epidendrum ciliare, el material biológico procede de una planta en cultivo originalmente colectada por el Dr. Oscar Francke en Tierra Colorada, Guerrero entre Chilpancingo y Acapulco, por los túneles de la autopista del sol, en una zona con vegetación mixta de pino-encino a 1600 msnm. Y de una planta en cultivo que procede de la zona del municipio de Ixhuatlancillo, Veracruz. Los ejemplares de respaldo para herbario se encuentran en preparación. 29 6.3 Criterios de selección de etapas del desarrollo: Debido a la disparidad de tamaño de las flores y botones de las especies estudiadas (E. ciliare tiene flores de 7 cm; B. uniflora de 4 cm; C. bilamellatum con flores de 3 cm y M. subulatifolium tiene flores de 0.7 cm) no se pudo utilizar un criterio de longitud para estimar las etapas de desarrollo estándar para las 4 especies, es decir, un criterio estrictamente basado en tamaño (cm) para la selección de las etapas del desarrollo.Para cada especie en particular, tomando en cuenta el tamaño de sus flores en antesis se utilizó de forma visual el tamaño, y se establecieron tres etapas del desarrollo de la siguiente manera, etapas tardías o maduras del desarrollo: flores en antesis y botones subsecuentes a estas en la inflorescencia de tamaño grande y preantéticos; etapas intermedias o medias: compuestas por los botones en la parte media de la inflorescencia, sin desarrollo completo; por último, las etapas tempranas del desarrollo: compuestas por los botones en la parte apical de la inflorescencia que presentaban las tallas menores (muy pequeñas). De tal manera, hay tres etapas de desarrollo de Figura 7. Material biológico colectado, flores y botones florales. A: Caularthron bilamellatum. B: Barkeria uniflora. C: Epidendrum ciliare. D: Microepidendrum subulatifolium. 30 acuerdo a la posición de las flores en antesis o los botones florales en la inflorescencia: temprana, media y tardía. 6.4 Procesamiento del material Fijación: El material biológico colectado se fijó en FAA (formol, ácido acético glacial, etanol 96º y agua, 10 : 5 : 50 : 35; López et al., 1998) durante tres semanas. Deshidratación: Posteriormente el material se deshidrató en una serie gradual de diluciones de etanol en los siguientes porcentajes 30%, 50%, 70%, 85%, 96%, 100% y 100% durante una hora y quince minutos por cada concentración (Valencia, 2008). Inclusión en parafina: Los botones florales deshidratados y seleccionados para cortes anatómicos, se transfirieron a una mezcla de xilol-paraplast 1:1 y en paraplast puro, durante 24 horas respectivamente dentro de una estufa a una temperatura de entre 58° C- 65° C; (Valencia, 2008). Una vez que el tejido estuvo infiltrado en paraplast puro se incluyó con la ayuda de cubos metálicos con la orientación requerida. 6. 5 Cortes anatómicos Los bloques de paraplast conteniendo el material biológico fueron cortados en un microtomo de rotación a 8 μm de grosor; las secciones obtenidas se adhirieron al portaobjetos, se desparafinaron y luego se llevó a cabo la tinción doble de safranina-verde rápido en metilcelosolve (López et al., 1998). Las laminillas se observaron en un microscopio fotónico Leica DM 500 y se tomaron fotografías con una cámara digital Canon PowerShot A620. 6.6 Microscopía electrónica de barrido Para observar el desarrollo de la columna en los botones y flores en diferentes etapas del desarrollo se retiraron los sépalos y pétalos, excepto el labelo observado en primera instancia y posteriormente removido para observar los caracteres presentes en la columna. El material fijado en FAA, disectado, y posteriormente deshidratado se secó a punto crítico en una desecadora CPD-030 Bal-tec. El material desecado fue montado y recubierto con una delgada capa de oro en una 31 ionizadora Denton Vacuum Desk II. Las muestras se observaron en el microscopio electrónico de barrido Jeol JSM5310 LV y se realizó el registro fotográfico. Calculo de grados de inflexión de la antera: La medición se llevo a cabo por medio del uso de un transportador en las fotografías resultado de la microscopía electrónica de barrido de las anteras en vista lateral. Se tomó como referencia para la medición con el transportador la base el clinandrio y el ápice de la antera para medir el grado de inflexión de la antera. 32 VII. RESULTADOS 7.1 Orden de presentación de los resultados Los resultados se presentan primero describiendo los hallazgos obtenidos en cada estructura (columna, labelo, antera, etc.) durante cada una de las etapas del desarrollo (tempranas, intermedias y tardías), y se compararon entre las especies estudiadas. El orden de presentación y comparación de las especies será siempre: Caularthron bilamellatum, Barkeria uniflora, Epidendrum ciliare y Microepidendrum subulatifolium. 7.2 Micromorfologia 7.2.1 Desarrollo de la columna y labelo Etapas de desarrollo tempranas: En Caularthron bilamellatum el labelo se observa libre de longitud igual a la columna y antera juntas; la columna y la antera tienen la misma longitud, en la base del labelo se observan los primordios de las dos protuberancias que caracterizan a esta estructura; por arriba de estas protuberancias el labelo se ensancha y posteriormente forma un ápice agudo (Fig. 8A). En Barkeria uniflora, Epidendrum ciliare y Microepidendrum subulatifolium, desde las primeras etapas el labelo, es trilobulado y está completamente fusionado en E. ciliare, y parcialmente fusionado en M. subulatifolium. En E. ciliare envuelve completamente a la antera y a gran parte de la columna, para su observación, fue necesario remover el ápice envolvente del labelo (Fig. 8B-D, G, H). En C. bilamellatum se observa que la columna y antera tienen la misma longitud (Fig. 8A; Fig. 9A) al igual que en B. uniflora (Fig. 8B). A diferencia de las especies anteriores en E. ciliare la columna se observa más larga que la antera y el clinandrio está más desarrollado (Fig. 8C; Fig. 9C), mientras que en M. subulatifolium, la columna se observa de menor longitud con respecto a la antera y muy poco desarrollada (Fig. 8D; Fig. 9D). Etapas de desarrollo intermedias: En C. bilamellatum el labelo libre se ha alargado, su ápice sobrepasa a la antera y en su base las dos protuberancias también han crecido haciéndose notablemente visibles (Fig. 8E); en B. uniflora el labelo también se ha alargado, se observa unido a la base de la columna y adpreso a lo largo de ella (Fig. 8F). La columna de ambas especies C. 33 bilamellatum y B. uniflora) también se ha desarrollado a lo ancho, principalmente en la parte media donde comienzan a insinuarse las extensiones de tejido o alas que son características en ambos géneros. Una vez que el labelo se ha alargado la antera ahora es solo una porción pequeña de la parte apical (Fig. 8E y F; Fig. 9E y F). En E. ciliare la columna ha crecido profusamente tanto longitudinalmente como en su anchura (principalmente en su parte media y apical Fig. 8G; Fig. 9G), los lóbulos apicales y laterales del labelo se encuentran fusionados a todo lo largo (Fig. 9C y G) y envuelven completamente a la parte apical de columna; se observan muy desarrollados mostrando para esta etapa las fimbrias características de la especie (Fig. 8G). En M. subulatifolium la columna se ha desarrollado y se observa de la misma longitud que la antera (como C. bilamellatum y B. uniflora en sus primeras etapas Fig. 8H: Fig. 9H), en el ápice de la columna se observa el clinandrio, su forma asemeja un diente visto por la parte lateral, mientras que el labelo permanece parcialmente fusionado a la columna y envolviendo la parte apical de la antera (Fig. 8H; Fig. 10H). Etapas de desarrollo tardías: En C. bilamellatum durante las etapas tardías la columna se ha arqueado en su parte media, a esta misma altura, en sus flancos laterales, las alas se encuentran completamente extendidas y desarrolladas. En la parte apical de la columna el clinandrio está bien desarrollado. Al momento de la antesis la parte ventral de la columna esta aplanada y el labelo continua libre, tiene casi el doble de longitud que la columna, sus protuberancias se encuentran muy desarrolladas y están por debajo de la altura de la antera (Fig. 8I). En B. uniflora la columna se ha alargado, aplanado y arqueado ligeramente en su parte ventral, en sus flancos laterales se encuentran completamente desarrolladas las alas y en su parte apical el clinandrio (Fig. 8J; Fig. 9J). En E. ciliare para observar las etapas tardías del desarrollo de la columna fue necesario disectar el labelo trilobulado completamente desarrollado. El lóbulo medio sobresale como una proyección aguda y los laterales son fimbriados. La columna se ha arqueado ligeramente y muestra en la parte apical un prominente clinandriofimbriado, el cual envuelve dos terceras partes de la antera (Fig. 8K; Fig. 9K). En M. subulatifolium, la columna se ha alargado ligeramente y en su ápice se observa 34 al clinandrio, con sus protuberancias en forma de diente y por encima de este la antera. Al momento de la antesis, el labelo que continua parcialmente fusionado a la columna (Fig. 8L; Fig. 9L) se ha extendido, presenta tres quillas la parte media y su ápice es agudo (Fig. 8L). 7.2.2 Desarrollo de antera: Inflexión (Incumbent anthers) Etapas de desarrollo tempranas: En C. bilamellatum, B. uniflora, E. ciliare y M. subulatifolium, la antera inicia su diferenciación siendo una estructura erecta (Fig. 10A, B y D; Fig. 9C; Tabla 1). Etapas de desarrollo intermedias: Durante estas etapas la antera de C. bilamellatum tiene una inflexión aproximadamente 80° de su posición inicial (Fig. 10E), en B. uniflora la inflexión tiene 115° de su posición inicial (Fig. 10F) y en E. ciliare la inflexión tiene 90° de su posición inicial (Fig. 10G). En M. subulatifolium no se observa inflexión. Etapas tardías: En la antesis la antera tiene una inflexión de su posición inicial, en C. bilamellatum 90° (Fig. 10I), en B. uniflora y E. ciliare 170° (Fig. 10J y K) y en M. subulatifolium casi 45° (Fig. 10L. Tabla 1). 35 Figura 8. Desarrollo floral de la columna y labelo en vista lateral (excepto D) de Caularthron bilamellatum (A, E, I), Barkeria uniflora (B, F, J), Epidendrum ciliare (C, G, K) y Microepidendrum subulatifolium (D, H, L). A: Etapa temprana, antera y columna erectas con igual longitud, labelo libre desde la base (flecha punteada) y dos protuberancias (flecha blanca). B: Etapa temprana, antera y columna erectas con igual longitud, labelo retirado, pero unido a la base y libre adpreso a todo lo largo con la columna (como F). C: Etapa temprana, columna más desarrollada que antera, labelo trilobular envolviendo a la columna (removidos los lóbulos laterales, sus restos señalado por flecha blanca). D: Etapa temprana, columna poco desarrollada en longitud, (lóbulos de antera perdidos en el procesamiento del material). E: Desarrollo longitudinal de la columna, ensanchamiento y arqueo ligero en parte media, labelo libre desde base (flecha punteada), protuberancias parte media (flecha), antera inicia inflexión. F: Desarrollo longitudinal de la columna, ensanchamiento y arqueo muy ligero, labelo unido en base (flecha punteada), adpreso a lo largo (flecha blanca), antera inicia inflexión. G: Columna muy elongada, vista solo la parte apical del botón, lóbulos laterales del labelo envolviéndola y desarrollando fimbrias características. H: Columna ligeramente elongada, mismo tamaño que antera ambas erectas, labelo envolviendo punta. I: Etapa tardía, elongación de columna, arqueada en parte media, labelo libre con el doble tamaño que antes protuberancia marcada (flecha punteada), antera con gran inflexión. J: Etapa tardía, elongación, adelgazamiento y aplanamiento ventral de la columna, ligeramente arqueada, labelo libre adpreso (flechas blancas) antera con una notable inflexión. K: Etapa tardía, columna muy desarrollada alargada y ensanchada en la punta, clinandrio prominente envuelve por completo antera con una notable inflexión. L: Etapa tardía, labelo extendido con tres quillas, fusionado en la parte media de la columna, antera con poca inflexión. Barras de referencia: A-L (excepto D, K) = 1 mm. D y K = 100 µm. Aumento: A-C, E-J = 15X; D = 75X y K = 35X an = antera; cl = columna; cln = clinandrio lb = labelo; lblm = lóbulo medio del labelo; ro = rostelo; sp = sépalo. 36 Figura 9. Desarrollo floral de la columna en vista ventral (excepto B) de Caularthron bilamellatum (A, E, I), Barkeria uniflora (B, F, J), Epidendrum ciliare (C, G, K) y Microepidendrum subulatifolium (D, H, L). A: Etapa temprana, antera y columna erectas con igual longitud, (labelo retirado). B: Etapa temprana, antera y columna erectas con igual longitud, labelo retirado pero unido a la base y libre adpreso a todo lo largo con la columna (como F). C: Etapa temprana, columna más desarrollada que antera, labelo trilobular (removidos todos los lóbulos, los restos de la fusión del labelo con la toda columna señalados con flechas blancas), antera erecta con ápice pronunciado. D: Etapa temprana, columna poco desarrollada en longitud, antera de mayor tamaño. E: Desarrollo longitudinal de la columna, ligeramente arqueada en parte media. F: Desarrollo longitudinal de la columna, ensanchamiento y ligeramente arqueada, labelo unido en base y adpreso a lo largo, antera inicia inflexión. G: Columna muy elongada, vista solo la parte media y apical del botón, labelo parcialmente retirado, los lóbulos laterales del labelo fusionados con la columna y envolviéndola (flecha blanca, se observan restos de donde se encuentran unidos ambos tejidos), antera en proceso de inflexión. H: Columna ligeramente elongada, mismo tamaño que antera ambas erectas, labelo envolviendo punta. I: Etapa tardía, columna muy elongada, aplanada ventralmente, con presencia de alas en sus flancos laterales y arqueada en su parte media-apical, antera con inflexión. J: Etapa tardía, columna muy elongada, aplanada ventralmente, con presencia de alas en sus flancos laterales y muy ligeramente aqueada en su parte media-apical, el labelo libre adpreso y antera con notable inflexión. K: Etapa tardía, columna muy desarrollada (solo se observa la parte apical), alargada y ensanchada en la punta, clinandrio prominente que envuelve por completo la antera con notable inflexión. L: Etapa tardía, labelo fusionado en la parte media de la columna, antera con poca inflexión. Barras de referencia: A-C, E-G, I, J y L = 1 mm. D, H y K = 100 µm. Aumento: A-C, E-G, I, J y L = 15X; D = 100X y H, K = 35X al = alas en la columna; an = antera; cl = columna; cln = clinandrio; es = estigma; lb = labelo; lbl = lóbulo lateral del labelo; lblm = lóbulo medio del labelo; ro = rostelo. 37 Figura 10. Inflexión de la antera (en vista lateral excepto D), en el desarrollo floral de de Caularthron bilamellatum (A, E, I), Barkeria uniflora (B, F, J), Epidendrum ciliare (C, G, K) y Microepidendrum subulatifolium (D, H, L). A: Etapa temprana, antera erecta, ovoide con ápice muy pronunciado (forma de gota, asterisco). B: Etapa temprana, antera erecta, ovoide con ápice pronunciado (forma de gota, asterisco), róstelo en desarrollo. C: Etapa temprana, antera ovoide ya en inflexión de cerca de 45° (asterisco, en la Figura 9D se aprecia que inicia erecta con forma ovoide y el ápice pronunciado como en A y B), róstelo y clinandrio aserrado en desarrollo. D: Etapa temprana, antera erecta y redonda, sin ápice; inicio de diferenciación de róstelo en la parte apical de la columna. E: Etapa intermedia, antera en inflexión de cerca de 80° (asterisco señala el ápice). Lóbulo medio del clinandrio más desarrollado. F: Etapa intermedia, antera en inflexión de cerca de 115° (asterisco señala el ápice). Lóbulo medio del clinandrio más desarrollado. G: Etapa intermedia, antera en inflexión de cerca de 90°. Clinandrio cubriendo más de la mitad de la antera, aserrado. H: Etapa intermedia, labelo envolviendo columna y antera, la mitad apreciable de esta no presenta inflexión. Margen lateral del clinandrio dentado. I: Etapa tardía, antera inflexión de 90° (asterisco señala el ápice). Lóbulo medio del clinandrio desarrollado como solapa. J: Etapa tardía, antera en inflexión de 170° (asterisco señala el ápice). Lóbulo medio del clinandrio prominente, desarrollado como solapa, lóbulos laterales conspicuos. K: Etapa tardía, antera en inflexión 170° (asterisco señala el ápice). Lóbulo medio clinandrio prominente, fimbriado en el ápice cubriendo tres cuartas partes de la antera. L: tardía, antera ligeramente en inflexión cerca de 45° (asterisco señala el ápice), margenlateral del clinandrio con un diente poco conspicuo. Barras de referencia: A-L (excepto H) = 100 µm. H = 1 mm. Aumento: A, B, E, F, I, y J = 50X; D = 100X; C y K = 35X; G y L =75X; H = 15X an = antera; cl = columna; cln = clinandrio; lb = labelo; ro = rostelo. 38 7.2.3 Morfología de la antera Etapas de desarrollo tempranas: C. bilamellatum y B. uniflora comparten la forma de la antera erecta ovada, bilobulada, cada lóbulo de forma ovoide y el ápice es muy agudo, terminando en punta semejando una gota. (Fig. 11A y B); en Epidendrum ciliare la antera erecta es de forma ovoide, bilobulada, con el ápice bifurcado (Fig. 11C) y en M. subulatifolium la antera erecta es de forma obovada subcúbica sin ápice (Fig. 11D). En una subsecuente etapa, en C. bilamellatum la antera continua erecta pero ahora es de forma más redonda, los dos lóbulos semejan la forma de los gajos de una naranja; el ápice se ha ensanchado y es menos agudo (Fig. 11E). En B. uniflora la antera con inflexión de 90° respecto a su posición inicial, se observa bilobulada, cada lóbulo (en posición horizontal) tiene forma ovoide (Fig. 11F). En E. ciliare la antera bilobulada se observa con poca inflexión (menos de 45° de su posición inicial), tiene forma esférica y el ápice es bifurcado, cada lóbulo semeja la forma de los gajos de una naranja (Fig. 11G); en M. subulatifolium, la antera erecta conserva su forma obovada bilobulada, cada lóbulo tiene forma ovoide y presenta una elongación de tejido en su parte cercana al ápice (Fig. 11H). Etapas del desarrollo intermedias: En C. bilamellatum la antera esta aún erecta, con forma esférica y con dos lóbulos semejando la forma de los gajos de una naranja (Fig. 11I). En B. uniflora la antera con inflexión de 115° respecto a su posición inicial, se observa alargada, aplanada sobre si misma hacia la columna (Fig. 11J). En E. ciliare la antera con inflexión de 60° respecto a su posición inicial, tiene forma convexa en el dorso y aplanada ventralmente, el ápice permanece bifurcado (Fig. 11K); en M. subulatifolium la antera bilobulada tiene forma obovada subcúbica, con una elongación de tejido en la parte media cercana al ápice (Fig. 11L). Etapas de desarrollo tardías: Al momento de la antesis, la antera de C. bilamellatum con inflexión de 90° respecto a su posición inicial se ha aplanado, es bilobulada, cada lóbulo tiene forma reniforme y en el ápice se observan expuestas caudículas (Fig. 11M). La antera de B. uniflora con inflexión de 170° respecto a su posición inicial, es aplanada con forma de corazón y en el ápice se 39 observan expuestas caudículas (Fig. 11N). En E. ciliare la antera con inflexión de 170° respecto a su posición inicial, es subesférica aplanada, con caudículas expuestas en la parte apical (Fig. 11O) y en M. subulatifolium, la antera con inflexión de 45° respecto a su posición inicial es obovada subcúbica, bilobulada y con un pliegue en la parte media cercana al ápice (Fig. 11P. Tabla 1). 7.2.4 Micromorfología de la cutícula de la epidermis de la antera La ornamentación de la cutícula de la epidermis de la antera en las cuatro especies es estriada (Fig. 12C-H), siendo muy conspicua en Barkeria uniflora y Epidendrum ciliare (Fig. 12G y H). Etapas del desarrollo tempranas: En M. subulatifolium y C. bilamellatum la cutícula no muestra ornamentación durante estas etapas, las células en la primer especie se observan ligeramente corrugadas en su cutícula y en la segunda especie completamente lisas (Fig. 12A y B). A diferencia de esto, en B. uniflora y E. ciliare la ornamentación es estriada conspicua (Fig. 12C y D). Etapas del desarrollo tardías: En M. subulatifolium, las estrías tienen patrón radial en algunas células y en otras longitudinalmente (Fig. 12E). En C. bilamellatum, B. uniflora y E. ciliare las estrías de la cutícula de las células epidermales no tienen un patrón definido, solo son muy conspicuas (Fig. 12 F, G y H; Fig. 13A y B. Tabla 1). 7.2.5 Estomas en anteras En todas las etapas del desarrollo, en la parte central de la antera de C. bilamellatum, B. uniflora y E. ciliare (Fig. 14A-C) se observaron abundantes estomas (Fig. 14D-I) de tipo actinocítico (Fig. 14J-L). En M. subulatifolium no se observaron estomas en la antera en ninguna etapa del desarrollo (Tabla 1). 40 Figura 11. Desarrollo de la antera (en vista ventral excepto B, F, K y P) de Caularthron bilamellatum (A, E, I), Barkeria uniflora (B, F, J), Epidendrum ciliare (C, G, K) y Microepidendrum subulatifolium (D, H, L). A: Etapa temprana, antera erecta con forma de gota, bilobulada (flechas blancas), ápice muy pronunciado (asterisco). B: Etapa temprana, antera erecta con forma de gota, bilobulada (flecha blanca señalando un lóbulo), ápice muy pronunciado (asterisco). C: Etapa temprana, antera erecta, ovoide, bilobulada (flechas blancas), ápice pronunciado bifurcado (asterisco). D: Etapa temprana, antera erecta obovada subcúbica, bilobulada (flechas blancas) sin ápice; E: Etapa subsecuente, antera erecta, redondeada, bilobulada (flechas blancas), lóbulos con forma de gajos de naranja, ápice menos marcado (asterisco) F: Etapa subsecuente, antera inicia inflexión, redondeada, ápice menos marcado (asterisco). G: Etapa subsecuente, antera inicia inflexión, redondeada, bilobulada (flechas blancas), lóbulos con forma de gajos de naranja, ápice bifurcado (asteriscos). H: Etapa subsecuente, antera erecta, obovada, bilobulada (flechas blancas), con un pliegue en parte frontal cerca del ápice (asterisco). I: Etapa intermedia, antera erecta, muy redondeada, bilobulada (flechas blancas), lóbulos con forma de gajos de naranja, ápice aplanado (asterisco) J: Etapa intermedia antera, con inflexión de 115° (asterisco), aplanándose sobre sí misma. K: Etapa intermedia antera con el ápice bifurcado y con inflexión de 60° (asterisco), bilobulada (flechas blancas) redondeada en el dorso y ventralmente planta. L: Etapa intermedia, antera erecta obovada subcúbica, bilobulada (flechas blancas) con pliegue (asterisco). M: Etapa tardía, antera con inflexión de 90°, aplanada, bilobulada, cada lóbulo forma reniforme; ápice con un par de caudículas expuestas. N: Etapa tardía, antera con inflexión de 170°, aplanada sobre sí misma con forma de corazón, ápice con dos pares de caudículas expuestas. O: Etapa tardía, antera con inflexión de 170°, subesférica, aplanada sobre sí misma, ápice con dos pares de caudículas expuestas. P: Etapa tardía, antera con inflexión de 45°, obovada subcúbica, bilobulada y con un pliegue frontal en la parte media ventral (asterisco). Barras de referencia: A-P = 100 µm. Aumento: A, K, M, N y O = 35X; D = 100X; B, C, E-I, L = 50X; P = 15X. an = antera; cau = caudícula, cl = columna; cln = clinandrio; es = estigma lb = labelo; ro = róstelo. 41 Figura 12. Ornamentación estriada (excepto A y B) de la cutícula de la epidermis de la antera en etapas tempranas y antéticas de Microepidendrum subulatifolium (A, E), Caularthron bilamellatum (B, F), Barkeria uniflora (C, G) y Epidendrum ciliare (D, H). A: Etapa temprana, no se observa ornamentación de la epidermis de la antera nula, las células son de forma globosa ligeramente corrugadas. B: Etapa temprana, no se observa ornamentación de la epidermis de la antera, las células están lisas. C: Etapa temprana, ornamentación de la epidermis de la antera estriada conspicua, patrón radial. D: Etapa temprana, ornamentación de la epidermis de la antera estriada conspicua, patrón radial. E: Etapa antesis, ornamentación estriada, patrón radial en algunas células y en otras paralelas entre sí longitudinalmente. F: Etapa antesis, ornamentación estriada conspicua sin patrón definido. G: Etapa antesis, ornamentación estriada muy conspicua sin patrón definido H: Etapa antesis, ornamentación estriada muy conspicua sin patrón definido. Barras de referencia: A-H = 10 µm.Aumento: A = 500X; B-H = 750X 42 Figura 13. Flor en etapa de desarrollo tardía de E. ciliare en corte longitudinal. A: Células con ornamentación estriada en la epidermis de la antera. B: Acercamiento a célula con ornamentación estriada de la epidermis de la antera. Barras de referencia: A = 1250 µm y B = 500 µm. Aumento: A = 40X y B = 100X 43 7.2.6 Caudículas Durante la antesis de C. bilamellatum, en la parte apical de la antera, se encuentran expuestas un par de caudículas de los polinios (Fig. 15A y E). Las células de las caudículas son de formas irregulares, con las paredes engrosadas y de aspecto fibroso (Fig. 15J). En la zona de la epidermis de la antera donde se exponen las caudículas, las células son alargadas y no se observan estriadas (Fig. 15I). Durante la antesis de B. uniflora, en la parte apical de la antera, se encuentran expuestas dos pares de caudículas (Fig. 15B y F). En esta zona donde se exponen la caudículas, las células de la epidermis de la antera son muy alargadas (Fig. 15K) y no se encuentran estriadas; al igual que en C. bilamellatum las células de las caudículas son de forma irregular, con las paredes engrosadas y de aspecto fibroso (Fig. 15L). Durante la antesis de E. ciliare, en la parte apical de la antera se encuentran expuestas dos pares de caudículas (Fig. 15C y G). En la zona donde se exponen las caudículas, a diferencia de C. bilamellatum y B. uniflora, las células de la epidermis de la antera son estriadas (Fig. 15M). Las células de la caudícula son redondas, estriadas y granulosas (Fig. 15N). En E. ciliare se observó que las caudículas son extensiones elásticas del polinio producidas dentro de la antera (Fig. 16). Durante la antesis de M. subulatifolium, en la zona que correspondió, en las etapas del desarrollo tempranas, a la parte apical de la antera no se presentan caudículas (Fig. 15D). Las células del ápice de la antera son rectangulares alargadas y sin estrías (Fig. 15H). 7.2.7 Clinandrio y Rostelo Clinandrio: El clinandrio de C. bilamellatum y B. uniflora es trilobulado, tiene dos lóbulos laterales y uno central; en C. bilamellatum el lóbulo central es el más pronunciado, sobresale como una solapa en la parte dorsal de la antera, y los lóbulos laterales son poco evidentes (Fig. 15A), a diferencia de B. uniflora, donde los tres lóbulos son prominentes y el lóbulo central forma una solapa con los dos lóbulos laterales (Fig. 15B). En E. ciliare, el clinandrio es una estructura muy conspicua, en la parte dorsal se compone de proyecciones con forma fimbriada y cubre gran parte lb lb 44 de la antera al momento de la antesis (Fig. 15C). En M. subulatifolium el clinandrio es una estructura inconspicua, se observa como una pequeña proyección con forma de diente en los flancos de la antera (Fig. 11P; Fig. 15D. Tabla 1). Rostelo: El rostelo de M. subulatifolium, C. bilamellatum y B. uniflora está compuesto de células rectangulares con paredes onduladas, alargadas y principalmente lisas (a excepción de C. bilamellatum donde se observaron algunas células ligeramente estriadas. Fig. 17A-C). El rostelo de E. ciliare está compuesto de células globosas estriadas, similares a las de la epidermis de la antera (Fig. 17D. Tabla 1). lb lb 45 Figura 14. Estomas actinocíticos en la epidermis de la parte central de las anteras de Caularthron bilamellatum (A, D, G, J), Barkeria uniflora (B, E, H, K) y Epidendrum ciliare (C, F, I, L). A-C: Antera en la antesis, estomas presentes en la parte central (flechas blancas). D: Acercamiento a la parte central de la epidermis de la antera, presencia de abundantes estomas (flechas punteadas). E: Acercamiento a la parte central de la epidermis de la antera, presencia de abundantes estomas (flechas punteadas). F: Acercamiento a la parte central de la epidermis de la antera, presencia de estomas (flechas punteadas).G-I: Abundantes estomas de tipo actinocítico en la parte central de la antera. J-L: Acercamiento a uno de los estomas actinocíticos presentes en la parte central de la antera. Barras de referencia: A-F, I = 100 µm. G, H, J, K, L = 10 µm. Aumento: A y B = 50X; C = 75X; D-F e I = 200X; G y H = 350X y J-L = 750X an = antera; cln = clinandrio, 46 Figura 15. Caudículas expuestas en el ápice de la antera al momento de la antesis de Caularthron bilamellatum (A, E, I, J), Barkeria uniflora (B, F, K, L) y Epidendrum ciliare (C, G, M, N). Caudículas no expuestas en Microepidendrum subulatifolium (D y H) A: Clinandrio trilobado con lóbulo medio en forma de solapa, caudículas expuestas en el ápice de la antera. B: Clinandrio trilobado con lóbulo medio en forma de solapa, y lóbulos laterales prominentes, caudículas expuestas en el ápice de la antera C: Clinandrio fimbriado muy prominente cubriendo más de la mitad de la antera, caudículas expuestas en el ápice de la antera D: Clinandrio poco prominente como diente en el flanco de la antera, sin caudículas expuestas. E: Antera parte apical con un par de caudículas expuestas (1). F: Antera parte apical con dos pares de caudículas expuestas (1 y 2). G: Antera parte apical con dos pares de caudículas expuestas (1 y 2). H: Células parte apical antera alargadas y lisas distintas a las del resto de la epidermis. I: Células parte apical antera alargadas y lisas distintas a las del resto de la epidermis (esféricas, estriado conspicuo). J: Células de caudículas, irregulares, con paredes engrosadas de aspecto fibroso. K: Células parte apical antera muy alargadas y lisas, distintas a las del resto de la epidermis (esféricas, estriado conspicuo). L: Células de caudículas, irregulares, con paredes engrosadas de aspecto fibroso. M: Células parte apical antera redondas, estriado muy conspicuo iguales a las del resto de la epidermis. N: Células de caudículas, redondas, estriadas, aspecto granuloso. Barras de referencia: A-G = 100 µm. H-L = 10 µm. Aumento: A-C = 35X; D = 50X; E y J = 100X; F = 75X; G = 150X; H, L, M y N = 350X e I, K y N = 750X. al = alas en la columna; aan = ápice antera; an = antera; cau = caudículas; cln = clinandrio; es = estigma; ro = róstelo 47 Figura 16. Flor en etapa de desarrollo tardía de E. ciliare en corte longitudinal: La antera está completamente desarrollada bilobulada, en la parte derecha por encima del rostelo se observa una caudícula, con células intensamente teñidas de rojo en su interior. Aumento: 10X an = antera; cau = caudícula; cl = columna; cln = clinandrio; ro = róstelo. Figura 17. Células del rostelo al momento de la antesis de Microepidendrum subulatifolium (A), Caularthron bilamellatum (B), Barkeria uniflora (C) y Epidendrum ciliare (D). A:-C: Rostelo compuesto de células rectangulares con paredes celulares onduladas, alargadas y generalmente lisas (excepto B con algunas células ligeramente estriadas). D: Rostelo compuesto de células globosas, estriadas similares a las de la epidermis de la antera. Barras de referencia A-D = 10 µm. Aumento: A-D = 750X 48 Tabla 1. Cuadro comparativo de los caracteres en la alianza Epidendrum encontrados la presente investigación y de especies de la subtribu Laeliinae con información bibliográfica. Especies clave alianza Epidendrum Alianza Encyclia Especies Caracteres observados Orleanesia (Romero y Carnevali, 2005). Caularthron bilamellatum Barkeria uniflora Epidendrum ciliare Microepidendrum subulatifolium Alamania punicea (Soto-Arenas, 2005c) Encyclia (Romero y Carnevali, 2005; Valencia et al., 2011) Prosthechea (Higgins, 2005; Valencia et al., 2011) Fusión labelo-columna a todo lo largo del desarrollo Labelo libre sin fusión unido con pie de columna. Labelo libre. Labelo unido a la base, resto libre pero adpreso a la columna. Labelo completamente fusionado
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