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Biología

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Universidad Nacional Autónoma de México

FACULTAD DE QUÍMICA

Optimización de parámetros de fructificación para la
producción comercial de Pleurotus eryngii

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUIMICA DE ALIMENTOS

PRESENTA:
ORNELAS GARCÍA BELÉN

DIRECTOR DE TESIS
HERMILO LEAL LARA

CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX.
2018

http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwi21aCT1pHLAhXD7SYKHS_aDgMQjRwIBw&url=http://idiomas.quimica.unam.mx/ingles/Arriba.html&psig=AFQjCNHlCgrVIyLQRQF2w6ZwssLZJs5UKw&ust=1456446989550868

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JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: Leal Lara Hermilo.
VOCAL: Profesor: Ortegon Avila Aurora Irma.
SECRETARIO: Profesor: Montiel Pacheco Carmina.
1er. SUPLENTE: Profesor: Juarez Arrollo Elsi Ideli.
2° SUPLENTE: Profesor: Jimenez Reyez Genaro

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
LABORATORIO 324, DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLIGÍA,
CIUDAD UNIVERSITARIA CONJUNTO “E” FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM.

ASESOR DEL TEMA:
HERMILO LEAL LARA.______________________________

SUSTENTANTE:
BELEN ORNELAS GARCÍA.___________________________

1. RESUMEN 1
2. INTRODUCCIÓN 3
3. ANTECEDENTES 5
3.1 Los hongos 5
3.2 Taxonomía 6
3.3 Morfología 8
3.4 Nutrición 9
3.5 Condiciones de crecimiento 12
3.6 Reproducción 13
3.7 Ciclo de vida 17
3.7.1 Desarrollo y tipificación de micelio 19
3.8 Mejoramiento genético de hongos 22
3.9 Recuperación de progenie meiótica 24
3.10 Dedicariotización 25
3.10.1 Dedicariotización natural 26
3.10.2 Dedicariotización artificial 27
3.11 Hibridaciones 28
3.12 Cultivo de Pleurotus spp 28
3.13 Pleurotus eryngii 31
3.13.1 Nombres científico y comunes 31
3.13.2 Taxonomía de Pleurotus eryngii 31
3.13.3 Hábitat de Pleurotus eryngii 31
3.13.4 Características de Pleurotus eryngii 32
3.13.5 Factores fisicoquímicos determinantes para el cultivo de P. eryngii 33
ÍNDICE

3.13.6 Valor nutritivo de Pleurotus 36
4. JUSTIFICACIÓN 38
5. HIPÓTESIS 39
6. OBJETIVOS 40
7. MATERIALES Y MÉTODOS 41
7.1 Material biológico 41
7.2 Preparación de medio de cultivo (AEM) 41
7.3 Purificación de cepa 41
7.4 Fructificación de cepa de Pleurotus eryngii 42
7.4.1 Preparación de inoculo de grano 42
7.4.2 Determinación de humedad del sustrato 42
7.4.3 Preparación de sustratos 42
7.4.4 Producción de esporóforos 43
7.5 Dedicariotización de cepas de Pleurotus eryngii y producción de híbridos 44
7.5.1 Preparación de soluciones para dedicariotizar 44
7.5.2 Preparación del inoculo para la dedicariotización 44
7.5.3 Dedicariotización de cepas de Pleurotus eryngii 45
7.5.4 Clasificación de neohaplontes 45
7.5.5 Hibridaciones y cepas reconstituidas 46
8. RESULTADOS 47
8.1 Dedicariotización de cepas comerciales de P. eryngii (MB y FQ) 47
8.2 Producción de híbridos de cepa P. eryngii MB y FQ 56
8.3 Identificación preliminar del efecto de ciertas variables de cultivo sobre la
producción de 2 cepas comerciales de P. eryngii
58
8.4 Evaluación del efecto del tiempo de incubación, tamaño de bolsa, cepas de P.
eryngii, composición de sustrato y rascado (inducción)

9. CONCLUSIONES 91
10. RECOMENDACIONES 92
11. BIBLIOGRAFÍA 93
12. ANEXOS 96

1.- RESUMEN

México es el mayor productor de hongos de Latinoamérica. El Champiñón
(Agaricus), representa el 90% de la producción nacional de hongos, las setas
(Pleurotus sp) el 9.9% de la producción y el Shiitake (Lentinula edodes) el 0.1%
(Martínez- Carrera et al., 2007). El hongo comestible Pleurotus eryngii también
conocido como trompeta real, se caracteriza por ser un producto gourmet, muy
apreciado en Estados Unidos, Europa y Asia, posee un estipe grueso y carnoso,
con características sensoriales muy agradables. Sin embargo este hongo no se
produce en México, ya que es un hongo poco conocido en el mercado nacional y
cuya tecnología de producción es desconocida, además de ser un proceso costoso
y de baja productividad.
Para el desarrollo de una tecnología que permita una producción rentable de P.
eryngii resultaba necesario realizar esfuerzos de diferente tipo. En un enfoque se
realizó un programa de mejoramiento genético para obtener nuevas cepas
(híbridos) a partir de dos cepas comerciales de P. eryngii, FQ y MB. Las cepas MB
y FQ se sometieron a un proceso de dedicariotización, recuperando los dos tipos de
componentes monocarióticos (neohaplontes) de cada una de las cepas. Los
neohaplontes recuperados se aparearon entre ellos obteniéndose así 3 híbridos y
sus respectivas cepas reconstituidas. Al fructificar estas cepas junto con las cepas
parentales, se observó que tanto la cepa reconstituida FQ, como uno de los híbridos
produjeron eficiencias biológicas (EB) mucho mayores 183 ± 4% y 174 ± 10 %,
respectivamente, que el resto de las cepas, por lo que representan un muy valioso
material biológico para una producción comercial.
En un segundo enfoque, se realizaron experimentos para afinar algunos parámetros
para lograr una producción rentable de P. eryngii. Además de comparar la
productividad de 2 cepas comerciales, se optimizó la composición del sustrato, el
tiempo de incubación, el efecto tamaño de bolsa con sustrato y el efecto de 2
procedimientos para la inducción de la fructificación, el choque térmico y el rascado

de la superficie del sustrato. Se determinó que la cepa FQ es la más productiva, y
que el sustrato N (45% paja, 20% aserrín, 22% salvado, 7% gluten y 6% CaCO3),
con un tiempo de incubación de 21 días, sin choque térmico, con tamaño de bolsa
de 3.5 kg y sin inducción por rascado son las condiciones que permiten una mayor
producción de P. eryngii.

2. INTRODUCCIÓN

Pleurotus eryngii, también conocido como el hongo ostra rey o cardoncello, se está
convirtiendo cada vez más popular entre los consumidores en Europa, Asia y
América del Norte. Se le aprecia como producto gourmet por ser un hongo con una
gran textura y sabor, que posee un estipe sumamente grueso, carnoso, con
características sensoriales altamente agradables para el consumidor y una larga
vida de anaquel en comparación de otros hongos (Royse et al., 2005).

La producción comercial de esta especie comenzó en Italia a mediados de 1970 y
es producido en más de una docena de países. En Japón, la producción aumentó
de 60 toneladas en 1995 a más de 29,000 toneladas en 2003 (Yamanaka, 2005).
El incremento en la producción se ha observado en China, donde la producción
comercial se inició a finales de 1990 y ya para 2001 los productores chinos
producían aproximadamente 7,300 toneladas, la cual se elevó para el 2003 a 114
100 toneladas (Cheng, 2005; Tan et al., 2005). En los EE.UU, la producción
comercial se inició en 2000 y en 2004 alcanzó 85 toneladas (Royse et al., 2005).

En México hace algunos años se estuvo introduciendo este hongo vendiéndose en
los supermercados a un precio promedio de 660 $/kg, lo que lo hacía un producto
muy difícilde adquirir. Una mejora en los rendimientos indudablemente disminuiría
los costos de producción y los precios de venta. La productividad de P. eryngii
depende ciertamente de las cepas empleadas pero también está seguramente
influenciada por el tipo de sustrato, en término de las proporciones tanto de
materiales básicos como de suplementos. Si bien Rodríguez Estrada y Royse
(2007) recomiendan sustratos con cascarilla de algodón como componente principal
(>60%), se reportan también rendimientos aceptables en sustratos con solo paja de
trigo o con salvado de arroz (Kirbag y Akyuz, 2008). Debido a las diversas
posibilidades de combinaciones en la formulación del sustrato, es seguramente
posible encontrar una formulación que permita altas productividades con materiales
accesibles localmente con la consecuente disminución en el costo de producción de

Pleurotus eryngii. Adicionalmente deben investigarse otras variables que permitan
llegar a este objetivo como sería la reducción del tiempo de incubación, optimizar el
tamaño de la bolsa con sustrato y el efecto de los distintos procedimientos para la
inducción de la fructificación.

La selección de las cepas de P. eryngii más adecuadas para el cultivo comercial en
México es también de importancia fundamental. Aparte de evaluar distintas cepas
con características comerciales, ésto debe ser completado con el desarrollo de
cepas mejoradas. El mejoramiento genético de cepas de hongos comestibles
permite obtener cepas con características que ayuden a satisfacer necesidades
específicas. La mayoría de los programas de mejoramiento genético para hongos
comestibles se han basado en el sistema natural de combinación genética a partir
de las progenies meióticas, apareando micelios monocarióticos compatibles. Un
enfoque más efectivo es por medio de la dedicariotización de cepas comerciales
para poder combinar las características presentes en esas cepas mediante cruzas
controladas para obtener así, cepas cuyo genoma posiblemente les permitirá
expresar las características de las cepas seleccionadas (Sonnenberg et al., 2005).
De esta manera podrían obtenerse híbridos a partir de dos cepas distintas que
permitan llegar a tener altos rendimientos con fenotipos adecuados para la
producción comercial y que disminuyan los costos de producción y por ende el
precio de P. eryngii.

3. ANTECEDENTES

3.1 LOS HONGOS.

La micología es la ciencia que estudia los hongos. El término hongo se deriva del
latín “fungus” que significa seta y del griego “sphongos” que significa esponja. Se
ha demostrado que los hongos son el grupo de organismos más numeroso en la
Tierra después de los insectos. En efecto, se calcula que hay más de 1, 500,000
especies de hongos, por lo que su impacto en el medio es enorme. La diversidad
de estos organismos, favorece a que se desarrollen en un sin fin de hábitats, por lo
que bien se dice que los hongos están en todas partes (Guzmán et al., 1993;
Alexopoulos et al., 1996). Los hongos son organismos diferentes a los del reino
vegetal y animal. Pertenecen al reino Fungí, poseen células eucarióticas y pared
celular con quitina, son heterótrofos es decir, requieren materia orgánica
preformada que utilizan como fuente de energía y de carbono para la síntesis de
estructuras celulares y carecen de clorofila.

En el caso de los hongos comestibles, la parte del hongo que se ve es solamente el
“fruto” del organismo. No obstante, con todos los hongos, la parte viviente del hongo
es un micelio constituido por un tejido de filamentos delgados llamados hifas. El
micelio está oculto debajo del suelo, en madera, o en otras fuentes de alimento, el
cual crece hasta que aparecen los cuerpos fructíferos. En los casos que el micelio
produce frutos microscópicos, estos no son visibles a simple vista.

Los hongos se alimentan absorbiendo nutrimentos del material orgánico en que
viven, para lo cual los hongos secretan metabolitos, ácidos y enzimas, que degradan
el material orgánico en partículas más fáciles de digerir y luego atraviesan la pared
celular de la hifa. Algunos descomponen material orgánico como hojas muertas
(saprófitos), otros se alimentan de células vivas causando enfermedades
(parásitos).

Los hongos infectan a plantas, animales y hasta a otros hongos (Fogel, 1997). Los
hongos micorrícicos viven en compañía de las plantas formando una asociación
simbiótica llamada micorriza, estableciendo con ellas una relación de dependencia
o colaboración nutricional. En dicha asociación, el micelio envuelve
(ectomicorrícicos), y a veces penetra (endomicorrícicos) las células de los ápices
radicales de la planta. Los hongos proveen ciertos nutrientes a las plantas a cambio
de otros nutrientes que el hongo no puede producir (Kobold, 2000).

3.2 TAXONOMÍA.

Existe aún controversia con respecto a la ubicación taxonómica de los hongos,
algunos autores como Moore-Landecker (1996) consideran que los hongos están
distribuidos en los reinos protoctista, chromista y fungí, considerando cinco
divisiones en este último reino (Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota,
Basidiomycota y una división de forma Deuteromycota); por otro lado, Guzmán et
al. (1993), Alexopoulos et al. (1996) así como Herrera y Ulloa (1998) ubican a todos
los hongos dentro del reino fungi o myceteae y, con algunas diferencias, lo dividen
en gymnomycota o también llamado myxomycota, mastygomycota y
amastygomycota o lo correspondiente a la división eumycota. Considerando esta
última clasificación realizada por Herrera y Ulloa (1998), el reino fungí consta de dos
divisiones naturales: Myxomycota y Eumycota, así como una división artificial de
líquenes, misma que incluye organismos mixtos constituidos por algas y hongos
asociados simbióticamente. La división Myxomycota incluye a ciertos hongos
gelatinosos (p. e. Enteridium lycoperdon), por otro lado, a los hongos pertenecientes
a la división Eumycota se les conoce como hongos verdaderos o perfectos y se
dividen en cuatro grupos o subdivisiones: Phycomycota, Ascomycota,
Basidiomycota y Deuteromycota.

El grupo Phycomycota se caracteriza por presentar hifas cenocíticas (sin septos),
su reproducción es sexual y asexual, el tipo de cuerpo fructífero que produce son
micromicetos.

En cuanto al grupo Ascomycota, este junto con el Basidiomycota tienen hifas
septadas y reproducción tanto sexual como asexual. La diferencia entre estos
grupos radica en que la Basidiomycota solo produce cuerpos fructíferos de tipo
macromicetos y Ascomycota produce tanto micromicetos como macromicetos.

El phylum Basidiomycota son hongos que forman esporas de origen sexual
llamadas basidiosporas sobre células especializadas que se conocen con el nombre
de basidios. Las basidiosporas a veces se denominan también esporidios, se
producen en alguna zona externa del basidio, cada basidio engendra cuatro
basidiosporas en su zona apical. Estos hongos se desarrollan formando un micelio
macroscópico, constituido por hifas macroscópicas tabicadas.

Dentro de estos hongos, Webster y Weber (2007) dividen a este phylum en 4
diferentes clases. La primer clase la constituyen los homobasidiomycetes que son
basidios no septados La segunda clase está formada por heterobasidiomycetes o
bien basidios septados La tercer clase son los denominados comúnmente como
royas (urediniomycetes) en los cuales los procesos de cariogamia se dan de
distintas partes del basidium: probasidium y metabasidium respectivamente, su ciclo
de vida se da en diferentes hospederos. Finalmente dentro de la cuarta clase están
los ustilaginomycetes, conocidos como carbones, estos solo tienen un hospedero
(fase patógena), talo levaduriforme fuera del hospedero, son parásitos de plantas.

Finalmente se tiene el grupo Deuteromycota sus hifas son septadas, su
reproducciónes asexual y producen micromicetos.

3.3 MORFOLOGÍA.

Los hongos pueden ser unicelulares o pluricelulares. Muchos hongos tienen quitina
en la pared celular como el polisacárido en mayor proporción, mientras que algunos
tienen celulosa en lugar de quitina. Los hongos unicelulares pueden ser de tres
tipos: plasmodial, quitridial o levaduriforme.

Los hongos pluricelulares o filamentosos están constituidos por células
denominadas hifas las cuales crecen en forma de largos brazos en toda dirección;
estas son generalmente uniformes y delgadas con diámetro de 1 a 2 mm. El
conjunto de hifas forma lo que se denomina micelio (Garcés, 2003). Algunos hongos
carecen de micelio y producen en cambio unos sistemas de madejas de diferente
grosor con diámetros variados llamadas rizomicelio.

Las estructuras reproductivas, las cuales contienen grandes cantidades de esporas
que son las responsables de la diseminación, frecuentemente determinan el color
de los cuerpos fructíferos (Garcés, 2003). Los hongos pueden tener una gran
variedad de estructuras afines a la reproducción sexual, en el caso de los
macromicetos el esporoma (cuerpo fructífero) es de un tamaño grande (visible a
simple vista), mientras que en los micromicetos, el esporoma no se alcanza a
distinguir a simple vista (Herrera y Ulloa, 1990). En el phylum Basidiomycota el
esporoma está constituido por diferentes partes como el estípite o pie, el cual
sostiene al píleo o sombrero.

En el píleo se encuentra el himenio que es un tipo de talo fértil en el cual se lleva a
cabo la cariogamia, la meiosis y se producen las esporas. El himenóforo (en el cual
se encuentra el himenio) puede estar organizado de diferentes maneras: en
láminas, poros, dentado, etc.

En el himenio se encuentra el basidio, la cual es una estructura que porta en su
superficie un determinado número de basidiosporas (4 por lo general) que se forman
a consecuencia de la cariogamia y la meiosis (Figura 1).

Figura 1. Morfología del hongo (Carillo, 2003)

3.4 NUTRICIÓN.

Los hongos son quimioheterótrofos, son incapaces de realizar la fotosíntesis, es
decir que no producen su propio alimento al igual que los animales, y obtienen sus
nutrientes del medio, a partir de materia orgánica ya elaborada por otros
organismos. Sin embargo los hongos no ingieren la materia orgánica y la digieren
internamente como los animales, los hongos requieren que las moléculas orgánicas
sean de tamaño pequeño.

Los hongos se alimentan por medio de absorción. Este proceso se lleva a cabo en
el ápice de la hifa que es donde todavía no se forma la pared celular y es donde
hay un mayor intercambio de componentes. Los hongos pueden explotar una amplia

gama de fuentes de nutrientes orgánicos, pero en todos los casos, dependen de la
absorción de nutrientes simples; solubles que se difunden a través de la pared o
que entren en las células a través de proteínas de transporte específicas. Dichas
proteínas sólo permiten el paso de moléculas pequeñas tales como monosacáridos,
aminoácidos y péptidos pequeños de dos o tres aminoácidos. Incluso los
disacáridos tales como sacarosa y celobiosa (un producto de degradación de la
celulosa) pueden necesitar ser degradados a monosacáridos antes de que sean
tomados por la mayoría de los hongos. Si los compuestos a absorber son complejos
se realiza una digestión extracelular mediante enzimas que tienen la capacidad de
descomponer aquellas moléculas muy complejas para que puedan ser absorbidas
o fagocitadas por la membrana celular (Deacon, 2006).

Los carbohidratos de origen vegetal constituyen la fuente de energía más abundante
para los hongos en la naturaleza, casi todos utilizan la glucosa, maltosa, sacarosa,
almidón, quitina, lignina, hemicelulosa y celulosa. Sin embargo la celulosa es el
polímero más disponible para los hongos en una amplia gama de ecosistemas. La
degradación de la celulosa por los hongos se lleva comúnmente a cabo por dos
enzimas, la endo-β-glucanasa y la β-glucosidasa, la primera rompe las cadenas de
celulosa produciendo varias moléculas (como la celobiosa y celotriosa), mientras
que la β-glucosidasa hidroliza los enlaces de las moléculas producidas por la
glucanasa para dar glucosa, la cual es asimilada por la célula. La celulosa en forma
cristalina requiere una tercer enzima la exo- β-glucanasa que separa unidades
sucesivas de celobiosa de los extremos de las cadenas de celulosa, es una enzima
de frecuencia mucho más restringida, pues son pocos los hongos que la producen,
entre estos se encuentran los ascomicetes y los basidiomicetes (Deacon, 1993).

Con respecto a los requerimientos de nitrógeno, se puede generalizar que todos los
hongos utilizan aminoácidos, la mayoría puede utilizar amonio y unos cuantos
pueden utilizar nitrato, presentando una preferencia marcada por el amonio. Otras
fuentes incluyen urea, hidroxilamina, L-aminoácidos y péptidos; siendo los D-
aminoácidos fuentes pobres de nitrógeno y en ciertos casos tóxicos.

Dada una fuente de carbono adecuada, muchos hongos crecen con nutrientes
orgánicos simples, ya que pueden sintetizar los constituyentes celulares necesarios
a partir de nitrógeno inorgánico, fosforo, potasio, azufre, etc. (Wainwright. 1992).
En el phylum Basidiomycota los hongos comestibles se pueden clasificar en dos
grandes grupos en función de su capacidad para degradar celulosa, hemicelulosa y
lignina. El primer grupo es el de la pudrición blanca, el cual tiene la capacidad de
degradar en mayor proporción lignina y celulosa a través de enzimas (Kirk y
Shimada, 1985). Por otro lado el grupo de la pudrición café solo puede asimilar
celulosa y hemicelulosa, modificando ligeramente la lignina (Kirk y Moore, 1972; Kirk
y Highley, 1973).

Según las enzimas que producen, los hongos son capaces de vivir de formas muy
distintas y sobre sustratos orgánicos variables, por ejemplo en el caso de Pleurotus
spp utiliza las siguientes enzimas (Tabla 1).

Tabla 1. Funciones del complejo enzimático de Pleurotus, spp. (Cohel, et al.,
2002)
Enzima Función
Manganeso peroxidasa (MnP)
Versátil peroxidasa (VP)
Oxidación (dependiente de H2O2) de
lignina y derivados fenólicos
Lacasa
Oxidación de orto y para-difenoles y
aminas aromáticas.
Alcohol Aril Oxidasa (AOO)
Oxidación extracelular de alcoholes
aromáticos a sus correspondientes
aldehídos. Generadora de H2O2.

Los hongos presentan varios tipos básicos de modo de vida. Los hongos que
obtienen los nutrientes a partir de materia orgánica no viva, que se encuentran en
el medio se denominan saprótrofos. Un ejemplo de este tipo de hongos son los que
viven sobre la hojarasca del bosque, madera, tejido inerte de árboles o estiércol.
Dentro de esta clasificación se encuentran las especies de Pleurotus. Los hongos
que obtienen nutrientes lentamente a partir de hospedantes vivos, a menudo sin
matarlo son biótrofos (parásitos obligados). Generalmente los hongos biótrofos
segregan compuestos químicos que modifican la permeabilidad de las membranas
celulares del hospedante provocando la salida de azúcares y aminoácidos que son
absorbidos por el hongo. Estos hongos se nutren de sustancias que hay en células
vivas o que tienen en sus líquidos orgánicos vitales como la linfa, la hemolinfa y la
sangre de los animales (Ulloa, 1990). Los hongos que atacan seres vivos de forma
tan violenta que matan al hospedante se denomina necrótrofos. Estos hongos
segregan toxinas que rompen membranas plasmáticas del hospedante provocando
la muerte. La ruptura de las células libera rápidamente nutrientes al medio, que son
absorbidos por el hongo. Estos hongos funcionan como parásitos (facultativos) en
los primeros momentos del ataque, y como saprótrofos, unavez que el hospedante
ha muerto. Son hongos patógenos de plantas y animales. Las micorrizas son
hongos que forman una relación simbiótica con plantas que pueden ser árboles
principalmente y arbustos, el micelio del hongo forma un apretado manto o vaina
alrededor de la superficie de la raíz. La planta expande su sistema radicular, de esta
forma el hongo recibe los carbohidratos necesarios del árbol (Garcés, 2003).

3.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO.

Los hongos crecen mejor en un hábitat oscuro, es necesario que el ambiente tenga
la humedad ideal para su desarrollo, la cual puede ser obtenida a través de la
atmósfera o del medio sobre el cual crecen. Cuando un ambiente es demasiadoseco
las condiciones para que se lleve a cabo el desarrollo del hongo son adversas por
lo que sobreviven entrando a la fase de latencia o produciendo esporas resistentes
a la deshidratación.

Los hongos se diseminan principalmente en forma de esporas, también lo pueden
realizar por fragmentos de hifas y por masas endurecidas de micelio llamadas
esclerocios.

La distancia a la cual las esporas pueden ser esparcidas varía de acuerdo con el
agente diseminador. El viento es probablemente el más importante agente
transportador de esporas de muchos hongos, las cuales pueden ser llevadas a
grandes distancias con respecto a su lugar de origen (Garcés, 2003).

3.6 REPRODUCCIÓN

La reproducción es la formación de nuevos individuos con características típicas de
la especie. En el caso de los hongos podemos observar diferentes formas para dar
origen a nuevos individuos: la asexual, parasexual y sexual. A la reproducción
asexual también se le conoce como somática o vegetativa, debido a que no
involucra fusión de núcleos. Se puede dar por fragmentación del micelio, el cual al
colocarse bajo condiciones adecuadas de temperatura, humedad y substrato, da
origen a un nuevo individuo. Esta forma de reproducción es muy utilizada para
multiplicar los hongos comestibles en el laboratorio. (Herrera y Ulloa, 1990, Sánchez
y Royse, 2009). La reproducción sexual en hongos permite la variación genética. La
mayoría de los hongos presenta ciclos alternos de reproducción asexual y sexual
como parte de su desarrollo (Alexopoulus, 1996; Herrera y Ulloa, 1990, Sánchez y
Royse, 2001).

La reproducción parasexual es un mecanismo raro, en el que las hifas se unen sin
fusión nuclear posterior y da lugar a un heterocarión de núcleos haploides. En
algunas ocasiones pueden conjugarse los núcleos y aparece un núcleo diploide
heterocigótico (Sánchez y Royse, 2001).

La reproducción sexual no es rápida e implica somatogamia es decir la unión de
hifas o gametos, la cariogamia que es la fusión de núcleos y la producción de
gametos por meiosis. Con los hongos comestibles, las hifas que forman el micelio
actúan como gametos y su sexualidad está determinada por genes nucleares, que
confieren un carácter genético conocido como compatibilidad sexual. Esto hace
que solo aquellas hifas provenientes de micelios compatibles se fusionen y den
origen por somatogamia a un compartimento hifal con dos tipos de núcleos
diferentes. A partir de este compartimiento se produce la dicariotización del micelio
para dar origen a lo que es llamado micelio heterocariótico (con diferentes tipos de
núcleos).

La cariogamia generalmente se presenta tiempo después de la somatogamia, por
lo que el micelio heterocariótico se multiplica y mantiene sin dificultad. La fusión de
núcleos solo se dará en los basidios, la cual originará por meiosis la espora de
origen sexual (basidiosporas). En los hongos, la reproducción sexual se puede dar
de diferentes maneras, por ejemplo hay hongos cuyo talo es auto compatible
(homotálico) es decir no necesita de otro talo para reproducirse sexualmente, son
producidos por un solo micelio monospórico y la transición de la fase haploide a la
dicariofase ocurre en ausencia de una interacción de compatibilidad con otro
micelio (Herrera y Ulloa, 1998). Con otros hongos, el talo es auto incompatible
(heterotálico) por lo que necesitan de otro talo para poder reproducirse El
homotalismo puede ser de dos tipos:

1. Homotalismo primario: Hace referencia a que una basidiospora germina para
formar un micelio, que inmediatamente se organiza en segmentos binucleados,
teniendo fíbulas o conexiones grapa (clamp) en las hifas. No hay distinción genética
entre los dos núcleos de cada célula, y este micelio es capaz de formar esporoma
(Webster y Weber, 2007).

2. Homotalismo secundario: Consta de un micelio dicariótico fértil originado a
partir de una espora con dos núcleos meióticos compatibles, provenientes de dos
tipos de apareamiento; en este tipo de homotalismo, el genotipo de un núcleo
individual restringe la reproducción sexual de un homocarión, aunque la distribución
de los productos meióticos en los basidios es tal, que típicamente los núcleos
poseen genotipos complementarios dentro de una simple espora y el micelio
derivado de tal espora heterocariótica posee la capacidad de formar un dicarión y
complementar así la reproducción sexual (Deacon, 2006).
Entre las especies heterotálicas es necesario el apareamiento de diferentes
micelios homocarióticos para poder completar su ciclo sexual. De manera general
se pueden observar dos sistemas de heterotalismo en los basidiomicetes (Guzmán
et al., 1993; Herrera y Ulloa, 1998):

a) Compatibilidad unifactorial o bipolar: Está controlada por un solo factor
(factor A) de un par de cromosomas homólogos que necesitan aparearse
sexualmente para dar origen a un par de genes alelos o alelomorfos compatibles
(A1A2) mientras que las otras posibles combinaciones (A1A1 y A2A2) serán
estériles al no ser compatibles entre sí. Agaricus bisporus (Ramírez y col., 2000),
Auricularia aurícula y Pholiota nameko (Guzmán et al., 1993) son ejemplos de
especies que despliegan este tipo de compatibilidad.

b) Compatibilidad bifactorial o tetrapolar: Está controlada por dos factores (A y
B) ubicados en cromosomas diferentes debido a la segregación meiótica. Cada
factor posee un par de genes alelos que controlan el mismo tipo de caracteres en
cada locus en posición idéntica respecto a su cromosoma homólogo y forman
parejas de genes (A1A2, B1B2). Solo será fértil aquel apareamiento sexual que
reúna los cuatro alelos diferentes para formar un micelio heterocigótico, de esta
forma se producirán basidiosporas con los siguientes genotipos: A1B1, A2B2,
A1B2 y A2B1 dependiendo del arreglo de los cromosomas homólogos producido
durante la meiosis (Figuara 2).

Además de las especies del género Pleurotus, Guzmán et al. (1993) citan como
ejemplos de hongos comestibles con este tipo de compatibilidad a Auricularia
polytricha, Coprinus fimetarius, Flammulina velutipes, Lentinus boryanus, L.
edodes y L. lepideus.

Casi de manera general, los hongos superiores desarrollan un solo tipo de
compatibilidad. Sin embargo, hay reportes de un conjunto de especies
relacionadas dentro de las cuales se despliegan ambos sistemas de compatibilidad
sexual.

Un caso extremo de esta relación lo constituye Sistotrema brinkmanni, este hongo
comprende un mínimo de tres especies y cada una de ellas presenta cada uno de
los patrones básicos de sexualidad: homotalismo primario, heterotalismo
unifactorial y heterotalismo bifactorial (Koltin et al., 1972).

En el phylum Basidiomycota la mayoría de especies se basan en el sistema de
compatibilidad heterotálico tetrapolar. Para que acontezca la plasmogamia es
necesaria la presencia de dos micelios compatibles, que tengan diferentes alelos
para los genes o también llamados factores de incompatibilidad A y B (Figura 5).
En cualquier apareamiento de micelios heterotálicos tetrapolares se tiene como
resultado de la meiosis 4 diferentes tiposde compatibilidad en una frecuencia igual,
por ejemplo A1B1 X A2B2 = A1B1, A1B2, A2B1, A2B2.

El factor de incompatibilidad (gen) A está involucrado en la formación de fíbulas,
en la división sincronizada, septación, mientras que el factor de incompatibilidad
(gen) B regula la actividad de la enzima R-glucanasa que favorece la fusión de la
fíbula codificando feromonas lipopeptídicas y receptores de feromonas, éstos son
requeridos para promover la migración nuclear seguida de la fusión de hifas, fusión
de la célula hifal, después de que el dicarión es establecido (Casselton y Riquelme
2004; Brown y Casselton, 2001).

Figura 2. El carácter sexual de los hongos. A: Micelio monocariótico. B:
Plasmogamia. C: Micelio dicariótico. D: Homotalismo primario. E: Homotalismo
secundario. F: Heterotalismo unifactorial. G: Heterotalismo bifactorial. Obsérvese
la cariogamia en la segunda célula (Guzmán, 1993)

3.7 CICLO DE VIDA.

El ciclo de vida de los hongos se divide en tres etapas principales. La primera etapa
es denominada plasmogamia o anastomosis que consta de la fusión de dos células
(hifas monocarióticas) y a través de la plasmogamia los individuos coexisten en un
citoplasma común. Las fíbulas constituyen una huella de intercambio nuclear entre
células, es decir ha ocurrido la plasmogamia ya que una fíbula aparece debido a un
intercambio nuclear y es consecuencia de la conjugación del micelio monocariótico
para originar el micelio dicariótico. En el principio se origina como una pequeña
ramificación en el extremo de la hifa en crecimiento para posteriormente curvarse

en forma de gancho (Deacon, 1993). En la segunda etapa del ciclo de vida a partir
del micelio secundario se forman los cuerpos fructíferos, en su himeneo se forman
los basidios, en los que antes de madurar, se lleva a cabo la cariogamia es decir la
fusión nuclear definitiva que aparentemente se unieron en la plasmogamia.
Finalmente la tercera etapa es la meiosis, en la cual el núcleo del zigoto sufre la
meiosis, los genes de tipo reproductivo y los que controlan otras características se
segregan en los cuatro núcleos hijos resultantes. Es decir ocurre la recombinación
genética.

Figura 3. Ciclo de vida generalizado de un hongo (Núñez, 2017)

El basidio tetranucleado produce cuatro extensiones tubulares denominadas
esterigmas cuyos ápices se expanden formando las esporas las que desarrollan un
micelio autoestéril con un solo núcleo posmeiótico y un tipo de incompatibilidad,
finalmente los núcleos haploides migran a través de los esterigmas hacia las
basidiosporas (Figura 3). Los factores de incompatibilidad son importantes debido
a que evitan el entrecruzamiento de los micelios de un mismo cuerpo fructífero y
favorece

el intercambio genético de poblaciones silvestres de la misma especie, así mismo,
estos factores A y B son los responsables de la dedicariotización.

3.7.1. DESARROLLO Y TIPIFICACIÓN DE MICELIO

Aunque algunos basidiomicetos tienen la tendencia de crecer como levaduras, el
micelio de las especies mejor conocidas está formado por hifas bien desarrolladas
y con septos. Éstas crecen a través del substrato obteniendo así su alimento. De
manera individual las hifas son microscópicas, pero pueden ser vistas a simple vista
cuando están en masa como micelio. El micelio de la mayoría de los basidiomicetos
heterotálicos pasa por tres etapas de desarrollo, antes de que el hongo complete su
ciclo de vida. Al inicio, el micelio primario u homocarión, llamado así para enfatizar
que todos sus núcleos son idénticos. Este estado usualmente se desarrolla después
de la germinación de una basidiospora. Tan pronto como los septos se forman,
éstos dividen al micelio en nuevos compartimientos típicamente uninucleados
(monocarión).

Aunque el micelio primario en la mayoría de los basidiomicetos parece capaz de
tener un crecimiento indefinido, no es común encontrarlo en la naturaleza de esta
manera, pues da origen casi inmediatamente al llamado micelio secundario o
heterocarión. La formación del micelio secundario usualmente involucra una
interacción entre dos micelios homocarióticos compatibles. Éste puede ser
resultado de la espermatización o de la fusión de dos compartimientos de micelio
homocariótico compatible, dando origen a un comportamiento heterocariótico en el
que cada compartimiento hifal contiene dos núcleos (dicarión).

A partir del compartimiento de micelio secundario, la dicariotización del resto del
micelio puede darse aparentemente en una de dos formas:

a) La célula binucleada produce una ramificación en la cual los dos núcleos migran
y posteriormente se dividen conjuntamente, aunque los núcleos hijos migran cuando

el compartimiento hifal es dividido en dos por la formación de un nuevo septo.
Repetidas divisiones de este tipo acompañadas por la formación de nuevos septos
da como resultado la formación de un micelio extenso y dicariótico

b) El segundo método de dicariotización, fue propuesto por Raper (1966), y ocurre
más frecuentemente que el primero. Aquí se menciona que hay división de los
núcleos en la célula binucleada seguida por la migración de los núcleos hijos hacia
el micelio primario que pertenece a un grupo de compatibilidad opuesto. En otras
palabras, un núcleo a se muda hacia el micelio b, mientras que el núcleo b se muda
hacia el micelio a. Al llegar al nuevo compartimiento, los núcleos extranjeros se
dividen rápidamente y su progenie migra de un compartimiento a otro hasta que
ambos micelios se dicariotizan completamente.

El mecanismo mediante el cual muchos de los basidiomicetos aseguran el
mantenimiento de la condición dicariótica en cada nuevo compartimiento del micelio
secundario, involucra la formación de estructuras especializadas llamadas
conexiones grapa o fíbulas, que son formadas durante la división de los núcleos en
el extremo de la hifa en crecimiento. La presencia de conexiones grapa se considera
generalmente como indicativo de la condición dicariótica, aunque no todas las
especies las forman.

El micelio terciario de los basidiomicetos es representado por los tejidos
organizados y especializados que comprende los basidiocarpos de las especies
más complejas. En este caso las hifas se entretejen para formar el carpóforo y en
algunas especies pueden diferenciarse morfológicamente en varios tipos. (Sánchez
y Royse, 2002)

La mayoría de las especies parecen poseer septos simples con un solo poro central.
En algunas especies la pared del septo cercana al poro está engrosada y forma una
hinchazón en forma de dona o de barril. A este tipo se le ha llamado septo doliporo,

y algunas veces está cubierto en alguno de los lados por una estructura
membranosa en forma de domo llamada tapa del poro del septo o parentesoma
(Figura 4).

Esta estructura parece ser una modificación del retículo endoplásmico y es parte
integral y funcional del septo. Se han reportado varios tipos de poros en los septos
de basidiomicetos, aunque las tapas de algunas especies parecen ser estructura
continua no porosa, pero en la mayoría de las especies están perforados. Flegler et
al. (1976) señala que la función del septo doliporo es actuar como una malla o filtro,
que permite el paso de algunos componentes del citoplasma del hongo de un
compartimiento hifal al próximo, pero retarda el paso de otros (Sánchez y Royse
(2002).

Figura 4. Septos de basidiomicetos: a) septo simple b) septo doliporo (Deacon,
2005)

Figura 5. Funciones de los genes de factores de incompatibilidad A y B en la
regulación de formación y mantenimiento de dicarión (Valencia del Toro, 2001).
.

3.8 MEJORAMIENTOGENÉTICO DE HONGOS.

Actualmente hay un auge en el uso de técnicas de biología molecular para
programas de mejoramiento genético con distintos tipos de organismos. No
obstante, en el caso de los hongos comestibles se presenta la dificultad de que son
organismos complejos con una amplia gama de características, muchas de las
cuales están bajo el control de múltiples genes. Por tal motivo, la mayoría de los
programas de mejoramiento genético para hongos comestibles se basan en el
sistema natural de recombinación genética al aparear micelios monocarióticos

compatibles. El propósito del entrecruzamiento es combinar las características
presentes en distintas cepas mediante cruzas controladas para obtener así, cepas
cuyo genoma posiblemente les permitirá expresar las características de las cepas
seleccionadas (Sonnenberg et al., 2005).

Con las nuevas técnicas de mejoramiento genético se vislumbra la posibilidad de
obtener híbridos, de cepas comerciales y silvestres, que puedan retener las
características de importancia comercial de las cepas originales. Estas
características podrían ser entre otras:

 Elevada velocidad de crecimiento del 20 % o más.
 Amplio espectro de sustratos para su desarrollo.
 Altas eficiencias biológicas, por arriba del 100%
 Esporóforos resistentes que faciliten el manejo post-cosecha.
 Colores y sabor agradables al consumidor.
 Mayor vida de anaquel.

Para lograr los objetivos anteriores resulta de gran importancia el uso de las técnicas
de selección de cepas y mejoramiento genético. Con la intención de obtener
híbridos con características adecuadas para la producción comercial, se utilizan
diferentes técnicas para recuperar los componentes monocariotes (haploides), sin
pasar por la meiosis, para obtener el material genético responsable de las
características del dicariote.

Con la recuperación de este material monocariótico (a partir de cepas comerciales
y silvestres) resulta más fácil y práctica la obtención de híbridos. Sin embargo, la
mayoría de las veces no se dispone de los componentes monocarióticos
correspondientes (Leal-Lara y Eger-Hummel, 1982).

En general, existen dos posibilidades para obtener el material inicial para un
programa de mejoramiento genético de este tipo:

1) Aislamiento y recuperación de la progenie meiótica (esporada).
2) Desdicariotización (obtención de componentes monocarióticos).

3.9 RECUPERACIÓN DE PROGENIE MEIÓTICA.

Este método consiste en recolectar las esporas producidas por los esporóforos de
las cepas de interés, para efectuar apareamientos compatibles de una misma
progenie. Sin embargo, existen reportes de que mediante tal metodología los
híbridos no siempre superan a las cepas parentales (Gaitán, 2000; Salmones et al.,
2004).

Por otra parte, es un método lento debido a que es necesario fructificar las cepas,
por medio de la inoculación del micelio en un sustrato que contenga lignina, celulosa
y una fuente de nitrógeno, para obtener la esporada y después nuevamente llevar
las cepas obtenidas a fructificación en una etapa posterior para evaluar sus
características de fructificación. Otra desventaja de este método es la necesidad de
realizar una gran cantidad de apareamientos, ya que no se tienen las bases
genéticas y moleculares para asegurar la presencia de las características deseadas
en la progenie obtenida. Esta incertidumbre sobre el aporte genético presente en
las basidiosporas se debe a que para su segregación el micelio dicariótico sufre
primeramente la cariogamia y posteriormente la meiosis. Durante la cariogamia se
fusionan los núcleos del micelio dicariótico produciendo un núcleo zigótico, el cual
sufre la meiosis, fase en la cual ocurre la recombinación genética y se producen
cuatro tipos de esporas que contienen el material genético en una combinación
diferente a la que se encontraba en las cepas monocarióticas que dieron origen a la
cepa dicariote.

3.10 DEDICARIOTIZACIÓN.

La dedicariotización es un proceso mediante el cual se obtienen los dos tipos de
componentes monocarióticos (neohaplontes) de una cepa dicariótica, cuyos
neohaplontes tienen como característica la obtención de un micelio sin fíbulas.
La dedicariotización tiene la ventaja de reducir el tiempo requerido para aislar los
genotipos presentes en las cepas parentales, debido a que no se requiere fructificar
las cepas seleccionadas. Además los componentes monocarióticos de una cepa
representan la composición genética completa de la misma, por lo que aumentan
las posibilidades de obtener cepas cuyo genoma les permita expresar las
características deseadas. Ramírez-Carrillo (2011) demostró que con neohaplontes
obtenidos por el método de dedicariotización, era posible obtener apareamientos
con neohaplontes de diferentes géneros y especies, rompiendo así barreras de
compatibilidad interespecíficas e intergenéricas. Por esta razón, si se quisiera en
experimentos posteriores se podría, con un programa de mejoramiento genético,
obtener cepas asporógenas de distintos géneros implicando invariablemente la
recuperación de neohaplontes de una cepa asporógena para posteriormente
aparearlos con neohaplontes de otros géneros y especies.

3.10.1 DEDICARIOTIZACIÓN NATURAL.

Debido a que el micelio dicariótico (diploide) es muy estable, no todas las especies
poseen la característica de desdicariotizarse espontáneamente. Sin embargo, se ha
reportado para unas cuantas especies de hongos basidiomicetos una habilidad de
desdicariotizarse naturalmente. Esto consiste en que a partir de micelio dicariote
(diploide) una proporción de núcleos se separan espontáneamente para formar
micelio monocariote (haploide), este fenómeno se conoce como desdicariotización,
haploidización natural o aneuploidismo (Arita, 1979).

3.10.2 DEDICARIOTIZACIÓN ARTIFICIAL.

Existen varias técnicas que han sido utilizadas para separar artificialmente, en sus
2 componentes monocarióticos, el micelio dicariote de distintos basidiomicetos.
Estas técnicas han sido empleadas gracias a que en estos hongos basidiomicetos
presentan un micelio de tipo dicariótico con fíbulas (uniones en forma de grapa que
indican que el micelio es dicariótico). Así, al separar un micelio dicariótico (con
fíbulas) y posteriormente recuperar micelio monocariótico (sin fíbulas), es una señal
de que se ha logrado la dedicariotización. Al micelio monocariote recuperado se le
denomina neohaplonte. El término neohaplonte fue introducido por Fries y Aschan
(1952), para designar al micelio monocariótico (1N) derivado de micelio dicariótico
(1N + 1N), sin la intervención de la cariogamia y meiosis.

La dedicariotización, por métodos artificiales (Tabla 2), se ha logrado mediante
microcirugía, la cual se realiza sobre hifas terminales, justo en la etapa en que el
núcleo ha migrado hacia la fíbula, en ese momento se corta tanto la célula terminal
como la fíbula. Con este método se ha obtenido una baja reproductividad debido a
la escasa recuperación de neohaplontes Un método mecánico que podría permitir
la obtención de fragmentos miceliales, para la recuperación de neohaplontes, es la
homogeneización. Con este método se busca la obtención de trozos de hifas con
un solo núcleo. Sin embargo, los resultados obtenidos han sido que a baja velocidad
no se obtiene ningún efecto dedicariotizante, mientras que a altas velocidades los
micelios menos resistentes a las fuerzas de corte fueron selectivamente eliminados,
por lo que sólo se logró la recuperación de un núcleo (Kerruish y Da Costa, 1963).

Dentro de los métodos químicos, inicialmente, se utilizaron sustancias altamente
tóxicas como el desoxicolato de sodio o el ácido cólico (Milles y Raper, 1956). Para
este tipo de dedicariotización química se ha reportado que,en la mayoría de los
casos, se obtiene una recuperación no simétrica de los neohaplontes, es decir se
logra recuperar únicamente un núcleo del dicariote.

Otro método de dedicariotización química, utilizando soluciones no tóxicas de
glucosa-glicina y glucosa-peptona, fue implementado por Leal-Lara (1980) y Leal-
Lara y Eger-Hummel (1982). Estos autores estudiaron genéticamente 14 cepas
(entre ellas 2 mutantes) de 5 especies de basidiomicetos, logrando obtener
simétricamente los 2 componentes monocarióticos. Así mismo observaron, por el
comportamiento y morfología del micelio, que en los neohaplontes obtenidos no se
presentaron mutantes. Este método cuenta con las siguientes ventajas: obtener
cepas monocarióticas que no han pasado por el proceso de meiosis, con lo cual se
evita el problema de variabilidad genética que se presenta cuando se parte de
progenies monocarióticas obtenidas a partir de esporas, además de reducir el
tiempo requerido para aislar los genotipos de las cepas dicarióticas. Con este
método es posible obtener los 2 componentes neohaplontes de una especie, los
cuales pueden ser utilizados posteriormente para mejoramiento de cepas por
sencillos apareamientos.

Tabla 2. Métodos para dedicariotizar hongos (Leal Lara y Eger, 1982; Arias, 1998;
Valencia del Toro 2002).

3.11 HIBRIDACIONES.

Los producción de cepas híbridas por hibridaciones al azar consisten en mezclar
una alta concentración de esporas y repartirlas directamente sobre un medio
nutritivo (AEM) (Valjalo y Labarère, 2004). Luego se espera a que las esporas del
cultivo multiespórico germinen y se entrecrucen para transferir después a una nueva
caja de Petri, el área de crecimiento micelial deseada (subcultivo). Para verificar que
la mayoría son cepas dicarióticas, se toman muestras de micelios provenientes de
esta germinación.

Los apareamientos controlados consisten en fusionar monocariotes, en pares, de
dos en dos, en una caja de Petri. Después de la incubación se forma un micelio
dicariótico sobre la línea de contacto, se examina al microscopio para ver la
presencia de fíbulas (signo de la dicariotización en el caso de la mayoría de los
basidiomicetos, si bien no para todos los Agaricales), y se pasa a la colección. A
partir de estos dicariotes se preparará la semilla que será utilizada para hacer los
ensayos de fructificación.

3.12 CULTIVO DE Pleurotus spp.

El cultivo de P. ostreatus inició en 1974 en la población de Cuajimalpa (Martínez-
Carrera et al., 1991). La producción de hongos comestibles en México (Figura 6),
es una actividad relevante y Martínez-Carrera (2006) estimó volúmenes de
producción de 47,468 toneladas anuales de hongos frescos. Nuestro país es el
mayor productor de Latinoamérica ya que genera alrededor del 58.9% de la
producción total y se ubica en el 16º lugar de producción a nivel mundial. El monto
actual de las operaciones comerciales supera los 200 millones de dólares
generando alrededor de 25 mil empleos directos e indirectos. (Martínez-Carrera,
2006). Los hongos comestibles que se cultivan comercialmente en México son
principalmente el champiñón común (Agaricus sp.), casi 94% del total, siguiéndole
en importancia Pleurotus con 5% del total, y ya en cantidades insignificantes

Lentinula (con 0.04%), Ganoderma y Grifola. En el caso de los 2 últimos hongos,
reishi y maitake, todavía no existe una producción consistente, solo se tienen
registradas pruebas a escala comercial en el 2005. Las fracciones arancelarias de
importaciones y exportaciones no hacen la distinción entre hongos comestibles
silvestres y cultivados. La globalización a través de la apertura total del sector
agropecuario dentro del tratado de libre comercio de América del norte (TLCAN), a
partir del 2003, ha beneficiado y brindado nuevas oportunidades de desarrollo para
la producción de hongos comestibles por parte de los sectores social y privado.

Figura 6. Evolución histórica y tendencias de la producción comercial estimada de
hongos comestibles cultivados en México durante el periodo 1945-2004 (Martínez-
Carrera et al., 1991; Martínez-Carrera, 2000-2002; Martínez- Carrera et al., 2006).

A partir de 1994, se observó un incremento irregular de las exportaciones (Figura
7), ya que alcanzaron 1,602 toneladas en el 2000, pero disminuyeron a solo 351
toneladas en el 2001 y 1,535 toneladas en el 2004. Los volúmenes de exportación
generan divisas por más de 3.7 millones de dólares anuales. En cambio, la dinámica

de las importaciones ha sido constante, pasando de 640 toneladas en 1996, a 8888
toneladas en el 2004 con un valor económico superior a los 9 millones de dólares
(Martínez-Carrera et al., 2006).

El incremento a nivel mundial y nacional en el cultivo de hongos comestibles del
genero Pleurotus, plantea la necesidad de desarrollar técnicas para el mejoramiento
genético con la finalidad de obtener cepas comerciales que permitan ofrecer al
consumidor un alimento con atributos comerciales de calidad, y al productor, contar
con un germoplasma de alta calidad que garantice altos rendimientos en la
producción en tiempos cortos (Royse y Zaki, 1991; Sánchez y Royse, 2001)

Figura 7. Comercio exterior (Exportaciones) de hongos comestibles frescos y
procesados en México durante el periodo 1993-2004. (Martínez-Carrera, 2002;
Martínez-Carrera et al., 2000; Martínez-Carrera et al., 2006).

3.13. Pleurotus eryngii

3.13.1 NOMBRE CIENTIFICO Y COMUNES

El nombre científico de este hongo comestible es Pleurotus eryngii (Figura 8) y tiene
muy diversos nombres dependiendo de la región donde se le consuma, el más
común en español es seta de cardo aunque también se le conoce como seta de
lastra, hongo panical, chirgola, gírgola (en catalán), gírgola de panical, gardu ziza,
kardu-ziza (en euskera), boletus de las estepas, trompeta rey (King trumpet
mushroom), ostra rey (king oyster), cuerno francés, cardoncello (en Italia) o eringi
(en Japón),

Figura 8. Pleurotus eryngii

3.13.2 TAXONOMIA DE Pleurotus eryngii.

Reino: Fungí, filo: Basidiomycota, clase: Homobasidiomycetes, orden: Agaricales,
familia: Pleurotaceae, género: Pleurotus, especie: eryngii.

3.13.3 HÁBITAT DE Pleurotus eryngii.

Suele desarrollarse sobre raíces muertas de distintas plantas, sobre todo sobre las
del cardo corredor, Eryngium campestre. Suele fructificar en el otoño,
particularmente si el suelo ha recibido precipitaciones abundantes y las
temperaturas son suaves. Ocasionalmente puede fructificar en primavera, siempre
que haya sido lluviosa y cálida. Frecuentemente es atacada por larvas. Está muy
difundido por Europa meridional, siendo muy frecuente en toda España. Es una
https://es.wikipedia.org/wiki/Eryngium_campestre

excelente seta comestible típica de los países mediterráneos meridionales (sur de
Europa, norte de América y Asia central)

3.13.4 CARACTERISTICAS DE Pleurotus eryngii.

 HIMENIO:
Es la parte normalmente situada bajo el sombrero que puede tomar distintas formas,
láminas, tubos, aguijones o pliegues, cuya función principal es crear, desarrollar,
almacenar y dispersar las esporas que generaran un nuevo ciclo en la formación de
una nueva seta. En el caso de P. eryngii son láminas espaciadas, desiguales y
decurrentes de color blanco. Su color es de importancia fundamental al depositarse
sobre el mismo las esporas maduras que en grandes aglomerados son las
responsables de proporcionar los distintos colores por los que posteriormente
podrán ser clasificadas las setas de manera macroscópica
.
 LAS LÁMINAS:
Cuando el himenio está formado por láminas, estas proporcionan una gran
superficie bajo el sombrero que permite desarrollar y liberar enormes cantidades de
esporas. Las láminas de Pleurotus eryngiison blanquecinas decurrentes es decir
que estas están plegadas al pie, sus laminas son apretadas y tiende a presentar
laminillas intercaladas

 SOMBRERO:
Situado sobre el pie, ejerce la función de protección en la formación y desarrollo de
las esporas. Por su forma el sombrero se clasifica como convexo, inicialmente
circular y en la madurez más irregular, con una circunferencia de 3- 12 cm. De
acuerdo a la textura de la superficie del sombrero, está clasificado como fibroso.

 CUTICULA:
La cutícula es lisa en su madurez y húmeda y ligeramente afieltrada en su juventud,
e incluso un poco escamosa.

 PIE:
Actúa como sujeción del himenio y del sombrero, generalmente excéntrico pero en
ocasiones central, mide de 3- 10 cm. Carnoso, de la misma consistencia que el
sombrero, cilíndrico, algo ventrudo es decir obeso (abombado), más delgado en el
ápice, liso y sin anillo.

 MICELIO:
Es la parte vegetativa del hongo, y en realidad el auténtico hongo. Su misión
consiste en tomar del suelo los diversos compuestos orgánicos para alimentarse.
En ocasiones pueden parecer falsas raíces. Generalmente es de color blanco y
puede llegar a tener muchos metros de longitud.

 CARNE:
Es blancuzca con un olor poco apreciable, suave, agradable, muy característico de
la especie, de consistencia compacta y flexible pero tierna. Sabor suave y dulce. La
seta de cardo es una de las setas más apreciada por sus características sensoriales
apropiadas para todo tipo de platillos. Su sabor es más delicado que los
champiñones y las setas (Pleurotus ostreatus), es muy combinable con carnes,
pescados y hortalizas.

3.13.5 FACTORES FISICOQUÍMICOS DETERMINANTES PARA EL
CULTIVO DE Pleurotus eryngii.

Los factores fisicoquímicos determinantes para la formación de cuerpos fructíferos
de Pleurotus eryngii son: temperatura, humedad, iluminación, ventilación y pH.
Estos factores deben mantenerse constantes durante todo el periodo de cultivo y
ser lo más parecido posible al medio natural para obtener buenas producciones.
Cuando Pleurotus eryngii crece bajo condiciones óptimas presenta un estípite fuerte
y compacto, la masa principal se desarrolla como píleo y tiene un color café o crema,
pero cuando crece bajo condiciones extremas el cuerpo fructífero muestra un
crecimiento anormal. Por ejemplo cuando crece bajo condiciones de poca

iluminación el estípite es largo y grueso y el píleo se reduce de tamaño y el color es
café pálido a crema, y cuando se combina con una ventilación insuficiente con una
pobre iluminación se induce un crecimiento de hongos pequeños y en forma de
racimo (Zadrazil, 1978; Anderson, 1973).

a) La mayoría de los hongos comestibles son rnesófilos y la temperatura óptima
para su desarrollo es en un intervalo de 10 a 40°C, estando la óptima entre 25 y
30°C. La temperatura óptima para el crecimiento micelial de P. eryngii es de
25°C, para P. ostreatus y P. ostreatus «florida" es 28 °C. Por otra parte la
fructificación tiene lugar en un amplio margen de temperatura que va de 15 a
28°C (Zadrazil, 1978; Chang y Miles, 1989; Stamets y Chilton, 1983).

b) Otro factor que determina la velocidad de crecimiento micelial es la humedad
relativa (HR). Para un buen desarrollo de los basidiomicetos la humedad relativa
debe estar entre 95 a 100%, existiendo especies que se desarrollan a bajos
niveles de humedad (Chang y Miles, 1989). El rango óptimo de humedad va
entre 60-80% para el desarrollo de las especies de Pleurotus (Zadrazil, 1978).
Para el desarrollo del cuerpo fructífero, el valor óptimo está situado entre el 75-
80% y no se presenta fructificación a humedades menores al 65%. En
atmósferas saturadas (100%) el desarrollo del basidiocarpo es anormal (Leong,
1982).

c) Se ha comprobado que la iluminación tiene influencia sobre el desarrollo
vegetativo del micelio (Chang y Miles, 1989). Danai et. al (1998) observaron que
en oscuridad se produce el máximo crecimiento al usar tanto un inóculo joven (1
día) como uno viejo (5 días) pero que con Iluminación se Inhibe en mayor
proporción el crecimiento con los inóculos jóvenes que con inóculos viejos. La
iluminación es determinante para el desarrollo del primordio, pues se requiere
una exposición a una longitud de onda de 300-500 nm (luz verde) por lo menos
15 minutos al día. Por tanto este factor repercute directamente en la calidad y
los rendimientos del cultivo (Zadrazil, 1978). Para el desarrollo final del cuerpo

fructífero se requiere de una Iluminación de luz blanca (300-400 nm). Cuando un
cuerpo fructífero se desarrolla con poca luz el estípite es más largo y grueso y el
píleo es más reducido que en un carpóforo que se desarrolló con suficiente luz
(Zadrazil, 1978). La Intensidad de la luz determina también el color del cuerpo
fructífero (colores claros cuando hay una adecuada exposición de iluminación y
colores pálidos cuando la exposición es pobre), mientras que la dirección de ésta
determina que los estipes sean centrales, excéntricos o laterales (Eger, 1979 y
Leong, 1982).

d) Con la ventilación se regula la concentración de O2 y CO2. La mayoría de los
hongos son aerobios, pueden crecer en bajas concentraciones de oxígeno
(Chang y Miles, 1989). El oxígeno y dióxido de carbono son indispensables en
el desarrollo del micelio y en la formación del cuerpo fructífero. Una
concentración relativamente alta de CO2 (20-28%) en el aire es útil para
estimular el crecimiento del micelio de Pleurotus spp. Sin embargo
concentraciones superiores a 30% inhiben la formación de primordios, por ello,
cuando se desea producir hongos de manera comercial es necesario
implementar un buen sistema de ventilación en la cámara de fructificación de tal
manera que elimine constantemente el CO2 formado por la misma respiración
del hongo (Zadrazil, 1978). Una ventilación deficiente se manifiesta en
deformaciones del cuerpo fructífero. El crecimiento del micelio se da en
condiciones semi anaerobias y el desarrollo de carpóforos bajo condiciones
aerobias (Lealham y Staham, 1987; Leong, 1982).

e) Los hongos comestibles necesitan sustratos con un pH ligeramente ácido a
neutro, 5 a 7. Se ha determinado que el crecimiento micelial en cultivos
sumergidos con valores de pH ácido entre 4 a 6 es favorable para el crecimiento
del micelio de Pleurotus ostreatus "florida" y P. eryngii. El pH óptimo para P.
ostreatus "florida" está entre 5.5 y 6.5; para P. eryngii es ligeramente más bajo
entre 5 y 6. A pH básicos el crecimiento de Pleurotus es inhibido (Zadrazil 1978).

3.13.6 VALOR NUTRITIVO DE Pleurotus.

El valor nutritivo de Pleurotus spp ha sido reconocido desde hace mucho tiempo.
Sus proteínas contienen todos los aminoácidos esenciales y son de valor nutritivo
más alto que las proteínas de plantas, con una calidad muy cercana a la proteína
animal (Sánchez y Royse, 2002). Adicionalmente a su valor como alimento rico en
proteína, los hongos contienen carbohidratos, en particular carbohidratos
poliméricos como el glucógeno y la quitina, y varios compuestos carbonados de bajo
peso molecular como la glucosa, fructosa, galactosa, trealosa y muchos otros. Son
ricos en minerales como el potasio, el fósforo y el hierro. Contienen un amplio rango
de vitaminas y son particularmente ricos en tiamina (B1), riboflavina (B2), así como
en ácido pantoténico (B5), ácido ascórbico (C), ergosterol (D) y biotina (H). La
riqueza en fibra cruda debe ser igualmente mencionada. (Sánchez y Royse, 2001).

En particular, las setas (Pleurotus) se caracterizan por tener buenos contenidos
proteicos entre 26 a 35% en peso seco Chang y Miles (1989) habiéndose llegado
a reportar valores de 42.5% para Pleurotus citrinopileatus (Ragunathan et al., 2003).
Este dato es significativo si se compara con el 7.3% del arroz, 25.2% de la leche y
32.2%del trigo (Martínez-Carrera y Larque-Saavedra, 1990). El contenido de lípidos
que presentan las cepas oscila en el intervalo de 1.08% a 9.4% (Valencia y Álvarez
Garin, 2000).

Los carbohidratos son los constituyentes que se encuentran en mayor porcentaje
en las especies de Pleurotus spp con contenidos que van de 46% hasta 59.2%. Los
principales carbohidratos son diversos tipos de hexosas (32.26%), carbohidratos
solubles (4.2%) y pentosas (1.66%) (Bano y Rajathaman, 2002).

En humedad llega a tener este hongo alrededor de 70 a 90 % (Tabla 3).

Tabla 3. Valores reportados de composición de Pleurotus spp. (Valencia y Álvarez
Garín, 2000).

Específicamente para el género Pleurotus spp., los valores de aminoácidos
reportados indican que son ricos en los aminoácidos esenciales arginina, histidina,
lisina, leucina y valina, con 11.1, 8.5 y 8.5 g/100g respectivamente, así como
metionina, fenilalanina, treonina, triptófano. Respecto a los aminoácidos no
esenciales se encuentran presentes alanina, ac. aspártico, ac. glutámico, glicina,
prolina, serina y tirosina.

Las setas son también una buena fuente de vitaminas hidrosolubles,
particularmente del complejo B, aunque son escasas las clasificadas como
liposolubles (A, D, E y K) (Valencia y Álvarez Garin, 2000).

Constituyentes
Crisan y Sands,
1978
Bano y Rajarathnam,
1982
Chang y miles,
1989
Valencia
del Toro et
al., 1995
Valencia
del Toro et
al., 1997
Humedad 73.1-91 73.3 73.0-90.8 87.3-89.8 91.7-94.2
Proteina 10.0-30.4 10.5 10.3-30.4 26.2-32.1 21-31.5
Grasa 1.6-7.2 1.6 1.6-9.8 3.4-7.9 3.0-7.1
Cenizas 6.1-10.7 6.1 6.1-9.8 3.9-6.5 3.7-8.7
Fibra cruda 7.5-11.9 7.5 7.5-8.7 6.9-10.1 7.7-14.2
Referencias

4 JUSTIFICACIÓN.

Pleurotus eryngii está teniendo cada vez más popularidad en ciertas regiones de los
Estados Unidos, como un producto gourmet. En México hace algunos años se
estuvo importando este hongo vendiéndose en los supermercados a un precio
promedio de $660 el kilogramo y en la actualidad este hongo ya se produce en
México pero el precio se mantiene alto, ronda los 700 $/kg. Esto hace que el
producto esté limitado en su comercialización. Una mejora en los rendimientos
disminuiría los costos de producción y los precios de venta, y así se promovería la
popularidad de este hongo facilitando su comercialización en el mercado nacional,
abriéndose asimismo una opción para exportar hongos frescos a los Estados Unidos

Dentro de las diferentes estrategias para mejorar la producción de los hongos
comestible y también de P. eryngii, se ha evaluado el uso de distintos ingredientes
del sustrato y la adición de suplementos (Curvetto et al., 2002; Rodríguez Estrada y
Royse, 2007; Royse et al., 2004; Schisler, 1990; Schisler y Sinden, 1962; Sinden y
Schisler, 1962). No obstante existe todavía controversia sobre una formulación
óptima de sustrato para el caso de P. eryngii, pero también sobre el efecto de
distintas variables de cultivo como el tiempo de incubación, el tipo y tamaño de
contendor (bolsa) con sustrato y la mejor manera de inducir la fructificación como el
efecto del choque térmico y el rascado de la bolsa con micelio. Es importante por lo
tanto realizar una investigación para definir el efecto de cada una de estas variables.
Tampoco existen reportes sobre la producción de P. eryngii utilizando diferentes
cepas y mucho menos sobre la posibilidad de desarrollar cepas mejoradas de este
hongo. Es por lo tanto también importante producir híbridos a partir de cepas
comerciales. Esto es posible a través de recuperar sus componentes
monocarióticos (neohaplontes) por medio de su dedicariotización. Al disponer de los
componentes monocarióticos (neohaplontes) será factible producir híbridos tanto
entre cepas de P. eryngii como con otras especies de Pleurotus spp.

5. HIPÓTESIS.

 Será posible definir condiciones del proceso que permitan mejorar la
producción de Pleurotus eryngii, tales como la composición del sustrato, el
tiempo mínimo de incubación, el tamaño del contenedor del sustrato (bolsa)
y la conveniencia de tratamientos de inducción para la fructificación (rascado
o choque térmico)

 Será posible recuperar los 2 componentes monocarióticos de las 2 cepas
comerciales de P. eryngii, (FQ Y MB) por dedicariotización química en
soluciones de peptona y glucosa

6. OBJETIVOS.

6.1 Objetivo general

Desarrollar alternativas para mejorar la factibilidad de una producción comercial de
Pleurotus eryngii optimizando parámetros del proceso productivo y además obtener
cepas híbridas de interés comercial por apareamientos entre neohaplontes de
cepas dicarióticas comerciales de Pleurotus eryngii.

6.2 Objetivos particulares.

Evaluar tratamientos alternos para fructificación, realizando variaciones en el tiempo
de incubación, sustrato, cepa, choque térmico y optimización de tamaño de
contenedor de sustrato e inducción por rascado para mejorar rendimientos y
disminuir tiempo de producción.

Obtener los dos componentes monocarióticos (neohaplontes) de 2 cepas
comerciales de P. eryngii, MB y FQ, mediante dedicariotización química para
realizar apareamientos.

Realizar apareamientos entre los neohaplontes de P. eryngii para obtener cepas
reconstituidas y los híbridos.

Seleccionar las cepas híbridas que se llevarán a fructificación para evaluar sus
características fenotípicas y de producción.

Seleccionar las cepas híbridas con altos rendimientos y características novedosas
para su eventual uso comercial.

7. MATERIALES Y MÉTODOS.

7.1 Material biológico.

Se utilizaron 2 cepas comerciales de Pleurotus eryngii (MB y FQ). La cepa FQ fue
aislada por el Dr. Hermilo Leal Lara, subcultivando tejido vegetativo del cuerpo
fructífero de un producto fresco adquirido de una cadena comercial en la ciudad de
México en el 2006, mientras que la cepa de MB se aisló de una seta del mismo
género producida por la empresa de Monte Blanco.

7.2 Preparación de medio de cultivo (agar de extracto de malta).

Se preparó el medio de agar de extracto de malta (AEM) disolviendo 7.5 g de
extracto de malta Bioxon® en 100 mL de agua destilada, a continuación se
agregaron 9 g de agar bacteriológico, se agitó el matraz con la finalidad de dispersar
el agar y se adicionaron 400 mL de agua destilada, volviendo nuevamente a agitar
para disolver todo el medio. El medio ya preparado se esterilizó en autoclave a
121ºC y 15 Lb/in2 de presión durante 45 minutos. Del medio estéril se vertieron 10
mL en cajas Petri estériles. Una vez que el medio ha solidificado, las cajas Petri se
colocaron en bolsas de plástico y se incubaron 24 horas a 24ºC para verificar su
esterilidad. Este medio se utilizó para la propagación vegetativa de las cepas.

7.3 Purificación de la cepa.

Las cepas de Pleurotus eryngii proporcionadas por el Dr. Hermilo Leal se
encontraban en un medio de agar extracto de malta (AEM). Se determinó su pureza
por medio de observación en el microscopio de colonias obtenidas por resiembras
de esas cepas para confirmar la presencia de fíbulas (dicariotes) y la ausencia de
mohos o bacterias contaminantes.

7.4 Fructificación de cepas de Pleurotus eryngii.

7.4.1 Preparación de inoculo de grano.

Para la preparación del inóculo se utilizó trigo estéril. Primeramente el trigo se hirvió
en exceso de agua por 45 minutos y posteriormente se drenó y se lavó con agua
fría. Al trigo frío se le adicionó 1.3% de CaCO3 y 0.3% de CaSO4 para regular el pH
óptimo para el desarrollo del micelio y después de un mezclado, se llenaron bolsas
de polipropileno con 500 g de mezcla, se cerraron con una liga y después se
esterilizaron por 2 horas a 121°C y 20 Lb/in2. El grano estéril, ya frío, se inoculó con
el micelio que se había desarrolladoen las cajas Petri y se incubó por 15 a 20 días,
hasta que el trigo estaba completamente invadido por el micelio.

7.4.2 Determinación de humedad del sustrato.

Este parámetro se determinó pesando cinco muestras de cada sustrato en cajas
Petri a peso constante y se colocaron en una estufa a 60°C por 24 horas. Después
de este tiempo las muestras se volvieron a pesar. El contenido de humedad se
determinó con la siguiente fórmula

𝑯𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅 (%) = (
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒐 − 𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒔𝒆𝒄𝒐
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒐
) 𝑿 𝟏𝟎𝟎

7.4.3 Preparación de sustratos.

Se pesaron los ingredientes de los distintos sustratos en las cantidades indicadas
en la Tabla 12 (experimento 1 y 2) y Tabla 19 (experimento 3). A continuación se
adicionó agua de manera gradual mezclando continuamente los ingredientes.

El agua añadida fue la necesaria para alcanzar un contenido de humedad del 67%,
la cual se determinó en una prueba previa con una muestra de 1 kg de sustrato. A
la mezcla húmeda se le añadió sulfato de calcio y carbonato de calcio de acuerdo a
cada formulación. Se llenaron bolsas de polipropileno con 2 o 3.5 kg de sustrato
húmedo y se esterilizaron en autoclave a 121°C, 15 Ib/𝑖𝑛2 durante 3 horas. Después
de enfriar el sustrato por 24 horas, se inoculó con el grano de trigo al 5% y se
anotaron los pesos de cada bolsa. El sustrato ya inoculado se colocó en un cuarto
de incubación (24°C) donde permaneció por 21, 35 o 49 días.

7.4.4 Producción de esporóforos.

Al término del periodo de incubación, las bolsas con sustrato se encontraban
completamente invadidas por el micelio, y antes de transferirlas al área de
fructificación, en algunos casos se realizó una estimulación del micelio dando
frotaciones a la superficie de las bolsas durante 1 minuto o bien colocándolas por
24 horas en un cuarto frío a 4°C., ambos métodos se realizan para provocarle estrés
al hongo y que se induzca la fructificación como método de supervivencia. En el
cuarto de producción la temperatura se mantuvo a 181 °C, con humedad relativa
de 75-90 %, con una ventilación de aire fresco continua para buscar mantener
niveles bajos de CO2. Después de 1 o 2 semanas, dependiendo del tratamiento, se
formaron primordios sobre la superficie del sustrato. En cuanto los primordios
alcanzaban una altura de aproximadamente 2 cm, se cortó la parte superior de las
bolsas. En un lapso de 4 a 6 días, los primordios crecieron hasta alcanzar el tamaño
de un producto comercial de Pleurotus eryngii (8 a 10 cm de altura). En ese
momento se cosecharon los esporóforos cortándolos con un cuchillo en la base.

Se registraron los pesos de los hongos cosechados en cada sustrato con lo cual se
determinó la producción por bolsa de sustrato. La eficiencia biológica se calculó
usando la cantidad de hongos cosechados, el contenido de humedad del sustrato
ya esterilizado y el peso húmedo de cada bolsa con sustrato.

E.B. = (
g hongos frescos
100 g de sustrato seco
) 𝑥100

7.5. Dedicariotización de cepas de Pleurotus eryngii y producción
de híbridos.

7.5.1 Preparación de soluciones para dedicariotizar.
Se prepararon soluciones dedicariotizadoras a dos concentraciones (20 y 30 g/L)
de peptona P (Oxoid) y glucosa anhidra disueltas en agua destilada. Se colocaron
50 mL de la solución dedicariotizadora en matraces Erlenmeyer de 125 mL de
capacidad y se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 15 Lb/in2 de presión por 30
minutos. Los matraces estériles se incubaron por 24h a 24ºC para comprobar su
esterilidad. Estas soluciones dedicariotizadoras fueron utilizadas para la obtención
de los componentes monocarióticos (neohaplontes) de las diferentes cepas de
Pleurotus eryngii.

7.5.2 Preparación del inóculo para la dedicariotización.

Se resembraron las 2 cepas de Pleurotus eryngii en EMA, colocando 5 inóculos de
0.5 mm de diámetro en 5 puntos equidistantes en la placa de agar, a 1.5 cm de
distancia del borde de la caja. Las cajas se incubaron a 18ºC o 24°C hasta que la
caja Petri estuviera totalmente invadida por el micelio. La placa de EMA invadida de
micelio se cortó en cuadros de 1cm2 y se colocaron en un homogeneizador estéril
con 50 mL de agua destilada estéril (etapa de maceración).

El homogeneizador se operó por diferentes tiempos (3 hasta 5 minutos) a la
velocidad más alta. Los matraces con solución dedicariotizadora se inocularon con
50 µL de micelio homogeneizado y se incubaron a 18ºC por 15-30 días.

7.5.3 Dedicariotización de cepas de Pleurotus eryngii.

Después de 4 días de incubación, se evaluó la presencia de micelio en crecimiento
en los matraces con solución dedicariotizadora y en caso positivo, el contenido del
matraz se vertió en un homogeneizador estéril y se operó a máxima velocidad por
60 segundos (etapa de homogenización). Se tomaron 25 µL del micelio
homogeneizado que se inocularon en cajas con EMA, añadiéndosele 100 µL de
agua destilada estéril para facilitar una distribución homogénea del micelio
homogeneizado sobre la superficie de la placa de agar. A continuación las cajas
Petri se incubaron a 18ºC o 24 °C hasta la aparición de colonias. Las colonias
obtenidas se observaron al microscopio para determinar la presencia o ausencia de
fíbulas. Las colonias en donde se observó ausencia de fíbulas (neohaplontes o
micelio de tipo monocariótico) fueron aisladas y resembradas en EMA, para verificar
la ausencia de fíbulas en su nuevo crecimiento.

7.5.4 Clasificación de los neohaplontes.

Antes de realizar los apareamientos se verificó el carácter monocariótico de todos
los neohaplontes resembrándolos en cajas Petri, donde se verificó en el microscopio
la ausencia de fíbulas. Posteriormente, en cajas Petri con medio EMA, se realizaron
los apareamientos entre los neohaplontes obtenidos de la cepa P. eryngii FQ y los
de la cepa MB en todas las posibles combinaciones. Para ello se cortaron de las
colonias en crecimiento, cubos de agar de medio centímetro aproximadamente que
se colocaron en pares en los 4 puntos equidistantes de una caja (2 neohaplontes
diferentes por cada punto de la caja). Después de incubarlos a 24°C por 72 h fueron
revisadas diariamente al microscopio para determinar la formación de fíbulas,
indicadoras de micelio dicariótico.

7.5.5 Hibridación y cepas reconstituidas.

Se seleccionaron algunos de los neohaplontes ya clasificados de cada cepa, para
realizar nuevos apareamientos. Se aparearon neohaplontes de tipo 1 con los de tipo
2 de cada cepa para obtener cepas reconstituidas. También se realizaron
apareamientos entre los neohaplontes de las dos cepas, MB vs FQ, para obtener
híbridos inter-cepa.

8. RESULTADOS.

El objetivo de este trabajo consistía en optimizar distintas variables y parámetros
para aumentar la factibilidad de la producción comercial de P. eryngii en México.
Adicionalmente a la optimización de los parámetros propios de cultivo, se consideró
necesario el desarrollo de cepas mejoradas. La obtención de cepas mejoradas se
planteó mediante el apareamiento de neohaplontes de distintas cepas comerciales.
Para ello se requería buscar las condiciones óptimas para la recuperación de los
componentes monocarióticos (neohaplontes) por dedicariotización de las cepas
comerciales MB y FQ de Pleurotus eryngii.

8.1 DEDICARIOTIZACIÓN DE CEPAS COMERCIALES DE P. eryngii
(MB Y FQ).

Para poder obtener los dos componentes monocarióticos de las 2 cepas
comerciales de Pleurotus eryngii, MB y FQ, se tomó como referencia la metodología
desarrollada por Leal Lara (1980) y Arteaga Santillán et al. (1996) para
dedicariotización de cepas. Cabe mencionar que se modificaron algunas
condiciones, a continuación, se presentan las condiciones utilizadas para el
experimento 1:

 Tiempo de macerado: 3, 3.5,