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10.8.2022

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Biología

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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLÁN

Optimización de pretratamiento de muestras de plasma
para cuantificar residuos de Zilpaterol por Cromatografía
de Líquidos acoplado a Espectrometría de Masas

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA

PRESENTA:
PERLA XOCHITL CRUZ VALDEZ
ASESORES:
Dra. Raquel López Arellano
M. en C. Mariana Dolores Hernández

CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO, 2017
UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
http://www.google.com.mx/imgres?q=escudo+unam&hl=es&rlz=1T4ADRA_esMX446MX448&biw=1024&bih=474&gbv=2&tbm=isch&tbnid=m3Kh6y4CVjZDrM:&imgrefurl=http://historias-del-lado-sucio.blogspot.com/2010/09/como-no-te-voy-querer.html&docid=OP1wpF2ZP3QrtM&imgurl=http://4.bp.blogspot.com/_w-TSP9jWRr8/TJ706UbaBGI/AAAAAAAABgo/XkF4FDVJ8qA/s1600/unam_escudo.jpg&w=912&h=1024&ei=uSeaTvqYDcuLsALXx-y5BA&zoom=1

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OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

III
AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Raquel López Arellano y al DAR. Juan José Díaz:
Por permitirme se parte de LEDEFAR y brindarme la oportunidad de terminar este
proyecto tan importante en mi vida, también por ser un ejemplo de inteligencia y liderazgo
para muchos de nosotros.
A Mariana y la Maestra Ady:
Por la oportunidad de poder trabajar a su lado, por su ayuda, por sus explicaciones y sobre
todo por la gran paciencia que me tuvieron en este proyecto.
A mis Sinodales:
Por el tiempo que dedicaron a hacer las correcciones necesarias para mejorar mi trabajo de
tesis.

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

IV
ÍNDICE GENERAL

AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ III
ÍNDICE GENERAL ............................................................................................................. IV
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................... V
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... VIII
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. X
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. XII
1. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 1
1.2 ZILPATEROL ............................................................................................................. 3
1.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES ..................................................................... 3
1.2.2 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS ..................................................................... 6
1.2.3 ESTABILIDAD ....................................................................................................... 6
1.2.4 SOLUBILIDAD ....................................................................................................... 6
1.3 SANGRE ..................................................................................................................... 7
1.3.1 DESCRIPCIÓN ....................................................................................................... 7
1.3.2 COMPONENTES DEL PLASMA .......................................................................... 7
1.3.3 OBTENCIÓN DEL PLASMA ................................................................................ 8
1.4 IMPORTANCIA DE CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL EN PLASMA
DE BOVINO. ......................................................................................................................... 9
1.5 MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS (PURIFICACIÓN DE
MUESTRAS) ....................................................................................................................... 12
1.5.1 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS .................................................................... 12
1.6 EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA ......................................................................... 16
1.7 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (UPLC/MS/MS). ......................................................... 19
1.7.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS ....................................................................... 20
1.8 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ........................................................ 21
2. OBJETIVOS.................................................................................................................. 25
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 27
DESARROLLO EXPERIMENTAL .................................................................................... 30
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 41
5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 77
6. ANEXOS ....................................................................................................................... 78
7. REFERENCIAS ............................................................................................................ 79

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

V
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 1: PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DEL ZILPATEROL ................................ 6
TABLA 2: COMPOSICIÓN DE LA SANGRE, PLASMA LÍQUIDO Y PAQUETE
CELULAR BOVINO (G/100 ML). ................................................................................. 7
TABLA 3: TÉCNICAS EMPLEADAS PARA LA PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS .. 15
TABLA 4: RANGO ACEPTABLE PARA LA PRECISIÓN DE LOS ANALITOS
ESTABLECIDO POR LA GUÍA VICH GL 49. ........................................................... 23
TABLA 5: PRECISIÓN ACEPTABLE (% CV) DE LOS ANALITOS ESTABLECIDA POR
LA GUÍA VICH GL 49. ................................................................................................ 24
TABLA 6: REACTIVOS. ..................................................................................................... 27
TABLA 7: ESTÁNDAR PRIMARIO. .................................................................................27
TABLA 8: MATERIAL. ...................................................................................................... 28
TABLA 9: APARATOS E INSTRUMENTOS. ................................................................... 29
TABLA 10: CURVA DE CALIBRACIÓN DEL ZILPATEROL PARA LA LINEALIDAD
DEL SISTEMA. ............................................................................................................ 32
TABLA 11: SELECCIÓN DEL AGENTE PRECIPITANTE. ............................................. 32
TABLA 12: PROCEDIMIENTO PARA ESTABLECER LA CONCENTRACIÓN A LA
CUAL ES SATURADO EL CARTUCHO. .................................................................. 33
TABLA 13: PROPORCIÓN DE NH4OH Y CH4O PARA LA MEZCLA DE ELUCIÓN. .. 34
TABLA 14: CONDICIONES PARA OPTIMIZAR EL TIEMPO, VOLUMEN Y PRESIÓN
DE EXTRACCIÓN EN EL EQUIPO DE PRESIÓN POSITIVA. ................................ 35
TABLA 15: SELECCIÓN DEL AGENTE PRECIPITANTE POR MEDIO DE
UPLC/MS/MS ............................................................................................................... 35
TABLA 16: SELECCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL ÁCIDO
TRICLOROACÉTICO. ................................................................................................ 36
TABLA 17: PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE ÁCIDO FÓRMICO. ............... 36
TABLA 18: PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE NH4OH. ................................. 37
TABLA 19: ORDEN DE ADICIÓN DEL ÁCIDO FÓRMICO A DIFERENTES
CONCENTRACIONES. ............................................................................................... 37
TABLA 20: ORDEN DE ADICIÓN DEL NH4OH A DIFERENTES CONCENTRACIONES
/ CH4O EN LA MEZCLA DE ELUCIÓN. .................................................................... 37
TABLA 21: CURVA DE CALIBRACIÓN DEL SISTEMA. .............................................. 38
TABLA 22: PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES STOCK DE ZILPATEROL PARA
LA CURVA DE CALIBRACIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC) EN
PLASMA ....................................................................................................................... 39

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

VI
TABLA 23: CURVA DE CALIBRACIÓN EN PLASMA DE BOVINO Y LÍMITE DE
CUANTIFICACIÓN (LC) DE ZILPATEROL EN PLASMA. ..................................... 40
TABLA 24: PREPARACIÓN DE STOCK DE ZILPATEROL PARA PUNTO CONTROL Y
LÍMITE DE DETECCIÓN (LD). .................................................................................. 40
TABLA 25: LIMITE DE DETECCIÓN (LD) DE ZILPATEROL EN PLASMA DE
BOVINO. ...................................................................................................................... 40
TABLA 26: CONDICIONES DE IONIZACIÓN DE ZILPATEROL. ................................ 41
TABLA 27: PARÁMETROS DE FRAGMENTACIÓN DE IÓN MOLECULAR DE
ZILPATEROL. .............................................................................................................. 42
TABLA 28: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DE LAS DIFERENTES
PROPORCIONES DE FASE MÓVIL. ......................................................................... 44
TABLA 29: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA CON LOS
DIFERENTES MODOS DE INYECCIÓN. .................................................................. 46
TABLA 30: CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ÓPTIMAS. ................................... 47
TABLA 31: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DEL ZILPATEROL
CON LA ACETONA Y EL ÁCIDO TRICLOROACÉTICO COMO AGENTES
PRECIPITANTES. ........................................................................................................ 51
TABLA 32: COMPARACIÓN DEL % DE RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL
OBTENIDO A DIFERENTES CONCENTRACIONES DEL ÁCIDO
TRICLOROACÉTICO. ................................................................................................ 52
TABLA 33: COMPARACIÓN DEL % DE RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL
OBTENIDO A DIFERENTES VOLÚMENES DE CARGA. ...................................... 56
TABLA 34: COMPARACIÓN DEL % DE RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL
OBTENIDO A DIFERENTES TIEMPOS DE CARGA. .............................................. 56
TABLA 35: COMPARACIÓN DEL % DE RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL
OBTENIDO A DIFERENTES PRESIONES DE CARGA. .......................................... 59
TABLA 36: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DEL ZILPATEROL A
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ÁCIDO FÓRMICO COMO SOLUCIÓN
DE LAVADO 1. ............................................................................................................ 60
TABLA 37: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DEL ZILPATEROL A
DIFERENTES CONCENTRACIONES DEL HIDRÓXIDO DE AMONIO EN LA
SOLUCIÓN DE ELUCIÓN. ......................................................................................... 62
TABLA 38: COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DEL ZILPATEROL A
DIFERENTES PROPORCIONES DE LA MEZCLA DE ELUCIÓN. ......................... 64
TABLA 39: PARÁMETROS Y CRITERIOS DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO
BIOANALÍTICO. ......................................................................................................... 68

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

VII
TABLA 40: RELACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ZILPATEROL EN FUNCIÓN
DE LA RESPUESTA ANALÍTICA (ÁREA). .............................................................. 69
TABLA 41: EXACTITUD Y PRECISIÓN DEL SISTEMA. ............................................... 70
TABLA 42: RELACIÓN DE CONCENTRACIÓN ADICIONADA DE ZILPATEROL EN
FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN RECUPERADA PARA DETERMINAR LA
LINEALIDAD DEL MÉTODO. ................................................................................... 71
TABLA 43: ANÁLISIS DE VARIANCIA Y DE REGRESIÓN LINEAL DEL MÉTODO DE
ZILPATEROL. .............................................................................................................. 72
TABLA 44: EXACTITUD Y PRECISIÓN ABSOLUTA DEL MÉTODO. ........................ 74
TABLA 45: COMPARACIÓN DEL PROMEDIO DEL % DE RECUPERACIÓN GLOBAL
RELATIVO Y % DE RECUPERACIÓN GLOBAL ABSOLUTO. ............................. 74
TABLA 46: ANÁLISIS DE VARIANZA. ........................................................................... 75
TABLA 47: DATOS EXPERIMENTALES DEL LÍMITE DE DETECCIÓN Y DEL LÍMITE
DE CUANTIFICACIÓN. .............................................................................................. 75

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: ESTRUCTURA DEL CLORHIDRATO DE ZILPATEROL ............................. 5
FIGURA 2: ESTRUCTURA DEL ZILPATEROL EN BASE LIBRE................................... 5
FIGURA 3: ESTRUCTURA DEL DIISOPROPIL-ZILPATEROL ....................................... 6
FIGURA 4: SANGRE CENTRIFUGADA A 1500 G POR 15 MINUTOS. ........................... 9
FIGURA 5: NIVELES PLASMÁTICOS PROMEDIO DE 9 BOVINOS QUE RECIBIERON
UNA DOSIS DE 6 PPM DE ZILPATEROL DURANTE 50 DÍAS .............................. 10
FIGURA 6: DISMINUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DESPUÉS DE LA
ADMINISTRACIÓN DE 6 PPM DE ZILPATEROL EN DIFERENTES TEJIDOS DE
BOVINO ....................................................................................................................... 11
FIGURA 7: PROCESADOR DE PRESIÓN POSITIVA-96 CON CARTUCHOOASIS MCX
PARA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA. ................................................................ 19
FIGURA 8: CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE
MASAS. ........................................................................................................................ 20
FIGURA 9: FRAGMENTACIÓN MOLECULAR DEL ZILPATEROL, EMPLEANDO
COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN METANOL. ........................................................ 42
FIGURA 10: ELECCIÓN DE FASE MÓVIL A: 1) FORMIATO DE AMONIO 5 MM; 2)
ÁCIDO FÓRMICO AL 0.2%; 3) ÁCIDO FÓRMICO AL 0.2% / METANOL (95:5). 43
FIGURA 11: CROMATOGRAMAS DE LAS DIFERENTES PROPORCIONES DE FASE
MÓVIL [(ÁCIDO FÓRMICO / METANOL (95:5)] / METANOL. ............................. 45
FIGURA 12: COMPARACIÓN DE LOS PICOS DE ZILPATEROL CON LOS
DIFERENTES MODOS DE INYECCIÓN. .................................................................. 46
FIGURA 13: CROMATOGRAMA: A) CROMATOGRAMA ANTES DE LA
SATURACIÓN DEL CARTUCHO OASIS MCX; B) CROMATOGRAMA DESPUÉS
DE LA SATURACIÓN CON 30200 NG/ML DE ZILPATEROL DEL CARTUCHO
OASIS MCX. ................................................................................................................ 48
FIGURA 14: ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LOS 5 AGENTES PRECIPITANTES. .. 50
FIGURA 15: CROMATOGRAMA DE LA RESPUESTA ANALÍTICA DE ZILPATEROL
CON ACETONA Y ÁCIDO TRICLOROACÉTICO COMO AGENTES
PRECIPITANTES. ........................................................................................................ 51
FIGURA 16: COMPARACIÓN DEL SOBRENADANTE OBTENIDO CON ÁCIDO
TRICLOROACÉTICO DESPUÉS DE LA PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS: A)
2.5%; B) 5.0% Y C) 10.0%. ........................................................................................... 52

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

IX
FIGURA 17: COMPARACIÓN DE LOS CROMATOGRAMAS OBTENIDOS CON
ÁCIDO TRICLOROACÉTICO DESPUÉS DE LA PRECIPITACIÓN DE
PROTEÍNAS: A) 2.5%; B) 5.0% Y C) 10.0%. .............................................................. 53
FIGURA 18: ESTRUCTURA DE LA FASE ESTACIONARIA DE OASIS MCX. ............ 54
FIGURA 19: ESQUEMA GENERAL DEL PROCEDIMIENTO DE SPE PARA LA
PURIFICACIÓN Y PRECONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA. ............................ 55
FIGURA 20: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DEL % DE
RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL OBTENIDO A DIFERENTES VOLÚMENES
DE CARGA. .................................................................................................................. 57
FIGURA 21: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DEL % DE
RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL OBTENIDO A DIFERENTES TIEMPOS DE
CARGA. ........................................................................................................................ 58
FIGURA 22: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DEL % DE
RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL OBTENIDO A DIFERENTES PRESIONES
DE CARGA. .................................................................................................................. 59
FIGURA 23: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DEL % DE
RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL OBTENIDO A DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE ÁCIDO FÓRMICO. ........................................................ 61
FIGURA 24: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DEL % DE
RECUPERACIÓN DEL ZILPATEROL OBTENIDO A DIFERENTES
CONCENTRACIONES DEL NH4OH EN LA SOLUCIÓN DE ELUCIÓN. ............... 63
FIGURA 25: GRAFICA DE LA COMPARACIÓN DEL ZILPATEROL LIBERADO CON
RESPECTO A LA PROPORCIÓN DE SOLVENTE ORGÁNICO (METANOL)
ADICIONADO A LA MEZCLA DE ELUCIÓN. ......................................................... 64
FIGURA 26: CROMATOGRAMAS DE LA COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA
ANALÍTICA DEL ZILPATEROL A DIFERENTES PROPORCIONES DE LA
MEZCLA DE ELUCIÓN. ............................................................................................. 65
FIGURA 27: CONDICIONES DE TRABAJO PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE
SÓLIDA. ....................................................................................................................... 66
FIGURA 28: LINEALIDAD DEL SISTEMA PARA CUANTIFICAR ZILPATEROL EN
PLASMA BOVINO. ..................................................................................................... 70
FIGURA 29: LINEALIDAD DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN
DE ZILPATEROL EN PLASMA BOVINO. ................................................................ 72
FIGURA 30: GRÁFICO DE ERROR ABSOLUTO DE LA CONCENTRACIÓN DE
ZILPATEROL (NG/ML). ............................................................................................. 73

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

X
LISTA DE ABREVIATURAS
EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético
TCA Ácido Tricloroacético
VICH Armonización Internacional Veterinaria
βAA Beta Agonista Adrenérgico
r2 Coeficiente de Correlación
r Coeficiente de determinación
Log Kow Coeficiente de reparto octanol-agua
CODEX Comité del Codex Alimentarius Internacional
pKa Constante de Disociación acida
MS1 Cuadrupolo 1
MS2 Cuadrupolo 2
etc. Entre otros
SPE Extracción en Fase Sólida
°C Grados Celsius
g Gramos
F1 Ion precursor
F2 Ion producto
M+ Iones moleculares
ES+ Ionización por electro aspersión en modo positivo
Kg Kilogramo
psi libra-fuerza por pulgada cuadrada
LQ Límite de Cuantificación
LD Límite de Detección
L Litro
Log C Logaritmo de la concentración
λ Longitud de onda
≥ Mayor o igual que
˃ Mayor que
≤ Menor o igual que
˂ Menor que
µg Microgramo
µL Microlitros
mg Miligramo
mL Mililitro
mM Milimolar
min. Minutos

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CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

XI
mol Mol
MNM Monitoreo de Reacción Múltiple
ng Nanogramo
nm Nanómetros
NOM´S Normas Oficiales Mexicanas
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura
ISO Organización Internacional de Normalización
OMS Organización Mundial de la Salud
OIE Organización Mundial de Sanidad Animal
OMC Organización Mundial del Comercio
OPS Organización Panamericana de la Salud
ppb partes por billón
% Porcentaje
R.A. Reactivo Analítico
m/z Relación masa/carga
rpm Revoluciones por minuto
SAGARPA Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación
SEMARNAT Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales
SS Secretaría de Salud
s Segundos
SENASICA Servicio Nacional Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria
ST 1 Solución de Trabajo 1
ST 10 Solución de Trabajo 10
ST 2 Solución de Trabajo 2
ST 3 Solución de Trabajo 3
ST 4 Solución de Trabajo 4
ST 5 Solución de Trabajo 5
ST 6 Solución de Trabajo 6
ST 7 Solución de Trabajo 7
ST 8 Solución de Trabajo 8
ST 9 Solución de Trabajo 9
TR Tiempo de Retención
g. Unidades de gravedad.
IUPAC Unión Internacional de Química Pura y Aplicada

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

XII
INTRODUCCIÓN
En México existe un problema de intoxicación alimentaria debido a la administración de
algunos medicamentos como el Zilpaterol que es un compuesto β-Agonista Adrenérgico
utilizado para la alimentación continua del ganado de carne en corral de engorda, cuyo efecto
es mejorarlas características del canal y la composición química de la carne al reducir el
contenido de grasa y aumentar el contenido de proteínas en poco tiempo.
Por tal motivo algunas compañías mexicanas se han interesado en el resguardo de la salud
pública y se han encargado de verificar que los productos cumplan con los criterios de
aceptación que regulan algunas Instituciones como SEMARNAT, SAGARPA y la Secretaria
de Salud, las cuales aseguran la inocuidad y calidad por medio de un control de residuos
tóxicos en los alimentos de origen animal.
Por tal motivo objetivo de esta tesis fue desarrollar y optimizar un método bioanalítico que
permita extraer, purificar y concentrar el Zilpaterol en una muestra de plasma por medio de
un cromatógrafo de líquidos acoplado a un detector de espectrometría de masas, utilizando
técnicas de Precipitación de Proteínas y Extracción en Fase Sólida que permitieron de manera
efectiva extraer el analito, estas técnicas permitieron la eliminación de mayor cantidad de
componentes que tiene la matriz biológica y que pudieron influir directamente en la
determinación.
El analito se separó utilizando una columna Acquity UPLC BEH, 1.7 µm 2.1 X 50mm, C18
en fase reversa (Fase móvil de Ácido Fórmico al 0.2% en agua / Metanol (95:5) / Metanol
95:5 v/v). La detección fue en modo positivo de Ionización Electrospray (ESI+) a través de
MRM. La reacción de transición de Zilpaterol fue de 262.08 → 244.09 m/z. El método fue
validado considerando los parámetros y criterios de la guía VICH GL49, demostrando que
es un método lineal en el intervalo de 1.6 a 12.0 ng/mL con un coeficiente de determinación
de 0.9971 y un % de recobro absoluto global del 73.83%, siendo un método exacto, preciso
y especifico, con un coeficiente de variación intra e inter-día menor al 15% en términos de
desviación estándar relativa, que bajo las condiciones propuestas representa un método
alternativo confiable para analizar por medio de UPLC MS/MS.
Palabras claves: Zilpaterol, B-Agonista adrenérgico, UPLC/MS/MS.

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

1
1. MARCO TEÓRICO
1.1 REGULACIÓN NACIONAL E INTERNACIONAL DE
MEDICAMENTOS DE USO VETERINARIO PARA CONTROLAR LA
RESIDUALIDAD DE ZILPATEROL EN BOVINO.
México es un país comprometido en preservar la salud pública y animal y se encarga de
mantener un nivel competitivo y de calidad en sus productos, es por eso que establece
medidas con las que proporciona mayor certeza en la inocuidad de los alimentos y como
parte de estas acciones se encarga de regular la presencia de residuos y contaminantes, tales
como aditivos, promotores de crecimiento, medicamentos veterinarios, plaguicidas, entre los
principales.
La regulación, el control y prevención de la contaminación ambiental y la presencia de
residuos tóxicos en alimentos en México, son responsabilidad de las siguientes instituciones
de la Administración Pública Federal:
 Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT): es la
responsable de la aplicación de la regulación para mejoramiento del ambiente y el
establecimiento de criterios ecológicos para la conservación de los recursos naturales.
 Secretaría de Salud (SS): Entre otras funciones, debe apoyar al mejoramiento de las
condiciones sanitarias del medio y operativas para propiciar un desarrollo
satisfactorio del hombre, así mismo lleva a cabo programas para evaluación e
investigación de la calidad sanitaria en alimentos y bebidas.
 Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
(SAGARPA): La SAGARPA a través del Servicio Nacional Sanidad, Inocuidad y
Calidad Agroalimentaria (SENASICA), es responsable de asegurar la inocuidad y
calidad de los alimentos de origen animal producidos internamente, de los que
ingresan al país a través de los puntos de ingreso y del control de los residuos tóxicos
en ellos, por lo que elabora y evalúa programas de monitoreo y seguimiento
epidemiológico (en caso de violaciones a los límites de tolerancia), además le
corresponde ejercer el control de productos químico farmacéuticos, plaguicidas,
biológicos, alimentos, equipos y servicios para animales.
También se aplican Normas Oficiales Mexicanas (NOM´s) de observancia obligatoria. En
materia de salud animal, se cuenta con 60 diferentes NOM’s; que son relativas a los criterios

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CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

2
y especificaciones para el monitoreo y control de residuos tóxicos en alimentos de origen
animal.
México también toma como base diversas normas y recomendaciones nacionales e
internacionales, entre las que destacan: el Comité del Codex Alimentarius Internacional
(CODEX), Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
(FAO), Organización Mundial de la Salud (OMS), Organización Panamericana de la Salud
(OPS), Organización Mundial del Comercio (OMC), Organización Mundial de Sanidad
Animal (OIE), Organización Internacional de Normalización (ISO), así como requisitos
internacionales, como son las resoluciones del Compound Evaluation System del Servicio de
Inspección y Seguridad de los Alimentos de Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos y la Directiva 96/23/CE, de la Unión Europea [1].
En México los medicamentos veterinarios no pueden ser comercializados sin el registro que
otorga la autoridad responsable; el registro de medicamentos veterinarios lo realiza el
SENASICA a través de la Dirección General de Salud Animal, llevando el control nacional
de los medicamentos veterinarios y productos alimenticios que pretenden ser aprobados para
su venta y los que ya cuentan con aprobación, además de autorizar las renovaciones
periódicas de los productos que ya se encuentran en el mercado y aprobar a los laboratorios
de constatación y control de calidad en la materia.
El registro se debe efectuar en aquellos productos que por sus características de composición,
usos o indicaciones y limitaciones, pueden representar un riesgo a los animales, para quien
los aplican y para los consumidores de los productos o subproductos de ésos animales; los
productos que deben registrarse son: biológicos, químicos, farmacéuticos, promotores del
crecimiento, alimenticios, alimentos medicados nutraceúticos, herbolarios, homeopáticos,
fórmulas magistrales y derivados de la biotecnología.
Dentro de los requisitos establecidos para el registro de productos veterinarios está el
presentar información que garantice la calidad, eficacia e inocuidad del producto, tanto para
el animal como para el consumidor de productos alimenticios procedentes de animales
tratados.
Por lo anterior es necesario partir de una base que permita estructurar un expediente de
registro que incluya información: administrativa, técnica del producto, de seguridad y
eficacia, de residuos (incluyendo métodos analíticos para detección de los contaminantes en
alimentos), así como información de pruebas de campo y control de productos [1].
La validación de la metodología analítica para la determinación de residuos químicos en
tejidos comestibles incluye todos los procedimientos necesarios para demostrar que el

OPTIMIZACIÓN DEL PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE PLASMA PARA
CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL POR CROMATOGRAFÍA DE
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3
método utilizado es confiable y reproducible por otros investigadores para la determinaciónde las concentraciones de un analito en una matriz biológica y que puede ser aplicada en
forma segura y que representen las condiciones reales en las cuales se encuentra el compuesto
[2], [3], [4]. Por lo tanto, la validación es una herramienta fundamental para demostrar que
la metodología analítica es segura y confiable para el propósito establecido [4] y también
juega un rol significativo en la evaluación e interpretación de los resultados obtenidos.
Existe una gran variedad de guías para la validación de metodologías analíticas, por ejemplo:
la Guía de “Validación de métodos analíticos utilizados en estudios de eliminación de
residuos, VICH GL49”. Que establece los criterios para realizar y validar un método
bioanalítico que tienen la finalidad de evaluar la cinética de residuos de medicamentos
veterinarios. En la cual se basa el presente trabajo.
1.2 ZILPATEROL
1.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES
El Zilpaterol, es un tipo de β-Agonista Adrenérgico, aprobado por la FDA para la
alimentación continua del ganado de carne en corral de engorda con un periodo de retiro de
72 horas previas al sacrificio [5].
Se utiliza en la producción animal porque favorece la eficiencia en el uso del alimento, que
se manifiesta en el crecimiento rápido de los animales que los consumen, debido a que
estimulan el desarrollo de masa muscular mediante el aumento en la síntesis de proteína y
reducción en la degradación de la proteína a nivel de músculo estriado, mientras que en tejido
graso reduce la lipogénesis e incrementa la lipolisis [6], [7].
Comité Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios en su 81 ͣ reunión en 2015,
publicaron una monografía sobre la “Evaluación de Residuos de Determinadas Drogas
Veterinarias” en donde menciona que el Zilpaterol produce un ligero aumento del temblor en
humanos con una dosis de 0-0.04 µg/kg de peso corporal [8].
Este β-adrenérgico presenta límites máximos de residuos para los diferentes tejidos
comestibles (ppb): hígado 3.5, riñón 3.3, y músculo 0.5 .Por sus propiedades químicas, se
consideran de baja magnitud de riesgo para la población, cuando se consumen tejidos de
animales tratados [9][10].
El Zilpaterol es seguro porque no es tóxico, no produce mutagenicidad, ni genotoxicidad, no
tiene potencial carcinogénico y no afecta negativamente la reproducción de animales.

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Además de que no representa riesgo a la población que consume productos derivados de
animales alimentados previamente con esté βAA [11].
Algunos de los efectos adversos que presentan otros β-Agonistas cuando son administrados
en dosis mayores y producen intoxicación al consumidor son:
 Nerviosismo, sudoración, insomnio, aumento de apetito y palpitaciones.
 Dolor de cabeza, temblor y espasmos musculares, broncodilatación y náuseas.
 Aumento de la presión sanguínea, aumento de la frecuencia respiratoria y cardiaca.
La dosis de Zilpaterol que se utiliza en bovinos es de 0.15 mg de Zilpaterol por kg de peso
vivo por día, la cual corresponde a una concentración en el alimento de 6 ppm para un animal
con peso promedio de 400 kg que ingiere aprox. 10 kg de alimento terminado (con un
contenido de 90% de materia seca) por día administrado durante los últimos 30 días de la
engorda en corral [12].
El Zilpaterol es un fármaco no controlado, por lo que su venta es libre al público en general.
Solo con algunas reservas de uso como son [12]:
 Realizar la dosificación con exactitud para respetar la dosis recomendada.
 Almacenar el producto en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente (<25ºC).
 Utilizar overol, casco, mascarilla con filtro contra polvo, guantes y lentes
protectores al manipular el producto.
 Evitar la inhalación directa del producto y contacto directo con la piel y ojos.
 Almacenar lejos de los alimentos y mantener fuera del alcance de los niños.
 No fumar ni consumir alimentos durante su manejo.
 En caso de contacto con la piel, enjuagar con abundante agua corriente. En caso de
ingestión accidental, administrar un bloqueador &b2 como el propranolol, bajo
estricta supervisión médica.

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PROPIEDADES QUÍMICAS
El Zilpaterol es un polvo anhidro de color blanco o ligeramente amarillo. Tiene un peso
molecular de 297.8 g/mol y su fórmula molecular es C14H19N3O2∙ HCl.
El nombre IUPAC es (±)-Trans-4,5,6,7-Tetrahidro-7-hidroxi-6-(.isopropilamino) imidazol
[4,5,1-jk]-[1]benzazepin-2(1H) 1, clorhidrato [13] .

Figura 1: Estructura del Clorhidrato de Zilpaterol [14].
El Zilpaterol en base libre tiene un peso molecular de 261.113 g/mol y su fórmula molecular
es C14H19N3O2.

Figura 2: Estructura del Zilpaterol en base libre [8].
El Zilpaterol como ingrediente activo puro tiene dos carbonos quirales y por consiguiente 4
enantiómeros ópticos. Estos enantiómeros son: " ( 6R , 7R ) " , " ( 6R , 7S ) " , " ( 6S, 7R )"
y " ( 6S, 7S) " .

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Además el Zilpaterol administrado en ganado vacuno tiene un metabolito principal, el
Diisopropil - Zilpaterol que está presente en los tejidos comestibles como son carne y leche.
Tiene un peso molecular de 255.70 g/mol y su fórmula molecular es C11H14N3O2.

Figura 3: Estructura del Diisopropil-Zilpaterol [15].
1.2.2 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS
Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas del Zilpaterol [13] [8] [16].

1.2.3 ESTABILIDAD
Es fotosensible a los 53 días a pH= 4, a los 61 días a pH= 5, a los 28 días a pH= 9 y es estable
a una temperatura de 2 a 8 °C [13].
1.2.4 SOLUBILIDAD
El Zilpaterol es muy soluble en agua (150 g/L a 20 ̊ C) [13], y en otros medios acuosos
(alrededor de 50% de producto disuelto) a diferentes valores de pH (1-10). Es sólo
Propiedad Características
Punto de Fusión 219.5-220.5 °C
Coeficiente de partición
octanol/agua
Log Kow ˂ 1 a pH 5, 7, 9, a
25°C
pKa 8.09 a 26°C.
Transiciones de MS/MS m/z = 262→244

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ligeramente soluble en metanol (aproximadamente 3%) y prácticamente insoluble en la
mayoría de los disolventes orgánicos (<0,1%) tales como etanol, acetona, acetato de etilo,
éter isopropílico, hexano, tolueno, cloroformo, diclorometano o n-octanol [8].
1.3 SANGRE
1.3.1 DESCRIPCIÓN
La sangre es un elemento constante en los organismos y su composición química cambia
en función de factores como la raza, edad, estado físico, alimentación, etc. Sin embargo
se puede hablar de una composición media: 80% agua, 18% proteínas y 2 % de hidratos
de carbono, lípidos y sales minerales y tiene un pH que esta entre 7.33 y 7.45 [17].
Se divide en dos partes, el plasma y el paquete celular, este último constituido por los
glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas. En el bovino, el plasma representa
del 60 al 65% del total y el paquete globular del 35 al 40% [18].
Tabla 2: Composición de la sangre, plasma líquido y paquete celular bovino (g/100 mL) [18].
Componente
Sangre Plasma (60%)

Paquete celular(40%)
Agua
80-85 90-92 70-78
Proteínas
15-18 6-8 25-29
Lípidos
0.15 0.5-1 0.2
Hidratos de carbono
0.1 0.08-0.12 ---
Sales minerales
1 0.8-0.9 Trazas
Otras sustancias
0.55 0.2-0.3 ---
Materia Seca
15-20 8-10 22-30
1.3.2 COMPONENTES DEL PLASMA
El plasma es una sustancia compleja, su componente principal es el agua, es de color ámbar
y su intensidad varía de acuerdo a la presencia de pigmentos biliares (bilirrubina), carotenos
y otros pigmentos. También contiene proteínas plasmáticas, sustancias inorgánicas (como

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sodio, potasio, cloruro de calcio, carbonato y bicarbonato), azucares, hormonas, enzimas,
lípidos, aminoácidos y productos de degradación como urea y creatinina, estas últimas
aparecen en pequeñas cantidades.
Las proteínas del plasma tienen ciertas funciones generales, entre las que destacan las
siguientes:
1. Mantenimiento de la presión osmótica de la sangre
2. Participación en el equilibrio electrolítico.
3. Intervención en el proceso nutritivo, como fuente de aminoácidos para los tejidos.
4. Transporte de fármacos, iones metálicos, hormonas, ácidos grasos, etc. [19].
Entre las proteínas plasmáticas se encuentran la albumina, principal agente responsable del
transporte y almacenamiento de una gran variedad de sustancias de bajo peso molecular como
la bilirrubina, cortisol, hormonas sexuales, ácidos grasos libres y de fármacos como el
Zilpaterol.
1.3.3 OBTENCIÓN DEL PLASMA [20]
La sangre se recoge en una bolsa especial que contiene anticoagulante como EDTA, se
identifica por sujeto y sexo. Inmediatamente tras la extracción se invierte suavemente la bolsa
para favorecer que la sangre se mezcle bien con el anticoagulante. Se Transportar al
laboratorio para ser procesada en un tiempo no superior a 1 hora después de la extracción. Se
vacía a tubos para centrifuga y se centrifuga a 1500g durante 15 minutos. Tras la
centrifugación se observan tres capas:
 La fracción superior o sobrenadante tras la centrifugación de aspecto claro y
transparente, y de un color amarillo pálido corresponde al plasma sanguíneo.
 La segunda fracción o intermedia es fina y de color gris-blanco, y representa la
fracción de leucocitos.
 La tercera fracción o inferior es de un color rojo oscuro y corresponde a los eritrocitos
o hematíes.
Cuidadosamente se aspira el sobrenadante y se coloca en tubos de 50 mL, debidamente
etiquetados e identificados. Seguidamente se almacena en congelador a -4ºC.

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Figura 4: Sangre Centrifugada a 1500 g por 15 minutos.
En este trabajo experimental se utilizó la muestra de plasma bovino, pues es el medio de
transporte del fármaco dentro del organismo.
1.4 IMPORTANCIA DE CUANTIFICAR RESIDUOS DE ZILPATEROL EN
PLASMA DE BOVINO.
En las diferentes áreas de la química existen diversos propósitos para la cuantificación de
moléculas en fluidos biológicos, tales como: monitoreo de fármacos, toxicología forense,
toxicología del deporte, estudios preclínicos de fase I, estudios de bioequivalencia, estudios
de farmacodinamia y farmacocinética, descubrimiento de nuevos fármacos, etc.
La selección del fluido biológico depende de muchos factores, como el tipo de absorción,
distribución y eliminación del fármaco, el grado de unión a algún componente endógeno
(tejidos, proteínas, eritrocitos), complejidad de la matriz biológica, facilidad para la
extracción, propiedades fisicoquímicas de la molécula, concentración en la muestra, tipo de
detección del método analítico, entre otras [21].
La orina, sangre y plasma son los fluidos más comunes para la cuantificación de fármacos,
sin embargo se puede lograr en otros como las heces fecales.
En el presente estudio se trabajó con plasma ya que por medio de este se favorece el proceso
de distribución del fármaco.
La duración e intensidad del efecto que presenta el Zilpaterol depende del número de
moléculas que alcancen el sitio de acción y del tiempo que permanezcan en él.

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El proceso de absorción es el único factor que produce el aumento en la concentración
plasmática del Zilpaterol. Por el contrario, los procesos de distribución, metabolismo y
excreción remueven la porción de Zilpaterol libre presente en el plasma.
Si se considera que tanto la velocidad de absorción como la velocidad de eliminación son
procesos que siguen una cinética de primer orden, es decir que son proporcionales a la
cantidad de Zilpaterol en el sitio de administración la primera y a la cantidad de Zilpaterol
en el organismo la segunda, es lógico suponer que en una primera etapa la cantidad en el sitio
de administración será mucho mayor que la cantidad de fármaco en el plasma por lo tanto la
velocidad de absorción será mayor que la de eliminación. Posteriormente, a medida que
disminuye la cantidad de Zilpaterol en el sitio de administración y aumenta su concentración
plasmática, las dos velocidades tienden a igualarse. Finalmente, la velocidad de eliminación
será superior a la absorción debido al aumento mayor de la concentración plasmática
comparada con la cantidad remanente de Zilpaterol en el sitio de administración [22]
En la literatura se demuestra que el Zilpaterol se absorbe rápidamente vía oral y los niveles
plasmáticos alcanzan un nivel máximo durante los 10 y 30 días del tratamiento. Después de
este periodo ya no hay acumulación de fármaco y comienza la eliminación en el organismo.
Figura 5: Niveles plasmáticos promedio de 9 bovinos que recibieron una dosis de 6 ppm de Zilpaterol durante 50 días
[5].
También se demuestra que se absorbe rápidamente en los tejidos y los niveles más elevados
de residuos se localizan en el hígado y los riñones, y a las 48 h de su administración el 80%
del compuesto se ha eliminado de éstos. Además de que los niveles de Zilpaterol encontrados
en el músculo son muy bajos y en la grasa son casi inexistentes. Después de 24 horas de
suspender el tratamiento, se observa una rápida caída en los niveles de Zilpaterol en todos
los tejidos.

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Figura 6: Disminución de la concentración después de la administración de 6 ppm de Zilpaterol en diferentes tejidos de
bovino [5].
La presencia de residuos veterinarios en alimentos de origen animal trae consecuencias a
nivel de salud pública, en el comercio y en la industria.
El uso de fármacos veterinarios en la producción agropecuaria hace que los consumidores de
alimentos de origen animal estén potencialmente expuestos al consumo de residuos de
sustancias que pueden tener cierto grado de toxicidad, ya que los compuestos permanecen en
el organismo animal como consecuencia del tratamiento recibido, incluyendo el principio
activo original y/o los productos de su biotransformación (metabolitos). Estas sustancias
también están presentes en los productos derivados de estos animales como son la carne, la
leche, los huevos o la miel. La presencia de estos residuos, en mayor o menor proporción,está relacionada con: la naturaleza del producto, la dosis utilizada, la forma de aplicación y
el tiempo transcurrido desde su aplicación hasta el sacrificio de los animales (en el caso de
la carne y las vísceras) o hasta la recolección del producto cuando se trata de leche, huevos
o miel [23].
En el caso de Zilpaterol, los estudios de toxicidad aguda, subcrónica, genética,
carcinogenicidad, teratogenicidad y desempeño reproductivo han demostrado que fármaco
no es tóxico, no produce mutagenicidad, ni genotoxicidad, no tiene potencial carcinogénico
y no afecta negativamente la reproducción, cuando se utiliza por parte del usuario del
producto, en la fabricación del alimento para el ganado, en los animales que lo consumen en
su ración de finalización y en el público que consume la carne, vísceras y subproductos de
los animales tratados con este fármaco [5].

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12
Los métodos de análisis para medicamentos veterinarios en los alimentos deben detectar con
fiabilidad la presencia de un analito de interés, determinar su concentración e identificar
correctamente al analito.
En éste trabajo se estableció un método analítico validado, este método proporcionó
información cuantitativa que puede ser utilizada para determinar si existen residuos del
fármaco después del tiempo de retiro que es de 72 horas antes del sacrificio del animal.
1.5 MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS (PURIFICACIÓN
DE MUESTRAS) [24].
La naturaleza de la muestra dicta el modo básico de preparar la solución a analizar. Para el
tratamiento previo de las muestras podemos ayudarnos de todas las técnicas analíticas
existentes.
La característica principal del plasma es la presencia de una gran cantidad de proteínas. A
pesar de que las proteínas son muy diferentes tanto física como químicamente a los fármacos
que comúnmente se desean cuantificar, puede llegar a existir una fuerte afinidad entre ellos
y representar una dificultad en su análisis. Por tal razón se debe realizar una
desproteinización.
La desproteinización es la remoción de proteínas de sangre, suero o plasma para obtener un
filtrado libre que nos asegure la cuantificación del fármaco sin que haya alguna interferencia.
La desproteinización de las muestras puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las
técnicas que se mencionan a continuación.
1.5.1 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
El término proteína deriva del griego "proteos" (lo primero, lo principal) y habla de su gran
importancia para los seres vivos. La importancia de las proteínas es, en un primer análisis,
cuantitativa: constituyen el 50% del peso seco de la célula (15% del peso total) por lo que
representan la categoría de biomoléculas más abundante después del agua. Sin embargo su
gran importancia biológica reside, más que en su abundancia en la materia viva, en el elevado
número de funciones biológicas que desempeñan, en su gran versatilidad funcional y sobre
todo en la particular relación que las une con los ácidos nucleicos, ya que constituyen el
vehículo habitual de expresión de la información genética contenida en éstos últimos [25].
La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los
métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la

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destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o
químicos.
Se ha desarrollado una amplia gama de técnicas de ruptura celular, que se usan a escala de
laboratorio que se pueden clasificar como:
1.5.1.1 PRECIPITACIÓN POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD.
El hecho de que las proteínas sean moléculas anfóteras se debe a que sus superficies presentan
regiones hidrofóbicas, y regiones hidrofílicas cargadas ya sea positiva o negativamente [26].
Debido a su naturaleza anfótera cuando una proteína se encuentra en solución acuosa produce
complejas interacciones con la solución que la rodea. Particularmente, cuando se agrega un
agente precipitante a la solución, las proteínas que presentan mayor hidrofobicidad (por
contar con la mayor cantidad de aminoácidos hidrofóbicos en su superficie) precipitan más
fácilmente que las de menor hidrofobicidad. En el primer caso las proteínas tienen una baja
solubilidad y en el segundo caso una alta solubilidad. De lo anterior se desprende que la
estructura de la proteína determina su solubilidad [26].
La proteína permanece en solución cuando termodinámicamente es más favorable estar
rodeada por el solvente que estar en un agregado con otra proteína formando una fase sólida.
La proteína puede insolubilizarse ya sea cambiando las características de una superficie, o
cambiando el solvente que la rodea. Como el cambiar las características de la superficie de
la molécula puede implicar cambiar la proteína misma [26].
Generalmente se opta hacer cambios en el solvente que altera la solubilidad de la proteína.
a) Precipitación de proteínas con sales: Se realiza agregando altas concentraciones
de sales a la solución en la que se encuentra la proteína para producir su precipitación.
Este método está basado en el hecho de que la adición de las sales elimina el agua de la
proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse
intermolecularmente. Aquellas proteínas que presentan mayor número de regiones
hidrofóbicas sobre su superficie, forman agregados, y precipitan más rápidamente que
aquellas que presentes pocas regiones hidrofóbicas [26].
b) Precipitación isoeléctrica: Las proteínas por su naturaleza anfóterica presentan una
carga neta negativa a pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. A determinado
pH existe un punto llamado isoeléctrico en el cual la carga neta de la proteína es cero.
A este pH la molécula es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico.

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Tipo de interacciones que se presentan entre moléculas cargadas:
 La proteína se encuentra a un pH diferente de su punto isoeléctrico, las
moléculas proteicas poseen una carga eléctrica neta del mismo signo. Debido a
esto existe una repulsión electrostática entre las moléculas ocasionando que su
solubilidad se incremente.
 Las atracciones electrostáticas son bloqueadas por pequeños agregados de las
moléculas.
 En el punto isoeléctrico el efecto de las fuerzas electrostáticas entre las
proteínas es casi nulo. En estas condiciones la solubilidad de la proteína es
mínima, y en consecuencia las moléculas de proteína tienen a unirse y a
precipitarse. A este tipo de precipitación se le llama precipitación isoeléctrica.
La precipitación isoeléctrica comúnmente se realiza a pH´s ácidos, debido a que
los ácidos son baratos y varios de ellos como el fosfórico, clorhídrico, sulfúrico
y Tricloroacético son aceptables en productos alimenticios [26].
c) Precipitación con solventes orgánicos: Los disolventes orgánicos son
generalmente buenos agentes precipitantes de proteínas debido a que por sus
constantes dieléctricas pequeñas, provocan la disminución del poder de solvatación
de sus disoluciones acuosas respecto a los iones disueltos, entre ellos los de las
proteínas, de tal manera que su solubilidad se ve disminuida y así se induce su
precipitación.Cuanto menor sea la polaridad del disolvente adicionado, mejor será
su capacidad de desproteinización. La disminución de la constante dieléctrica debida
a los disolventes orgánicos aumenta también las diferencias en el comportamiento de
la precipitación por sales (salting-out), de modo que ambas técnicas pueden ser
combinadas [27].
Se recomienda emplear proporciones de 1.5 a 2 de disolvente orgánico con respecto
al volumen de la muestra. Los disolventes orgánicos más empleados son el etanol, el
metanol y el acetonitrilo [28].

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Tabla 3: Técnicas empleadas para la precipitación de proteínas [28–30]
Método de
precipitación
Observaciones
Ácido Tricloroacético
En una concentración de 10%, se requiere una proporción de
1.0 volúmenes de disolvente con respecto a la muestra. Tiene
excelente eficiencia, debe almacenarse en frio. Presenta
dificultad para remover el reactivo de las muestras
Ácido Perclórico (6%
p/v)
Excelente eficacia, debe almacenarse en frio (peligro de
explosión). El pH final es menor a 3, puede presentar
descomposición del analito. La mayoría de los compuestos
básicos se extraen exitosamente. Se requiere una proporción
de 0.8 volúmenes de reactivo con respecto a la muestra.
Ácido Meta fosfórico
Excelente eficiencia, debe almacenarse en frio, pH final
menor a 3, probable descomposición del analito. Se requiere
una concentración al 6% en proporción 1 a 1 con respecto a
la muestra.
Sulfato de Zinc-
Hidróxido de Sodio
Excelente eficacia. Precipitado fino con pH cercano a 7. Es
conveniente trabajar a bajas temperaturas. Se requiere una
porción de 2.0 volúmenes de reactivo con respecto a la
muestra.
Saturación con (NH4)2
SO4
Moderadamente eficiente, altas cantidades de sales en el
sobrenadante, pH final cercano 7. En una proporción 1 a 1
con respecto a la muestra.
Acetonitrilo
Se requiere de una proporción de 1.5 volúmenes de
disolvente con respecto a la muestra. Adecuado para
posterior análisis mediante HPLC
Acetona
Se requiere de una proporción de 1.0 volúmenes de
disolvente con respecto a la muestra. Es conveniente trabajar
a bajas temperaturas.
Etanol
Se requiere de una proporción de 2.0 volúmenes de
disolvente con respecto a la muestra. Recomendado para
fármacos inestables a bajo pH
Ciclos de congelación-
descongelación
Poco eficiente, consume mucho tiempo.
Calentamiento 90° por 5-
15 minutos.
Poco eficiente, descomposición de la muestra, no sirve para
analitos termolábiles

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Luego de la precipitación de proteínas, suelen aplicarse sucesivos pasos de separación y
purificación de los componentes celulares. Como primer paso, puede realizarse una
centrifugación diferencial para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelos
específicos. En este caso, las proteínas asociadas a membrana quedarán en el pellet
(precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugación) y las solubles en el
sobrenadante [24].
1.6 EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
Para cuantificar el fármaco presente en plasma se requiere que esté libre de proteínas por lo
que es necesario precipitarlas antes de realizar una extracción en fase sólida.
La extracción en fase sólida tiene lugar mediante un mecanismo de intercambio iónico,
adsorción-desorción de los analitos en la superficie del material activo de las columnas,
estableciéndose un equilibrio entre la concentración de analito en la fase estacionaria y la
fase móvil [29]. La extracción en Fase Sólida es un método rápido, confiable y preciso para
la preparación de muestra, limpieza y concentración del analito de interés, libre de
interferencias y en una adecuada concentración para su detección y medición [31].
Dentro de las ventajas de la Extracción en Fase Sólida se encuentran [31,32]:
a) Rapidez en la preparación de la muestra
b) Bajo costo, debido a que hay un menor consumo de solventes y reactivos y una menor
generación de residuos.
c) Permite la concentración de sustancias a nivel de trazas.
d) Requiere una menor cantidad de muestra.
e) Elimina las posibles interferencias
f) Mejora la seguridad debido a que reduce la exposición a los solventes.
g) Es de fácil automatización permitiendo un simultáneo procesamiento de lotes de
muestras múltiples.

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17
La selección de las condiciones óptimas para la extracción depende de las propiedades
fisicoquímicas del analito de interés y de la matriz que lo rodea. A grandes rasgos, la
metodología para una extracción en fase sólida consta de los siguientes pasos [33]:
 Lavado y activación del cartucho. Esta operación tienen por objeto solvatar los
grupos funcionales del material de relleno del cartucho. Los analitos no pueden
interactuar con el relleno de la columna si sus grupos no se encuentran totalmente
“activados”.
 Aplicación de la muestra. La muestra se introduce en el cartucho relleno con
partículas sólidas recubiertas de diversos materiales similares a los usados en la
cromatografía de fase enlazada. Los analitos contenidos en el fluido biológico
presentan una gran afinidad por la superficie del sólido siendo fuertemente
adsorbido sobre la superficie del empaque del cartucho.
 Lavado del cartucho. Este paso se debe de realizar con disolventes cuya fuerza de
elución sea suficiente para que los compuestos que puedan interferir sean eluidos
del cartucho pero no así el analito.
 Elución del analito. Finalmente, el analito se eluye con un disolvente tal que posea
la fuerza de elución apropiada y se colecta para su análisis posterior.
Las muestras biológicas contienen un gran número de compuestos endógenos que
difieren ampliamente en su polaridad los cuales muestran una afinidad variable por los
empaques sólidos no polares. Esto es muy importante para seleccionar la composición de
los disolventes de lavado y de adsorción a fin de lograr que el compuesto más polar de la
matriz se eluya y el compuesto más lipofílico permanezca sobre el empaque sólido. Es
necesario que la diferencia en la fuerza de elución de los disolventes de lavado y de
adsorción sea lo más pequeña posible, de esta manera se puede colectar el analito de
interés junto con algunos pocos componentes de la matriz biológica de polaridad similar
[33].
Un aspecto importante que hay que considerar en esta técnica es el hecho de que la
superficie de la fase sólida se modifica debido a la fuerza de adsorción de los compuestos
presentes en la matriz biológica en una cantidad relativamente grande. En el caso del
plasma, la superficie de la fase sólida puede llegar a saturarse con proteínas de tal modo
que la adsorción del analito y los compuestos de la matriz ocurra sobre las proteínas
adsorbidas como una especie de enlace entre ellos en vez de adsorberse en el empaque
del cartucho. Esta es una situación indeseable puesto que la extracción dependerá de la

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cantidad de proteínas presentes en la muestra y del tipo deempaque sólido empleado
(diferentes marcas y lotes). Esto conlleva a obtener una recuperación no reproducible
debido a que el enlace a las proteínas no puede ser controlado [33].
1.6.1 PROCESADOR DE PRESION POSITIVA-96 [34,35].
Durante el proceso de extracción se emplean equipos que permiten la elución de los analitos
de interés como el procesador de presión positiva en cual funciona usando un gas
comprimido, tanto para sellar las columnas como desplazar el líquido. Utiliza un gas inerte
como el nitrógeno purificado en cilindros, el gas debe estar libre de humedad, partículas e
hidrocarburos, esto es esencial para prevenir la contaminación de la muestra.
El suministro de gas se establece a 40-50 psi por un regulador colocado entre la fuente de gas
y el procesador.
El procesador de presión positiva 96 permite al usuario configurar y operar dos rangos de
flujo:
 Flujo alto: rango que va de 15 a 60 psi y ayuda al acondicionamiento, equilibrado y
lavado de las muestras en la columna lavado de columna.
 Flujo bajo; rango que va de 0 a 15 psi y ayuda a la carga y elución de la muestra.
El sistema logra esto mediante el uso de un rotámetro de baja presión para velocidades de
flujo más lentas y un regulador de presión media de las tasas de flujo más rápidas. Este flujo
se distribuye por igual en cada una de las 96 salidas del colector.
Las ventajas del procesador de presión positiva:
 Alcanza altas presiones; ayudan a fluir muestras con gran viscosidad.
 La distribución del gas a través del colector permite una presión uniforme y
homogénea en todos los pocillos
 El flujo del líquido en cada pocillo proporciona extracciones altamente uniformes que
mejoran la reproducibilidad en la recuperación de analito.

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Figura 7: Procesador de Presión Positiva-96 con cartucho Oasis MCX para Extracción en Fase Sólida.
1.7 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (UPLC/MS/MS).
Considerando que los valores plasmáticos de Zilpaterol son muy pequeños, es necesario
utilizar técnicas de alta capacidad de análisis y sensibilidad, tal es el caso de la cromatografía
de líquidos acoplado a la espectrometría de masas.
1.7.1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA [36].
La UPLC se puede utilizar como técnica preparativa y como técnica analítica, permitiendo
la purificación, identificación y cuantificación del analito deseado. La elección de la fase
estacionaria y la fase móvil, del flujo al que se va a impulsar la fase móvil a través de la fase
estacionaria e incluso de la temperatura a la que se va a realizar la cromatografía, permitirán
una correcta separación del analito de otros compuestos.
En la cromatografía líquida, la fase móvil eluye de la columna durante un tiempo determinado
conteniendo cantidades muy diferentes de solutos que pasan a través de un sistema de
detección. El instrumento detecta la presencia del soluto que es convertida en una señal
eléctrica y ésta puede ser tratada por un procesador de datos. Se representa la señal obtenida
en función del tiempo o del volumen de elución, y al gráfico obtenido se le conoce como
cromatograma. Los solutos se representan gráficamente como una serie de picos que pueden
identificarse por su anchura, altura o área. Para la cuantificación de compuestos se utiliza la
señal del detector haciendo que sea proporcional a la cantidad o a la concentración inyectada
de analito.

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Figura 8: Cromatógrafo de Líquidos acoplado a Espectrometría de Masas.
1.7.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometría de masas es actualmente el detector más potente en cromatografía, porque
el espectro de masas es capaz de detectar bajas concentraciones de analito como son
picogramos por mililitro, además de que suministra información tanto cualitativa como
cuantitativa sobre los compuestos que eluyen de una columna, y puede distinguir diferentes
sustancias que tienen el mismo tiempo de retención [37].
Dentro del espectrómetro de masas, se procede a la ionización de la muestra mediante
diferentes métodos. El sistema de ionización más frecuente es el de impacto electrónico que
bombardea las moléculas con electrones de una cierta energía, capaces de provocar la
emisión estimulada de un electrón de las moléculas y así ionizarlas. Además de moléculas
ionizadas o iones moleculares (M+) también se forman iones fragmentados debido a la
descomposición de los iones moleculares con exceso de energía. El tipo y proporción relativa
de cada uno de estos fragmentos es característico de las moléculas analizadas y de las
condiciones del proceso de ionización. Una vez ionizadas las moléculas, se aceleran y se
conducen hacia el sistema colector mediante campos eléctricos o magnéticos. La velocidad
alcanzada por cada Ión será dependiente de su masa. La detección consecutiva de los iones
formados a partir de las moléculas de la muestra, suponiendo que se trate de una sustancia
pura, produce el espectro de masas de la sustancia, que es diferente para cada compuesto
químico y que constituye una identificación prácticamente inequívoca del compuesto
analizado [36].
Un espectrómetro de masas está conformado principalmente por tres partes: la fuente de
masas, el analizador de masas y el transductor o detector.

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Para realizar la determinación de masas se efectúa lo siguiente [38]:
1. Ionización: la especie a estudiar es vaporizada e ionizada en la fuente del equipo. En
este estado, todo el compuesto formado por moléculas produce una mezcla estadística
de iones de fragmentación.
2. Aceleración: posteriormente, los iones son extraídos de la fuente, focalizados y
acelerados por las lentes electrónicas para incrementar su energía cinética.
3. Separación: los iones son filtrados siguiendo su relación masa/carga (m/z) por el
analizador.
4. Detección: después de la separación los iones terminan su recorrido chocando con un
detector que amplifica la muy débil corriente eléctrica inicialmente originada.
5. Obtención del espectro de masas: adquirido por el tratamiento de la señal enviada por
el detector.
1.8 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
El proceso de validación de métodos tiene como objetivo demostrar que un método es apto
para el uso previsto. Esto significa que en las manos de un analista debidamente capacitado,
utilizando el equipo y los materiales especificados, y siguiendo los procedimientos descritos
en el método, se pueden obtener resultados fiables y sistemáticos dentro de límites
estadísticos especificados para el análisis de una muestra. La validación debería abordar las
cuestiones relacionadas con el residuo marcador, el tejido elegido como objetivo y la escala
de concentraciones identificadas por el laboratorio en colaboración con el gerente del
programa de residuos. Cuando un analista capacitado, que trabaja en un laboratorio
competente en materia de control de residuos, sigue el protocolo del método utilizando las
normas analíticas adecuadas, se deberían obtener resultados dentro de los límites de
funcionamiento establecidos, para el análisis del mismo material de muestra o en uno
equivalente [39].
Esta actividad se justifica porlos siguientes aspectos:
 Moral y Ética
 Aseguramiento de calidad
 Regulatoria [40]

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Para asegurar un buen proceso y fiabilidad analítica, la validación del método requiere un
estudio en profundidad de muchos factores, incluyendo la selectividad, linealidad,
recuperación, repetibilidad, robustez, reproducibilidad, los efectos de matriz (masa), y
consistencias de tiempos de retención (TR) y la relación de iones MS [41].
En general, hay características de rendimiento específicas de una validación del método.
Estas características de rendimiento se definen como parámetros de desempeño:
Linealidad del sistema
La ICH define la linealidad de un método analítico como la capacidad (dentro de un rango
dado) para obtener resultados de datos variados (por ejemplo, área y altura) que sean
directamente proporcionales a la concentración (cantidad del analito) en la muestra.
La linealidad se demuestra usualmente por dilución directa de una solución Stock. Se
recomienda que la linealidad sea llevada a cabo por dilución serial de una solución Stock. Si
las diferentes concentraciones se preparan de manera independiente, se introduce un mayor
error al estudio de linealidad. Al menos se deben utilizar cinco concentraciones diferentes.
Usualmente se logra la linealidad cuando el coeficiente de determinación r ≥ 0.98.
La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener resultados de prueba
que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformación matemática
bien definida.
Linealidad del Método [42].
La linealidad del método se debe generar a partir de una curva de calibración en la que se
evalúa la relación lineal de la concentración en toda la gama de una matriz (tejido, leche,
huevo o la miel). Las curvas de calibración se pueden generar en tres formatos, dependiendo
de la metodología:
a) Muestras en disolvente / tampón ,
b) Muestras fortificadas con la matriz biológica (plasma, orina, leche, miel, etc.) y
extraídas con ensayos analíticos ya establecido.
Se deben utilizar cinco diferentes concentraciones como mínimo y la evaluación de los
residuos se debe realizar al menos tres ensayos por separado.

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Exactitud [42].
La exactitud se refiere al grado de concordancia entre el valor verdadero de la concentración
del analito y el resultado medio que se obtiene mediante la aplicación del procedimiento
experimental. La precisión está estrechamente relacionado con el error sistemático (sesgo del
método analítico) y la recuperación del analito (medida como porcentaje de recuperación).
Tabla 4: Rango aceptable para la precisión de los analitos establecido por la Guía VICH GL 49.
Concentración del analito* Rango aceptable para la Precisión
˂ 1 µg/Kg -50 % a +20 %
≥ 1 µg/Kg ˂ 10 µg/Kg -40 % a +20 %
≥10 µg/Kg ˂ 100 µg/Kg -30 % a +10 %
≥100 µg/Kg -20 % a +10 %
* µg/Kg = ng/g = ppb

Precisión [42].
La precisión de un método es el grado de concordancia entre resultados de ensayos
independientes obtenidos a partir de material de ensayo homogéneo en condiciones
establecidas de uso.
La precisión debe ser determinada por la evaluación de un mínimo de tres réplicas a tres
diferentes concentraciones, (debe incluir el límite de cuantificación) a través de tres días de
análisis.
La precisión debe cumplir con los siguientes criterios:

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Tabla 5: Precisión aceptable (% CV) de los analitos establecida por la Guía VICH GL 49.
Concentración
Precisión aceptable dentro
de la corrida
(Repetibilidad) % CV
Precisión aceptable entre
las corridas %CV
< 1 μg/kg 30 % 45%
≥ 1 μg/kg < 10 μg/kg 25 % 32%
≥ 10 μg/kg < 100 μg/kg 15% 23%
≥ 100 μg/kg 10 % 16%
*Según lo determinado por la ecuación de Horwitz CV = 2(1-0.5 log C) donde C =
concentración expresada como fracción decimal (por ejemplo 1 µg / kg se introduce
como 10-9).

Límite de detección [42].
El límite de detección de un método analítico es la cantidad más baja de analito en una
muestra que puede ser detectado con certeza aceptable, pero no la cuantificación como un
valor exacto.
Límite de Cuantificación [42].
El límite de cuantificación de un método analítico es la cantidad más baja de analito en una
muestra que se puede determinar cuantitativamente con precisión y exactitud aceptables.

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2. OBJETIVOS

Objetivo General:
Desarrollar y optimizar un método de pretratamiento de muestras de plasma de bovino por
medio de la precipitación de proteínas y la SPE para cuantificar Zilpaterol, utilizando como
técnica de análisis la Cromatografía de Líquidos acoplado a Espectrometría de Masas.
Objetivos particulares:
 Realizar una investigación documental de las propiedades fisicoquímicas del
Zilpaterol para establecer las condiciones de pretratamiento de plasma y así
cuantificarlo por Cromatografía de Líquidos acoplado a Espectrometría de Masas.
 Establecer un plan experimental para definir condiciones de tratamiento de plasma de
bovino para extraer Zilpaterol.
 Optimizar las condiciones de análisis en el UPLC/MS/MS que permitan cuantificar
Zilpaterol en plasma de bovino.
 Realizar la validación para evaluar que el desempeño del método analítico cumpla
con los requisitos establecidos por la Guía VICH GL 49.

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DIAGRAMA DE FLUJO

Realizar una investigación documental de las propiedades fisicoquímicas
del Zilpaterol para establecer las condiciones cromatográficas y de
pretratamiento de plasma.
Selección de condiciones cromatográficas
Desarrollo del Proceso de Extracción del Plasma
 Fase móvil  Volumen de inyección
 Columna  Flujo
 Tipo de inyección  Ion padre e hijo

Selección del Agente Precipitante de Proteínas

 Etanol
 Acetona
 Ácido Tricloroacético
 Mezcla de Acetona/ Ácido Tricloroacético (50:50)
 Acetonitrilo

Selección de:

 Volumen a utilizar en cada paso de la extracción
 Solución de: acondicionamiento, equilibrado, lavado y
para la elución En concentraciones diferentes y
proporciones diferentes de disolvente orgánico y agua.

Leer el sobrenadante en el espectro UV- Visible y determinar
cuál presenta menor absorbancia, ya que este será el que
tenga menor cantidad de proteínas (en el sobrenadante).
Desarrollo de la Extracción en Fase Sólida
De acuerdo a los resultados que se obtengan, elegir la
solución que presente mejor definición del pico y mayor
respuesta del Zilpaterol.

Validación del Método

 Linealidad
 Exactitud
 Precisión
 Límite de Detección
 Límite de Cuantificación

Cumplir con los requerimientos