Papel-de-la-cinasa-wnk4-en-la-regulacion-del-cotransportador-renal-de-nacl--por-angiotensina-II

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
PAPEL DE LA CINASA WNK4 EN LA REGULACIÓN DEL COTRANSPORTADOR 
RENAL DE Na
+
:Cl
-
 POR ANGIOTENSINA II 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
 
 
PRESENTA: 
MARÍA CASTAÑEDA BUENO 
 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
DR. GERARDO GAMBA AYALA 
 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS 
 
COMITÉ TUTOR: 
DRA. NORMA BOBADILLA SANDOVAL 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS 
DRA. MARTA ALICIA MENJÍVAR IRAHETA 
FACULTAD DE QUÍMICA, C.U.,UNAM 
 
 
 
 
MÉXICO, D. F. FEBRERO DE 2013 
 
 
 
 
 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en la Unidad de Fisiología Molecular, entidad que 
pertenece al Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM y al 
departamento de Nefrología y Metabolismo Mineral del Instituto Nacional de 
Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. 
 
 
 3 
RECONOCIMIENTOS 
 
El presente trabajo se realizó principalmente en la Unidad de Fisiología Molecular, IIB-
INCMNSZ y en colaboración con algunos investigadores del extranjero cuya 
participación específicamente fue la siguiente: 
- Shelia Kantesaria, personal de Pfizer que generó el ratón WNK4-KO, 
- Luciana Morla y Alain Doucet del “Centre de Recherche des Cordeliers”, en la 
Universidad de Paris, Paris, Francia, que realizaron los experimentos descritos en la 
figura 2D, E y F del artículo presentado en el apéndice 2), 
- Dario Alessi, investigador del “Medical Research Council”, de la Universidad de 
Dundee, Escocia, colaborador en el proyecto de Wellcome Trust, quien factilitó el 
envío de los ratones WNK4-KO y nos proporcionó los anticuerpos utilizados en el 
estudio. 
 
Fue posible gracias a los siguientes donativos 
 
Conacyt No. 16815, intitulado: Regulación del cotransportador de NaCl. Implicaciones 
en la hipertensión arterial y la obesidad. 
 
Wellcome Trust No. 091415, intitulado: Modulation of renal NaCl transproter via 
angiotensin II-WNK4-SPAK signalling pathway. 
 
También fue posible gracias al apoyo técnico de la Química Norma Hilda Vazquez 
técnico académico del Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB), UNAM, adscrita 
al grupo del Dr. Gamba. 
 
Finalmente, también se reconoce el apoyo técnico del personal del bioterio del IIB y del 
bioterio del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán 
(INNSZ). En particular, se reconoce el trabajo del M.V.Z. Jorge Omar Garcia Rebollar 
y de la M.V.Z. Georgina Díaz del IIB y de la M.V.Z. Mónica Guevara Canizal del 
INNSZ. 
 
 
 
 4 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A Gerardo, por la confianza, apoyo y orientación, pero sobre todo por la amistad que 
siempre me ha brindado. 
 
A Normita, por su ayuda, apoyo y compañía todas las mañanas desde tempranito. 
 
A los miembros del comité tutor, la Dra. Norma Bobadilla y la Dra. Marta Menjívar, 
por sus opiniones y valiosas aportaciones al proyecto durante los exámenes tutorales. 
 
A los miembros del jurado, por su valiosa contribución en la revisión de esta tesis. 
 
A los miembros del lab, del más viejo al más nuevo: Chelo, Adriana, Erika, Diana, 
Damián, Juan Pablo, Ze, María, Lorena, Luz, Adrián, Isidora, Lalo y a todos los que 
me falta mencionar que pasaron por aquí en algún momento y con los que compartí 
muchos momentos. Gracias por su compañía, amistad y apoyo. 
 
A Milo, por aapoyarme y hacerme tan feliz estos últimos dos años. 
 
A mis papás y a mi hermano, por su cariño y apoyo. 
 
 
 
 
 
 
 5 
 
El trabajo realizado durante mi doctorado dio origen a las siguientes publicaciones 
que se encuentran en los apéndices indicados. 
 
ARTÍCULOS ORIGINALES 
 
1. Castañeda-Bueno,M., L.G.Cervantes-Pérez, N.Vázquez, N.Uribe, S.Kantesaria, 
L.Morla, N.A.Bobadilla, A.Doucet, D.R.Alessi, and G.Gamba. Activation of the 
renal Na
+
:Cl
-
 cotransporter by angiotensin II is a WNK4-dependent process. 
Proceedings of the National Academy of Sciences (2012) 109, 7923-7928. 
(APÉNDICE 2) 
 
2. Chávez-Canales M, Arroyo JP, Ko B, Vázquez N, Bautista R, Castañeda-Bueno 
M, Bobadilla NA, Hoover RS, Gamba G. Insulin increases the functional activity of 
the renal NaCl cotransporter. Journal of Hypertension. (2013) 31(2), 303-311. 
(APÉNDICE 3) 
 
3. Pacheco-Alvarez,D., N.Vázquez, M.Castañeda-Bueno, P. de-los-Heros, C.Cortes-
González, E.Moreno, P.Meade, N.A.Bobadilla, and G.Gamba. WNK3-SPAK 
Interaction is Required for the Modulation of NCC and other Members of the SLC12 
Family. Cellular Physiology and Biochemistry (2012) 29, 291-302. (APÉNDICE 3) 
 
4. Mutig,K., T.Kahl, T.Saritas, M.Godes, P.Persson, J.Bates, L.Rampoldi, S.Uchida, 
C.Hille, C.Dosche, S.Kumar, M.Castaneda-Bueno, G.Gamba, and S.Bachmann. 
Activation of the bumetanide-sensitive Na
+
,K
+
,2Cl
-
-cotransporter NKCC2 is 
facilitated by Tamm-Horsfall protein in a chloride-sensitive manner. Journal of 
Biological Chemestry. (2011) 286 (34), 30200-30210. (APÉNDICE 3) 
 
ARTÍCULOS DE REVISIÓN 
 
5. Castañeda-Bueno,M. and G.Gamba. Mechanisms of sodium-chloride cotransporter 
modulation by angiotensin II, Current Opinion in Nephrology and Hypertension 
(2012) 21(5), 516-522. (APÉNDICE 3) 
 
6. Castañeda-Bueno,M., J.P.Arroyo, and G.Gamba. Independent Regulation of Na+ 
and K
+
 Balance by the Kidney. Medical Principles and Practice (2012) 21, 101-114. 
(APÉNDICE 3) 
 
7. Castañeda-Bueno,M. and G.Gamba. SPAKling insight into blood pressure 
regulation. EMBO Molecular Medicine (2010) 2, 39-41. (APÉNDICE 3) 
. 
 
 
 
 
 6 
ABREVIATURAS UTILIZADAS EN LA TESIS 
 
 
AngII- Angiotensina II 
APR- Actividad plasmática de renina 
AVP- Arginina vasopresina 
CCCs- Cotransportadores de cloro acoplado a cationes 
CC- Conducto colector 
Motivo CC- motivo de hélice helicoidal (del inglés : “coiled-coil”) 
C-terminal- Carboxi-terminal 
CNT- Túbulo conector 
CUL3- Del inglés: “Cullin 3” 
DAC- Diacilglicerol 
Dominio AI- Dominio autoinhibitorio 
ECA- Enzima convertidora de angiotensina 
ECV- Volumen circulante efectivo 
ENaC- Del inglés: “Epithelial sodium channel” (canal epitelial de sodio). 
FEC- Fluido extracelular 
HEK- Del inglés: “Human Embryonic Kidney” 
11-HSD- 11- hidroxiesteroide deshidrogenasa 
IP3- Inositol-trifosfato 
KLHL3- Del inglés: “Kelch-like 3” 
N-terminal- Amino terminal 
Nedd4-2-Del ingles: “Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4-2” 
NCC- Cotransportador de sodio-cloro (sensible a tiazidas) 
NKCC- Cotransportador de sodio-potasio-cloro (sensible a furosemida/bumetanida) 
OSR1- Del inglés: “Oxidative stress response 1” 
PA- Presión arterial 
 
 
 7 
PLC- Fosfolipasa C 
PHAII- Pseudohipoaldosteronismo tipo II 
ROMK- Del ingles: “Renal outer medullary potassium channel” (Canal de potasio de la médula 
externa renal) 
SGK1- Del inglés: “Serum glucocorticoid kinase 1” 
SPAK- Del inglés: “Ste20-related proline-alanine rich kinase” (cinasa rica en prolinas y alaninas, 
relacionada con Ste20) 
SPAK-KS- Del inglés: “Kidney Specific SPAK” (SPAK específica de riñón). 
SPAK-L- Isoforma larga de SPAK 
Ratones SPAKKI – Ratones “knockin” para SPAK que contienen una mutación en SPAK que hace 
a la cinasa catalíticamente inactiva. 
Ratones SPAK-/-- Ratones SPAK “knockout” 
SRAA- Sistema renina-angiotensina-aldosterona 
TAL- Porción ascendente gruesa del asa de Henle. La abreviatura proviene de las siglas en 
ingles: “Thick Ascending Limb”. 
TCD- Túbulo contorneado distal 
WNK- Del inglés: “With no Lysine (K)” (Sin lisina) 
Ratones WNK4KO o WNK4-/-- Ratones WNK4 “knockout” 
Ratones WNK4PHAII- Ratones transgénicos que expresan una versión de WNK4 con una 
mutación PHAII. 
KS-WNK1- Del inglés: “kidney specific WNK1” (WNK1 específica de riñón). 
 
 
 
 8 
ÍNDICE 
 
I. RESUMEN 
II. INTRODUCCIÓN 
1. El riñón y el manejo renal de NaCl 
2. NCC como actor principal en la reabsorciónde NaCl en el túbulo 
contorneado distal 
3. Importancia de NCC en el manejo renal de NaCl e implicaciones en el 
control de la PA: síndrome de Gitelman y PHAII 
4. Importancia del NCC en el manejo renal de potasio. 
5. El pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII): genes afectados 
6. La cinasa WNK4 como reguladora de la función de NCC 
7. ¿Las mutaciones PHAII provocan una ganancia de función en WNK4? 
8. Las cinasas SPAK y OSR1, otros participantes en la vía de señalización 
9. Regulación fisiológica de la actividad del NCC 
10. El sistema renina-angiotensina-aldosterona en la regulación del volumen 
extracelular y en el desarrollo de hipertensión 
11. Regulación del NCC por angiotensina II 
 
III. PLANTEAMIENTO DEL PROYECTO 
IV. MODELO ANIMAL 
V. MATERIAL Y MÉTODOS 
VI. RESULTADOS PUBLICADOS 
VII. RESULTADOS NO PUBLICADOS 
VIII. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 
IX. LISTA DE CONCLUSIONES 
X. PERSPECTIVAS 
XI. BIBLIOGRAFÍA 
XII. APÉNDICE 1. Tablas de modelos genéticos murinos 
XIII. APÉNDICE 2. Artículo publicado con principal relación a este trabajo. 
XIV. APÉNDICE 3. Otros artículos publicados. 
 
 
 9 
I. RESUMEN 
 
El cotransportador de Na
+
:Cl
-
 sensible a tiazidas (NCC) es la principal vía para 
la reabsorción de Na
+
 y Cl
-
 en túbulo contorneado distal (TCD) de riñón de mamífero 
(33) y pertenece a la familia de cotransportadores electroneutros SLC12. NCC es 
fundamental en la reabsorción renal de NaCl, en el control de la presión arterial y en 
manejo renal de Ca
2+
 y K
+
. Una evidencia de esto es el efecto diurético de las tiazidas, 
inhibidores específicos de este cotransportador, que son ampliamente utilizadas en la 
clínica para el tratamiento de la hipertensión arterial. Además, la caracterización de 
enfermedades genéticas asociadas a alteraciones en el funcionamiento del NCC también 
ha sido fundamental para conocer el papel fisiológico de este cotransportador. El 
síndrome de Gitelman es una enfermedad genética autosómica recesiva ocasionada por 
mutaciones inactivantes en el gen de NCC (SLC12A3) que cursa con hipotensión 
arterial, hipokalemia, hipocalciuria y alcalosis metabólica (118). Por otro lado, el 
pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII) es una enfermedad genética autosómica 
dominante ocasionada por mutaciones en una cinasa reguladora de la función del NCC: 
WNK4 (136). En varios estudios, tanto in vitro como in vivo, se ha demostrado que 
dicha cinasa ejerce una acción inhibitoria sobre la función del NCC (44) y que las 
mutaciones tipo PHAII evitan este efecto inhibitorio, lo que provoca una hiperactividad 
del NCC. Congruente con esto, el síndrome es una imagen en espejo casi perfecta del 
síndrome de Gitelman, con hipertensión arterial, hiperkalemia, acidosis metabólica e 
hipercalciuria. 
El sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) es un eje hormonal que 
participa en la regulación de la presión arterial y del volumen del liquido extracelular. 
La renina es una hormona proteica producida y secretada principalmente en el riñón 
ante disminución del volumen circulante. Esta enzima convierte al angiotensinógeno en 
angiotesina I, que a su vez es convertida en angiotensina II (AngII) por efecto de la 
enzima convertidora de angiotensina. La AngII actúa en receptores de siete dominios 
transmembranales acoplados a proteínas Gheterotriméricas. Se conocen dos receptores 
de este tipo para AngII, el receptor AT1 y el receptor AT2. Sin embargo, el receptor que 
media los efectos clásicos de AngII es el AT1, que es un receptor de tipo Gq. En el 
músculo liso vascular la AngII es un potente vasoconstrictor, lo que aumenta la presión 
arterial. Por otro lado, la AngII también aumenta la reabsorción renal de sal. Esto lo 
hace a través de dos vías: estimula la síntesis de aldosterona y actúa en forma directa 
 
 
 10 
sobre mecanismos de reabsorción de sal en los túbulos renales (65). Recientemente se 
ha estudiado el efecto de la AngII sobre el NCC. La AngII promueve el tránsito de 
vesículas cargadas con NCC hacia la membrana apical de las células del túbulo 
contorneado distal (TCD) y también promueve la fosforilación activadora de NCC, lo 
que aumentaría la reabsorción de sal en esta región (37; 113; 127). Poco se conoce sobre 
el mecanismo por el cual la AngII logra este efecto. 
En un trabajo reciente de nuestro laboratorio se demostró que la AngII modula el 
efecto de la cinasaWNK4 sobre NCC (111). En ausencia de AngII la WNK4 inhibe al 
NCC, lo cual se lleva a cabo por disminución de la cantidad de NCC en la membrana 
plasmática (137). En presencia de AngII se pierde el efecto inhibidor de WNK4 sobre 
NCC. Este efecto de AngII es dependiente de la presencia del receptor AT1 ya que se 
previene con losartán, el bloqueador de AT1. Este efecto es específico para WNK4, ya 
que no ocurre con otras WNKs y requiere de la presencia de SPAK, cinasa que, según 
experimentos in vitro, fosforila a NCC para modular su actividad (105). Finalmente, 
WNK4 con mutaciones tipo PHAII no responde al estímulo de la AngII, por lo que se 
propuso que las mutaciones en WNK4 imitan el efecto de la AngII. 
En el presente proyecto se planteó una estrategia para estudiar in vivo la 
relevancia de esta propuesta. En concreto, lo que se busca demostrar es que la WNK4 
media, al menos en parte, el efecto observado de AngII sobre NCC. Para esto se utilizó 
como modelo animal una cepa de ratones con deficiencia homóciga de la cinasa WNK4 
(ratones WNK4
KO
). Dichos ratones fueron donados recientemente a nuestro laboratorio 
y se comenzó la reproducción con el fin de expandir las colonias. Se confirmó la 
ausencia de expresión de la cinasa WNK4. Se llevó a cabo la caracterización fenotípica 
inicial de dichos ratones en condiciones basales: se estudiaron los niveles de electrolitos 
sanguíneos y urinarios y el estado de activación del SRAA bajo un régimen alimenticio 
normal. También se estudió la respuesta de los ratones a la administración de dieta baja 
en NaCl y a la infusión de AngII. 
Los ratones WNK4
KO
 presentaron niveles mayores de excreción urinaria de K
+
 y 
Cl
-
 que se correlacionaron con la hipokalemia y la hipocloremia moderadas observadas, 
así como hipomagnesemia y alcalosis metabólica. No presentaron diferencias en los 
niveles plasmáticos o urinarios de otros electrolitos pero sí presentaron niveles elevados 
de actividad plasmática de renina (APR), a pesar de tener presión arterial normal. La 
concentración plasmática de aldosterona fue similar a la de los ratones silvestres, a pesar 
de la APR alta. Esto último podría deberse a un defecto en la síntesis o secreción de 
 
 
 11 
aldosterona o a la presencia de hipokalemia. Se observó menor expresión del NCC (a 
nivel de proteína y mRNA), menor fosforilación activadora del NCC y de la cinasa 
reguladora SPAK. Se observó también mayor actividad del canal epitelial de Na
+
, ENaC 
y menor actividad del NCC. La pérdida renal de potasio observada podría deberse a la 
deficiencia en la actividad de NCC como se observa en el síndrome de Gitelman, 
aunque también podría explicarse por la falta de actividad de WNK4 sobre otras 
proteínas involucradas en el manejo renal de potasio, como ROMK y ENaC. El 
aumento observado en la actividad de ENaC apoya esta noción. Finalmente, el 
incremento en la APR sugiere un estado de depleción de volumen el cual podría 
explicarse, al menos en parte, por la ausencia de función de NCC. Pensamos que este 
aumento podría estar estimulando otros mecanismos de reabsorción renal para evitar la 
pérdida renal de NaCl y la caída en la presión arterial. 
La ausencia de fosforilación de NCC en presencia de APR elevada va de 
acuerdo a la hipótesis de que WNK4 media la activación de NCC por AngII. Esto se 
suma al hecho de que, en los ratones WNK4
KO
, a diferencia de lo observado en los 
controles silvestres, no se observó aumento en la expresión del NCC, ni de fosforilacióndel NCC o de la cinasa SPAK ante la administración de dieta baja en sodio o la infusión 
de AngII. Esto sugiere que en ausencia de WNK4 se pierde la capacidad de activación 
de la cinasa SPAK y de NCC, tanto por AngII como por aldosterona. 
En conclusión, se propone que las alteraciones fenotípicas observadas en los ratones 
WNK4
KO
 se deben, al menos en parte, a la ausencia de función de NCC en los ratones 
WNK4
KO
 y que la cinasa WNK4 es un participante en la vía de señalización mediante la 
cual la AngII modula la actividad del NCC. 
 
 
 
 
 12 
II. INTRODUCCIÓN 
 
II.1 El riñón y el manejo renal de NaCl 
 
El riñón realiza varias funciones que son vitales para el funcionamiento adecuado del 
organismo: participa en la eliminación de toxinas y productos metabólicos; produce 
hormonas involucradas en el metabolismo de calcio y fósforo, regulación de la presión 
arterial, y eritrogénesis y, finalmente, participa en el mantenimiento de la homeostasis 
corporal, regulando el volumen del fluido extracelular, el pH y la concentración de 
electrolitos (Na
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
, Cl
-
) del fluido extracelular (9). 
La regulación del volumen del fluído extracelular (FEC) es esencial para el 
mantenimiento de la presión arterial dentro de límites necesarios para la adecuada 
perfusión de los tejidos. El organismo regula el volumen del FEC a través del monitoreo 
y ajuste del contenido corporal de cloruro de sodio (NaCl). El riñón es el único órgano a 
través del cual podemos eliminar NaCl en forma finamente regulada. 
Por otro lado, debido a que el riñón puede separar la excreción de sal de la de agua, este 
órgano juega un papel esencial en el mantenimiento de la osmolaridad del FEC 
mediante el monitoreo y el ajuste del contenido de agua. Esto es básico debido a que 
cambios importantes en la osmolaridad afectan el volumen celular y por lo tanto, las 
funciones celulares. 
Estos dos sistemas, el de control de volumen y control de osmolaridad, se 
complementan, ya que los cambios en el contenido de NaCl corporal generan cambios 
en el volumen de FEC gracias a la acción del sistema de mantenimiento de la 
osmolaridad que activa el aumento en el contenido de agua para evitar que el NaCl 
genere una alteración osmótica. Esto ocasiona un cambio en el volumen del FEC, que a 
su vez provoca la activación de una serie de mecanismos que desencadenan una 
respuesta renal que tiende a regresar el volumen a la normalidad. 
La mayor parte de las funciones renales mencionadas se logran gracias a la acción 
conjunta de tres procesos fundamentales que realiza el riñón: filtración glomerular, 
reabsorción tubular y secreción tubular. Estos se realizan a lo largo de la nefrona, que es 
la unidad funcional del riñón. Un riñón humano está constituido por aproximadamente 
un millón de nefronas y cada una de ellas está conformada por un glomérulo y un túbulo 
que se divide en varias porciones. El glomérulo consiste en un capilar enrrollado sobre 
sí mismo, rodeado por una cápsula de tejido epitelial, la cápsula de Bowman. Esta 
 
 
 13 
cápsula consta de dos capas, una capa interna formada por células llamadas podocitos, 
de origen epitelial, que recubren a los capilares glomerulares, y una capa externa 
denominada capa parietal. Entre estas dos capas se genera un espacio, el espacio de 
Bowman, o espacio urinario, que es continuo con el lumen tubular. El túbulo, por su 
parte, está formado por un epitelio simple, cuyas morfología y propiedades funcionales 
cambian de acuerdo a la función que se realiza en cada segmento. 
La filtración glomerular es el movimiento de plasma desde el capilar glomerular hacia 
el espacio de Bowman (anteriormente se pensaba que las proteínas sanguíneas no se 
filtraban, pero hoy en día se sabe que si hay cierto grado de filtración de proteínas, que 
después son reabsorbidas y que sólo en bajas cantidades se excretan en orina). La 
filtración glomerular depende de la integridad de la membrana de ultrafiltración 
(conformada por el endotelio de los capilares glomerulares, la membrana basal y los 
podocitos que rodean a los capilares) y, como en cualquier otro sistema capilar, de las 
fuerzas de Starling. En este sentido la única particularidad de los capilares glomerulares 
a resaltar es que la presión hidrostática intracapilar está determinada por la presión de 
perfusión renal y por las resistencias de las arteriolas aferentes (antes del capilar) y 
eferentes (después del capilar). El balance en la constricción de las arteriolas aferentes y 
eferentes glomerulares es determinante en la presión hidrostática intracapilar glomerular 
y, por lo tanto, en la tasa de filtración glomerular. Por ejemplo, a mayor constricción de 
la arteriola aferente, menor será la presión hidrostática intracapilar y a mayor 
constricción de la arteriola eferente, mayor será la presión hidrostática intracapilar. Por 
lo tanto, si ambas arteriolas se constriñeran los efectos opuestos tenderían a 
neutralizarse. 
 El espacio de Bowman, como ya se dijo, es continuo con el lumen del túbulo renal al 
cual entra el filtrado glomerular. Por lo tanto, el filtrado glomerular es expuesto a los 
procesos de reabsorción y secreción a lo largo de los túbulos renales para convertir una 
gran cantidad de ultrafiltrado plasmático en una pequeña cantidad de orina, que contiene 
la cantidad precisa de agua y elementos orgánicos e inorgánicos que deben ser 
eliminados. En el adulto normal, la tasa de filtración glomerular normal es 
aproximadamente de 125 ml/min (180 L en 24 h), mientras que la producción promedio 
de orina es de 0.8 a 1.2 ml/min (1 a 2 litros en 24 h), lo que significa que la reabsorción 
tubular es un proceso muy activo ya que debe regresar a la circulación 
aproximadamente 179 L cada 24 h. 
 
 
 14 
La reabsorción tubular es el movimiento de moléculas desde la luz tubular hasta el 
intersticio renal (y posteriormente a la sangre). La secreción tubular es el movimiento 
de moléculas desde el intersticio renal hacia el lumen tubular. La reabsorción y 
secreción pueden ser procesos pasivos (paracelulares: en que las moléculas pasan a 
través de las uniones intercelulares del epitelio tubular), determinados únicamente por 
gradientes electroquímicos u osmóticos y la permeabilidad de la pared tubular, o 
procesos activos en los cuales está involucrada toda una maquinaria celular (procesos 
trancelulares) que provee la energía y el medio de transporte para que se lleven a cabo. 
En la mayoría de los casos, la reabsorción transcelular es posible gracias a la 
expresión/actividad de la ATPasa de Na
+
/K
+
 basolateral que expulsa sodio e ingresa 
potasio a la célula y de esta forma genera un gradiente electroquímico que favorece la 
entrada apical de Na
+
 a través de diversas proteínas que permiten su difusión hacia el 
interior celular (canales), o que acoplan la entrada de sodio al movimiento de otros 
solutos que también requieren reabsorberse (transportadores secundarios). Los 
transportadores secundarios se dividen en dos clases: aquellos que mueven ambos 
solutos transportados en la misma dirección (cotransportadores) y aquellos que acoplan 
la entrada de un soluto a la célula con la salida de otro (intercambiadores). 
La porción tubular de la nefrona se divide en varios segmentos de acuerdo a criterios 
funcionales y anatómicos (figura 1). A continuación se enumeran del segmento más 
próximo al glomérulo al más distal: 
 
 túbulo contorneado proximal, que se subdivide en porciones S1, S2 y S3 
 asa de Henle, que se subdivide en: 
 asa descendente delgada, 
 asa ascendente delgada y 
 asa ascendente gruesa, 
 túbulo contorneado distal (TCD), que se subdivide en TCD1 y TCD2 
 túbulo conector, 
 conducto colector, subdividido en: 
 colector inicial, 
 colector cortical, 
 colector medular (externo e interno). 
 
 
 15 
 
 
 
De manera resumida, el papelen la reabsorción de NaCl (que es la función renal que 
más nos interesa para los fines de este trabajo) de cada uno de estos elementos es el 
siguiente. 
En el túbulo proximal se recupera la mayor parte del filtrado glomerular. Se reabsorbe 
la totalidad de los nutrientes filtrados, como glucosa y aminoácidos, acoplando el 
transporte de éstos a la entrada de sodio. Como ya se mencionó, el gradiente para la 
entrada de sodio es generado por la ATPasa de Na
+
/K
+
 ubicada en la membrana 
basolateral. Además se reabsorbe Na
+
 mediante la operación simultánea de un 
intercambiador Na
+
/H
+
 y otro de Cl
-
/HCO3
-
, ambos apicales, y un cotransportador 
basolateral de Na
+
/HCO3
-
. Este mecanismo es importante en la regulación ácido-base 
del organismo. En total se reabsorbe alrededor de un 65% de la cantidad total de Na
+
 
filtrada. El Cl
-
 se reabsorbe por vía paracelular en la parte inicial de este segmento, 
obedeciendo al gradiente eléctrico y químico transepitelial que genera la entrada de Na
+
. 
En la parte final, el Cl
-
 se reabsorbe por vía transcelular, acoplado a la salida de aniones 
como formato, oxalato o HCO3
-
. Dado que este es un segmento permeable al agua, toda 
la reabsorción de Na
+
 va acompañada de reabsorción agua y, de esta forma, la 
concentración luminal de Na
+
 se mantiene constante. 
Figura 1. Estructura de la nefrona 
 
 
 16 
El asa de Henle forma parte del sistema para concentrar o diluir la orina. Participa en la 
generación de un intersticio medular hipertónico a través de la reabsorción de NaCl en 
un segmento impermeable al agua. Esta hipertonicidad es explotada río abajo por los 
túbulos colectores en donde la reabsorción de agua es estimulada por la diferencia entre 
la osmolaridad luminal y la intersticial. La regulación de la permeabilidad al agua en el 
conducto colector es parte esencial del mecanismo biológico para regular la 
osmolaridad plasmática mediante la generación de orina diluida o concentrada. En el 
asa de Henle se lleva a cabo el 25% de la reabsorción total de Na
+
. Los mecanismos de 
transporte utilizados son el cotransportador electroneutro de Na
+
/K
+
/2Cl
-
, llamado 
NKCC2, que se expresa únicamente en el asa ascendente gruesa y un transporte 
paracelular pasivo en la porción del asa ascendente delgada. El transportador NKCC2 es 
blanco de los llamados diuréticos de asa, como bumetanida o furosemida. 
 La mácula densa es una región de células epiteliales especializadas que marcan la 
transición entre la nefrona proximal y la nefrona distal. Se localiza entre la porción 
gruesa del asa ascendente de Henle y el túbulo contorneado distal, y en este sitio el 
túbulo entra el contacto con el glomérulo (el túbulo pasa entre la arteriola aferente y 
eferente) lo que permite que señales generadas en el epitelio tubular en respuesta a la 
composición del fluido tubular puedan ser comunicadas al glomérulo y a las arteriolas 
aferentes y eferentes de los capilares glomerulares para modificar la filtración. En 
concreto, la mácula densa detecta la cantidad de NaCl que llega hasta esta porción de la 
nefrona gracias a que las células expresan al cotransportador NKCC2 el cual media la 
entrada de Na
+
, Cl
-
 y K
+
 a la célula. Los cambios en la concentración intracelular de 
iones producidos como consecuencia de cambios en la actividad del NKCC2 son la 
señal que activa diversas vías de señalización necesarias para producir una respuesta. Si 
la cantidad de NaCl que llega a la mácula aumenta, ésta promueve que la filtración 
glomerular disminuya, y viceversa, hasta que la llegada de NaCl a este sitio se 
normalice. Este fenómeno lo conocemos como balance túbulo-glomerular. De esta 
manera, la cantidad de NaCl que pasa más allá de esta región tubular es constante por lo 
que los procesos de reabsorción y secreción proximales no tienen un efecto importante 
en el contenido final de NaCl en la orina. 
El túbulo distal y el sistema de conductos colectores, son los sitios que llevan a cabo el 
control fino de la excreción de NaCl y agua. A pesar de que estos se encargan de 
reabsorber únicamente un ~10% del NaCl filtrado, son los sitios en donde se define de 
manera fina la cantidad de sal y agua excretada en orina. Estos son los sitios blancos de 
 
 
 17 
hormonas como la aldosterona, la angiotensina II y la hormona antidiurética (ADH), las 
cuales son efectoras de los mecanismos de control de volumen y osmolaridad del FEC. 
Sobre los mecanismos de reabsorción en el túbulo distal se hablará con más detalle en 
el siguiente apartado. 
 En el túbulo conector y los conductos colectores encontramos diversos tipos celulares: 
células de túbulo conector (en túbulo conector), células principales (en conductos 
colectores, y células intercaladas A y B (presentes en ambos). En estos segmentos el 
Na
+
 se reabsorbe principalmente a través de un canal de sodio apical (ENaC) que se 
expresa en las células de túbulo conector y principales, y esta reabsorción genera un 
voltaje transepitelial negativo en el lumen que permite la reabsorción paracelular de Cl
-
. 
Este voltaje también impulsa la secreción de potasio hacia el lumen vía un canal de K
+
 
apical llamado ROMK. (9). Recientemente se describió un mecanismo trancelular 
adicional para la reabsorción de Na
+
 y Cl
-
 en estos segmentos de la nefrona, mediado 
por proteínas expresadas en las células intercaladas B (55). Éste mecanismo involucra la 
actividad del intercambiador Cl
-
/HCO3
-
 apical llamado pendrina, del intercambiador de 
Cl
-
/HCO3
-
 dependiente de Na
+
, NDCBE (también apical) y de un canal de Cl
-
 
basolateral. La actividad acoplada de estas proteínas produce la reabsorción de Na
+
 y Cl
-
 
(en cantidades equimolares y, por lo tanto, el proceso es electroneutro) y además es 
interesante que este mecanismo es inhibido por los fármacos tipo-tiazida que, como 
veremos más adelante, son también inhibidores del NCC. 
 
 
II.2 NCC como actor principal en la reabsorción de NaCl en el túbulo 
contorneado distal 
 
En el túbulo distal se reabsorbe alrededor del 10% de la cantidad de NaCl filtrada en el 
glomérulo. Esto se definió años atrás mediante estudios de microperfusión (en los que 
se controlaba la solución de entrada y salida de la porción tubular bajo estudio y se 
conocían las concentraciones de electrolitos presentes, por lo que se podía determinar la 
fracción reabsorbida), cuando al túbulo distal todavía se le consideraba como una 
entidad anatómica de la nefrona que comprendía desde la mácula densa hasta la primera 
confluencia con otra nefrona (19; 33). Sin embargo, actualmente se sabe que dentro de 
dicho segmento hay varias zonas con diferencias funcionales entre sí bien definidas. En 
concreto, lo que anteriormente se conocía como túbulo distal ahora se divide en cuatro 
 
 
 18 
zonas: el túbulo contorneado distal temprano (TCD1), el túbulo contorneado distal 
tardío (TCD2), el túbulo conector (CNT) y el conducto colector inicial (CCI) (103). En 
el apartado previo se habló de los mecanismos para la reabsorción de Na
+
 que existen en 
el túbulo conector y en los conductos colectores. El principal de estos mecanismos 
involucra la actividad del canal epitelial de sodio ENaC. En el túbulo contorneado distal 
en cambio el mecanismo principal para la reabsorción de Na
+
 involucra a una proteína 
llamada NCC. 
La proteína NCC es un cotransportador membranal que acopla la entrada de Cl
-
, a la 
entrada de Na
+ 
 a la célula. Es el blanco de los diuréticos tipo tiazida, ampliamente 
usados en la clínica para el manejo de la hipertensión arterial (18; 33; 66). Su estructura 
primaria fue descrita por primera vez por Gamba y colaboradores (42), quienes clonaron 
el NCC de lenguado (Pseudopleuronectes americanus) a través de una estrategia de 
expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laevis, en los que inyectaban RNA de la 
vejiga urinariade pez para distinguir las fracciones que producían una captación de Na
+
 
sensible a tiazidas. Una vez clonado el gen de pez, los genes de cotransportadores de 
diversos mamíferos fueron clonados con estrategias basadas en homología de 
secuencias (41; 78; 118) lo cual permitió el estudio más detallado de su expresión, 
estructura, función, regulación, etc. 
En el riñón, NCC se expresa exclusivamente en la membrana apical del túbulo 
contorneado distal (TCD) y, como ya se dijo, constituye la principal vía para la 
reabsorción de NaCl en esta zona de la nefrona. El TCD se divide en TCD1 y TCD2. El 
TCD1 está compuesto exclusivamente por células de túbulo contorneado distal, 
mientras que el TCD2 es una especie de zona de transición ya que en esta zona también 
se empieza a observar la presencia de células intercaladas, características de segmentos 
tubulares posteriores (CNT y colectores) (103). Además, en TCD2 se empieza a detectar 
la expresión de ENaC, en cantidades cada vez mayores, conforme se avanza sobre el 
túbulo. La longitud del TCD2 (definido como el segmento en que se observa 
coexpresión de NCC e ENaC) depende de la especie. Por ejemplo, en roedores la 
transición es más lenta, o sea que se observa claramente que hay un segmento en que 
coexisten las células intercaladas con las células de TCD y en que hay coexpresión de 
NCC e ENaC. Por el contrario, en conejo no se observan células intercaladas en el TCD 
y el TCD termina de manera abrupta, esto es, en un punto específico se dejan de 
observar células de TCD y éstas se sustituyen por células de túbulo conector. Además 
no hay coexpresión de NCC y ENaC. ENaC se empieza a expresar en el momento en 
 
 
 19 
que NCC se deja de expresar (se dice que no hay TCD2) (74). En cualquier caso, el 
final del TCD se distingue por la ausencia de NCC. En el humano se desconocen las 
características de la transición entre TCD y túbulo conector. 
Las células de túbulo contorneado distal son las más ricas en mitocondrias de toda la 
nefrona y presentan una gran amplificación basolateral, además de que son aquellas en 
las que se detecta la más alta actividad de la ATPasa de Na
+
/K
+
 (103){Katz, 1979 
#278}. Esto refleja la importancia de la reabsorción de NaCl en este segmento de la 
nefrona, que es la actividad principal. Dicha reabsorción ocurre de la siguiente manera. 
Como muestra la figura 2, la ATPasa Na
+
/K
+
 basolateral genera el gradiente de Na
+
 
necesario para la entrada apical de este catión, a la cual se acopla la entrada de Cl
-
 vía 
NCC. El Na
+
 atraviesa así el epitelio, mientras que el Cl
-
, cuya concentración 
intracelular es elevada a niveles por encima del equilibrio electroquímico, sale a través 
de la membrana basolateral vía el canal de Cl
-
, CLC-K2. La continua actividad de la 
ATPasa Na
+
/K
+
 es posible gracias a la extrusión apical y basolateral de K
+
. Las 
proteínas que se piensa que están implicadas en la recirculación apical de potasio son el 
canal de potasio llamado ROMK (apical) (68), un cotransportador apical de K
+
/Cl
-
 (2), 
y el canal apical de potasio Kv1.1 (51). Del lado basolateral también ocurre parte de la 
recirculación del K
+
 a través de otro canal recientemente identificado en este segmento, 
Kir4.1 (codificado por KCNJ10) (116)(43). La recirculación al espacio basolateral vía 
Kir4.1 probablemente es la más importante, ya que la actividad del NCC no se ha 
asociado a cambios en el voltaje transepitelial y además porque la inactivación genética 
de dicho canal provoca un síndrome con alteraciones de origen renal similares a las 
observadas como consecuencia de la inactivación del NCC (116) (más adelante se 
detallan). Esto sugiere que la actividad de Kir4.1 está estrechamente relacionada a la 
actividad del NCC. 
 
 
 
 20 
 
Figura 2. Mecanismo de reabsorción de NaCl en TCD. La actividad de la ATPasa de Na
+
/K
+ 
basolateral 
(amarillo) genera el gradiente de Na
+
 necesario para el cotransporte de Na
+
 y Cl
-
 mediado por el 
contransportador de Na
+
/Cl
-
 sensible a tiazidas, NCC (rojo). El canal de K
+
 basolateral Kir4.1 (naranja) 
es indispensable para la recirculación de K
+ 
hacia el intersticio, aunque los canales apicales de K
+
 ROMK 
y Kv1.1 (verde) y un cotransportador de K
+
/Cl
-
 apical (morado) también podrían participar en la salida 
de K
+
 de la célula. El cloro que entra a la célula vía NCC pasa al intersticio a través del canal basolateral 
de cloro CLC-K2. 
 
El cotransportador NCC forma parte de una familia de 9 miembros en mamíferos 
llamada la familia de cotranportadores de cloruro acoplado a cationes (CCC). Hasta el 
momento se conoce la función de 7 de los 9 miembros y todos aquellos cuya función se 
conoce median un transporte de tipo electroneutro, en el que el movimiento del Cl
-
 está 
acoplado al movimiento de la misma cantidad de cationes, ya sea Na
+
, K
+
, o ambos. El 
NCC es el único miembro que transporta únicamente Na
+
. Existen otros dos miembros, 
NKCC1 y NKCC2, que transportan dos Cl
-
, 1 Na
+
 y un K
+
 en un ciclo de transporte, y 
cuatro miembros que transportan Cl
-
 acoplado únicamente a K
+
 (43). 
En cuanto a estructura, el cotransportador NCC cuenta con 12 regiones 
transmembranales (TM) y los extremos amino y carboxilo de la proteína se localizan del 
lado intracelular. Esta topología se predijo inicialmente a través de un análisis de 
hidropatía (42) y ha sido comprobada experimentalmente en otro cotransportador que 
pertenece a la misma familia que NCC y que tiene un porcentaje de identidad de 60 % 
con NCC en la región transmembranal (46). Se han descrito dos secuencias casi 
idénticas para el cotransportador humano. Una consta de 1,021 aminoácidos (X91220) y 
la segunda consta de 1031 (NM_000339). La diferencia son 27 nucleótidos faltantes en 
la región codificada por el exón 20 (118) (78). Hasta el momento se desconocen el 
origen y alguna posible relevancia fisiológica de esta diferencia encontrada. La región 
amino terminal del NCC consta de 130 aminoácidos, la región transmembranal central 
de 475 aminoácidos y la región carboxilo de 416/425 aminoácidos. La topología 
 
 
 21 
predicha para los NCCs de otras especies es muy similar. En el cotransportador de rata y 
de lenguado se ha comprobado que existen dos sitios de glicosilación en el asa 
extracelular que conecta las regiones TM 7 y 8. La glicosilación en estos sitio es 
esencial para el tráfico de la proteína hacia la membrana celular (58; 84). El 
cotrasnportador NCC sin glicosilaciones pesa ~110 kDa y glicosilado pesa ~140 kDa. 
La secuencia de la proteína humana está altamente conservada en la región de 
glicosilación y presenta el mismo patrón de movilidad electroforética, lo que sugiere 
que también se glicosila en estos dos sitios. Por último, se sabe que el cotransportador 
tiene la capacidad de formar estructuras homodiméricas y además se ha comprobado 
que estas estructuras son funcionales. Se desconoce si la formación de dímeros es 
indispensable para la función (25). 
 
 
II.3 Importancia de NCC en el manejo renal de NaCl e implicaciones en el 
control de la presión arterial: Síndrome de Gitelman y Pseudohipoaldosteronismo 
tipo II (PHAII). 
 
En al adulto la cantidad total de NaCl excretada por el riñón iguala a la cantidad total de 
NaCl ingerido a través de la dieta. De esta forma, el cuerpo mantiene una cantidad 
constante de Na
+ 
y Cl
-
 en sangre, lo cual es importante ya que esto a su vez determina 
el volumen del líquido extracelular (en donde el Na
+ 
y el Cl
-
 son los osmolitos 
principales) y, por ende, del volumen circulante. El volumen circulante está 
íntimamente relacionado con el nivel de presión arterial del organismo. El mecanismo 
que se ha propuesto para explicar esta relación es el siguiente. Al disminuir el volumen 
circulante, por ejemplo, disminuye el retorno venoso, el gasto cardiacoy se genera un 
reajuste en las resistencias periféricas totales como parte del mecanismo de 
autorregulación del flujo sanguíneo local, lo que finalmente disminuye la presión 
arterial (figura 3)(59). 
 
 
 22 
 
Figura 3. Mecanismo mediante el cual las tiazidas reducen la presión arterial al disminuir la reabsorción 
renal de Na
+
. La disminución en el volumen circulante y en el volumen sanguíneo que llega al corazón 
disminuye el gasto cardiaco y, por lo tanto, la presión arterial. La perfusión de tejidos resultante no 
satisface la demanda metabólica, lo que desencadena un fenómeno de autorregulación mediado por 
vasodilatación que resulta en una disminución en la presión arterial acompañada de una resistencia 
periférica disminuida y un gasto cardiaco normal. Adaptado de Lifton, R., 2001 (72). 
 
Como ya se dijo, NCC participa en la reabsorción de NaCl en la nefrona distal, sitio en 
que, al ser posterior a la mácula densa, el fluido no está sujeto al llamado “balance 
túbulo-glomerular” (ver sección II.1 mácula densa), y por lo tanto, alteraciones en la 
reabsorción a este nivel se pueden ver reflejadas en la excreción final de NaCl en orina. 
De esta manera, alteraciones en la excreción urinaria en respuesta a alteraciones en la 
función de NCC se reflejan en los niveles de volumen circulante y, por consiguiente, 
tienen un efecto sobre la presión arterial. A esto se debe el efecto anti-hipertensivo de 
las tiazidas que, como ya se dijo, son inhibidores específicos del transportador (42) y, 
por lo tanto, actúan como diuréticos que se utilizan como tratamiento de primera línea 
para el manejo de la hipertensión arterial (18). 
Otras evidencias de la importancia de mantener niveles adecuados de actividad del 
NCC para mantener la presión arterial, es la existencia de enfermedades genéticas cuya 
fisiopatología se explica por alteraciones en la función de NCC. 
El síndrome de Gitelman es una enfermedad genética autosómica recesiva ocasionada 
por mutaciones inactivantes en el gen de NCC (118; 128) (tabla 1). Existen más de 100 
mutaciones puntuales caracterizadas que producen este síndrome y se estima que 
alrededor del 1 % de la población presenta un alelo mutante de este gen (22; 60). Los 
sujetos con un solo alelo mutado presentan menor presión arterial y menor riesgo para 
el desarrollo de hipertensión arterial (1; 60). Por su parte, los pacientes con síndrome de 
 
 
 23 
Gitelman (mutaciones inactivantes en ambos alelos) presentan hipotensión debido a una 
disminución en el volumen circulante. Además, tienen una marcada avidez por la sal y 
el alto consumo compensa parcialmente la deficiencia en la reabsorción renal vía NCC. 
Presentan también otras alteraciones electrolíticas que a primera vista no parecerían 
relacionadas con la función de NCC, al encargarse éste únicamente del transporte de 
Na
+
 y Cl
-
. Sin embargo, la reabsorción de NaCl vía NCC influye en el manejo renal de 
otros electrolitos de forma indirecta. Por ejemplo, la disminución en la función de NCC 
aumenta la reabsorción de calcio e inhibe la reabsorción de magnesio (6; 47; 79). Los 
mecanismos son poco claros hasta el momento, aunque algunos grupos han propuesto 
que el aumento en la reabsorción de calcio tiene lugar a nivel del túbulo proximal como 
consecuencia del aumento en la reabsorción proximal de Na
+
 que ocurre para 
compensar parcialmente la pérdida de la función del NCC (75; 91). Otros, sin embargo, 
han propuesto que la hipocalciuria observada en este síndrome se debe a un aumento en 
la reabsorción de calcio al nivel del TCD, con base a observaciones hechas en una línea 
celular inmortalizada de túbulo distal de ratón (47), en ratones “knockout” para NCC y 
en pacientes con síndrome de Gitelman en que los niveles de TRPV5 y TRPV6 se 
encuentran aumentados (145). El TRPV5 y el TRPV6 son canales de calcio que se 
expresan en la membrana apical del TCD y que participan en el proceso de reabsorción 
transcelular de calcio característico de este segmento de la nefrona. 
En cuanto al magnesio, Bindels y colaboradores han propuesto que la hipomagnesemia 
en pacientes con Gitelman podría deberse a la disminución en la expresión y, por lo 
tanto, la actividad del canal de Mg
2+
 apical TRPM6, ya que su expresión se ha visto 
disminuida en modelos murinos de Gitelman (91). Por otro lado, estudios del mismo 
grupo han revelado que mutaciones en el gen codificante para un canal de K
+
 que se 
expresa en la membrana apical del TCD, Kv1.1, provocan hipomagnesemia hereditaria. 
Según la propuesta de los autores, la deficiencia en la función de este canal de K
+
 (a 
través del cual se secreta K
+
 al lumen tubular) provoca que no se genere el gradiente 
electroquímico necesario para promover la reabsorción de Mg
2+
 vía TRPM6, 
produciéndose así un defecto en la reabsorción de Mg
2+
 en este segmento de la nefrona 
(51). En concordancia con dicho mecanismo, es razonable pensar que la deficiencia en 
la actividad del NCC afectaría también la actividad del canal Kv1.1, debido a que no se 
podría mantener la actividad de la ATPasa Na
+
/K
+
 basolateral y, por lo tanto, se vería 
también afectada la reabsorción de Mg
2+
. 
 
 
 24 
La función de NCC también impacta el metabolismo de K
+
 y el balance ácido-base. El 
bloqueo de la función de NCC puede provocar hipokalemia, es decir, niveles bajos de 
K
+
 en sangre. La causa de la hipokalemia se explica en la siguiente sección. Por su 
parte, los efectos en el balance ácido-base están ligados a los efectos en el metabolismo 
de K
+
. Se sabe que la hipokalemia puede causar alcalosis metabólica, así como la 
alcalosis puede ser causa de hipokalemia. Una disminución en la concentración 
plasmática de K
+
 disminuye la cantidad de K
+
 unido a proteínas, y estos sitios de unión 
pueden unir a cambio H
+
 disminuyendo así la concentración plasmática de H
+
. Además 
la secreción de H
+
 también aumenta en el conducto colector en respuesta a un aumento 
en el flujo y a la cantidad de Na
+
,Cl
-
 y K
+
 que llegan a este sitio (9). Por ejemplo, la 
mayor llegada de K
+
 (dada la secreción aumentada vía ROMK o MaxiK) en conjunto 
con la hipokalemia son factores que se espera que estimulen la actividad del 
intercambiador de K
+
/H
+
 de las células. De esta forma, aumenta la secreción renal de H
+
 
que contribuye al desarrollo de acidosis metabólica. 
En resumen, la deficiencia en la función de NCC en pacientes con síndrome de 
Gitelman causa hipotensión arterial, hipokalemia, alcalosis metabólica, 
hipomagnesemia e hipocalciuria. También se observan mayor densidad mineral ósea, 
secundaria a la hipocalciuria y, en ocasiones, niveles elevados de enzimas del sistema 
renina-angiotensina-aldosterona que son indicadoras de la depleción de volumen. 
Alteraciones opuestas a las que se presentan en el síndrome de Gitelman se observan 
cuando la función de NCC se encuentra elevada, es decir, se desarrolla hipertensión 
arterial, hiperkalemia, acidosis metabólica e hipercalciuria. De manera interesante, los 
niveles de magnesio plasmático no se elevan. Esto se ha visto en modelos animales 
transgénicos en que esta función está aumentada (67; 146) y en personas con 
pseudohipoaldosteronismo tipo 2 (PHAII) (también llamado síndrome de Gordon), 
enfermedad genética autosómica dominante cuya fisiopatología se explica 
principalmente por aumentos en la función de NCC (44; 45) (tabla 1). A pesar de que 
las mutaciones que causan este síndrome no ocurren directamente sobre NCC, sino 
sobre una cinasa reguladora que también regula a otros participantes de la función renal, 
se piensa que todos los trastornos que presentan estos pacientes se deben a la alteración 
en la función del NCC , esto debido a que todos se corrigen con tiazidas a dosis bajas 
(79) y a que la ausencia de NCC en un modelo murino de PHAII evita que se 
desarrollen dichas alteraciones(más bien se producen las alteraciones observadas en 
Gitelman) (67). No obstante, cabe mencionar que recientemente fue descrito un 
 
 
 25 
mecanismo para la reabsorción electroneutra de Na
+
 y Cl
-
, que es sensible a tiazidas y 
que ocurre en células intercaladas B de túbulo conector y conductos colectores. Este 
mecanismo involucra la actividad acoplada del intercambiador de Cl
-
/HCO3
- 
conocido 
como Pendrina y del intercambiador de Cl
-
/HCO3
-
 dependiente de Na
+
, NDCBE (55; 
71). Esto abre la posibilidad de que en la fisiopatología del PHAII esté involucrada 
también la activación de dicho mecanismo, la cual sería también revertida fácilmente 
con la administración de tiazidas. 
 
Tabla 1. Cuadro comparativo de síndrome de Gitelman y PHAII 
 
Síndrome de Gítelman Pseudohipoaldosteronismo tipo II 
(PHAII) 
Enfermedad genética autosómica recesiva Enfermedad genética autosómica 
dominante 
Mutaciones inactivantes en NCC Mutaciones de “ganancia de función” en 
WNK4 o mutaciones que aumentan la 
expresión de WNK1 
 
Se corrige completamente con tiazidas 
Hipotensión arterial Hipertensión arterial 
Alcalosis metabólica Acidosis metabólica 
Hipokalemia Hiperkalemia 
Hipomagnesemia Normomagnesemia 
Hipocalciuria Hipercalciuria (mutación en WNK4) 
↑ densidad mineral ósea ↓ densidad mineral ósea 
↑ la actividad plasmática de renina (APR) ↓ APR 
↑ [aldosterona]
plasmática
 ↓ [aldosterona]
plasmática 
 
 
 
 
 
Finalmente, es interesante mencionar que recientemente se describió un tercer síndrome 
de origen genético, llamado síndrome SESAME o EAST (7; 115), en el cual, parte de 
las alteraciones fenotípicas observadas resultan de la actividad deficiente del NCC. En 
este caso las mutaciones ocurren en el canal de K
+
 Kir4.1 (codificado por KCNJ10) el 
 
 
 26 
cual se expresa en varios tejidos, pero que en riñón se localiza exclusivamente en la 
membrana basolateral de TCD, túbulo conector, colector inicial y, en menor grado, en 
asa ascendente gruesa de Henle. Los pacientes presentan ataques epilépticos, sordera 
neurosensorial, ataxia y retraso mental debido a la pérdida de la actividad del canal en 
sistema nervioso central y oído, y además presentan alteraciones electrolíticas de origen 
renal. En específico, se observan hipokalemia, alcalosis metabólica, hipomagnesemia, 
hipocalciuria e indicios de pérdida urinaria de sal, como poliuria, consumo elevado de 
sal y niveles elevados de actividad plasmática de renina y aldosterona. Debido a que el 
mal funcionamiento de cada uno de los mecanismos distales para reabsorción de sal se 
asocia con patrones de alteraciones electrolíticas bien establecidos y el patrón observado 
en este síndrome es similar a aquel observado en el síndrome de Gitelman, la idea que 
prevalece es que la actividad deficiente de Kir4.1 afecta principalmente la reabsorción 
de sal a nivel del TCD. Se ha propuesto que la actividad de Kir4.1 es importante para la 
recirculación hacia el espacio basolateral del K
+
 que entra a la célula a través de la 
Na
+
/K
+
 ATPasa y que al afectarse la actividad de Kir4.1, se afecta la actividad de la 
ATPasa, lo cual a su vez impacta también en la actividad del NCC (115). 
 
II.4 Importancia del NCC en el manejo renal de potasio. 
 
Como ya se dijo, el bloqueo de la función de NCC puede provocar hipokalemia, es 
decir, niveles bajos de K
+
 en sangre. Por ejemplo, la hipokalemia es un efecto 
secundario bien conocido de los diuréticos tipo tiazida que se presenta, principalmente, 
ante la intoxicación con dicho fármaco. Además, como se mencionó en la sección 
anterior, una de las alteraciones que presentan los pacientes con síndrome de Gitelman y 
que también se observa en los modelos murinos de Gitelman es precisamente la 
hipokalemia (21; 117; 145). La visión actual es que la deficiencia en la actividad del 
NCC provoca hipokalemia porque se afecta de manera indirecta a los mecanismos 
involucrados en el manejo renal de K
+
 de la nefrona distal. 
La cantidad de K
+
 que se excreta en orina responde a los niveles de ingesta de K
+
, ya 
que, a mediano plazo, la cantidad excretada de K
+
 debe de ser igual a la cantidad 
ingerida para mantener así el balance de K
+
 en el organismo. La nefrona distal es el sitio 
en donde se define la cantidad de K
+
 que se excreta en orina. Debido a que la 
concentración plasmática de K
+
 es baja y se mantiene baja a pesar de que la ingesta de 
K
+
 aumente, la cantidad de K
+
 que se filtra en el glomérulo es baja y la mayor parte de 
 
 
 27 
este K
+
 se reabsorbe en los segmentos más proximales de la nefrona (antes de la mácula 
densa). Cuando la ingesta de K
+
 es baja, la nefrona distal lleva a cabo la reabsorción del 
K
+
 restante que es apenas el ~10% del K
+
 filtrado. En cambio, cuando la ingesta de K
+
 
es alta, en la nefrona distal se lleva a cabo la secreción de una cantidad importante de K
+
 
para así aumentar la cantidad excretada en orina. Por lo tanto, los mecanismos 
involucrados en el manejo de K
+
 están sujetos a diversos tipos de regulación, 
principalmente, a regulación hormonal (8; 48; 50). 
El proceso de secreción de K
+
 en la nefrona distal involucra a dos tipos de canales de 
potasio que se expresan en la región apical del túbulo conector y en conductos 
colectores: el canal renal de potasio de médula externa (ROMK; Renal Outer Medullary 
Potassium Channel) y los canales BK (Big potassium) (49) (figura 4). La cantidad de K
+
 
que se transporta a través de estos canales depende del gradiente electroquímico 
transepitelial de K
+
. Tres factores importantes influyen en dicho gradiente: 1) La 
reabsorción de Na
+
 a través del canal apical ENaC (Epithelial Na
+
 Channel) (figura 4), 
que promueve la generación de un potencial eléctrico negativo en el lumen, 
favoreciendo así la secreción de K
+
 a través de los canales; 2) La actividad de la Na
+
/K
+
 
ATPasa basolateral que mantiene los niveles intracelulares de K
+
 altos y que además 
permite que se mantenga la reabsorción de Na
+
 vía ENaC, ya que el Na
+
 que entra a las 
células epiteliales a través de ENaC pasa después al intersticio renal a través de dicha 
bomba; 3) La cantidad de fluido que llega a la nefrona distal también influye en la 
secreción de K
+
, porque mientras mayor es el volumen de fluido presente, mayor es la 
cantidad de K
+
 que se puede secretar antes de agotar el gradiente, en otras palabras, es 
más difícil igualar la concentración intracelular y luminal de K
+
. 
 
 
 
 28 
 
 Figura 4. Proteínas de transporte involucradas en el manejo de Na
+
 y K
+
 en la nefrona distal. TCD1, 
túbulo contorneado distal temprano; TCD2, túbulo contorneado distal tardío; CNT, túbulo conector; CD 
conducto colector. 
 
Alteraciones en la actividad del NCC afectan de manera indirecta la actividad de estos 
mecanismos de secreción de K
+
. Por ejemplo, la inactivación del NCC provoca 
hipokalemia ya que aumenta la secreción renal de K
+
 porque se activan dichos 
mecanismos. La causa de esto es el aumento en el volumen de líquido y en la cantidad 
de NaCl que llega a túbulo conector y colector al estar bloqueado NCC. El aumento 
luminal de Na
+
 en túbulo conector y conductos colectores favorece la reabsorción a 
través del canal ENaC, generando un potencial eléctrico negativo en el lumen, que 
favorece la salida de K
+
 a través de ROMK. Así mismo, la actividad de ENaC es 
necesaria para mantener la actividad de la ATPasa de Na
+
/K
+
 la cual se requiere para la 
secreción de K
+
. Por último, la contracción del volumen extracelular ocasionada por la 
deficiencia en la actividad del NCC puede activar el eje renina-angiotensina-aldosterona 
y la aldosterona circulante exacerbar el efecto sobre la secreción de K
+
, ya que la 
aldosterona es un conocido promotor hormonal de la excreción renal de K
+
. Los canales 
de K
+
 sensiblesa flujo BK también participan en el aumento en la secreción de K
+
 (9; 
21). 
Dada esta estrecha relación entre la actividad del NCC y los mecanismos de secreción 
distal de K
+
, se piensa que la regulación del NCC forma parte de un mecanismo 
 
 
 29 
fisiológico para modular la excreción de K
+
. Existe evidencia, por ejemplo, de que la 
fosforilación N-terminal del NCC, la cual está relacionada con el estado de activación 
del cotransportador (ver sección II.8) aumenta en animales mantenidos en dietas bajas 
en K
+
, lo cual es importante, probablemente, para lograr la máxima retención de K
+
 
(126). De hecho, en los ratones “knockout” para NCC mantenidos en dieta baja en K
+
, 
la hipokalemia se agrava, lo cual sugiere que la activación del NCC es un mecanismo 
importante para evitar la pérdida de K
+
 en situaciones en que la ingesta es baja (87; 
117). Además, en ratones en que el NCC se encuentra sobre-activado (en la sección II.6 
se explica este modelo a detalle) la administración de dieta alta en K
+
 provoca 
hiperkalemia severa, alcanzándose valores de [K
+
] plasmáticos de 7-12 mM (67). 
 
 
II.5 El pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII): genes afectados 
 
El PHAII es una enfermedad autosómica dominante, monogénica, pero heterogénea. 
Hasta el momento se sabe, mediante análisis de ligamiento genético, que mutaciones en 
al cuatro loci diferentes pueden causar la enfermedad. Dos de los loci afectados en 
PHAII corresponden a cinasas de la misma familia: la cinasa WNK1 (12p13.3) y la 
cinasa WNK4 (17q21) (29; 30; 136). De los otros dos loci se habla al final de esta 
sección. 
WNK1 y WNK4 son cinasas de serina/treonina que forman parte de una familia de 4 
miembros en mamíferos: WNK1, WNK2, WNK3 y WNK4. La descripción inicial de 
estas cinasas es relativamente reciente, ya que el primer miembro se identificó en el año 
2000 a partir de un intento de clonación de nuevos miembros de la familia de las 
cinasas MEK (139). Sin embargo, la caracterización demostró la incapacidad de esta 
nueva proteína de fosforilar a sustratos conocidos de las cinasas ERK y la incapacidad 
de activarse ante estímulos conocidos de este tipo de vías, además de que se encontró 
una organización única del dominio catalítico por la ausencia de un residuo de lisina 
involucrado en la catálisis y localizado en el subdominio II del dominio cinasa 
conservada en todas las cinasas conocidas hasta el momento. Se demostró que, a pesar 
de esto, las cinasas WNK son catalíticamente activas y que esto es gracias a un residuo 
de lisina presente en el subdominio I del dominio cinasa que compensa la ausencia de la 
lisina ausente (81; 139). La sustitución de dicha lisina del subdominio II por una 
 
 
 30 
cisteína le dio su nombre a esta familia de cinasas: WNK viene de “with no lysine” (sin 
lisina). 
Las cuatro cinasas de la familia presentan una organización estructural similar (figura 
5): un dominio amino terminal de 150-200 residuos poco conservado entre las WNKs, 
una región cinasa de ~270 aminoácidos altamente conservada y una región carboxilo-
terminal regulatoria de tamaño variable y también poco conservada entre las diferentes 
WNKs. 
 
Figura 5. Estructura de las cuatro cinasas de la familia WNK. 
 
Además se pueden identificar tres regiones altamente conservadas desde WNK1 hasta 
WNK4 (57). La más conservada (RC1) corresponde al dominio cinasa localizado hacia 
el extremo amino-terminal, que se puede dividir en los 12 subdominios característicos 
de las cinasas de serinas/treoninas (81; 139). La serina 382 en WNK1 de rata se localiza 
en el asa de activación (T loop) dentro de la región cinasa y se ha visto que su 
autofosforilación o la fosforilación de este sitio por otra cinasa se requiere para activar a 
WNK1 (140; 148). También dentro de ésta primera región conservada, posterior al 
extremo carboxilo del dominio cinasa, encontramos al dominio autoinhibitorio (AI), una 
región de ~65 aminoácidos que, en ciertas condiciones, ejerce un efecto negativo sobre 
la actividad cinasa (140). Éste mecanismo de regulación no es único de las WNK, ya 
 
 
 31 
que se ha demostrado para otras cinasas en las que se ha estudiado ampliamente. En 
estas cinasas, dicho dominio ejerce una interacción con el sitio activo de la enzima y 
bajo distintas señales activadoras, la interacción puede afectarse con la consecuente 
activación de la enzima. Este dominio ha sido estudiado únicamente en WNK1 de rata y 
se ha demostrado que la construcción de una WNK1 truncada justo al final del dominio 
AI, tiene una actividad catalítica disminuida y que esta disminución no se observa 
cuando se ensaya la actividad cinasa de una WNK1 truncada unos 100 aminoácidos 
después del dominio AI, lo que sugiere que hay una región autoregulatoria en esta zona 
que evita la inhibición mediada por el dominio AI (140). En WNK1 y WNK4 existe un 
motivo de “hélice helicoidal” (CC, por sus siglas en inglés: “coiled-coil”) poco después 
del dominio AI (en WNK3 este dominio se encuentra en una zona más posterior; figura 
5). Inmediatamente después del dominio AI de WNK1 y WNK4 hay una región rica en 
aminoácidos ácidos que está conservada a lo largo de todas las WNKs (57). 
La segunda región conservada (RC2), de ~60 aminoácidos, se localiza 
aproximadamente a la mitad de la cadena polipeptídica y, dentro de ésta región, no se 
ha identificado ningún motivo con estructura o función conocida. La tercera región 
conservada (RC3) es, al igual que RC2, una región corta (~80 aminoácidos) que se 
localiza hacia el extremo C-terminal. Dentro de ésta región se localiza el segundo 
motivo CC (primero para WNK2). Los motivos CC generalmente median interacciones 
proteína-proteína, por lo que se ha propuesto que podrían participar en la formación de 
complejos heteroméricos, con otras proteínas involucradas en una vía de señalización, u 
homoméricos, entre monómeros de WNK (67). De hecho, recientemente dos grupos han 
descrito que los diferentes tipos de WNKs (WNK1-4) pueden interactuar entre sí y que 
dentro de este segundo motivo CC se encuentran los residuos indispensables para esta 
interacción (124; 143). Se demostró que sólo un fragmento peptídico contenido dentro 
de este motivo es necesario para la interacción entre distintas WNKs y que la mutación 
individual de 3 residuos dentro de este fragmento reducen de manera drástica las 
interacciones. Más aún una mutante en que se sustituyó dos de estos residuos por 
alanina (H1145A/Q1156A de WNK4 de humano), perdió por completo la capacidad de 
interactuar con otras WNKs en un sistema in vitro. En estas mutantes se observó 
también una reducción en la actividad de autofosforilación, lo que sugirió que este sitio 
de interacción podría también estar involucrado en la formación de homodímeros, cuya 
existencia previamente se había demostrado (67). Hasta el momento se sabe que las 
 
 
 32 
WNKs pueden formar homómeros y heterómeros, pero se desconoce cuál es la 
conformación predominante in vivo, cual es la conformación activa, etc. 
Respecto a las mutaciones causantes de PHAII, las mutaciones encontradas en el gen de 
WNK1 no afectan a ninguno de estos dominios, sino que recaen en una región dentro 
del intrón 1. Se ha comprobado experimentalmente que estas mutaciones, que en 
realidad son deleciones que abarcan al menos una región de 22 kb, provocan un 
aumento en la expresión de la cinasa (136;26). Es decir, el PHAII en este caso se debe a 
la sobre-expresión de WNK1 silvestre. WNK1 se expresa en varios tejidos, y en riñón 
se expresa exclusivamente en TCD y en los conductos colectores, tanto corticales como 
medulares. Existen varias isoformas de la cinasa, pero para fines de simplicidad diremos 
que existen dos isoformas que se producen a partir de 2 promotores alternativos: la 
isoforma larga, codificada por la región codificante completa comprendida en el gen, y 
la isoformacorta, que carece del dominio cinasa amino-terminal, ya que la transcripción 
inicia a partir de un exón 4 alternativo, el exón 4a. Tanto de la isoforma larga, como de 
la isoforma corta, existen a su vez varias isoformas que se generan como consecuencia 
del splicing alternativo que pueden sufrir varios exones que codifican segmentos de la 
región C-terminal de la cinasa (130). La isoforma larga se expresa en varios tejidos, 
pero de manera predominante en corazón, músculo esquelético y riñón (27; 136), 
mientras que la isoforma corta es específica de riñón y se encuentra predominantemente 
en TCD (27; 130). En estudios recientes con animales transgénicos se ha demostrado 
que las deleciones en el intrón 1, aumentan la expresión de ambas isoformas en DCT y 
causan la expresión ectópica ubicua de la isoforma corta (26). Los estudios actuales 
están enfocados a entender el mecanismo mediante el cual el aumento en la expresión 
de las isoformas de WNK1 afecta la función de NCC. Datos recientes de nuestro 
laboratorio, que aún no han sido publicados, sugieren que tanto la isoforma larga de 
WNK1 como KS-WNK1 tienen la capacidad de promover la activación del NCC. Esto 
se basa en observaciones hechas en ovocitos de X. laevis en los que es posible medir la 
actividad del NCC (como se explica en la sección II.6, apartado “Experimentos in 
vitro”). En éstas células, la actividad del NCC expresado de forma heteróloga aumenta 
cuando también se provoca la expresión de WNK1 o de KS-WNK1. 
Por su parte, las mutaciones en el gen de WNK4 recaen en la región codificante y son 
mutaciones puntuales. Se han identificado hasta el momento 5 mutaciones de este tipo 
causantes de PHAII (53; 136) (figura 5). Cuatro de ellas (P561L, E562E, D564A/H y 
Q565E) recaen en la región altamente conservada en todos los miembros de la familia, 
 
 
 33 
inmediatamente posterior al primer motivo CC y que se caracteriza por ser rica en 
aminoácidos con carga negativa. La quinta mutación es la R1185C, que se localiza en 
una región posterior al segundo motivo CC. Se ha propuesto que las mutaciones podrían 
afectar interacciones necesarias para la función de WNK4 mediadas por los motivos CC 
(56). 
Por último, recientemente se describieron dos genes adicionales en que también recaen 
mutaciones causantes de PHAII. Estos genes codifican para dos proteínas que forman 
parte de un complejo con actividad de ubiquitin ligasa E3, que se clasifica dentro de la 
familia de ubiquitin ligasas RING. Dichas proteínas son Kelch3 (el nombre completo en 
inglés es “Kelch-like 3”; KLHL3) y Cullin3 (CUL3). El complejo de ubiquitin ligasa 
está conformado por un dímero de KLHL3 y un dímero de CUL3. Cada subunidad de 
KLHL3 contiene un sitio para unión del sustrato de ubiquitilación y contiene un 
dominio para unión a CUL3 (el dominio BTB). Por su parte, cada subunidad de CUL3 
contiene un sitio para unión con el dominio BTB de KLHL3 y otro sitio para unión con 
la ubiquitin ligasa de tipo RING. De hecho, CUL3 es una proteína ubicua que participa 
en la regulación de una amplia gama de funciones celulares, al participar en complejos 
de ubiquitin ligasa que actúan sobre diversos blancos celulares. Al unirse a diferentes 
proteínas similares a KLHL3, que poseen dominios BTB y que contienen el sitio de 
unión del sustrato, se confiere a CUL la capacidad de actuar sobre diferentes blancos. 
Las mutaciones causantes de PHAII que ocurren en KLHL3 pueden ser de tipo 
dominante o recesivo. Se han descrito mutaciones recesivas a lo largo de la región 
codificante del gen, mientras que las mutaciones dominantes ocurren en regiones muy 
especificas, en concreto, ocurren en el dominio BTB o en el sitio de unión del sustrato. 
Dada la similitud entre el fenotipo observado en los pacientes con mutaciones recesivas 
y en los pacientes con mutaciones dominantes, se infiere que las mutaciones dominantes 
ejercen un efecto dominante-negativo sobre la función del complejo, abatiendo así la 
actividad de ubiqutin-ligasa. 
Por otro lado, todas las mutaciones causantes de PHAII en CUL3 afectan el splicing del 
exón 9, provocando que se produzca una proteína que carece del segmento codificado 
por este exón, un segmento de 57 aminoácidos cuya función se desconoce, pero que 
forma parte de la región de la proteína que une al dominio BTB con el dominio de unión 
a la ubiquitin-ligasa RING. Todas son mutaciones de novo, dominantes y se piensa que 
éstas afectan específicamente a la unión con KLHL3 ya que los pacientes presentan un 
fenotipo PHAII y no presentan otros transtornos, es decir, parece que las mutaciones 
 
 
 34 
sólo afectan la función de la nefrona distal a pesar de que CUL3 se expresa y actúa en 
distintos tipos celulares. Nuevamente, se infiere que las mutaciones producen una 
pérdida de función ya que el fenotipo es similar al observado en pacientes con 
mutaciones recesivas en KLHL3 y, dado que presentan un patrón de herencia 
mendeliana dominante, probablemente las mutaciones ejercen un efecto dominante 
negativo. 
Hasta el momento se desconoce el papel que juegan KLHL3 y CUL3 en la modulación 
de la función de la nefrona distal, sin embargo, dado que las alteraciones PHAII reflejan 
la sobreactivación del NCC, la propuesta más obvia es que el complejo de ubiquitin 
ligasa integrado por KLHL3 y CUL3, entre otras proteínas, promueva normalmente la 
degradación del NCC o de alguna proteína activadora del NCC, de tal forma que la 
pérdida de función de dicho complejo provoque el aumento en la actividad del 
cotransportador, lo cual explicaría el desarrollo de las alteraciones observadas. En 
concordancia con esto, se ha demostrados ya que ambas proteínas se expresan en las 
células del TCD. 
Finalmente, es interesante mencionar que entre los distintos tipos de PHAII existen 
diferencias en cuanto a la gravedad de las alteraciones presentadas y, por lo tanto, la 
edad en que se diagnostican, siendo las mutaciones en CUL3 las que producen las 
alteraciones más graves (10). El hecho de que todas las mutaciones encontradas en 
CUL3 sean mutaciones de novo, sugiere que las alteraciones son tan graves que 
provocan una incapacidad reproductiva. En cuanto a los demás tipos de PHAII, el orden 
de gravedad que se observa de acuerdo al tipo de mutación es el siguiente: mutaciones 
recesivas en KLHL3 > mutaciones dominantes en KLHL3 > WNK4 > WNK1. Esta 
observación probablemente nos habla del nivel jerárquico que tiene cada proteína en las 
vías de señalización implicadas en la regulación del NCC. 
 
 
II.6 La cinasa WNK4 como reguladora de la función del NCC 
 
Expresión 
En riñón WNK4 se expresa exclusivamente en podocitos, la porción ascendente gruesa 
del asa de Henle, túbulo contorneado distal (TCD) y conducto colector (TC) (92; 136). 
También se expresa en otros tejidos como colon, próstata, corazón, hígado, páncreas, 
cerebro y pulmones (61). La localización de WNK4 es casi exclusiva de epitelios 
 
 
 35 
polarizados dentro de dichos tejidos. Inicialmente se describió que, en riñón, WNK4 se 
concentra en las uniones intercelulares del epitelio tubular y co-localiza con proteínas 
específicas de las uniones estrechas (zonula occludens-1), lo cual resultaba interesante 
porque alteraciones genéticas en proteínas de estas uniones alteran la permeabilidad 
paracelular de iones, por lo que se propuso la posibilidad de que modificaciones en ellas 
mediadas por WNK4 pudieran tener un efecto similar (136). Sin embargo, en un trabajo 
reciente en el que se estudió la localización subcelular de WNK4 mediante 
inmunofluorescencia, con un anticuerpo distinto, se cuestionó la localización de WNK4 
en uniones estrechas (92). 
Las publicaciones existentes de caracterizaciones fenotípicas de pacientes con PHAII 
mencionan únicamente alteraciones de origen renal, lo que podría ser un reflejo de la 
expresión predominante de WNK4 en riñón. Sin embargo, otraposibilidad es que las 
mutaciones puntuales en WNK4 estén afectando una o varias funciones de esta cinasa 
que sean particulares al riñón y no así a otros órganos. Nuestros hallazgos apoyan está 
última posibilidad (ver adelante). 
Experimentos in vitro 
El evidente papel de WNK4 sobre la función renal predispuso a que los primeros 
experimentos enfocados a estudiar la relación de WNK4 con otras proteínas fuera 
precisamente con cotranspotradores renales de TCD y conducto colector (CC) y con 
proteínas de las uniones estrechas presentes en el epitelio renal. Debido al conocimiento 
previo de la alta sensibilidad de pacientes con PHAII a los diuréticos tipo tiazida y 
debido a que el síndrome es una imagen en espejo del síndrome de Gitelman (causado 
por mutaciones inactivantes en NCC), el primer transportador renal lógico a estudiar fue 
NCC. Los primeros experimentos se realizaron en nuestro laboratorio, in vitro, 
utilizando el sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis. En este 
sistema se logra la expresión del NCC mediante la inyección de RNA complementario 
(cRNA) de NCC, que los ovocitos son capaces de traducir a proteína y de expresar en 
membrana. Una vez expresado el cotransportador en la membrana, es posible 
determinar su actividad midiendo la cantidad de 
22
Na
+
 que es incorporado a la célula en 
cierto periodo de tiempo y la fracción que es dependiente de cloro o sensible a tiazidas. 
Al coexpresar NCC con WNK4 en ovocitos el nivel de actividad del NCC observado 
fue menor, es decir, se demostró un efecto negativo de WNK4 sobre la actividad del 
NCC (137). Este efecto negativo se relacionó un una disminución en la llegada del NCC 
a la membrana celular y además se vio que es dependiente de la actividad cinasa, ya que 
 
 
 36 
la coexpresión de una WNK4 con una mutación que abate la actividad cinasa no 
produjo el mismo efecto. Ante la coexpresión del NCC con WNK4 con mutaciones tipo 
PHAII (WNK4-PHAII) no se observó un efecto negativo sobre NCC y tampoco una 
disminución en la llegada a membrana. Este efecto diferencial entre WNK4 y WNK4-
PHAII no se pudo explicar por un cambio en la interacción con NCC ya que ambas 
cinasas coinmunoprecipitaron en cantidades similares con el cotransportador (137). 
Otros grupos obtuvieron resultados similares (52; 142) y además, tanto en ovocitos, 
como en células HEK-293, se hicieron observaciones que sugerían que la disminución 
en la actividad del NCC y de su expresión en membrana provocada por WNK4 se 
debían a que esta cinasa afecta el tráfico de NCC desde el Golgi hasta la membrana 
plasmática y desvía al cotransportador hacia lisosomas para promover su degradación 
(52; 121). 
Más recientemente se ha observado que la capacidad de los diferentes tipos de WNKs 
de interaccionar entre ellas, mencionada en la sección anterior tiene implicaciones a 
nivel funcional. Se ha observado que WNK4 tiene la capacidad de inhibir al efecto 
activador que WNK3 sobre el NCC (según datos del grupo de Ellison (143) y datos no 
publicados de nuestro laboratorio), así como el efecto activador de WNK1 sobre NCC 
(según datos no publicados de nuestro laboratorio). Existe la posibilidad de que la 
inhibición del NCC mediada por WNK4, observada en los diversos modelos, se deba a 
un efecto de WNK4 sobre las cinasas endógenas (WNK1 o WNK3) y, dado que todas 
ellas co-expresan en las células del TCD, es posible que la interacción entre ellas forme 
parte de un mecanismo celular para la regulación del NCC. 
 
De manera similar a lo realizado para NCC se ha estudiado también de manera amplia, 
en sistemas de expresión heteróloga el efecto de la coexpresión de WNK4 con otros 
transportadores importantes para el manejo de electrolitos en la nefrona distal. Los 
resultados se resumen en la figura 6. Se observó que WNK4 tiene también un efecto 
negativo sobre la actividad de ENaC, el canal apical de Na
+
 de la región tardía de TCD 
y del CC, y que las mutaciones PHAII evitan esta inhibición. A diferencia del efecto 
sobre NCC, el efecto negativo de WNK4 sobre ENaC resultó no ser dependiente de la 
actividad catalítica de la cinasa (107). También se demostró un papel negativo de 
WNK4 sobre ROMK, el canal apical de K
+
 del CC. Este efecto también resultó ser 
independiente de la actividad cinasa y a diferencia de lo ocurrido con NCC o con ENaC, 
 
 
 37 
la WNK4-PHAII ejerció un efecto inhibitorio aún mayor sobre la corriente mediada por 
el canal (63). 
Por último, dos grupos independientes evaluaron la capacidad de WNK4 de alterar la 
permeabilidad celular de Cl
-
 en epitelios artificiales formados por células MDCK. Kahle 
et. al. (62) encontraron que la transfección de WNK4 provocaba un aumento en la 
permeabilidad paracelular de Cl
-
 dependiente de la actividad cinasa, y que este efecto se 
acentuaba >4.5 veces en presencia de mutaciones PHAII. Yamauchi et al. (141), por su 
parte, también observaron el aumento en la permeabilidad paracelular de Cl
-
 al 
transfectar con WNK4-PHAII. Además, observaron que WNK4 silvestre inducía la 
fosforilación de claudinas y que los niveles de fosforilación eran mayores con WNK4-
PHAII. 
 
Figura 6. Efecto de WNK4 y de WNK4-PHAII sobre la actividad de proteínas renales involucradas en el 
transporte distal de electrolitos. 
 
Experimentos in vivo. 
El papel regulatorio de WNK4 sobre NCC fue verificado posteriormente in vivo en 
modelos de ratones transgénicos. El grupo de Richard Lifton generó un modelo 
transgénico que contiene dos alelos extras de WNK4 que contienen una mutación tipo 
PHAII (ratones WNK4
PHAII
) y un segundo modelo con dos alelos extras de WNK4 
silvestre (ratones WNK4
Tg
) (67). En el primer modelo (WNK4
PHAII
) observaron un 
fenotipo similar al que presentan los pacientes con PHAII: hipertensión, hiperkalemia, 
hipermagnesemia, hipercalciuria y acidosis metabólica. Por medio de 
inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para distintas zonas de la nefrona se 
demostró que en estos ratones ocurre un aumento del área de la superficie del lumen 
tubular exclusivamente en el TCD, lo cual se relacionó con un aumento en la expresión 
 
 
 38 
del NCC y otras proteínas específicas de TCD que se confirmó por PCR en tiempo real. 
Se cruzaron estos ratones con ratones “knockout” de NCC, para generar ratones 
WNK4
PHAII 
deficientes en NCC y éstos presentaron un fenotipo similar al observado en 
los “knockout”, es decir, la ausencia de NCC previno por completo el desarrollo del 
fenotipo PHAII, lo que reveló la importancia del NCC, no solo para la reabsorción de 
sal, sino también en el manejo renal de otros electrolitos. Esto, en conjunto con la 
alteración histológica observada solamente en TCD, apoyó fuertemente la idea de que la 
fisiopatología del PHAII se debe principalmente a un aumento en la función del NCC. 
En los ratones WNK4
Tg 
se observaron alteraciones opuestas: hipotensión, hipokalemia 
e hipocalciuria, es decir, un fenotipo similar al observado en síndrome de Gitelman lo 
que sugería que podría deberse a la función disminuida del NCC. En efecto, en estos 
ratones se observó una disminución del área de la superficie luminal del TCD y una 
expresión disminuida del NCC y de otras proteínas específicas del segmento. Esto 
concordaba con la observación inicial hecha en ovocitos sugiriendo que WNK4 ejerce 
un papel negativo sobre la función del NCC. 
Por otro lado, el grupo del Dr. Uchida generó una cepa de ratones de tipo “knock-in” de 
WNK4 en la que se sustituyó un alelo silvestre por un alelo con una mutación tipo 
PHAII (ratones WNK4
D561A/+
) (146). Estos ratones también presentaron un fenotipo tipo 
PHAII y lo novedoso de este trabajo fue que se demostró que en estos ratones no sólo 
está aumentada la expresión total de NCC, sino que también está aumentada la 
fosforilación en residuos localizados en el extremo amino que se han asociado a la 
activación