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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas PAPEL DEL CITOESQUELETO DE ACTINA EN LA REPLICACIÓN DE ROTAVIRUS TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias PRESENTA QBP. Oscar Trejo Cerro TUTOR PRINCIPAL Dr. Carlos Federico Arias Ortiz Instituto de Biotecnología, UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTORAL Dr. Federico Sánchez Rodríguez † (IBT-UNAM) Dr. Ramón González García Conde (CIDC-UAEM) Cuernavaca, Morelos Febrero 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Jurado Presidente Dra. Leonor Pérez Martínez Secretario Dr. Ernesto Ortiz Suri Vocal Dra. Ana Lorena Gutiérrez Escolano Vocal Dr. Juan Ernesto Ludert León Vocal Dra. María del Carmen Beltrán Núñez El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Virología Molecular del Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México bajo la tutoría del Dr. Carlos Federico Arias Ortiz. En la realización de la presente se contó con beca otorgada por CONACYT y el proyecto se desarrolló con apoyo económico del donativo CONACYT 221019, además de contar con el apoyo del PAEP para asistir al IX Congreso Nacional de Virología. A mi madre, Joaquina, mi padre, Santos y mi hermano, Gustavo, gracias por todo su apoyo incondicional. “La ciencia es como el sexo: algunas veces tiene aplicaciones prácticas, pero no es por eso que lo hacemos” Richard Feynman 5 ÍNDICE GENERAL RESUMEN ............................................................................................................................................ 9 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 11 Generalidades de los rotavirus...................................................................................................... 11 Ciclo de replicación ....................................................................................................................... 12 Adsorción y penetración a la célula .......................................................................................... 12 Transcripción del genoma viral y traducción ............................................................................ 13 Maduración y salida de la partícula viral................................................................................... 14 Citoesqueleto de actina ................................................................................................................ 17 Polimerización y despolimerización del filamento de actina .................................................... 17 Compuestos químicos que afectan la dinámica del citoesqueleto de actina ........................... 19 Proteínas de unión a actina ....................................................................................................... 19 Sistema Rho-GTPasas .................................................................................................................... 21 Mecanismos de señalización de las Rho-GTPasas ..................................................................... 22 Regulación del citoesqueleto de actina por Rho-GTPasas ............................................................ 24 CDC42 ........................................................................................................................................ 24 Rac ............................................................................................................................................. 24 Rho ............................................................................................................................................ 25 Rol del citoesqueleto de actina en infecciones virales ................................................................. 27 Papel de la actina dentro del ciclo viral..................................................................................... 28 ANTECEDENTES ................................................................................................................................. 30 Rotavirus modifica el citoesqueleto de actina .............................................................................. 30 Interacciones entre proteínas virales y actina .............................................................................. 30 HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 32 OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 33 General .......................................................................................................................................... 33 Específicos ..................................................................................................................................... 33 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................. 34 Células y virus. ............................................................................................................................... 34 Anticuerpos y reactivos ................................................................................................................. 34 Viabilidad celular ........................................................................................................................... 35 Tratamiento con inhibidores ......................................................................................................... 35 6 Determinación del título viral ....................................................................................................... 35 Inmunofluorescencia ..................................................................................................................... 36 Lipofección reversa de siRNAs ...................................................................................................... 36 Western blot ................................................................................................................................. 36 Fraccionamiento celular por gradiente de densidad. ................................................................... 37 Biotinilación de proteínas de membrana. ..................................................................................... 37 Preparación de balsas lipídicas ..................................................................................................... 38 Microscopía Electrónica de Transmisión....................................................................................... 38 RESULTADOS .....................................................................................................................................40 Efecto de fármacos que alteran al citoesqueleto de actina en el rendimiento viral .................... 40 Efecto del jasplakinólido sobre la organización del citoesqueleto de actina en células MA104 .. 43 Cinética de producción y liberación de virus ................................................................................ 44 La infección con rotavirus no compromete la viabilidad celular a tiempos en los que inicia su salida de células infectadas ........................................................................................................... 47 Parte de las partículas virales extracelulares se encuentran asociadas a estructuras lipídicas de baja densidad ................................................................................................................................ 48 Análisis por microscopía electrónica de células MA104 tratadas con jasplakinólido e infectadas con RRV ......................................................................................................................................... 54 El jasplakinólido afecta la distribución intracelular de VP4 .......................................................... 57 La asociación entre balsas lipídicas y rotavirus requiere del treadmilling del citoesqueleto de actina ............................................................................................................................................. 62 La proteína VP4 presente en membrana plasmática se incorpora a partículas infecciosas. ........ 64 Caracterización del papel de proteínas reguladoras de la dinámica del citoesqueleto de actina en la replicación de rotavirus utilizando la interferencia de RNA. ..................................................... 66 Efecto de los diferentes siRNAs que modifican al citoesqueleto de actina sobre diferentes etapas del ciclo replicativo de rotavirus ................................................................................................... 71 DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 78 CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 86 PERSPECTIVAS ................................................................................................................................... 87 REFERENCIAS ..................................................................................................................................... 88 7 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Imágenes de reconstrucciones 3-D de las partículas de rotavirus……………...12 Figura 2. Ciclo replicativo de rotavirus………………………………………………………...16 Figura 3. Dinámica de ensamblaje (treadmilling)…………………………………………….18 Figura 4. Proteínas que participan en la organización del citoesqueleto de actina………21 Figura 5. Activación de las Rho-GTPasas…………………………………………………….23 Figura 6. Señalización de Rac y CDC42 en la reorganización del citoesqueleto de actina……………………………………………………………………………………………….25 Figura 7. Señalización de Rho en la reorganización del citoesqueleto de actina…………26 Figura 8. Diferentes rearreglos del citoesqueleto de actina………………………………....27 Figura 9. Efecto de la citocalasina D, latrunculina B y jasplakinólido sobre la salida de RRV de células MA104…………………………………………………………………………..41 Figura 10. Efecto de la citocalasina D, latrunculina B y jasplakinólido sobre la producción total de virus……………………………………………………………………………………….41 Figura 11. Jasplakinólido inhibe la salida de RRV en células MA104……………………...42 Figura 12. Jasplakinólido no afecta la formación de partículas infecciosas de RRV……..43 Figura 13. Efecto del jasplakinólido sobre células MA104 a diferentes tiempos………….44 Figura 14. Cinética de liberación de la cepa RRV…………………………………………....45 Figura 15. Cinética de producción de virus infeccioso de la cepa RRV……………………46 Figura 16. La salida de rotavirus es inhibida por jasplakinólido…………………………….47 Figura 17. La salida de rotavirus de las células inicia cuando aún no se presenta daño celular………………………………………………………………………………………………48 Figura 18. Rotavirus está asociado a estructuras de baja densidad en el sobrenadante celular………………………………………………………………………………………………52 Figura 19. Partículas virales purificadas no flotan en el gradiente de densidad y el tratamiento de virus extracelular con detergente previene la flotación del virus…………..53 Figura 20. Imágenes de microscopía electrónica de virus extracelular asociado a estructuras membranosas de baja densidad…………………………………………………..54 Figura 21. Microscopía electrónica de células MA104 infectadas con RRV en presencia o ausencia de jasplakinólido……………………………………………………………………….57 Figura 22. Jasplakinólido afecta la localización de la proteína VP4 en el citoplasma…....59 8 Figura 23. El jasplakinólido inhibe el transporte de VP4 hacia la membrana plasmática..61 Figura 24. La asociación entre RRV y balsas lipídicas requiere del treadmilling del citoesqueleto de actina…………………………………………………………………………..64 Figura 25. La VP4 localizada en membrana plasmática es incorporada a partículas infecciosas…………………………………………………………………………………………66 Figura 26. Rotavirus requiere de proteínas que reorganizan el citoesqueleto de actina..67 Figura 27. Análisis de la eficiencia de los silenciamientos…………………………………..68 Figura 28. El silenciamiento de Actn, Diaph y Rac1 no afecta la viabilidad celular………69 Figura 29. Efecto de los RNAi en la reorganización del citoesqueleto de actina…………70 Figura 30. Las proteínas Diaph, Actn y Rac1 no intervienen en la salida de rotavirus de células infectadas…………………………………………………………………………………72 Figura 31. Actn y Diaph son requeridas para la entrada de rotavirus……………………...73 Figura 32. La GTPasa Rac1 se requiere para la síntesis de proteínas de rotavirus…………………………………………………………………………………...............76 Figura 33. Rac1 afecta la síntesis de proteínas celulares…………………………………...77 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Drogas que afectan al citoesqueleto de actina…………………………………….19 9 RESUMEN Rotavirus es el principal agente etiológico de gastroenteritis aguda en niños, causando diarrea severa y deshidratación grave. En células en cultivo, la infección con rotavirus produce una reorganización del citoesqueleto de actina, sin embargo no es claro el papel que tiene esta estructura celular en la replicación del virus. Con el propósito de investigar su importancia, utilizamos dos enfoques metodológicos: el uso de fármacos que alteran al citoesqueleto de actina y el silenciamiento de proteínas involucradas en la adecuada dinámica del mismo. Se observó que el jasplakinólido, fármaco que induce la polimerización y estabiliza el filamento de actina (Holzinger, 2009), no altera la formación de partículas infecciosas en células infectadas, sin embargo inhibe la liberación del virus en un 60%. Históricamente se ha pensado que los virus no envueltos son liberados de células no polarizadas por medio de lisis celular (Tucker y Compans, 1993), sin embargo, en este trabajo encontramos que en células MA104 no polarizadas, rotavirus comienza a salir a partir de las 9 horas post-infección (hpi), mientras que el daño celular causado por la replicación del virus se observa hasta las 12 hpi, lo cual sugiere que el virus es liberado por un mecanismo no lítico, al menos en tiempos tempranos de la infección, y que este mecanismo de liberación depende del citoesqueleto de actina. La caracterización del virus liberado en el sobrenadante celular por medio de gradientes de densidad en iodixanol sugirió que éstos se encuentran asociados a estructuras membranosas, ya que migran a zonas de baja densidad del gradiente y también encontramos que esta asociación no es afectada por jasplakinólido. Por microscopía de inmunofluorescencia encontramos que, en célulasinfectadas tratadas con jasplakinólido, la proteína viral VP4 se acumula en una zona perinuclear, mientras que en células no tratadas con el fármaco, VP4 se distribuye de manera más uniforme en el citoplasma. Previamente se había reportado que VP4 se asocia intracelularmente a estructuras conocidas como balsas lipídicas, ricas en colesterol y esfingolípidos, y que se transporta a la membrana plasmática en células MA104 infectadas (Cuadras et al., 2006; Nejmeddine et al., 2000). En este trabajo confirmamos la presencia de VP4 en la superficie celular y encontramos que en presencia de jasplakinólido el transporte de VP4 hacia la membrana plasmática disminuye en un 50% y que la interacción del virus con balsas lipídicas también decrece en presencia del fármaco. Finalmente, demostramos que la proteína VP4 presente en la superficie celular se ensambla en las nuevas partículas virales liberadas al medio, lo cual indica que, al menos parte de la morfogénesis del virus ocurre en la membrana celular, a través de un mecanismo que requiere de la funcionalidad del citoesqueleto de actina. Este hallazgo es completamente novedoso, y contrasta 10 con la idea de que el ensamble final de la partícula viral ocurre en las cisternas del retículo endoplásmico. Por otro lado, utilizando el sistema de RNA de interferencia, se llevó a cabo en nuestro laboratorio un tamizaje de genes celulares involucrados en el transporte intracelular de vesículas, que pudieran ser importantes para la replicación del virus (Silva-Ayala, datos no publicados). En este tamizaje se encontró que las proteínas Actn, Diaph y Rac1, involucradas en la reorganización del citoesqueleto de actina, son necesarias para el ciclo viral. En este trabajo nos propusimos corroborar esos datos y dilucidar la etapa del ciclo de replicación del virus en el cual se requieren. Observamos que la proteína Actn participa en la entrada de rotavirus, ya que su silenciamiento redujo la infectividad en un 50%, sin embargo al transfectar por lipofección DLPs, evitando el paso de entrada, la infectividad del virus no se afecta en células silenciadas. El silenciamiento de la proteína Diaph disminuyó la progenie viral en un 40%, interviniendo también en el paso de entrada del virus, además, por medio de Western blot observamos que esta proteína también participa en la síntesis de proteínas virales. Los ensayos de interferencia de Rac1 decrecieron la progenie viral en un 60% y por ensayos de Western blot demostramos que esta proteína se requiere para la síntesis de proteínas virales, sin embargo, observamos que también es requerida para síntesis de proteínas celulares, pudiendo inhibir la producción de virus infeccioso de manera indirecta. Los datos que obtuvimos en este trabajo sugieren que el citoesqueleto de actina participa activamente en la replicación de rotavirus, tanto a nivel de entrada como en la liberación del virus a tiempos tempranos de la infección. 11 INTRODUCCIÓN Generalidades de los rotavirus Rotavirus es una de las principales causas de gastroenteritis en niños menores de 5 años a nivel mundial y puede ocasionar la muerte de los infantes ya que genera una severa deshidratación y un desbalance electrolítico (Parashar et al., 2006). A pesar de los esfuerzos en la difusión de la vacunación contra este agente etiológico, aún sigue representando un serio problema de salud a nivel mundial, ya que tan solo en el año 2013 la Organización Mundial de la Salud estimó que cerca de 215,000 niños murieron debido a la infección con rotavirus. El género Rotavirus pertenece a la familia Reoviridae, es un virus icosaédrico, no envuelto, de 70nm de diámetro, su genoma está organizado en 11 fragmentos de RNA de doble cadena que se hallan envueltos en tres capas de proteínas. El genoma viral codifica para seis proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6, VP7) y seis proteínas no estructurales (NSP1-NSP6). La capa más interna del virión se conforma de 60 dímeros de la proteína VP2, la cual rodea el genoma del virus, además de 12 copias de VP1, la RNA polimerasa dependiente de RNA, y a 12 copias de VP3, con actividad de guanil transferasa, metilasa y fosfodiesterasa. La capa intermedia está compuesta por 260 trímeros de VP6, los cuales al ensamblarse sobre la capa de VP2 forman partículas de doble cápside, también llamadas DLPs, del inglés double-layered particles (Figura 1a). La capa más externa se compone de 260 trímeros de VP7 y 60 trímeros de VP4, que al ensamblarse sobre la capa de VP6 forman partículas de triple cápside, denominadas TLPs, del inglés triple-layered particles (Figura 1b), las cuales son infecciosas (Estes y Greenberg, 2013). 12 Figura 1. Imágenes de reconstrucciones 3-D de las partículas de rotavirus. A) Partícula de doble cápside (DLP), en amarillo se observa la capa interna (VP2) y en rojo la capa intermedia (VP6), B) Partícula de triple cápside (TLP), en rojo se observa la capa intermedia (VP6), en azul la capa externa (VP7) y en verde la proteína VP4, la cual forma las espículas del virión. Tomado de Libersou et al., 2008. Ciclo de replicación Adsorción y penetración a la célula El primer paso en el ciclo de replicación de rotavirus es la interacción que tiene la partícula viral con la superficie de la célula huésped. Esta adhesión es llevada a cabo por las proteínas de capa externa VP4 y VP7 con diferentes receptores y co- receptores celulares (López et al., 2006), entre los cuales se han identificado al ácido siálico (Dormitzer, 2002), las integrinas α2β1, αxβ2, αvβ3 y α4β1 (Coulson et al., 1997; Gutiérrez et al., 2010), además de la proteína de choque térmico hsc70 (Guerrero et al., 2002). Se ha descrito que todos estos receptores relacionados con el reconocimiento de rotavirus se encuentran asociados a balsas lipídicas (Isa, 2004) (Figura 2). Posterior a la unión del virus con la célula, su internalización hacia el interior de la célula se lleva a cabo por un proceso endocítico, el cual puede variar dependiendo de la cepa. Por ejemplo, la cepa de rotavirus RRV, aislada de un mono rhesus, requiere para su entrada colesterol y dinamina y no depende de clatrina ni A B 13 caveolina; sin embargo, la cepa UK, de origen bovino, penetra por una endocitosis mediada por clatrina (Gutiérrez et al., 2010). El desnudamiento del virus y su salida del endosoma hacia el citoplasma requiere de diversos factores, como la disociación de las proteínas de la capa externa (VP7), además de un cambio conformacional de VP4, que origina el pliegue de VP5 sobre sí mismo adoptando una conformación tipo “paraguas” que expone un dominio hidrofóbico de la proteína que desestabiliza la membrana endosomal (Trask et al., 2010). Transcripción del genoma viral y traducción Las DLPs son transcripcionalmente activas, ya que rotavirus posee su propia maquinaria de transcripción, la cual se encuentra en el núcleo del virión y consiste en VP1 y VP3, sin embargo otros estudios han descrito también a VP6 como una proteína esencial para la transcripción del genoma (Jayaram et al., 2004). Los mRNAs son sintetizados dentro del virión de manera coordinada con su extrusión hacia el citoplasma a través de los poros que existen en las partículas de doble capa, llegando a ser detectables a una hora post-infección (Patton, 1990). Estos transcritos tienen dos funciones: sirven como molde para que se sintetice la cadena de polaridad negativa durante la replicación del genoma viral y para dirigir la síntesis de proteínas del virus. La transcripción del RNA de rotavirus se efectúa de modo conservativo, es decir, las dos hebras del RNA genómico de doble cadena del virus permanecen dentro de las DLPs, mientras que las cadenas de RNA recién sintetizadas son translocadas como mRNA por medio de los canales existentes en los vértices de la partícula viral (Lawtonet al., 1997). Los rotavirus son capaces de modular la maquinaria de traducción celular, causando una inhibición de la síntesis de proteínas celulares y de este modo favorecer la síntesis de proteínas virales. Los mRNAs de rotavirus no poseen una cola de poli-A, en su lugar tienen una secuencia consenso (GACC) en su extremo 3´, la cual se encuentra conservada en los once genes (Poncet et al., 1994). Esta secuencia funciona como “enhancer” en la traducción de los mRNAs virales, interaccionando principalmente con la proteína no estructural NSP3, y 14 probablemente con otras proteínas del virus (Gratia et al., 2015). La traducción de los mRNAs de rotavirus produce las proteínas estructurales y no estructurales del virus. NSP2 y NSP5, dos proteínas no estructurales, son necesarias para producir las inclusiones citoplasmáticas denominadas viroplasmas, los cuales son sitios de empaquetamiento del ssRNA (+) en las nuevas partículas virales que se están ensamblando, mientras es simultáneamente replicado a dsRNA (Patton et al., 2006). El viroplasma parece estar dividido en dos zonas, de acuerdo a la distribución de las proteínas virales que lo componen. La región más interna está enriquecida con las proteínas NSP2 y NSP5, así como las proteínas del core VP1 y VP2 (Altenburg et al., 1980; González et al., 2000), sugiriendo que en esta zona se forma el core (partículas de una sola capa o SLP, del inglés single-layered particle) de la nueva progenie viral, y ocurre la replicación del genoma y su empaquetamiento. La zona más externa del viroplasma parece estar enriquecida por la proteína VP6, la cual es necesaria para la formación de la DLP a partir del core previamente formado (López et al., 2005). Las DLPs geman de los viroplasmas hacia el retículo endoplásmico utilizando a NSP4, glicoproteína transmembranal del virus residente en la membrana del retículo endoplásmico, que es utilizada como receptor de las DLPs, al interactuar con la proteína VP6 en la superficie de las DLPs (Taylor et al., 1996). Maduración y salida de la partícula viral Al gemar a través de la membrana del retículo endoplásmico las DLPs adquieren un capa lipídica, en las cuales se encuentran presentes las proteínas NSP4 y la glicoproteína de superficie VP7. Por un mecanismo aún no definido la cubierta de lípidos se pierde cuando las partículas envueltas migran hacia el interior del lumen del retículo endoplásmico, perdiéndose también NSP4 y se adquiere la capa externa del virus compuesta de VP7 (Estes y Greenberg, 2013). La etapa en la cual la proteína VP4 se incorpora a la progenie viral aún no se ha dilucidado completamente. Una primera hipótesis está basada en estudios donde se observa que VP4 se asocia al complejo VP7-NSP4 localizado en las membranas del retículo endoplásmico (Maass y Atkinson, 1990); de este modo, al gemar las DLPs 15 por el retículo endoplásmico se asociaría a estos complejos VP4-NSP4-VP7 y resultaría en el ensamblado de la tercera capa del virus en el lumen del retículo. Sin embargo, otros estudios han demostrado que VP4 se localiza en balsas lipídicas en la membrana plasmática (Sapin et al., 2002), lo que plantea la hipótesis de que las DLPs salen del viroplasma, geman a través del retículo endoplásmico e interaccionan con los complejos VP7-NSP4, de este modo las partículas adquieren la proteína de capa externa VP7. Posteriormente las vacuolas derivadas del retículo, que contienen a las partículas de triple capa, interaccionan con las balsas lipídicas, favoreciendo la integración de VP4 a las partículas virales recién sintetizadas (Delmas et al., 2004a). Esta partícula de tres capas representa al virus maduro, infeccioso, el cual se ha asumido históricamente que se libera de células en cultivo no polarizadas, por lisis celular (McNulty et al., 1976), por ejemplo en el caso de las células epiteliales de riñón de mono MA104 (Ver Figura 2). Por otro lado, se ha descrito que el virus se libera de células Caco-2 polarizadas, de origen epitelial de intestino grueso, por un proceso de gemación no lítico (Gardet et al., 2006). 16 Figura 2. Ciclo replicativo de rotavirus. Los rotavirus interaccionan con glicanos en la superficie celular, posterior a lo cual se unen a co-receptores celulares, incluyendo integrinas y a la proteína hsc70. La internalización se lleva a cabo por vía endocítica, que conduce a la partícula hacia endosomas tempranos o tardíos (dependiendo de la cepa). La tercera capa de rotavirus es removida y esto libera a las DLPs, las cuales son partículas transcripcionalmente activas. Comienza la síntesis de mRNA viral, el cual es usado para sintetizar las proteínas del virus. Después de que se sintetizan las proteínas virales, se forman los viroplasmas, lugar donde ocurre la replicación del RNA genómico y la formación de nuevas DLPs. Se ha propuesto que los viroplasmas interactúan con lipid droplets, sin embargo esta propuesta está aún en debate. En el retículo endoplásmico (RE) se encuentra anclada la glicoproteína viral NSP4, la cual funciona como receptor de las nuevas DLPs ensambladas, las cuales comienzan a gemar hacia el retículo. NSP4 co- localiza con el marcador de autofagia LC3 y posee actividad de viroporina, puesto que favorece la liberación de Ca2+ hacia el citoplasma. Las DLPs adquieren momentáneamente una capa lipídica dentro del RE, sin embargo esta es removida cuando la partícula adquiere su capa externa, compuesta por las proteínas VP7 y VP4. La Adherencia Vp8 Receptor sialidado Integrina Cambio conformacional activado por corte proteolítico hsc70 Vp5 Vp7 VP7 Endocitosis Traducción Transcripción Balsa lipídica Salida no lítica por transporte vesicular independiente de Golgi Lisis celular Núcleo NSP2,5,6 VP1,2,3,6 Viroplasma Síntesis dsRNA Partícula de doble capa Vp4NSP4 Vp7 Lc3RE Lipid Droplet Vp5 Pérdida de la envoltura y maduración de la partícula Gemación y adquisición de una envoltura lipídica 17 liberación del virus es llevada a cabo por lisis celular o en el caso de células epiteliales polarizadas por un mecanismo no lítico. Adaptada de Estes y Greenberg, 2013. El desarrollo del ciclo viral es auxiliado por factores celulares que en parte son modulados por acción del virus. Una de las estructuras celulares que se ve afectada es el citoesqueleto de actina, el cual se reorganiza durante la infección (Taylor et al., 2011). Citoesqueleto de actina El citoesqueleto de actina interviene en una gran variedad de funciones que son esenciales en todas las células, ya que participa en dar estructura y forma a la célula, además de que sus propiedades dinámicas favorecen el movimiento y división celular (Hall, 1998). Las moléculas individuales de actina son proteínas globulares de 375 aminoácidos denominadas G-actina. Estos monómeros de actina interaccionan entre sí, llegando a polimerizarse para formar filamentos de actina (F-actina). Dado que estos filamentos se organizan por monómeros orientados en una misma dirección, la F-actina tiene polaridad, por lo que sus extremos terminales (llamados extremo positivo y negativo) son distinguibles uno del otro (Cooper, 2000). Estos microfilamentos de actina son estructuras de 7 a 9 nm de diámetro unidas por uniones no covalentes de subunidades de actina dispuestos en hélices de redes bidimensionales y geles tridimensionales que se encuentran dispersos en todo el citoplasma celular, sin embargo se hallan más concentrados en la corteza, justo debajo de la membrana plasmática, por lo que se le denomina actina cortical (Alberts et al., 2002). Polimerización y despolimerización del filamento de actina El filamento de actina es sometido a diferentes procesos de regulación que le permiten ensamblarse y desensamblarse rápidamente dependiendo de las necesidades de la célula. En estudiosin vitro se ha observado que el polímero de actina se despolimeriza a G-actina en soluciones con baja fuerza iónica, y al aumentar la fuerza iónica a niveles fisiológicos la actina comienza a polimerizarse espontáneamente (Cooper, 2000). El primer paso para la polimerización de la 18 actina es la nucleación, la cual consiste en la formación de pequeños agregados de tres monómeros de actina. Posterior a esto, el filamento comienza a crecer, puesto que las subunidades de actina se van adicionando en los extremos del filamento. En el extremo positivo la incorporación de G-actina es entre cinco y diez veces más rápida en comparación al extremo negativo, mientras que en este extremo del filamento los monómeros se van disociando más rápidamente. Este mecanismo de recambio entre polimerización/despolimerización del filamento de actina es conocido como dinámica de ensamblaje (treadmilling, en inglés) (Wegner e Isenberg, 1983). Este proceso requiere ATP, donde la actina unida a ATP polimeriza en el extremo positivo y la actina unida a ADP es disociada del extremo negativo (Figura 3) Figura 3. Dinámica de ensamblaje (treadmilling). La actina unida a ATP se asocia con el extremo positivo, elongando al filamento y posteriormente el ATP es hidrolizado a ADP. Como la actina unida a ADP se disocia más rápidamente que la actina-ATP, existe un desacoplamiento de actina en el extremo negativo. Adaptada de Cooper, 2000. Extremo negativo Extremo positivo Intercambio de ATP por ADP Hidrólisis de ATP 19 Compuestos químicos que afectan la dinámica del citoesqueleto de actina Existen fármacos que alteran el citoesqueleto de actina, los cuales son derivados de toxinas naturales que producen plantas, hongos o esponjas, como mecanismo de defensa (Alberts et al., 2002). Estas drogas poseen diferentes mecanismos de acción, ya que pueden llegar a unirse al filamento completo o a las subunidades del polímero (Tabla 1), y se han aprovechado como herramientas en el estudio de la dinámica del citoesqueleto. Tabla 1. Drogas que afectan al citoesqueleto de actina. Adaptada de Alberts et al., 2002. Fármaco Efecto en el filamento Mecanismo de acción Origen Citocalasina Despolimeriza Se une al extremo “+” del filamento de actina, evitando su polimerización Hongos Faloidina Estabiliza Se une y estabiliza el filamento de actina Hongos del género Amanita Jasplakinólido Estabiliza Se une y estabiliza al filamento de actina. También es capaz de inducir la polimerización del mismo. Esponja marina Latrunculina Despolimeriza Se une a las subunidades de actina, evitando su polimerización Esponja marina Swinólido Despolimeriza Corta al filamento de actina Esponja marina Proteínas de unión a actina La actina monomérica puede polimerizarse en un filamento y desacoplarse nuevamente en condiciones in vitro, sin embargo, dentro de la célula existen numerosas proteínas que son capaces de unirse al monómero o al filamento de actina y que regulan la dinámica del citoesqueleto. Estas proteínas son capaces de organizar espacial y temporalmente a la actina, controlando la disponibilidad de G-actina, la nucleación del filamento, su elongación y despolimerización (Alberts et al., 2002). 20 Un importante regulador de la elongación del filamento de actina es la profilina, la cual se une a los monómeros libres, estimulando el intercambio de actina-ADP por actina-ATP y de este modo facilita la polimerización (Lassing y Lindberg, 1985). Su contraparte, la timosina, secuestra las subunidades de actina, inhibiendo su polimerización (Goldschmidt et al., 1992). Otra proteína clave en la despolimerización del filamento es la cofilina. Esta proteína puede unirse al filamento de actina y favorece la disociación de los monómeros en el extremo negativo (Hawkins et al., 1993). Además llega a cortar al filamento, generando más extremos negativos y por ende desensamblando al filamento de actina. La cofilina también es capaz de unirse a la actina-ADP, previniendo que vuelva a reincorporarse al filamento (Cooper, 2000). La nucleación de novo requerida para el ensamblaje del polímero utiliza a las proteínas Arp2 y Arp3 (Arp2/3), apoyadas de otras proteínas como las forminas. De este modo, proteínas como profilina, cofilina, Arp2/3 y forminas, entre otras (Figura 4), actúan de manera conjunta para remodelar al citoesqueleto de actina, dependiendo de los requerimientos celulares. Debido a los diferentes mecanismos por los cuales los microfilamentos pueden ser polimerizados/despolimerizados, existe una gran variedad de vías de señalización celular que permiten a la célula modular al citoesqueleto, siendo uno de los más importantes el sistema de las Rho-GTPasas. 21 Figura 4. Proteínas que participan en la organización del citoesqueleto de actina. Los monómeros y el filamento de actina son sometidos a polimerización o despolimerización dependiendo de las necesidades celulares, lo cual es regulado por diferentes proteínas de unión a actina. Adaptada de Alberts et al., 2002. Sistema Rho-GTPasas Las Rho-GTPasas fueron descubiertas en los años ochenta en levaduras y mamíferos y se catalogaron dentro de la superfamilia Ras, las cuales están compuestas de pequeñas GTPasas monoméricas con un peso de 21-25 kD (Hall, 1990). En mamíferos, la familia de Rho-GTPasas comprende 20 miembros (Heasman y Ridley, 2008), y su localización celular depende de las modificaciones 22 post-traduccionales a las que son sometidas, por lo que muchas de ellas pueden encontrarse libres en el citosol y otras ancladas a membrana (Boivin y Beliveau, 1995). Mecanismos de señalización de las Rho-GTPasas En la mayoría de las Rho-GTPasas los primeros pasos en su activación comienzan con la interacción de un ligando con un receptor celular en la membrana plasmática, incluyendo tirosin cinasas, receptores acoplados a proteínas G y varios receptores de citocinas (Hall y Nobes, 2000). La señalización de estas GTPasas monoméricas involucra un estado “encendido” o activo, al estar unidas a GTP y un estado “apagado” o inactivo al estar unidas a GDP. El ciclo entre el estado activo e inactivo de estas GTPasas es regulado por tres grupos de proteínas: los factores intercambiadores de guanina (GEFs, por sus siglas en inglés, “guanine nucleotide-exchange factors”), las proteínas que activan a la GTPasa (GAPs, por sus siglas del inglés, “GTPase-activating proteins”) y los inhibidores de disociación de nucleótidos de guanina (GDIs, por sus siglas en inglés, “guanine nucleotide-dissociation inhibitors”) (Figura 5). En humanos se han descrito cerca de 70 GEFs, las cuales facilitan el intercambio de nucleótidos en las Rho-GTPasas, promoviendo la liberación de GDP al mismo tiempo que la unión de GTP (Rossman et al., 2005). Se conocen alrededor de 80 GAPs en mamíferos, las cuales activan la función de las Rho-GTPasas, al promover la hidrólisis del GTP (Tcherkezian y Lamarche-Vane, 2007). En mamíferos se han reportado tres GDIs, estas proteínas se unen a los grupos prenilo de algunas proteínas Rho, secuestrándolas y manteniéndolas lejos de sus respectivos blancos (Dovas y Couchman, 2005). 23 Figura 5. Activación de las Rho-GTPasas. En un estado inactivo, las GTPasas Rho se encuentran unidas a GDP o se encuentran inhibidas al estar unidas a proteínas GDI. Para activarse, es necesario que las proteínas GEF intercambien el GDP por GTP en las proteínas Rho, esto las activa y pueden interactuar con diferentes proteínas efectoras. Para regresar a su estado inactivo, las proteínas GAPs promueven la actividad intrínseca de GTPasa de las proteínas Rho, generándose la Rho-GTPasa-GDP. Adaptada de Heasman y Ridley, 2008. La unión del ligando activa los GEFs, lo cual promueve la activación de las proteínas Rho. Unavez activadas, las Rho-GTPasas median su efecto celular al interactuar con sus proteínas blanco, activando tirosin cinasas, serin y treonin cinasas, fosfolipasas, proteínas de andamiaje, entre varias otras. Las proteínas blanco activadas son responsables de diversas funciones , como la progresión del ciclo celular, la expresión de ciertos genes o la reorganización del citoesqueleto de actina, sin embargo aún se desconoce la función de varias de ellas (Hall, 2012). Membrana plasmática Proteínas efectoras 24 Regulación del citoesqueleto de actina por Rho-GTPasas A pesar de que las proteínas Rho fueron descubiertas en la década de los ochenta, fue hasta mediados de los noventa cuando tres de ellas, Rho, Rac y CDC42, se vincularon directamente en la organización del citoesqueleto de actina (Ridley y Hall, 1992; Ridley et al., 1992; Nobes y Hall, 1995). CDC42 La proteína CDC42 tiene como funciones principales regular el citoesqueleto de actina y la polaridad celular en diversos organismos eucariotas (Heasman y Ridley, 2008). En muchos tipos celulares es responsable de la formación de filopodios (Nobes y Hall, 1995) (Figura 6), los cuales son proyecciones citoplasmáticas altamente dinámicas y ricas en actina (Figura 8). Estas estructuras contienen haces paralelos de F-actina y son importantes para que las células puedan sensar el ambiente en el que se encuentran, están involucradas en la adhesión a la matriz extracelular y también llegan a participar en la locomoción celular (Gupton y Gertler, 2007). Rac Esta GTPasa posee tres isoformas activas (Rac1, Rac2 y Rac3), sin embargo se expresan de manera diferencial dependiendo del tipo celular. Rac1 es el miembro mejor estudiado y se expresa de manera ubicua, mientras que la expresión de Rac2 está restringida a células hematopoyéticas (Shirsat et al., 1990) y Rac3 se encuentra principalmente en el cerebro (Corbetta, 2005). Rac1 participa en la migración celular y promueve la polimerización de actina en la periferia celular llevando a cabo la formación de plegamientos de la membrana y lamelipodios (Figura 6). Estas últimas estructuras son prolongaciones laminares transitorias producidas por la polimerización de actina debajo de la membrana plasmática (Figura 8). Una vez que Rac es activada puede interactuar con proteínas que conducen la nucleación del filamento de actina, incluyendo al complejo Arp 2/3 a través de proteínas WAVE y forminas (Jaffe y Hall, 2005). Rac también puede remover las proteínas de capping del extremo positivo del filamento e incrementar la disponibilidad de G-actina regulando la actividad de cofilina (Jaffe y Hall, 2005; Wang et al., 2007). 25 Figura 6. Señalización de Rac y CDC42 en la reorganización del citoesqueleto de actina. La formación de filopodios y lamelipodios son favorecidos por la activación de CDC42 y Rac a través de varias cinasas y diferentes proteínas efectoras. Estas dos GTPasas pueden llegar a converger en algunas vías para estabilizar al filamento. PAK, cinasa activa p-21; LIMK, cinasa LIM; MLC, cadena ligera de miosina. Modificado de Burridge y Wennerberg, 2004. Rho Se conocen tres isoformas de Rho (RhoA, RhoB y RhoC), y todas ellas promueven la formación de fibras de estrés (Figura 7) y complejos de adhesiones focales (Hall y Nobes, 2000). Se ha observado que RhoB se encuentra localizado en vesículas endocíticas y es capaz de regular el tráfico endosomal (Ridley, 2006). Estas proteínas Rho actúan como los primeros interruptores en la señalización 26 celular que comunica los receptores celulares con el citoesqueleto de actina (Ridley y Hall, 1992). Figura 7. Señalización de Rho en la reorganización del citoesqueleto de actina. La pequeña GTPasa Rho favorece la formación de fibras de estrés, así como la polimerización y estabilización de la actina. MLC, cadena ligera de miosina; LIMK, LIM cinasa; mDia, proteína Diaph. Modificado de Burridge y Wennerberg, 2004. 27 Figura 8. Diferentes rearreglos del citoesqueleto de actina. El citoesqueleto de actina es una estructura altamente dinámica que puede polimerizarse/despolimerizarse formando diferentes estructuras, dependiendo de las necesidades celulares o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. A.G., Aparato de Golgi; R.E., Retículo endoplásmico. Adaptada de Taylor et al., 2011. Rol del citoesqueleto de actina en infecciones virales El citoesqueleto de actina es una estructura que interviene en numerosas funciones celulares, por lo que no es de sorprender que sea reorganizado para optimizar el ciclo de infección de muchos virus. Las primeras asociaciones entre una infección viral y la alteración del citoesqueleto provienen de “células transformadas”1 por virus como SV40, adenovirus, virus del sarcoma de Rous, entre otros, los cuales generan cambios morfológicos como redondeamiento Podosoma Lamelipodio Filopodio Filamento de actina Microvellosidades Ondulaciones de membranaActina cortical Fibras de estrés Miosina Vesículas A.G. R.E. Núcleo 1. Células transformadas es un término que se refiere a células alteradas morfológicamente y que proliferan de manera anormal, puesto que suelen perder la inhibición de crecimiento al contacto. De manera general este proceso se efectúa por una desregulación del ciclo celular e inhibición de la apoptosis por proteínas virales. 28 celular, formación de pseudópodos, pérdida de fibras de estrés, así como pérdida de la inhibición del crecimiento por contacto (Fleissner y Tress, 1973; Goldman et al., 1975). A partir de entonces se ha observado que el grado de alteración en el citoesqueleto varía entre diferentes infecciones virales, la etapa del ciclo replicativo del virus y el tipo de célula infectada (Taylor et al., 2011). Papel de la actina dentro del ciclo viral Entrada El primer paso en una infección viral es el proceso de entrada, donde las proteínas virales de superficie interaccionan con receptores celulares. Estos receptores se encuentran asociados a filamentos de actina situados debajo de la membrana plasmática y en muchos casos la interacción virus-receptor desencadena el movimiento de la partícula viral (“surfing”) hacia el lugar donde ocurre la endocitosis (Lehman et al., 2005). En otros casos la adherencia del virus a la célula genera que sean los receptores celulares los que se agrupen (movimiento mediado por el citoesqueleto) cerca del punto de contacto virus-célula y de este modo faciliten la entrada del virus (Jimenez-Baranda et al., 2007). La mayor parte de los virus entran a la célula por endocitosis (Mercer et al., 2010), y con frecuencia se requiere de la actina para que el proceso se lleve a cabo, ya que al utilizar drogas que interfieren con el funcionamiento del citoesqueleto de actina algunos virus son incapaces de entrar a la célula (Mercer y Helenius, 2008; Greene y Gao, 2009). Replicación del genoma viral y morfogénesis El proceso por el cual el virus replica su genoma y lo empaqueta dentro de las cápsides víricas debe ser perfectamente coordinado para asegurar que se produzcan virus infecciosos. La participación de la actina en este proceso puede darse en dos formas: en algunos virus, como el virus Sincitial Respiratorio (RSV), la actina es necesaria para que el genoma se replique adecuadamente, 29 funcionando como factor de transcripción o estabilizando al genoma viral, sin embargo los mecanismos exactos de cómo interactúa la actina con el ácido nucleico aún falta por determinarse (Harpen et al., 2009). Por otro lado, el citoesqueleto de actina puede transportar al genoma y las proteínas virales a sitios específicos de la célula donde el ensamblado se lleva a cabo, como en el caso del virus de Newcastle (NDV) y el virus Sendai (SV) (Taylor et al., 2011).Salida del virus y su diseminación a otras células La progenie viral recién sintetizada debe salir de la célula infectada para poder infectar otras células. En el caso de algunos virus envueltos que salen de su célula huésped por gemación, como HIV o el virus del Sarampión (MV), se ha observado que el citoesqueleto de actina es determinante en la maduración y liberación de las partículas virales (Fackler y Kräusslich, 2006; Stallcup et al., 1983). Las proteínas virales pueden interactuar directamente con el sistema RhoGTPasa o con algunas proteínas efectoras, lo que provoca la formación de citonemas, filopodios o lamelipodios, y le permiten al virus salir de la célula y/o infectar células aledañas (Taylor et al., 2011). 30 ANTECEDENTES Rotavirus modifica el citoesqueleto de actina Se ha observado que en células infectadas con rotavirus la estructura y función del citoesqueleto sufren modificaciones; a 24 horas post-infección (hpi) la actina incorporada en microfilamentos (F-actina) sufre una despolimerización en las microvellosidades de células Caco-2 (carcinoma de colon) polarizadas (Jourdan et al., 1998). Existen reportes de modificaciones en la dinámica del citoesqueleto independientes de la homeostasis del calcio intracelular, tal es el caso de la formación de fibras de estrés de actina en células MA104 (riñón de mono verde) no polarizadas a 3 hpi, y el cambio en la conformación de algunas proteínas de los filamentos intermedios en células Caco-2 a 18 hpi (Zambrano et al., 2012; Brunet et al., 2000). Interacciones entre proteínas virales y actina Existen algunos reportes de proteínas virales que parecen interaccionar con el citoesqueleto. En células Cos-7 y MA104 se demostró que a 7 hpi la proteína NSP4 está implicada en la variación de calcio intracelular, lo que puede llevar a una alteración de las proteínas que se encargan de organizar al citoesqueleto (Zambrano et al., 2008). Por otro lado, en células Cos-7 transfectadas con un vector que expresa la proteína estructural VP4, se observó la interacción específica de VP4 con haces de filamentos de actina citoplásmica y su remodelación para formar agregados o cuerpos de actina 24 h después de la transfección (Gardet et al., 2006). Se reportó también que, en células Caco-2 polarizadas, VP4 co-localiza con F-actina a 6 hpi y remodela los haces de filamentos subcorticales en el brush border de la células, desorganizando su estructura y probablemente favoreciendo la salida del virus (Gardet et al., 2006). En cultivos diferenciados de células Caco-2 se ha observado que existe un decremento en la salida apical de rotavirus por efecto del fármaco jasplakinólido, con aumento en su salida por la región basolateral (Gardet et al., 2007), lo cual contrasta con la liberación del virus en un sistema no polarizado (como el caso de 31 células MA104), la cual se asume que es llevada a cabo por un proceso de lisis celular (McNulty et al., 1976). A pesar de la información disponible, no es claro el papel que tiene el citoesqueleto de actina en la replicación de rotavirus. Aún se requieren determinar factores involucrados durante la interacción del virus con su célula hospedera que desencadenan cambios en la estructura y conformación del citoesqueleto para favorecer la replicación viral. Por ejemplo, experimentos efectuados en nuestro laboratorio demuestran que inhibidores de la polimerización de la actina afectan la entrada únicamente en ciertas cepas de rotavirus (Gutiérrez, 2011), además de que recientemente se demostró que la interferencia de la expresión de los genes Cdc42, RhoA y Actn, relacionados con el sistema Rho-GTPasas, disminuye la infectividad del rotavirus RRV, y que estas proteínas participan en el proceso de endocitosis del virus (Silva-Ayala et al., 2013). Por otro lado, en un tamizaje reciente llevado a cabo en nuestro laboratorio se identificaron varios genes celulares que codifican para proteínas involucradas en la dinámica del citoesqueleto que pudieran estar implicados en el ciclo de replicación de rotavirus. Dentro de estos se encuentran: Diaph, que actúa en el ensamblaje de la F-actina y formación de fibras de estrés y Rac1, GTPasa perteneciente a la superfamilia RAS involucrada en la inducción de plegamientos y extensiones de membrana (Silva-Ayala, datos no publicados). 32 HIPÓTESIS El ciclo de replicación de rotavirus requiere de la dinámica del citoesqueleto de actina y de las proteínas Actn, Diaph y Rac1. 33 OBJETIVOS General Determinar el papel del citoesqueleto de actina en el ciclo de replicación de rotavirus. Específicos 1. Determinar el efecto de drogas que afectan al citoesqueleto de actina en la producción de partículas infecciosas del rotavirus de simio RRV. 2. Validar si existe disminución de la infectividad del rotavirus RRV al silenciar por RNAi la expresión de los genes que codifican para Actn, Diaph y Rac1. 3. Evaluar los pasos del ciclo de replicación de rotavirus que se afectan al disminuir la síntesis de Actn, Diaph y Rac1 por RNAi. 34 MATERIALES Y MÉTODOS Células y virus. La línea celular MA104, derivada de epitelio de riñón de mono rhesus (Cercopithecus aethiops), se creció en medio DMEM-RS (Dubecco´s modified Eagle´s minimal essential medium) (Thermo Scientific) (Pittsburg, USA) en un ambiente con 5% de CO2 a 37°C. La cepa de rotavirus RRV (rhesus rotavirus) se propagó en células MA104, previa activación con 10 µg/ml de tripsina a 37°C por 30 min. El virus RRV se añadió a células MA104 por 1 h a 37°C, posteriormente se retiró el inóculo, y se agregó MEM incubándose por un periodo de 14 h a 37°C. Para lisar las células se procedió a congelar y descongelar las células (2 veces) y se centrifugó a 600 x g por 10 min para retirar los restos celulares. El titulo viral fue determinado como se describe posteriormente, y el virus se almacenó en alícuotas a -70°C. Anticuerpos y reactivos. Los anticuerpos policlonales contra la partícula viral completa (α-TLP), la proteína viral NSP2 y la proteína vimentina fueron producidos en nuestro laboratorio. Los anticuerpos monoclonales HS2 y 2G4 contra la proteína VP4 fueron donados por H.B. Greenberg (Universidad de Stanford, Calif., USA). Los anticuerpos contra las proteínas celulares Actn (Abnova) (Taipei, TW); Diaph (Abcam) (Cambridge, UK); Rac1 (Cytoskeleton, Inc.) (Denver, USA), se adquirieron comercialmente. Los anticuerpos secundarios utilizados para las inmunofluorescencias fueron anti-conejo y anti-ratón acoplados a Alexa-Fluor 568 (Molecular Probes) (USA). En los ensayos de inmunoperoxidasa se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplada a peroxidasa (Perkin Elmer Life Sciences) (Waltham, USA) y para la visualización de actina se utilizó faloidina acoplada a Alexa-Fluor 488 (InvitrogenTM, USA). La citocalasina D se obtuvo de Sigma (St. Louis, USA) y la latrunculina B y el jasplakinólido de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). Para los ensayos de biotinilación de proteínas de membrana se utilizó Sulfo-NHS-LC-Biotina (ThermoFisher Scientific, USA) y las proteínas biotiniladas fueron purificadas a través de perlas magnéticas de estreptavidina (New England BioLabs inc., USA). Los siRNA utilizados fueron de Dharmacon –Thermo Scientific (Pittsburg, USA). 35 Viabilidad celular. Las células fueron crecidas en placas de 96 pozos y procesadas con el fármaco o infección respectiva para cada ensayo. A diferentes tiempos, según el ensayo realizado, se evaluó la viabilidad por dos métodos. En el primero se determinó la liberación de la LDH (lactato deshidrogenasa), medida en el sobrenadante de las células, utilizando el kit Lactato Dehydrogenase kit TOX-7(Sigma, México), de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El segundo método consistió en medir la respiración celular utilizando Resazurina (7-Hidroxi- 3H-fenoxazina-3-10-óxido) como indicador. Para esto, se agregaron 10 µl de resazurina (Biotium, U.S.A) a cada pozo y se incubaron las células por 2 h a 37°C, posterior a lo cual se midió la absorbancia a 570 nm y cada valor se ajustó a su respectivo control. Tratamiento con inhibidores. Monocapas confluentes de células MA104 crecidas en placas de 96 pozos se lavaron dos veces con MEM y se inocularon con una multiplicidad de infección (MOI) de 3 durante 1 h a 37°C. Después de este tiempo el inóculo fue retirado, se lavaron las células con MEM y se trataron con citocalasina D, latrunculina B o jasplakinólido durante diferentes periodos de tiempo y a las concentraciones indicadas en cada ensayo, incubándose por 14 h a 37°C. Las células fueron congeladas y descongeladas dos veces, después de lo cual se procedió a colocar cada lisado en tubos estériles, centrifugándose para quitar restos celulares. Posteriormente las unidades formadoras de focos se calcularon utilizando un ensayo de inmunoperoxidasa. Determinación del título viral. Este se llevó a cabo por un ensayo de inmunoperoxidasa. Brevemente, monocapas confluentes de células MA104 crecidas en placas de 96 pozos se lavaron dos veces con MEM y se añadió el virus (50 µl de lisado) por 1 h a 37°C. Posteriormente las células fueron lavadas con MEM y se incubaron por 14 h a 37°C. Después del tiempo de incubación las células fueron fijadas con acetona al 80% en buffer de fosfatos (PBS) por 20 min, después de lo cual se lavaron con PBS y se incubaron con α-TLP (1:2,000) por 1 h a 37°C. Posterior a este periodo se lavaron las células con PBS, incubándose con el anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa (1:3,000) por 1 h a 37°C. Por último, las células se lavaron nuevamente con PBS y se agregó carbazol y 36 peróxido de hidrógeno hasta observar el desarrollo de color. Se lavó con agua y las unidades formadoras de focos se contaron en un microscopio invertido (Nikon, Japón). Inmunofluorescencia. Células MA104 confluentes crecidas en cubreobjetos de vidrio se infectaron a una MOI de 3 por 1 h a 37°C, el inóculo fue retirado y las células se lavaron con MEM. Posterior al tiempo de infección correspondiente, según el ensayo o el tratamiento con el fármaco respectivo, las células fueron fijadas con paraformaldehído (Sigma) (St. Louis, USA) al 2% en PBS por 20 min a temperatura ambiente y permeabilizadas por 15 min con 0.5% de Tritón X-100 (Sigma) (St. Louis, USA) en solución de bloqueo (1% BSA (albúmina sérica bovina), en PBS con 50 mM NH4Cl). Posteriormente las células fueron incubadas con el anticuerpo primario correspondiente para cada experimento, diluido en solución de bloqueo por 1 h a temperatura ambiente, después de lo cual se lavaron las células 3 veces por 5 min con PBS-NH4Cl 50 mM. Se incubaron las células con el anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón acoplado a Alexa 568 por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente la monocapa se incubó con DAPI 30 nM (4´,6-diamidino-2-fenilindol) (InvitrogenTM, USA) por 10 min y con faloidina acoplada a Alexa 488 por 20 min. Los cubreobjetos fueron montados con Citifluor AF1 (Electron Microscopy Sciences) (Hatfield, USA) en portaobjetos. Las muestras fueron observadas en un microscopio de epifluorescencia (Zeiss, Axioskop 2, Alemania) acoplada a una cámara digital (Photometrics Cool Snap HQ). Lipofección reversa de siRNAs. Se realizó una mezcla de oligofectamina (InvitrogenTM, USA) en MEM, (15 µl de oligofectamina por 1 ml de MEM) y se incubó a 37°C por 10 min. A la mezcla se añadieron diferentes concentraciones del siRNA correspondiente y se incubó por 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron 150 µl de una suspensión de 1x105 células/ml en las placas de 96 pozos y 72 h después las células fueron procesadas. Western blot. Células MA104 previamente tratadas con el siRNA correspondiente, muestras biotiniladas o muestras provenientes de un 37 fraccionamiento a través de un gradiente de densidad se lisaron con amortiguador de carga (Tris-HCl 50 mM pH 6.8, 2% SDS, 0.1% azul de bromofenol, 10% glicerol, 1% β-mercaptoetanol) hirviendo las muestras por 5 min, y se analizaron por electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al 7.5 y 12.5%, en función del experimento. Las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de Inmobilon (Milipore) (Darmstadt, Alemania) por 60 min a 130 mA. La membrana se bloqueó por 1 h a temperatura ambiente con agitación, con 5% de leche descremada (Carnation) en PBS-tween (0.1%). La membrana se incubó posteriormente con el anticuerpo primario diluido en la misma solución de leche por 1 h a temperatura ambiente. Acabada la incubación la membrana se lavó con PBS-tween (0.1%) tres veces por 10 min y se añadió el anticuerpo secundario (hecho en ratón o conejo, de acuerdo al experimento) acoplado a peroxidasa por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente se lavó la membrana nuevamente y se detectaron las proteínas utilizando el sistema Western Lightning (Perkin Elmer) (Waltham, USA) exponiéndose a una película hipersensible Kodak (Rochester, USA). Fraccionamiento celular por gradiente de densidad. Células MA104 o CaCo-2 crecidas en frascos de 75cm2 se infectaron con la cepa RRV a una MOI de 3. A 10 hpi (células MA104) o 18 hpi (células CaCo-2) los sobrenadantes fueron recolectados y los detritos celulares remanentes se removieron centrifugando a 600 x g por 15 min. Posteriormente el virus se concentró por centrifugación a 150 000 x g durante 2 h, el botón se resuspendió en TNC (Tris-HCl 10 mM pH 7.5, NaCl 140 mM, CaCl2 10 mM) y se mezcló con una solución de iodixanol (Sigma, México) hasta alcanzar un 40% de este compuesto, en un volumen final de 1.2 ml. Este volumen se colocó en un tubo de ultracentrífuga nuevo de 5 ml, y se generó un gradiente discontinuo de iodixanol, en TNC, añadiendo sobre la muestra de virus (1.2 ml), 1.5 ml de iodixanol 35%, 0.8 ml de iodixanol 30%, 0.8 ml de iodixanol 20% y 0.8 ml de iodixanol 15%. El gradiente se centrifugó a 150 000 x g por 4 h a 4 °C y posteriormente se colectaron fracciones de 400 µl para su posterior procesamiento. Biotinilación de proteínas de membrana. Células MA104 infectadas y tratadas o no tratadas con jasplakinólido se lavaron 3 veces con PBS frío. Posteriormente se 38 incubaron con 0,5 mg de NHS-LC-Biotina en buffer de biotinilación (trietanolamina 10 mM (pH 9); NaCl 150 mM; CaCl2 0,1 mM; MgCl2 1 mM) durante 30 min en hielo y nuevamente se realizaron 3 lavados con PBS frío. Para bloquear la NHS- LC-Biotina libre, las muestras se incubaron con 50 mM NH4Cl/PBS durante 10 min. Las células se lisaron incubando con buffer RIPA (Tris 10 mM (pH 7,4); NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; Tritón X-100 1%; deoxicolato de sodio 0,5%; SDS 0,1%; aprotinina 1%) durante 10 min en hielo. Transcurrido el tiempo de incubación se colocaron 20 μl de perlas magnéticas de estreptavidina durante 1 h a temperatura ambiente. Después se realizaron 4 lavados a las perlas en el siguiente orden: RIPA; RIPA con 0,5 M de NaCl; RIPA/TNE (10mM Tris (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA) 1:1; TNE. Finalmente las perlas se resuspendieron en 40 μL de buffer de carga, conteniendo SDS 1% y 200 mM de ditiotreitol y se hirvieron durante 5 min. Preparación de balsas lipídicas. Células MA104 crecidas en frascos de 75 cm2 fueron infectadas y tratadas o no con jasplakinólido. Posteriormente se despegaron con EDTA, se centrifugaron y lavaron dos veces con PBS y se llevaron a un tubo Eppendorf en hielo. Los pasos siguientes se efectuaron en un cuarto frío (4ºC). El botón celular se lisó por 20 min en 200 μl de TNC con 1% de Tritón X-100 (v/v). Posteriormente lo lisado se mezcló con iodixanoly se llevó a una concentración final de 40% de iodixanol y se preparó un gradiente de iodixanol discontinuo, como se describió previamente, con las siguientes características: 600 μl de la muestra en iodixanol 40% se colocaron en el fondo de un tubo para ultracentrífuga, seguido de 900 μl de iodixanol 35%, 900 μl de iodixanol 30%, 900 μl de iodixanol 25% y 900 μl de iodixanol 20%, aforándose a 5 ml finales con TNC. Los gradientes se centrifugaron a 200 000 x g por 4 h a 4°C y posteriormente se colectaron fracciones de 450 µl para su posterior procesamiento. Microscopía Electrónica de Transmisión. Los análisis de microscopía electrónica se realizaron en la unidad de Microscopía Electrónica del Instituto de Biotecnología de la UNAM por la Dra. Guadalupe Zavala y también en colaboración con la Dra. Catherine Eichwald del Instituto de Virología de la 39 Universidad de Zurich, Suiza. Para ello células MA104 se crecieron en frascos de 75cm2 y se infectaron con la cepa RRV a una MOI de 3. A 10 hpi se recolectaron los sobrenadantes celulares y se fraccionaron por medio de un gradiente de densidad (descrito con anterioridad). De algunas fracciones se tomó una muestra y se tiñeron con acetato de uranilo (3%) en 70% de metanol, analizándose cada muestra por medio de un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 900 (Gatan, Inc., Pleasanton, California, USA). 40 Tiempo post-infección (h) Citocalasina D Latrunculina B Jasplakinólido RESULTADOS Efecto de fármacos que alteran al citoesqueleto de actina en el rendimiento viral Para conocer si el ciclo de replicación de rotavirus requiere la participación del citoesqueleto de actina se utilizaron tres fármacos que alteran su organización: latrunculina B y citocalasina D (los cuales favorecen la despolimerización de la F- actina) y jasplakinólido (el cual induce y estabiliza al filamento de actina). Se determinó su toxicidad sobre monocapas de células MA104 observando el efecto citopático de los mismos a diferentes concentraciones, utilizando microscopía de contraste de fases (datos no mostrados). Posteriormente, se añadió cada fármaco a la concentración mayor en la que no se observó efecto citopático, a diferentes tiempos post infección (0, 4 y 8 h) a células MA104 infectadas con la cepa RRV (MOI de 3). El rendimiento viral se calculó en los lisados totales de células infectadas (células + medio de cultivo) a las 14 hpi, y por otro lado se cuantificó la salida del virus, a través de determinar el virus presente únicamente en el medio extracelular, definido en este trabajo como sobrenadante. Ni citocalasina D (10 mM) ni latrunculina B (1 µM) afectaron significativamente la producción de progenie viral total ni la salida del virus de la célula (Figuras 9 y 10). Por otro lado, el jasplakinólido (1 µM) pareció interferir con la salida de RRV de las células infectadas, pero no en la formación de las partículas infecciosas (Figura 9). Co nt ro l 0 4 8 0 4 8 0 4 8 0 50 100 150 % P ro g en ie V ir al ( S o b re n ad an te ) .... ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ 41 Citocalasina D Latrunculina B Jasplakinólido Tiempo post-infección (h) Figura 9. Efecto de la citocalasina D, latrunculina B y jasplakinólido sobre la salida de RRV de células MA104. Cada fármaco fue agregado a las células a diferentes tiempos (0, 4 y 8 hpi) y en todos estos casos las células se incubaron a 37°C hasta las 14 hpi. A este tiempo se colectó el sobrenadante de las células y el virus presente se tituló por un ensayo de inmunoperoxidasa, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). Los datos se expresan como porcentaje de virus en sobrenadante respecto al control (células sin fármaco), que fue tomado como el 100% y se analizaron por medio de GraphPad Prism por una prueba de Tukey; ⃰⃰⃰⃰ p<0.01, ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ p<0.05. Figura 10. Efecto de la citocalasina D, latrunculina B y jasplakinólido sobre la producción total de virus. Cada fármaco se agregó a las células a diferentes tiempos (0, 4 y 8 hpi). A las 14 hpi a 37°C en cada caso, se colectaron las células junto con el sobrenadante y se lisaron por varios ciclos de congelación-descongelación. Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). Los datos son expresados como porcentaje de rendimiento viral respecto al control (células sin fármaco). Co nt ro l 0 4 8 0 4 8 0 4 8 0 20 40 60 80 100 120 Hpi % P ro g en ie V ir al ( L is ad o s) 42 Dado que nuestros resultados sugirieron que el jasplakinólido tiene efecto sobre la salida del virus de las células, se procedió a realizar pruebas con nuevas ventanas de tiempo con este fármaco. Los resultados confirmaron que jasplakinólido inhibe la salida de RRV en células MA104, con un efecto mayor al agregar la droga a 4 hpi (Figura 11), sin embargo, al determinar el virus presente en lisados totales se confirmó también que esta droga no afecta la formación de las partículas infecciosas (Figura 12). Como se observó que existía un efecto mayor si se añadía el fármaco a 4 hpi se decidió trabajar a estos tiempos en los ensayos posteriores. Figura 11. Jasplakinólido inhibe la salida de RRV en células MA104. El fármaco se añadió a diferentes tiempos post-infección (0, 4, 8 y 10 hpi). Después de 14 h de infección a 37°C, se colectó el sobrenadante y se cuantificó mediante un ensayo de inmunoperoxidasa. Las barras representan el error estándar de la media de cuatro ensayos independientes (n=4) Los datos son expresados como porcentaje de virus en sobrenadante respecto al control (células sin fármaco) que fue tomado como el 100% y se analizaron por medio de GraphPad Prism por una prueba de Tukey; ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ p<0.001. C on tr ol 0 4 8 10 0 50 100 150 Tiempo post-infección (h) al cual el jasplakinólido se agregó % P ro g e n ie V ir a l (S o b re n a d a n te ) ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ 43 Figura 12. Jasplakinólido no afecta la formación de partículas infecciosas de RRV. El fármaco se añadió a diferentes tiempos post-infección (0, 4, 8 y 10 hpi). Después de 14 h de infección a 37°C, se colectaron las células junto con el sobrenadante y se lisaron por varios ciclos de congelación-descongelación y se cuantificó el virus presente en el lisado. Las barras representan el error estándar de la media de cuatro ensayos independientes (n=4). Los datos son expresados como porcentaje de rendimiento viral respecto al control (células sin fármaco) que fue tomado como el 100%. Efecto del jasplakinólido sobre la organización del citoesqueleto de actina en células MA104 Para observar el efecto del jasplakinólido sobre el citoesqueleto de actina durante diferentes tiempos de acción, células MA104 se trataron con jasplakinólido (1 µM) a diferentes tiempos y se tiñeron con faloidina fluorescente para observar al citoesqueleto de actina. Las células control muestran una red de actina cortical que permite observar el contorno de cada célula, además de presentar una red de haces de filamentos en el citoplasma celular (Figura 13A). En las células tratadas con el fármaco se observaron alteraciones morfológicas en el citoesqueleto, principalmente en la red de actina citoplasmática, la cual tiende a desparecer conforme avanza el tiempo (a las 10 y 14 h después de agregar jasplakinólido). C on tr ol 0 4 8 10 0 50 100 150 Tiempo post-infección (h) al cual el jasplakinólido se agregó % P ro g e n ie V ir a l (L is a d o s ) 44 A D C B También se puede observar lo queparecieran ser agregados de actina en el citoplasma a tiempos largos de exposición con el fármaco (Figura 13D), sin embargo la actina cortical parece no afectarse en presencia del jasplakinólido. Figura 13. Efecto del jasplakinólido sobre células MA104 a diferentes tiempos. Células MA104 fueron o no tratadas con jasplakinólido (1µM) a diferentes tiempos: A) Células control; B) 6 h con jasplakinólido; C) 10 h con jasplakinólido; D) 14 h con jasplakinólido. Todas las células fueron incubadas con o sin fármaco a 37°C y fueron fijadas y teñidas como se describió previamente en Materiales y Métodos. En azul (DAPI) se muestran los núcleos, mientras que la actina se tiñó con faloidina acoplada a Alexa- 488 (verde). Cinética de producción y liberación de virus Se ha reportado que la formación de nuevas partículas virales comienza a las 4 hpi, y la mayor parte se encuentra ensamblada a las 8 hpi (Martínez, 2015), sin C 45 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Testigo Jasplakinólido Tiempo (hpi) U F F /m l E n s o b re n a d a n te ( 1 06 ) embargo desconocíamos los tiempos post-infección a los cuales el virus comienza a salir de las células y si el jasplakinólido inhibe diferencialmente esta liberación a diferentes tiempos. Para determinar esto, células MA104 se infectaron con la cepa RRV y se les añadió o no el jasplakinólido a 4 hpi, cuantificándose la cantidad de virus dentro y fuera de las células a diferentes tiempos. Como se puede observar en la figura 14, la liberación del virus de las células empieza a partir de las 10 hpi, teniendo un pico máximo a las 14 hpi, y en todo este lapso de tiempo se observó una menor cantidad de virus en el sobrenadante en células tratadas con el fármaco respecto al control. A tiempos tardíos de infección (≥16 hpi), la cantidad de virus en el sobrenadante disminuye, debido probablemente a que éstos se unen a la superficie de otras células para iniciar un nuevo ciclo. La cantidad de virus total (virus dentro y fuera de las células) se incrementa a partir de las 4 hpi, hasta llegar a un máximo a las 14 hpi. Sin embargo, no se observó diferencia en la cantidad de virus total en células tratadas con jasplakinólido respecto a las no tratadas a lo largo de toda la infección (Figura 15). Figura 14. Cinética de liberación de la cepa RRV. Células MA104 fueron infectadas con la cepa RRV (MOI=3) y se incubaron a 37°C. A 4 hpi se añadió el jasplakinólido (1µM) y se mantuvo así por el resto de la infección. La cuantificación se realizó tomando únicamente los sobrenadantes. Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). 46 C tr l Ja s C tr l Ja s C tr l Ja s C tr l Ja s C tr l Ja s 0 50 100 % P ro g e n ie V ir a l ( S o b re n a d a n te ) Figura 15. Cinética de producción de virus infeccioso de la cepa RRV. Células MA104 fueron infectadas con la cepa RRV (MOI=3) y se incubaron a 37°C. A 4 hpi se añadió el jasplakinólido (1µM) y se mantuvo así por el resto de la infección. La cuantificación se realizó colectando las células junto con el sobrenadante y lisándolas por congelación. Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). Antes de las 8 hpi no se observó la presencia de virus en el sobrenadante, sin embargo el virus liberado se puede detectar a partir de las 9 hpi. A partir de este tiempo hasta las 14 hpi la presencia del fármaco inhibió la salida de rotavirus en un 60% aproximadamente (Figura 16). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 1.01005 1.01006 1.01007 1.01008 1.01009 Testigo Jasplakinólido Tiempo (hpi) U F F /m l E n l is a d o s t o ta le s ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ 9 hpi 10 hpi 11 hpi 12 hpi 14 hpi 47 0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 Control Infección/Fármaco Infección Fármaco Tiempo (h) i % L D H A Figura 16. La salida de rotavirus es inhibida por jasplakinólido. Células MA104 fueron infectadas con la cepa RRV y se incubaron a 37°C. A 4 hpi se añadió el jasplakinólido (Jas, 1 µM) y se mantuvo así hasta cada tiempo respectivo para su respectiva cuantificación. Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). Los datos son expresados como porcentaje de virus en sobrenadante respecto al control (Ctrl, células sin fármaco) que fue tomado como el 100% y se analizaron por medio de GraphPad Prism por una prueba de Tukey; ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ p<0.001. La infección con rotavirus no compromete la viabilidad celular a tiempos en los que inicia su salida de células infectadas Tradicionalmente, se ha asumido que rotavirus es liberado de células MA104 por lisis celular (Altenburg et al., 1980), sin embargo en nuestras condiciones de trabajo esta liberación es inhibida por el jasplakinólido, lo cual sugiere que podría existir otro mecanismo por medio del cual rotavirus sale de estas células no polarizadas. Para determinar si la infección con rotavirus y/o el tratamiento con jasplakinólido causan daño celular, y en caso afirmativo, a qué tiempos lo ocasionan, se midió la viabilidad de las células MA104 por dos métodos: liberación de lactato deshidrogenasa y reducción de rezarsurina. El primer método nos permitió evaluar indirectamente la integridad de la membrana celular, mientras que el segundo nos dio indicios de la viabilidad celular por medio de su actividad metabólica. Los resultados muestran que este fármaco no daña a las células MA104 a tiempos menores a 12 hpi (Figura 17). Estos resultados sugieren que, al menos a tiempos tempranos de la infección (<12 hpi), el virus sale de las células MA104 por un mecanismo no lítico. ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ 48 B Figura 17. La salida de rotavirus de las células inicia cuando aún no se presenta daño celular. Células MA104 se infectaron a una MOI de 3 y se incubaron el tiempo indicado a 37°C, añadiéndose el fármaco a 4 hpi. Después del tiempo de incubación respectivo se colectó el medio celular y la liberación de LDH fue determinada (A) o la reducción de rezarsurina fue medida (B). Las barras representan el error estándar de la media de tres ensayos independientes (n=3). Los datos son expresados como cantidad de LDH liberada al medio (A) o porcentaje de sobrevivencia celular respecto al control que fue tomado como 100% (B). Los datos se analizaron por medio de GraphPad Prism por una prueba de Tukey; ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰, ⃰⃰⃰⃰ p<0.01 Parte de las partículas virales extracelulares se encuentran asociadas a estructuras lipídicas de baja densidad La observación de que el fármaco inhibe la salida del virus sin afectar la viabilidad celular, sugiere que existe un mecanismo no lítico por el cual el virus comienza a liberarse de las células a partir de las 9 hpi. Para caracterizar las partículas virales que se liberan a tiempos tempranos examinamos la hipótesis de que el virus extracelular pudiera salir asociado a vesículas y por lo mismo pudiera encontrarse asociado a estructuras membranosas de la célula. Este tipo de egreso viral asociado a vesículas se ha reportado previamente para diferentes virus, algunos de ellos no envueltos, como poliovirus (Feng et al., 2013). 0 2 4 6 8 10 12 14 0 50 100 150 Control Células/Fármaco Infectadas/Fármaco Infectadas Hpi % S o b re v iv e n c ia ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰⃰ ⃰⃰⃰⃰ 49 Para analizar la interacción rotavirus-membranas en el medio extracelular utilizamos un gradiente de flotación en iodixanol, el cual permite separar proteínas solubles de estructuras asociadas a membranas lipídicas con base en su densidad, ya que estas últimas flotan después de ultracentrifugarse en este tipo de gradiente
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