Participacion-de-la-sinapsina-en-la-liberacion-extrasinaptica-de-serotonina

Vista previa del material en texto

1 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Participación de la sinapsina en la 
liberación extrasináptica de serotonina 
 T E S I S 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 Bióloga 
 P R E S E N T A : 
 Paola Ximena Torres Castro 
 
 DIRECTORA DE TESIS: 
Citlali Trueta Segovia 
2016 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
1. Datos del alumno 
Torres 
Castro 
Paola Ximena 
5549315781 
Universidad Nacional autónoma de 
México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
307309482 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Citlali 
Trueta 
Segovia 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Gloria Acacia 
Benítez 
King 
 
4. Datos del sinodal 2 
Dra. 
Tatiana 
Fiordelisio 
Coll 
 
5. Datos del sinodal 4. 
Dra. 
Alette 
Ortega 
Gómez 
 
6. Datos del sinodal 3 
Dra. 
Martha María de la Salud 
León 
Olea 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Participación de la sinapsina en la liberación extrasináptica de serotonina 
55p 
2016 
 
3 
Índice 
Resumen ........................................................................................................................................... 5 
Introducción ...................................................................................................................................... 7 
Antecedentes .................................................................................................................................... 7 
La serotonina. ............................................................................................................................................ 7 
Liberación sináptica y extrasináptica. ..................................................................................................... 13 
Fenómeno de Autoinhibición un mecanismo regulador de la propia neurona ...................................... 14 
Las sinapsinas .......................................................................................................................................... 15 
Sistema nervioso de la sanguijuela. ........................................................................................................ 18 
Liberación serotonérgica en neuronas de Retzius .................................................................................. 20 
Planteamiento del problema. ........................................................................................................... 22 
Hipótesis. ........................................................................................................................................ 23 
Objetivos ......................................................................................................................................... 23 
Material y Métodos. ........................................................................................................................ 24 
Aislamiento y cultivo de neuronas. ......................................................................................................... 24 
Estimulación eléctrica- registro intracelular. .......................................................................................... 25 
Inmunodot. .............................................................................................................................................. 26 
Fenómeno de autoinhibición como bioensayo. ...................................................................................... 26 
Análisis Estadístico .................................................................................................................................. 26 
Inmunofluorescencia ............................................................................................................................... 27 
Adquisición y análisis de imágenes de fluorescencia. ............................................................................. 28 
Resultados ...................................................................................................................................... 29 
La sinapsina está presente en el sistema nervioso de la sanguijuela. .................................................... 29 
Participación de la sinapsina regulando la liberación se serotonina en sitios perisinápticos a partir de 
vesículas electrodensas. .......................................................................................................................... 30 
La sinapsina se localiza en sitios extrasinápticos en neuronas serotonérgicas de Retzius. .................... 33 
Cambios en la distribución de la sinapsina al evocar la liberación extrasináptica .................................. 35 
4 
Colocalización entre la sinapsina y la sinaptofisina en neuronas serotonérgicas ................................... 37 
Cambios en la colocalización al evocar la liberación extrasináptica ....................................................... 37 
Incremento en el número de puntos fluorescentes al evocar la exocitosis ........................................... 40 
Concentración de los puntos fluorescentes al evocar la exocitosis ........................................................ 43 
La sinapsina y la sinaptofisina se desplazan hacia la membrana plasmática al estimular eléctricamente 
a 20 Hz ..................................................................................................................................................... 45 
Discusión ......................................................................................................................................... 47 
La sinapsina, una proteína conservada filogenéticamente. .................................................................... 47 
Participación de la sinapsina en la secreción perisináptica .................................................................... 47 
La sinapsina como elemento regulador de la exocitosis extrasináptica ................................................. 49 
Conclusiones ................................................................................................................................... 52 
Referencias ..................................................................................................................................... 53 
 
 
 
5 
RESUMEN 
Los neurotransmisores se empaquetan en vesículas secretoras y su liberación puede ocurrir en las 
terminales presinápticas de las sinapsis químicas ó en sitios extrasinápticos. En las terminales 
presinápticas, algunas vesículas forman una poza de reserva. Ante la estimulación repetitiva algunas de 
estas vesículas se movilizan hacia la membrana presináptica donde se fusionan y liberan el 
neurotransmisor. El mantenimiento de la poza de reserva se atribuye principalmente a la función de la 
proteína sinapsina, en su estado no fosforilado mantiene unidas a las vesículas con el citoesqueleto. Los 
neurotransmisores además de ser secretados en las terminales presinápticas, también pueden ser 
secretados en sitios extrasinápticos, como en la periferia de la terminal presináptica, a lo largo del axón y 
en el cuerpo de la neurona, también llamado soma. Los neurotransmisores que se liberan en estos sitiostambién se almacenan en vesículas sinápticas que pueden ser claras o electrodensas. Actualmente se 
desconoce si la sinapsina, participa en la regulación de la secreción extrasináptica a partir de vesículas 
electrodensas. En este proyecto estudiamos la participación de la sinapsina en la liberación de 
serotonina, a partir de vesículas electrodensas en sitios perisinápticos y extrasinápticos en neuronas de 
Retzius de la sanguijuela. Para estudiar la participación de la sinapsina en la liberación perisináptica 
utilizamos como bioensayo la respuesta de autoinhibición producida por la serotonina en las terminales 
presinápticas a partir de las diferentes pozas vesiculares en la terminal presináptica. El bloqueo con 
nimodipina de los canales de calcio tipo L que bloquean la secreción perisináptica, a partir de vesículas 
electrodensas, disminuyó en un 59±3.7% la respuesta de autoinhibición, mostrando que las vesículas 
electrodensas de la zona perisináptica contribuyen en cerca de un 60% a esta respuesta. El bloqueo 
simultáneo de la secreción perisináptica con nimodipina y de la movilización de la poza de reserva con 
KN-93, que bloquea a las cinasas dependientes de calcio y calmodulina disminuyó en 84±3.1% la 
respuesta de autoinhibición, mostrando que la poza liberable de vesículas sinápticas contribuye en un 
16% a la respuesta. Estos resultados sugieren que la poza de reserva sináptica contribuye 
aproximadamente un 25% a la respuesta de autoinhibición. El bloqueo de la fosforilación de la sinapsina 
con KN-93 disminuyó en 62±8% la respuesta de autoinhibición, mostrando sobreposición del efecto de 
este fármaco y el de la nimodipina. Esto sugiere que el bloqueo de la fosforilación de la sinapsina, 
además de disminuir la movilización de la poza de reserva, disminuye parte de la secreción a partir de 
vesículas electrodensas perisinápticas. Nuestros resultados sugieren que la sinapsina sí participa 
funcionalmente en el anclaje de las vesículas electrodensas perisinápticas. 
Para estudiar la posible participación de la sinapsina en la secreción somática observamos la localización 
de esta proteína mediante la técnica de inmunofluorescencia. La sinapsina se localizó tanto en la punta 
del muñon axonal donde se encuentran las terminales presinápticas como en sitios extrasinápticos. La 
6 
estimulación de la neurona con un tren de 10 impulsos a una frecuencia de 20Hz con un electrodo 
intracelular para evocar la exocitosis, produjo un cambio en la distribución de la marca que se localizó 
más adyacente a la membrana plasmática. Analizamos la relación de la sinapsina con los cúmulos 
vesiculares mediante el análisis por inmunofluorescencia de su colocalización con la sinaptofisina por 
inmunofluorescencia contra la sinaptofisina (proteína integral de las vesículas). Se cuantificó el 
porcentaje de colocalización en células estimuladas y sin estimular. A pesar de que el porcentaje de 
colocalización fue relativamente bajo ambas marcas se localizaron más adyacentes a la membrana 
plasmática en las células estimuladas, sugiriendo que la sinapsina podría tener una relación funcional con 
las vesículas electrodensas que liberan serotonina en sitios extrasinápticos 
Nuestros resultados muestran que la proteína sinapsina participa regulando la liberación de serotonina, 
a partir de vesículas electrodensas que liberan su contenido en sitios perisinápticos, al mantener a las 
vesículas unidas con el citoesqueleto. Se localiza en sitios extrasinápticos, como el soma y el axón 
primario. Cuando se evoca la exocitosis cambia su localización concentrándose adyacente a la membrana 
plasmática del soma y del axón primario. La sinapsina colocaliza con los cúmulos de vesículas 
electrodensas y esta colocalización incrementa al evocar la exocitosis tanto en el soma como en el axón 
primario de las neuronas, sugiriendo una participación funcional en sitios extrasinápticos 
 
7 
INTRODUCCIÓN 
Además de la bien conocida liberación de neurotransmisores por exocitosis desde las terminales 
sinápticas, las neuronas pueden liberar neurotransmisores desde sitios extrasinápticos en el soma, axón 
y las dendritas. Los neurotransmisores así liberados regulan circuitos neuronales de manera paracrina. La 
exocitosis extrasináptica ocurre a partir de cúmulos de vesículas electrodensas y requiere de altas 
frecuencias de estimulación para efectuarse. En las terminales sinápticas las vesículas de la poza de 
reserva se mantienen unidas entre sí y al citoesqueleto por medio de la proteína sinapsina. La 
fosforilación de la sinapsina en respuesta a la estimulación repetitiva, permite la disociación de las 
vesículas del citoesqueleto, para permitir su movilización hacia la poza liberable y su posterior fusión 
para liberar su contenido. De este modo la sinapsina mantiene la liberación ante altas frecuencias de 
estimulación, en las terminales presinápticas. Sin embargo, no se conoce si la sinapsina tiene una función 
en sitios diferentes a la terminal presináptica y si mantiene a las vesículas electrodensas agrupadas y 
unidas al citoesqueleto regulando la liberación extrasináptica 
En este trabajo exploramos la posible participación de la sinapsina regulando la movilización de las 
vesículas electrodensas que liberan serotonina en sitios perisinápticos y extrasinápticos, en neuronas 
serotonérgicas 
 
ANTECEDENTES 
La serotonina. 
La serotonina es un mensajero químico que regula a las células del sistema nervioso central y periférico 
(Siegel, et al. 2006). Actúa como neurotransmisor local en la sinapsis y como modulador paracrino 
cuando se secreta en sitios extrasinápticos. 
 Las funciones de la serotonina están altamente conservadas a lo largo de la escala filogenética e 
incluyen una amplia variedad de funciones fisiológicas y conductas. A nivel periférico circula en la sangre 
y actúa sobre el músculo liso de los vasos sanguíneos regulando el tono vascular. Otra función periférica 
en la que participa es la contracción y relajación del musculo liso de las vísceras, así como en los 
movimientos peristálticos gastrointestinales (Kato, 2013). En el sistema nervioso central participa en 
funciones fisiológicas neuroendocrinas al ser uno de los principales neurotransmisores del núcleo 
supraquiasmático hipotalámico. La serotonina aumenta la liberación de la hormona del crecimiento y la 
prolactina. Esta monoamina está implicada en la regulación termo-nociceptiva. 
8 
La serotonina regula patrones motores rítmicos, como los que controlan la masticación, la locomoción y 
la respiración. Por ejemplo, en las sanguijuelas modula el circuito neuronal que coordina el nado. 
También modula circuitos neuronales responsables de una gran variedad de conductas, como la 
conducta sexual. Áreas críticas como la amígdala y el septum, que orquestan esta conducta, son 
inervadas por terminales serotonérgicas. El incremento en la actividad serotonérgica central atenúa la 
conducta sexual (Angoa-Pérez and Kuhn, 2015), es decir, tiene una influencia inhibidora en el mecanismo 
neural que media la conducta sexual. Otro ejemplo es la conducta alimenticia (apetito). La serotonina 
aumenta la saciedad e inhibe el consumo de alimento (Muller and Jacobs, 2009). Modula estados de 
ánimo y emociones como ansiedad, estrés y miedo, esto se ha demostrado por la alta densidad de 
receptores a serotonina en el sistema límbico (Albert et al., 2014) . El mal funcionamiento de la 
neurotransmisión de la serotonina está relacionado a trastornos neuropsiquiátricos , como la depresión, 
la esquizofrenia, el trastorno bipolar, y el trastorno obsesivo-compulsivo (Muller and Jacobs, 2009; 
Sadkowski et al., 2013; Siegel, et al. 2006). La serotonina participa en procesos cognitivos como la 
consolidación de la memoria, la atención y el aprendizaje. Se ha demostrado una alta densidad de 
receptores en particular 5-HT7 y 5-HT2 en hipocampo, giro dentado y corteza cerebral tantoen ratas y en 
primates como los humanos (Meneses, 2015; Zhang and Stackman, 2015; Roberts and Hedlund, 2012). 
Síntesis de serotonina (5-HT) 
La síntesis de serotonina inicia con el trasporte del aminoácido aromático L-triptófano, de la sangre hacia 
el líquido cerebroespinal. El primer paso es la conversión de triptófano a 5-hidroxitriptofano (5-HTP) por 
la enzima triptófano hidroxilasa, que es codificada por dos distintos genes: TPH1 en tejido periférico y 
TPH-2 en el sistema nervioso central. Esta enzima agrega un grupo hidroxilo en la posición 5 del núcleo 
indol. Posteriormente el 5-HTP es descarboxilado a 5-hidroxitriptamina (5-HT) por la enzima 
descarboxilasa de aminoácidos L aromáticos. En la estructura de la serotonina, la combinación del grupo 
hidroxilo en la posición 5 del núcleo indol y la amina de nitrógeno, le confiere la capacidad de servir 
como un aceptor de protones. En pH fisiológico la serotonina es una sustancia hidrofílica; por lo tanto no 
atraviesa la barrera lipofílica hematoencefálica. Su descubrimiento en 1948 por Maurice Rapport e Irving 
Page en el cerebro fue extraordinario, ya que indica que se sintetiza ahí (Rapport et al., 1948). 
9 
Figura 1. Biosíntesis de la serotonina. (Tomado de Siegel, et al. 2006) 
 
 
10 
Neuroanatomía del sistema serotonérgico. 
Las neuronas que contienen serotonina fueron directamente visualizadas en la década de los 60 a través 
de la técnica de inmunohistoquímica por Dahlström y Fuxe (Dahlström and Fuxe, 1964), quienes 
describieron que los somas de estas neuronas tienen una distribución restringida al tallo cerebral, 
describieron 9 grupos conformados por celulares, estos grupos fueron nombrados por orden de caudal a 
rostral como B1 hasta B9. Sus axones inervan casi todo el sistema nervioso central, aunque 
artificialmente se pueden dividir en dos poblaciones. El grupo de ganglios que reside en la porción rostral 
del puente proyecta sus axones a la corteza cerebral y al cerebelo, el grupo en la porción caudal del 
puente proyecta principalmente hacia medula espinal. 
El grupo rostral, que se extiende del mesencéfalo a la mitad del puente, está constituido por tres 
núcleos. Primeramente, el núcleo caudal linearis, identificado por Dahkström y Fuxe como B8, el cual 
pertenece al tegmento mesencefálico ventral localizado próximo al núcleo rojo. Este núcleo tiene 
población heterogénea de neuronas, ya que incluye neuronas dopaminergicas y neuronas que contienen 
sustancia P. El segundo núcleo que pertenece a este grupo, es el núcleo del raphe dorsal, este núcleo 
tiene el mayor número de neuronas serotonérgicas, al contener un tercio del total de neuronas 
serotonérgicas del cerebro. Estos núcleos fueron descritos por Dahlström y Fuxe como los grupos B7 y 
B6. El núcleo del raphe dorsal, se distribuye en el eje anteroposterior entre el núcleo oculomotor y el 
núcleo abducens, contiene neuronas serotonérgicas multipolares que proyectan principalmente a la 
corteza cerebral, a la amígdala y a la substancia nigra. Por último, el núcleo del raphe medial, presenta 
una proyección ascendente centrada predominantemente en la región central, el área tegmental ventral, 
el hipotálamo, el tálamo e hipocampo. Esta vía podría modular directa e indirectamente el sistema 
motor. 
El grupo caudal se extiende del metaencéfalo a la decusación del tracto piramidal. Este grupo está 
constituido por el núcleo magnus descrito por Dahlström y Fuxe como grupo B3, el cual está restringido a 
la línea media localizado en el tegmento ventral al nivel del núcleo facial, las neuronas serotonérgicas 
que lo constituyen principalmente son bipolares. Otros núcleos que constituyen al grupo caudal son el 
núcleo del raphe obscuris que corresponde al grupo B2 descrito por Dahlström y Fuxe y el núcleo del 
raphe palidus, este es el núcleo de raphe más pequeño corresponde al grupo B1. Las neuronas 
serotonérgicas de este grupo son elongadas con pocos procesos dendríticos, están orientadas 
predominantemente dorso-ventralmente (Muller and Jacobs, 2009). 
11 
Figura 2. Localización neuroanatómica de los núcleos serotonérgicos del raphe. Ilustración de un corte sagital de un 
cerebro adulto, mostrando la ubicación de los núcleos de raphe en el tallo cerebral. En el cerebro medio, los núcleos 
presentan proyecciones serotonérgicas ascendentes hacia el hipotálamo, el tálamo, los núcleos basales, el sistema límbico 
y la corteza frontal. Los núcleos del raphe medulares se caracterizan por proyecciones principalmente descendentes. 
 
12 
Receptores de serotonina 
La gran diversidad de efectos que tiene la serotonina y su amplio espectro de acciones pueden ser 
explicados por los diferentes subtipos de receptores, se pueden dividir en 7 familias de acuerdo a su 
estructura molecular, farmacología y en cómo transducen la señal. Los receptores de serotonina a 
excepción de la familia 3, se caracterizan porque son proteínas integrales de membrana con 7 dominios 
transmembranales hidrofóbicos conectados por tres asas intracelulares y tres asas extracelulares, la 
terminal amino está orientada hacia el espacio extracelular mientras que la terminal carboxilo hacia el 
citoplasma. Para transmitir la señal se acoplan a proteínas G. Estos receptores poseen sitios comunes 
conservados dentro de las familias, los dominios extracelulares están glicosilados, y poseen residuos de 
cisteína que pueden formar enlaces disulfúricos, que conceden un cambio estructural en la 
conformación del receptor. Los dominios intracelulares contienen sitios de fosforilación para diferentes 
cinasas y sitios potenciales de interacción proteína-proteína (Chattopadhyay, et al. 2007). La familia 3 se 
caracteriza porque los receptores son canales iónicos que dependen de un ligando (5HT3A-5HT3E.). En 
general los receptores de serotonina se localizan en alta densidad en estructuras como: el hipocampo, la 
amígdala, la corteza entorrinal, el hipotálamo, la sustancia nigra, los ganglios basales, la corteza frontal y 
el cerebelo. Los mecanismos efectores asociados a los receptores son estimular o inhibir a la enzima 
adenil ciclasa, este mecanismo efector depende del subtipo de receptor y de la estructura en la que se 
encuentra, y estimular a la enzima fosfolipasa C. La distribución de los receptores sugiere que están 
asociados a funciones integrativas, cognitivas y en regular los estados emocionales. Los receptores de 
serotonina son un blanco terapéutico potencial para el tratamiento de desórdenes conductuales como la 
esquizofrenia, la ansiedad y la depresión. 
Figura 3. Representación esquemática de un receptor heptahelioidal a serotonina. (Tomado de chattopadhyay, et al. 
2007) 
 
13 
Liberación sináptica y extrasináptica. 
La liberación sináptica es un tipo de comunicación entre neuronas, se caracteriza por la liberación de 
mensajeros químicos llamados neurotransmisores que están almacenados en vesículas. El arribo de un 
potencial de acción y en consecuencia la entrada de calcio permite la fusión de las vesículas y la 
liberación de los neurotransmisores, que difunden por la hendidura sináptica hasta unirse con sus 
receptores que están localizados en la neurona postsináptica. La liberación de los neurotransmisores en 
la sinapsis química es rápida, es decir, el neurotransmisor actúa activando a los receptores por 
milisegundos. Este tipo de liberación se ve reflejada en respuestas conductuales rápidas y efectos 
localizados. La zona activa es una región en la membrana citoplasmática localizada en la terminal 
presináptica, la zona activa consiste de macromoléculas que se unen a las proteínas de las vesículas, 
estas uniones entre proteínas permiten el ensamble y fusión de las vesículas sinápticas. Una de las 
proteínas sinápticas que participa en este ensamble es la sinaptofisina (una glicoproteína integral de 
membrana), utilizada comúnmente como marcador de vesículas, por ser una de las proteínasmás 
abudantes de las vesículas sinápticas al constituir el 8% de estas (Hou and Dahlström, 2000). La 
sinaptofisina junto con la sinaptobrevina, forman un complejo macromolecular a través de su unión con 
la sintaxina y la SNAP-25. La sinaptotagmina cataliza la fusión de las membranas de manera dependiente 
de la presencia de calcio, en consecuencia los neurotransmisores son liberados ( Siegel, et al. 2006) 
Además de la clásica liberación sináptica, los neurotransmisores pueden ser liberados en sitios 
extrasinápticos. Esta liberación también es conocida como transmisión en volumen. Las evidencias que 
soportan este concepto son: la distribución de vesículas secretoras en sitios extrasinápticos, la presencia 
de neurotransmisores en el espacio extracelular y fuera de la hendidura sináptica en concentraciones 
capaces de activar receptores, así como la localización de receptores para neurotransmisores en los 
somas de las neuronas y en las células gliales (Para revisión ver Trueta and De-Miguel, 2012). La 
exocitosis extrasináptica ocurre en sitios como el cuerpo neuronal (soma), a lo largo del axón y las 
dendritas, en neuronas centrales y periféricas de vertebrados e invertebrados. Esta secreción se 
caracteriza porque depende de altas frecuencias de estimulación mayores a 2 Hz, por la amplia difusión 
de los neurotransmisores a estructuras distantes y la duración de la liberación ya que puede continuar 
por varios segundos incluso minutos después de haber terminado la despolarización (De-Miguel and 
Nicholls, 2015). Los neurotransmisores que liberan en sitios extrasinápticos son: dopamina, 
noradrenalina, ATP, oxitocina, glutamato, GABA, acetilcolina serotonina y péptidos (Trueta and De-
Miguel, 2012). En particular la serotonina que se libera en sitios extrasinápticos se puede almacenar 
tanto en vesículas claras como en vesículas electrodensas (Descarries and Mechawar, 2000). 
14 
Fenómeno de Autoinhibición un mecanismo regulador de la propia 
neurona 
El fenómeno de autoinhibición es un mecanismo de autorregulación de la propia neurona, que es 
mediado por las propiedades eléctricas intrínsecas de la membrana plasmática en las terminales 
presinápticas, donde la neurona controla su frecuencia de disparo, a través de activar autorreceptores 
(Andrade et al., 2015). Este mecanismo se ha descrito en neuronas dopaminérgicas, noradrenérgicas, 
neuronas que liberan histamina y en neuronas serotonérgicas (De Luca et al., 2016; Threlfell et al., 
2010). En neuronas serotonérgicas de Retzius de la sanguijuela se describió el mecanismo de 
autoinhibición por Cercós et al; en 2009. El mecanismo consiste en que la serotonina liberada inhibe la 
actividad eléctrica de la propia neurona, ejerciendo efectos sobre su propio sitio de liberación. La 
serotonina liberada actúa sobre autorreceptores acoplados a canales de cloro, en respuesta a la 
activación de los autorreceptores incrementa la conductancia de la membrana produciendo una 
respuesta hiperpolarizante que disminuye la excitabilidad (Cercós et al., 2009). La respuesta 
hiperpolarizante se invirtió al cambiar la dirección del gradiente transmembranal de cloro utilizando 
electrodos llenos de cloruro de potasio (KCl); la respuesta se observó como una despolarización que 
además se amplificó. Esta estrategia fue necesaria porque el potencial electroquímico del cloro está muy 
cercano al potencial de membrana y en condiciones fisiológicas la respuesta no se distingue con claridad 
(Cercós et al., 2009) 
 
 
15 
Las sinapsinas 
Las sinapsinas son una familia de proteínas conservadas filogenéticamente, específicas de neuronas que 
se asocian reversiblemente a vesículas sinápticas (Shupliakov et al., 2011). En mamíferos se han 
identificado tres genes syn I, syn II y Syn III, que codifican para la sinapsina con splicing alternativo, 
dando origen a 10 isoformas (Syn Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa-IIIf). En invertebrados se planteó la hipótesis de la 
condición ancestral, la cual resalta que hay un solo gen de sinapsina. Esta hipótesis es confirmada en 
nematodos como c. elegans, y en moluscos como Loligo pealei, Aplysia californica y Helix pomatia 
(Humeau et al., 2011). 
La sinapsina I es una proteína que fue identificada por el equipo de investigación dirigido por Paul 
Greengard en la década de los 80 y nombrada inicialmente como proteína I. Posteriormente se 
renombró como sinapsina. En sus estudios mostraron, que en los periodos de conducción del impulso 
nervioso se incrementó el estado de fosforilación de la sinapsina y que este dependía de la 
concentración de calcio intracelular debido a que la fosforilación de la sinapsina se debe a la activación 
de proteínas cinasas dependientes de calcio. Estos estudios fueron realizados en ganglio cervical de 
conejo (Nestler and Greengard, 1982). En esta preparación mostraron que hay dos fuentes de la 
proteína, un 60% que está en la terminal presináptica y un 40% que se localiza en el cuerpo celular. 
Cuando colocaron el inhibidor de la síntesis de la proteína sinapsina (cycloheximide) afecto únicamente a 
la sinapsina del cuerpo celular, pero no a la sinapsina de la terminal presináptica, sugiriendo que la 
síntesis ocurre en el cuerpo neuronal. 
Las funciones descritas para la sinapsina I y la sinapsina II son mantener la organización y abundancia de 
las vesículas en la terminal nerviosa, en particular el agrupamiento de las vesículas en la poza de reserva 
así como regular el movimiento de las vesículas de la poza de reserva hacia la zona activa (Bykhovskaia, 
2011). Las funciones de la sinapsina III, están asociadas al desarrollo neuronal (Cesca et al., 2010) 
En general las funciones de la sinapsina están controladas por ciclos de fosforilación y defosforilación de 
la sinapsina, al ser sustrato de diferentes tipos de proteínas cinasas, como la cinasa dependiente de AMP 
cíclico (PKA), de la cinasa dependiente de calcio y calmodulina (CaMK) tipo I, II y IV y de la cinasa activada 
por mitógeno (MAPK/Erk), que fosforilan a la proteína sinapsina en diferentes sitios. 
 
16 
Estructura de la sinapsina I 
En general las sinapsinas son proteínas con múltiples dominios, constituidos por una gran cabeza 
globular y una región N-terminal elongada rica en prolina. La porción globular se subdivide en tres 
dominios llamados A B y C, que son comunes en todas las isoformas de mamíferos y también de 
invertebrados (Humeau et al., 2011). La región C-terminal se constituye por diferentes dominios que van 
del dominio D hasta el dominio I, dependiendo de la isoforma de la sinapsina 
En particular la sinapsina I se caracteriza por poseer el dominio D. Se constituye en 27% por residuos de 
prolina y 17% de residuos de glutamina. Tiene dos sitios de fosforilación por la cinasa dependiente de 
calcio y calmodulina tipo II (CaMKII). La fosforilación de este dominio provoca el mayor cambio 
conformacional, al reducir la afinidad por las vesículas y modificar la interacción con los filamentos de 
actina (Benfenati et al., 1990; Shupliakov et al., 2011). 
Figura 4. Dominios de la proteína sinapsina I en mamíferos e invertebrados. (A) Estructura de la sinapsina I de 
mamíferos, incluyendo los subdominios de ambas isoformas. (B) Comparación de los subdominios de la sinapsina I entre 
los invertebrados hélix pomatia, aplysia californica y loligo palei. (Modificado de Yann Humeau, 2011) Al dominio A se le 
atribuye la interacción con los fosfolípidos. El dominio C es el dominio más extenso. Una porción se inserta parcialmente 
en la sección hidrofóbica de la capa bilipídica de las vesículas sinápticas, y otra porción con los filamentos de actina. 
(Song and Augustine, 2015). 
 
17 
Mecanismo de acción de la sinapsina I y la fosforilación por CaMKII en el dominio D 
La sinapsina I tiene una alta afinidad de unión a la membrana de las vesículas sinápticas, debido a las 
interacciones electrostáticas e hidrofóbicas entre proteína-proteínay proteína-lípidos (Cheetham et al., 
2001). Las vesículas sinápticas se mantienen agrupadas y unidas al citoesqueleto a unas cuantas micras 
de la membrana plasmática en la terminal presináptica, estas vesículas conforman la poza de reserva. La 
estimulación nerviosa produce el re-arreglo y movimiento de las vesículas de la poza de reserva hacia la 
poza liberable. Esta función es atribuida a múltiples proteínas, pero la sinapsina I tiene un papel 
fundamental, ya que en su estado no fosforilado, la sinapsina I mantiene el cúmulo a través de unir a las 
vesículas sinápticas con los filamentos de actina. 
El proceso de señalización inicia cuando el potencial de acción activa canales de calcio dependientes de 
voltaje. El calcio intracelular se une a la calmodulina, la unión induce un cambio conformacional en la 
calmodulina que permite continuar la señal al unirse a las cinasas dependientes de calcio y calmodulina 
(CaMK). Estas cinasas en el estado de arresto, es decir, cuando el dominio regulador inhibe al dominio 
catalítico, no tienen la capacidad de fosforilar. Una vez que el complejo calcio-calmodulina se une al 
dominio regulador activa al dominio catalítico, de este modo la cinasa transfiere el grupo δ-fosfato del 
ATP a la sinapsina (en su dominio D en residuos de serina-treonina). Este grupo fosfato, que está cargado 
negativamente altera la carga de la sinapsina I cambiando su conformación. Como resultado la sinapsina 
pierde afinidad por las vesículas sinápticas y por la actina (Song and Augustine, 2015; Wang, 2008). La 
movilización de algunas vesículas de la poza de reserva y posteriormente su fusión en la zona activa, se 
debe a la fosforilación de la sinapsina I por proteínas cinasas dependientes de calcio y calmodulina tipo II 
(CaMKII), permitiendo la disociación de las vesículas con el citoesqueleto (Bykhovskaia, 2011). De esta 
forma la sinapsina I permite mantener la transmisión ante altas frecuencias de estimulación (Pieribone 
1995, Sankaranarayanan, 2003) 
 
 
18 
Sistema nervioso de la sanguijuela. 
Las neuronas de Hirudo sp. presentan ventajas únicas en el estudio de los mecanismos de regulación de 
la liberación de neurotransmisores, incluyendo la posibilidad de sobrevivir por semanas preservando su 
potencial de membrana, así como la forma y duración de su distintivo potencial de acción. En este 
proyecto usamos las neuronas de Retzius aisladas de la sanguijuela Hirudo sp. La sanguijuela como 
modelo biológico presenta características únicas, ya que las neuronas pueden ser aisladas y permanecer 
en cultivo durante semanas, durante las cuales preservan sus propiedades eléctricas y continúan la 
síntesis y liberación de serotonina (Henderson et al., 1983) 
Las sanguijuelas que utilizamos como modelo biológico son anélidos que pertenecen a la clase Hirudinea. 
Presentan simetría bilateral, son hermafroditas (fecundación interna y cruzada) y hematófagas. Una 
peculiaridad es que poseen glándulas que secretan una gran cantidad de anticoagulantes, entre ellos la 
hirudina, un péptido que impide la coagulación de la sangre. 
El sistema nervioso de las sanguijuelas consiste de una cadena conformada por 32 ganglios unidos por 
dos largas fibras que conectan neuronas de ganglios adyacentes. Esta cadena corre longitudinalmente en 
la región ventral de la sanguijuela. Los primeros cuatro ganglios están fusionados y corresponden a la 
masa ganglionar cefálica. En el cuerpo medio poseen 21 ganglios que son independientes y controlan de 
manera relativamente autónoma cada segmento corporal de la sanguijuela, ya que las prolongaciones de 
los somas neuronales emergen a través del par de raíces nerviosas que surgen de cada ganglio, estos se 
ramifican e inervan los órganos internos, los músculos y la piel. Cada ganglio contiene aproximadamente 
400 neuronas, que pueden ser identificadas por su tamaño y localización. La mayoría de las neuronas 
están presentes en pares. El diámetro de sus somas varía entre 10 µm y 80 µm y se distribuyen en 6 
paquetes, dos centrales, dos anteriores y dos posteriores. En el paquete central anterior se ubican las 
células de Retzius, que son las neuronas de mayor tamaño y liberan el neurotransmisor serotonina, que 
modula conductas como la alimentación, el nado y la contracción de los músculos en la sanguijuela. Los 
últimos 7 ganglios están fusionados y corresponden a la masa ganglionar caudal. En la región anterior 
(cefálica) de la sanguijuela sobre la superficie dorsal de su piel poseen 5 pares de fotorreceptores 
arreglados en forma de arco. Los segmentos del cuerpo medio tienen en la superficie dorsal y ventral 7 
pares de sensilas, que son órganos sensoriales que contiene mecanorreceptores, estos pares de sensilas 
se localizan en el anillo central de cada segmento corporal.(Muller et al., 2010; Sawyer, 1986). 
19 
Figura 5 Sistema Nervioso Central de Hirudo sp. (A) El SNC de la sanguijuela consiste de una masa ganglionar cefálica, 21 
ganglios libres y una masa ganglionar caudal (Tomado de Nicholls 2001). (B) Vista ventral de un ganglio segmental. Las 
células individuales son reconocidas por su tamaño y localización. En el paquete central se observa el par de neuronas de 
Retzius y en paquetes adyacentes las neuronas mecanosensoriales las cuales responden al toque (T), a la presión (P) y al 
daño noscivo (N) de la piel. (Tomado de Nicholls y Baylor 1968) 
 
20 
Liberación serotonérgica en neuronas de Retzius 
La mayor parte de lo que se sabe sobre secreción sináptica y extrasináptica de serotonina se ha 
estudiado en las neuronas de Retzius de la sanguijuela, por sus múltiples ventajas que se han 
mencionado anteriormente. Las neuronas de Retzius pueden secretar serotonina en diferentes regiones 
morfológicas: en las terminales presinápticas a partir de vesículas claras y en sitios extrasinápticos como 
el soma, secretando grandes cantidades de serotonina a partir de vesículas electrodensas. A través de 
estos mecanismos de secreción de serotonina, una neurona puede modular la actividad de un blanco 
sináptico o de un circuito neuronal (Leon-Pinzon et al., 2014; Trueta et al., 2003). 
La secreción sináptica es mediada por la activación de canales de calcio del tipo N y P/ Q, a diferencia de 
la secreción somática, que depende de canales de calcio tipo L (Trueta et al., 2003). En la terminal 
presináptica, la liberación de serotonina ocurre a partir de un único potencial de acción o cuando se 
estimula eléctricamente a 1 Hz, por vesículas claras que tienen un tamaño aproximadamente de 40 nm 
de diámetro (estas no se observan en el soma de las neuronas de Retzius). La secreción somática en 
neuronas identificadas de Retzius de Hirudo sp. depende de altas frecuencias de estimulación mayores a 
10 Hz o de largas despolarizaciones, para que el calcio intracelular se acumule y difunda. La exocitosis 
puede continuar por varios minutos después de la estimulación. 
El soma contiene cúmulos de vesículas electrodensas de aproximadamente 100nm de diámetro (Bruns et 
al., 2000). Cerca de 100 cúmulos de vesículas llegan a fusionarse después de un tren de 20 Hz, y se 
calcula que cada cúmulo de vesículas electrodensas se compone de 100 a 1000 vesículas, que contiene 
67,000 moléculas de serotonina cada una (Bruns and Jahn, 1995). Leon Pinzon y colaboradores estiman 
que un tren de 10 impulsos a 20 Hz evoca la fusión de 60,000 a 100, 000 vesículas en el soma (Leon-
Pinzon et al., 2014). Los cúmulos de vesículas electrodensas en micrografía electrónica en el soma de 
neuronas de Retzius se observaron a diferentes distancias con respecto a la membrana plasmática. 
Cuando fueron estimuladas a 1Hz, se observaron dos poblaciones de cúmulos vesiculares. Uno en la zona 
perinuclear con un diámetro promedio de 375 ± 24nm, distribuidos junto con el aparato de Golgi, 
mitocondria y retículo endoplásmico. La segunda población llamada periférica se localizó distante dela 
membrana plasmática, el diámetro promedio de esos cúmulos fue de 493 ± 35nm, los cuales estaban 
asociados con fibras de microtúbulos de 20 a 25nm cerca de mitocondrias y retículo endoplásmico. 
(Trueta et al., 2003, 2012). Cuando las neuronas fueron previamente estimuladas a 20 Hz el 47% de los 
cúmulos vesiculares se encontraban posados adyacentes a la membrana plasmática en contacto con la 
membrana plasmática (Trueta et al., 2012) 
21 
Las terminales sinápticas de las neuronas de Retzius están rodeadas de vesículas electrodensas(Kuffler et 
al., 1987) que también contienen serotonina que es liberada en las zonas perisinápticas. La exocitosis de 
vesículas electrodensas en zonas perisinápticas requiere de la actividad eléctrica repetitiva y al igual que 
en el soma depende de la activación de canales de calcio tipo L, pero las frecuencias necesarias para 
activarla son menores que las requeridas en el soma, ya que ocurre desde frecuencias de 2 Hz. 
Figura 6 Ultraestructura de una neurona de Retzius en el ganglio. (A) Micrografía electrónica de una neurona de Retzius 
en el ganglio que fue fijada despues de la estimulación a 1 Hz, a esta frecuencia no se evoca la liberación somática de 
serotonina; se observan cúmulos de vesículas electrodensas pseudocoloreadas en azul (VC) rodeando el núcleo (n) 
distantes de la membrana plasmática (pm). La mitocondria (m), el retículo endoplásmico (er), y los cuerpos 
multivesiculares (mvb) se encuentran cerca de las vesículas, Barra escalar = 2µm. (B) Magnificación de una neurona que 
ha sido estimulada a 1 Hz (C) La célula fue estimulada a una frecuencia de 20 Hz, las vesículas electrodensas se 
encuentran adyacentes a la membrana plasmática Barra escalar=1µm. Las células de Retzius están rodeadas por células 
gliales gigantes (g) (Tomado y modificado de De-Miguel et al., 2012; Trueta et al., 2012) 
22 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 
Las neuronas serotonérgicas liberan serotonina a partir de diferentes compartimentos, incluyendo las 
terminales sinápticas, las zonas perisinápticas, el axón y el soma. En las terminales sinápticas se conoce 
que la sinapsina mantiene la poza de reserva al agrupar y anclar a las vesículas con el citoesqueleto, 
también se sabe que la sinapsina permite la liberación de serotonina ante la estimulación repetitiva. Sin 
embargo, se desconoce sí las vesículas electrodensas que liberan en sitios perisinápticos y 
extrasinápticos son ancladas al citoesqueleto por medio de la sinapsina. En nuestra investigación nos 
preguntamos sí ¿La sinapsina puede participar en la liberación perisináptica y extrasináptica de 
serotonina? 
En este trabajo investigamos 1) si la sinapsina regula el anclaje de vesículas electrodensas con el 
citoesqueleto que liberan su contenido en sitios perisinápticos, 2) si la sinapsina se localiza en sitios 
extrasinápticos como el soma y a lo largo del axón primario, y 3) si la sinapsina se asocia espacialmente 
con los cúmulos de vesículas electrodensas. Para contestar estas preguntas utilizamos las neuronas de 
Retzius, por sus múltiples ventajas. 
 
23 
HIPÓTESIS. 
 
Si la sinapsina es una proteína que mantiene la organización y abundancia de las vesículas sinápticas 
claras en la poza de reserva, a través de mantener ancladas las vesículas al citoesqueleto y regular la 
disponibilidad de vesículas que se fusionan, entonces la sinapsina puede participar en el anclaje de 
cúmulos de vesículas electrodensas que se fusionan en sitios perisinápticos y extrasinápticos regulando 
su movilización hacia la membrana 
OBJETIVOS 
 
Objetivo general 
Estudiar si la sinapsina, participa regulando la secreción de serotonina al mantener a las vesículas 
electrodensas ancladas al citoesqueleto, en la liberación perisináptica y extrasináptica. 
Objetivos específicos. 
Estudiar la participación funcional de la sinapsina en la secreción perisináptica a partir de las vesículas 
electrodensas. 
Determinar si la proteína sinapsina se localiza en sitios extrasinápticos del soma y el axón en asociación 
con vesículas electrodensas. 
 
24 
MATERIAL Y MÉTODOS. 
Aislamiento y cultivo de neuronas. 
El procedimiento para aislar las neuronas ha sido descrito por Dietzel (Dietzel et al., 1986). Las neuronas 
de Retzius se aislaron del sistema nervioso central de sanguijuelas Hirudo sp. Adultas. Las sanguijuelas 
fueron anestesiadas con una solución de etanol al 8%. La cadena ganglionar se sujetó con alfileres aun 
plato con fondo de sylgard. Las cápsulas ganglionares se abrieron con pinzas para exponer los somas 
neurales, después de abrir la capsula del ganglio se incubó 1 hora a 19°C con enzimas proteolíticas, 
colagenasa y dispasa 2mg/ml (Roche). Las neuronas de Retzius fueron identificadas visualmente por su 
tamaño y localización dentro del ganglio, cada neurona individualmente fue removida a través de una 
pipeta de vidrio aplicando succión. Las neuronas se enjuagaron varias veces con medio estéril para 
eliminar los detritos y microorganismos contaminantes y se sembraron en platos de cultivo (Falcon) con 
fondo de vidrio pretratadas con concanavalina-A 2ml/ml (SIGMA) como sustrato (18-20°C), 
complementado con 2% de suero bovino fetal (Gibco) inactivado por calor, 6mg/ml de glucosa y 0.1 
mg/ml de gentamicina. 
25 
Figura 7 Aislamiento de neuronas identificadas de un ganglio segmental de sanguijuela. Se pueden identificar neuronas 
individuales por su tamaño y localización. Las neuronas de Retzius se marcan con una R. La pipeta está aislando una 
neurona mecanosensorial sensible a presión (Tomado de Dietzel et al; 1986) 
 
Estimulación eléctrica- registro intracelular. 
Para la estimulación y registro intracelular se utilizaron microelectrodos con una resistencia de 15 a 25 
megaohms, hechos a partir de capilares de vidrio de borosilicato, elaborados con un cortador P97 (Sutter 
Instrumentes, Novato, CA). Para invertir el gradiente transmembranal de las neuronas de Retzius, los 
electrodos fueron llenados con KCl 3M. Los registros eléctricos fueron amplificados por un amplificador 
Axoclamp-2B (Axon Instrumentes, Union City, CA) en modo de fijación de corriente, conectado a un 
convertidor analógico digital Digidata 1200 (Axon Instruments) a una frecuencia de muestreo de 20 KHz. 
Usando el software pCLAMP9 (Axon Instruments), los datos fueron almacenados en una PC. El potencial 
de membrana fue mantenido en -60mV por inyección de corriente directa. El protocolo de estimulación 
consistió en aplicar un tren de 10 potenciales de acción producidos por la inyección de 20ms de pulsos 
de corriente a una frecuencia de 10Hz, usando un estimulador S88 conectado a una unidad de 
aislamiento SIU5 (Grass Instruments, West Warwick, RI). 
26 
Inmunodot. 
Se homogenizó por alta velocidad (52000rpm) el tejido del sistema nervioso central de la sanguijuela, 
ganglios cerebroide y esofágico de caracol, e hipocampo de rata. En solución buffer pH 7.2. Se cargaron 
las muestras en una membrana de nitrocelulosa (BIORAD, poro de 0.22 micras) activada previamente en 
solución PBS con 20% de metanol pH 7.2, durante 15min. El bloqueo de sitios inespecíficos se llevó a 
cabo sumergiendo la membrana en solución PBS 10mM 0.9% NaCl ,0.3% tween -20 (BIORAD) con 3.5% 
de leche en polvo, pH7.2 durante 1 hora en agitación constante a temperatura ambiente. Se incubó el 
anticuerpo primario hecho en cabra contra sinapsina (Santa Cruz, sc-8295) durante 24 hrs. a 4°C en 
agitación constante. Posterior a los lavados, se incubo el anticuerpo secundario producido en burro 
contra cabra, el cual esta conjugado con peroxidasa de rábano (Santa Cruz, sc-2020) durante 2h en 
agitación constante a temperatura ambiente. Se detectó la marca por quimioluminiscencia captada por 
una placa fotográfica ultrasensible Kodak. 
Fenómeno de autoinhibición como bioensayo. 
Para conocer la participación de la sinapsina en el anclaje de las vesículas electrodensas perisinápticasutilizamos la respuesta de autoinhibición como bioensayo, ya que es proporcional a la cantidad de 
serotonina liberada en la terminal nerviosa. Medimos la integral de la respuesta de autoinhibición 
después de un tren de diez impulsos a 10Hz, invertida y amplificada por la inyección intracelular de cloro. 
Análisis Estadístico 
Se midió el área bajo la curva de cada registro electrofisiológico con el software pclamP9.0, los datos 
fueron exportados a GraphPad Prism 9.0. Se aplicó la prueba de Pearson-Omnibus para comprobar la 
distribución de normalidad para los grupos de datos. Los resultados fueron mostrados como media ± 
error estándar de la media. Se realizó la prueba t de student, con un nivel de confianza del 95% para 
comparar la diferencia de los grupos experimentales con el grupo control. 
27 
Figura 8 Fenómeno de autoinhibición como bioensayo. (A) Registro intracelular con un electrodo lleno de KAc. La 
respuesta de autoinhibición se observa como una hiperpolarización después del tren de impulsos (Flecha azul). (B) 
Registro intracelular con un electrodo lleno de KCl. La respuesta de autoinhibición se observa como una despolarización 
porque se invirtió el gradiente transmembranal de cloro (flecha verde). En rojo se muestra el área bajo la curva de la 
respuesta. (Modificado de Cercós, et al; 2009) 
 
Inmunofluorescencia 
El cultivo primario de neuronas de Retzius fue procesado para identificar a través de la técnica de 
inmunofluorescencia la distribución subcelular de las proteínas sinapsina y sinaptofisina. Las neuronas 
fueron fijadas con paraformaldehído 4% durante 30min. Enseguida se procedió a realizar 3 lavados con 
PBS al 0.1%. Posteriormente se procedió a permeabilizar la membrana y bloquear sitios inespecíficos, 
manteniendo las neuronas durante 30 min. en una solución de PBS con triton x-100 y albumina de suero 
bovino 3%. Se incubaron los anticuerpos primarios burro anti-sinapsina (santa cruz) en una dilución de 
trabajo 1:500 así como cabra anti-sinaptofisina (santa cruz) 1:300, las neuronas fueron incubadas en esta 
solución durante 24 horas en agitación constante a 4°C. Posteriormente, el cultivo fue sometido a varios 
lavados con solución PBS, para incubar los anticuerpos secundarios Alexa 488 anti-burro 1:200 y Alexa 
633 anti-cabra 1:300. Por último, las células fueron sometidas a lavados con PBS para retirar el exceso de 
28 
anticuerpo secundario. Las muestras fueron montadas en medio de montaje DAKO, y se colocó un 
cubreobjetos. 
Un grupo de células fue estimulado eléctricamente previo a la fijación con trenes de 10 impulsos a 20 Hz. 
Adquisición y análisis de imágenes de fluorescencia. 
Las imágenes fueron adquiridas en el microscopio confocal meta 500 Zeiss con un objetivo EC Plan-
Neofluar 63x, con apertura numérica de 1.25, de inmersión en aceite. Los fluoróforos fueron excitados 
de manera secuencial con una longitud de onda de 488 nm para identificar a la sinapsina y 633 nm para 
identificar la sinaptofisina. La emisión fue adquirida en los rangos de 497-561 y 657-711 
respectivamente. Las imágenes fueron digitalizadas en una matriz de 512 x 512 pixeles y almacenadas en 
una PC. Se adquirió una secuencia de imágenes en distintos planos focales para cada neurona, 
aproximadamente cada 1.5 µm. El procesamiento y análisis de las secuencias de imágenes se realizó 
utilizando los programas de cómputo Image J (NIH, USA), Igor Pro (Wavemetrics, USA) y GraphPad Prism 
9.0. 
Con el programa image J se seleccionaron las regiones de interés que corresponden a los puntos de 
fluorescencia para cada proteína. Se obtuvieron los valores de intensidad de fluorescencia, el área, así 
como las coordenadas en X y en Y de cada región 
Los datos obtenidos fueron graficados con el programa Igor Pro, donde se utilizó una rutina semi-
automática escrita por la Dra. Citlali Trueta Segovia, para obtener los mapas de distribución de ambas 
marcas, que representan la localización de las proteínas, en dos condiciones diferentes: cuando no 
fueron estimuladas eléctricamente y cuando fueron estimuladas eléctricamente con un tren de 10 
impulsos a 20 Hz. Con esta rutina se obtuvo: el promedio del número de puntos fluorescentes para cada 
una de las marcas (la sinapsina y la sinaptofisina), de los dos grupos de neuronas (no estimuladas y 
estimuladas a 20Hz), el promedio se obtuvo sumando el número de puntos de cada rebanada óptica de 
los diferentes planos focales de la misma neurona y se dividió entre el número de neuronas por grupo; la 
fluorescencia normalizada (la intensidad de fluorescencia menos el fondo, divido entre el área) y el 
porcentaje de colocalización entre amabas proteínas. Para obtener más información de las marcas 
fluorescentes el análisis se dividió considerando dos regiones morfológicas, el soma y el muñon axonal. 
 
29 
RESULTADOS 
La sinapsina está presente en el sistema nervioso de la sanguijuela. 
El primer paso en nuestra investigación fue detectar a la proteína sinapsina en el sistema nervioso de la 
sanguijuela. Cabe mencionar que hasta el momento no existen datos bibliográficos donde describan que 
la sinapsina lleve a cabo funciones fisiológicas en el sistema nervioso de este invertebrado. A través de la 
técnica de inmunodot verificamos que la sinapsina sí está presente en el sistema nervioso de este 
invertebrado (Figura 9A), posiblemente cumpliendo alguna función fisiológica. En la Figura 9 se muestra 
el inmunodot, en el cuál están presentes muestras del tejido nervioso homogenizado de: el sistema 
nervioso de la sanguijuela (Figura 9A), el hipocampo de rata (Figura 9B), los ganglios de caracol, 
cerebroide (Figura 9C) y subesofágico (Figura 9D). Estas últimas tres muestras se usaron como controles 
positivos ya que se ha identificado la presencia de esta proteína en los mismos; a su vez se usó muestra 
del tejido homogenizado de hipocampo de rata donde se omitió el anticuerpo primario, esta muestra fue 
usada como control negativo (Figura 9E). Los resultados de este trabajo fueron posibles por el apoyo de 
la Dra. Martha León-Olea y del Dr. René Garduño-Gutiérrez del departamento de Neuromorfología 
funcional, división de investigaciones en Neurociencias del Instituto Nacional de Psiquiatría “Ramón de la 
Fuente Muñiz”. Una vez que comprobamos la presencia de la sinapsina en el SNC de la sanguijuela, 
procedimos a estudiar su posible participación funcional en las terminales nerviosas de las neuronas 
serotonérgicas de Retzius de la sanguijuela, donde la sinapsina podría participar regulando la liberación 
de serotonina a partir de vesículas electrodensas, las cuales liberan su contenido en sitios perisinápticos, 
como se describe a continuación. 
Figura 9. Presencia de la sinapsina en el sistema nervioso central de diferentes organismos. (A) Reacción específica, del 
reconocimiento de la sinapsina en una muestra del homogenizado del SNC de la sanguijuela. La misma reacción se 
observa en (B) hipocampo de rata, (C) ganglio cerebroide de caracol, y (D) ganglio subesofágico de caracol. (E) 
Hipocampo de rata incubado sin anticuerpo primario como control negativo. 
 
30 
Participación de la sinapsina regulando la liberación se serotonina en 
sitios perisinápticos a partir de vesículas electrodensas. 
Para estudiar si la sinapsina podría estar regulando la liberación de serotonina a partir de vesículas 
electrodensas perisinápticas, utilizamos como bioensayo la autoinhibición que produce la serotonina al 
ser liberada en las terminales sinápticas. La serotonina liberada se une a autorreceptores acoplados a 
canales de cloro, que en condiciones fisiológicas producen una hiperpolarización después de la 
estimulación eléctrica. Esta respuesta puede ser invertida inyectando cloruro a la célula con un electrodo 
lleno de cloruro de potasio, que además amplifica la respuesta. Para estos experimentos utilizamos la 
respuesta invertida y medimos el área bajo la curva,como una medida indirecta de la cantidad de 
serotonina que liberó la propia neurona después de un tren de 10 impulsos a 10 Hz. 
Para conocer la contribución de la serotonina que proveen las vesículas electrodensas a la respuesta de 
autoinhibición, bloqueamos los canales de calcio tipo L, necesarios para la secreción de serotonina de 
vesículas electrodensas, pero no para las vesículas claras en presencia de nimodipina 10 µM. En 
presencia de nimodipina, la respuesta fue 59 ± 3.7% (n=8), sugiriendo que este es el porcentaje de 
contribución de las vesículas electrodensas perisinápticas a la respuesta de autoinhibición (Figura 10 A y 
D). 
Para conocer la contribución de la poza sináptica liberable a la respuesta de autoinhibición, bloqueamos 
tanto la liberación perisináptica como la movilización de la poza de reserva. Esto último se hizo 
inhibiendo la fosforilación de la sinapsina al bloquear la CaMKII con KN-93 10 µM. En esta condición la 
respuesta disminuyó 84 ± 3.1% (n=9), mostrando que el 16% restante se debe a la serotonina que provee 
la poza liberable de vesículas claras (Figura 10 B y D). 
Si en promedio el 59% de la respuesta la proveen las vesículas electrodensas perisinápticas y el 16% la 
poza liberable, entonces el 30% restante debe proveerlo la poza de reserva. Sin embargo, al inhibir 
únicamente la fosforilación de la sinapsina, no solo se bloqueó el 30% esperado. La respuesta disminuyó 
38%. Este resultado siguiere que no sólo se inhibe la movilización de la poza de reserva de las vesículas 
claras, sino también un porcentaje de vesículas electrodensas (Figura 10 C, D y E). 
 
31 
 
A 
B 
e 
D 
..... , 
e,,,,,, 
Nkr IlIiplrtl 
• KJrj·'l 
32 
Figura 10. Participación de la sinapsina regulando la liberación de serotonina a partir de vesículas electrodensas 
persinápticas. Registros electrofisiologicos donde se muestra la respuesta de autoinhibición como indicador de la 
cantidad de serotonina liberada en las terminales nerviosas, producida por un tren de 10 impulsos a 10 Hz, en 
diferentes condiciones experimentales. (A) Comparación de un registro control (negro) y después de bloquear los 
canales de calcio tipo L con Nimodipina 10µM para bloquear la secreción perisináptica (rojo) en la misma neurona de 
Retzius. (B) Comparación de un registro control (negro) y después de bloquear simultáneamente los canales de calcio 
tipo L y la fosforilación de la sinapsina (azul) al bloquear la CaMKII con KN-93 10µM para impedir la fosforilación de la 
sinapsina y con ello la movilización de las vesículas de la poza de reserva. (C) comparación de un registro control 
(negro) y después de bloquear únicamente la fosforilación de la sinapsina al bloquear a la CaMKII con KN-93 10 µM 
(verde). (D) Integral de la respuesta de autoinhibición normalizada con respecto al control, en las tres condiciones 
experimentales anteriores (media ± error estándar). El bloqueo de la secreción perisináptica disminuyó la respuesta 
de autoinhibición en 59 ± 3.7% (n=8). El bloqueo de CaMKII disminuyó la respuesta en 62 ± 8% (n=11). El bloque 
simultaneo de la secreción perisináptica y de la CAMKII disminuyó la respuesta de autoinhibición en un 84 ± 3.1% 
(n=9), mostrando que la serotonina secretada por las vesículas de la poza liberable contribuye aproximadamente en 
15% de la respuesta. El hecho de que el KN-93 bloqueó una porción de la respuesta mayor que la esperada para la 
poza de reserva de vesículas claras sugiere que el bloqueo de la CAMKII bloquea parcialmente la secreción 
perisináptica * P˂ 0.5 Prueba t de student. (E) La barra representa los porcentajes de contribución de cada tipo de 
poza vesicular. En rojo la contribución de vesículas electrodensas perisinápticas, en azul la contribución de vesículas 
claras de la poza liberable, en blanco la porción que corresponde a vesículas claras de la poza de reserva. Las 
diagonales verdes señalan la proporción de disminución a la respuesta, cuando se inhibe la fosforilación de la 
sinapsina, se esquematiza como disminuye un porcentaje de vesículas electrodensas perisinápticas 
 
 
33 
La sinapsina se localiza en sitios extrasinápticos en neuronas 
serotonérgicas de Retzius. 
Como observamos que la sinapsina participa regulando la liberación de serotonina de un porcentaje de 
vesículas electrodensas en sitios perisinápticos, el siguiente paso fue explorar su localización en sitios 
extrasinápticos. Para ello realizamos la técnica de inmunofluorescencia contra la sinapsina en neuronas 
de Retzius en cultivo. La Figura 11, esta figura muestra una reconstrucción tridimensional a partir de una 
serie de imágenes confocales de una neurona de Retzius. En la reconstrucción se puede observar como 
la sinapsina no solo está presente en la punta del muñon axonal, sino también en el soma y a lo largo del 
muñon axonal. 
 
 
34 
Figura 11 Reconstrucción tridimensional de una neurona de Retzius, mostrando por inmunofluorescencia la presencia 
y distribución sub-celular de la sinapsina. En la figura izquierda se muestra la reconstrucción tridimensional de una serie 
de imágenes confocales de una neurona que muestra inmunoreactividad específica de la sinapsina (verde). La sinapsina 
se localiza en el soma así como a lo largo del muñon axonal y particularmente en la transición entre estas dos 
estructuras. En la parte superior se observa la misma reconstrucción rotando cada 20°. Barra escalar = 20 µm. 
 
35 
Cambios en la distribución de la sinapsina al evocar la liberación 
extrasináptica 
La síntesis de la sinapsina se lleva a cabo en el cuerpo de la neurona y la sinapsina se transporta a las 
terminales nerviosas. Para mostrar que la sinapsina se localiza en el soma por tener una posible función 
en la liberación de serotonina y no estar presente únicamente por ser el sitio de síntesis de la sinapsina; 
y en el muñon axonal por estar transportándose a la terminal nerviosa. Como parte de la estrategia 
experimental previo a la técnica de inmunofluorescencia estimulamos eléctricamente a un grupo de 
neuronas (n=3) con un electrodo intracelular con un tren de 10 impulsos a una frecuencia de 20Hz, con 
el objetivo de estimular la exocitosis y poder comparar la distribución de la sinapsina con el grupo de 
neuronas que no fueron estimuladas previo a la inmunofluorescencia (n=6). Además de marcar por 
inmunofluorescencia a la sinapsina, también se realizó el marcaje por inmunofluorescencia contra la 
sinaptofisina (se utilizó a la sinaptofisina como marcador de las vesículas, por ser una proteína integral 
de estas). Cuando adquirimos en el microscopio confocal las imágenes observamos que para el grupo de 
neuronas no estimuladas, ambas marcas (la sinapsina y la sinaptofisina) se localizaban de manera 
homogénea en el soma distantes de la membrana plasmática, y en el muñon axonal, mientras que al ser 
estimuladas se observó una redistribución de las marcas, localizándose más adyacentes a la membrana 
plasmática (Figura 12). Estas observaciones sugerían que la sinapsina sí podía tener una función en la 
liberación de serotonina en sitios extrasinápticos, quizá regulando la movilización de los cúmulos de 
vesículas electrodensas durante la exocitosis. 
Para estudiar la distribución de la sinapsina, su relación espacial con los cúmulos de vesículas 
electrodensas y el cambio en la distribución de las proteínas al evocar la exocitosis, se cuantificó el 
porcentaje de colocalización entre ambas proteínas en ambas condiciones (neuronas no estimuladas y 
neuronas estimuladas a 20 Hz). 
 
36 
 
Figura 12 Redistribución de las marcas fluorescentes de las proteínas sinapsina (verde) y sinaptofisina (rojo) al 
estimular electricamente a 20 Hz. Se observan neuronas de Retzius de la sanguijuela en dos condiciones, cuando no 
fueron estimuladas eléctricamente (neuronas a la izquiera) y cuando se estimularon a una frecuencia de 20 Hz (derecha). 
Cada neurona corresponde a lasobreposición de una serie de 8 imágenes confocales adquiridas cada 1.4 µm en el eje Z. 
En ambas proteínas se observa una redistribución de las marcas, localizándose más adyacentes a la membrana 
plasmática, al estimular la liberación extrasináptica. Barra escalar = 20 µm. 
 
 
37 
Colocalización entre la sinapsina y la sinaptofisina en neuronas 
serotonérgicas 
Actualmente sabemos que la sinapsina es una proteína asociada a vesículas sinápticas en estado de 
reposo, se ha descrito que la sinapsina mantiene a las vesículas agrupadas y unidas al citoesqueleto en la 
poza de reserva, en la terminal presináptica. En nuestra hipótesis esperábamos que la sinapsina y la 
sinaptofisina coexistieran en el mismo sitio, al menos en la terminal nerviosa, donde se ha descrito en 
particular esta función, y que hasta el momento no se ha estudiado en la secreción extrasináptica. Para 
explorar está posibilidad, evaluamos la relación espacial entre las marcas fluorescentes de la sinapsina y 
la sinaptofisina, a través del análisis de colocalización de las imágenes que se adquirieron en el 
microscopio confocal (ver métodos). Es generalmente aceptado que la localización y la función fisiológica 
de una proteína están estrechamente relacionadas (Bolte and Cordelières, 2006).En esta preparación y 
en otras, se ha demostrado una compartamentalización funcional con respecto a la cantidad y dinámica 
de liberación de los neurotransmisor que secreta una neurona a partir de diferentes regiones 
morfológicas como el soma, el axón y las terminales presinápticas. Para obtener un análisis más 
detallado consideramos la compartamentalización funcional y separamos el análisis en dos regiones 
morfológicas de la neurona: el soma y el axón primario 
El porcentaje de colocalización en el muñon axonal incluyendo la punta fue de 37±2.6, en el soma el 
porcentaje fue de 13±1.8 (media ± error estándar, Figura 16). Estos resultados apoyan la teoría qué en 
estado de reposo, la sinapsina mantiene ancladas a las vesículas con el citoesqueleto. El porcentaje de 
colocalización en el muñon es mayor que en el soma. El hecho de que haya colocalización en el soma 
habré la posibilidad a que la sinapsina regule la liberación de serotonina a partir de vesículas 
electrodensas en estos sitios. 
Cambios en la colocalización al evocar la liberación extrasináptica 
En un segundo grupo de neuronas que fueron estimuladas eléctricamente previo a la 
inmunofluorescencia para evocar la liberación de serotonina extrasináptica se cuantificaron los 
porcentajes de colocalización entre la sinapsina y la sinaptofisina en el soma y en el muñon axonal. El 
porcentaje de colocalización en el soma fue de 18±2.6 y en el muñon axonal 53±11. Los resultados 
mostraron una tendencia a incrementar la colocalización con respecto al grupo de neuronas que no 
fueron estimuladas eléctricamente. Estos resultados son contradictorios con nuestra hipótesis, ya que se 
esperaba que al evocar la liberación de serotonina, el porcentaje de colocalización fuera menor que el 
porcentaje de colocalización del grupo de neuronas que no fueron estimuladas eléctricamente, porque la 
sinapsina en estado de reposo se asociaría con vesículas electrodensas por mantenerlas unidas al 
38 
citoesqueleto, al evocar la liberación de serotonina estimulando a la neurona eléctricamente y activar 
canales de calcio; la sinapsina sería fosforilada por la cinasa dependiente de calcio y calmodulina, como 
resultado cambiaría su estructura conformacional y en consecuencia dejaría de anclar a las vesículas 
electrodensas para que se movilicen a la membrana plasmática y se fusionen, sin embargo estos 
resultados abren la posibilidad de considerar una asociación funcional diferente. 
 
Figura 13 Gráfica de barras de los porcentajes de colocalización entre las proteínas sinapsina y sinaptofisina en 
neuronas serotonérgicas de Retzius en dos regiones morfologicas: el soma y el muñon axonal, en dos condiciones 
experimentales: cuando no se estimularon electricamente (barras lilas) y cuando las neuronas de Retzius fueron 
estimuladas con un tren de 20 Hz previo a la inmunofluorescencia (barras moradas). En la gráfica se observan barras 
que indican el promedio de los porcentajes de colocalización entre las proteínas. En el soma los porcentajes de 
colocalización son menores que en en el muñon axonal. En el grupo de neuronas que fueron estimuladas a 20 Hz, la 
colocalización fue mayor tanto en el soma como en el muñon axonal. 
Espacio 
39 
Figura 14 Inmunofluorescencia de la sinapsina (verde) y la sinaptofisina (rojo) en una neurona de Retzius 
inmunomarcada con alexa 488 (verde) y Cy5 (rojo) que fue estimulada a 20Hz. (A) Rebanada óptica del plano ecuatorial 
de una neurona de Retzius, se observa la distribución y localización de ambos inmunomarcadores, concentrandose 
ambas marcas adyacentes a la membrana plásmatica del soma y del muñon axonal, en algunos sitios se observa 
colocalización entre las proteínas como se destaca en los cuadros blancos en el soma de la neurona. (B) Se muestra la 
colocalización de tres sitios en el soma de la neurona con un aumento del 200%, que corresponden a los cuadros blancos 
de la Figura 14 A. Barra escalar = 20 µm 
 
40 
Incremento en el número de puntos fluorescentes al evocar la exocitosis 
Para continuar investigando la relación entre la sinapsina y los cúmulos vesiculares analizamos las 
características de las marcas fluorescentes por separado (de la sinapsina y la sinaptofisina). En el 
programa de image J se seleccionaron manualmente como regiones de interés los puntos fluorescentes 
de las marcas para ambas proteínas. Se cuantificó el número de puntos fluorescentes, la intensidad de 
fluorescencia específica y el diámetro de cada punto fluorescente (ver métodos). Para detallar más el 
análisis, distinguimos dos regiones morfológicas de la misma neurona: el soma y el muñon axonal. 
Para el grupo de neuronas que no fueron estimuladas eléctricamente (n=6), el promedio del número de 
puntos fluorescentes en el soma fue de 482 ± 48, en el grupo de neuronas que fueron estimuladas a 20 
Hz (n=3) el número de puntos fue mayor, 677 ± 87. En el muñon axonal de las neuronas que no fueron 
estimuladas eléctricamente el promedio fue de 403 ± 41 y en el grupo de neuronas estimuladas el valor 
fue de 544±20. Para el caso de las marcas de sinaptofisina, se observaron las mismas tendencias, es 
decir, el número de marcas fluorescentes fue mayor tanto en el soma como en el muñon axonal en el 
grupo de neuronas que fueron estimuladas a 20 Hz. En el soma el número de puntos fluorescentes para 
la marca de sinaptofisina fue de 463±85 en el grupo de neuronas no estimuladas y 521± 85 en el grupo 
de neuronas estimuladas. Para el caso del muñon axonal, el promedio del número de puntos 
fluorescentes para la marca de sinaptofisina en las neuronas no estimuladas fue de 128±27, mientras 
que en el grupo de neuronas estimuladas a 20 Hz el valor fue de 299±52. 
En resumen, encontramos un incremento en el número de puntos fluorescentes en el grupo de neuronas 
en las que se estimularon a 20 Hz, comparado con el grupo de neuronas que no fueron estimuladas 
eléctricamente, en ambas regiones morfológicas. Para la sinapsina (Figura 15E), el incremento fue mayor 
en el soma, casi 30% más; mientras que para la sinaptofisina (Figura 16E), casi no hubo diferencias en el 
número de puntos fluorescentes para esta región, pero sí se observó una marcada tendencia a 
incrementar el número de puntos fluorescentes en el muñon axonal (más del 50%). Esta relación se 
puede observar a detalle en las Figuras 15 C, D y 16 C, D. Para explicar este aumento proponemos que la 
marca con menor cantidad de puntos fluorescentes, (el grupo de las neuronas no estimuladas) las 
proteínas sinapsina y sinaptofisina se localizan distantes entre sí mientras que al evocar la liberación y 
agruparse, es decir, cuando las marcasfluorescentes se concentran, pueden ser cuantificadas y 
distinguirse como marca especifica. Esta hipótesis, se ve favorecida porque en el análisis observamos un 
incremento en el diámetro de los puntos fluorescentes, como se detalla a continuación 
41 
Figura 15 Inmunofluorescencia de la sinapsina en neuronas identificadas. (A,B) corresponden a imágenes confocales 
del plano ecuatorial de dos neuronas representativas de Retzius, que muestran inmunofluorescencia de la sinapsina 
(verde) en dos condiciones: a la izquierda una neurona que no fue estimulada electricamente previo a la 
inmunofluorescecia y a la derecha una neurona que fue estimulada a 20 Hz. Barra escalar = 20 µm (C,D) Acercamiento de 
los somas de las imágenes A y B; en círculos rojos se muestran los puntos fluorescentes que marcan la localización de la 
sinapsina. Barra escalar = 5 µm. (E) Promedio del número de puntos fluorescentes. (F) promedio de la fluorescencia 
especifíca (unidades arbitrarias) 
E F 
B • o " • '" " ! • .[ ;¡ 
~ • ,;. • o ~ • • ~ • ~ ~ 
~ 
42 
Figura 16 Inmunofluorescencia de la sinaptofisina en neuronas identificadas. (A,B) corresponden a imágenes confocales del 
plano ecuatorial de las neuronas de Retzius, que muestran inmunofluorescencia de la sinaptofisina (rojo). Barra escalar = 20 
µm (C,D) Acercamiento del soma de la imagen A y B, en círculos amarillos se muestran los puntos fluorescentes. Barra escalar = 
5 µm. (E) promedio del número de puntos fluorescentes para el soma y para el muñon axonal. (F) promedio de la fluorescencia 
especifica (unidades arbitrarias) 
No Estimuladas Estimuladas a 20 Hz 
E F 
• , -~ '" -~ ~ "- ~ l! o 
o 
~ > • ~ 
~ o • 
43 
Concentración de los puntos fluorescentes al evocar la exocitosis 
Además del número de marcas fluorescentes, se consideraron y evaluaron otros parámetros, para tener 
más elementos, que pudieran mostrarnos el comportamiento de la proteína sinapsina y su participación 
en la exocitosis de los cúmulos de vesículas electrodensas, que fueron identificados a través de la 
proteína sinaptofisina, dentro de esos parámetros consideramos evaluar el diámetro de las marcas y la 
intensidad de fluorescencia, estas medidas representan de manera indirecta la cantidad de proteína que 
ha sido reconocida por el anticuerpo. 
Cuando realizamos histogramas de frecuencias con los valores obtenidos del diámetro de los puntos 
fluorescentes, para las marcas de sinapsina y sinaptofisina, resulto interesante observar, que al evocar la 
exocitosis, hay un incrementó en el diámetro de las áreas fluorescentes, tanto para la sinapsina (Figura 
14) como para la sinaptofisina (Figura 15), este cambio está acompañado de una tendencia a aumentar 
la fluorescencia, en el soma y en el muñon axonal, para ambas marcas (Figura 12F y 13F). En el soma 
cuando las neuronas no fueron estimuladas eléctricamente, el valor para el diámetro más frecuente fue 
de 0.9 µm, y al evocar la exocitosis incrementó a 1.2 µm, como consecuencia disminuyó la frecuencia 
para el valor de 0.9 µm y los valores por debajo de este. El mismo comportamiento se observó en el 
muñon axonal, para ambas marcas. Proponemos que este efecto probablemente se debe a que las 
proteínas se encontraban distantes entre sí cuando las neuronas no fueron estimuladas eléctricamente, 
y tenían una intensidad de fluorescencia baja que pudo haberse considerado como ruido. Y ante la 
estimulación, cuando se promueve la secreción, las proteínas se concentran y por ello aumenta el 
tamaño de las marcas, que se ve reflejado en el incremento del diámetro de las marcas fluorescentes. 
Esta hipótesis se ve reforzada, porque además hay una tendencia a incrementar la fluorescencia 
44 
Figura 17 Incremento en el diámetro de los puntos fluorescentes de sinapsina en el grupo de neuronas que fueron 
estimuladas a 20 Hz 
Figura 18 Incremento en el diámetro de los puntos fluorescentes de sinaptofisina en el grupo de neuronas que fueron 
estimuladas a 20 Hz 
 
45 
La sinapsina y la sinaptofisina se desplazan hacia la membrana 
plasmática al estimular eléctricamente a 20 Hz 
A pesar de que el porcentaje de colocalización para la sinapsina y la sinaptofisina es relativamente bajo 
(Figura 16). Al analizar la distribución de las marcas, limitando el análisis al soma de las neuronas de 
Retzius, en ambas condiciones (cuando no fueron estimuladas eléctricamente y cuando lo fueron). 
Observamos un cambio de distribución al evocar la exocitosis, tanto para la sinapsina como para la 
sinaptofisina, (indicador de la localización de los cúmulos vesiculares). Esto se demostró trazando rectas 
del centro del soma de la neurona, hacia el límite de la membrana plasmática, sobre los mapas de 
distribución (Figura 18A). Asignamos una escala arbitraria de 0% al centro y 100% de la distancia, a la 
membrana plasmática. Generamos histogramas de frecuencia en los que consideramos como un evento 
cada vez que la marca está en contacto con la recta y a qué distancia. Para el caso del grupo que las 
neuronas que no fueron estimuladas eléctricamente (n=6) la distribución de las marcas es más 
homogénea entre el centro y la membrana, en comparación con el grupo de neuronas que fueron 
estimuladas eléctricamente a 20Hz. Las marcas para estas neuronas se caracterizaron porque la mayor 
frecuencia de distribución se concentró entre el 80 y 100% de la distancia. 
 
46 
Figura 19 Distribución de las marcas de las proteínas sinapsina (verde) y sinaptofisina (rojo). (A) neuronas 
representativas, de los grupos de neuronas que no fueron estimuladas (a la izquierda) y el grupo que si lo fue (a la 
derecha,) se muestra sobre los mapas el contorno del soma en negro y 12 trazos representativos del centro hacia el 
exterior de la membrana plasmática, sobre los que se generaron histogramas de frecuencias (B) de la distribución de la 
sinapsina y la sinaptofisina, cuando no fueron estimuladas (n=6) y cuando fueron estimuladas eléctricamente a una 
frecuencia de 20 Hz (n=3) 
A 
• < 
a 
2 
;;; 
B 
• < 
• 
~ • < 
~ 
• < 
' '; 
~ o 
~ 
• < 
~ 
, 
r 
, 
o 
l' 
¡: 
No Estimuladas Estimuladas 20 Hz 
No Esti muladas Estimuladas 20 Hz 
l ' 
1 : 
- - - - - - - - - - -- ,-- - ._-
¡: 
- --
47 
DISCUSIÓN 
En este trabajo mostramos que la proteína sinapsina se encuentra presente en el sistema nervioso de la 
sanguijuela regulando la liberación de serotonina que está almacenada en vesículas electrodensas que 
liberan su contenido en sitios perisinápticos en neuronas serotonérgicas de Retzius. También mostramos 
su localización y cambio de distribución al evocar la liberación en sitios extrasinápticos. 
La sinapsina, una proteína conservada filogenéticamente. 
Se confirmó la expresión de la proteína sinapsina en el sistema nervioso de la sanguijuela. Este es el 
primer trabajo en que se muestra la presencia de la sinapsina en la sanguijuela, a través de la técnica de 
Inmunodot. Este resultado apoya la hipótesis del gen ancestral de la sinapsina, el cual señala que hay un 
gen que codifica para la sinapsina en invertebrados (Humeau et al., 2011). Es importante recordar que la 
sinapsina I es la sinapsina que contiene el dominio D, que al ser fosforilado por la CaMKII, genera el 
mayor cambio conformacional y la función de anclar las vesículas al citoesqueleto. La sinapsina, presente 
en invertebrados se asemeja a la sinapsina I, por los estudios reportados. Su presencia en la sanguijuela 
confirma que es una proteína efectora con gran relevancia fisiológica y evolutiva. 
Participación de la sinapsina en la secreción perisináptica 
El registro intracelular de neuronas de Retzius en diferentes condiciones experimentales y utilizar la 
respuesta de autoinhibición como bioensayo permitió estudiar la función de la sinapsina en la regulación 
de las vesículas electrodensas que liberan serotonina en sitios perisinápticos. Determinamos que la 
sinapsina mantiene a un porcentaje