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Universidad Nacional Autónoma de México 
 
Facultad de Estudios Superiores Iztacala 
 
 
Participación de La Vía De Señalización Sonic Hedgehog y Su 
Regulación Epigenética En Células Tipo Stem 
QuimioResistentes del Cáncer Pulmonar 
 
TESIS 
Que para obtener el título de Licenciado en Biología 
PRESENTA: 
Oscar Omar Solís Castro 
 
Director de tesis: 
Dr. Federico Ávila Moreno 
Unidad de Biomedicina (UBIMED) Laboratorio 12 
 
 Tesis realizada con el financiamiento del proyecto UNAM, DGAPA-PAPIIT: IB202512 
 
 
Los Reyes Iztacala, Edo. de México Mayo 2013 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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Director de Tesis 
Dr. Federico Ávila Moreno 
 
Asesores de Tesis 
Dr. Santiago Martínez Calvillo 
Dra. Patricia Piña Sánchez 
Dra. Yolanda Irasema Chirino López 
Dr. Jorge Eduardo Campos Contreras 
Sinodales 
 
Presidente: 
 
Dr. Santiago Martínez Calvillo 
Vocal: 
 
Dra. Patricia Piña Sánchez 
Secretario 
 
Dr. Federico Ávila Moreno 
Suplente: 
 
Dra. Yolanda Irasema Chirino López 
Suplente: 
 
Dr. Jorge Eduardo Campos Contreras 
 
 
 
 
En memoria de mis abues, Carlos Castro y Adela Cupertino, mis ejemplos de amor, fortaleza 
y perseverancia, es un orgullo descender de ustedes. 
 
Agradecimientos 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, mi Alma Mater durante mi formación 
profesional y la que me ha brindado conocimientos y oportunidades. 
A la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, la cual ha sido mi casa durante mi formación, donde 
conocí a mi nueva familia y donde he aprendido lo poco que se dé la vida. 
Al Dr. Federico Ávila, quien me ha guiado a lo largo de esta última etapa en mi formación 
profesional, por su dedicación, consejos, confianza y la oportunidad de pertenecer a su grupo de 
investigación en el cual realicé este trabajo. 
A mis tutores de licenciatura, el Dr. Ignacio Peñalosa y el Dr. Santiago Martínez junto con sus 
grupos de investigación, por darme la oportunidad de aprender de ellos durante mis inicios en la 
investigación. 
A mis sinodales, la Dra. Patricia Piña, la Dra. Yolanda Chrino, el Dr. Jorge Campos y el Dr., Santiago 
Martínez, por brindarme sus consejos y experiencia durante la revisión de esta tesis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicatoria 
A mis padres y hermanos (Neto, Ivan y Paul), nunca olvidaré el día que me aceptaron a la UNAM y 
les dije que me iría, ese día decidí alejarme para cumplir mis metas y mis sueños a pesar del 
sacrificio que representaba para ustedes y del cual no estaba al tanto en ese momento, no fueron 
testigos de todos mis logros y mis derrotas, de mis alegrías y tristezas o de mi desarrollo en esta 
etapa de mi vida, y a pesar de eso nunca se quejaron ni me limitaron, siempre creyeron en mí y 
siempre me motivaron a seguir adelante, a pensar en grande y nunca rendirme, y por eso tienen 
que saber que en cada uno de esos momentos siempre estuvieron presentes en mi corazón, 
ustedes son mi ejemplo y mi motor, y este último logro es para ustedes, no podría pedir una mejor 
familia, los amo. 
A mi tía Mede, porque para mí no es necesario tener la misma sangre para considerarla parte de 
mi familia, usted se ha convertido en alguien muy especial y ha sido un placer compartir con usted 
esta etapa de mi vida, gracias por su apoyo, siempre estará en mi corazón y pensamientos. 
A Memo y la familia Rios-Naranjo, porque toda carrera se empieza con un paso, gracias por darlo 
conmigo, ustedes me acobijaron y animaron los primeros días lejos de mi hogar y me facilitaron 
las cosas para decidir quedarme y continuar. Gracias por aceptarme en su familia, Memo: tú eres 
un hermano para mí y te deseo lo mejor para ti y tu familia. 
A la bandita (Iram, Hugo, Jorge, Neto, Serene y Edgar), por convertirse en mi familia, compartir 
los momentos importantes y enseñarme que la vida va más allá de lo que se ve en un microscopio, 
gracias por siempre estar conmigo, abrirme las puertas de sus casas, por alegrarse de mis logros 
como si fueran suyos y por ayudarme a levantarme cuando estaba abajo, yo solo espero poder 
estar a la altura de su amistad cuando me necesiten y seguir contando con ustedes por siempre. 
A Sarai, nunca lograré convencerte de lo importante que eres para mí, pero gracias por estar 
conmigo a pesar de todo, tú eres la persona que más me conoce y junto a ti he compartido 
muchas experiencias y momentos importantes en esta etapa, gracias por creer en mí y por tu 
cariño, te quiero. 
A Yutzil, tú fuiste mi principal competencia y también mi principal aliada, y por eso te debo 
muchos de mis méritos académicos. Me alegro de haberte conocido, gracias por permitirme 
compartir momentos importantes contigo, tú has sido especial durante la carrera y aprecio tú 
amistad y compañía, te quiero. 
Al grupo de investigación (Daniel, Mijail, Ana, Carlos y Leonel), por enseñarme y aprender 
conmigo, ha sido un placer convivir con ustedes, ustedes se han convertido en muy buenos amigos 
y les deseo el mejor de los éxitos. 
 
 
"When we try to pick out anything by itself, we find it 
hitched to everything else in the Universe." John Muir. 
 
Índice de contenido 
 
Introducción ........................................................................................................................................ 1 
1.1 Biología del cáncer .............................................................................................................. 1 
1.2 Epidemología del cáncer y cáncer pulmonar ............................................................................ 1 
1.3 Epigenética ................................................................................................................................ 2 
1.4 Aberraciones epigenéticas en cáncer ....................................................................................... 4 
1.5 Células Stem del Cáncer (CSCs) ........................................................................................... 5 
1.6 CSCs y Vía de Señalización Sonic Hedgehog (Hh) ................................................................ 6 
1.7 El Transportador de Membrana ABCG2 .............................................................................. 7 
1.8 El Marcador de Troncalidad BMI1 ....................................................................................... 8 
1.9 CSCs del Cáncer Pulmonar .................................................................................................. 9 
2. Antecedentes Directos .................................................................................................................. 10 
2.1 Regulación Epigenética de los Marcadores ABCG2, BMI-1 y Miembros de la Vía Hh en Cáncer
 ....................................................................................................................................................... 10 
2.2 Expresión de Marcadores Fenotípicos BMI-1, ABCG2 y Hh en Carcinomas Pulmonares ....... 11 
3. Planteamiento del problema ........................................................................................................ 11 
4. Justificación ...................................................................................................................................12 
5. Objetivos ....................................................................................................................................... 12 
5.1 Objetivo general ...................................................................................................................... 12 
5.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................. 12 
6. Materiales y métodos ................................................................................................................... 13 
6.1 Estrategia experimental. ......................................................................................................... 13 
6.2 Cultivo ..................................................................................................................................... 14 
6.3 Conteo Celular ......................................................................................................................... 14 
6.4 Administración de Tratamientos Farmacológicos ................................................................... 14 
6.5 Ensayos de inhibición epigenética mediante el uso de 5-AZA y TSA ...................................... 14 
6.6 Inhibición de la vía de Hh mediante el inhibidor específico de SMO Ciclopamina ................. 15 
6.7 Inhibición de la vía Hh mediante el uso de siRNA anti-Gli1 (iGli1).......................................... 15 
6.8 Ensayos de Viabilidad Celular meidante ensayos de citotoxicidad por MTS .......................... 17 
6.9 Extracción de RNA Total .......................................................................................................... 17 
6.10 Síntesis de cDNA .................................................................................................................... 18 
6.11 Análisis de Expresión del mRNA Mediante RT-PCR en Tiempo Real ..................................... 18 
6.12 Electroforesis ......................................................................................................................... 20 
6.13 Análisis Estadístico ................................................................................................................ 20 
7. Resultados ..................................................................................................................................... 21 
7.1 Evaluación de Modelos Celulares Para el Análisis del Fenotipo Stem-Quimioresistente ....... 21 
7.1.1 Células Resistentes (Sobrevivientes) a Tratamientos Antineoplásicos ............................ 21 
7. 1.2 Viabilidad Celular Bajo Tratamiento Farmacológico ....................................................... 22 
7.1.3 Expresión de la Vía de Sonic Hedgehog y Marcadores de Troncalidad y 
Quimioresistencia...................................................................................................................... 23 
7.1.4 Expresión de la Vía Sonic Hedgehog y Marcadores Asociados a Fenotipo Stem-
Quimioresistente ....................................................................................................................... 24 
7.2 Regulación Epigenética de la Vía Hh y Moléculas Asociadas a Fenotipo Stem-
Quimioresistente. .......................................................................................................................... 25 
7.2 .1 Inducción de la Expresión del RNAm Mediante Inhibidores de Metilación del DNA por 5-
AZA e Inhibidores de Des-Acetilasas de Histonas por TSA. ....................................................... 25 
7.3 Participación de la Vía Sonic Hedgehog en la Función tipo Stem-Quimioresistente. ............. 27 
7.3.1 Análisis de Viabilidad Celular Mediante la Inhibición de la vía de Hedgehog por 
Ciclopamina. .............................................................................................................................. 27 
7.3.2 Efecto de la Inhibición de la Vía Sonic Hedgehog Mediante Ciclopamina sobre la 
Expresión del mRNA de Marcadores Tipo Stem. ...................................................................... 28 
7.3.3 Análisis de Sensibilidad a Fármacos Oncológicos Frente a Inhibición de la Vía Hh por 
Ciclopamina. .............................................................................................................................. 29 
7.3.4 Efecto de la Inhibición de la Vía de Hedgehog (Hh) Mediante el uso de siRNAs (iGli1). . 30 
8. Discusión de resultados. ................................................................................................................ 34 
8.1Resisitencia a fármacos oncológicos por líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar. ..... 34 
8.2 Expresión Inducible de marcadores de troncalidad y quimioresistencia en cáncer pulmonar
 ....................................................................................................................................................... 34 
8.3 Regulación Epigenética de la Vía de Señalización Sonic Hedgehog en la Expresión de 
Marcadores Tipo Stem y Quimioresistencia. ................................................................................ 36 
8.4 Inhibición de la Vía de señalización Sonic Hedgehog .............................................................. 38 
8.4.1 Viabilidad de Células Tumorales ...................................................................................... 38 
8.4.3 Regulación del fenotipo stem .......................................................................................... 39 
9. Conclusiones.................................................................................................................................. 42 
10. Literatura citada. ......................................................................................................................... 44 
Anexo I ............................................................................................................................................... 54 
Tablas con valores normalizados .................................................................................................. 54 
Anexo II .............................................................................................................................................. 59 
Programación del software LightCycler 480® SW1.5 .................................................................... 59 
Anexo III ............................................................................................................................................. 59 
Anexo IV ............................................................................................................................................ 59 
 
Resumen 
El cáncer es una enfermedad multifactorial compleja, responsable del mayor número de muertes 
en el mundo, a este respecto el cáncer pulmonar representa el carcinoma con mayor incidencia y 
mortalidad. Por otro lado algunos de los mecanismos involucrados en los procesos de 
carcinogénesis son los factores epigenéticos como la metilación en dinucleótidos CpG y la 
modificación covalente de histonas. Asimismo distintas evidencias indican que la vía de 
señalización Sonic Hedgehog se encuentra sobre-expresada en cáncer, regulando la expresión de 
marcadores de troncalidad como ABCG2 y BMI-1, que están involucrados en mecanismos de 
quimioresistencia y mantenimiento de células tipo stem del cáncer (CSCs), capaces de promover 
la falta de eficacia terapéutica y permitir los relapsos de la enfermedad. El presente proyecto 
consistió en el estudio de GLI-1, como molécula efectora de esta vía de señalización y su papel 
poco estudiado como regulador del fenotipo stem-quimioresistente en cáncer pulmonar. Se 
utilizaron modelos in vitro de carcinoma pulmonar a los cuales se les evaluaron los niveles de 
expresión de ABCG2, BMI-1-1, GLI-1 y SMO por medio de RT-PCR en tiempo real, posterior a ser 
sujetosa 3 condiciones: i) al estímulo farmacológico mediante el uso de tratamientos 
antineoplásicos, ii) posterior a la inhibición de la vía con el alcaloide Ciclopamina o con el siRNA 
específico para el efector de la vía: GLI-1, y iii) posterior a tratamientos inhibitorios de la 
maquinaria epigenética 5-AZA y TSA. Asimismo para evaluar la participación de la vía en 
quimioresistencia se realizaron ensayos de viabilidad celular por MTS cuando las células fueron 
tratadas con i) Fármacos, ii) con los inhibidores de la vía Ciclopamina o siRNA y iii) con la 
combinación de fármacos e inhibidor. 
 
Se encontró que el perfil de expresión en células sobrevivientes a fármacos corresponde al 
fenotipo de CSCs, asimismo se observó la participación de la metilación del DNA en ABCG2 y SMO. 
Por otro lado los resultados de viabilidad celular tras la inhibición con el siRNA sugieren 
fuertemente la participación de la vía en el fenómeno de quimioresistencia, mientras que el 
análisis de expresión posterior a la inhibición de la vía señala que la vía probablemente regula el 
fenotipo troncal quimioresistente en carcinomas pulmonares y que probablemente lo haga debido 
a su poder regulatorio sobre moléculas marcadoras de troncalidad y quimioresistencia en 
carcinomas pulmonares, con lo que se establece la participación funcional de la vía para en el 
fenotipo stem-quimioresistente en carcinomas pulmonares y se propone como un blanco para 
nuevos acercamientos terapéuticos en contra de carcinomas pulmonares. 
 
Palabras claves: ABCG2, BMI-1, cáncer de pulmón, Cancer Stem cells, Hedgehog. 
 
 
 
Abstract 
Cancer is a complex multifactorial disease, which is the first cause of death worldwide; on this 
regard lung cancer represents the most incident and deathful type of carcinoma. On the other 
hand one of the mechanisms involved on carcinogenesis relies on the epigenetic regulation, such 
as the methylation of CpG dinucleotides and the covalent modification of histones. At the same 
time several evidences indicate the participation of the Hedgehog developmental signaling 
pathway, which is over-expressed in cancer, also known to regulate stem cell markers such as 
ABCG2 and BMI-1 in some types of cancer, these markers are commonly involved in 
chemoresistance and stem cell renewal in cancer stem cells; on this regard these cells are 
responsible of treatment failure and cancer relapse. The aim of the present work was to study GLI-
1 as Hedgehog pathway’s effector molecule and its role as a cancer stem cell regulator in lung 
cancer. In order to decipher such role the relative expression levels by real time RT-PCR of GLI-1, 
ABCG2, BMI-1 and SMO after being exposed to three conditions was evaluated: i) after a 
pharmacological stimulli on the drug surviving cells, ii) after the pathway inhibition either by the 
chemical compound Cyclopamine or by a small interfering RNA (siRNA) and iii) after being treated 
with inhibitors of the epigenetic machinery 5’-Aza or TSA. At the same time, aiming to evaluate 
Hedgehog’s participation in chemoresistance, we analyzed cell viability by the MTS assay when 
cells were treated with: i) pharmacological drugs, ii) with either Cyclopamine or siRNA as pathway 
inhibitors and iii) with the combination of drugs with inhibitors. 
Among the findings it was observed that the expression profile present in the drug survival cells 
corresponds to the CSCs phenotype, we also found the participation of DNA methylation in ABCG2 
and SMO as a regulatory mechanism. On the other hand, the results regarding cell viability after 
the siRNA inhibition clearly sugest the participation of Hedgehog pathway in chemoresistance, 
while the expression analysis after the inhibition showed that Hedgehog pathway regulates the 
CSCs phenotype in lung carcinomas and that this characteristic may be due to its regulatory 
capacity over stem cell markers ABCG2 and BMI-1 in lung. All together this results suggest the 
functional capacity of the Hedgehog pathway in lung cancer stem cells and it is proposed as a 
target for novel therapy approaches against deathly lung neoplasias. 
 Key words: ABCG2, BMI-1, Cancer Stem cells, Hedgehog, Lung Cancer 
 
 
 
 
 
1 
 
Introducción 
1.1 Biología del cáncer 
De acuerdo con Hanahan y Weinberg (2000) existen caracteres escenciales que en su conjunto 
permiten el desarrollo de las neoplasias malignas, señalados como los “Hallmarks” del cáncer, 
mismos que permiten definir el desarrollo de la enfermedad oncológica, destacando entre otros 
los siguientes caracteres: i) la capacidad de sostener señales de proliferación, ii) la evasión de 
supresores de crecimiento, iii) la capacidad de evasión de la apoptosis iv) la inmortalidad 
replicativa, v) la capacidad de invasión y metástasis, vi) evasión de muerte celular y vii) la 
angiogénesis. A su vez durante la última década y como resultando de nuevas investigaciones han 
sido propuestos 2 caracteres adicionales, los cuales son viii) la evasión de la respuesta inmune y ix) 
la desregulación del metabolismo energético. A este respecto, se define que la capacidad de 
adquirir estos hallmarks es conducida por alteraciones a nivel de DNA que resultan en anomalías a 
nivel global del genóma y que sumadas a las propiedades del microambiente o nicho celular 
provocan la aparición de esta enfermedad (Hanahan y Weiberg, 2011). El entendimiento de dichos 
hallmarks en la investigación oncológica permite actualmente el desarrollo de un análisis de mayor 
integración e interpretación para el desarrollo de una mayor comprensión sobre la biología de las 
neoplasías malignas. 
En cuanto a las bases moleculares de la carcinogénesis a nivel de alteraciones del DNA y anomalías 
genómicas, encontramos a 2 grupos de genes involucrados: los genes supresores de tumor y los 
oncogenes; los cuales en cáncer se encuentran alterados provocando un funcionamiento anómalo 
de los mecanismos de regulación del ciclo celular, reparación de daño al DNA, apoptosis, entre 
otros (Ríos y Hernández, 2001). 
Sin embargo, cabe resaltar que existen otros factores además de los genéticos que pueden 
originar la aparición de la enfermedad, tales como los factores epigenéticos, también capaces de 
interactuar con factores genéticos alterados durante los procesos de transformación neoplásica, 
que también permiten la aparición de estos hallmarks del cáncer, como alteraciones en 
mecanismos minímos para el establecimiento de las enfermedades oncológicas (Brena y Costello, 
2007; Jones y Baylin, 2007). 
1.2 Epidemología del cáncer y cáncer pulmonar 
Los cánceres o neoplasias malignas representan la segunda causa de muerte en países 
económicamente desarrollados y países en vías de desarrollo, sólo después de las enfermedades 
cardiovasculares. Su alta incidencia es el resultando del crecimiento poblacional y aumento en la 
esperanza de vida en promedio de distintas poblaciones; aunado con malos hábitos de vida 
asociados al cáncer, como fumar, inactividad física y dietas hipercalorícas no-saludables (Jemal 
et.al., 2012). 
2 
 
En 2008 cerca de 12.7 millones de casos de cáncer fueron diagnosticados, provocando alrededor 
de 7.5 millones de muertes a nivel mundial. Los tipos de cáncer de mayor incidencia y mortalidad 
son el cáncer de mama y cáncer pulmonar en mujeres y hombres, respectivamente (Jemal et.al., 
2012). Con respecto a lo anterior, a nivel mundial el cáncer de pulmón ha sido el tipo de neoplasia 
más común, representando 12.7% del total de casos y el 18.2% de las muertes debidas a 
neoplásias malignas (Borkuz et al., 2003). 
En México, los análisis de recopilación de datos señala que el 12.5% del total de muertes se deben 
a algún tipo de neoplasia maligna (Cerecedo et.al., 2009). En nuestro país, la neoplasia maligna de 
mayor incidencia es el cáncer de próstata, representando 11.7% del total de casos, seguido por el 
cáncer de mama (10.9%),cérvico uterino (8%) y pulmón (7.2%). Sin embargo, el de mayor 
mortalidad entre éstos es el cáncer de pulmón, causando 11.3% del total de muertes por cáncer 
en México y representando por sí sólo la octava causa de muerte en el mundo (Jemal et al. 2012; 
OMS, 2012). 
La alta mortalidad se debe en parte a la ineficacia de los métodos de diagnóstico en etapas 
tempranas, comúnmente acompañada de una pobre prognósis de los pacientes. En este sentido, 
se ha señalado que el índice de sobrevida a cinco años para un paciente diagnosticado en estadío 
clínico III o IV (tardío) es en promedio del 15% (Borkuz et al., 2003). Por otro lado, 70% de los 
pacientes diagnosticados en estadio clínico I y II (temprano) responden de manera favorable a 
esquemas de tratamiento farmacológico, radiológico y quirúrgico, elevando el índide de sobrevida 
a 60%; sin embargo, como se mencionó anteriormente, es reducido el número de pacientes con 
diagnóstico temprano (Cerecedo et.al., 2009). 
Por otro lado, con respecto a su clasificación histopatológica, el cáncer pulmonar se divide en 2 
grandes grupos: carcinomas pulmonares de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y 
carcinomas pulmonares de células no-pequeñas (NSCLC); siendo este último el más común, con 
alrededor del 75% del total de casos de cáncer pulmonar. Los NSCLC se dividen en 3 principales 
tipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células grandes y carcinoma de células 
escamosas (Risch y Plass, 2008). Adicional a ello, se conoce que la alta tasa de mortalidad asociada 
a NSCLCs ha continuado en aumento durante los últimos 40 años, comparado con otros tipos de 
neoplásias malignas, entre ellas cánceres como de mama, próstata, colón y recto, donde se ha 
logrado reducir los índices de mortalidad gracias al desarrollo de nuevos esquemas de diagnóstico 
y terapéuticos (Chang, 2011). Prevaleciendo el desarrollo de estudios de investigación básica y 
clícica tanto a nivel genético, como epigenético para revertir este patrón negativo. 
1.3 Epigenética 
El término epigenética es generalmente usado para referirse a cambios en la expresión génica a 
través de mecanismos que no involucran cambios en la secuencia del DNA y que pueden ser 
heredados (Jirtle y Skinner, 2007). Al respecto, todas las células en un organismo comparten la 
misma información genética; sin embargo, sólo algunas comparten el mismo fenotipo, el cual se 
modula a partir de los mecanismos de regulación epigenética capaces de modificar la estructura 
3 
 
química del DNA y remodelar la estructura de la cromatina, convirtiendo la información genética 
en rasgos de fenotipo. En este sentido, los mecanismos epigenéticos resultan fundamentales en 
distintos procesos celulares, que incluyen entre otros, la regulación de la expresión genética del 
RNAm, expresión de micro-RNAs, interacciones DNA-proteína, supresión de elementos móviles del 
DNA como transposones, diferenciación celular, embriogénesis, inactivación de cromosomas 
sexuales, la impronta genética, así como los mecanismos de reparación y replicación del DNA 
(Portella y Esteller, 2010; Hahn et al., 2010). 
A su vez, existen distintos niveles de regulación epigenética capaces de establecer y estabilizar 
cambios en la estructura de la cromatina y por tanto regular la actividad transcripcional (Hahn et 
al., 2010), entre éstos encontramos la modificación química covalente por metilación del DNA y 
modificaciones de las histonas. 
Metilación del DNA: Definida por la adición de un grupo metilo a la base pirimidínica citosina 
catalizada por las enzimas DNA metil-transferasas (DNMTs) (Mathews et al., 2009), principalmente 
en un contexto de dinucleótidos CpGs. En el genoma se encuentran regiones densas en 
dinucleótidos CpG a los cuales se les han denominado islas CpG. Las islas CpG se encuentran en 
60% de los genes humanos, estas en condiciones normales contienen bajos niveles de metilación 
(hipometiladas), y sólo alrededor del 10% adquiere patrones de metilación de forma tejido-
dependiente. Esta modificación se relaciona con la represión transcripcional y funciona directa o 
indirectamente, impidiendo la unión de factores de trascripción al DNA a través del reclutamiento 
de proteínas de unión al DNA metilado (proteínas MBD, por siglas en inglés), a su vez estos 
reclutan factores de remodelación de la cromatina y/o complejos modificadores de histonas 
(Portella y Esteller, 2010; Santos y Dean, 2004). 
Modificación del código de histonas y remodelación de la cromatina: La cromatina es una 
estructura compuesta de DNA nuclear empaquetado por proteínas. La unidad básica de la 
cromatina es el nucleosoma, conformado de alrededor de 147 pb de DNA envuelto en un 
octámero de histonas (pares de H2A, H2B, H3 y H4). Adicionalmente cada histona puede 
modificarse de manera covalente a nivel pos-transcripcional mediante metilación, acetilación, 
ubiquitinación y fosforilación. A este respecto, las modificaciones son establecidas por sistemas 
enzimáticos asociados a la cromatina, entre las que encontramos metil-transferasas de arginina y 
lisinas; así como desacetilasas (HDACS) y acetilasas (HATs) de histonas. Al respecto, se dice que las 
modificaciones dan lugar a un “código histónico” el cual establece la conformación de la cromatina 
que a su vez dicta el estado de actividad genético-transcripcional dependiente del repertorio de 
modificaciones químicas covalentes (Johnsen, 2012; Mills 2010; Mathews et al., 2009). 
También es posible encontrar otros niveles de regulación epigenética, tales como variantes de 
histonas y participación de RNAs no codificantes largos (ncRNA) (Henikoff, 2008; Gieni y Hendzel, 
2009). Por lo que cabe mencionar, que si bien estos niveles son descritos de forma independiente, 
es necesario resaltar que éstos no son eventos aislados, sino dinámicos y transitorios por lo que es 
importante tener en cuenta la conexión e interacción que ocurre entre éstos (Jin et al., 2011). 
4 
 
1.4 Aberraciones epigenéticas en cáncer 
Es común encontrar patrones de expresión genética anormales implicados en el desarrollo de 
enfermedades en humanos, incuyendo las neoplásias malignas. En cáncer dichas anomalías 
responden a mecanismos de regulación epigenética, debido a esto se ha propuesto que cambios 
tanto en metilación del DNA, como modificaciones de histónas pueden ocurrir en etapas 
tempranas y tardías del cáncer; es decir en etapas de iniciación, promoción y progresión 
neoplásica. Por lo que, alteraciones en la impronta genético-epigenética promueven la adquisición 
de características adicionales favorables hacia el establecimiento de las enfermedades malignas 
(Baylin y Ohm, 2006). 
Respecto al mecanismo de metilación del DNA, en cáncer se ha observado un fenómeno de 
desmetilación global del genoma, conduciendo a la redistribución de las 5-metil-citosinas e 
hipermetilación en islas CpG ubicadas en promotores, llevando al silenciamiento genético de 
genes clave del funcionamiento celular, entre ellos los genes supresores de tumor (Jones y Baylin, 
2008). Sumado a ello, la activación transcripcional a través de la pérdida de metilación también se 
ha observado en cáncer. Tales modificaciones son las causantes de la pérdida de la impronta 
génica provocando la activación de oncogenes. A su vez, las neoplasias también se encuentran 
caracterizadas por estados de hipometilación y activación de regiones intergénicas e intragénicas; 
así como regiones con secuencias repetitivas provocando inestabilidad cromosómica (Esteller, 
2007). 
Por otro lado, aberraciones en las modificaciones histónicas sobre genes o regiones genéticas 
implicadas en la progresión neoplásica, son también importantes para este fenómeno. En este 
sentido, se ha observado como evento común la pérdida de grupos acetilo en el residuo de lisina 
16 de la histona 3 (H3K16ac); así como la aparición de la marca de trimetilación en el residuolisina 
20 de la histona 4 (H4K20me3) (Fraga et al., 2005). Sumado a esto, en cáncer se ha observado la 
capacidad de re-activación de miembros del grupo Policomb y Tritorax, quienes dirigen 
mecanismos de represión y expresión respectivamente durante el desarrollo embrionario y están 
involucrados en el establecimiento de la memoria epigenética. Como ejemplo tenemos a la sobre-
expresión de EZH2, una metil-transferasa de histonas responsable de establecer la marca de 
trimetilación en el residuo de lisina 27 de la histona 3 (H3K27me3), cuya actividad correlaciona 
con la progresión de múltiples neoplasias (Wang et.al., 2007; Jones y Baylin, 2008). 
Estos ejemplos permiten contextualizar la importancia de los mecanismos epigenéticos y el papel 
que juegan en conjunto con factores genéticos durante el desarrollo del cáncer, por lo que 
constituyen indicadores genético-epigenéticos de la progresión maligna (Brena y Costello, 2007). 
Adicional a ello, ejemplifican la inapropiada participación de mecanismos utilizados en el 
desarrollo embrionario, permitiendo la adquisición de caracteres fenotípicos y funcionales, 
normalmente presentes en células de tipo troncal (Mills, 2010). 
Basado en lo anterior, se ha buscado desarrollar terapias antineoplásicas que buscan inhibir 
miembros de la maquinaria epigenética con el fin de controlar o re-expresar genes supresores de 
tumor, oncogenes o genes relacionados con apoptosis, como son los inhibidores de DNMTs, entre 
5 
 
ellos: 5-Azacitidina (5-AZA) y/o el inhibidores de HDACs, como Tricostatina A (TSA), los cuales han 
sido probados por la food an drug administration (FDA) en E.U.A., en el tratamiento de algunos 
tipos de tumores malignos con resultados positivos o marginales (Walton et al., 2008; Christman, 
2002; Bachman et al., 2003; Meng et al., 2007). 
1.5 Células Stem del Cáncer (CSCs) 
El contenido celular de una masa tumoral se conforma por un conjunto de poblaciones celulares 
heterogéneas, es decir células de fenotipo y función diferente. Dicha heterogeneidad ha sido 
atribuída a grupos reducidos de células identificadas por su capacidad de auto-renovación, 
diferenciación hacia células progenitoras y división asimétrica, estas son denominadas células tipo 
stem (o troncales) del cáncer (CSCs, por sus siglas en inglés) (Reya, 2001). En este sentido, de 
acuerdo con la teoría de las CSCs, esta sub-población es la responsable de dirigir el crecimiento y 
dispersión del tumor, por lo que son también llamadas células iniciadoras del cáncer o células con 
capacidad de propagación del cáncer (Lobo, 2007). 
En cuanto a su origen, existen dos modelos mutuamente no-excluyentes que pretenden explicar el 
establecimiento y presencia de CSCs en tumores malignos. i) El modelo jerárquico propone que su 
origen ocurre a partir de la transformación de células stem adultas fisiológicas (ASCs por sus siglas 
en inglés). Este modelo se apoya en el hecho de que las ASCs pueden preferentemente ser blancos 
de aberraciones iniciales debido a que son poblaciones celulares de larga vida y por tanto 
expuestas en mayor tiempo a factores de estrés biológico, en contraste de su progenie 
diferenciada de periodos cortos de vida. ii) El modelo estocástico propone que una célula de 
mayor diferenciación (no-stem) podría desarrollar la capacidad de auto-renovación, congruente 
con propiedades de células stem, adquiriendo dichas capacidades debido a su adaptabilidad 
intrínseca dada por las anomalías genético-epigenéticas que presenta (Houghton, 2007). 
Basado en lo anterior, diversos mecanismos explican la presencia de las CSCs, entre ellos múltiples 
vías de señalización como la vía de WNT/β-Catenina, Notch y Sonic Hedgehog; así como genes de 
control celular como BMI-1 y PTEN, confirmándose en distintos modelos neoplásicos, cuya función 
es necesaria y fundamental para el mantenimiento de las CSCs, evidenciando la necesidad de 
retomar el estudio de vías de señalización activas durtante el desarrollo embrionario (Pardal, 
2007; Mills, 2010). 
A su vez, otro de los mecanismos de las CSCs es el de resistencia a fármacos o quimioresistencia 
(también llamada: fármaco-resistencia), promovida por activación de algunas vías y/o mecanismos 
arriba mencionados y/o como resultando de diversas alteraciones, entre las que destacan 
mutaciones en sitios de unión al fármaco, inactivación del fármaco, sobre-expresión de 
transportadores de multi-drogo-resistencia (MDR) y sobre-activación de mecanismos de 
reparación del daño al DNA (Dean, 2005; Rosell et al., 2002). 
Basado en lo anterior, el auge de la teoría de CSCs y sus características ha llevado a nuevos 
enfoques sobre terapias oncológicas. En este sentido, las terapias más empleadas son aquellas 
capaces de reducir la masa tumoral de células progenitoras de alta proliferación. Sin embargo, 
6 
 
estas terapias resultan ineficientes en prevenir la repoblación tumoral, comunmente llevando a la 
recurrencia y metástasis del cáncer. Debido a ello, las CSCs han empezado a ser un blanco de 
terapias a través de la inhibición de las vías de señalización o de moléculas marcadoras de este 
fenotipo; inclusive algunas de éstas ya se encuentran en proceso de pruebas pre-clínicas (Allison et 
al., 2012). 
1.6 CSCs y Vía de Señalización Sonic Hedgehog (Hh) 
Respecto a la participación de posibles vías de señalización implicadas en cáncer o recientemente 
involucradas en la biología de las CSCs, la vía de Sonic Hedgehog (Hh) resulta un sólido candidato 
implicado en la fisiología de células stem durante el desarrollo embrionario capaces de promover 
la proliferación acelerada de células progenitoras e instruir su diferenciación hacia distintos tipos 
celulares y mantenimiento de ASCs (Ingham y Placzek, 2006). 
En mamíferos la vía Hh involucra tres ligandos activadores de la vía: Sonic hedgehog (Shh), Indian 
hedgehog (Ihh) y desert hedgehog (Dhh), y su ausencia permite que su receptor Patched (Ptch) 
mantenga una actividad de represión sobre Smoothened (SMO). De este modo al unirse el ligando 
a Ptch, éste pierde su función represora, iniciando la cascada de señalización a través de SMO, 
resultando en la activación de los factores de transcripción llamados Gli y su disociación de SUFU y 
Fused, para posteriormente traslocarse al núcleo (Figura 1). De este modo GLI-1 está involucrado 
en activación, GLI-2 funciona de manera ambivalente (tanto activador como represor); mientras 
que GLI-3 actúa como represor de la transcripción (Lau et al., 2006; Li et al. 2012). 
 
 
 
 
 
Fig. 1. Modelo básico de regulación de la vía de señalización Sonic Hedgehog. En ausencia del ligando de 
Hedgehhg (Hh) la vía permanece inactiva debido a la represión de Smoothened (Smo) por Patched (PTCH) 
(Izquierda), mientras que en presencia de Hh, Smo deja de ser reprimido y permite la activación del factor de 
transcripción Gli y su disociación de los factores SUFU y Fused, que al translocarse al núcleo permite activar sus 
genes blanco (Derecha). Tomada de Li et al., 2012. 
7 
 
No resulta difícil imaginar cómo una vía con características tanto mitógenas, como morfógenas 
puede contribuir en la tumorigénesis cuando se encuentra desregulada. Al respecto se sabe que la 
vía Hh podría participar en fases de inducción, promoción y progresión del cáncer induciendo la 
expresión de genes que afectan la proliferación y control del ciclo celular, tales como Ciclina D1, 
Ciclina D2, N-MYC, IGF2, HES1, así como genes anti-apoptóticos (BCL2), angiogénicos (VEGF); o 
aberraciones que promueven la inestabilidad genética (Merchant y Matsui, 2010). 
Adicional a lo anterior, se ha descrito el aumento en la actividad de la vía Sonic Hedgehog en 
tumores del tipo glioblastoma, meduloblastoma, carcinoma de células basales, cáncer de mama, 
cáncer de páncreas, melanoma, linfoma, próstata y recientemente sugerido en carcinomas 
pulmonares, entre otros (Li et al., 2012). En estoscasos ha destacado la inhibición de SMO y/o GLI-
1, traduciendose en la reducción significativa de la proliferación y reducción de la capacidad 
mestatásica en modelos tumorales de xenotransplantes (Merchant y Matsui, 2010). 
Al respecto, escasa información se ha descrito específicamente en torno a su posible participación 
en el fenotipo quimioresistente del cáncer. No obstante, un estudio reciente determinó que la vía 
Hh se sobre-expresa en CSCs y que la activación de esta vía es relevante para el fenómeno de 
quimioresistencia en modelos in vitro e in vivo de cáncer gástrico (Song et al., 2011), característica 
que podría recaer en parte a su capacidad de regular transcripcionalmente a genes que codifican 
para los transportadores de membrana ABCG2, MDR1, ABCB1 y glicoproteína P, implicados 
funcionalmente en eventos de quimioresistencia (Sims-Mourtada, et al., 2007). 
Otros estudios sugieren que la capacidad por mantener el fenotipo troncal se debe a su capacidad 
reguladora sobre la molécula BMI-1, miembro del grupo polycomb (Liu et al., 2006), 
principalmente participando en el mantenimiento de CSCs en neoplasias no sólidas como leucemia 
(Hosen et al., 2007); donde un fenotipo troncal-quimioresistente es dependiente de la expresión 
de moléculas de superficie con capacidad MDR, entre ellos, receptores tipo ABC, como ABCG2. 
1.7 El Transportador de Membrana ABCG2 
La familia de transportadores ABC representa una de las familias más grandes de proteínas 
transportadoras. En humano hay 48 transportadores ABC divididos en 7 subfamilias desde ABCA 
hasta ABCG, cuya función principal radica en la capacidad de exportar agentes nocivos hacia el 
exterior de la célula. ABCG2, también llamado BCRP (Breast Cancer Resistance Protein por sus 
siglas en inglés), es un transportador importante para el mecanismo de quimioresistencia, debido 
a su capacidad de regular la biodisponibilidad de sustancias dentro de la célula, que le confieren 
capacidad de resistir a los mecanismos de accción de distintos fármacos. En particular dicho 
transportador posee afinidad por una variedad de sustratos farmacológicos utilizados 
comunmente en la práctica clínica, entre los que destacan cisplatino, doxorubicina, mitoxantrona, 
etoposido, irinotecan, Gefitinib, Imatinib, constituyendo un factor pronóstico en neoplasias, así 
como un marcador de alto potencial terapéutico frente a CSCs (Mo y Zhang, 2012; An y Ongkeko, 
2012). 
8 
 
Aunado a ello, es considerado que ABCG2 funciona como el determinante molecular que permite 
el fenotipo SP (Side Popµlation, por sus siglas en inglés) o población colateral, caracterizado por la 
capacidad de transporte/exclusión del trazador fluorescente “Hoechst 33342”, cuya expulsión 
constituye una característica de células tipo stem. El aislamiento de células SP constituye un 
acercamiento que ha permitido el estudio de CSCs putativas, demostrado en su capacidad de 
formación de colonias, alta proliferación, tumorigenesis in vivo y alta quimioresistencia, en 
contraste con células No-SP. Basado en ello, ha sido posible la identificación y estudio de la 
población SP reflejando su identidad molecular CSCs en distintos tipos de neoplásias entre ellas: 
leucemia, cáncer de mama, retinoblastoma, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, 
cáncer de cuello, osteosarcoma, cáncer de esófago y cáncer pulmón, (Ding et al., 2010). 
1.8 El Marcador de Troncalidad BMI1 
El proto-oncogen BMI-1 es un miembro del grupo policomb requerido durante el desarrollo 
embrionario para mantener el sileciamiento de genes no requeridos durante dicha etapa del 
desarrollo. Al respecto, se conoce que BMI-1 constituye un regulador específico del locus genético 
INK4a-ARF, cuyo sitio es regulado negativamente impidiendo la expresión de los genes supresores 
de tumor p16INK4a y p14ARF; el primero inhibe a la cinasa dependiente de ciclina D1, impidiendo 
la fosforilación de Rb. Por su parte, p14ARF previene la degradación e inactivación de p53, dando 
como resultando que BMI-1 impida la continuación del ciclo celular mediada por Rb y bloquear en 
gran medida los procesos de apoptosis conducidos por p53, inactivando genes supresores de 
tumor de alta importancia en la progresión neoplásica, por lo que la presencia de esta molécula se 
encuentra relacionada con pobre pronóstico en pacientes con cáncer (Vonlanthen et al., 2001). A 
este respecto, se ha reconocido su participación en distintas neoplásias incluidos cáncer de mama, 
neuroblastoma, leucemia mieloide, cáncer ovárico y de pulmón (Jiang et al. 2009). Más aún, se ha 
identificado la capacidad de BMI-1 para la auto-renovación y mantenimiento de células troncales 
(Park et al., 2004) o población SP con fenotipo troncal en carcinoma hepatocelular, lo que ha 
permitido un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares que operan en la población SP 
en este carcinoma (Chiba et al. 2008). 
Adicionalmente, entre las diferentes implicaciones que conlleva la actividad de BMI-1 en cáncer, 
se ha repostado correlación, entre la sobre-expresión de BMI-1 como marcador de troncalidad y la 
pobre respuesta a esquemas terapéuticos en distintos tipos de cáncer (Cao, et al., 2011). 
Asimismo, se ha observado que la reducción de BMI-1 permite restituir mecanismos de apoptosis 
y/o senescencia en células neoplásicas, aumentando la susceptibilidad hacia agentes citotóxicos 
como el fármaco cisplatino en pacientes con osteosarcoma (Wu et al., 2011a) y Doxorubicina en 
cáncer de mama (Wu et al., 2011b). Dichas evidencias han permitido determinar el papel central 
de esta molécula en los procesos celulares de troncalidad y quimioresistencia en cáncer, 
constituyendo posibles blancos terapéuticos en futuras terapias antineoplásicas. 
9 
 
1.9 CSCs del Cáncer Pulmonar 
Reportes previos lograron identificar ASCs en tejido pulmonar histológicamente normal, cuya 
función radica en el mantenimiento y reparación del epitelio pulmonar cuando se presenta 
cualquier tipo de daño (Giangreco et al., 2006). A este respecto, en modelos murinos se identificó 
un porcentaje menor al 0.1% de células con fenotipo SP ABCG2+ (summer et al., 2004); donde 
cabe resaltar que la expresión de ABCG2 en pulmón histológicamente normal podría tener como 
función la capacidad de protección en contra de agentes nocivos que entran a nivel local o 
sistémico, evitando el daño de las ASCs (Van der Deen et al., 2005). 
Adicionalmente es preciso destacar que la identificación de ASCs y su función en tejido pulmonar 
se relacionan con la presencia de la vía de Hh, no sólo activa durante la morfogénesis pulmonar 
en el desarrollo embrionario, sino también durante la regeneración epitelial de las vías aéreas 
superiores, posterior al daño epitelial externo. Sumado a ello, se demostró que dicha vía de 
señalización se encuentra activa en varias líneas celulares del cáncer pulmonar y tumores sólidos 
pulmonares (Watkins et al., 2003). 
Diversos estudios corroboraron la presencia de CSCs en carcinomas pulmonares, corroborando 
propiedades de fenotipo y función, tanto en líneas celulares como en muestras neoplásicas de 
tejido sólido pulmonar (Ho et al., 2007; Salcido et al., 2010) (Ver Tabla 1). Destacando mecanismos 
y vías de señalización intrínsecos del cáncer, varios de los cuales permanecen por ser dilucidados 
(Wu et al., 2012). 
Nombre Uso y/o Función propuesta en células stem 
CD133 Marcador ampliamente estudiado en CSCs de múltiples tejidos. 
ABCG2 Expulsión de compuestos y resistencia a fármacos. 
ALDH Marcador de poblaciones stem normales y malignas. 
BMI-1* Mantenimiento y auto-renovación de células stem. 
CD44 Mediador de adhesión, migración, interacciones con matriz celular y 
potenciador de funciones tumorales. 
Wnt/β-Catenina Juega un papel importante en el desarrollo del cáncer 
Sonic Hedgehog Juega un papel importante en el desarrollo de órganos y segmentación 
corporal. 
Stem Cell Factor/c-kitJuega un papel importante en la auto-renovación y proliferación de 
CSCs. 
Oct4/Nanog Genes HOX esenciales para la auto-renovación de células stem. 
Rac1 Transducción de señales involucradas en cáncer. 
 
 
 
 
 
Tabla 1. Marcadores estudiados de cancer stem cells de pulmón. Tomado de Wu et al., 2012; *Koch et al., 2008 
10 
 
2. Antecedentes Directos 
2.1 Regulación Epigenética de los Marcadores ABCG2, BMI-1 y Miembros de la 
Vía Hh en Cáncer 
Diversos estudios realizados sobre miembros de la vía Hh han demostrado su regulación 
transcripcional a nivel epigenético mediante distintos modelos neoplásicos. Por un lado, en cáncer 
de mama se ha demostrado que la metilación del DNA en la secuencia promotora del gen PTCH 
correlaciona con bajos niveles de expresión relativa del RNAm (Wolf et.al., 2006); mientras que 
Shahi et al. (2010), mediante el estudio de PTCH, identificaron que sólo el 16% de los casos en 
líneas celulares y 25% en tumores sólidos de meduloblastoma presentaban metilación en el DNA, 
demostrando correlación con los niveles de expresión bajos del RNAm. Por otro lado, se ha 
observado la expresión de SMO en líneas celulares de meduloblastoma, glioblastoma y 
neuroblastoma, cuando su promotor carece de metilación (Shahi et al., 2007). Al mismo respecto, 
en cáncer de mama Cui et al. (2009) demostraron hipometilación del promotor del ligando de Hh 
en 70% de las muestras con sobre-expresión del RNAm, sugiriendo que el mecanismo de 
metilación del DNA en secuencias promotoras, constituye un factor importante en la regulación 
transcripcional de este gen. 
Por otro lado, respecto a los mecanismos de regulación epigenética del gen ABCG2 en cáncer, 
resultan particularmente interesantes las notables diferencias entre líneas celulares 
quimioresistentes y su correspondiente línea celular parental. Al respecto, a nivel de 
modificaciones del código histónico, la línea celular de cáncer de mama MCF-7 en presencia del 
fármaco Doxorubicina mostró un enriquecimiento 10 veces mayor de acetilación en la histona H3 
dentro de la región promotora del gen, comparado con la misma línea MCF-7 parental (Calcagno, 
et al., 2008). Mientras que, Nakano et al., (2008) en cáncer de mama resistentes a tratamiento por 
irinotecan (SN-38) y Bram et al., (2009) en líneas resistentes de cáncer ovárico (IGROV1), linfoma 
de células T (CCRF) y cáncer pulmonar (A549) demostraron disminución en los niveles de 
metilación, con aumento en la expresión de ABCG2, en correlación con el fenotipo 
quimioresistente del cáncer. No obstante, a la fecha no queda suficientemente clara la 
responsabilidad del código histónico y/o metilación del DNA en genes de la vía de Hh, como 
posibles responsables de establecer la resistencia mediada por ABCG2, frente a los principales 
esquemas de tratamiento oncológico pulmonar, entre ellos, derivados del platino y otros 
intercaladores del DNA como Doxorubicina (Chang, 2011). Asimismo, a la fecha ningún estudio se 
ha enfocado al análisis de regulación por metilación de la región promotora de los genes GLI-1 y 
BMI-1. 
 
11 
 
2.2 Expresión de Marcadores Fenotípicos BMI-1, ABCG2 y Hh en Carcinomas 
Pulmonares 
Actividad de la vía de señalización Sonic Hedgehog se ha descrito en distintas neoplasias, 
incluyendo a los carcinomas pulmonares, como son tumores del grupo SCLC, donde se encuentra 
sobre-expresada (Vestergaard et al., 2006); a su vez la presencia de la vía representa la capacidad 
para mantener la proliferación celular y evasión de la apoptosis en líneas celulares de SCLC (Park, 
et al., 2011). 
Más aún, estudios en células troncales derivadas de cáncer de pulmón han demostrado la sobre-
expresión de algunos genes miembros de la vía Hh, en valores superiores a genes de otras vías de 
señalización importantes en cáncer, destacando WNT y/o NOTCH, así como la expresión del 
transportador de membrana ABCG2, el cual también muestra niveles de expresión superiores a 
otros transportadores involucrados en quimioresistencia (Bertolini et al., 2009). 
A este respecto la población SP mediada por ABCG2 en la línea A549 de NSCLC ha sido 
caracterizada, encontrando rasgos de fenotipo stem y resistencia a fármacos, revelando la 
importancia de este marcador para el fenotipo troncal en cáncer pulmonar (Sung et al., 2008). 
Por otro lado, también se ha observado la presencia de BMI-1 en muestras de SCLC, la cual 
correlaciona con estados avanzados de la enfermedad (Vrzalikova, et al., 2008) y baja expresión 
del gen supresor de tumor p16 (Breuer et al., 2005). Más aún, la inhibición de esta molécula 
utilizando RNAs de interferencia demostró la importancia de esta molécula en mecanismos de 
invasión y metástasis en la línea celular de cáncer pulmonar tipo adenocarcinoma A549 (Meng et 
al., 2012). Sin embargo, poco se ha estudiado con respecto a su participación en células troncales 
derivadas del cáncer pulmonar. 
A pesar de conocerse las funciones de estos factores en cáncer, además de ciertas evidencias que 
sugieren la participación de la vía Sonic Hedgehog en la expresión de marcadores de troncalidad 
(Singh et al., 2011; Michael et al., 2008), a la fecha poco se sabe acerca de su regulación en células 
tipo stem quimioresistentes del cáncer pulmonar, por lo que el presente proyecto plantea su 
estudio en este sentido. 
3. Planteamiento del problema 
 
La capacidad funcional de las CSCs en términos de propagación, migración y quimioresistencia 
como factores implicados en el pobre pronóstico con relapsos del cáncer en pacientes, abre la 
puerta hacia el estudio de nuevas terapias que tengan como blanco a poblaciones celulares con 
capacidad de quimioresistencia a largo plazo, tal vez permitiendo una mejor respuesta a fármacos, 
así como el mejoramiento del índice de sobrevida que permita disminuir y/o controlar los índices 
de relapsos, metástasis y alta mortalidad por cáncer pulmonar. 
12 
 
4. Justificación 
 
La importancia que posee la vía Sonic Hedgehog en CSCs y su capacidad de regulación sobre 
ABCG2 y BMI1, con la capacidad funcional de proliferación, propagación, invasión y 
quimioresistencia, nos obliga a profundizar sobre el conocimiento de esta vía de señalización en 
cáncer. Al respecto, actualmente son escasos los reportes que apoyan la particpación de Hh en el 
funcionamiento de CSCs pulmonares, por lo que su estudio a nivel de epigenético y asociados a 
este fenotipo y función en cáncer pulmonar, permitirá dilucidar el probable papel determinante 
que juega como regulador clave en la quimioresistencia y troncalidad de las neoplasias 
pulmonares. 
5. Objetivos 
5.1 Objetivo general 
Analizar la participación de la vía de señalización Sonic Hedgehog y su regulación epigenética en 
los mecanismos de quimioresistencia de células tipo stem del cáncer pulmonar. 
5.2 Objetivos Particulares 
-Evaluar la inducción de modelos celulares de cáncer pulmonar in vitro A549, A427 e INER 37, con 
fenotipo stem-quimioresistente, mediante el análisis de expresión de marcadores stem (ABCG2 y 
BMI-1) frente al tratamiento de los fármacos oncológicos cisplatino y Doxorubicina). 
-Evaluar la participación de mecanismos de regulación epigenética en correlación con los perfiles 
de expresión del RNAm de miembros de la vía Hh (GLI-1 y SMO) y marcadores de troncalidad 
(ABCG2 y BMI-1), en líneas celulares A549, A427 e INER 37. 
-Analizar si la vía de señalización Hh es determinante en la resistencia o sensibilidad a fármacos 
oncológicos cisplatino y doxorubicina en las líneas celulares A549, A427 e INER 37. 
-Establecer si el fenotipo tipo stem-quimioresistente es regulado a través de la vía Hh (GLI-1), en 
correlación con la expresión de sus blancos transcripcionales como ABCG2 y BMI-1 en las líneas 
A549, A427 e INER 37. 
13 
 
6. Materiales y métodos 
6.1 Estrategia experimental. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análisis de 
Expresiónde la vía 
de Hh (SMO y GLI-
1) y marcadores de 
troncalidad 
(ABCG2 y BMI-1) 
Por RT-PCR 
Tiempo real. 
 
Análisis de 
Viabilidad celular 
por MTS 
Inhibidores 
+ Fármaco 
Análisis de 
Expresión de la vía 
de Hh (SMO y GLI-
1) y marcadores de 
troncalidad 
(ABCG2 y BMI-1) 
Por RT-PCR 
Tiempo real. 
 
Análisis de 
Expresión de la vía 
de Hh (SMO y GLI-
1) y marcadores de 
troncalidad 
(ABCG2 y BMI-1) 
Por RT-PCR 
Tiempo real. 
Análisis de 
Viabilidad celular e 
índice de células 
sobrevivientes por 
MTS y conteo 
célular. 
Cultivos de líneas celulares de 
adenocarcinoma pulmonar: 
A549, A427 e INER 37 
Evaluación de la 
participación de 
mecanismos deregulación 
epigenética 
Participación de la vía Hh en 
quimioresistencia y regulación del 
fenotipo Stem. 
Evaluación de modelos celulares 
quimioresistentes 
 
Secuencial 1: 
CIS/DOX 
Inhibición de 
maquinaria 
epigenética con 
5-AZA y TSA 
Inhibición de 
SMO 
Ciclopamina 
30µM 
Inihibición de 
GLI-1 
siRNA anti-Gli-1 
Secuencial 2: 
DOX/CIS 
Doxorubicina 
100nM 
Cisplatino 
8µM 
Inhibidores 
+ Fármaco 
+ 5AZA ó 
TSA 
14 
 
6.2 Cultivo 
Se utilizaron líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar de células no pequeñas de origen 
caucásico A549 y A427 obtenidas del ATCC y la línea del mismo tipo histológico de origen mestizo 
mexicano INER 37 (Ponce et al., 2005). Se cultivaron en medio RPMI 1640 (Biowest) 
complementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Biowest,), 0.1% de gentamicina (Biowest.), 
1% de L-glutamina (Biowest), 1% de Piruvato de Sodio (Biowest) y 2.5% de Hepes (Biowest), en 
condiciones de cultivo de 37º C y 5% de CO2. Las células se cultivaron en cajas T25 con 5ml de 
medio, cajas de 6 pozos con 1.5ml de medio y cajas de 96 pozos con 100µl de medio a partir de 1 
millón, 200 mil y 1800 células respectivamente, dependiendo del ensayo a realizar, permitiendo 
que las células se adhirieran durante 12 H previas a adicionar cualquier condición experimental. 
6.3 Conteo Celular 
Para colocar la población deseada en cada caja de cultivo las células fueron tripsinizadas con 
tripsina-EDTA 2X (Biowest) y posteriormente resuspendidas en 5ml de medio complementado, 
después fueron contadas en presencia de azul de tripano 1% en una cámara de Neu Bauer, el 
número de células totales se obtuvo por medio de la siguiente fórmula: 
[[(# vivas/#campos)(Factor de dilución)]X10000] X 5ml 
6.4 Administración de Tratamientos Farmacológicos 
 Cultivos celulares en cajas T25 fueron sometidos durante 48 H a 4 condiciones farmacológicas: 
Cisplatino 8µM (SIGMA), Doxorubicina 100nM (SIGMA), los cuales son utilizados en la clínica como 
tratamientos de primera línea, a su vez, dado que también son utilizados en ciertos casos se 
manejaron combinaciones de estos fármacos Secuencial 1 (Cisplatino 8µM/Doxorubicina 100nM) y 
Secuencial 2 (Doxorubicina 100nM/Cisplatino 8µM) (Spira et al., 2004), adicionalmente se utilizó 
un grupo control con medio de cultivo sin tratamiento. Los tratamientos secuenciales fueron 
administrados con el oligonucleótido fármaco durante 24H y con el segundo por las 24H restantes 
mediante un cambio de medio. Después de las 48H las células sobrevivientes aún adheridas 
fueron tripsinizadas para su conteo y posteriormente colocadas en TRIzol® (Invitrogen ™) para la 
extracción de RNA y posterior análisis de expresión (ver más adelante). Se calculó el índice de 
sobrevivencia con base al porcentaje de células remanentes después de cada tratamiento. 
6.5 Ensayos de inhibición epigenética mediante el uso de 5-AZA y TSA 
Se aplicaron tratamientos con el inhibidor de DNMTs 5-aza-2’-deoxicitidina a 4µM (5-AZA) y el 
inhibidor de desacetilasas de histonas (HDACs) Tricostatin A a 300nM (TSA) (SIGMA). Las células 
fueron cultivadas en cajas de 6 pozos y tratadas por 48H, posteriormente el medio fue retirado 
cuidadosamente por pipeteo y las células fueron lisadas y homogenizadas directamente en los 
pozos con el reactivo TRIzol® (Invitrogen ™) para la extracción de RNA y su posterior análisis de 
expresión (Ver más adelante). 
15 
 
 
6.6 Inhibición de la vía de Hh mediante el inhibidor específico de SMO 
Ciclopamina 
Se realizaron tratamientos con Ciclopamina en la concentración 30µM (SIGMA), como control se 
utilizó la Tomatidina (SIGMA) a la misma concentración. Los cultivos en cajas T25 fueron 
sometidos durante 48H a estos tratamientos y posteriormente las células aún adheridas fueron 
tripsinizadas y colocadas en TRIzol® (Invitrogen ™) para la extracción de RNA y posterior análisis 
de expresión (Ver más adelante). Asimismo las células se trataron simultáneamente con los 
tratamientos farmacológicos ya mencionados y con el tratamiento con Ciclopamina (CPM) o 
Tomatidina (TOM) como control negativo en cajas de 96 pozos para el análisis de viabilidad celular 
(Ver más adelante). 
 
6.7 Inhibición de la vía Hh mediante el uso de siRNA anti-Gli1 (iGli1) 
Existen diferentes clases de RNA pequeños con funciones regulatorias, entre ellas, la represión de 
la expresión génica. Estos funcionan dirigiendo el knock-down o silenciamiento gen-específico a 
nivel transcripcional y/o postranscripcional a través del mecanismo de interferencia del RNA, el 
cual requiere de complejos proteicos responsables de la maduración y funcionamiento del RNA 
pequeño. Brevemente los RNAs pequeños son sintetizados como transcritos primarios con la cap-
5’ y la cola poli A 3’, posteriormente son transportadas al citoplasma donde es cortada por el 
complejo DICER para después ensamblarse en el complejo RISC, en el cual reconoce a su secuencia 
blanco para ser inhibida (Felekkis, et al., 2010). 
Se realizó el knock-down de la molécula efectora de la vía de Hedgehog: GLI-1, para lo cual se 
utilizó el RNA pequeño de interferencia (siRNA) comercial de Santa Cruz Biotecnology, INC., (Gli-1 
siRNA (h): sc-37911) que consiste de tres secuencias específicas de 19-25 nucleótidos, el cual fue 
transfectado con lipofectamine® RNAi Reagent (Invitrogen™). El grupo control fue transfectado 
con secuencias Scramble que no llevan a la degradación específica de ninguna secuencia de mRNA 
humana conocida. Para esto primeramente se realizó la siembra de las células en medio sin 
complementar con 3% de SFB sin antibiótico. 12H después se prepararon 2 mezclas (Tubos A y B) 
para transfectar de acuerdo a la tabla 3, donde cada tubo por separado fue incubado por 5 
minutos a temperatura ambiente, posteriormente el contenido de ambos tubos fue mezclado en 
un tercer tubo (tubo C), el cual se dejó incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 
 
 
 
 
16 
 
 
 
Para la transfección en cajas de 6 pozos se prosiguió a retirar el medio de las cajas para después 
agregar 400µl de medio con 3% de SFB sin antibiótico, llevándolo a un volumen de 500µl con 100µl 
del tubo C. La transfección se llevó a cabo en condiciones de cultivo durante 24H, posteriormente 
se retiró el medio y se agregaron 1.5ml de medio complementado, las células se mantuvieron en 
condiciones de cultivo 24H más (48H totales), posteriormente se retiró el medio, se lisó y 
homogenizó directamente en los pozos con el reactivo TRIzol® (Invitrogen ™) para la extracción de 
RNA y su posterior análisis de expresión (Ver más adelante). 
 Para las cajas de 96 pozos las células fueron sembradas en 50µl en medio sin complementar con 
3% de SFB sin antibiótico, al día siguiente se preparó la transfección de acuerdo a la tabla 3 y el 
volumen total del cultivo fue llevado a 100µl con el mismo medio sin complementar y con los 
tratamientos señalados en la tabla 4 durante 48H. como control se utilizaron las secuencias 
Scramble. 
Tratamiento + siRNA 
Control- 
(siRNA Scramble) 
Cisplatino 8µM 
Doxorubicina 100nM 
Cis 8µM + 5-AZA 4µM 
Cis 8µM+ TSA 300nM 
Dox 100nM+5-AZA 4µM 
Dox 100nM+ TSA 300nM 
 
 
 
 
Tubo Componente Caja 96 pozos Caja 6 pozos 
A 
Medio 4.25µl 44µl 
Lipofectamina0.75µl 6µl 
B 
Medio 4.25µl 44µl 
siRNA o Scramble (10µM) 0.75µl 6µl 
Total por pozo Tubo C 10µl 100µl 
Tabla 4. Combinación 
de tratamientos con la 
inhibición de Gli1 
usando siRNAs. 
 
Tabla 3. Preparación para transfección. Se prepararon por separado los tubos A y B y fueron mezclados en un tercer 
tubo (tubo C), el cual fue adicionado a cada pozo correspondiente a las cajas de cultivo utilizadas. 
 
17 
 
6.8 Ensayos de Viabilidad Celular meidante ensayos de citotoxicidad por MTS 
La viabilidad celular fue evaluada a través del análisis de actividad metabólica celular, mediante 
cuantificación colorimétrica a tráves del reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-
2-(4-sulfofenill)-2H-tetrazolium (MTS). Donde las células viables son capaces de transformar MTS 
al compuesto Formazan, adquiriendo una coloración púrpura que es cuantificada mediante 
espectrofotómetro a 550nm. De tal forma que células con baja viabilidad desarrollarán menor 
coloración púrpura y por tanto menor absorbancia comparado con células de mayor viabilidad 
(Twentyman y Luscombe, 1987). 
La viabilidad se evaluó en tres escenarios: i) tratamiento con fármacos oncológicos, ii) inhibición 
de la vía Hh con Ciclopamina o siRNA y iii) aplicando fármacos en combinación del inhibidor 
Ciclopamina o siRNA. Se introdujo al menos una réplica por placa de las condiciones 
experimentales utilizadas (Ver resultados). Se utilizó el kit Cell titer 96® AQueous One Solution Cell 
Proliferation Assay de Promega. Los ensayos se realizaron en cajas de 96 pozos, agregando 10µl de 
MTS por pozo 3H antes de completarse las 48H de tratamiento, permaneciendo en condiciones de 
cultivo hasta el término de exposición. Inmediatamente después la densidad óptica (D.O.) se 
obtuvo en el espectrofotómetro de microplacas Epoch™ de Biotek® instruments a 550nm. Los 
resultados fueron normalizados a los controles correspondientes (Ver resultados). La viabilidad se 
calculó de acuerdo a la siguiente fórmula: 
 Viabilidad celular = (D.O. de la muestra/D.O. del Control) X 100 
6.9 Extracción de RNA Total 
Para obtener el RNA total de cada muestra se utilizó el reactivo de TRIzol® (Invitrogen™), el cual es 
una solución monofásica de fenol e isotiocinato de guanidina, capaz de inhibir la actividad de 
RNAasa e interferir y disolver componentes celulares. El proceso de extracción se llevó a cabo de 
acuerdo a las instrucciones del proovedor, que consisten primeramente en homogenizar la 
muestra con 1ml de reactivo (suficiente para extracción de 1 a 10 millones de células). 
Posteriormente se realizó la separación de fases agregando 200µl de cloroformo (SIGMA), 
incubando a temperatura ambiente durante 3 minutos y centrifugando a 12,000g durante 15 
minutos a 4°C. Al término de la centrifugación se distinguen 3 fases en el tubo, se transfirió la 
parte superior acuosa a un tubo de 1.5ml nuevo. Seguido de esto se continuó a precipitar el RNA 
con 500µl de isopropanol (SIGMA) frío (4°C) por 1hr a 4°C, pasado el tiempo de incubación se 
centrifugó a 12,000g por 10 minutos a 4°C y se decantó el sobrenadante. Después siguieron dos 
lavados: se re-suspendió la muestra con 1ml de etanol 75% frío (4°C) y centrifugando a 12,000g 
por 5 minutos, desechando el sobrenadante. Después de los lavados se esperó a que todo el 
etanol residual se evaporara para posteriormente re-suspender en 30µl de agua libre de RNAsas, 
las muestras se guardaron a -20°C y fueron descongeladas en hielo y cuantificadas por medio del 
espectrofotómetro de microplacas Epoch™ de Biotek® instruments antes de cada ensayo. 
 
18 
 
6.10 Síntesis de cDNA 
Para poder analizar un trascrito de RNAm por la reacción en cadena de la polimerasa antes es 
necesario convertirla a cDNA, esto es posible gracias a la actividad enzimática de la transcriptasa 
reversa, que permite la retro-transcripción del RNA hacia DNA, a este proceso se le llama RT-PCR 
(Lodish et al. 2007). Para realizar el análisis de expresión se sintetizó cDNA a partir del RNA total 
de cada grupo experimental por medio del Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit de Roche 
de acuerdo a las indicaciones del proveedor (tabla 5) utilizando el termociclador MaxyGene™ de 
Axygene. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.11 Análisis de Expresión del mRNA Mediante RT-PCR en Tiempo Real 
Existe una variante del PCR llamado PCR cuantitativo (qPCR), la cual es una herramienta que 
permite medir la cantidad de cierto transcrito de manera simultánea al proceso de amplificación 
en la PCR, la medición es permitida por la adición de sondas de hidrolisis específicas adheridas al 
DNA capaces de emitir fluorescencia cuando son hidrolizadas. Las sondas se encuentran marcadas 
con Fluoresceina (FAM) en el extremo 5’ y con un marcador oscuro en el extremo 3’, de tal forma 
que al estar unidos la fluorescencia emitida por el fluoróforo es absorbida por el marcador oscuro, 
sin embargo al momento de la síntesis de DNA la activad 5’ exonucleasa de la polimerasa 
hidroliza el extremo de la sonda, como el donador y el aceptor están ahora separados, la 
florescencia es detectada y analizada en ese momento por el equipo (Roche). 
 
Componente Volumen para 1 reacción Concentración Final 
 H2O Variable No aplica 
Anchored-Oligo(dT) 
Oligonucleótido (50pmol/µl) 
1µl 2.5µM 
Random Hexamer 
Oligonucleótido (600pmol/µl)* 
2µl 60µM 
RNA Total Variable 1ug** 
Buffer Transcriptasa Reversa 
(5X) 
4µl 1X (8mM MgCl2) 
Inhibidor RNasa (40 U/µl) 0.5µl 20U 
dNTPs Mix (10mM) 2µl 1mM 
Transcriptasa Reversa (20U/µl) 0.5µl 10U 
Total 20µl No Aplica 
Tabla 5. Síntesis de cDNA. Se desglosan las 
condiciones de la reacción de síntesis de cDNA 
de acuerdo a lo recomendado por el proveedor. 
Temperaturas de Reacción: 55°C por 30 
minutos seguidos de 85°C por 5 minutos. 
*No fue utilizado para las muestras 
provenientes del tratamiento con Ciclopamina 
y Tomatidina ni para las muestras transfectadas 
con siRNA iGli1. 
**Para las muestras provenientes del 
tratamiento con Ciclopamina/Tomatidina y 
ensayos con siRNA iGli1 se utilizaron 2ug de 
RNA total. 
19 
 
En este proyecto los análisis de expresión se realizaron posterior a los tratamientos ya señalados 
por medio de ensayos de RT-PCR en tiempo real de los genes ABCG2, BMI-1, GLI-1, SMO al igual 
que los genes PTCH y OCT 3/4 para lo cual se diseñaron oligonucleótidos de expresión 
correspondientes a cada gen, adicionalmente se diseñaron oligonucleótidos para los genes 
constitutivos GAPDH y HPRT que fueron utilizados como controles endógenos a los cuales fueron 
normalizados los otros genes, además las sondas correspondientes a cada gen fueron 
identificadas. Los oligonucléotidos se diseñaron por medio de las herramientas bioinformáticas 
Oligonucleótido3© y el ProbeFinder© encontrados en el Assay Design Center de roche. Los 
oligonucleótidos están diseñados para incluir 2 exones en el amplicon, estos se describen en la 
tabla 6. 
 
Gen (Amplicón) Oligonucléotido Longitud Posición Tm (°C) %GC Secuencia 
ABCG2 (67 nt). 
Probe #56 
Sentido 21 nt 1135-1155 60 52 tggcttagactcaagcacagc 
Antisentido 20 nt 1182-1201 60 55 tcgtccctgcttagacatcc 
BMI-1 (112nt). 
Probe #63 
Sentido 22 nt 1048-1069 59 41 ttctttgaccagaacagattgg 
Antisentido 20 nt 1140-1159 60 50 gcatcacagtcattgctgct 
GLI-1 (124 nt). 
Probe #1 
Sentido 20 nt 603-622 59 50 ccaggaatttgactcccaag 
Antisentido 18 nt 709-726 61 61 ggctttgaagggcctcag 
SMO (83 nt). 
Probe #5 
Sentido 18 nt 2196-2213 60 61 tcacccctgtggcaactc 
Antisentido 18 nt 2261-2278 59 61 ctgcagctctggggagat 
PTCH1 (91 nt). 
Probe # 5 
Sentido 20 371-390 60 50 tctggagcagatttccaagg 
Antisentido 27 435-461 59 33 acccagtttaaataagagtctctgaaa 
OCT ¾ (88 nt.) 
Probe #60 
Sentido 19 2-20 60 53 cttcgcaagccctcatttc 
Antisentido 19 71-89 59 53 gagaaggcgaaatccgaag 
GAPDH (66nt). 
Probe #60 
Sentido 19 nt 83-101 60 58 agccacatcgctcagacac 
Antisentido 19 nt 130-14860 53 gcccaatacgaccaaatcc 
HPRT (102 nt) 
Probe # 73 
Sentido 24 218-241 59 33 tgaccttgatttattttgcatacc 
Antisentido 20 300-319 60 35 cgagcaacgttccagtcct 
Tabla 6. Descripción de los oligonucléotidos de expresión. 
 
 
 
20 
 
Por otro lado el análisis se llevó a cabo en el instrumento de tiempo real Light Cycler® 480 de 
Roche, para el cual fueron utilizadas sondas de la Universal Probe Library (UPL) y el ProbeMaster 
de Roche como se desglosa en la tabla 7. Las muestras se leyeron en placas de 96 pozos 
conteniendo al menos 1 réplica de cada pozo por ensayo. 
 
 
 
6.12 Electroforesis 
Se realizó la electroforesis en geles de Agarosa (Roche) al 3% para visualizar el producto del RT-
PCR en tiempo real de las placas correspondientes a los tratamientos con siRNA iGli1 de las líneas 
A549 e INER 37. 50ml de gel de Agarosa fue teñido con 0.8µl de Midori Green (Nippon genetics) y 
se corrió a 80V por 30 minutos en una cámara de electroforesis convencional. La imagen fue 
tomada con el Sistema de documentación de geles BioSens SC 645 y la intensidad de las bandas 
fue analizada con el software GelAnalyzer 2010A. 
6.13 Análisis Estadístico 
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un sólo factor para observar diferencias entre los 
tratamientos a nivel de viabilidad celular, para este ensayo se realizaron al menos 2 experimentos 
independientes, se consideró una diferencia significativa con un valor de p<0.05. Los valores 
obtenidos en ensayos de expresión relativa se obtuvieron a partir de un experimento 
independiente, en el cual la muestra fue análizada por duplicado o triplicado en la placa de tiempo 
real. Los valores numéricos de cada figura se presentan en el Anexo I. 
 
Reacción Preparación de muestra 
Componente Volumen Concentración Final Componente Volumen Concentración Final 
H2O 2.2µl X cDNA 1 X 
UPL 0.1µl X H20 1.5 X 
ProbeMaster (2X) 5µl 1X Total 2.5 X 
Oligonucleótidos 
(10µM) 
0.2µl 0.2µM 
Total 7.5µl X 
Tabla 7. Preparación de la reacción y las muestras para la PCR tiempo real. Se prepararon 2 mezclas por separado, por un 
lado la reacción con las sondas y primers específicos para cada gen y por otro la muestra de cDNA, ambos se mezclaron en la 
placa de 96 pozos del termociclador en un volumen final de 10uL, el termociclador Light Cycler 480 fue programado de 
acuerdo a las condiciones encontradas en el Anexo II. 
 
21 
 
7. Resultados 
7.1 Evaluación de Modelos Celulares Para el Análisis del Fenotipo Stem-
Quimioresistente. 
7.1.1 Células Resistentes (Sobrevivientes) a Tratamientos Antineoplásicos 
Como parte de la evaluación de nuestros modelos celulares oligonucleótidoo se realizó un conteo 
celular posterior a 48H de tratamiento basado en esquemas farmacológicos como son el 
tratamiento con cisplatino 8µM (Cis 8µM), doxorubicina 100nM (Dox 100nM) y los tratamientos 
secuenciales con cisplatino/doxorubicina (S1) y doxorubicina/cisplatino (S2) que nos permitió 
obtener una pobación celular resistente a estos tratamientos, observando que el tratamiento con 
Cisplatino 8µM fue el de mayor efecto sobre la población celular, resistiendo al tratamiento el 
30%, 46% y 32% de células en líneas celulares A549, A427 e INER37, respectivamente; seguido del 
tratamiento secuencial 2, en el cual fue posible identificar un índice de sobrevivencia del 29%, 68% 
y 33%, respectivamente (Figura 3). Adicionalmente se logró observar que la línea A427 posee 
mayor resistencia bajo tratamiento con Doxorubicina 100nM con 91% de la población (resistente); 
así como 95% con el tratamiento S1 en línea celular A549, en contraste con el control negativo, 
esta pobre reducción de la población celular no era esperada y probablemente se deba a errores 
metodológicos durante el conteo, sin embargo, en general los resultados obtenidos permitieron la 
obtención de un grupo celular reducido que resistió a nuestros esquemas farmacológicos (Figura 
3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
20
40
60
80
100
120
Control CIS 8uM Dox 100nM S1 S2
P
o
rc
e
n
ta
je
 d
e
 c
é
lu
la
s 
Índice de células resistentes 
A549
A427
INER 37
Fig. 3 Índice de células 
resistentes, posterior a 48H 
de tratamiento con fármacos 
y sus combinaciones 
secuencial 1 (S1) y secuencial 
2 (S2) sobre las líneas 
celulares de cáncer pulmonar 
A549, A427 e INER 37. 
22 
 
 
 
7. 1.2 Viabilidad Celular Bajo Tratamiento Farmacológico 
Sumado al conteo celular, se evaluó la viabilidad celular posterior a 48H de tratamiento, mediante 
la actividad metabólica cuantificada colorimétricamente con el uso del reactivo MTS, de esta 
forma pudimos obtener valores cuantitavos menos subjetivos que permitieron el análisis de 
quimioresistencia en nuestros modelos celulares. A este respecto, encontramos que el 
tratamiento con Cisplatino 8µM tiende a reducir la viabilidad celular en 13% (±13) en línea A427; 
mientras que 11% (±19) en la línea celular INER 37, sin embargo los fármacos no presentaron un 
efecto significativo en la viabilidad celular (p<0.05) (Figura 4) con lo que se pudo observar que la 
viabilidad celular no es afectada por los fármacos antineoplásicos en nuestros modelos celulares. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4 Análisis de viabilidad celular frente a fármacos oncológicos 
Cis-platino vs Doxorubicina y sus combinaciones. Porcentaje de 
viabilidad celular mediante ensayos por MTS, posterior a 48H de 
Tratamiento con fármacos antineoplásicos en líneas celulares 
A549, A427 e INER 37. Los valores fueron comparados con 
relación al control. n= número de réplicas biológicas. 
0
20
40
60
80
100
120
Control CIS 8uM Dox 100nM S1 S2
V
ia
b
ili
d
ad
 c
e
lu
al
r 
 A549 
0
20
40
60
80
100
120
Control CIS 8uM Dox 100nM S1 S2
V
ia
b
ili
d
ad
 c
e
lu
la
r 
INER 37 
0
20
40
60
80
100
120
Control CIS 8uM Dox 100nM S1 S2
V
ia
b
ili
d
ad
 c
e
lu
la
r 
A427 n=3 n=3 
n=4 
23 
 
7.1.3 Expresión de la Vía de Sonic Hedgehog y Marcadores de Troncalidad y Quimioresistencia. 
Se prosiguió a observar por primera vez en el grupo los niveles basales de expresión 
transcripcional de los marcadores de troncalidad (ABCG2, BMI-1) y miembros de la vía de 
Hedgehog (GLI-1, SMO) en nuestros modelos celulares de cáncer pulmonar, por lo que se realizó 
un análisis de expresión relativo del RNAm mediante PCR en tiempo real, llevando a cabo análisis 
de expresión comparativo entre las líneas celulares. Para ello, se realizó una mezcla del RNAm de 
las 3 líneas celulares y se utilizó para normalizar los valores relativos de expresión de cada línea 
celular. Como se esperaba las 3 líneas celulares mostraron expresión basal del RNAm, siendo BMI-
1 y GLI-1 los de mayor expresión relativa en línea celular A427; mientras que A549 expresa ABCG2 
y SMO, en mayor nivel. La línea INER 37 mostró niveles ligeramente menores comparado con A427 
y A549, de manera interesante los niveles del activador de la vía GLI-1 son equivalentes en los 3 
modelos celulares, indicando la activación transcripcional de la vía de hedgehog (Figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5. Niveles de expresión basal 
del RNAm en modelos celualres 
de cáncer pulmonar. Expresión 
relativa basal de los genes de la 
vía de Hedgehog y genes 
implicados en fenotipo troncal-
quimioresistente en líneas 
celulares A549, A427 e INER 37. 
Los valores son relativos respecto 
a una mezcla un RNAm total que 
incluye a las 3 líneas. Valores 
relativos a GAPDH. Análisis 
realizados por duplicado. 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
BMI-1 ABCG2 GLI-1 SMO
Ex
p
re
si
ó
n
 r
e
la
ti
va
 (
G
A
P
D
H
) 
Expresión basal 
Mezcla líneas celulares
A549
A427
INER 37
24 
 
7.1.4 Expresión de la Vía Sonic Hedgehog y Marcadores Asociados a Fenotipo Stem-
Quimioresistente 
Con el objetivo de dilucidar si en efecto las células sobrevivientes a los tratamientos oncológicos