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Estudiando Biologia

10/8/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA
PATRONES DE GENES QUE CODIFICAN PARA ADHESINAS Y
RESISTENCIA A LOS AZOLES EN CEPAS DE Candida glabrata
AISLADAS DE PACIENTES CON CANDIDOSIS ORAL CRONICA

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

B I Ó L O G A

PRESENTA:

WENDOLY CRUZ MORENO

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. ERIC MONROY PÉREZ

Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de
México, 2016

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.

DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS
Esta tesis se la dedico a mi Padre Celestial por la oportunidad que me dio de elegir esta
carrera, le agradezco porque nací de buenos padres que me han guiado por un buen
camino. También agradezco a dios por darme cualidades tales como; paciencia,
dedicación y por todo el conocimiento que me brinda para concluir este importante
trabajo.
Al doctor Eric Monroy y a la doctora Gloria Luz Paniagua por estar siempre al pendiente
de mí, de mi trabajo, por animarme y apoyarme en este proyecto.
A mi madre Genoveva que me ha brindado toda su longanimidad, por preocuparse por mí,
por enseñarme que yo puedo realizar todo en esta vida confiando en mí y en dios, gracias
por estar en cada momento de mi vida te amo mama.
A mi padre Norberto por todos los sacrificios que ha hecho para verme plena, por
sostenerme y darme las fuerzas para seguir adelante. Gracias papi por ir por mi después
de mis prácticas de campo e invitarme a cenar y por escuchar mis aventuras.
A mis amadas hermanas Ana y Miriam gracias por hacerme feliz, porque con sus palabras
de alentó he terminado una de mis metas, por sus porras. Ana gracias por desvelarte
conmigo para estudiar para los exámenes, Miri gracias por recordarme día tras día que
debía terminar mi tesis.
A mis amigas Ericka y Leslie por todo el apoyo que me brindaron por esas noches locas el
cual juntábamos nuestro conocimiento para tener éxito, Eri tu y yo hasta final juntas y tú
también Les.
A mi amigo Carlos por apoyarme en mis trabajos y ser un gran amigo en mi vida.
A mi perro Terry el cual me daba alegría al llegar a casa por estar conmigo en las noches
haciendo tarea, por cuidarme y levantarme cada mañana.
Y por último a mi persona favorita Jorge gracias amor por tus palabras, por creer en mí
en que lo lograría, por hacerme feliz esto fue el empujón que necesitaba para concluir
esto te amo.
Se los dedico con amor.

INDICE PÁGINA
RESUMEN 1
1. INTRODUCCIÓN 2
1.1Especies del género Candida de importancia médica. 2
1.2Generalidades de Candida glabrata. 3
1.3Características fisiológicas de C. glabrata. 3
1.4Factores de virulencia de C. glabrata. 4
1.5Candidosis oral. 6
1.6Epidemiología. 6
1.7Resistencia a los azoles en Candida glabrata. 7
2. ANTECEDENTES 9
3. OBJETIVO GENERAL 10
3.1Objetivos particulares 10
4. JUSTIFICACIÓN 11
5. MATERIALES Y MÉTODOS 12
6. RESULTADOS 23
7. DISCUCIÓN 40
8. CONCLUSIONES 46
9. LITERATURA CITADA 47

RESUMEN
Candida glabrata es un patógeno oportunista responsable del 15% de los
pacientes no inmunocomprometidos que presentan candidosis oral. C. glabrata
posee una familia de genes subteloméricos llamada EPA, los cuales codifican
adhesinas de unión a las células epiteliales humanas y AED2 (adherence to
endotelial cells) y PWP7 que codifican para adherencia a células endoteliales. El
propósito de este trabajo fue determinar la presencia de genes de virulencia, la
resistencia a los azoles y los diferentes patrones de expresión de genes de
adhesión a células epiteliales y endoteliales en cepas de Candida glabrata de
origen oral, utilizando un modelo In vitro de epitelio reconstituido humano (RHE).
Se analizaron 39 cepas de C. glabrata previamente aisladas de pacientes no
inmunocomprometidos con candidosis oral crónica. Las cepas de C. glabrata
fueron identificadas por PCR mediante el gen rRNA. La detección de la familia
EPA (1, 3, 7, 9, 11,13 y 15) y de los genes de resistencia a los azoles (CgPDR1
CgPDH1) en las cepas de Candida glabrata se realizó por PCR convencional.
Para promover la expresión de los genes, las cepas de C. glabrata (con presencia
de los marcadores de virulencia) fueron crecidas en agar Sabouraud a 37ºC por
24 horas, después fueron inoculadas sobre la superficie de los epitelios e
incubadas a 37oC x 48 h, en 5% de CO2 y humedad saturada. La extracción del
RNA de C. glabrata se realizó utilizando el Qiacube, la reversotranscripción
mediante el equipo comercial de Qiagen y la expresión por PCR en Tiempo Real.
Los porcentajes de los genes identificados por PCR en las cepas de C. glabrata
fueron EPA 3 100% (n=39), EPA 1 89.7% (n=35), PWP7 100% (n=39), CgPDR1
100% (n=39) y CgPDH1 100% (n=39), mientras que los genotipos EPA 7, EPA 13,
PWP7 y AED2 se expresaron en el 100% (n=26) de las cepas de C. glabrata. Los
resultados demostraron que la cronicidad de la candidosis oral de los pacientes
no inmunocomprometidos puede deberse a la participación y expresión de los
genes de adhesión de la familia EPA, así como los genes CgPDR1 y CgPDH1 que
codifican la resistencia a los azoles.
2

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Especies del género Candida de importancia médica.
Los hongos del género Candida son un grupo de levaduras sumamente ubicuas y
con características muy diversas, este género abarca más de 160 especies, de las
cuales se considera que sólo 18 son patógenas para el hombre (López, 2005).
Entre los principales especies que ocasionan diferentes tipos de candidosis en el
hombre se encuentran; Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. krusei, C. dubliniensis, C. guilliermondii y C. zeylanoides (Carmody
y Kane, 1986: Tabla 1).

Especie de
candida
Sitios afectados Enfermedad subyacente
C. glabrata Tracto urinario, mucosa y tejido
hemático.
Infección por VIH, tumores,
leucemia, TMO y diabetes.
C. tropicalis Mucosa oral, infección de huesos
y articulaciones.
Infección por VIH, tumores,
leucemia y TMO*
C. dubliniensis Mucosa oral. Infección por VIH y TMO
C. krusei Mucosaoral e Infección
diseminada.
Infección por VIH, TMO y
leucemia.
C. parapsolosis Endocarditis e infección de
huesos y articulaciones.
Nacimiento prematuro,
nutrición parenteral y
catéter intravenoso.
Tabla 1. Especies de candida de importancia médica más comúnmente aisladas
(Moran y col. 2002). TMO* = trasplante de médula ósea.

1.2 Generalidades de Candida glabrata.
Candida glabrata pertenece a la familia Cryptococcaceae, es una levadura
haploide, anamórfica, no filamentosa, existe como comensal o patógeno en el
tracto gastrointestinal y genitourinario de los humanos y animales en forma de una
pequeña blastoconidia (Castañón, 2012). La incidencia cada vez mayor de
candidosis intrahospitalarias por Candida y su asociación en individuos
susceptibles que cursan con inmunodeficiencias hacen posible que estos
microorganismos, considerados comensales, se vuelvan patógenos oportunistas,
que se ven implicados en infecciones superficiales y sistemáticas tales como
septicemia, endocarditis, infecciones pulmonares e infección de la cavidad oral
(Castrillón, 2005). C. glabrata ha sido considerada como un saprobio al ser
frecuentemente aislada de piel, boca, vagina e inodoros. Crece en el agar
sabouraud como colonias lisas de consistencia blanda y de color crema,
constituidas por células de 2.0-4.0 x 3.0-5.5 μm de diámetro, presentan formas
individuales ovoides, incapaces de formar seudohifas o seudomicelio, pueden
formar una cadena corta de levaduras ovoides. En medios de cultivo líquidos
pueden formar un pequeño anillo y sedimento (Rippon, 1988).

1.3 Características fisiológicas de C. glabrata

Los blastoconidios de C. glabrata no asimilan el inositol y no poseen pigmento
carotenoide. La temperatura máxima de crecimiento es de 43-45ºC y la
temperatura óptima para las cepas de origen clínico es de 35-37 ºC. Solamente
fermenta la glucosa y la α-trealosa (Tabla 2). La proporción de guanina-citosina
que caracteriza el DNA de C. glabrata es aproximadamente del 40%, posee 11
cromosomas y su DNA mitocondrial es una molécula circular de 19 pb.

Tabla 2. Características diferenciales de C. glabrata y C. albicans.

1.4 Factores de virulencia de C. glabrata

C. glabrata posee diferentes factores de virulencia entre los que se encuentra la
familia de genes EPA (Epithelial Adhesin) que codifican para adhesinas con
afinidad para las células epiteliales de mamífero in vitro (Castaño et al., 2005).
La capacidad de adhesión es promovida principalmente por el gen EPA1
(Epithelial Adhesin 1), que codifica para una proteína de pared celular. Mutaciones
en EPA1, ocasionan la pérdida de adhesión de C. glabrata a células epiteliales in
vitro. El genoma de C. glabrata tiene más de 20 genes homólogos a EPA1,
algunos de los cuales se ha demostrado que codifican para adhesinas. La mayoría
de estos genes se encuentran localizados en regiones subteloméricos del genoma
y ésta localización tiene implicaciones importantes para su expresión ya que están
regulados negativamente mediante silenciamiento subtelomérico, de manera que
in vitro, todos los genes son silenciados excepto EPA1 (Castaño et al., 2005; De
Las Peñas et al., 2003). El silenciamiento subtelomérico, por posición cercana al
telómero (TPE), se ha descrito en S. cerevisiae y se sabe que participan una serie
de proteínas tales como Sir2p, Sir3p, Sir4p, Rap1p, Ku70p Ku80p y Rif1p (Rusche
et al., 2003). En S. cerevisiae, el silenciamiento subtelomérico comienza cuando la
Características Candida glabrata Candida albicans
Blastoconidios 2-5 x 4-6 µm 3-7 x 3-14 µm
Seudohifas No Si
Clamidosporas No Si
Número de cromosomas 11, haploide 7-9, diploide
Resistencia a triazoles +++ +
Asimilación de azúcares Glucosa y Trealosa Glucosa, sacarosa, maltosa,
trealosa, galactosa y arabinosa
5

proteína Rap1p se une a una serie de sitios de reconocimiento en los telómeros.
Rap1p recluta a su vez el complejo formado por Sir3p y Sir4p que a su vez
reclutan a Sir2p. La proteína Sir2p es una desacetilasa de histonas que utiliza
como cofactor NAD+. Esta desacetilasa quita grupos acetilo de las histonas H3 y
H4 que se encuentran en los nucleosomas aledaños a los telómeros y favorece la
formación de una estructura cerrada de la cromatina que no es favorable para la
transcripción (cromatina silenciosa). Se ha reportado que al menos 4 telómeros en
C. glabrata (los genes EPA1-7), están sujetos a silenciamiento subtelomérico
controlado por los genes SIR, RAP1 y RIF1 (Castaño et al., 2005; De Las Peñas et
al., 2003). Mutantes en estos genes eliminan el silenciamiento subtelomérico, y las
células se tornan hiperadherentes debido a que se expresan varios genes EPA. La
expresión de adhesinas es importante para la virulencia in vivo, porque una cepa
que lleva una delección de sir3, presenta un incremento de aproximadamente 3
veces en la colonización del riñón en un modelo de infección sistémica en ratones
(Castaño et al., 2005). Por otra parte, una cepa que no contiene ninguno de los
genes EPA1, EPA6, y EPA7, no coloniza eficientemente el riñón y la vejiga en un
modelo de infección de vías urinarias del ratón (Domergue et al., 2005) Estos
datos apuntan a la importancia de las adhesinas Epa1p, Epa6p y Epa7p en la
virulencia de C. glabrata. Se ha demostrado que EPA6 se induce en la vejiga y el
riñón durante una infección de vías urinarias del ratón. En este caso, la señal
importante para la de represión de EPA6, es la deficiencia de niacina o ácido
nicotínico (AN) en orina (Domergue et al., 2005). Otra característica importante de
C. glabrata es que presenta una alta capacidad de formar biofilms en superficies
de plástico, y la adhesina más importante para este fenómeno es EPA6. Así
mismo, mutaciones en SIR4 (que afectan silenciamiento), forman biofilms con una
mayor eficiencia, presumiblemente debido a la sobreexpresión de EPA6 (Iraqui et
al., 2005). Estos resultados pueden tener importantes implicaciones clínicas ya
que muchas de las infecciones están asociadas con catéteres implantados.
Otros genes que codifican para la adherencia en células endoteliales son AED2
(Adherence to Endotelial Cells) y PWP7 (PA14 domain containing Wall Protein)
(Desai et al., 2011).
6

1.5 Candidosis oral

Las infecciones micóticas de la cavidad oral son las patologías más frecuentes
causadas por las especies del género Candida. La colonización de la superficie
de la mucosa oral por Candida va a depender de la expresión de los distintos
genotipos de adhesión, aprovechando la baja respuesta inmune de los pacientes
infectados. La frecuencia de la candidosis oral (CO) oscila entre el 20% a 70%, y
se presenta debidos a diferentes factores, como el tratamiento prolongado con
antibióticos para combatir infecciones bacterianas, la diabetes mellitus, por la
inmunosupresión de pacientes en tratamiento contra el cáncer, SIDA, etc. (Aguirre,
2002). Candida glabrata se aísla en cavidad oral y vaginal de individuos sanos y
en las manos del personal sanitario. La colonización por esta levadura se
incrementa con la prolongación de la hospitalización y el deterioro clínico del
enfermo. Además de la candidosis oral, C. glabrata también puede ocasionar
candidosis vaginal o candidosis sistémica (Buitrón, 2009).

1.6 Epidemiología

El aumento de la frecuencia de las infecciones por Candida no solamente se
encuentra asociado de un importante incremento de la morbilidad y de las
estancias hospitalarias, sino también de un aumento de la mortalidad, por lo que
Candida glabrata se aísla cada vez con mayor frecuencia de muestras clínicas,
como agente de candidosis vaginal, o produciendo micosis sistémicas graves y
candidemia en los enfermos inmunodeprimidos y con neoplasias hematológicas o
sólidas (Tabla 3). En las mujeres afectadas de vaginitis conflujo aumentado, C.
glabrata corresponde a la especie aislada con mayor frecuencia después de C.
7

albicans, variando desde 0.6 a 36 %, con una frecuencia media entre el 15 a 20%.
También se han descrito algunos brotes epidémicos en las unidades de cuidados
intensivos (UCI), considerados como infecciones nosocomiales. En un estudio
realizado en Madrid por Muriel et al., en 2000, en donde se estudiaron 108 cepas
procedentes de muestras ginecológicas, 138 de la UCI neonatal y 71 de las UCI
de adultos, se encontró que C. glabrata fue identificada en el 19.4% de las
muestras vaginales (consideradas infecciones comunitarias), en el 27.5% de las
muestras neonatales, y en el 29.6% de las UCI de adultos. Estos datos
demuestran el frecuencia nosocomial predominante de C. glabrata respecto al
comunitario.

Infección comunitaria Vaginitis
Infección nosocomial. Enfermos inmunodeprimidos y debilitados.
Asociaciones. Frecuente con otras levaduras.
Origen de la infección. Frecuentemente exógeno.
Factores de riesgo de la infección
sistemática.
Sonda vesical (condidura).
Catéter vascular (candidemia).
Factores específicos de riesgos. Administración previa de fluconazol
hospitalización prolongada.
Tabla 3. Características de las infecciones por C. glabrata.

1.7 Resistencia a los azoles en Candida glabrata

En los últimos años el uso inadecuado de los antimicóticos, principalmente de los
azoles (fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol, etc.) para tratar los
diferentes tipos de candidas ocasionadas por las especies del género Candida,
incluyendo a C. glabrata, ha ocasionado con el tiempo la selección de cepas
resistentes a estos agentes. Se ha descrito que los mecanismos de la elevada
resistencia a los azoles en C. glabrata se debe a la sobreexpresión constitutiva de
8

las proteínas transportadoras ABC (ATP-binding cassette) que funcionan como
bombas de flujo, y las cuales son codificadas por los genes CDR1 (CgCDR1),
CgPDH1, y CgSNQ2 (Miyazaki et al. 1998). Estos transportadores son regulados
por el factor de transcripción binuclear de zinc del operón CgPdr1, un gen
homólogo al de Saccharomyces cerevisiae Pdr1 (ScPdrl) y al de los factores de
transcripción ScPdr3 (Vermitsky et al. 2006), CgPDR1, CgCDR1, CgPDH1 y
CgSNQ2. Todos estos genes contienen al menos un elemento de secuencia en
respuesta a la droga pleiotrópica (PDRE) en sus promotores, lo que sugiere que
CgPdr1 puede regular su propia expresión, así como la de los transportadores, a
través de la unión estos elementos de regulación (Torelli et al. 2008).
Recientemente se ha reportado que Pdr1 de C. glabrata (y Pdr1 de S. cerevisiae)
se unen directamente a fluconazol, lo que resulta en la activación de las bombas
de eflujo de las drogas, un mecanismo similar de regulación de la resistencia a
multidrogas (MDR) por el receptor pregnane X (PXR), un receptor nuclear en
vertebrados, también conocido como un esteroide cristalino hidrocarbonado.
Además un solo punto de mutación en el supuesto dominio funcional de CgPDR1
resulta en un incremento de transcripción de CgCDR1, CgPDH1, y CgSNQ2, así
como de un incremento de la resistencia a los azoles (Ferrari et al .2009).
Recientemente se encontró que existe una elevada variabilidad en las mutaciones
del dominio de CgPDR1, demostrando de ésta manera que la activación de la
mutación en la proteína CgPDR1 tiene un efecto no únicamente en la resistencia a
los azoles, sino también en la virulencia para causar enfermedad en el hospedero
(Ferrari et al .2009).

2. ANTECEDENTES
 De las Peñas y colaboradores en el 2003 estudiaron las glicoproteínas
de superficie relacionadas con la virulencia de Candida glabrata. Estas
adhesinas EPA son codificadas por regiones subteloméricas y el
silenciamiento de la transcripción depende de los genes RAP1 y SIR.
Estos autores demostraron que el silenciamiento de la región
subtelomérica de EPA depende de Sir3p y Rap1p.

 Irene y colaboradores en el 2005 analizaron la regulación transcripcional
y el control de la longitud de los telómeros de las adhesinas
subteloméricas en Candida glabrata. Estos autores demostraron la
existencia de múltiples genes EPA que codifican para adhesinas y
demostraron que la transcripción de al menos dos de estas adhesinas
es regulado por silenciamiento subtelomérico.

 Desai y colaboradores en el 2005 analizaron las adhesinas Pwp7p y
Aed1p ancladas a la pared celular de C. glabrata y demostraron que la
delección de los genes PWP7 y AED1 que codifican estas proteínas
resultó en una significativa reducción en la adherencia a las células
endoteliales. Estos datos indicaron que C. glabrata utiliza estas genes
para la adhesión a células endoteliales in vitro.

 Kelly y colaboradores en el 2010 examinaron los perfiles genómicos de
expresión de los genes que median la resistencia a los azoles del
hongo C. glabrata y demostraron que el gen CgPDR1 activa un amplio
repertorio de genes, lo cual provoca mutaciones activadoras específicas
que resultan en la activación de subconjuntos discretos de este
10

repertorio, por lo tanto la sobreexpresión condiciona la elevada
resistencia a los azoles.

3. OBJETIVO GENERAL
 Determinar los diferentes patrones de expresión de un grupo de genes de
adhesión a células epiteliales y endoteliales en cepas de Candida glabrata de
origen oral.

3.1 OBJETIVOS PARTICULARES

 Identificación de la especie de C. glabrata por PCR multiplex.

 Caracterización por PCR de punto final de los genes de la familia EPA 1, 3, 7,
9, 11, 13,15, AED2 y PWP7.

 Detección de los genes que codifican la resistencia a los azoles CgPDR1 y
CgPDH1 por PCR en las cepas de C. glabrata.

 Expresión de los genotipos de adhesión de las cepas de C. glabrata utilizando
un modelo in vitro de epitelio reconstituido humano (RHE).

 Identificación de las diferentes combinaciones de los genes de adhesión y
resistencia a los azoles en las cepas de C. glabrata.

4.0 JUSTIFICACIÓN
Debido al incremento de las candidosis orales por Candida glabrata en nuestro
país, es importante caracterizar los perfiles de expresión de los genes
involucrados en la adhesión celular durante un modelo in vitro de infección en
epitelio oral, así como de los marcadores genéticos que codifican la resistencia a
los azoles en un grupo de cepas de Candida glabrata de origen oral.

5. MATERIAL Y MÉTODOS

5.1 Obtención de muestras.
Las cepas de Candida spp. Fueron aisladas de pacientes no
inmunocomprometidos con infecciones orales que acudieron al Laboratorio de
Análisis Clínicos de la Clínica Universitaria de la Salud Integral (CUSI), ubicada en
la Facultad de Estudios Superiores (FES) Iztacala.

5.2 Toma y Siembra de las muestras
Las muestras de las infecciones orales de los pacientes fueron tomadas mediante
hisopos estériles y posteriormente se sembraron por el método de estría cruzada
en los medios sólidos de cultivo de Agar sangre, S-110 y sabouraud y se
incubaron a 37º C/ 24 horas. Al término las cepas del género Candida fueron
identificadas por morfología colonial y microscópica utilizando la tinción de Gram.

5.3 Extracción del ADN para la identificación de C. glabrata.
El ADN de las cepas del género Candida identificadas fue extraído por el método
de ebullición, para lo cual y después de obtener el crecimiento visible de las
colonias de Candida en el agar sabouraud por 24 h, se tomaron varias colonias
por medio de asas estériles y se depositaron en un tubo de rosca de 16 x 150 que
contenía 2 ml de agua desionizada estéril, la muestra se mezcló en un vortex por
20 segundos y se colocó a baño maria por 20 minutos.Al terminó la muestra se
depositó en contenedores con hielo por 10 minutos y se centrifugó en tubos
eppendorff a 12,000 rpm por 10 minutos. Finalmente se separó el sobrenadante
13

(que contenía el DNA templado) a otro tubo estéril y se guardó a – 20° C para su
posterior utilización.
5.4 Identificación de las distintas especies de Candida por PCR
multiplex.
La detección de las especies de Candida (Tabla 4) por PCR multiplex se llevó a
cabo por el método descrito por Luo & Mitchell, (2002). Para lo cual se realizó
primero un PCR sencillo de punto final con los oligonucleótidos universales para
el grupo de hongos ITS1 e ITS4 (5 pmol). El volumen final para la mezcla de
reacción fue de 25 microlitros; 1 microlitro de cada oligonucleótido (TS1 y TS4), 20
microlitros de H2O libre de nucleasa, 3 microlitros de ADN templado, 1.5 mmol de
MgCl2, 0.5 U de AmpliTaq polimerase y 100 mmol de dNTPs (PuRetaqTM Ready-
To-GoTM PCR beads). La amplificación del DNA se realizó bajo las siguientes
condiciones: desnaturalización inicial a 96°C por 5 minutos; seguido de 40 ciclos
a 94°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos.
Finalmente una extensión de 72°C por 15 minutos. Posteriormente se realizó el
PCR multiplex con los oligonucleótidos CALB1 y CALB2 (5 pmol), CGL1 y CGL2
(7 pmol), CPA1e, CPA3f y CPA2 (6 pmol), y CTR1 y CTR2 (4 pmol). El
volumen final para la mezcla de reacción fue de 25 microlitros; 1 microlitro de cada
primer, 15 microlitros de H2O libre de nucleasa, 3 microlitros de DNA templado, 1.5
mmol de MgCl2, 0.5 U de AmpliTaq polimerase y 100 mmol de dNTPs (PuRetaqTM
Ready-To-GoTM PCR beads). La amplificación del ADN se realizó bajo las
mismas condiciones que para ITS1 e ITS4. Las cepas de C. albicans ATCC 32354
y Candida glabrata (ATCC 90030) fueron utilizadas como controles positivos.

Tabla 4 Oligonucleótidos utilizados en la detección de las distintas especies patógenas del
género Candida.

5.5 Identificación de las genes EPA, AED 1, PWP7 y ACT1 PCR .
Los oligonucleótidos y las condiciones de PCR para la detección los genes EPA 1,
3, 7, 9, 11, 13, 15 fueron las descritos por De las peñas y colaboradores (2003)
(Tabla 5) y la de los genes AED 2, PWP7 y ACT1 por Desai y colaboradores
(2005) (Tabla 6). Para la amplificación por PCR para cada gen por separado se
utilizaron las perlas PuRetaq, que contenían 1.5 mmol de MgCl2, 0.5 U de Ampli
Taq polimerasa y 100 mmol de dNTPs, para un volumen final por mezcla de
reacción de 25 µl: por lo cual se tomó 1 µl de cada uno los oligonucleótidos
(Tabla 5 y tabla 6), 20 µl de agua libre de nucleasa y 3 µl de ADN templado. La
amplificación del ADN se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización
inicial a 96°C por 5 minutos; seguido de 40 ciclos a 94°C por 30 segundos, 58°C
Especie Nombre del
oligonucleótido
Secuencia del oligonucleótido (5´a 3´) Tamaños de los
amplicones (pb)
Todos los hongos ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
Variable ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
Candida albicans CALB1 TTTATCAACTTGTCACACCAGA
273 CALB2 ATCCCGCCTTACCACTACCG
Candida glabrata CGL1 TTATCACACGACTCGACACT
423 CGL2 CCCACATACTGATATGGCCTACAA
Candida
parapsilosis
CPA1e TTGGTAGGCCTTCTATATGGG
320
300
CPA3f GCCAGAGATTAA ACTCAACCAA
CPA2 CCTATCCATTAGTTTATACTCCGC
Candida tropicalis CTR1 CAATCCTACCGCCAGAGGTTAT
357 CTR2 TGGCCACTAGCAAAATAAGCGT
15

por 30 segundos y 72°C por 30 segundos. Finalmente una extensión de 72°C
por 15 minutos.
Gen Nombre del
oligonucleótido
Secuencia del primer (5-3) Tamaño del
amplicón (pb)
EPA 1 Forward GGGCTCAAAAACAGCTAAAG 143 pb
Reverse TAACAGTGTTTTCGTTTGAT
EPA 3 Forward GCATGTTGATAGTTCCAAAA 143 pb
Reverse TAATTTGATCAGTAGCACCG
EPA 7 Forward GGGTTCTCAAACAGCTAAGG 143 pb
Reverse TTACAGGGTTCGAATCTGAC
EPA 9 Forward GGCCTAATGAGGCTGACCAA 143 pb
Reverse GGCCTAATGAGGCTGACCAA
EPA 11 Forward GGCCCAATCAAGATAAGAAT 143 pb
Reverse TTAGTGGAGCCGGAGAATCG
EPA 13 Forward GGCCAGGCGTGAACAAAAAC 143 pb
Reverse TTTGCCGAATAGGCGAGTCA
EPA 15 Forward GGGCAAAAAAAGCCTCAAAA 143 pb
Reverse TTATTATTGCATTTGAATGC
Tabla 5 Oligonucleótidos utilizados en la PCR para la detección de los genes de la Familia
EPA que confieren adhesión.
Gen

Nombre del
oligonucleótido
Secuencia del primer (5-3) Tamaño del
amplicón
(pb)
AED2 Forward AGGATCCTGACGCAATGAGGCTTA 870pb
Reverse ACTTGCTGGAAAGCGAGGGAGTAT
PWP7 Forward TTCCGTGGTTACTTCATCCCACCA 137pb
Reverse AGAACCAGAACCACCTTCACCAGT
ACT1 Forward GTGGCAACGGTTTGATGC 124pb
Reverse GGCTTTCGATTTCTCACC
Tabla 6 Oligonucleótidos utilizados en la PCR para la detección de los genes de adhesión a
las células endoteliales.
16

5.6 Identificación por PCR de los genes que codifican la
resistencia a los azoles en las cepas de C. glabrata.
La identificación de los genes que codifican la resistencia a los azoles CgPDR1 y,
CgPDH1 se realizó por PCR de acuerdo a lo descrito por Caudle y colaboradores
(2010) (Tabla 7). Para la amplificación por PCR sencillo se utilizaron las perlas
PuRetaq, que contenían 1.5 mmol de MgCl2, 0.5 U de Ampli Taq polimerasa y 100
mmol de dNTPs, para un volumen final por mezcla de reacción de 25 µl: por lo
cual se tomó 1 µl de cada uno los oligonucleótidos (Tabla 7), 20 µl de agua libre
de nucleasa y 3 µl de ADN templado. La amplificación del ADN se realizó bajo las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 96°C por 5 minutos; seguido de
40 ciclos a 94°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos y 72°C por 30
segundos. Finalmente una extensión de 72°C por 15 minutos.

GEN Nombre del
oligonucleótido
Secuencia del primer (5-3) Tamaño del
amplicón
(pb)
CgPDR1 Forward TTTGACTCTGTTATGAGCGATTACG 51 pb
Reverse TTCGGATTTTTCTGTGACAATGG
CgPDH1 Forward ACGAGGAGGAAGACGACTACGA 63 pb
Reverse CTTTACTGGAGAACTCATCGCTGT
Tabla 7 Oligonucleótidos utilizados en la PCR para la identificación de los genes que
confieren resistencia a los azoles.

5.7 Análisis de las muestras amplificadas por PCR mediante
electroforesis en geles de agarosa
Después de la amplificación del ADN, 5 µl de cada amplicón fueron analizados
por electroforesis en geles de agarosa al 2%. La agarosa contenía 0.3 µl de
Midori Green (BioRad) por cada 100 ml de TB 1X. Las bajo condiciones de
corrimiento fueron: 120 volts, 94 miliampers por 120 minutos. Al término los geles
fueron fotografiados bajo luz UV utilizando el sistema de fotodocumentación
modelo GEL LOGIC 100 (KODAK).

5.8 Preparación del inóculo de C. glabrata para la cuantificación
de la expresión de los genes EPA, AED 1, PWP7 por PCR en
Tiempo Real.
Para promover la expresión de los genes, las cepas de C. glabrata (con presencia
de los marcadores de virulencia) fueron crecidas en agar Sabouraud a 37ºC por
24 horas. Posteriormente, y por medio de un asa estéril se tomó una colonia de C.
glabrata y se depositó en 10 ml de YPD (extracto de levadura peptona dextrosa).
El medio se incubó a 37º C por 24 horas. Al término, las células del cultivo se
colectaron por centrifugación (2,000 rpm por 3 minutos), se lavaron tres veces con
PBS y se contaron. Cuatro millones de células se inocularon en 10 ml de YPD y
se incubaron a 37º C por 24 horas. Al término las células del cultivo se colectaron
nuevamente por centrifugación (2,000 rpm por 3 minutos), se lavaron tres veces
con PBS y se contaron por triplicado (Green et al., 2004). Un inóculo de 4 x 107
células/ml se preparó para usarse en el epitelio oral humano (TR146), de
Laboratorio SkinEthic, Francia (Figura 1).

Figura 1. Placa con epitelio oral humano (TR146). Fotografía: Laboratorio Clínico,
FES-Iztacala, UNAM.

5.9 Inoculación en el epitelio oral humano
50 l de una suspensiónde C. glabrata/PBS (2 x 106 células en total) se depositó
en la superficie del epitelio oral humano (TR146), y se incubaron a 37oC x 49 h,
en 5% de CO2 y humedad saturada.

5.10 Extracción y purificación del ARN para la PCR en Tiempo
Real.
El ARN total de C. glabrata fue extraído utilizando el kit Rneasy (Qiagen; No. De
catálogo 74104) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y utilizando el
19

equipo QIAcube, para lo cual las levaduras se recolectaron del epitelio oral
humano (TR146) y en un tubo Eppendorf se preparó una dilución en PBS para
tener 7.5 x 108 células. El equipo QIAcube realizó lo siguiente: El tubo fue
centrifugado a 1000 g durante 4º C por 5 minutos. Se decantó totalmente el
sobrenadante, se re suspendieron las células del hongo en 2 ml de buffer Y1 con
lyticasa (50 U por 1 x 107 células) y se incubó de 10-30 minutos a 30ºC en
agitación suave. Posteriormente se centrifugó a 300 g (375 rpm) durante 5
minutos para formar el pellet de esferoplastos y se descartó el sobrenadante. Se
adicionaron 350 l de buffer RLT y el tubo se agitó en un vortex vigorosamente
para lisar los esferoplastos Si el material insoluble no fue visible, se centrifugó 2
minutos a máxima velocidad, y se usó el sobrenadante en los pasos siguientes.
Al término se adicionaron 350 l de etanol al 70% para homogeneizar el lisado, se
mezcló suavemente, se transfirieron 700 l a una columna contenida en un tubo
de 2 ml, se centrifugó a ≥ 8000 g (≥ 10,000 rpm) por 15 segundos y el líquido de
flujo se descartó. Posteriormente se adicionaron 700 l de buffer EW1 a la
columna, se centrifugó a ≥ 8000 g (≥ 10,000 rpm) por 15 segundos para lavar la
membrana y el líquido de flujo se descartó. Al término se adicionaron 500 l de
buffer RPE a la columna, se centrifugó ≥ 8000 g (≥ 10,000 rpm) por 15 segundos
para lavar la membrana y el líquido de flujo se descartó. Nuevamente se
adicionaron 500 l de buffer RPE a la columna, se centrifugó ≥ 8000 g (≥ 10,000
rpm) por 2 minutos para lavar la membrana y líquido de flujo se descartó. Al
término se colocó la columna en un tubo colector nuevo de 2 ml, se centrifugó a
máxima velocidad por 1 minuto. De nueva cuenta se colocó la columna en un tubo
20

colector nuevo de 1.5 ml, se adicionaron de 30-50 l de agua libre de Rnasas
directamente sobre la membrana de la columna y se centrifugó ≥ 8000 g (≥
10,000 rpm) por 1 minuto para obtener el ARN. La concentración y pureza total
del ARN fue medida utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000. El ARN
esperado debió de ser < 30 g. El ARN es muy inestable, por lo que
inmediatamente se realizó la reversotranscripción a ADNc.

5.11 Reversotranscripción con eliminación de ADN genómico.
Para realizar el proceso de la reversotranscripción de ARN a ADNc se utilizó el kit
Quantitec Revere Transcription (Qiagen; No. De catálogo 205311) siguiendo las
instrucciones del fabricante como sigue:
Eliminación del ADN genómico.
Se descongelaron los componentes del Kit a temperatura ambiente (15-25ºC).
Para un volumen final por reacción de 14 microlitros se depositó en un tubo
eppendorf de 0.2 ml cada uno de los siguientes componentes (Tabla 8):

Componente Volumen/reacción Concentración final
gADN Wipeout buffer, 7x 2 microlitros 1x
ARN templado 1 microgramos -
Agua libre de Rnasa 11 microlitros -
Volumen total 14 microlitros -
Tabla 8. Componentes de reacción utilizados para eliminar el ADN genómico.

Posteriormente se incubó el tubo a 42º C por 2 minutos, e inmediatamente se
colocó en hielo.

Preparación de la master mix para la reversotranscripción
La master mix contenía todos los componentes necesarios para la síntesis de la
primera cadena de ADNc. Para un volumen final por reacción de 20 microlitros
se depositó en un tubo eppendorf de 0.2 ml cada uno de los siguientes
componentes (Tabla 9):
Componente Volumen/reacción Concentración final
Master mix para
reversotranscripción
Quantiscript Reverse
Transcriptasa (contiene inhibidor
de Rnasas)

1 microlitro

Quantiscript RT buffer, 5x
(incluye Mg2+ y dNTPs)
4 microlitros 1x
RT Primer Mix 1 microlitro -
ARN Templado (obtenido en la
reacción anterior)
14 microlitros -
Volumen total 20 microlitros -
Tabla 9. Componentes de reacción utilizados para la reversotranscripción.

Al término se mezcló el tubo y se mantuvo en hielo hasta incubarlo a 42ºC por 15
minutos. Posteriormente se incubó a 95ºC por 3 minutos para inactivar la
transcriptasa reversa. Finalmente se guardó la reacción (ADNc) a -20º C hasta su
utilización en PCR en Tiempo Real.
22

5.12 Preparación de la mezcla de reacción para PCR en Tiempo
Real utilizando SYBR®Green.
Los oligonucleótidos empleados para la cuantificación de la expresión de los
genes EPA, AED 2, PWP7 de C. glabrata fueron los mismos utilizados en la
PCR convencional (Tablas 5 y 6, respectivamente). Para el ensayo de PCR en
Tiempo Real se utilizó el kit Rotor Gene SYBR®Green PCR (Qiagen), siguiendo
las instrucciones del fabricante. El volumen final de la mezcla de reacción fue de
25 microlitros; 12.5 microlitros Master Mix SYBR Green, microlitro del primer
Forward (1 m), 1 microlitro del primer Reverse (1 m), 2 microlitros (20 ng de
ADNc) y 8.5 microlitros de Rnasa-Free-Water. Las condiciones de amplificación
fueron: 95°C durante 5 minutos (activación de la HotStart), 40 ciclos de
desnaturalización a 95°C durante 5 segundos y la combinación de
alineación/extensión de 60°C por 10 segundos
El gen rARN de C. albicans se utilizó como gen de referencia. La cepa de C.
albicans ATCC 32354 fue utilizada como control positivo.

6. RESULTADOS

6.1 Pacientes estudiados
Para el desarrollo de este trabajo se analizaron 40 cepas de C. glabrata de
pacientes con candidosis oral crónica. El 55% (n=22) fueron mujeres y el 45%
(n=18) hombres (Gráfica 1). En la gráfica 2 se observa que los pacientes
presentaron una edad comprendida en el rango de 22 a 57 años, la frecuencia
más alta se encontró dentro del rango de 30-40 años con un 40% (n=16), seguido
por el de 40-50 años con el 30% (n=12), posteriormente se encontró el rango de
22-30 años con el 17.5% (n=7). La frecuencia más baja se observa dentro del
rango de 50-57 años con el 12.5% (n=5).

6.2. Identificación de Candida glabrata por PCR multiplex.
Se analizaron 40 cepas del género Candida spp. Obtenidas de pacientes con
candidosis oral crónica. Para la identificación de las distintas especies del género
Candida se llevó a cabo el método de PCR multiplex (Fotografía 1.) el cual
amplifica regiones internas del gen rRNA de cada especie (tabla 4). El 97.5%
(n=39) de las cepas correspondió a la especie Candida glabrata (Fotografía 2),
mientras 2.5% (n=1) correspondió a Candida tropicalis. El tamaño del amplicón fue
de 423 pb (Fotografía 1).

6.3 Detección de los genes EPA, AED 2, PWP7 y ACT1 por PCR
convencional en cepas de Candida glabrata.
La frecuencia de los genes de la familia EPA se observa en la tabla 10 y los
genes de adhesión endoteliales tabla 11. Los genes de la familia EPA detectados
con mayor frecuencia fueron EPA 3 (100%, n=35) (Fotografía 4), EPA 7 (94.8%,
n=37) ( Fotografía 5), EPA 1 (89.7%, n=35) ( Fotografía 3), EPA 11 (89.7%, n=35)
(Fotografía 7), EPA 15 (89.7%, n=35) (Fotografía 9), EPA 9 (87.1%, n=34)
(Fotografía 6) y EPA 13 (58.9%, n=23) (Fotografía 8). Mientras los genes de
adhesión endotelial con mayor frecuencia fueron PWP7 (100%, n=39) (Fotografía
10), AED 2 (100%, n=39) (Fotografía 11) y finalmente ACT 1 (92.3%, n=36).

Genes de la
familiaEPA
No. (%)
EPA 1 35 89.7
EPA 3 39 100
EPA 7 37 94.8
EPA 9 34 87.1
EPA 11 35 89.7
EPA 13 23 58.9
EPA 15 35 89.7
Genes No. (%)
PWP7 39 100
AED2 39 100
ACT 1 36 92.3
Tabla 10. Detección de los genes
de la familia EPA en cepas de
Candida glabrata.
Tabla 11. Detección de los
genes que codifican adhesinas
endoteliales en cepas de
Candida glabrata.
27

7.4 Identificación por PCR
convencional de los genes que
confieren resistencia a los azoles en
cepas de C. glabrata.
Los genes CgPDR1 y CgPDH1 fueron identificados en el 100% (n= 39) de las
cepas (Tabla 12 y Fotografías 12 y 13).
Genes No. (%)
CgPDR1 39 100
30

CgPDH1 39 100
Tabla 12. Detección de los genes que
codifican resistencia a los azoles en cepas
de C. glabrata.

Tabla 12. Detección de los genes que
codifican resistencia a los azoles en
cepas de C. glabrata.

6.5 Identificacion de las combinaciones de los genes que
codifican adhesión y resistencia a los azoles en las cepas de C.
glabrata.
Se identificaron 13 patrones distintos en las cepas de C. glabrata (Tabla 13),
dentro de los cuales el patrón No. 1 conformado por 12 genes (EPA 1, EPA 3,
EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13, EPA 15, ACT 1, PWP7, AED2, CgPDR1 y
CgPDH1) se encontró en el 30.7% (n=12) de las cepas, seguido por el patrón
No.2 conformado por 11 genes (Epa 1, Epa 3, Epa 7, Epa 9, Epa 11, Epa 15, ACT
1, PWP7, AED2, CgPDR1 y CgPDH1) con el 23% (n=9). Los otros patrones se
observan en la tabla 13.

N° patrón Combinación de genes N° de cepas %
1 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13,
EPA 15, ACT 1, PWP7, AED2, CGPDR1 Y
CGPDH1
12 30.76%
2 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 15,
ACT 1, PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
9 23%
3 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13,
EPA 15, PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
3 7.69%
4 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 13, EPA 15, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
3 7.69%
5 EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13, EPA 15,
ACT 1, PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
2 5.12%
6 EPA 1, EPA 3, EPA 9, EPA 11, EPA 15, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
2 5.12%
7 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 15, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
2 5.12%
8 EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 15, ACT 1, 1 2.56%
32

Tabla 13. Diferentes patrones de los genes de virulencia y resistencia a los azoles
en las cepas de C. glabrata.
6.6 Expresión de los genes de virulencia en las cepas de C.
glabrata por PCR en Tiempo Real utilizando un modelo in vitro de
epitelio oral humano.
Para llevar a cabo la expresión de los genes se seleccionaron 26 cepas de C.
glabrata portadoras de los genes de virulencia. Únicamente 7 genes (EPA 1,
EPA 7, EPA 9, EPA 13, PWP7, AED2 Y ACT 1) se expresaron después de la
infección in vitro del epitelio oral (Tabla 13). Los genes expresados con mayor
frecuencia fueron EPA 7 (100%, n=26) (Fotografía 14 y 15 ), EPA 13 (100%, n=26)
(Fotografía 20 y 21 ), PWP7 (100%, n=26) (Fotografía 22 y 23), AED2 (100%,
n=26) ( Fotografía 24 y 25 ), EPA 9 (96.1%, n=25) (Fotografía 18 y 19), ACT1
(34.6%, n=9) (Fotografía 26 y 27) y finalmente EPA 1 (11.5%, n=3) (Fotografía 14
y 15 ), mientras que los genes EPA 3, EPA 15 y EPA 16 no se expresaron.
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
9 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 11, EPA 15, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
1 2.56%
10 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 11, EPA 13, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
1 2.56%
11 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13,
ACT 1, PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
1 2.56%
12 EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
1 2.56%
13 EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13, ACT 1,
PWP7, AED2, CGPDR1 Y CGPDH1
1 2.56%
Genes No. (%) De
expresión
33

EPA 1 3 11.5%
EPA 7 26 100%
EPA 9 25 96.1%
EPA 13 26 100%
PWP7 26 100%
AED2 26 100%
ACT 1 9 34.6%
Tabla 14. Expresión de los genes en las cepas de C.
glabrata después de la infección in vitro del epitelio oral.
34

"
,.
"
'"
'"
"
"'
"'
Tl'r esl1 c>d
"'
" NTe
Fotografía 14. Detección de la expresión de l gen EPA1 en las cepas de C. glabrata por PCR en
Tiempo Real, utilizando SY BER® Green. La lectura se realizó en el cana l verde. NTC= No
Control Templado; Control Positivo= C.glabrata (ATCC 155455).
EPA 1
Fotografia 15. Curva de fusión (Melting point) de la corrida del gen EPA 1
35

"
"
'"
"'
•••
"'
o
"" ,
z
"'
"'
03
"'
"'
""
Thres m
Control positivo--,~
10 15 20 25 :Il 35 40
q<-
Fotografía 16. Detección de la expres ión del ge n EPA 7 en las cepas de C. glabrata por PCR
en Tiempo Rea l, utili zando SYBER® Green. La lectura se realizó en el canal verde. NTC= No
Control Templado; Control Pos itivo= C.glabrata ( ATCe 155455).
EPA 7 ,.
Productos espedficos
Fotografía 17. CUf'/ a de fusión (Mell ing poinl ) de la corrida del gen EPA 7. Los productos
espec íficos muestran una temperatura más alta que los productos inespec íflcos.
1I
36

055
Fotografía 18. Detección de la expresión del gen EPA 9 en las cepas de C. glabrata por PCR en
Tiempo Real, ut ilizando SYBER® Green. La lectura se realizó en el canal verde. NTC= No
Control Templado; Control Positivo= C.glabrata ( ATCC 155455).
4.0
"
EPA 9
"
"
~ 20 Productos especificos
1.5
, .•
"
00
" . ",
Fotografía 19. Curva de fus ión (Me lting po int) de la corrida del gen EPA 9. Los productos
específicos muestran una temperatura más alta que los produc tos inespecíficos .
37

'"
"
u
"
o."
Control positivo
o.,
"'
"'
Thresl10 kl NTe
00
Fotografía 20. Detección de la expresión del gen EPA 13 en las cepas de C. glabrata por
PCR en Tiempo Rea l, utiliza ndo SY BER(R) Green. La lectura se rea lizó en el canal verde
NTC= No Control Templado; Control Pos itivo= Cglabrata (ATCC 155455).
EPA 13
Fotografía 21. Curva de fusión (Mell ing point) de la corrida del gen EPA 13. Los productos
espec íficos muestran una temperatura más alta que los productos inespec íficos.
38

'"
Fotografía 22. Detección de la expresión del gen PWP7 en las cepas de e glabrata por
PCR en Tiempo Real, utilizando SYBER® Green. La lectura se realizó en el canal verde.
NTC= No Control Templado: Control Posit ivo= C.glabrata ( ATCC 155455).
PWP7
Productos especificos
O" •
Fotografía 23. Curva de fusión (Mell ing point) de la corrida del gen PWP7. Los productos
espec íficos muestran una temperatura más alta que los productos inespec íficos.
39

i
NTe
JI
Fotografía 24. Detección de la expres ión del gen AED2 en las cepas de C. glabrata por PCR en
Tiempo Real, utilizando SYBER® Green. La lectu ra se reali zó en el canal verde. NTC= No
Control Templado; Control Posit ivo= Cglabrata (ATCe 155455).
A ED2
Fotografía 25. Curva de fus ión (Melting point) de la corrida del gen AED2. Los productos
espec íficos muestran una temperatura más alta que los productos inespecíficos.
40

7. DISCUSIÓN
7.1 Análisis de los pacientes estudiados con candidosis oral.

En este estudio se analizaron 40 cepas del género Candida aisladas de pacientes
con candidosis oral (22 mujeres y 18 hombres, Gráfica 1), dentro de las cuales
treinta y nueve pertenecieron a la especie de C. glabrata (Figura 1 y 2). Se ha
descrito que C. albicans es el agente causal responsable del 80% de los casos de
candidosis oral, mientras el 20% son ocasionadas por otras especies como C.
glabrata, C. krusei, C. parapsilosis entre otras (Furneri, 2008). Arevalo en un
estudio realizado en 1989 encontró que C. albicans fue la especie más frecuente
en infecciones orales (78.7%), seguido por C. tropicalis (8,1 %), C. parapsilosis
(5,4 %) y C. glabrata (5.3 %). Estosresultados nos hacen suponer que en un
período de 10 años ha ocurrido una disminución de la frecuencia de C. albicans en
la candidosis oral, mientras que la frecuencia de otras especies como C. glabrata
se han incrementado,
Rueda et al., (2011) realizaron un estudio en donde analizaron los cultivos orales
de 149 individuos (32 mujeres), encontrando en el 38.3% (n=57) de ellos alguna
especie del género Candida, dentro las cuales la especie más frecuente fue C.
albicans seguida por C. glabrata. La candidosis oral es una infeccion causada por
hongos del genero Candida (Gamboa et al., 2006). La colonización de la cavidad
oral por especies de Candida ha sido definida como la adquisición y el
mantenimiento del microorganismos sin signos clínicos, esta colonización ha sido
asociada a la presencia de caries, mala higiene bucal, uso de prótesis dentales,
maloclusión, entre otros (Martins et al., 2010).
Diversos factores se han asociado al incremento de las candidosis orales, tales
como, SIDA, cáncer, diabetes, leucemia, extremos de la edad (niños y ancianos),
utilización de antibioticos de amplio espectro, quimioterapias, terapias en cuidados
intensivos, trasplantes de órganos y síndromes metabólicos (Pfaller et al., 2007).
En la población en general, se han reportado porcentajes de portadores
asintomácos de Candida del 17 al 75% (Jaimes et al., 2008). En la cavidad oral,
42

Candida albicans ha sido la especie más frecuentemente reportada (47-75% de
las levaduras aisladas). Asimismo, otras especies también han sido idenficadas,
como son C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, C.dubliniensis y
Candida guillermondii (Rueda et al., 2011) .

7.2 Identificación de los genes de la Familia EPA, AED2, PWP7 y
ACT1 por PCR convencional en las cepas de Candida glabrata.

La patogenicidad de C. glabrata se debe a los diferentes factores de virulencia
que posee, entre los que se encuentra la familia de genes EPA (Epithelial
Adhesin) que codifican para adhesinas con afinidad para las células epiteliales de
mamífero in vitro (Castaño et al., 2005). En este estudio se encontró que Los
genes de la familia EPA detectados con mayor frecuencia fueron EPA 3 (100%,
n=35) (Fotografía 4), EPA 7 (94.8%, n=37) (Fotografía 5), EPA 1 (89.7%, n=35) (
Fotografía 3), EPA 11 (89.7%, n=35) (Fotografía 7), EPA 15 (89.7%, n=35)
(Fotografía 9), EPA 9 (87.1%, n=34) (Fotografía 6) y EPA 13 (58.9%, n=23)
(Fotografía 8). En C. glabrata las únicas proteínas de adhesión son las Epa,
mientras que en C. albicans se enceuntran las proteínas Als (Hoyer, 2001),
Hwp1 (Staab et al., 1999) y Eap1 (Li & Palecek, 2003). Se ha descrito que Epa1
es un miembro de una gran clase de proteínas de la pared celular anclado a
glicosilfosfatidilinositol (GPI-CWP) encontrado en diversas especies de hongos,
incluyendo Saccharomyces cerevisiae, C. glabrata, C. albicans, y Aspergillus
fumigatus (Brul et al., 1997; Kapteyn et al., 2000; Klis et al., 2001). En C. glabrata
Epa1 es la proteína más importante de la adhesión in vitro en cultivos de células
epiteliales humanas (Cormack et al., 1999). Alejandro De Las Peñas et al., (2003)
demostraron que los genes EPA6, EPA7 y EPA1 codifican para adhesinas
capaces de mediar la adherencia a las células epiteliales, lo cual representó la
primera evidencia de que la familia EPA participa en la adhesión celular a células
epiteliales. Recientemente Zupancic et al., (2008) describieron que Epa1 y Epa7
también contribuyen a la adherencia a las células endoteliales.
43

En este estudio los genes de adhesión a células endoteliales identificados con
mayor frecuencia fueron PWP7 (Fotografía 10) y AED 2 (Fotografía 11) con el
100%, en cada caso (n=39), mientras que ACT 1 se identificó en el 92.3% (n=36).
Se ha descrito la participación de las proteínas Pwp7 y Aed2 de C. glabrata en la
adhesión a células endoteliales in vitro (Castaño et al 2005). Como ya
mencionamos, AED2 es importante para la adhesión de las células endoteliales en
humanos, lo que constituye un importante factor de patogenicidad para las
infecciones sistémicas ocasionadas por C. glabrata ( Desai et al., 2011).
Recientemente se reportó que PWP7 y AED1 poseen un largo intragénico Tándem
de secuencias repetidas con un rango de tamaño de 132 a 195 nucleótidos.
Pwp7p y Aed1p contienen un conservado “SHITT” de secuencias repetidas, de 5
para Pwp7 y de 6 veces para Aed1p. El tamaño de las repeticiones del tándem
es diferente en PWP7 (195 nucleótidos cada repetición) y AED1 (132 nucleótidos
cada repetición). No hay ningunas repeticiones de tándem “SHITT” en Aed2p. A
causa de su tamaño, dieron a estas secuencias de repetición de tándem el
nombre “megasatélites” y como se describió, están presentes sólo en C. glabrata y
su pariente de levadura más cercano Kluyveromyces delphensis (Rolland et al.,
2010; Thierry et al., 2008). De modo interesante, estas secuencias de repetición
son encontradas sólo en genes que codifican para proteínas de la pared celular,
sugiriendo que ellas pueden tener un rol en la adherencia y patogenicidad (Thierry
et al., 2008; Thierry et al., 2010).

7.3 Identificación por PCR convencional de los genes que
confieren resistencia a los azoles en las cepas de Candida
glabrata.
En este estudio se encontró que los genes CgPDR1 y CgPDH1 que codifican
para la resistencia a los azoles (Tabla 12 y Fotografías 12 y13), estuvieron
presentes en todas las cepas (n=39,100%) de Candida glabrata. Se ha descrito
que los mecanismos de la elevada resistencia a los azoles en C. glabrata se debe
a la sobreexpresión constitutiva de las proteínas transportadoras ABC (ATP-
44

binding cassette) que funcionan como bombas de flujo, y las cuales son
codificadas por los genes CDR1 (CgCDR1), CgPDH1, y CgSNQ2 . Caudle et al.,
2010 demostró que el gen CgPDR1 regula diversos grados de expresión de los
genes transportadores ABC (CgCDR1, CgPDH, y CgSNQ2). La elevada
frecuencia de los genes que codifican para resistencia a los azoles encontrada en
este estudio en las cepas de C. glabrata, podría deberse al uso indiscriminado de
los azoles, en cuyo caso las cepas se han seleccionado como resistentes, debido
probablemente a mutaciones del gen CgPDR1. Estos resultados ponen de
manifiesto que en México ha ocurrido un notable incremento de cepas de C.
glabrata portadoras de genes que codifican para la resistencia a los azoles, por lo
que se considera importante utilizar otros antifúngicos para tratar las candidosis
orales por este tipo de hongos.

7.4 Identificación de las diferentes combinaciones de los genes
de adhesión y de resistencia a los azoles en las cepas de C.
glabrata.
En este estudio se encontraron 13 patrones distintos de asociación de los genes
de adhesión, de ACT 1 y de los marcadores de resistencia a los azoles en las
cepas de C. glabrata estudiadas (Tabla 13), dentro de los cuales el patrón No. 1
conformado por 12 genes (EPA 1, EPA 3, EPA 7, EPA 9, EPA 11, EPA 13, EPA
15, ACT 1, PWP7, AED2, CgPDR1 y CgPDH1) se encontró en 12 cepas. Estos
resultados reflejan que las cepas de C. glabrata estudiadas podrían presentar
diversos perfiles de expresión durante el proceso de infección de la candidosis
oral, por lo que suponemos que las cepas con más marcadores de virulencia
podrían ser más patógenas para los pacientes, en donde los procesos infecciosos
podrían volverse crónicos, debido a la elevada frecuencia de los genotipos que
codifican para la resistencia a los azoles.

7.5 Determinación de la expresión de los genes de adhesión en
las cepas de C. glabrata utilizando un modelo in vitro de epitelio
oral.
Con el propósito de determinar la expresión de los genes de adhesión utilizando
un modelo in vitro de epitelio humano oral, se seleccionaron 26 cepas de Candida
glabrata portadoras de la mayoríade los genes de virulencia. El 100% (n=26) de
las cepas de C. glabrata expresó los genes EPA 7 (Tabla 17 y fotografía 14 y 15),
EPA 13 (Fotografía 20 y 21), PWP7 (Fotografía 22 y 23) y AED2 (Fotografía 24 y
25), el 96.1% (n=25) EPA 9 (Fotografía 18 y 19), 34.6% (n= 9) ACT1 (Fotografía
26 y 27) y finalmente el 11.5% EPA 1 (n=3) (Fotografía 14 y 15 ), mientras que los
genes EPA 3, EPA 15 y EPA 16 no se expresaron. Se ha descrito que EPA 1 es el
principal gen de adhesión a la células epiteliales de 45mamífero in vitro (Castaño
et al., 2005), sin embargo en este estudio solamente tres cepas fueron capaces de
expresarlo (11.5%, Fotografía 14 y 15). Este hecho puede deberse a que se ha
descrito que EPA1 es débilmente transcrito en la fase estacionaria de crecimiento,
en donde probablemente se encontraban nuestras células, por consiguiente, se ha
reportado que las células de C. glabrata en la fase estacionaria no son adherentes
a una variedad de células epiteliales (Lec2 células, así como a células HeLa, células
A498 y células T24) (Castaño et al., 2005). Los resultados también concuerdan
con los resultados de Kaur y col. (2007), quienes describieron que EPA 1 se
expresa principalmente a las 3 horas y empieza a disminuir a las 6 horas.
Se ha reportado que al menos 4 telómeros en C. glabrata (los genes EPA1-7),
están sujetos a silenciamiento subtelomérico controlado por los genes SIR, RAP1
y RIF1 (Castaño et al., 2005; De Las Peñas et al., 2003). Se ha reportado que
mutantes en estos genes eliminan el silenciamiento subtelomérico, y las células se
tornan hiperadherentes debido a que se expresan varios genes EPA. Estas
mutaciones probablemente pueden encontrarse en las cepas de C. glabrata,
estudiadas, debido a que los genes EPA7, EPA9 y EPA13 (Fotografías 14, 18 y
20, respectivamente) fueron capaces de expresarse in vitro, después de la
infección del epitelio oral humano.
46

Por otro lado los genes PWP7 (Fotografía 22) y AED2 (Fotografía 24) fueron
capaces de expresarse en todas las cepas estudiadas (n=26) después de la
infección del epitelio. Aunque es bien conocido que estos genes tienen afinidad
para las células endoteliales (Desai et al., 2011), y la subsecuentes infecciones
sistémicas, en este trabajo se demostró que estos marcadores genéticos también
se expresan durante infecciones a células epiteliales.

8. CONCLUSIONES
1. En este estudio se encontró que Candida glabrata fue la especie aislada con
más frecuencia de los pacientes no inmunocomprometidos con candidosis oral.
2. Los genes de la familia EPA detectados con mayor frecuencia en las cepas de
C. glabrata fueron EPA 3, EPA 7, EPA 1, EPA 11, EPA 15 y EPA 9.
3. Todas las cepas de C. glabrata fueron portadoras de los genes PWP7 y AED2
que codifican para adhesión a células endoteliales y de los marcadores CgPDR1
y CgPDH1 que codifican para resistencia a los azoles.
4. Las cepas de C. glabrata presentaron diferentes patrones de combinaciones de
marcadores de virulencia y de resistencia a los azoles.
5. En este estudio se demostró que la mayoría de las cepas de C. glabrata fue
capaz de expresar los genes EPA 7, EPA 13, PWP7, AED2 y EPA 9 después de
la infección in vitro del epitelio oral humano.

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Portada
Índice
Resumen
1. Introducción
2. Antecedentes
3. Objetivo General
4. Justificación
5. Material y Métodos
6. Resultados
7. Discusión
8. Conclusiones
9. Literatura Citada