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Estudiando Biologia

10/8/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOMEDICINA

PERFILES DE PRODUCCIÓN DE CITOCINAS EN MODELOS DE INFECCIÓN IN
VITRO POR VIRUS ZIKA
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRESENTA:
BQD. RUBÉN ROBERTO GONZÁLEZ FERNÁNDEZ

TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. SALVADOR FONSECA CORONADO
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM.
COMITÉ TUTOR: DRA. SANDRA DIAZ BARRIGA ARCEO
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM.
M. en C. KARINA RUIZ TOVAR
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM

Ciudad Universitaria, Cd. Mx. OCTUBRE, 2018

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOMEDICINA

PERFILES DE PRODUCCIÓN DE CITOCINAS EN MODELOS DE INFECCIÓN IN
VITRO POR VIRUS ZIKA
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRESENTA:
BQD. RUBÉN ROBERTO GONZÁLEZ FERNÁNDEZ

Ciudad Universitaria, Cd. Mx. OCTUBRE, 2018

pose;
Ciencias UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
DIVISiÓN ACADEMICA DE INVESTIGACiÓN Y POSGRADO
COORDINACiÓN
OFICIO FCIE/DAIPI976/2018
Lic . Ivonne Ram írez Wence
Directora General de Administración Escolar, UNAM
Presen te
ASUNTO: Oficio de Jurado
Me permito mformar a usted Que en la reun ión ordinana del Comité Académico del Posgrado en Ciencias
Biológ icas, celebrada el dia 17 de septiembre de 2018 se aprobÓ el siguiente jurado para el examen de
grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS en el campo de conocimiento de Biomedic ina del (la)
a lumno(a) GONZÁLEZ FERNÁNDEZ RUBÉN ROBERTO con numero de cuenta 409081835 con la tesis
mulada " PERFILES DE PRODUCCiÓN DE CITOCINAS EN MODELOS DE INFECCiÓN IN VITRO POR
VIRUS ZIKA", realizada baJO la dirección del (la) DR. SALVADOR FONSECA CORONADO:
Presidente
Vocal:
Secreta rio:
Suplente:
Suplente:
DR. CARLOS CABELLO GUTlERREZ
DR. ALEJANDRO ESCOBAR GUTIÉRREZ
ORA. SAN ORA DiAl BARRIGA ARCEO
ORA. OlGA NOHEMI HERNÁNDEZ DE LA CRUZ
M. EN C. KARINA RUIZ laVAR
Sin otro partICular, me es grato enviarle un cordial saludo.
AGNSNMVAlASR/grf°
ATENTAMENTE
" POR MI RAZA HABLARA EL EspíRITU"
Ciudad Unrversitarla. Cd Mx., a 3 de octubre de 2018
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AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES

Primeramente, al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional
Autónoma de México por brindarme la oportunidad de estar dentro de programa
de Maestría y darme las herramientas necesarias para continuar con mi formación
académica, por permitirme una capacitación de alta calidad, lo que sin duda me
permitió desarrollar mi proyecto de investigación.

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo recibido
durante toda la maestría través de la beca CONACYT 778421.

Agradezco a mi Tutor principal Dr. Salvador Fonseca Coronado y a los miembros
de mi Comité Tutor la Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo y la M. en C. Karina Ruiz
Tovar, por todo el apoyo brindado durante el posgrado, por toda la paciencia,
disposición y comprensión durante la realización de mi proyecto de investigación.
Sin duda contribuyeron en mi formación tanto académica como personal.

AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL

Al Dr. Carlos Cabello Gutiérrez, por todas sus contribuciones al proyecto, por
abrirme las puertas de su laboratorio sin esperar nada a cambio, sin su apoyo
simplemente no hubiera sido posible la culminación del mismo, espero algún día
poderle retribuir aunque sea un poco de todo lo que usted me dio, muchas gracias
por todo.

Al M. en C. Fernando Hernández Sánchez por sus consejos y recomendaciones,
por la capacitación continua y su apoyo durante la realización de este proyecto.

A todo el personal del laboratorio de Virología y Micología del Instituto Nacional de
Enfermedades Respiratorias, que aunque solo estuve un tiempo, en todo
momento me hicieron sentir parte del laboratorio.

Al Dr. Alejandro Escobar Gutiérrez, por permitirme estar y ser parte de su
laboratorio, gracias por sus contribuciones al proyecto.

A la Dra. Olga Nohemí Hernández de la Cruz por todo su apoyo y sobre todo
dirección durante el posgrado.

A mis amigos y compañeros del posgrado: Fay, Dani, Alejandro, Efrén y Axel que
hicieron más ameno esos momentos difíciles donde parecía no haber solución,
agradezco de todo corazón el apoyo incondicional que me proporcionaron y les
deseo mucho éxito en sus proyectos personales y profesionales.

DEDICATORIA

Este proyecto está dedicado a mis padres y a mi hermano, por su apoyo
incondicional en todo momento, por sus consejos y por soportarme en momentos
difíciles donde ni yo me aguantaba. También te lo dedico a ti Diana, que siempre
me has apoyado sin importar lo equivocado que este o lo difícil que sea la
situación, sin duda tienes mucho que ver en la culminación de esta etapa, sigamos
recorriendo juntos este camino llamado vida, te amo pachona.

ÍNDICE GENERAL
Contenido
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................................iii
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................................... v
ÍNDICE DE ABREVIATURAS .................................................................................................................. vi
RESUMEN ............................................................................................................................................ 1
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 2
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 3
ANTECEDENTES ................................................................................................................................... 4
HISTORIA DEL VIRUS DE ZIKA .......................................................................................................... 4
CARACTERÍSTICAS DE LA ENFERMEDAD ......................................................................................... 5
COMPLICACIONES CLÍNICAS ............................................................................................................
7
ZIKV y Síndrome de Guillain-Barré .............................................................................................. 7
ZIKV y microcefalia ...................................................................................................................... 9
Síndrome congénito asociado a ZIKV ........................................................................................ 11
AGENTE ETIOLÓGICO .................................................................................................................... 13
CICLO DE REPLICACIÓN DE ZIKV .................................................................................................... 14
DIAGNÓSTICO DE ZIKV .................................................................................................................. 15
EPIDEMIOLOGÍA ............................................................................................................................ 16
VÍAS DE TRANSMISIÓN DE ZIKV .................................................................................................... 17
Transmisión por vector ............................................................................................................. 17
Transmisión por transfusiones sanguíneas ............................................................................... 18
Transmisión vertical de ZIKV ..................................................................................................... 19
Transmisión sexual de ZIKV ....................................................................................................... 19
PATOGÉNESIS Y RESPUESTA INMUNE ........................................................................................... 21
PERMISIVIDAD DE LAS CÉLULAS HUMANAS A LA INFECCIÓN POR ZIKV ....................................... 22
JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................................. 24
HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 24
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 25
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................................... 25
OBJETIVOS PARTICULARES ............................................................................................................ 25
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................. 26
ii

Cultivo de células Aag-2 infectadas con ZIKV ................................................................................ 26
Purificación de RNA viral. .............................................................................................................. 27
Caracterización molecular de ZIKV ................................................................................................ 27
Propagación de ZIKV en células Vero ............................................................................................ 31
Titulación de ZIKV por ensayo de placas líticas ............................................................................. 32
Inmunocitoquímica de células infectadas con ZIKV ...................................................................... 33
Cinéticas de infección .................................................................................................................... 34
Cuantificación de citocinas ............................................................................................................ 35
Análisis estadístico ........................................................................................................................ 35
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 36
Cultivo de células Aag-2 e infección con ZIKV ............................................................................... 36
Detección del genoma de ZIKV y caracterización molecular ........................................................ 36
Obtención de abasto viral en células Vero .................................................................................... 40
Titulación viral de ZIKV por ensayo de formación de placas líticas .............................................. 41
Inmunocitoquímica de células vero infectadas con ZIKV .............................................................. 43
Identificación del grado de infección por Inmunocitoquímica ..................................................... 44
Cuantificación de citocinas en células DU145 y HeLa infectadas con ZIKV ................................... 50
DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 63
CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 68
LITERATURA CITADA .......................................................................................................................... 69
ANEXO ............................................................................................................................................... 79

iii

ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1.- INMUNOPATOGENIA DEL SGB:. ............................................................................................. 8
FIGURA 2.- TAMAÑO CRANEAL DE RECIÉN NACIDOS CON MICROCEFALIA MODERADA O SEVERA ASOCIADA A
LA INFECCIÓN POR ZIKV EN COMPARACIÓN CON UN RECIÉN NACIDO SANO.. ...................................... 9
FIGURA 3.- VIRUS DE ZIKA (ZIKV)........................................................................................................ 14
FIGURA 4.- TRANSMISIÓN DE ZIKV A TRAVÉS DEL MOSQUITO VECTOR.. ................................................. 18
FIGURA 5.- DETERMINACIÓN DE CARGAS VIRALES DE ZIKV EN LÍNEAS CELULARES HUMANAS. ................. 23
FIGURA 6.- DETERMINACIÓN DE CARGAS VIRALES DE ZIKV EN LÍNEAS CELULARES NO HUMANAS. ........... 23
FIGURA 7.- ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ............................................................................................... 26
FIGURA 8.- ALINEACIÓN Y COBERTURA DE LOS INICIADORES UTILIZADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LA
REGIÓN E DEL GENOMA DEL ZIKV.. ............................................................................................... 30
FIGURA 9.- DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA TITULACIÓN DE ZIKV POR ENSAYO EN PLACAS LÍTICAS ............ 33
FIGURA 10.- DISEÑO DEL SISTEMA PARA LAS CINÉTICAS DE INFECCIÓN. ................................................. 34
FIGURA 11.- CULTIVO DE CÉLULAS AAG-2 INFECTADAS CON ZIKV ......................................................... 36
FIGURA 12.- VISUALIZACIÓN DE PRODUCTOS DE RT-PCR PARA LA DETECCIÓN DEL GENOMA DE ZIKV EN
DE CÉLULAS AAG-2 INFECTADAS.. ................................................................................................. 37
FIGURA 13.- VISUALIZACIÓN DE PRODUCTOS DE RT-PCR PARA LA DETECCIÓN DEL GENOMA DE ZIKV EN
DE CÉLULAS AAG-2 INFECTADAS.. ................................................................................................. 37
FIGURA 14.- RESULTADO DEL ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA CONSENSO ........................................... 39
FIGURA 15.- MONOCAPA DE CÉLULAS VERO SIN INFECCIÓN. ................................................................. 40
FIGURA 16.- CÉLULAS VERO INFECTADAS CON ZIKV, TRES DÍAS POST-INFECCIÓN ................................. 41
FIGURA 17.- IMAGEN REPRESENTATIVA DEL MÉTODO DE TITULACIÓN DE POR ENSAYO DE FORMACIÓN DE
PLACAS
LÍTICAS............................................................................................................................ 42
FIGURA 18.- INMUNOCITOQUÍMICA DE CÉLULAS VERO INFECTADAS CON ZIKV. ....................................... 44
FIGURA 19.- IDENTIFICACIÓN DEL GRADO DE INFECCIÓN POR INMUNOCITOQUÍMICA EN CÉLULAS DU145. . 45
FIGURA 20.- IDENTIFICACIÓN DEL GRADO DE INFECCIÓN POR INMUNOCITOQUÍMICA EN CÉLULAS HELA..... 46
FIGURA 21.- CÉLULAS DU145 INFECTADAS POR ZIKV/CM
2
.. ................................................................. 47
FIGURA 22.- CÉLULAS HELA INFECTADAS POR ZIKV/CM
2
.. .................................................................... 48
iv

FIGURA 23.- VISUALIZACIÓN DE PRODUCTOS DE RT-PCR EN CÉLULAS DU145 INFECTADAS CON ZIKV.. 48
FIGURA 24.- VISUALIZACIÓN DE PRODUCTOS DE RT-PCR EN CÉLULAS HELA INFECTADAS CON ZIKV ..... 49
FIGURA 25.- CANTIDAD DE CÉLULAS INFECTADAS / CM
2
. ...................................................................... 49
FIGURA 26.- NIVELES DE IL-1Β EN CÉLULAS DU145 ............................................................................. 51
FIGURA 27.- NIVELES DE IL-2 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................... 51
FIGURA 28.- NIVELES DE IL-4 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................... 52
FIGURA 29.- NIVELES DE IL-6 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................... 52
FIGURA 30.- NIVELES DE IL-7 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................... 53
FIGURA 31.- NIVELES DE IL-8 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................... 53
FIGURA 32.- NIVELES DE IL-12 (P70) EN CÉLULAS DU145 .................................................................... 54
FIGURA 33.- NIVELES DE IL-13 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................. 54
FIGURA 34.- NIVELES DE IL-17 EN CÉLULAS DU145 ............................................................................. 55
FIGURA 35.- NIVELES DE MIP-1Β EN CÉLULAS DU145 .......................................................................... 55
FIGURA 36.- NIVELES DE TNF-Α EN CÉLULAS DU145 ........................................................................... 56
FIGURA 37.- NIVELES DE G-CSF EN CÉLULAS DU145 .......................................................................... 56
FIGURA 38.- NIVELES DE IFN-Ɣ EN CÉLULAS DU145 ............................................................................ 57
FIGURA 39.- NIVELES DE MCP-1 EN CÉLULAS DU145 .......................................................................... 57
FIGURA 40.- NIVELES DE IL-1Β EN CÉLULAS HELA ................................................................................ 58
FIGURA 41.- NIVELES DE IL-4 EN CÉLULAS HELA .................................................................................. 58
FIGURA 42.- NIVELES DE IL-13 EN CÉLULAS HELA ................................................................................ 59
FIGURA 43.- NIVELES DE G-CSF EN CÉLULAS HELA ............................................................................. 59
FIGURA 44.- NIVELES DE MCP-1 EN CÉLULAS HELA ............................................................................. 60
FIGURA 45.- NIVELES DE TNF-Α EN CÉLULAS HELA .............................................................................. 60
FIGURA 46.- NIVELES DE IFN-Ɣ EN CÉLULAS HELA .............................................................................. 61
FIGURA 47.- NIVELES DE IL-6 EN CÉLULAS HELA .................................................................................. 61
FIGURA 48.- NIVELES DE IL-7 EN CÉLULAS HELA .................................................................................. 62
FIGURA 49.- NIVELES DE IL-8 EN CÉLULAS HELA .................................................................................. 62
v

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA 1.- COMPARACIÓN DE SIGNOS Y SÍNTOMAS EN FIEBRE POR DENGUE, CHIKUNGUNYA, Y ZIKA.. ......... 6
TABLA 2.- MALFORMACIONES QUE SE PRESENTAN EN EL SÍNDROME CONGÉNITO ASOCIADO A ZIKV. ........ 12
TABLA 4.- INICIADORES UTILIZADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN CODIFICANTE DE LA PROTEÍNA E
DE ZIKV. ..................................................................................................................................... 28
TABLA 5.- MEZCLA DE REACCIÓN PARA RT-PCR DE ZIKV. .................................................................... 29
TABLA 6.- CONDICIONES DE AMPLIFICACIÓN PARA RT-PCR DE ZIKV ..................................................... 29
TABLA 7.- TÍTULOS VIRALES OBTENIDOS EN CÉLULAS VERO POR ENSAYO DE FORMACIÓN DE PLACAS
LÍTICAS.. ...................................................................................................................................... 42

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

BBB Barrera Hematoencefálica
C Proteína de Cápside
Caspr Proteína Asociada a Contactina
CPE Efecto citopático
CZS Síndrome Congénito Asociado a ZIKV
dsRNA Ácido Ribonucleico de cadena doble
E Proteína de Envoltura
hNPC Células Progenitoras Neuronales humanas
HSP Proteínas de choque térmico
G-CSF Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos
GM-CSF Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos
ICAM-1 Molécula de Adhesión Intracelular 1
IFN-γ Interferón gama
IL Interleucina
Kv Canales de Potasio Regulados por Voltaje
MAC Complejo de Ataque a la Membrana
MCP-1 Proteína Quimioatrayente de Monocitos 1
MDA5 Proteína asociada a la diferenciación del melanoma 5
MIP-1β Proteína Inflamatoria de Macrófagos 1 beta
mRNA Ácido Ribonucleico mensajero
Nav Canales de Sodio Regulados por Voltaje
vii

NPC Células Progenitoras Neuronales
NS Proteína No Estructural
PAMPs Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
preM Proteína de premembrana
PRRs Receptores de Reconocimiento de Patrones
RdRP RNA polimerasa dependiente de RNA
RT-PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa con Retrotranscriptasa
RIG-I Gen 1 inducible por ácido retinoico
RNA Ácido Ribonucleico
SCB Barrera hematotesticular o de células de Sertoli
SFB Suero Fetal Bovino
SGB Síndrome de Guillain-Barré
ssRNA Ácido Ribonucleico de cadena sencilla
TLR Receptor tipo Toll
TNF-α Factor de Necrosis Tumoral alfa
VCAM-1 Molécula de Adhesión de Células Vasculares 1
UTR Región no codificante
ZIKV Virus de Zika

RESUMEN

El virus de Zika (ZIKV) es un flavivirus perteneciente a la familia Flaviviridae, que
es transmitido principalmente por mosquitos del género Aedes, la enfermedad del
mismo nombre se caracteriza por un proceso febril agudo, acompañado de
mialgias, artralgias, dolor retro-orbital, cefalea, edema, rash maculopapular y
conjuntivitis. Las principales complicaciones asociadas a la infección de ZIKV son
el síndrome de Guillain-Barré (SGB), microcefalia y síndrome congénito. Además
de la transmisión vectorial, existen reportes de otras vías de transmisión como la
transmisión por transfusión sanguínea, transmisión vertical y transmisión sexual
del virus, sugiriendo que puede replicarse en células del tracto genital. Este
estudio tuvo como objetivo principal evaluar la capacidad infectiva del ZIKV en
líneas celulares representativas del tracto uro-genital humano: HeLa (cérvix) y
DU145 (próstata) así como el perfil de producción de citocinas derivado de dicha
infección. Los resultados obtenidos demuestran que las células HeLa y DU145 son
poco susceptibles a la infección por ZIKV, existiendo una pobre respuesta de
citocinas inflamatorias, presentando diferencias significativas en MCP-1 y TNF-α
en células HeLa y diferencias significativas
en IL-6, IL-8 y MIP-1β en el caso de las
células DU145.

ABSTRACT

Zika virus (ZIKV) is an arbovirus belonging to the flaviviridae family transmitted
mainly by mosquitoes of the genus Aedes, Zika disease is characterized by an
acute febrile process, accompanied by myalgias, arthralgias, retroorbital pain,
headache, edema, rash and conjunctivitis. The main complications associated with
ZIKV infection are Guillain-Barré syndrome (GBS), microcephaly and congenital
syndrome. In addition to vector transmission, there are reports of other
transmission ways such as blood transfusion, vertical and sexual transmission,
suggesting that the virus replicates in cells of the genital tract. The aim of the
present study was to evaluate the infectious capacity of ZIKV in cell lines
representative of the human urogenital tract HeLa (cervix) and DU145 (prostate) as
well as the cytokine production profile of infection. Results indicates that HeLa and
DU145 cells are little susceptible to infection by ZIKV with a poor response of
inflammatory cytokines. HeLa cells presented significant differences in cytokines
production to MCP-1 and TNF-a, whereas DU145 cells showed significant
differences in product levels of IL-6, IL - 8 and MIP-1β.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad por virus Zika se caracteriza por un proceso febril agudo,
acompañado de mialgias, artralgias, dolor retro-orbital, cefalea, edema, rash
maculopapular y conjuntivitis, aunque se ha reportado que cerca del 75 % de los
casos son asintomáticos. Además, se ha observado que un porcentaje bajo de los
pacientes puede presentar otros trastornos como púrpura trombocitopénica,
síndrome de Guillain-Barré y otras alteraciones neurológicas, así como defectos
congénitos en neonatos de madres infectadas durante el embarazo. El virus Zika
(ZIKV), es transmitido al humano mediante la picadura de mosquitos vectores del
género Aedes, principalmente Aedes aegypti y Aedes albopictus; existen reportes
de otras vías de transmisión como la parenteral (transfusión sanguínea), la
transmisión vertical y la transmisión sexual, sugiriendo que el virus es capaz de
replicarse en células del tracto genital (como se ha descrito para las células de
Sertoli), para lo cual los mecanismos de infección y patogénesis han comenzado a
describirse, convirtiéndola en la vía de transmisión menos estudiada (Faria, N. y
cols., 2016; Ioos, S. y cols., 2014; Hamel y cols., 2016; Siemann, D. y cols., 2017).
Por otro lado, se ha demostrado que los fibroblastos, los queratinocitos y las
células dendríticas son permisivas a la infección por ZIKV y que, una vez
infectadas, generan una respuesta inmune antiviral que conlleva, entre otras
cosas, a la producción de interferones tipo I. Así mismo, la formación de
autofagosomas está asociada al reconocimiento de patrones moleculares
asociados a patógenos (PAMPs) virales por diversos receptores, principalmente
TLR-3, RIG-1 y MDA-5 (Faye, O. y cols., 2014; Hamel, R. y cols., 2016; Musso, D.
y Gluber, D., 2016). Es así que este proyecto evalúa la capacidad de infección in
vitro de ZIKV en células de próstata y cérvix y la producción de citocinas
inflamatorias, para contribuir al estudio de la inmunopatogenia de la infección.

ANTECEDENTES

HISTORIA DEL VIRUS DE ZIKA

El virus de Zika (ZIKV) es un flavivirus perteneciente a la familia Flaviviridae, fue
aislado por primera vez en 1947 a partir de muestras sanguíneas de macacos
rhesus del bosque de Zika en Uganda. En 1948 se identificó la presencia del virus
en mosquitos del género Aedes, específicamente A. africanus. Los primeros casos
en humanos se reportaron en 1953, al aparecer signos y síntomas característicos
de la enfermedad en 3 individuos, en los cuales se confirmó la infección viral
mediante la determinación de anticuerpos neutralizantes. En 1969 en Malasia, se
aisló el virus en mosquitos A. aegypti, siendo el primer reporte de la presencia del
virus fuera de África. Otros casos de infección en humanos fuera del continente
africano ocurrieron en Indonesia en el año de 1977. Hasta el año 2007, solo se
habían reportado 13 casos confirmados de la infección. (Musso, D. y Gruber, D.,
2016; Petersen, L. y cols., 2016; Yun, S. y Lee, Y., 2017).

El primero brote importante de enfermedad por ZIKV se registró en 2007 en la isla
de Yap, Micronesia, durante el cual se reportaron casos de una enfermedad
“similar al dengue” en la que los pacientes presentaban fiebre, rash, altralgias y
conjuntivitis, estimando que alrededor de 5,000 de los casi 7,000 habitantes
estaban infectados con ZIKV, aunque solo el 19% presentó signos y síntomas
clásicos de la infección (Duffy, M. y cols., 2009; Musso, D. y Gruber, D., 2016;
Yun, S. y Lee, Y., 2017). Posteriormente en octubre de 2013 en la Polinesia
Francesa se reportaron 3 casos de personas pertenecientes a una misma familia
que presentaban fiebre (<38ºC), astenia, rash, artralgias, cefaleas y conjuntivitis
en dos de los casos, una semana después se reportó un caso más con signos
similares. Dos meses después de los primeros casos ya se estimaban 19,000
casos de ZIKV probable, al final del brote el número estimado de casos fue de
30,000, correspondiendo al 11.5% de la población total. Cabe destacar que
existieron los primeros reportes de complicaciones neurológicas y transmisión no
5

asociada al vector en un pequeño porcentaje de los casos (Cao-Lormeau, V. y
cols., 2014; Musso, D. y Gruber, D., 2016; Petersen, L. y cols., 2016). Durante
marzo de 2015 se reportaron los primeros casos de la enfermedad en el
continente americano, específicamente en Brasil, donde se confirmó el primer
caso autóctono de ZIKV y se estimó que durante ese año, el número de casos de
ZIKV en Brasil fue de entre 500,000 y 1, 500,000. Para septiembre del mismo año,
se reportó un aumento en el número de infantes que nacían con microcefalia en
las mismas regiones donde se reportaban casos de ZIKV, convirtiéndose en el
primer país en reportar una asociación entre la microcefalia y la infección. Cabe
señalar que, entre 2014 y 2015 existieron pequeños brotes de la enfermedad en
otras islas del Pacífico como Nueva Caledonia, Isla de Pascua, Islas Cook y
Samoa, que se asocian a la ruta de entrada del virus a América (Atif, M. y cols.,
2016; Musso, D. y Gruber, D., 2016; Faria, N. y cols., 2016; Petersen, L. y cols.,
2016).

CARACTERÍSTICAS DE LA ENFERMEDAD

El periodo de incubación del virus en el hospedero humano va de 3 a 12 días
posteriores al momento de la picadura de un mosquito infectado y usualmente los
síntomas se presentan durante 2 y 7 días, aunque el 75% de los casos son
asintomáticos. Asimismo, la infección por ZIKV puede generar una amplia gama
de signos y síntomas, los cuales se detallan en la Tabla 1. La presentación clínica
es muy similar a la producida por otros arbovirus como el virus del Dengue o
Chikungunya, por lo que la correcta interpretación de los signos y síntomas resulta
primordial para el diagnóstico clínico diferencial. En esta enfermedad, los síntomas
desaparecen de forma gradual y las complicaciones u hospitalización del paciente
ocurre en raras ocasiones, a diferencia de dengue o fiebre amarilla donde la
evolución a formas clínicas graves es más frecuente. Hasta el momento el
tratamiento para la infección por ZIKV es solo sintomático y de soporte, ya que no
existe vacuna o tratamiento antiviral específico (Ioos, S., y cols., 2014; Atif, M. y
6

cols., 2016; Fauci, A. y Morens, D., 2016; Maharajan, M. y cols., 2016;
Sampathkumar, P. y Sanchez, J., 2016; Ritter, J. y cols., 2017).

Tabla 1.- Comparación de signos y síntomas en fiebre por Dengue, Chikungunya, y Zika.
Adaptado de (Ioos, S., y cols., 2014; Atif, M. y cols., 2016; Maharajan, M. y cols., 2016).
Signos y Síntomas Dengue Chikungunya Zika
Fiebre
++++ +++ +++
Mialgia/Artralgia +++ ++++ ++
Edema en extremidades - - ++
Rash maculopapular ++ ++ +++
Dolor retro-orbital ++ + ++
Conjuntivitis - + +++
Linfadenopatías ++ ++ +
Hepatomegalia - +++ -
Leucopenia/Trombocitopenia +++ +++ -
Hemorragia + - -
Choque ++ - -
Malestar/dolor muscular +++ +++ +

Ya que aún no existe una vacuna o tratamiento antiviral específico, el mejor
método de prevención es el control del vector, que consiste en disminuir el número
de mosquitos mediante la eliminación de sitios de oviposición (como fosos,
depósitos de agua, llantas usadas, etc...) y el uso de insecticidas y pesticidas para
eliminar las larvas del mosquito en agua estancada. La protección individual
también es importante e incluye: usar pantalones largos y ropa de colores claros,
así como playeras de manga larga y sombreros, usar repelentes para la piel y el
uso de mosquiteros en casa para evitar el contacto con el mosquito vector (Ioos,
S., y cols., 2014; Sampathkumar, P. y Sanchez, J., 2016).

COMPLICACIONES CLÍNICAS

Las principales complicaciones asociadas a la infección de ZIKV son el síndrome
de Guillain-Barré (SGB), microcefalia y el síndrome congénito (Krauer, F. y cols.,
2017).

ZIKV y Síndrome de Guillain-Barré

La asociación entre ZIKV y SGB fue reportada por primera vez en 2013 durante el
brote en la Polinesia Francesa (Cao-Lormeau, V. y cols., 2016) y en julio de 2015
Brasil reportó síndromes neurológicos en pacientes que habían cursado la
enfermedad (Araujo, L. y cols., 2016). El SGB comprende un grupo de neuropatías
autoinmunes agudas, caracterizadas por la debilidad de las extremidades con o
sin afectación del músculo inervado por el cráneo. Estas neuropatías incluyen el
SGB clásico, que se caracteriza por una parálisis aguda de las 4 extremidades y
formas localizadas, por ejemplo, debilidad faríngea cervical-cefálica, debilidad
faríngea aguda y parálisis facial (Savino, W. y cols., 2016), el SGB puede
presentarse incluso semanas después de presentarse la infección (Puga Torres,
Padrón Sánchez, & Bravo Pérez, 2003).

Existen dos hipótesis para explicar la inmunopatogenia del SGB:

(A) Polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda: Se fundamenta en la
generación de autoanticuerpos que reconocen las vainas de mielina de las
terminaciones axónicas, estos anticuerpos autorreactivos son capaces de activar
complemento promoviendo la formación del complejo de ataque a la membrana
(MAC) en la superficie externa de las células de Schwann y el inicio de la
degeneración vesicular, los macrófagos posteriormente invaden este sitio y actúan
como carroñeros para eliminar los restos de mielina.

(B) Neuropatía axonal motora: Los axones mielinizados se dividen en cuatro
regiones funcionales: los ganglios de Ranvier, paranodos, juxtaparanodos e
8

internodos. Los gangliósidos GM1 y GD1a se expresan fuertemente en los nodos
de Ranvier, donde están localizados los canales de sodio regulados por voltaje
(Nav). Los canales de la proteína asociada a contactina (Caspr) y el potasio
dependiente de voltaje (Kv) están presentes, respectivamente, en los paranodos y
yuxtaparanodos. Los anticuerpos autorreactivos IgG anti-GM1 o anti-GD1a se
unen al axolema nodal, lo que lleva a la formación de MAC. Esto resulta en la
desaparición de los conjuntos de Nav y la separación de la mielina paranodal, que
puede conducir a la falla de la conducción nerviosa y la debilidad muscular. La
degeneración axonal puede aparecer en una etapa posterior, los macrófagos
posteriormente invaden los nódulos en el espacio periaxonal, eliminando los
axones lesionados (Figura 1) (Yuki, N. y Hartung, H., 2012). Además, existe
mimetismo molecular entre los anticuerpos generados en el SGB y los que se
generan durante la infección por ZIKV, lo que explicaría que algunos de los casos
presenten este tipo de complicaciones (Acosta, Y. y cols., 2018).

Figura 1.- Inmunopatogenia del SGB: (A) Polineuropatia desmielinizante inflamatoria aguda y (B)
Neuropatía axonal motora (Adaptado de Yuki, N. y Hartung, H., 2012).
9

ZIKV y microcefalia

La microcefalia es un defecto congénito donde el tamaño de la cabeza del resien
nacido es más pequeño de lo esperado en comparación con el tamaño de la
cabeza de infantes de la misma edad y sexo (donde la circunferencia
occipitofrontal es menor a 2 desviaciones estándar) (Figura 2). En los humanos, la
microcefalia representa un defecto congénito grave y junto con la mayoría de las
anomalías congénitas, tiene mecanismos causales complejos que a menudo tiene
etiologías multifactoriales. Se reconocen dos tipos: La primera ocurre cuando el
cerebro no alcanza su tamaño apropiado durante el embarazo, alrededor de las 32
semanas del período de gestación, y es causada por una disminución gradual en
la producción de neuronas. La segunda se refiere a un tamaño cerebral normal en
el momento del nacimiento, pero no existe un crecimiento posterior debido a la
pérdida de las conexiones dendríticas (Rodriguez, A., 2016; Alvarado, M. y
Schwartz, D., 2017; Faizan, I. y cols., 2017).

Figura 2.- Tamaño craneal de recién nacidos con microcefalia moderada o severa asociada a la
infección por ZIKV en comparación con un recién nacido sano. Tomado de Petersen, L. y cols.,
2016.
La microcefalia es probablemente causada por una depleción de las neuroglias
radiales y de las células madre neurales en el cerebro en desarrollo, ya sea a
través de la muerte celular o la diferenciación prematura (Olagnier, D. y cols,
10

2016). En estudios post-mortem se ha encontrado evidencia de la relación entre la
infección por ZIKV y el daño cerebral. En 2016 Mlakar y colaboradores publicaron
los resultados de un análisis de autopsia de un feto con microcefalia debido a una
supuesta infección sintomática por ZIKV materna adquirida en Brasil y en el
momento del examen post-mortem, después de la interrupción electiva del
embarazo, el feto (de 32 semanas de gestación) presentaba microcefalia,
hidrocefalia y múltiples anomalías microscópicas, además de inflamación focal.
ZIKV fue identificado en el tejido cerebral del feto. Estos resultados también
soportan la hipótesis sobre la transmisión vertical de ZIKV (Cavalheiro, S. y cols.,
2016; Mlakar, J. y cols., 2016; Alvarado, M. y Schwartz, D., 2017; Faizan, I. y cols.,
2017; Schwartz, D., 2017a).

El primer trimestre del embarazo es crucial para el desarrollo neurológico
adecuado del feto, por lo que es más probable que la infección por ZIKV durante
este periodo afecte el sistema nervioso central (Faizan, I. y cols., 2016). La
transmisión transplacentaria de ZIKV de la madre al feto puede ocurrir por la
infección de macrófagos placentarios (células de Hofbauer) y citotrofoblastos,
siendo los macrófagos placentarios las principales células blanco de la infección
por ZIKV en la placenta (Quicke, K. y cols., 2016). La infección viral en los
macrófagos placentarios induce la producción de interferones tipo I y citocinas pro-
inflamatorias como parte de una respuesta antiviral. La entrada de ZIKV a la célula
está mediada por los receptores de superficie celular DC-SIGN, AXL, proteínas de
choque térmico, TYRO3 y TIM-1 y se ha demostrado que AXL se sobre expresa
en células cerebrales humanas en desarrollo, como células gliales radiales,
astrocitos, células del endotelio y microglía. La entrada de ZIKV a través de este
receptor estimula las vías de señalización mediadas por AXL y suprime la
respuesta inmune innata, esto conduce a una infección viral en las neuronas y sus
células asociadas. Estudios recientes han demostrado que ZIKV se replica en el
cerebro embrionario de ratones principalmente en las células progenitoras
neuronales (NPC). La infección por ZIKV conduce a una alteración en la
regulación de los genes asociados con la respuesta inmune,
el ciclo celular, la
11

diferenciación y la apoptosis en NPC, lo que resulta en malformaciones
neurológicas. En 2016 Tang y colaboradores demostraron que el virus Zika
también puede infectar NPC humanas (hNPC), concluyendo que ZIKV desregula
el ciclo celular y la transcripción y las vías apoptóticas en las hNPC, lo que
conduce a un crecimiento celular reducido. También se ha demostrado que la
desregulación de los genes dependientes del ácido retinoico puede afectar la
formación del tubo neural de las células cerebrales, causando malformaciones
neurológicas (Dang, J. y cols., 2016; Kumar, A. y cols., 2016; Tang, H. y cols.,
2016; Faizan, I. y cols., 2017).

Síndrome congénito asociado a ZIKV

Aunque la microcefalia ha sido la complicación más estudiada como consecuencia
de la infección por ZIKV durante el embarazo, existen otras malformaciones
fetales asociadas poco descritas que en conjunto se han denominado como
síndrome congénito asociado a ZIKV (CZS). Este nuevo síndrome de
malformación congénita incluye no solo microcefalia y daño cerebral fetal, sino
también una variedad de anomalías del desarrollo, que incluyen manifestaciones
musculoesqueléticas, oculares, craneofaciales, genitourinarias, pulmonares y de
otros tipos (Tabla 2). La restricción del crecimiento intrauterino también ocurre en
bebés con CZS, por lo que se sospecha que ZIKV podría tener mecanismos
similares a los agentes infecciosos que son responsables del síndrome TORCH
(Toxoplasmosis, Rubéola, Citomegalovirus y Herpes simple), algunos
investigadores ya consideran a ZIKV como un agente tipo TORCH (Coyne, C. y
Lazear, H., 2016; Schwartz, D., 2017b).

Los estudios clínicos, patológicos y experimentales han establecido que el ZIKV es
fuertemente neurotrópico y se dirige no solo a las células progenitoras neurales
sino también a las neuronas y otras células cerebrales. Este daño cerebral directo
e inducido por el virus puede explicar muchas de las malformaciones observadas
en casos de CZS, tales como la disminución de la actividad fetal, anomalías
craneofaciales, contracturas articulares, malformaciones de las extremidades y
12

artrogriposis pulmonar, hipoplasia y criptorquidia. De forma similar a otros
síndromes de malformación congénita (incluidos los producidos por algunos
agentes de TORCH), existe variabilidad tanto en el espectro como en la gravedad
de la embriopatía en los bebés con CZS. Es importante recalcar que no en todos
los casos de CZS se presenta la microcefalia (Atif, M. y cols., 2016; Ritter, J. y
cols, 2017; Alvarado, M. y Schwartz, D., 2017).

Tabla 2.- Malformaciones que se presentan en el síndrome congénito asociado a ZIKV
(Modificado de Alvarado, M. y Schwartz, D., 2017).
Nivel Manifestaciones clínicas
Neurológico Microcefalia
Hidrocefalia
Micracefalia
Lisencefalia
Polimicrogiria
Pachygyria
Agyria
Holoprosencefalia
Ventriculomegalia
Anomalías del cuerpo calloso
Calcificaciones intracerebrales
Lesiones cerebrales destructivas
Ocular Atrofia coriorretiniana
Anomalías del nervio óptico
Maculopatías
Anormalidades vasculares
Músculo esquelético Artrogriposis
Anomalías craneofaciales (craneosinostosis)
Pie deforme
Displasia acetabular
Genitourinario Criptorquidia
Hipospadias
Otro Restricción de crecimiento intrauterino
Anasarca
Hipoplasia pulmonar
Arteria umbilical única
13

AGENTE ETIOLÓGICO

ZIKV es un Flavivirus perteneciente a la familia Flaviviridae, de entre 40 y 70 nm
de diámetro, con un genoma de RNA de cadena sencilla y de polaridad positiva de
aproximadamente 10.7 kb, con dos regiones no codificantes (5´ UTR y 3´ UTR) y
con un marco de lectura abierto que codifica para una poliproteína que al ser
procesada da lugar a 3 proteínas estructurales (proteína de cápside (C), proteína
de premembrana (prM) y proteína de envoltura (E)) y a 7 proteínas no
estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B Y NS5) (Figura 3). La
proteína E (<53 kDa) es la principal proteína de superficie del virus, está
involucrada en varios aspectos del ciclo viral, mediando la unión del virus con el
receptor en la célula blanco y la fusión de membranas. La proteína NS5 (<103
kDa) es la proteína viral más grande cuyo extremo C-terminal tiene actividad de
RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) y el extremo N-terminal está
implicado en la protección del RNA debido a su actividad de metil transferasa. La
región 3`UTR del genoma de ZIKV contiene aproximadamente 428 nucleótidos,
incluidos 27 patrones de plegamiento que pueden estar implicados en el
reconocimiento por factores celulares o virales, la traducción, la estabilización del
genoma, el empaquetamiento de RNA y la ciclación. En 2007 se identificó y
publicó el genoma completo de ZIKV. Hasta el momento, solo se ha identificado
un serotipo circulante con dos principales linajes: Asiático y Africano (Faye, O. y
cols., 2014; Abushouk, A. y cols., 2016; Dowd, K. y cols., 2016; Hamel, R. y cols.,
2016; Musso, D. y Gluber, D., 2016; Olagnier, D. y cols., 2016; Shastry, S. y cols.,
2016; Sirohi, D. y cols., 2016;).
14

Figura 3.- Virus de Zika (ZIKV), ZIKV tiene como genoma un ssRNA (+) el cual codifica para una
poliproteína que al ser procesada genera 3 proteínas estructurales y 7 no estructurales. Modificada
de Sirohi, D. y cols., 2016.

CICLO DE REPLICACIÓN DE ZIKV

El RNA del virión es infeccioso y actúa como RNA mensajero (mRNA) y genoma
viral. El ciclo replicativo del ZIKV comienza con la unión del virión a la membrana
celular del hospedero a través de la proteína E y penetra por endocitosis mediada
por receptores de superficie celular como DC-SIGN, AXL, proteínas de choque
térmico (hsp), TYRO3 y TIM-1 (Faizan, I. y cols., 2017; Meertens, L. y cols., 2017).
Después, la membrana viral se fusiona con la membrana endosomal y el RNA de
cadena sencilla (ssRNA) se libera en el citoplasma de la célula infectada.
Comienza la traducción y posteriormente se escinde la poliproteína, dando lugar a
las proteínas estructurales y no estructurales. La replicación ocurre en las fábricas
virales citoplásmicas del retículo endoplásmico (RE). Las fábricas virales son
compartimentos intracelulares (inclusiones) que aumentan la eficacia de la
replicación-ensamblaje viral y la protegen de las defensas del hospedero. Las
fábricas virales pueden ser citoplásmicas o nucleares y a menudo surgen de una
15

reorganización extensa de los compartimentos del citoesqueleto y/o de la
membrana celular de la célula huésped (Netherton, C. y Wileman, T., 2011).
Durante la replicación se produce RNA de doble cadena (dsRNA), el cual sirve
como molde para transcribir nuevos ssRNA que se ensamblan junto con las
proteínas virales dentro del RE para formar nuevos viriones. Los viriones se
transfieren al aparato de Golgi y finalmente se liberan en los espacios
intracelulares, donde causan la infección de nuevas células (Atif, M. y cols., 2016;
Hamel, R. y cols., 2016; Olagnier, D. y cols., 2016; Yun, S. y Lee, Y., 2017).

DIAGNÓSTICO DE ZIKV

La infección por ZIKV generalmente se diagnostica clínicamente para después
confirmar con pruebas de laboratorio específicas. La circulación de ZIKV
regularmente está acompañada por la presencia de otros arbovirus como Dengue
o Chikungunya, lo que dificulta el diagnóstico clínico de la enfermedad. El
diagnóstico de laboratorio se debe realizar preferentemente mediante la detección
del genoma viral en suero del paciente por qRT-PCR durante los primeros 5 días
desde la aparición de los síntomas, ya que hasta el momento no se han
desarrollado pruebas serológicas específicas debido a que los anticuerpos
producidos anti-ZIKV presentan reacción cruzada contra virus del dengue. El
genoma viral permanece detectable durante aproximadamente 20 a 60 días desde
el inicio de los síntomas (Abushouk, A. y cols. 2016;
Atif, M. y cols., 2016,
Sampathkumar, P. y Sanchez, J., 2016; Stettler, K. y cols., 2016).

El aislamiento de ZIKV puede realizarse a partir de sangre (suero o plasma),
líquido amniótico, leche materna, saliva, orina, semen, cerebro del feto,
fibroblastos cutáneos, y tejido placentario (Musso, D. y cols., 2015b; Faizan, I. y
cols., 2017).

EPIDEMIOLOGÍA

A nivel mundial hay constancia de transmisión vectorial de ZIKV en 84 países, en
64 de ellos, el vector está completamente establecido pero no hay constancia de
transmisión pasada o activa. Hasta el momento, 13 países han notificado casos de
transmisión de persona a persona y 31 países o territorios han notificado casos de
microcefalia y otras malformaciones del sistema nervioso central posiblemente
asociadas a la infección por el virus de Zika o que sugieren infección congénita; 23
países han reportado un aumento de la incidencia del SGB y/o de confirmación de
la infección por ZIKV mediante pruebas de laboratorio en casos de SGB (OMS,
2017).

En México, el 7 de marzo de 2015 se emitió la alerta epidemiológica por infección
por ZIKV. Desde ese momento, hasta agosto de 2018, se han reportado 12,042
casos confirmados autóctonos de ZIKV, de los cuales 7,026 han sido en mujeres
embarazadas. Las entidades que reportan un mayor número de casos son
Veracruz, Yucatán y Nuevo León. Se han reportado también 40 casos de CZS
(Secretaria de Salud, 2018).

En noviembre de 2016, se reportó el primer y único caso de microcefalia asociado
a ZIKV, este primer caso corresponde a producto femenino, nacido por inducción
de parto, con una edad gestacional de 33.5 semanas (prematuro), con peso de
995 gr y talla de 34.5 cm, misma que falleció al momento del parto (Secretaria de
Salud, 2016).

VÍAS DE TRANSMISIÓN DE ZIKV

Transmisión por vector

ZIKV se transmite principalmente a los humanos a través de la picadura de
mosquitos comúnmente del género Aedes siendo A. aegypti y A. albopictus los
vectores principales; el mosquito hembra se alimenta de sangre de individuos
infectados adquiriendo el virus, el cual cursa un periodo de incubación de 5 a 10
días para después diseminarse nuevamente a la saliva del vector y cuando el
mosquito hembra vuelve a alimentarse de un individuo sano, es capaz de
transmitir el virus (Figura 4). Aedes albopictus puede sobrevivir a climas
templados, a diferencia de A. aegypti que necesita de climas más tropicales
(Chouin-Carneiro, T. y cols., 2016). La distribución global del vector ha ido
aumentando con los años, lo que aumenta el riesgo de pandemias (Abushouk, A.
y cols., 2016). También existen reportes de presencia de ZIKV en algunas
especies de Anopheles, Eretmapodites, Culex y Mansonia incrementando la
posibilidad de transmisión vectorial (Diagne, C. y cols., 2015; Atif, M. y cols.,
2016).
18

Figura 4.- Transmisión de ZIKV a través del mosquito vector. El mosquito adquiere al virus una vez
que pica a un individuo infectado, existe un periodo de incubación de 5 – 10 días para su posterior
transmisión a un individuo sano (Modificado de Abushouk, A. y cols., 2016).

Transmisión por transfusiones sanguíneas

Durante el brote de ZIKV en la Polinesia Francesa, 42 de 1,505 donantes de
sangre, que en el momento de la donación de sangre eran asintomáticos, se
encontraron positivos para ZIKV por RT-PCR (Musso, D. y cols., 2014; Marano G.
y cols., 2016). En 2016, Barjas-Castro y cols. reportaron el caso de un hombre de
48 años que 3 días después de haber donado sangre comenzó a presentar
síntomas de dengue, pruebas serológicas y moleculares descartaron infección por
dengue, sin embargo, las muestras almacenadas de la donación fueron positivas
por RT-PCR para ZIKV. Una investigación retrospectiva demostró que el
concentrado de plaquetas de este donador se había transfundido a un paciente
después de un trasplante de hígado. Al hacer pruebas moleculares al paciente
transfundido, estas dieron un resultado positivo para ZIKV.

Transmisión vertical de ZIKV

Las mujeres embarazadas son susceptibles a la infección por ZIKV principalmente
en el primer trimestre del embarazo, la transmisión de ZIKV de madre a hijo puede
ocurrir en el útero o perinatalmente (Atif, M. y cols., 2016), lo que se confirmó por
dos casos ocurridos en la Polinesia Francesa, donde se identificó la presencia de
ZIKV tanto en las madres como en los recién nacidos, uno de los recién nacidos
presentaba síntomas característicos de la enfermedad mientras que el otro fue
asintomático (Besnard, M. y cols., 2014; Abushouk, A. y cols., 2016). En 2017,
Aagaard y colaboradores demostraron que ZIKV puede replicarse en trofoblastos
placentarios humanos sin destrucción de la célula huésped, es decir, sirven como
una especie de reservorio permisivo a la infección generando un riesgo latente de
que el recién nacido presente alguna complicación neurológica o microcefalia.
También existen reportes de que las células estromales endometriales, son
altamente permisivas a la infección por ZIKV, siendo una fuente potencial de
propagación del virus a los trofoblastos placentarios humanos durante el
embarazo (Pagani, I. y cols., 2017).

Transmisión sexual de ZIKV

En 2011, un informe de caso sugirió una ruta de transmisión viral no vectorial a
través del contacto sexual. En diciembre de 2013, se publicó el informe de caso
que confirma la presencia de partículas virales en el semen de un hombre de 44
años que había sido diagnosticado con infección por ZIKV dos semanas antes, en
este caso se hicieron pruebas moleculares para ZIKV dando resultado negativo en
sangre pero positivo en semen, lo que sugiere que existe replicación viral en el
tracto genital (Musso, D. y cols., 2015a). Las partículas virales replicativas, así
como el RNA viral (a menudo con un alto número de copias), se han identificado
en semen incluso si el paciente se ha realizado la vasectomía hasta 62 días
después del inicio de los síntomas (Atkinson, B. y cols., 2016; Petersen, L. y cols.,
2016; Huits, R. y cols., 2017) y la mayoría de los casos suelen presentarse
durante los primeros 19 días del comienzo de los síntomas. Por el contrario solo
20

se ha informado del caso de un paciente de sexo femenino que presentó la
infección 44 días después de que su pareja presentó los primeros síntomas.
Además, esta reportado que ZIKV puede transmitirse a través de sexo anal y
vaginal, y se tiene la sospecha de que posiblemente también por sexo oral
(Abushouk, A. y cols., 2016; D’Ortenzio, E. y cols., 2016).

Los mecanismos por los cuales ZIKV es capaz de infectar el tracto genital aún no
están completamente descritos. En 2017, Siemann y colaboradores demostraron
que las células de Sertoli primarias humanas son altamente permisivas a la
infección por ZIKV y son capaces de producir citocinas pro-inflamatorias,
interferones tipo I y moléculas de adhesión celular (VCAM-1, ICAM-1) como parte
de una respuesta antiviral específica; además demostraron mediante un modelo in
vitro de la barrera hematotesticular o de células de Sertoli (SCB) que ZIKV puede
atravesar más eficientemente dicha barrera sin alterar su permeabilidad que la
barrera hematoencefálica (BBB). También encontraron que mediadores
inflamatorios producidos por macrófagos infectados comprometen la integridad de
la barrera. Estos resultados sugieren que la infección en células de Sertoli es uno
de los pasos cruciales por los cuales ZIKV obtiene acceso a túbulos seminíferos
(un sitio inmuno-privilegiado) y que las células de Sertoli infectadas, mediante el
receptor Axl, sirven como reservorio para la infección de otras células testiculares
residentes, incluyendo el desarrollo de espermatozoides (Siemann, D. y cols.,
2017). Las células de Leydig son otra población celular importante en los
testículos,
estas producen y secretan testosterona y son necesarias para el
desarrollo del tejido reproductivo masculino y recientemente se demostró que
estas células no son tan permisivas a la infección por ZIKV como las células de
Sertoli. Sin embargo, existe una respuesta antiviral comparativamente silenciada
en células de Sertoli después de 48 horas de infección, lo que podría explicar la
capacidad de ZIKV para persistir en cultivos de células de Sertoli durante más de
un mes y, por extensión, su latencia en el tracto reproductor masculino (Kumar, A.
y cols., 2018)..

Otros estudios in vitro han demostrado que además de los fibroblastos dérmicos
humanos y los macrófagos placentarios, los fibroblastos uterinos (célula histo-
arquitectónica primaria del útero y el endometrio) también son permisivos a la
infección por ZIKV, lo que soporta el hecho de la transmisión sexual en mujeres,
aunque no se han descrito los mecanismos ni capacidad de persistencia viral
(Chen, J. y cols., 2016).

En 2011 se publicó el informe de caso de 2 científicos estadounidenses que
contrajeron la infección por ZIKV mientras trabajaban en Senegal en 2008. Uno de
ellos le transmitió la infección a su esposa después de su regreso. Este mismo
científico presentaba síntomas de prostatitis (dolor perineal y disuria leve) sin
presencia de fiebre, algo que hasta el momento no se había reportado, lo que
sugiere que ZIKV tiene la capacidad de infectar células de la próstata y provocar la
inducción de un ambiente infamatorio localizado (Foy, B. y cols., 2011).

PATOGÉNESIS Y RESPUESTA INMUNE

Al picar a un paciente infectado, el mosquito ingiere sangre infectada con ZIKV y al
igual que otros flavivirus, ZIKV se replica en el intestino medio y las glándulas
salivales del mosquito. Después de un periodo de incubación extrínseco de 5-10
días, el virus puede ser transmitido a los humanos. ZIKV es capaz de infectar a los
fibroblastos, los queratinocitos epidérmicos y las células de Langerhans. Los
fibroblastos y queratinocitos contienen Tyro3, AXL y TIM-1 que pueden servir
como receptores para ZIKV, asimismo, la molécula DC-SIGN en las células de
Langerhans también sirve como receptor para la entrada de virus. La interacción
entre la proteína E viral y los receptores de la superficie celular permite la entrada
de ZIKV en las célula blanco y una vez que ZIKV entra a la célula, se libera el RNA
viral en el citoplasma en donde puede ser reconocido por receptores de
reconocimiento de patrones (PRRs) que reconocen PAMPs virales como TLR-3,
TLR-7, TLR-8, RIG-I y MDA5. La infección primaria de los fibroblastos de la piel
con ZIKV provoca una sobre expresión de mRNA de TLR-3, RIG-I y MDA5. Como
22

consecuencia a la activación de los PRRs, se inicia una respuesta inmune innata
de tipo antiviral que incluye la producción de interferones tipo I y citocinas pro-
inflamatorias. Dado que ZIKV tiene la capacidad de inducir autofagia en las células
infectadas, la carga viral también puede reducirse mediante inhibidores de la
autofagia. Después de la replicación en las células de los tejidos locales y los
ganglios linfáticos regionales, ZIKV puede diseminarse desde el torrente
sanguíneo a otros tejidos y órganos, incluidos el sistema nervioso central, el
miocardio, los músculos esqueléticos y placenta. Las células T también se activan
durante la fase aguda de la fiebre del Zika polarizando una respuesta hacia los
perfiles Th1, Th2, Th9 y/o Th17 (Suthar, M. y cols., 2013; Hamel, L. y cols., 2015;
Atif, M. y cols., 2016; Carneiro, L. y Travassos, L., 2016; Dang, J. y cols., 2016;
Rajah, M. y cols., 2016; Musso, D. y Gubler, D., 2016).

PERMISIVIDAD DE LAS CÉLULAS HUMANAS A LA INFECCIÓN POR ZIKV

Se sabe que diferentes tipos de células, como los fibroblastos, queratinocitos
epidérmicos, células dendríticas, macrófagos, células endoteliales, células de
Sertoli, trofoblastos, células de Leydig y neuronas, son permisivas a la infección
por ZIKV (Hamel y cols., 2015; Chen, J. y cols., 2016; Liu, S. y cols., 2016; Rajah,
M. y cols., 2016; Faizan, I. y cols., 2017; Kumar, A. y cols., 2018; Siemann, D. y
cols., 2017).

En 2016, Chan y colaboradores evaluaron la susceptibilidad de 18 líneas celulares
humanas y 15 líneas celulares no humanas a la infección por ZIKV encontrando
que existe replicación activa de ZIKV en las líneas celulares de placenta (JEG-3),
neuronal (SF268), músculo (RD), de retina (ARPE19), pulmonares (Hep-2 y HFL),
de colon (Caco-2) y hepática (Huh-7). Asimismo reportaron que las líneas
celulares de próstata (LNCaP), testicular (833KE) y renal (HEK) mostraron un
aumento en la carga viral de ZIKV y/o expresión de proteína NS1 sin inducir ECP,
lo que sugiere su posible papel en la transmisión sexual con replicación viral en
estos sitios anatómicos (Figura 5). Entre las líneas celulares no humanas, células
23

de primate (Vero y LLC-MK2), cerdo (PK-15), conejo (RK-13), hámster (BHK21) y
pollo (DF-1) soportaron la replicación activa de ZIKV, por lo que estas especies
animales podrían utilizarse como modelos experimentales de infección para el
mantenimiento y propagación de ZIKV (Figura 6).

Figura 5.- Determinación de cargas virales de ZIKV por PCR en tiempo real en líneas celulares
humanas (Chan, J. y cols., 2016).

Figura 6.- Determinación de cargas virales de ZIKV por PCR en tiempo real en líneas celulares no
humanas (Chan, J. y cols., 2016).
24

JUSTIFICACIÓN

Existe poca información acerca de la biología del ZIKV, de cuáles son sus células
blanco y de la respuesta inmune derivada de la infección, la mayoría de los
estudios se centran en el vector y en los mecanismos involucrados en la
transmisión vertical y transmisión por lactancia, siendo la transmisión sexual la
menos estudiada.

Este proyecto propone evaluar la capacidad de infección del ZIKV en líneas
celulares del tracto genito-urinario humano, además del análisis del perfil de
producción de citocinas como parte de la evaluación de la respuesta inmune en
este modelo.

HIPÓTESIS

ZIKV inducirá un incremento en los niveles de las citocinas pro-inflamatorias en las
células HeLa y DU145 como parte de la respuesta contra la infección.
25

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la capacidad infectiva del ZIKV en líneas celulares representativas del
tracto uro-genital humano (HeLa y DU145), así como el perfil de producción de
citocinas derivado de la infección.

OBJETIVOS PARTICULARES

1.- Aislar y caracterizar molecularmente una cepa de ZIKV a partir de muestras
clínicas.

2.- Obtener abasto viral mediante el cultivo de ZIKV en una línea celular de
mosquito (Aag-2) y en células Vero.

3.- Estandarizar una técnica de titulación viral basada en unidades formadoras de
placas y/o en Inmunocitoquímica para la cuantificación de ZIKV.

4.- Realizar cinéticas de infección en las líneas celulares propuestas como modelo
de infección in vitro (HeLa y DU145).

5.- Cuantificar los niveles de G-CSF, GM-CSF, IFNɣ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-
7, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, MCP-1, MIP-1β y TNF-α en los
sobrenadantes de las células infectadas mediante tecnología Luminex©.

6.- Cuantificación viral en el sobrenadante de las células infectadas por
Inmunocitoquímica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 7.- Estrategia experimental

Cultivo de células Aag-2 infectadas con ZIKV

El aislado clínico se obtuvo a partir de una muestra clínica (suero) con diagnóstico
probable de enfermedad por ZIKV, a este aislado se le realizaron varios pases en
cultivos primarios de glándulas salivales de mosquito. La presencia de ZIKV fue
confirmada y monitoreada con el estuche comercial de PCR multiplex TaqMan™
Lyophilized One-Step qPCR Assay: DENV/CHIKV/ZIKV, Applied Biosystems™
(Life Technologies,
California, EUA).

Se utilizó la línea celular Aag-2 (células de glándulas salivales de mosquito Aedes
aegypti) como modelo inicial de infección y propagación de ZIKV. Se sembraron
células Aag-2 en botellas de cultivo de 25 cm2, se incubaron a 28°C en medio
Schneider (Caisson, Utah, EUA) suplementado con 1% de L-Glutamina,
aminoácidos no esenciales, vitaminas, penicilina, estreptomicina y 10 % de suero
fetal bovino (SFB). Una vez que la monocapa celular alcanzó un 70-80% de
27

confluencia, se retiró el medio y las células se inocularon con 400 µL del aislado
viral en 2 mL de medio Schneider sin SFB. Las células infectadas se incubaron
durante 2 horas a 28°C con agitación cada 15 minutos, una vez que se cumplió
este tiempo, se adicionó 1 ml más de medio Schneider con 1% de SFB. Los
cultivos se monitorearon durante un periodo de 3 a 5 días a 28 °C hasta observar
efecto citopático (CPE). El virus se cosechó despegando las células mediante
acción mecánica, se hicieron alícuotas de 500 µL de la suspensión celular, la
cuales se almacenaron a -70°C hasta su uso. Este procedimiento se repitió 7
veces más con la finalidad de amplificar el título viral de ZIKV.

Purificación de RNA viral.

A partir de los cultivos de células Aag-2 infectados, se purificó el RNA viral por el
método de afinidad en columna utilizando el equipo comercial QIAamp viral RNA
mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Los productos obtenidos se almacenaron a -70°C hasta su uso.

Caracterización molecular de ZIKV

Se diseñaron cuatro juegos de iniciadores para la detección molecular de ZIKV
tomando como base la secuencia del genoma completo de una cepa de ZIKV
circulante en México y reportada en GenBank por el InDRE, la cual está disponible
en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucco re/KU922960 (Tabla 4). Asimismo se
utilizaron dos programas web de libre acceso: Primer3Plus disponible en
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi y Primer-BLAST
disponible en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Estos iniciadores
están dirigidos a la amplificación de cuatro fragmentos que cubren la región que
codifica para la proteína E del virus, con la finalidad de, posteriormente, realizar la
caracterización molecular de la cepa (Figura 8).

Tabla 3.- Iniciadores utilizados para la amplificación de la región codificante de la proteína
E de ZIKV.
INICIADOR SECUENCIA 5’→3’ COBERTURA POSICIÓN
TAMAÑO
DEL
AMPLICÓN
REF
ZKVEFW1 GCTTTTGGGAAGCTCAACGA
ENVOLTURA
845-964
474
KU922960
(MEX-InDRE-
CODIFICANTE)
ZKVERV1 TTCTCTGGCTGGATGCTCTT 1299-1318
ZKVEFW2 TGGTGACATGCGCTAAGTTT 1255-1274
465
ZKVERV2 CCGTGTGAACTGCTCCTTCT 1700-1719
ZKVEFW3 AAGGCAAACTGTCGTGGTTC 1670-1689
427
ZKVERV3 CTCCCCGACTCCTATGACAA 2077-2096
ZKVEFW4 CCACCATTTGGGGACTCTTA 2055-2074
438
ZKVERV4 GACGAACACCCCTGTACCAC 2473-2492

La amplificación del genoma viral se realizó mediante reacciones de RT-PCR en
un solo paso con el estuche comercial OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Hilden,
Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante y tomando como molde el
RNA viral purificado a partir de la suspensión celular de los cultivos infectados con
el aislado clínico de ZIKV. La mezcla de reacción y las condiciones de reacción se
detallan en las tablas 5 y 6 respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo en
un termociclador de punto final C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, California, EUA).
Los productos se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%
teñidos con SyBR Safe (Invitrogen, California, EUA) utilizando el equipo E-Gel
Safe Imager Real Time Transilluminator (Invitrogen, California, EUA).

Tabla 4.- Mezcla de reacción para RT-PCR de ZIKV.
Kit One Step QIAGEN®
Componente (concentración) Volumen
Buffer 5x (12.5 mM Mg2+) 5 µl
Enzyme mix 1 µl
dNTPs mix (10 mM) 1 µl
Forward primer (10 pmol/μL) 2 µl
Reverse primer (10 pmol/μL) 2 µl
H2O 4 µl
RNA (100 ng) 10 µl
TOTAL 25 µl

Tabla 5.- Condiciones de amplificación para RT-PCR de ZIKV
RT-PCR para ZIKV
50 °C, 30 min 1 ciclo
95 °C, 15 min 1 ciclo
94 °C, 30 s
35 ciclos 59 °C, 30 s
72 °C, 60 s
72°C, 10 min 1 ciclo
12°C Constante

Figura 8.- Alineación y cobertura de los Iniciadores utilizados para la amplificación de la región E
del genoma del ZIKV. Región que codifica para la proteína E de ZIKV (va de la posición 918 a
2429); Producto 1 (845-1318); Producto 2 (1255-1719); Producto 3 (1670-2096); Producto 4
(2055-2492). Como referencia se utilizó la secuencia de ZIKV con número de acceso KU922960 en
el Gene Bank.
Los productos de amplificación que corresponden a los 4 fragmentos de la
proteína E de ZIKV, se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al
1%, en amortiguador TBE 0.5X. Para ello, 20 µl de cada producto fueron
mezclados con 4 µl de un amortiguador de carga para DNA con GelRed 6X. Las
muestras fueron cargadas en los pozos y como patrón de referencia se empleó un
marcador de peso molecular en escalera de 100 pb (Invitrogen, California, EUA).
Las muestras se corrieron a 100 volts aproximadamente 15 min. Y los productos
se visualizaron mediante su exposición a luz UV en un transiluminador ChemiDoc
XRS+ (Bio-Rad, California, EUA). Se cortaron los fragmentos del gel de agarosa
que contenían los productos y el DNA correspondiente fue extraído del gel
841 CGTGGCTTTT GGGAAGCTCA ACGAGCCAAA AAGTCATATA CTTGGTCATG ATACTGCTGA
901 TTGCCCCGGC ATACAGCATC AGGTGCATAG GAGTCAGCAA TAGGGACTTT GTGGAAGGTA
961 TGTCAGGTGG GACTTGGGTT GATGTTGTCT TGGAACATGG AGGTTGTGTC ACCGTAATGG
1021 CACAGGACAA ACCGACTGTC GACATAGAGC TGGTTACAAC AACAGTCAGC AACATGGCGG
1081 AGGTAAGATC CTACTGCTAT GAGGCATCAA TATCAGACAT GGCTTCGGAC AGCCGCTGCC
1141 CAACACAAGG TGAAGCCTAC CTTGACAAGC AATCAGACAC TCAATATGTC TGCAAAAGAA
1201 CGTTAGTGGA CAGAGGCTGG GGAAATGGAT GTGGACTTTT TGGCAAAGGG AGCC TGGTGA
1261 CATGCGCTAA GTTTGCATGC TCCAAGAAAA TGACCGGG AA GAGCATCCAG CCAGAGAATC
1321 TGGAGTACCG GATAATGTTG TCAGTTCATG GCTCCCAGCA CAGTGGGATG ATCGTTAATG
1381 ACACAGGACA TGAAACTGAT GAGAATAGAG CGAAGGTTGA GATAACGCCC AATTCACCAA
1441 GAGCCGAAGC CACCCTGGGG GGTTTTGGAA GCCTAGGACT TGATTGTGAA CCGAGGACAG
1501 GCCTTGACTT TTCAGATTTG TATTACTTGA CTATGAATAA CAAGCACTGG TTGGTTCACA
1561 AGGAGTGGTT CCACGACATT CCATTACCTT GGCACGCTGG GGCAGACACC GGAACTCCAC
1621 ACTGGAACAA CAAAGAAGCA CTGGTAGAGT TCAAGGACGC ACATGCCAA A AGGCAAACTG
1681 TCGTGGTTCT AGGGAGTCAA GAAGGAGCAG TTCACACGG C CCTTGCTGGA GCTCTGGAGG
1741 CTGAGATGGA TGGTGCAAAG GGAAGGCTGT CCTCTGGCCA CTTGAAATGT CGCCTGAAAA
1801 TGGATAAACT TAGATTGAAG GGCGTGTCAT ACTCCTTGTG TACCGCAGCG TTCACATTCA
1861 CCAAGATCCC GGCTGAAACA CTGCACGGGA CAGTCACAGT GGAGGTACAG TACGCAGGGA
1921 CAGATGGACC TTGCAAG GTT CCAGCCCAGA TGGCGGTGGA CATGCAAACT CTGACCCCAG
1981 TTGGGAGGTT GATAACCGCT AACCCCGTAA TCACTGAAAG CACTGAGAAC TCTAAGATGA
2041 TGCTGGAACT TGATCCACCA TTTGGGGACT CTTACATTGT CATAGGAGTC GGGGAG AAGA
2101 AGATCACCCA CCACTGGCAC AGGAGTGGCA GCACCATTGG AAAAGCATTT GAAGCCACT G
2161 TGAGAGGTGC CAAGAGAATG GCAGTCTTGG GAGACACAGC CTGGGACTTT GGATCAGTTG
2221 GAGGCGCTCT CAACTCATTG GGCAAGGGCA TCCATCAAAT TTTTGGAGCA GCTTTCAAAT
2281 CATTGTTTGG AGGAATGTCC TGGTTCTCAC AAATTCTCAT TGGAACGTTG CTGATGTGGT
2341 TGGGTCTGAA CACAAAGAAT GGATCTATTT CCCTTAT GTG CTTGGCCTTA GGGGGAGTGT
2401 TGATCTTCTT ATCCACAGCC GTCTCTGCT G ATGTGGGGTG CTCGGTGGAC TTCTCAAAGA
2461 AGGAGACGAG ATGTGGTACA GGGGTGTTCG TC TATAACGA CGTTGAAGCC TGGAGGGACA
31

mediante el uso del QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Hilden, Alemania),
siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración del DNA extraído se
determinó por espectrofotometría usando un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher
Scientific, Massachusetts, EUA). Para corroborar la integridad y concentración de
los productos de amplificación se corrieron en geles de agarosa al 1%, en buffer
TBE 0.5X.

Los productos de PCR purificados fueron secuenciados. Para la secuenciación, se
hizo una PCR utilizando 10 ng de cada amplificado y el ABI Prism BigDye™
Terminator v2.0 Cycle Sequencing Kit (Nimagen, Nijmegen, Holanda), siguiendo
las instrucciones del fabricante. La purificación de los productos se realizó con el
DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante, y se secaron en un Concentrator 5301 (Eppendorf, Hamburgo,
Alemania). Las muestras fueron secuenciadas por el método enzimático de
Sanger en un secuenciador automático 31300 Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, California, EUA). Los resultados fueron generados y desplegados
gráficamente por el programa Sequencing Análisis 5.2 (Applied Biosystem,
California, EUA) y se procedió a analizarlos. Durante el análisis, edición, y
ensamble final de las secuencias obtenidas se utilizó el paquete bioinformático
Staden Package 2.0. Se concluyó la caracterización con un análisis tipo BLAST en
el GenBank para confirmar la presencia de ZIKV.

Propagación de ZIKV en células Vero

Con la finalidad de una mejor propagación y de un aumento en el título viral de
ZIKV, se utilizó la línea celular Vero (Células epiteliales del riñón de mono verde
africano). Se sembraron células Vero en botellas de cultivo de 75 cm2,
incubándolas a 37°C y 5% de CO2 en medio esencial mínimo (MEM) (Thermo
Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) suplementado con 1% de L-Glutamina,
aminoácidos no esenciales, vitaminas, penicilina, estreptomicina y 10 % de SFB.
Una vez que la monocapa celular alcanzó un 80% de confluencia, se retiró el
32

medio y se inocularon 40 µL de ZIKV con 10 mL de medio MEM sin SFB. Las
células infectadas se incubaron durante 2 horas a 37°C y 5% de CO2, una vez que
se cumplió este tiempo, se retiró el medio y se lavó la monocapa con solución
salina-fosfatos (PBS) 2 veces. Se adicionaron 10 ml de medio MEM sin SFB. Los
cultivos se monitorearon durante un periodo de 2 a 3 días a 37°C y 5% de CO2
hasta observar efecto citopático (CPE). Posteriormente el virus se cosechó
despegando las células utilizando un gendarme, se hicieron alícuotas de 500 µL
de la suspensión celular, la cuales se almacenaron a -70°C hasta su uso. Este
procedimiento se repitió 7 veces más con la finalidad de amplificar el título viral de
ZIKV.

Titulación de ZIKV por ensayo de placas líticas

Para la titulación de ZIKV se tomó como base el protocolo publicado por Coelho y
colaboradores en 2017, el cual se adaptó a nuestras condiciones de trabajo. Se
sembró una botella de cultivo de 25 cm2 de células Vero y una vez confluente se
agregó tripsina para resuspender las células en 24 ml de MEM suplementado con
10 % de SFB, estas se sembraron en una placa de 24 pozos a razón de 250,000
células/ml/pozo. Una vez que las monocapas estuvieron totalmente confluentes,
se lavaron con PBS y se añadieron 200 μl de diluciones virales seriadas a cada
pozo, dejando al inicio de cada serie un pozo sin infectar como control negativo
(solo se coloca medio libre de suero), tal y como se ilustra en la figura 9. Las
placas se incubaron por 2 h a 37 ºC con 5 % de CO2. Las diluciones virales se
realizaron de la siguiente manera: se tomaron 100 μl del virus concentrado y se
colocó en un tubo eppendorf de 1.8 ml, a este se le adicionaron 900 μl de medio
MEM (esta fue la dilución 10-1), de esta primera dilución se tomaron 100 μl en otro
tubo eppendorf de 1.8 ml y se adicionaron 900 μl de medio MEM (dilución 10-2), se
repitió este procedimiento hasta llegar a la dilución de 10-10. Posterior al tiempo de
incubación, se retiró el medio y se añadieron 1.5 ml de medio libre de suero con
1.5 % de metilcelulosa y se incubaron a 37ºC con 5 % CO2 hasta la observación
de efecto citopático (5-7 días). Una vez que se observó el efecto citopático, se
33

retiró la metilcelulosa y las células se fijaron con una mezcla de alcohol/acetona
(1:1) por 15 minutos. Posteriormente se secó la placa, se tiñó con cristal violeta
por 30 minutos, se lavó la placa con agua corriente y se dejó secar toda la noche.
La titulación viral se determinó contando directamente el número de placas líticas
observadas en la dilución más alta, considerando:

UFP/ml = # placas x 5 x DF
En donde:
UFP: unidades formadoras de placas
DF: factor de dilución
5: factor de corrección correspondiente a 0.2 ml del inoculo viral.

Figura 9.- Diseño experimental de la titulación de ZIKV por ensayo en placas líticas

Inmunocitoquímica de células infectadas con ZIKV

Se sembraron las células en laminillas de 4 pozos (Thermo Scientific,
Massachusetts, EUA) una vez confluentes, se lavaron las monocapas con PBS y
se infectaron con ZIKV a una MOI de 3. Se incubaron a 37ºC con 5% CO2 por 2
horas, se retiró el sobrenadante y se lavaron con PBS dos veces. Las células se
fijaron con paraformaldehido al 4% por 15 minutos y se permeabilizaron con
acetona fría a -20 ºC, las laminillas se almacenaron a 4 ºC hasta realizar la
34

Inmunocitoquímica. Para la Inmunocitoquímica se utilizó el estuche comercial
Abcam ® EXPOSE Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC kit
(Abcam, Cambridge, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Como Anticuerpo primario se utilizó un anticuerpo monoclonal αFLAV clona H38J
(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA, Cat. No. MA1-7397).

Cinéticas de infección

Las cinéticas de infección para la determinación de citocinas se llevaron a cabo en
placas de 24 pozos. Las células se propagaron en botellas de cultivo de 150 cm2,
se tripsinizaron y se sembraron 250,000 células por cada pozo, una vez adheridas
se infectaron con ZIKV a una MOI de 3 y se incubaron a 37ºC con 5% de CO2
durante 2 horas. La cosecha de las células y los sobrenadantes infectados se
realizó a las 0, 12, 24, 49 y 72 horas respectivamente (Figura 10), el sistema se
diseñó de la siguiente manera: células sin infección, células infectadas con ZIKV,
virus inactivo por calor a 56ºC durante 30 min. (MOCK) como control negativo y
TNF-α como control positivo.

Figura 10.- Diseño del sistema para las cinéticas de infección.

A la par de las cinéticas de infección y con la finalidad de determinar la tasa de
replicación viral se prepararon laminillas para Inmunocitoquímica, estas se fijaron
a los mismos tiempos, es decir, 0, 12, 24, 48 y 72 horas realizando el mismo
35

procedimiento que el descrito previamente para Inmunocitoquímica. Se utilizó
PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación, proteína nuclear sintetizada
en la fase G1 y en la fase S del ciclo celular) como control positivo y una laminilla
sin anticuerpo primario para descartar uniones inespecíficas.

Cuantificación de citocinas

La determinación de citocinas se realizó utilizando un estuche comercial para la
cuantificación simultanea de 17 citocinas Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-Plex
Immunoassay (Bio-Rad, California, EUA) siguiendo las especificaciones del
fabricante, las citocinas cuantificadas fueron: G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, MCP-1, MIP-1β y TNF-α.
Para la lectura, y análisis de los datos se utilizó el equipo Bio-Plex® 200 system
(Bio.Rad, California, EUA). El límite de detección para cada citocina es el
siguiente: 1.1 pg/mL para G-CSF, 4.5 pg/mL para GM-CSF, 19.3 pg/mL para IFN-
γ, 0.8 pg/mL para IL-1β, 1.1 pg/mL para IL-2, 0.5 pg/mL para IL-4, 0.8 pg/mL para
IL-5, 1.1 pg/mL para IL-6, 0.5 pg/mL para IL-7, 0.5 pg/mL para IL-8, 0.9 pg/mL
para IL-10, 0.5 pg/mL para IL-12 (p70), 2.1 pg/mL para IL-13, 0.2 pg/mL para IL-
17, 6.7 pg/mL para MCP-1, 1.1 pg/mL para MIP-1β y 3.0 pg/mL para TNF-α.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo con ayuda del programa GraphPad Prism 5,
para determinar

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