Preparacion-de-un-conjugado-util-para-el-diagnostico-de-rabia-in-situ-utilizando-un-suero-hiperinmune-producido-en-conejo-a-partir-de-una-vacuna

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLÁN 
 
 
 
 
Preparación de un conjugado útil para diagnóstico 
de rabia in situ, utilizando un suero hiperinmune 
producido en conejo a partir de una vacuna 
 
 
TESIS 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN 
BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA 
PRESENTA: 
Alberto Fructuoso Moreno Leal 
 
ASESOR: Dr. en C. Andrés Romero Rojas 
 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO, 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 A la UNAM y a la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán: 
A las cuales estoy sumamente orgulloso y eternamente agradecido de haberme 
formado como profesionista, y además en el transcurso de mi carrera se 
inculcaron valores en mí, haciéndome crecer como persona. 
A mis padres: 
Madre: Que siempre me ha brindado su amor y su eterno apoyo a cada momento, 
y estoy seguro que gracias a ella me he formado como mejor persona, por tener 
siempre tiempo para mí, escucharme y darme aliento, gracias por creer en mí. Y 
mi padre el cual a pesar de su ausencia sigue presente conmigo por sus 
enseñanzas y el carácter que formó en mí, que desde el cielo me cuida y nunca 
me cansaré de agradecerle todo lo que hizo por nosotros. 
A mi hermana y su familia: 
La cual lleva un poco la carga de culpa de haber escogido esta licenciatura, 
siempre tiene una idea, una palabra o un consejo, a sus hijos los cuales adoro, y a 
su esposo que ha sido como otro hermano. 
Al doctor Andrés: 
Con el que estoy agradecido por brindarme su confianza al empezar este 
proyecto, por incluirme en muchas actividades, gracias por compartir todos esos 
conocimientos y hacerme sentir como en casa. 
A mis amigos: 
Que son una familia para mí, que siempre están conmigo en los momentos 
difíciles y son de las personas que siempre quiero en mi vida y en las cuales tengo 
un gran apoyo. En especial a Jackeline por su impulso, entusiasmo, ganas y su 
apoyo incondicional. 
 
3 
 
 
 
INDICE ......................................................................................................... 3 
ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................. 3 
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................... 3 
1.0 RESUMEN ................................................................................................... 5 
2.0 GENERALIDADES ...................................................................................... 6 
2.1 Virus de la rabia ................................................................................... 6 
2.1.1 Ciclo viral ............................................................................................ 7 
2.1.2 Inmunidad contra el Virus de la Rabia ................................................ 8 
2.1.3 Aspectos clínicos y patológicos de la enfermedad en los reservorios 10 
2.1.4 Tratamiento ......................................................................................... 11 
2.1.5 Nuevos regímenes de vacunación después de la exposición ............. 12 
2.1.6 Diagnóstico postmortem de la rabia .................................................... 13 
2.1.7 Diagnóstico intra vitam del Virus de la Rabia ...................................... 15 
2.1.8 Reseña histórica de los reactivos de diagnóstico ............................... 16 
2.2 Epidemiología e impacto socioeconómico de rabia, en 
animales de granja ............................................................................ 16 
2.3 Obtención y producción de un anticuerpo fluorescente ............... 20 
2.3.1 Separación de anticuerpos mediante salting out ................................ 20 
2.3.2 Purificación de la proteína de interés .................................................. 20 
2.3.3 Conjugación del anticuerpo purificado ................................................ 21 
2.4 Biológicos y kits de diagnóstico con registro sanitario ................ 21 
2.5 Marco legal del kit de diagnóstico ................................................... 21 
2.6 Demanda de mercado para el reactivo de diagnóstico de rabia ... 22 
3.0 JUSTIFICACIÓN ......................................................................................... 24 
4.0 HIPÓTESIS .................................................................................................. 25 
5.0 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 26 
5.1 OBJETIVOS SECUNDARIOS ............................................................... 26 
6.0 MATERIALES Y REACTIVOS .................................................................... 27 
 
4 
 
7.0 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................. 28 
7.1 Cuantificación de proteínas del inmunógeno ................................... 29 
7.2 Animales de experimentación ............................................................ 29 
7.3 Esquema de inmunización .................................................................. 29 
7.4 Obtención de los sueros ..................................................................... 30 
7.5 Purificación de proteínas .................................................................... 30 
7.6 Conjugación con FITC ......................................................................... 31 
7.7 Purificación mediante perlas de sefarosa ......................................... 32 
7.8 Prueba de humedad ............................................................................. 32 
7.9 Prueba de vacío ................................................................................... 33 
7.10 Técnica directa de AF ........................................................................ 34 
8.0 RESULTADOS ............................................................................................ 35 
8.1 Reacción con cloruro de bario ........................................................... 35 
8.2 Cuantificación de proteínas del suero ............................................... 36 
8.3 Obtención de muestras conjugadas .................................................. 37 
8.4 Purificación por sefarosa .................................................................... 38 
8.5 Resultados de pruebas a producto terminado .................................. 38 
9.0 ANÁLISIS DE RESULTADOS ..................................................................... 42 
9.1 Características e inmunogenicidad del modelo biológico y 
del antígeno ......................................................................................... 42 
9.2 Inmunogenicidad del antígeno ........................................................... 44 
9.3 Método de cuantificación de proteínas .............................................. 45 
9.4 Métodos de separación y conjugación .............................................. 46 
9.5 Constatación del conjugado ............................................................... 49 
10.0 CONCLUSIONES ........................................................................................ 54 
11.0 GLOSARIO .................................................................................................. 55 
12.0 ABREVIATURAS ........................................................................................58 
13.0 ANEXO ........................................................................................................ 59 
REFERENCIAS ........................................................................................... 63 
 
 
5 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura1. Imagen del territorio nacional mexicano .............................................. 18 
Figura 2. Casos de rabia en animales, reportados a SENASICA de 
1986 a 2016 en México ....................................................................... 19 
Figura 3. Número de casos de rabia en animales diagnosticados en distintos 
laboratorios y reportados a SENASICA hasta 2016 ............................ 23 
Figura 4. Procedimiento generalizado de producción ......................................... 28 
Figura 5. Esquema de inmunización en conejos cepa california ........................ 29 
Figura 6. Reacción de cloruro de bario ............................................................... 36 
Figura 7. Fluorescencia en los tubos de separación de los conjugados ............. 37 
Figura 8. Modelo biológico de estudio ................................................................ 59 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Concentración de proteínas ................................................................ 35 
Tabla .2 Resultados espectrofotometría de doble longitud de onda .................. 36 
Tabla 3. Concentración de proteínas separadas con Sefarosa en 10 muestras 
a distintos tiempos de recolección ....................................................... 37 
Tabla 4. Relación de absorbancias de los separados por Sefarosa .................. 38 
Tabla 5. Prueba de vacío .................................................................................. 39 
Tabla 6. Porcentaje de humedad en muestras liofilizadas del conjugado ......... 39 
Tabla 7. Resultados de fluorescencia reportados por el laboratorio de 
patología de SENASICA ...................................................................... 41 
 
 
 
 
 
 
6 
 
1.0 RESUMEN 
La rabia es una enfermedad viral zoonótica causada por la infección con el virus 
de la rabia (VR) y se presenta como una encefalomielitis de curso agudo. Una vez 
que el virus alcanza el Sistema Nervioso Central (SNC) la infección adquiere el 
carácter de irreversible, conduciendo invariablemente a la muerte al individuo. El 
VR afecta a todos los animales de sangre caliente y para diagnosticar la patología 
se cuenta con procedimientos especializados como la inmunofluorescencia que 
consiste en una reacción antígeno anticuerpo, misma que es posible detectar 
gracias a la incorporación de un colorante fluorescente al anticuerpo, este proceso 
no altera la especificidad del mismo. En México hasta el 2017, la rabia seguía 
siendo un problema persistente en el sector ganadero, no obstante, se descartó 
que la carne infectada fuera comercializada, debido a que las autoridades 
aseguran tomar las medidas para evitar el contacto con el consumidor, a pesar de 
dichas aseveraciones, en el mercado no existe un producto que permita 
comprobar si un animal de consumo sufrió la enfermedad. Debido a lo anterior, 
este proyecto tuvo como objetivo la producción de un conjugado policlonal con 
anticuerpos de conejo y en concordancia con la normativa mexicana, se realizaron 
pruebas de constatación para verificar la calidad del producto, así como su 
especificidad, capacidad de unión, título, porcentaje de humedad y comprobación 
del vacío en el envasado, obteniendo los resultados esperados y en conformidad 
con la normativa. 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
2.0 GENERALIDADES 
2.1 Virus de la rabia (VR) 
La rabia es una infección viral zoonótica, que se presenta como una 
encefalomielitis de curso agudo. Se transmite con alta eficiencia a cualquier 
mamífero a través de la mordedura de algún reservorio del virus que se encuentre 
infectado y en periodo de transmisión (Smith, 1996). 
El virión pertenece a la familia Rhabdoviridae, género Lyssavirus, mide 180 nm de 
longitud y 75 nm de diámetro con una forma característica que asemeja una bala. 
Los viriones están envueltos en una bicapa lipídica cuya composición es 
semejante a la de la membrana neuronal, en ella se encuentra anclada la 
glicoproteína G, hacia el interior se ubica la proteína de matriz (M), mientras que la 
nucleocápside está constituida por tres proteínas (N, P y L) y envuelve al ácido 
nucleico que es una cadena sencilla de RNA de polaridad negativa (Kusmin, 
2003). 
Gracias al aislamiento y uso de anticuerpos monoclonales y policlonales obtenidos 
de numerosas especies animales de todo el mundo, se han identificado cuatro 
serotipos de los virus de la rabia. 
 
El serotipo 1 corresponde a una cepa prototipo de Virus Patrón de Prueba 
(CVS por sus siglas en inglés Challenge Virus Standard) que engobla a la 
mayoría de los virus del terreno que se han aislado de mamíferos terrestres. 
El serotipo 2 es una cepa prototipo de murciélago de Lagos, aislada por 
primera vez de una mezcla de encéfalos de murciélagos de Nigeria 
(murciélago de Lagos). 
El serotipo 3 es una cepa prototipo Mokola, aislada por primera vez en 
musarañas en Nigeria, y después de una persona (Mokola 1); otros virus se 
han obtenido de musarañas de Camerún (Mokola 2) y de Ia República 
Centroafricana (Mokola 3), y de perros de Zimbabue (Mokola 5). 
8 
 
El serotipo 4 es una cepa prototipo Duvenhage, aislada por primera vez en 
el hombre en Sudáfrica (Duvenhage 1), y después en murciélagos en 
Sudáfrica (Duvenhage 2), y en Zimbabue (Duvenhage 3) (Soares, 2002). 
2.1.1 Ciclo viral 
Ciclo de replicación. El ciclo de replicación del virus de la rabia se lleva a cabo 
en el citoplasma de la célula blanco, ya que ninguna célula de mamífero es capaz 
de transcribir a partir de una cadena molde de RNA (-). El virus cuenta con su 
propia transcriptasa y replicasa (proteína L, RNA RdRP) de tal forma que solo 
requiere la maquinaria de traducción de proteínas y la de síntesis de nucleótidos, 
aminoácidos y lípidos de la célula blanco (Villa, 2015). 
Adsorción y Adherencia. El virus se adhiere a la célula gracias a los receptores 
de acetilcolina y fosfatidilserina que tienen una mayor expresión en células del 
SNC respecto a otras estirpes celulares. La adsorción es necesaria para que la 
infección viral se pueda llevar a cabo, mediante la formación de un endosoma y la 
fusión, esta es independiente de energía (Villa, 2015). 
Penetración y desnudamiento. El virus penetra por endocitosis dentro de una 
vacuola fagocítica. La reacción de fusión de membranas (membrana viral y 
membrana plasmática), que favorece la inyección de la nucleocápside al 
citoplasma, depende de un cambio a pH ácido dentro de la vacuola fagocítica 
(Villa, 2015). 
Transcripción y traducción. El virus de la rabia se replica exclusivamente en las 
regiones donde existen ribosomas. Cuando la nucleocápside ingresa al 
citoplasma, comienza el primer ciclo de traducción, permitiendo el inicio de la 
transcripción gracias a la proteína L viral que tiene actividad de RNA polimerasa 
dependiente de RNA (RdRP), así, a partir del genoma de RNA (-) se generan 
varias copias de RNA (+) que sirven como molde para la síntesis de nuevas 
cadenas de RNA (-) que posteriormente se ensamblarán junto con las proteínas 
de la nucleocápside para dar lugar a los nuevos viriones, es importante mencionar 
9 
 
que el proceso de traducción ocurre de manera simultánea a la transcripción (Villa, 
2015). 
Procesamiento postraduccional de la proteína G. Esta fase del ciclo se refiere 
a la glicosilación de la proteína G, de esta forma, el mRNA que codifica para G se 
traduce en los ribosomas del retículo endoplásmico rugoso, a continuación, la 
proteína sintetizada se inserta en la membrana de este organelo para ser 
transportada al aparato de Golgi (AG) donde se glicosila, la porción de membrana 
de AG que rodea a G glicosilada se transportaa la superficie celular donde, como 
parte del proceso de renovación de la membrana plasmática, la proteína G viral 
queda anclada a la membrana, este evento sirve como señal para que la proteína 
M, una vez traducida, se acople en el dominio citoplasmático de la proteína G 
(Villa, 2015). 
Ensamblaje. Ya que se llevó a cabo la transcripción, traducción y replicación, la 
formación de las nucleocápsides es espontánea. Una vez formada la 
nucleocápside, viaja hacia la región de la membrana donde ya están las proteínas 
G y M acopladas a la membrana de la neurona. En esta zona se ensamblan los 
viriones por reconocimiento mutuo de secuencias de aminoácidos en las proteínas 
N, G y M. Los viriones recién formados emergen inmediatamente de la célula por 
gemación y están listos para infectar otras células susceptibles y continuar con el 
ciclo propagativo (Villa, 2015). 
Vías de infección. Se han documentado varías vías de infección, como la 
transcutánea, epidérmica, aérea y digestiva. Sin embargo, como mecanismos de 
transmisión, las vías transcutánea y epidérmica son las únicas relacionadas con el 
mantenimiento enzoótico de la enfermedad (Villa, 2015). 
Progresión de la infección. La velocidad con la que se manifiestan los signos y 
síntomas de la rabia depende de las características biológicas de la cepa del virus 
que infecta, de la concentración de receptores para el virus en las células 
nerviosas del músculo esquelético, de la magnitud del inóculo, de la inervación en 
el sitio de entrada y de la proximidad de la lesión al SNC. Cuando la vía de 
10 
 
entrada del virus es transcutánea o epidérmica, este se localiza en el sitio de 
inoculación durante un tiempo variable. En ese lapso puede suceder una primera 
replicación en las células nerviosas de la placa neuromuscular más cercanas a la 
herida. Las células donde se multiplica el virus, inicialmente son parte de los 
nervios sensores y motores que inervan el sitio de infección. Esto aumenta de 
manera significativa la carga viral respecto a la que se inoculó inicialmente. Luego 
de esta primera fase de multiplicación, el agente infeccioso se desplaza entre 8 a 
20 mm por día a través de la red de neuronas del sistema nervioso periférico 
(SNP) mediante endocitosis o fusión de membranas. El camino que sigue el virus 
de SNP al SNC se denomina diseminación centrípeta (Villa, 2015). 
Una vez que el virus alcanza el SNC, la infección adquiere el carácter de 
irreversible, conduciendo invariablemente a la muerte al individuo. La infección y 
multiplicación del virus en el encéfalo inicia en el sistema límbico y luego se 
extiende al resto del cerebro, particularmente a la protuberancia, el mesencéfalo y 
el tálamo, produciendo edema, congestión vascular, infiltración discreta de 
linfocitos e hiperemia de las leptomeninges vecinas. Las lesiones por 
histopatología se observan en forma de focos distribuidos irregularmente en la 
sustancia gris, la circunvolución del hipocampo es la parte más afectada. Después 
de que el virus ha completado su invasión al cerebro comienza una etapa de 
dispersión denominada diseminación centrifuga, en la cual el virus regresa a los 
órganos del individuo con alta inervación (Villa, 2015). 
Cuando el virus llega a las glándulas salivales, este se difunde a través del nervio 
trigémino por las ramas que inervan las fibras mielínicas y amielínicas que 
penetran la membrana basal, llegando al citoplasma de las células acinares, lo 
que inicia la eliminación del virus a través de saliva. En perros la eliminación del 
virus por saliva inicia en promedio de 3 a 10 días antes de que se manifiesten los 
primeros signos clínicos, esto es importante, a pesar de que la infección es 
inicialmente asintomática, el animal resulta un potencial transmisor del virus. 
Durante esta etapa el virus se puede detectar e incluso aislar de células nerviosas 
de la retina, córnea, piel, páncreas, miocardio, glándulas salivales y del folículo 
11 
 
piloso. El intestino, la vesícula y el riñón son invadidos un poco más tarde durante 
el curso clínico de la enfermedad. Cuando la lesión ocurre en la cara, sea de un 
animal o del humano, la probabilidad de desarrollar la enfermedad es del 60 %, 
pero se reduce al 15 a 40 % cuando es en las manos o brazos, y sólo presenta de 
3 a 10 %, si es en las piernas. Lo anterior ocurre debido a la cercanía de la lesión 
con el SNC y del tamaño del inóculo (Villa, 2015). 
2.1.2 Inmunidad contra el virus de la rabia 
El VR, contiene una glicoproteína simple, y en algunos viriones se han hallado 
más de un patrón de glicosilación en la misma proteína. La proteína G es el 
determinante antigénico más relevante debido a que tanto los anticuerpos 
neutralizantes como las células T citotóxicas reconocen los epítopes de G. Se han 
descrito muchos sitios antigénicos diferentes que constituyen un grupo de 
epítopes. Los mapas de estos sitios indican que hay dos epítopes con 
conformación y secuencia bien definida y que estos están dispersos en distintos 
sitios de la cadena polipeptídica (Wunner, 2002). 
Un análisis más limitado, es el del antígeno de la nucleocápside, el cual ha 
demostrado que contiene un número distinto de epítopes, y solo algunos de ellos 
son compartidos en los diferentes tipos de VR, y algunos otros solo se encuentran 
en particular en un solo tipo (Hirose, 1996). 
2.1.3 Aspectos clínicos y patológicos de la enfermedad en 
los reservorios 
El VR afecta a todos los animales de sangre caliente, en el caso de los humanos, 
se reporta que el perro y gato fungen como los principales transmisores, por otro 
lado, los animales silvestres más involucrados en el ciclo epizootiológico de la 
rabia son el zorro, murciélago, tejones, zorrillos, lobos, mapaches y hurones, estos 
se encuentran en hábitats con llanuras, zonas montañosas, desiertos y muy 
raramente en zonas urbanas (Girón, 2015). 
12 
 
En México los animales domésticos son los más afectados por dicha enfermedad, 
y siguen este orden: perros, gatos, bovinos, equinos, cerdos, borregos, 
murciélagos, cabras, ardillas, zorrillos y ratas (Girón, 2015). 
La manifestación de la enfermedad depende del periodo de incubación, esto es, el 
tiempo transcurrido desde la exposición hasta el inicio de los signos clínicos. 
Aunque en la mayoría de los casos, este periodo dura varios meses, se ha 
reportado que la enfermedad puede iniciar pocas horas después de la agresión. 
Aproximadamente en el 15 % de los casos, este tiempo puede durar más de 3 
meses y en el 1 % más de 1 año o solo algunos días. Los períodos de incubación 
tienden a ser más cortos cuando la mordedura es en la cabeza (30-48 días) que 
cuando son en mano, brazo (40 a 59 días) o extremidades inferiores (38 a 78 días) 
(Rupprecht, 2002). 
2.1.4 Tratamiento 
En casos de infección con el VR se implementa un protocolo de profilaxis 
postexposición, el cual tiene como objetivo impedir que el virión entre en el SNC, 
lo cual, como se ha mencionado anteriormente, provocaría la muerte inmediata, 
dicho protocolo involucra métodos físicos y hace uso de terapéuticos como 
vacunas y anticuerpos monoclonales quiméricos (murino-humano) y humanizados 
(de origen murino). A continuación, se refiere dicho protocolo. 
 La limpieza a fondo y el tratamiento local de la herida tan pronto como sea 
posible después de la exposición. 
 Aplicación de una vacuna antirrábica potente y eficaz conforme a las 
normas de la OMS. 
 Administración de inmunoglobulina antirrábica, si está indicado. 
El tratamiento oportuno después de la exposición puede evitar la aparición de los 
síntomas y la muerte (Iseni, 1998). 
Interferón e inductores de interferón. Se ha comprobado que tanto las 
preparaciones exógenas de interferón como los inductores de interferón son 
13 
 
sumamente eficaces para reducir la mortalidad en ratones y primates inmunizados 
con una cepa de virus del terreno. Además, se ha demostradoque la 
administración conjunta de la vacuna e interferón reduce la replicación del virus y 
provoca una reducción de la mortalidad. Asimismo, ha comprobado la eficacia del 
interferón exógeno en un paciente que recibió un trasplante de córnea de una 
persona con rabia (Figueroa, 1984). 
2.1.5 Nuevos regímenes de vacunación después de la exposición 
Esta enfermedad se controla y previene mediante acciones conjuntas de los 
sectores público, social y privado ofreciendo información educativa al respecto en 
función de una vigilancia epidemiológica eficaz, la vacunación y el control de la 
población canina, el control de la población murciélago hematófago (vampiro) y la 
vacunación de animales de otras especies domésticas susceptibles, 
particularmente las de interés económico en riesgo, a fin de reducir las 
considerables pérdidas económicas en la ganadería del país (Hirose, 1996). 
El régimen de vacunación post exposición consiste en la aplicación de tres dosis 
de vacuna en el músculo deltoides del brazo derecho y del izquierdo en el día de 
la agresión y una dosis aplicada 8 días después. Con base en los resultados 
obtenidos tras la inmunización en humanos sanos, se sabe que, a las 6 horas se 
produce una reacción de inmunidad celular y tras 5 días se presenta una 
respuesta humoral (OMS, 2004). 
No se dispone de pruebas para diagnosticar la infección por rabia en los humanos 
antes de la aparición de los síntomas clínicos y, a menos que haya signos 
específicos de hidrofobia o aerofobia, el diagnóstico clínico es difícil de establecer. 
La rabia se confirma post mortem mediante diferentes técnicas que permiten 
detectar el virus completo en orina, saliva y detectando antígenos víricos o ácidos 
nucleicos en tejidos infectados como el cerebro y la piel (Cabello, 2007). 
 
14 
 
2.1.6 Diagnóstico postmortem de la rabia 
Para el diagnóstico de Ia rabia se ha elaborado un inmunoensayo ligado a 
enzimas (ELISA) llamado inmunodiagnóstico enzimático rápido de Ia rabia 
(RRETD), basado en Ia detección de la nucleocápside (N) del VR en el tejido 
cefálico. Debido a que el antígeno puede detectarse a simple vista, la prueba 
puede efectuarse en el terreno con Ia ayuda de un estuche especial (Perrin P. &., 
1987). 
Otra técnica para el diagnóstico consiste en el aislamiento del virus, que además 
de confirmar los resultados de las pruebas de detección de antígenos, elimina Ia 
necesidad de contar con animales de experimentación y resulta menos costoso en 
cuestión de equipos necesarios para lectura de resultados (Lamprea, 2010). 
Hasta la fecha, ha sido posible aislar varios cientos de Lyssavirus provenientes de 
muestras de seres humanos, animales domésticos y de animales salvajes de 
África, América, Asia y Europa Occidental; mismos que han sido comparados 
empleando anticuerpos monoclonales. Esos estudios demuestran que el VR 
puede distinguirse de otros Lyssavirus, y que los virus rábicos aislados de cierta 
zona geográfica o especie tienen patrones singulares de reactividad, tanto en los 
componentes de nucleocápside como de glucoproteína del virión. En ecosistemas 
relativamente sencillos, algunos huéspedes carnívoros importantes (canidos 
salvajes, por ejemplo) fungen como reservorios primarios de la rabia. En Canadá y 
los EEUU, los virus rábicos de campo se mantienen aislados en regiones 
geográficas limitadas en animales como los zorros, mapaches y murciélagos; se 
sabe que la transferencia del VR a otras especies poco importante para el 
mantenimiento de la infección debido a que los virus aislados de murciélagos y 
carnívoros terrestres son distintos (Wunner, 2002). 
El VR puede aislarse en cultivos celulares a partir de muestras de saliva, biopsias 
y líquido cefalorraquídeo mismas que deberán conservarse en congelación luego 
de su recolección. En algunas ocasiones, será necesario examinar las biopsias de 
encéfalo para detectar Ia presencia de antígeno o del virus, de ser posible, se 
15 
 
debe emplear la técnica anticuerpos fluorescentes (AF) para la búsqueda del 
antígeno. Sin embargo, se ha documentado que aun en las etapas avanzadas de 
la enfermedad, las biopsias, saliva y, el líquido cefalorraquídeo, pueden estar 
libres de virus (Caporale, 2009). 
En la actualidad no se realizan tantos ensayos moleculares ni de Ia reacción en 
cadena de la polimerasa en el diagnóstico habitual de Ia rabia en comparación con 
otras técnicas, debido a su alto costo (Villa, 2015). 
2.1.7 Diagnóstico intra vitam del Virus de la Rabia 
La elección de las técnicas de diagnóstico intra vitam (durante en curso de la vida) 
varía considerablemente según la etapa de Ia enfermedad; Ia detección de 
antígenos por lo general es sensible durante los primeros días, mientras que los 
anticuerpos neutralizantes de virus en el líquido cefalorraquídeo y suero tienden a 
aparecer después de 7-10 días de iniciados los primeros signos de Ia enfermedad. 
En esta técnica se emplean AF en impresiones corneales o biopsias de piel de 
pacientes con rabia; sin embargo, las muestras positivas por AF son más comunes 
durante las etapas finales de la enfermedad. La prueba se basa en el examen 
microscópico, bajo luz ultravioleta, de impresiones, frotis o secciones congeladas 
de tejido luego del tratamiento con suero o globulina antirrábicos conjugados con 
isotiocianato de fluoresceína (FITC). Para aumentar la sensibilidad de Ia prueba se 
recomienda emplear impresiones bilaterales (o frotis) de muestras de tejido del 
hipocampo y del tallo encefálico; algunos laboratorios también tiñen muestras de 
cerebelo (Johnson, 1978). 
La piel para la biopsia por lo general se toma de la zona de la nuca, con folículos 
de cabello que contengan nervios periféricos. Las impresiones corneales se 
obtienen de pacientes encefalíticos, tocando ligeramente Ia parte central de Ia 
cornea con un portaobjetos. La calidad de las muestras, tanto de las impresiones 
corneales como de las biopsias de piel es fundamental y deben refrigerarse 
inmediatamente después de la recolección. A pesar de que se ha demostrado la 
presencia de antígenos virales en impresiones corneales provenientes de 
16 
 
pacientes y animales infectados natural y experimentalmente, la sensibilidad de la 
técnica AF para el diagnóstico intra vitam es limitada debido a que mientras un 
resultado positivo indica la presencia de virus, uno negativo no descarta que haya 
infección. Aunque el antígeno de la rabia puede detectarse en biopsias de piel 
cuando aparecen los primeros signos clínicos, la proporción de los resultados 
positivos tiende a aumentar a medida que avanza la enfermedad. En las biopsias 
de piel de Ia nuca, solo algunos pacientes muestran signos positivos, 
especialmente durante la fase temprana de Ia enfermedad clínica. No obstante, Ia 
sensibilidad general de la prueba AF es más elevada en las biopsias de piel que 
en las impresiones corneales (Smith, 1996). 
La técnica de AF constituye un método rápido y sensible para el diagnóstico de la 
infección rábica en humanos y es por ello que este proyecto plantea utilizar esta 
técnica para el diagnóstico en animales (Caporale, 2009). 
2.1.8 Reseña histórica de los reactivos de diagnóstico 
La producción de antisueros de origen animal se inició a nivel mundial en los años 
20´s del siglo pasado y para los años 30´s el Instituto Nacional de Higiene de los 
EUA (NIH) inició la producción de este tipo de biológicos, primeramente dirigidos 
contra toxinas de origen microbiano, como la toxina diftérica y tetánica y 
posteriormente esta metodología fue aplicada a la producción de sueros contra 
venenos de animales ponzoñosos (Manchado, 2003). 
Los primeros productos consistían de sueros crudos, en donde sólo se eliminaban 
los componentes celulares (eritrocitos y leucocitos) y permanecían junto con las 
inmunoglobulinas de interés (dirigidas contra los diferentes componentes de las 
toxinas o venenos) otras proteínasresponsables de las reacciones secundarias, lo 
que obligó a desarrollar métodos que permitieran eliminar estas proteínas y 
purificar las inmunoglobulinas, utilizando para ello principalmente métodos de 
precipitación selectiva (Manchado, 2003). 
17 
 
Por otra parte Albert Coons, profesor en el departamento de bacteriología e 
inmunología en la Harvard Medical School, y miembro de la academia nacional de 
ciencias desde 1962, inició diversas investigaciones en la inmunología y en la 
biología celular que continúan vigentes hasta estos días gracias al desarrollo de la 
técnica de inmunofluorescencia por el marcaje de anticuerpos específicos con 
colorantes fluorescentes, los cuales permitían la detección de anticuerpos, 
antígenos y cualquier proteína antigénica en células y tejidos (Atanasiu, 1974). 
Por tanto, la inmunofluorescencia es un procedimiento especializado que consiste 
en una reacción antígeno anticuerpo utilizada tanto en inmunología como en 
histología, que es posible gracias a la incorporación de un colorante fluorescente 
al anticuerpo sin alterar su especificidad y una vez hecha la reacción, se expone a 
la luz ultravioleta emitida por el microscopio para ser evidenciado por el fenómeno 
de fluorescencia (Atanasiu, 1974). 
2.2 Epidemiología e impacto socioeconómico de rabia, en animales 
de granja 
En 1991 el comité de expertos sobre Rabia de la OMS señaló que la rabia seguía 
siendo un peligro importante para la salud humana en muchos países de África, 
Sudamérica y Asia, y que el tratamiento post exposición, la producción de vacunas 
para uso médico y veterinario, así como, la lucha contra la rabia en perros y 
animales salvajes representa una carga económica para los países afectados 
(Cabello, 2007). 
Por otra parte, en la actualidad se considera que en Latinoamérica mueren de 
rabia entre 500 mil y 1 millón de bovinos anualmente, lo que puede representar de 
1 a 5 mil millones de pesos mexicanos en pérdidas; estas cifras pueden aumentar 
considerablemente si se toma en cuenta que el número de casos reportados 
representan únicamente del 1 al 60 % del número de casos reales estimados 
(Girón, 2015). 
18 
 
En la figura 1 se muestra la prevalencia del VR en el territorio nacional mexicano, 
las zonas cuales presentan un mayor impacto socioeconómico están marcadas 
con rojo en estas mismas se encuentran algunas especies las cuales son el mayor 
reservorio del agente. Los casos de rabia en animales en México reportados a 
SENASICA desde 1986 hasta el 2017 se encuentran en la figura 2 los cuales 
además de mostrar la efectividad de las campañas propuestas por dicha 
institución, indican la demanda de reactivos de diagnóstico al ser casos 
confirmados por infección del VR (SENASICA, 2017). 
 
Figura1. Imagen del territorio nacional mexicano. En rojo las zonas con mayor 
prevalencia del vampiro hematófago y en verde las zonas libres del 
murciélago (SENASICA, 2017). 
 
En México, el presidente de la Unión Ganadera en la zona centro del estado de 
Veracruz, Jesús Ortega Couttolenc afirmó que hasta el 2017, la rabia seguía 
siendo un problema que persiste en el sector ganadero además aseveró que 
después de los casos de rabia paralítica en el municipio de Alvarado se ha 
insistido en la aplicación de vacunas y la implementación de otros métodos para el 
19 
 
control de la enfermedad, puntualizó que es difícil cuantificar las pérdidas, ya que 
a veces los productores no reportan los casos (Vela, 2017). 
 
Figura 2. Casos de rabia en animales, reportados a SENASICA de 1986 a 2016 
en México (SENASICA, 2017). 
 
En el mismo comunicado descartó que la carne infectada sea comercializada, ya 
que asegura se toman las medidas para evitar el contacto con el consumidor, a 
pesar de que no existe una forma efectiva de comprobar que el animal de 
consumo no fue afectado por dicha enfermedad. Sin embargo, en el 2017 en la 
zona sur del territorio mexicano persiste la rabia en animales de corral, debido a la 
abundancia del murciélago hematófago en dicha zona (Vela, 2017). 
 
 
 
 
20 
 
2.3 Obtención y producción de un anticuerpo fluorescente 
2.3.1 Separación de anticuerpos mediante salting out 
Los anticuerpos son proteínas globulares sintetizadas por células del sistema 
inmune (linfocitos B y células plasmáticas), estas moléculas están constituidas por 
aminoácidos polares ionizables, los cuales requieren moléculas de agua para ser 
estables, las moléculas de agua no serán capaces de soportar ambas cargas, las 
de la proteína y las de los iones de la sal cuando esta se encuentra en una 
proporción mayor a la de la proteína, el resultado de esto es la precipitación del 
soluto menos soluble, como el caso de las proteínas y las moléculas orgánicas 
grandes (Voet, 2006). El método de salting out sirve para separar proteínas de 
diferentes tamaños, cargas con diferentes características de superficie; existe una 
escala que ordena los cationes y aniones llamada Serie Hoffmeister (Bollog, 1991) 
basada en la capacidad hidrofóbica, hidrofílica y la capacidad de los iones de 
estabilizar las proteínas y los ordena de la siguiente forma: 
NH4+> K+> Na+ >Li+ >Mg2+ >Ca2+ 
En esta escala el amonio tiene la mayor potencia de precipitar solutos proteicos. 
Por otro lado los aniones de la escala anterior están ordenados: 
F- ≥ SO42-> H2PO4-> H3CCOO-> Cl-> NO3-> Br-> ClO3-> I->ClO- 
2.3.2 Purificación de la proteína de interés 
En el mercado existen reactivos cuya finalidad es la purificación de productos o 
moléculas de interés. Las perlas de sefarosa producidas con dextrán en sus 
diversas presentaciones comerciales pueden separar moléculas cuyo tamaño se 
encuentre en el rango de 0.7 a 600 kDa, el uso de una columna de sefarosa en la 
purificación de proteínas nos permite la separación por exclusión de moléculas de 
mayor tamaño no requeridas en el reactivo de diagnóstico final (Voet, 2006). 
21 
 
2.3.3 Conjugación del anticuerpo purificado 
Al momento de producir un anticuerpo fluorescente, es de suma importancia tener 
en cuenta la relación que existe entre la cantidad de FITC y la cantidad de 
inmunoglobulina obtenida y purificada (radio F/P), entre menor sea el cociente de 
la división numérica de las cantidades en unidades de peso, mayor serán las 
uniones inespecíficas que se observen al momento de la detección del antígeno 
en cuestión en la muestra (Iniesta, 2010). 
2.4 Biológicos y kits de diagnóstico con registro sanitario 
En México, un total de 1 243 productos biológicos cuentan con registro y se 
pueden localizar en la lista actualizada por SENASICA 
(https://www.gob.mx/senasica/acciones-y-programas/regulacion-de-productos-
veterinarios), 14 de estos productos están basados en técnicas inmunológicas, y 
son en su mayoría, kits de diagnóstico o antisueros que utilizan anticuerpos 
monoclonales o policlonales, lo anterior representa el 1 % del total de los 
productos biológicos comercializados; de los cuales, ningún producto 
manufacturado en el país está diseñado para la detección del VR o a la 
neutralización del virión posterior a la exposición (SENASICA, 2017). 
2.5 Marco legal del kit de diagnóstico 
En México existen normas de carácter obligatorio publicadas en el Diario Oficial de 
la Federación (DOF), las cuales hablan de temas específicos en diferentes 
ámbitos, en el caso de biológicos y reactivos dirigidos al área veterinaria, la 
dependencia gubernamental encargada de regular las normas que hablan de las 
especificaciones y comercialización de dichos productos es la Secretaría de 
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), 
existen más de una Norma Oficial Mexicana (NOM) que regula las características 
que deben de cumplir los productos farmacéuticos o biológicos para uso 
veterinario en sus diversas presentaciones. 
https://www.gob.mx/senasica/acciones-y-programas/regulacion-de-productos-veterinarios
https://www.gob.mx/senasica/acciones-y-programas/regulacion-de-productos-veterinarios22 
 
Las NOM que están involucradas en los kits de diagnóstico son: 
NOM-012-ZOO-1993, Especificaciones para la regulación de productos químicos, 
farmacéuticos, biológicos y alimenticios para uso en animales o consumo por 
éstos. 
Esta Norma es aplicable a todos los establecimientos dedicados a la producción, 
importación, acondicionamiento y almacenamiento con fines de distribución y 
comercialización de productos químicos, farmacéuticos, biológicos y alimenticios 
destinados al uso o consumo en animales, que representen un riesgo zoosanitario. 
NOM-035-ZOO-1996, Requisitos mínimos para las vacunas, antígenos y reactivos 
empleados en la prevención y control de la rabia en las especies domésticas. 
NOM-067-ZOO-2007, Campaña nacional para la prevención y control de la rabia 
en bovinos y especies ganaderas. Con actualización en el año 2011 y cuyos datos 
estadísticos son controlados por SENASICA. 
2.6 Demanda de mercado para el reactivo de diagnóstico de 
rabia 
En la Gráfica 2 se muestran los casos diagnosticados en distintos laboratorios 
desde 2011 hasta 2016 lo que indica la demanda de reactivos enfocados al 
diagnóstico del VR es de gran importancia, debido a que en México no se 
producen reactivos especializados para el diagnóstico de rabia, se recurre al uso 
de reactivos caseros o se limita a la evaluación clínica, así, la producción de un kit 
de diagnóstico resulta de gran valor para poder reducir los tiempos que suelen 
tomar otras técnicas como el aislamiento viral y que este se base en una técnica 
validada y confiable, asimismo, favoreciendo la disponibilidad del reactivo en el 
territorio nacional. 
23 
 
 
Figura 3. Número de casos de rabia en animales diagnosticados en distintos 
laboratorios y reportados a SENASICA hasta 2016 (SENASICA, 2017). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
3.0 JUSTIFICACIÓN 
En la República Mexicana, la entidad encargada de la regulación, aprobación y 
vigilancia de los productos biológicos y derivados para su uso en salud y 
diagnóstico veterinario es la SENASICA, dependencia de la SAGARPA, esta 
publica de manera anual un listado de los productos con aprobación sanitaria 
vigente para su libre venta. De los 1 104 productos registrados en el país, solo el 
1 % corresponde a biológicos basados en técnicas inmunológicas, de esta 
proporción, ningún producto corresponde a un sistema para el diagnóstico de la 
rabia a pesar de la importancia que representa la enfermedad a nivel veterinario, 
pecuario y de salud pública, asimismo, los kits de diagnóstico disponibles son de 
origen extranjero, no tienen registro sanitario y, por lo tanto, su importación 
representa un gasto adicional para las entidades que requieran dichos reactivos. 
Debido a lo anterior, este proyecto plantea el diseño e implementación de una 
metodología para la producción de anticuerpos policlonales para el diagnóstico de 
la rabia mediante inmunofluorescencia que cumpla con los requisitos que 
establece la normatividad mexicana vigente en materia de producción de 
biológicos de uso veterinario destinados a la prevención y control de la rabia en 
especies domésticas y pecuarias. Ofreciendo así, una alternativa a la adquisición 
de reactivos extranjeros, y mejorando la sensibilidad y especificidad de los 
métodos que se utilizan actualmente. 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
4.0 HIPÓTESIS 
El uso de una cepa vacunal del virus de la rabia contenido en una vacuna de uso 
común veterinario, biológicamente seguro y antigénicamente similar al virus de 
campo; al ser administrado con dos adyuvantes a conejos de cepa California 
machos jóvenes sanos, producirá una respuesta inmune, de los que se extraerán 
anticuerpos, los cuales serán utilizados para la producción de un conjugado que 
cumpla con requisitos de título y especificidad en conformidad con la NOM-035-
ZOO-1996; con el fin de ofrecer un método de diagnóstico confirmatorio confiable 
y barato de la infección por rabia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
5.0 OBJETIVO GENERAL 
Desarrollar e implementar una metodología apegada a la 
normatividad vigente en el país para la producción de anticuerpos 
policlonales acoplados a fluorocromo que sirvan para el diagnóstico 
de la rabia mediante inmunofluorescencia directa. 
 
5.1 OBJETIVOS SECUNDARIOS 
Diseñar un protocolo de producción del reactivo para diagnóstico de 
rabia de acuerdo a los procedimientos encontrados en la bibliografía. 
Elaborar un reactivo de diagnóstico con especificidad y título 
suficiente, que cumpla con los requerimientos de la Norma Oficial 
Mexicana NOM-035-ZOO-1996, Requisitos mínimos para las 
vacunas, antígenos y reactivos empleados en la prevención y control 
de la rabia en las especies domésticas, usando como antígeno una 
cepa vacunal contenida en un producto de uso comercial. 
Constatar y demostrar la calidad del reactivo producido, a través de 
un estudio realizado por un laboratorio de referencia en 
enfermedades veterinarias. 
 
 
 
 
 
 
27 
 
6.0 MATERIALES Y REACTIVOS 
Reactivos 
 Azida de sodio (NaN3) RC 
 Cloruro de Bario (𝐵𝑎𝐶𝑙2). RC 
 Cloruro de Sodio (NaCl) RC 
 Fosfato de Sodio Dibásico (𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4) RC 
 Fosfato trisódico (𝑁𝑎3𝑃𝑂4) RC 
 Isotiocianato de fluoresceína (ITCF). RC 
 Sulfato de amonio ((𝑁𝐻4)2𝑆𝑂4) RC 
 
Soluciones 
 Azida de sodio (NaN3) 0.01 % 
 Cloruro de Sodio 0.9 % (NaCl, Solución Salina isotónica) 
 Fosfato de Sodio Dibásico 0.1 M (𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4) 
 Fosfato de Sodio Dibásico 0.2 M (𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4) 
 Fosfato trisódico (Na3PO4) 0.1 M 
 Sulfato de amonio saturado al 70 % ((NH4)2SO4) 
 Suspensión de vacuna con adyuvante completo de Freund 
 
Material biológico 
 Seis conejos machos jóvenes de 1.5 a 2 kg de peso de cepa California 
obtenidos del módulo de cunicultura de la FES- Cuautitlán Campo 4. 
 Muestra sérica de conejos inmunizados con el virus de rabia. 
 Vacuna de rabia (Holland, lote: EKW205) 
 Adyuvante completo de Freund (Sigma Aldrich) 
 
 
28 
 
7.0 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
Figura 4. Procedimiento generalizado de producción (ORIGINAL). 
Esquema de inmunizacion y procedimiento 
de trabajo 
Oblencion de conejos ca lifornia como modelo 
biolagicode produccion 
t 
Esquema de inmunizacion los dias 0, 10,20, 
30, 40 
" 1~t>l'y~ I~/ / 
I I I I ' I I 
• " " " .. ., " ~. 
t 
Recoleccion de ta 
J muestra al dia 45 y 50 
Metodos de separaCiOfl y pLfilicaCiOrl f---> Salting out ~ UlallSIS 
Preparac/6n Cuanliflcacion de proteinas, calcu lo 
I<-
Conjugacion 
de reacliw s 280/495nm y envasado de alicuolas. FfTC, calculo 
de radio FIP 
."1 
\ Melodode / 
conselVacion Preparac!6n 
por liofllizacion de reacli't'Os 
Constatacion del reactivo (producto 
terminado) en SENASICA. 
,j, 
PrU€ba de humedad Prueba de vado PrU€ba direct~ de 
anticuerpo~ 
fluorescenles 
ConclllSiones 
29 
 
7.1 Cuantificación de proteínas del inmunógeno 
La concentración de proteínas en la vacuna con la cual se indujo inmunidad en los 
animales de experimentación se cuantificó por medio de espectrofotometría 
(NuDrop™ UV Spectrophotometer) de acuerdo la metodología reportada por 
Desjardins, 2009; nmcomo referencia se utilizó una solución comercial de 
albúmina de concentración conocida y como blanco agua destilada. 
7.2 Animales de experimentación 
Se formó un lote único de seis conejos machos con una masa corporal entre 1.5 a 
2 kg, los animales se mantuvieron en el bioterio de la Unidad de Posgrado de la 
FES-Cuautitlán Campo 1, con agua y comida ad libitum, previo al inicio del 
esquema de inmunización de dejó que los animales se adaptaran durante 4 días. 
7.3 Esquema de inmunización 
El esquema de inmunización (figura 5) se diseñó con base a lo publicado por 
González (2011) y Trimarchi (1974). 
 
Figura 5. Esquema de inmunización en conejos cepa california. Las 
inmunizaciones fueron los días 0, 10, 20, 30, 40 y la recolección de muestra 
los días 45 yel día 50 practicando la eutanasia por desangrado (fuente 
original). 
 
 
30 
 
Previo a la inmunización de los días 0 y 10 se realizó una emulsión con 6 mL de 
vacuna y 3 mL de adyuvante completo de Freund (2:1). Para ello, la mezcla se 
homogeneizó con ayuda de una jeringa aplicando fuerza en el émbolo, se 
consideró que la emulsión estaba lista cuando al agregar una gota a un vaso con 
agua, esta no se disolvía de manera inmediata. 
La inmunización se diseñó con base en lo publicado por Trimachi en 1974, de tal 
forma, se administró 0.5 mL de dicha emulsión en cada pierna por vía 
intramuscular en los animales de experimentación. Posteriormente, a los 20, 30 y 
40 días se administró 1 mL de vacuna por vía intramuscular. 
7.4 Obtención de los sueros 
De acuerdo con Petovsky (2004) y Trimarchi (1974), la obtención de sueros a los 
días 45 y 50 asegura la obtención de un título mayor de anticuerpos tras un 
esquema de inmunización, por ello se obtuvieron 20 mL de sangre por punción 
cardiaca de cada animal al día 45 (toma parcial) y al día 50 (toma final) se sacrificó 
el lote completo por exanguinación obteniendo un aproximado de 60 mL de sangre 
de cada animal. 
Las tomas parcial y final de las muestras se procesaron el mismo día de su 
extracción para la obtención del suero mediante centrifugación a 1500 g por 15 
min, los sueros se recolectaron para formar un pool que se almacenó a 4 °C, los 
sueros obtenidos de la toma final se agregaron al pool del día 45 formando un lote 
único de suero. 
7.5 Purificación de proteínas 
Las proteínas del suero se concentraron mediante el método de salting out; para 
ello, se fue agregando un volumen de solución de sulfato de amonio saturado por 
goteo a un volumen de suero a 4 °C en agitación, al término de este 
procedimiento, se incubó la muestra durante 24 h a 4 °C, después, se centrifugó a 
3000 g por 30 min a 4 °C, el sobrenadante se decantó y se agregó un volumen de 
31 
 
agua destilada igual al del pool de suero para reconstituir el precipitado. Lo 
anterior se repitió dos veces más para incrementar la pureza. 
Posteriormente, la solución se pasó a una bolsa de diálisis y se sumergió en NaCl 
al 0.9 % pH 8, esta solución se cambió diariamente hasta que no se detectó la 
presencia de sulfato en el medio isotónico, esta prueba se realizó agregando una 
solución saturada de 𝐵𝑎𝐶𝑙2 en un volumen igual al de la solución del dializado, la 
formación de una “nube” demostraba que la diálisis no había concluido, así, la 
ausencia de dicho fenómeno indicó que el proceso había concluido y se almacenó 
en un recipiente limpio para su uso posterior. 
7.6 Conjugación con FITC 
Para conjugar un anticuerpo con un fluorocromo, es necesario realizar el cálculo 
del radio F/P (Fluoresceína/Proteína), lo anterior se refiere a la cantidad de 
fluorocromo que hay por masa de proteína; de acuerdo a la bibliografía, el radio 
debe de ser 3.43 µg de fluorocromo por cada mg de proteína. Así, el cálculo se 
realiza de acuerdo a la siguiente ecuación: 
(𝑚𝑔𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 x 
3.43 𝜇𝑔𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑜𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜
𝑚𝑔𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
) = µg fluorocromo 
Una vez obtenido el resultado de la ecuación anterior, se disolvió el fluorocromo, 
en este caso FITC, en 250 mL de una solución de Fosfato de sodio monobásico 
𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4 [0.1] M, dicha solución se dejó reposar durante una hora, durante este 
tiempo, la solución de proteínas se puso en agitación suave y para agregar un 
cuarto del volumen elegido para conjugar de (𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4) [0.2] M por goteo, al 
terminar, de la misma forma, se agregó la solución de FITC; al finalizar, la solución 
se ajustó a pH 9.5 con 𝑁𝑎3𝑃𝑂4 [0.1] M. 
 
 
 
32 
 
7.7 Purificación mediante perlas de sefarosa 
Posterior a la conjugación, se realizó una purificación para obtener las proteínas 
con un peso molecular de 150 kDa que corresponden a las IgG’s. Para ello se 
utilizaron perlas de sefarosa (Sephadex G100) con un rango máximo de 
fraccionamiento de 150 kDa, las perlas se empacaron en una columna y como 
eluyente se usó buffer de fosfatos pH 9.5, cada fracción constó de 12 mL de 
eluato, la ausencia de color en el mismo marcó el final de la purificación. Después 
se tomó una alícuota de cada fracción para cuantificar la concentración de 
proteínas conjugadas a FITC mediante espectrofotometría obteniendo la relación a 
280/495 nm, que corresponde a la absorbancia emitida por las proteínas y por 
FITC respectivamente (Hebert, 1972). 
Las fracciones que presentaron un coeficiente (AQUÍ) se juntaron en un pool y 
después se hicieron alícuotas de 3 mL en frascos viales; la concentración final fue 
de en cada frasco fue de 3.18 mg Ac/mL, el contenido se liofilizó para concentrar 
el anticuerpo con la finalidad de conservar el producto para su posterior uso en las 
pruebas de constatación (humedad, vacío y técnica directa de AF) (Hebert, 1972). 
7.8 Prueba de humedad 
Esta prueba tiene como objetivo cuantificar la humedad contenida en un producto 
liofilizado por medio de una diferencia de pesos entre la forma comercial del 
producto y el peso del producto desecado y se realiza en un cuarto en condiciones 
controladas debido a que la humedad ambiental repercute directamente en esta 
medición. Se midió el porcentaje de humedad con ayuda de un termohigrómetro 
en el cuarto destinado a realizar este procedimiento, cabe mencionar que la 
lectura tiene que ser de 40 % (±10 %) para tener la certeza de que el resultado es 
confiable. 
Luego de obtener la lectura del termohigrómetro, se colocó un pesafiltro vacío en 
el desecador y transcurridos 30 min se midió su masa (Ppfv), posteriormente se 
colocaron 0.20 g de la muestra el pesafiltro y nuevamente se obtuvo la masa 
33 
 
(Ppf+mta), el pesafiltro (sin tapa) y la muestra se colocaron en una estufa a 60 °C 
durante 3 h, al concluir se tapó el pesafiltro (para reducir al mínimo una posible 
interferencia con la humedad ambiental) y se colocó en un desecador hasta que 
estuvo lo suficientemente frio para volver a determinar su masa nuevamente 
(Ppf+mta s). 
Los cálculos correspondientes para la determinación del porcentaje de humedad 
se realizaron de acuerdo a las siguientes ecuaciones: 
 Peso inicial: Pi= (Ppf+mta) – (Ppfv). 
Peso final: Pf= (Ppf+mta s) – (Ppfv) 
Peso perdido por el secado: Ps= Pi – Pf. 
% Humedad= (Ps/Pi) * 100. 
 
De acuerdo a la NOM-012-ZOO-1993, el resultado es satisfactorio cuando el 
promedio del porcentaje de humedad es igual o menor al 4 %, los cálculos se 
reportan en el anexo 1. 
7.9 Prueba de vacío 
Esta prueba indica la calidad del envasado para productos liofilizados, para llevar 
a cabo esta prueba las muestras liofilizadas de nuestro producto se trasladaron a 
un cuarto oscuro, donde con una bovina Tessler se les somete a descargas en 
diferentes puntos de la tapa, cabe mencionar que previo a este ensayo, se 
retiraron todas las partes metálicas en los frascos con la finalidad de evitar 
interferencias por conductividad eléctrica. 
 
 
34 
 
7.10 Técnica directa de AF 
Para constatar que las proteínas que se purificaron y conjugaron corresponden a 
anticuerpos con la capacidad de reconocer el VR, se procedió a reconstituir el 
contenido de los frascos liofilizados con buffer de fosfatos pH 9.5, la técnica 
directa de AF se siguió de acuerdo a lo establecido en la NOM-012-ZOO-1993. 
Para ello, se realizaron diluciones dobles seriadas en tubos de 12 x 75 mm con 
1 mL de buffer de fosfatos pH 9.5 y 1 mL del conjugado previamente reconstituido 
hasta llegar a una dilución 1/16. 
Todas las diluciones se evaluaron sobre laminillas fijadas de macerados de 
cerebros de ratones infectados con VR (control positivo) y sin infectar (control 
negativo) y se compararon con diluciones de un reactivo de referencia donado 
amablemente por SENASICA. 
Las muestras se visualizaron por microscopía de fluorescencia usando el filtro 
especial para FITC a 470nm, al terminar la evaluación, las laminillas se 
inactivaron en una solución de hipoclorito de sodio al 2 % como lo indica la NOM-
035-ZOO-1996. 
El análisis de las muestras consistió en la evaluación de la intensidad tintorial 
específica, la presencia de inclusiones y polvo fluorescente, y la tinción 
inespecífica de fondo y se calificó cualitativamente por medio de una escala de 
marcas. 
 
 
 
 
 
 
35 
 
8.0 RESULTADOS 
La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de 
ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación. Todas las 
sustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético. La 
cuantificación de proteínas se realiza por espectrofotometría, de acuerdo con lo 
publicado por Desjardins (2009) la primera cuantificación se realizó en el pool de 
sueros obtenidos, lo que sugiere que la inmunización hasta este punto del 
procedimiento fue exitosa. 
Tabla 1. Concentración de proteínas. El volumen total del pool sérico 
que se conjugó con FITC fue de 255 mL. 
Muestra Abs 280 Abs 260 260/280 Concentración 
(mg/mL) 
Muestra blanco 1.76 1.165 0.66 2.64 
Concentración de proteínas 
contenidas en el pool de suero 
(255 mL) 
15.38 18.265 1.19 23.07 
 
8.1 Reacción con cloruro de bario 
Una reacción química es todo proceso termodinámico en el cual dos o más 
sustancias (reactivos) se transforman cambiando su estructura molecular y sus 
enlaces, en otras sustancias llamadas productos. Como parte importante de la 
purificación de nuestro reactivo fue necesario llevar a cabo una reacción química 
cualitativa con 𝐵𝑎𝐶𝑙2 para revelar si el medio de diálisis (solución isotónica) 
posterior al salting out ya no presentaba ninguna traza de sales de amonio. En la 
figura 6 se muestra una reacción positiva después del primer dializado, en el tercer 
dializado ya no se observó la presencia de turbidez en el medio isotónico de 
diálisis. 
 
36 
 
 
Figura 6. Reacción de cloruro de bario. Aspecto cuando en el medio de 
diálisis aún hay presencia de sulfato de amonio. 
 
8.2 Cuantificación de proteínas del suero 
Los anticuerpos están constituidos por aminoácidos polares ionizables, los cuales 
requieren moléculas de agua para ser estables, posterior a realizar la separación 
de proteínas por el método de salting out, se cuantificaron las proteínas 
contenidas en el dializado para obtener el dato real de las proteínas que se 
conjugaron con FITC. En la tabla 2 se muestra una disminución en la 
concentración de proteínas encontradas en el dializado, aunque es un 
comportamiento normal debido a que en estas muestras ya no se encuentran 
tantas impurezas (células, hemoglobina, iones del suero etc.) como en el pool 
inicial. 
Tabla 2 Resultados espectrofotometría de doble longitud de onda. para la 
determinación de la concentración de proteína obtenida en suero de conejo 
inmunizado. BSA Albumina Sérica Bovina. 
Muestra Abs 280nm Abs 260nm 260/280 Concentración de proteína mg/mL 
Blanco (BSA) 1.565 0.758 0.48 2.348 
Proteína dializada 2.762 1.95 0.71 4.141 
37 
 
8.3 Obtención de muestras conjugadas 
Las fracciones que se obtuvieron tras la purificación por filtrado en columna de 
perlas de sefarosa se visualizaron bajo luz UV, de las cuales a partir de esta 
fluorescencia emitida se juntaron en 10 muestras, los resultados se muestran en la 
figura 7. 
 
Figura 7. Fluorescencia en los tubos de separación de los conjugados. 
1) el inicio del separado, 2) la parte del cuerpo del separado, 3) la parte 
final del separado por Sefarosa, se puede observar el aumento y caída 
de la fluorescencia en lámpara UV. 
 
Las 10 muestras con la mejor emisión de fluorescencia fueron cuantificadas 
mediante espectrofotometría, siguiendo el mismo método de cuantificación de 
proteínas contenidas en el pool de suero. Los resultados se reportan en la tabla 3. 
Tabla 3. Concentración de proteínas separadas con Sefarosa en 10 
muestras a distintos tiempos de recolección. 1 Abs= 1 mg/mL. 
Muestra 280 nm (Abs) 
260 nm 
(Abs) 260/280 
Concentración 
mg/mL 
1 0.092 0.133 0.69 0.092 
2 1.39 2.005 0.69 1.39 
3 2.113 3.122 0.68 2.113 
4 1.979 2.898 0.68 1.979 
5 2.319 3.298 0.70 2.319 
6 2.386 3.385 0.70 2.386 
7 2.243 3.221 0.70 2.243 
8 2.02 2.991 0.68 2.02 
9 1.759 2.652 0.66 1.759 
10 0.729 1.903 0.38 0.729 
 
 
 
38 
 
8.4 Purificación por sefarosa 
Las perlas de sefarosa pueden separar productos cuyo tamaño se encuentre en el 
rango de 0.7 a 600 kDa dependiendo del tamaño de separación entre las 
moléculas de sefarosa, el uso de una columna de Sephadex G-100 en la 
purificación de proteínas nos permite la separación por exclusión de moléculas de 
mayor tamaño no requeridas en el reactivo de diagnóstico elaborado en este 
proyecto. 
Uno de los métodos más efectivos para detectar fluorocromos es mediante 
espectrofotometría, un punto crítico de este procedimiento fue el determinar si 
existían o no proteínas unidas al fluorocromo utilizado, con esto se comprobó la 
existencia de anticuerpos conjugados con FITC, se utilizó un espectrofotómetro de 
luz UV a 495 nm, con lo que se comprobó que las muestras correspondientes al 
los eluatos 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se observó una mejor 280/495, los resultados se 
encuentran en la tabla 4 (Hebert, 1972). 
Tabla 4. Relación de absorbancias de los separados por Sefarosa. 
Absorbancia a 280 nm y 495 nm en eluatos del conjugado 
Muestra 495 nm 
(Abs) 
280 nm 
(Abs) 
Relación 
280/495 
1 1.907 0.092 0.048 
2 2.034 1.39 0.68 
3 2.03 2.113 1.04 
4 2.041 1.979 0.96 
5 2.043 2.319 1.13 
6 2.046 2.386 1.16 
7 2.044 2.243 1.09 
8 2.044 2.02 0.98 
9 2.047 1.759 0.85 
10 1.999 0.729 0.36 
 
8.5 Resultados de pruebas a producto terminado 
En conformidad con la NOM-012-ZOO-1993 “Especificaciones para la regulación 
de productos químicos, farmacéuticos, biológicos y alimenticios para uso en 
animales o consumo por éstos” y con la NOM-035-ZOO-1996 “Requisitos mínimos 
39 
 
para las vacunas, antígenos y reactivos empleados en la prevención y control de 
la rabia en las especies domésticas” numeral 4.6 Prueba de vacío para vacunas 
liofilizadas y 4.7 Prueba de humedad para vacunas liofilizadas, las muestras del 
reactivo de diagnóstico producido en este proyecto se sometieron a las pruebas de 
constatación correspondientes a un producto liofilizado en apego a procedimientos 
internos del laboratorio de Constatación de Biológicos y Reactivos de SENASICA, 
dichas pruebas verifican que el método de conservación del kit de diagnóstico fue 
satisfactorio y aseguran la calidad del envasado, los resultados de estas pruebas 
se reportan en la tabla 5 y 6. 
 
Tabla 5. Prueba de vacío. 
Muestra Frascos muestreados Resultado 
Frasco Referencia de 
vacuna liofilizada 
10 frascos Positivo a vacío 
(iluminados 10/10) 
Frasco de conjugado de 
rabia 
10 frascos Negativo a vacío 
(no se iluminan 0/10) 
 
Tabla 6 Porcentaje de humedad en muestras liofilizadas del conjugado. 
Muestra 
Humedad 
en cuarto 
(%) 
Peso del 
pesafiltro vacío 
(g) 
Peso del 
pesafiltro 
c/muestra 
(g) 
Peso del pesafiltro 
c/muestra 
desecada 
(g) 
Humedad 
en 
muestra 
(%) 
1 35 32.15 32.35 32.326 12 
2 35 32.16 32.36 32.336 12 
3 34 32.15 35.35 32.335 12 
 
Los resultados reportados por el laboratorio no fueron satisfactorios al evaluar el 
método de conservación del kit de diagnóstico mediante la prueba de humedad, 
por peso seco, la cual sale de los límites permitidos en la norma, y en la prueba de 
vacío no se obtuvieron los resultados esperados. 
En conformidad con la NOM-067-ZOO-2007, “Campaña Nacional Para La 
Prevención Y Control De La Rabia En Bovinos Y Especies Ganaderas” y con la 
NOM-035-ZOO-1996 “Requisitos mínimos para las vacunas, antígenos y reactivos 
empleados en la prevención y control de la rabia en las especies domésticas” en el 
40 
 
numeral 5. “Especificaciones para el conjugado antirrábico preparado con 
anticuerpospoliclonales” se muestra en la tabla 6 el análisis que se realizó en un 
microscopio de fluorescencia a nuestro kit de diagnóstico, dicho estudio fue 
realizado por el laboratorio de patología de SENASICA ubicado en la Carretera 
Federal Pachuca-México Km 37.5 en Tecámac de Felipe Villanueva, Méx. Los 
resultados reportados cumplieron las expectativas de unión al antígeno. Los 
requisitos mínimos están establecidos en la NOM-035-ZOO-1996 en el numeral 
mencionado anterior mente en este párrafo, con lo que podemos constatar que la 
serie de métodos de purificación, conjugación y envasado fueron satisfactorios 
para los objetivos de esta tesis. Las imágenes no fueron reportadas en esta tesis 
debido a los requerimientos de privacidad y manejo de datos del SENASICA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
4
1
 
 TA
B
LA
 
7 
R
ESU
LTA
D
O
S 
D
E 
FLU
O
R
E
SC
EN
C
IA
 
R
EPO
R
TA
D
O
S 
P
O
R
 
EL 
LA
B
O
R
A
TO
R
IO
 D
E PA
TO
LO
G
ÍA
 D
E SEN
A
SIC
A
. 
 
l abia 7 Resultados de fluorescencia reportados por ellaboratorio de patologia de SENASICA. 'CVS: cerebro de raton 
infectado con virus esundar, 'SCN: suspension de cerebro de raton normal (EI grado de intensidad tintorial especifica y de 
tincion inespecifica son terminos caracteristicos, reconocidos por la a,M,S.) 
/ 1:2 1:2 1:4 1:4 1:8 1:8 1:16 1:16 referencia conjugado referencia conjugado referencia conjugado referencia Conjugado de rabia de rabia de rabia de Rabia 
Cualidad SCN CVS SCN CVS SCN CVS SCN CVS SCN CVS SCN CVS SCN CVS SCN CVS 
Intensidad HH HH HH 
tintorial ++++ • •• ++H · •• ++H · · •• · H++ · 
especifica • • • 
Inclusiones HH HH HH 
Y polvo H++ • • H++ • • H++ • • +H+ • +H+ • 
fluorescente • • • 
l incion 
inespecifica . ++ ++. ++. . ++ • • ++ ++ . · • · . · . · 
defondo 
42 
 
9.0 ANÁLISIS DE RESULTADOS 
El protocolo de producción nos muestra en general todo el proceso operativo 
correspondiente a la producción de un kit de diagnóstico, la planeación, ejecución 
y pruebas de constatación para este producto fueron exitosas siguiendo un 
protocolo de producción similar al reportado por Hebert (1972) con las 
modificaciones en la toma al día 45 para aumentar el volumen total de la muestra 
y con ello la obtención de más cantidad de Ac’s de interés, y la conservación de la 
muestra a 2-8 °C, que inicialmente se planteaba en la referencia tomar solamente 
una muestra final y con ello practicar la eutanasia por exanguinación, el producto 
fue constatado con ayuda de SENASICA ubicado en la Carretera Federal 
Pachuca-México Km 37.5 en Tecámac de Felipe Villanueva, Méx. En el laboratorio 
de constatación de biológicos y reactivos y el laboratorio de patología del mismo 
centro, en conformidad con protocolos internos y en apego a las normas oficiales 
mexicanas mencionadas en esta sección. 
Las vacunas son preparaciones destinadas a generar inmunidad contra una 
enfermedad estimulando la producción de anticuerpos. Puede tratarse, por 
ejemplo, de una suspensión de microorganismos muertos o atenuados, o de 
productos o derivados de microorganismos. El método más habitual para 
administrar las vacunas es la inyección, aunque algunas se administran con un 
vaporizador nasal u oral (OMS, 2004). 
Partiendo del concepto anterior se escogió una vacuna de buen título viral, la cual 
contiene una cepa inactivada del VR y que nuestro modelo biológico de 
producción no corre el riesgo de desarrollar la infección, vacuna que es de fácil 
obtención y de bajo costo, de carga antigénica similar al virus de campo, la cual se 
administra comúnmente a especies que viven como mascotas domésticas, la 
vacuna contiene la cepa: CVS-27, título viral 10 DLR/50 % en 1 mL provieniente 
de células de encéfalo de ratón. 
 
43 
 
9.1 Características e inmunogenicidad del modelo 
biológico y del antígeno 
Los conejos son utilizados como modelos que pueden contribuir a nuestro 
conocimiento de diversas enfermedades. Históricamente, Louis Pasteur utilizó 
conejos para desarrollar su vacuna contra la rabia y el conejo también ha sido 
importante para el estudio de enfermedades cardiovasculares. 
Uno de los usos más frecuentes de los conejos en los laboratorios es la 
producción de anticuerpos, empleados para el diagnóstico de enfermedades 
infecciosas. Los anticuerpos son un componente fundamental del sistema 
inmunitario que solamente puede producir un animal vivo, estos reconocen y se 
unen de manera específica a secuencias de proteínas particulares (Trimarchi, 
1974). 
En la mayoría de las especies, los machos tienen un mayor potencial de 
crecimiento que las hembras. Y en particular los conejos california machos están 
solo un poco por debajo del promedio del crecimiento de la raza nueva zelanda 
cuando ambos llegan a desarrollarse en su totalidad pesan en promedio entre 3.6 
y 4 Kg, y 4 Kg respectivamente; la raza neozelandesa se emplea con mayor 
frecuencia en la producción de inmunosueros, para los fines de nuestro 
procedimiento se decidió emplear la raza california conseguida en el centro de 
cunicultura de la FES-Cuautitlán Campo 4 debido al costo, el cual es menor que el 
de un conejo Neozelandés y nos condujo a un buen resultado en cuanto a lo 
esperado en la producción de nuestro anticuerpo. 
Para producir anticuerpos, se inyecta al conejo una secuencia de proteínas 
tomada del organismo que causa la enfermedad a estudiar. Los anticuerpos son 
producidos por el sistema inmunitario del conejo y el progreso de la producción de 
anticuerpos se controla tomando pequeñas muestras de sangre a intervalos 
regulares. Una vez que se ha producido un nivel de anticuerpos suficiente, se 
toma la sangre del conejo bajo anestesia. El antisuero de un único conejo se 
44 
 
mantiene mucho tiempo y produce una gran cantidad de anticuerpos, que a 
menudo se emplean durante varios años (Trimarchi, 1974). 
La vía de inoculación del antígeno que se eligió fue la subcutánea debido al 
contenido proteico de la vacuna utilizada y los volúmenes máximos inyectables 
que está permitido de acuerdo a la vía de inoculación en este caso intramuscular 
(0.5 mL) (OMS, 2004). El título de anticuerpos incrementó por la potenciación de la 
respuesta inmunológica que induce el adyuvante completo de Freund 
disminuyendo el tiempo en el que se presenta una respuesta secundaria, esto es 
de 4 a 8 semanas, hasta 2 a 3 por el uso del adyuvante (OMS, 2004). 
9.2 Inmunogenicidad del antígeno 
El VR es un virus de RNA con una cadena sencilla de polaridad negativa, posee 
una nucleocápside constituida de tres proteínas L, N y P que le confieren una 
forma helicoidal, el virus está protegido por una bicapa lipídica donde se anclan las 
proteínas G y M, importantes para la replicación viral y potenciales inductores de 
la respuesta inmunológica del hospedero, así, se puede sugerir que el contenido 
en proteína G de las vacunas de rabia constituidas por virus atenuado o inactivado 
inducen la formación de anticuerpos neutralizantes en las especies inmunizadas y, 
por ende confieren protección contra la infección rábica. Estos anticuerpos 
neutralizantes son considerados el factor inmunitario más importante para la 
protección y estos pueden ser utilizados en la seroterapia como complemento de 
la vacunación antirrábica post-exposición (Martínez, 1999) 
Por otro lado, la proteína N presenta pocas variaciones entre las diferentes cepas 
virales, a diferencia de la proteína G la cuál es más inmunógenica y presenta 
algunos epítopos más inmunodominantes que otros, la proteína N posee varios 
epitopos los cuales son comunes a varios serotipos, esto parece deberse a la 
relativa conservación de la proteína N, dicha proteína se es la de mayor 
concentración cuando existe infección en el SNC o se cultiva in vitro en los cultivos 
celulares, esta proteína es el antígeno a detectar en el diagnóstico en el 
45 
 
laboratorio por la técnica de inmunofluorescencia habiendo conjugados y kitsque 
detectan su presencia mediante anticuerpos monoclonales. 
Recientemente, la proteína N y la nucleocápside (NC) han sido consideradas 
como elementos que juegan un papel importante en el poder protector de las 
vacunas contra rabia. Utilizando una inoculación vía intramuscular de vacuna 
rábica, se ha establecido que la proteína NC juega un papel importante en la 
protección. La vacuna al ser de virus inactivado, conserva completamente las 
moléculas antigénicas del virus, por tanto se generan anticuerpos contra las 
proteínas descritas anteriormente. A diferencia de los anticuerpos contra G y N, 
los anticuerpos anti NC protegen contra cualquier cepa o serotipo de Lyssavirus. 
(Kusmin, 2003) 
Mediante estas afirmaciones de la respuesta inmune del hospedero ante el virus 
de la rabia podemos decir que los anticuerpos aislados mediante el método de 
saltig out y posterior a la separación por Sephadex G-100 son en su mayoría 
dirigidos contra las proteínas G, N y NC, los cuales obtuvieron una reacción 
considerable con el antígeno, en la prueba de inmunofluorescencia (Hirose, 1996). 
9.3 Método de cuantificación de proteínas 
En investigación y en la industria se necesitan formas de cuantificar rápidamente 
diversas biomoléculas (es el caso en particular de las proteínas) como una parte 
rutinaria y punto crítico en los procedimientos de trabajo, esta información ayuda a 
tomar decisiones informadas antes de continuar con los experimentos posteriores. 
Hay muchos métodos de cuantificación de proteínas para elegir, incluyendo 
enfoques gravimétricos y ensayos colorimétricos, las mediciones directas de UV 
espectrofotométricas y análisis de aminoácidos. Todos estos métodos tienen sus 
puntos fuertes y débiles. Las mediciones espectrofotométricas UV directas son 
una opción buena para la determinación de proteínas ya que son fáciles de 
realizar, no requieren reactivos en exceso o normas, y consumen muy poca 
muestra (Loughrey, 2013). 
46 
 
Para los fines de rendimiento de la muestra al momento de la producción de 
nuestro reactivo, fue de suma importancia no desperdiciar producto al momento de 
la cuantificación de proteínas, siendo este método uno de los más sencillos y 
eficientes, además de que no requiere más de un reactivo y el equipo usado, 
haciendo más barato el costo de producción. 
9.4 Métodos de separación y conjugación 
Uno de los métodos más usados en la industria para la separación de proteínas es 
el salting out con sulfato de amonio, su uso como sal de preferencia se debe a la 
ubicación que tienen sus iones cuando se encuentran en una solución acuosa en 
la escala Hoffmeister además de que su interacción con la proteína es baja y tiene 
poca probabilidad de desnaturalizar o modificar la estructura proteica (Karlsson, 
1989). 
Una vez que la proteína se precipitó, se realizó la diálisis como parte del 
procedimiento de purificación de los anticuerpos obtenidos, este método se basa 
en la filtración molecular el cual separa moléculas de acuerdo con su tamaño, 
mediante el empleo de membranas semipermeables que contienen poros de 
dimensiones inferiores a las macromoleculares. Estos poros permiten que 
moléculas pequeñas, tales como las de los disolventes, sales y metabolitos 
pequeños, se difundan a través de la membrana pero bloqueen el tránsito de 
moléculas mayores. Las moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al 
fluido externo hasta que se alcanza el equilibrio, las macromoléculas 
permanecerán en el interior de saco de diálisis. El proceso puede repetirse varias 
veces a fin de sustituir completamente un soluto por otro o simplemente bajar por 
completo su concentración (Oshita, 1992). 
Una de las formas más comunes para detectar la presencia del sulfato de amonio 
en el medio de diálisis, es agregar cloruro de bario para que la siguiente reacción 
se efectúe: 
(𝑁𝐻4)2𝑆𝑂4 + 𝐵𝑎𝐶𝑙2 ↔ 2(𝑁𝐻4)𝐶𝑙 + 𝐵𝑎𝑆𝑂4 
47 
 
Siendo de estos dos productos el sulfato de bario el que produzca una coloración 
blanquecina o una presencia “nebulosa” en la solución de diálisis, es con esta 
reacción que se puede determinar de forma cualitativa la presencia o ausencia del 
sulfato de amonio en el medio, y por tanto, decidir si es conveniente detener el 
proceso de diálisis (Calderón, 2007). Hasta este punto, la separación y la 
purificación de proteínas totales del suero fueron exitosas, por lo que se propne 
utilizar esta técnica de manera rutinaria cuando se requiere la producción y 
purificación de un reactivo de naturaleza similar al producto de este proyecto. 
J. Riggs en 1958 probó el FITC y comprobó que fue superior a los marcadores 
usados hasta ese entonces debido a que el producto marcado tenía mayor 
estabilidad de almacenamiento, la solubilidad en agua era fácil y por ser muy 
detectable al ojo humano cuando se le somete a las radiaciones ultravioleta 
debido a que fluóresce en color verde-amarillo, color que rara vez se encuentra 
como auto fluorescente en tejidos normales. Para fines de diagnóstico se 
considera al método de AF marcados con FITC como el más adecuado ya que el 
anticuerpo conjugado permanece física y químicamente inalterado, por lo que es 
fácilmente detectado al hacer las reacciones Ag-Ab y arrojar resultados precisos. 
(Dean, The fluorescent antibody test, 1996) 
La conjugación de proteína con el FITC es una reacción química que toma lugar 
bajo diversas condiciones. Si el suero que se ha preparado para contener la 
apropiada concentración de anticuerpos, la cuidadosa designación y control de las 
condiciones de reacción usualmente da lugar a reactivos específicos. Los 
procedimientos de conjugación han sido desarrollados para poder ser empleados 
en la producción de reactivos teniendo el grado de unión (F/P ratio) destinado. La 
elección de un radio F/P para conjugar puede variar con los diferentes sistemas de 
unión Ag-Ab y para el uso que se le dé al conjugado (Lamprea, 2010). 
La tinción no específica (NSS non specific staining) muestra una relación directa 
con la concentración de FITC en el conjugado. Por lo tanto el grado de NSS que 
puede ser tolerado es un factor importante para determinar el radio F/P para 
cualquier sistema Ag-Ab (Hebert, 1972). 
48 
 
Cuando se prepara un conjugado, lo primordial es la obtención deseada del radio 
F/P para regular el peso inicial de colorante en la reacción de mezclado y permitir 
que se complete el proceso. Una alternativa, pero más costosa, es el método de 
incrementar el peso del colorante e interrumpir la reacción en un intervalo de 
tiempo específico (Hebert, 1972). 
El rango y la eficiencia de la reacción de unión está influenciada por la fuente 
animal del cual se extrae el Ac el tipo de albúmina, globulinas entre otras, y la 
concentración de la proteína, temperatura, pH, el sistema de buffer, y su 
concentración son factores importantes. La reacción de la unión es más eficiente 
si la reacción química se realiza en las siguientes condiciones: 25 °C, pH 9.5 y 
0.05 M Na2HPO4 y un factor final pero no menos importante en la preparación del 
conjugado es la pureza del reactivo FITC. Es por eso que el método elegido fue el 
óptimo en concordancia con los estudios realizados y cuyos resultados se 
muestran en la tabla 7 al hacer la comparación en el laboratorio de referencia con 
otros conjugados y arrojando resultados satisfactorios los cuales demuestran que 
la unión Ag-Ac se lleva a cabo de manera adecuada tal como es mostrado en la 
bibliografía (Calderón, 2007). 
Una vez conjugada la inmunoglobulina se filtró por medio de perlas de sefarosa 
las que son un gel de dextrán cuya marca comercial es Sephadex y el producto 
comercializado es Sephadex G-100, el grado de exclusión es controlado por la 
masa molecular del dextrán utilizado y la introducción de unidades de éter de 
glicerilo que generan entrecruzamiento entre los grupos hidroxilo de las cadenas 
de poliglucosa. Las distintas