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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN PRESENCIA DE HONGOS PATÓGENOS EN CUEVAS DE LA ZONA CENTRAL DEL VALLE DE MÉXICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: LICENCIADO EN BIOQUIMICA DIAGNOSTICA PRESENTA : OSCAR ALBERTO RUIZ GARCIA ASESORA: QFB. LETICIA CUBILLO CARRILLO CUAUTITLAN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO, 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR DEP ART AMENTO DE EXÁME NES p~9li~$~.Q.~¡\LES ' . '7", ' ""I.t 0 " ( .. 14" .... '1. .. :.: .. VmVEI\'IDAD }:!A<:,IO.'iAl. ·AVl'>}IOMA DE MEX I<::'O ASUNTO: VOI~~~¡BATORIO M. en C. JORGE AL FREDO CUÉLLAR ORDAZ DIRECTOR DE LA FES CUAUTITLAN PRESENTE W lmlJ,l9\iO :l ATN¡ I.A. LAURA MARGARITA C~IIt~~~ROA Jefa del Departamento de Exámenes Profesionales de la FES Cuautitlán. Con base en el Reglamento General de Exámenes. y la Dirección de la Facultad, nos permitimos comunicar a usted que revisamos el : Trabajo de Tesis Presencia de hongos patógenos en cuevas de la zona central del Valle de México. Que presenla el pasante: Osear Alberto Ruiz Garcia Con número de cuenta: 308128552 para obtener el Titulo de la carrera: Licenciatura en Bioquímica Diagnóstica Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. ATENTAMENTE "POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" Cuautitlán Izcall i, Méx. a 28 de Octubre de 2016. PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO NOMBRE PRESIDENTE Dr. Enrique Salas Téllez VOCAL Dra. Alma Lucila Núñez del Arco SECRETARIO Q.F.B. Leticia Cubillo Carrillo l er. SUPLENTE Q.F.B. Alma Susana García Barrón 2do. SUPLENTE M. en E. María Verónica Vázguez Cianea NOTA: los sinodales suplentes estan obligados a presentarse el dia y hora del Examen Profesional (art. 127). lMCF/cga n"., , u\~ FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR DEP ART AMENTO DE EXÁMENES P~º~F;~J.o.,~,ALES ' . "'-, ::'IoC ' . ;;,.14 " "''\. :..'' VmVEI\'IDAD }:!A<:,IOJ<AI. -...... ,(' .. ~! - . '':;'~ . ~~~ AVf'Jf'MA DE MEXK:.O M. en C. JORGE ALFREDO CUÉLLAR ORDAZ DlRECTOR DE LA FES CUAUTlTLA ASUNTO:VO~m' {~ ·.BATORIO ¡ '~1:.. f~·:~r,e~~' ~ ~~~~.r)d-' ~ PRESENTE . Ur¡.orrI.Ml'!'11.'Q tl ATN; I.A. LAURA MARGARITA C~I~~JMi.lJ.EROA . Jefa del Departamento de Exámenes Profesionales de la FES Cuautitlán. Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos comunicar a usted que revisamos el: Trabajo de Tesis Presencia de hongos patógenos en cuevas de la zona central del Valle de México. Que presenta el pasante: Osear Alberto Ruiz Garcia Con número de cuenta: 308128552 para obtener el Titulo de la carrera: Licenciatura en Bioquímica Diagnóstica Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. ATENTAMENTE "POR MI RAZA HABLARÁ EL ESpjRITU" Cuautitlán Izcall i, Méx. a 28 de Octubre de 2016. PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO NOMBRE PRESIDENTE Dr. Enrique Salas Téllez VOCAL Dra. Alma Lucila Núñez del Arco SECRETARIO Q.F.B. Leticia Cubillo Carrillo 1er. SUPLENTE Q.F.B. Alma Susana Garcfa Barrón 2do. SUPLENTE M. en E. María Verónica V ázquez Cianea NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el dia y hora del Examen Profesional (art . 127) . lMCF/cga Agradecimientos A la FES Cuautitlán por ser mi hogar durante más de cuatro años y permitirme crecer como profesionista. Agradezco a mi familia y amigos por apoyarme en cada una de mis locuras, rarezas y ocasionalmente ser parte de ellas. Gracias mama por aguantar mis desaciertos, las llamadas que nunca llegaron y apoyarme en todas aquellas aventuras en las que estuve y en las que siempre estaré metido Gracias. Al grupo de montañismo de la UNAM por mostrarme ese mundo que pocos conocen, llevarme a mis limite y permitirme conocer de lo que soy capaz. Este trabajo se realizo en el laboratorio 10 de la unidad de posgrado de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. Glosario Bóveda: nombre dado a determinadas zonas dentro de una cueva donde se presentan techos altos y paredes amplias. Caverna: cavidad natural del terreno causada por un proceso de erosión de corrientes de agua hielo o lava. Cueva: connotación utilizada para referirse a cavernas, sistemas cavernarios, sótanos o túneles de lava de forma coloquial. Espeleotema: denominación dada a las estructuras formadas dentro de las cavernas por acción de la disolución y meteorización que forman estos sistemas. Karts: nombre dado a al proceso químico de disolución de la roca calcárea que da como resultado la formación de cuevas y cavernas. Meteorización: proceso físico de degradación de rocas y minerales por procesos físicos como el paso del agua o el viento. Quirópteros: denominación dada de forma común a los murciélagos, sin distinción de especies. Repisa: se le domina a aquellas salientes que presentan un tamaño considerable en una pared natural. Sistema de progresión: denominación dada a los anclajes, distribución y colocación de cuerdas en una cueva para realizar la exploración. Sótano: nombre dado a aquellas cuevas en las que el colapso de una parte del techo da paso a la formación de la entrada de la misma. Suelo calcáreo: son todos aquellos suelos que presentan una alta concentración de rocas calcáreas. Suelo cavernario: conjunto de sedimentos y restos orgánicos depositados en el interior de la cueva que forman el suelo de estas. Zona vadosa: es la zona que se encuentra en contacto con el medio exterior a partir de la infiltración de agua y en la que se encuentra la mayor presencia de vida Cenoticos: descripción dada a los micelios que no presentan tabicaciones que delimitan celulas Mucidinaceos: nombre dado a los hongos que presentan hifas incoloras. Índice Resumen………………………………………………………………………………......1 Introducción …..………………………………………………………………………......2 Justificación……………………………………………………………………………...12 Objetivos….……………………………………………………………………………....13 Zonas de muestreo……………………………………………………………………...14 Metodología……………………………………………………………………………....18 Resultados …………………………………………………………………………….....22 Análisis de resultados..……………………………………………………………….....33 Conclusiones…………………………………………………………………………......43 Anexo 1……………………………………………………………………………………44 Bilbiografia………………………………………………………………………………..52 1 Resumen México se considera un país multidiverso en cuanto a organismos, ocupa el quinto lugar a nivel mundial en diversidad de organismos sobre la tierra por sus condiciones ambientales y microambientales. Su situación geográfica y accidentada topografía con variaciones de altitudes y climas han permitido laformación de un mosaico de ambientes para un gran número de organismos. Entre estos ecosistemas encontramos los sistemas cavernarios, a pesar de que México cuenta con aproximadamente 440 cuevas reportadas en su territorio gran parte de estas no han sido exploradas; las cuevas cuentan con su propio ecosistema y micro habitad que permite la supervivencia de un gran número de organismos. Estos ambientes se han relacionados con la presencia de hongos patógenos como es el caso de Histoplasma capsulatum. A su vez las condiciones internas de las mismas permiten la supervivencia un gran número de organismos ambientales. A pesar de la relación de los microorganismos con las cuevas existen pocos estudios que muestren esta conexión. A partir de tres cuevas localizadas en la zona central de México se realizo la toma de muestras de tierra de la zona vadosa de la caverna, estas muestras se procesaron mediante un lavado con agua peptonada para realizar el aislamiento de los hongos presentes en las cuevas. La identificación se realizó a partir de características microscópicas y macroscópicas. De los hongos identificados solo una pequeña parte de estos se consideran patógenos para el ser humano, gran parte de los agentes identificados son considerados ambientales. Los resultados obtenidos muestran que la presencia de agentes patógenos en estos entornos es baja, a comparación de lo esperado a partir de la literatura. A su vez se observa la gran diversidad de agentes que coexisten en estos entornos y la importancia que tienen para el ser humano. 2 Introducción Los hongos microscópicos Los hongos son los organismos más abundantes y ubicuos en la naturaleza, varían en forma y tamaño y pueden vivir de los sustratos y condiciones ambientales más variadas. Sus características morfofisiológicas les confieren a cada género la capacidad de sobrevivir en su entorno. De acuerdo a la clasificación de Kendrick del 2002 los hongos se clasifican dentro del reino fungí, a su vez estos están divididos en cuatros phyla; la clasificación se realiza a partir de las características morfológicas, fisiológicas pero principalmente por estudios de biología molecular. (Bonifaz A, 2012). Los hongos son organismos heterótrofos, se alimentan por absorción a partir de la secreción de sustancias sobre el sustrato para posteriormente fagocitarlo. Están formados por células eucariotas; ya sea uninucleada o multinucleadas; en la naturaleza existen dos disposiciones de las células fúngicas. Pueden ser unicelulares o pluricelulares; los hongos unicelulares están representados por las levaduras mientras los pluricelulares son representados por los hongos filamentosos (López R, 2012). Existe un reducido número de hongos que presenta dimorfismo, es decir la capacidad de pasar de una fase levaduriforme a una miceliar, esta capacidad está influenciada por las condiciones del medio. Tanto en los hongos filamentosos como en las levaduras la pared celular se constituye por polisacáridos y proteínas; dentro de los polisacáridos más importantes tenemos la quitina, el glucano y el galactomanano, mientras que las proteínas están asociadas a glicoproteínas formando una estructura solida como se observa en la ilustración 1. (Pontón J, 2008). 3 Ilustración 1. Diagrama de la composición de la pared celular de los hongos. Las concentraciones de estos agentes cambia entre los levaduriformes y los filamentosos, estas variaciones intervienen en la forma de las células fúngicas, la forma en las que interaccionan con su ambiente y como protección ante agentes tóxicos (Arenas R, 2008). Los hongo patógenos son especies zootropicas que requieren de tejido vivo para el crecimiento, o al menos en una fase de su ciclo, en cambio los hongos oportunistas son necrotoficos o saprofito, es decir utilizan componentes orgánicos generados por los hospederos. Los hongos necrotoficos pueden dividirse en queratolitico, lipofilicos, osmofilicos, y urofilicos (Arena R, 2008) se calcula que solo el 0.4% de los hongos existen son patógenos, pero este número va en crecimiento lentamente (Bonifaz A, 2012). 4 El micelio y su composición Los hongos presentan variaciones en su forma y constitución, de forma general se componen principalmente por talos o hifas en el caso de los filamentosos. La hifa es un tubo de constitución variada formado por una pared celular rígida en el que fluye protoplasma. El diámetro varía de 1 a 30 micras; termina en punta, misma que constituye la zona de extensión y representa la zona de crecimiento. Existen hongos que presentan un micelio tabicado conocido como septo, estos presentan un poro que permite el paso del citoplasma y el núcleo, esta estructura es común en los hongos Zygomycetes. En el caso de los hongos cenocíticos no se observan septo o muestras muy pocos, ocasionalmente para separar las zonas viejas del micelio o las reproductivas. (Bonifaz A, 2012) En los hongos mucidinaceos las hifas son incoloras o hialinas y en los negros o dematiceoas, el color oscuro se genera por la presencia de un pigmento parecido a la melanina; este le confiere una tolerancia contra el estrés ambiental y contra oxidantes producidos durante la defensa del huésped. (Bonifaz A, 2012). La formación de las hifas es un proceso que todavía no está aclarado. Investigaciones realizadas por Cole GT, Ruiz-Herrera y Bartnickie-Garcia permiten proponer de manera resumida el desarrollo de la hifa (Mendez, L, 2006). Los dictosomas, que son cuerpos residuales en el citoplasma, liberan una estructuras llamadas macrovesiculas que atraviesan la membrana celular por un proceso inverso al de la pinocitosis, en su interior llevan enzimas líticas que abren pequeños poros en la pared celular y simultáneamente depositan material amorfo que será la nueva pared celular por acción enzimática. Otras estructuras más pequeñas llamadas microvesiculas contienen en su interior quitina sintetasa, esta enzima actúa en el material amorfo de las macrovesiculas formando la quitina el crecimiento del hongo se lleva a cabo a partir de de la lisis de la pared, incorporación del material amorfo, síntesis de quitina y por último la formación de nueva pared (Mendez, L, 2006).. 5 La forma de crecimiento está determinada por la cantidad de microvesículas y macrovesiculas que se concentran en la pared del hongo; si estas estructuras se ubican en un punto determinado de la célula el crecimiento será tubular (hifa), si se localizan de manera homogénea en la periferia el crecimiento será levaduriforme, mientras que si la distribución varia en tiempo y distribución el crecimiento será irregular (ensanchamiento y crecimiento) (Mendez, L, 2006). Reproducción de los hongos Para conservar su habilidad de adaptación los hongos deben reproducirse fácilmente, este proceso se realiza a parir de una espora que posteriormente genera una un tubo germinativo que da lugar a un nuevo hongo. Existen dos tipos de reproducción en el reino fungí; la forma sexuada o perfecta en la que se genera la unión de dos núcleos, mientras que la asexuada o imperfecta se da a partir de un micelio aéreo o reproductor sin fusión de núcleos. De forma taxonómica se refiere como espora a todas aquellas estructuras que se forman por el intercambio genético; mientras que el término conidio se utiliza para referirse a aquellas que se producen por la fase asexuada del hongo (Bonifaz A, 2012). La reproducción sexuada tiene como fin el intercambio de material genético para mejorar las propiedades del hongo y promover la evolución; en la mayoría de los hongos se conoce esta fase, en el caso de algunos de ellos se desconoce todavía esta fase de su ciclo aunque esta característica se utiliza para la clasificación taxonómica de las especies estos agentes se encuentran repartidos en diferentes taxonomías.(BonifazA, 2012) La reproducción asexuada tiene como función la propagación del hongo, en este caso se genera una reproducción de células por división meiotica que contienen la misma información genética que las células somáticas; se conocen tres formas en las que los hongos llevan a cabo este proceso; dos de ellas por la formación de conidios libres y una a partir de la formación de esporas internas o dentro de una membrana o bolsa. En el caso de las dos primeras el proceso se conoce como conidiogenesis, este proceso tiene como finalidad la volver fértil las hifas o en su 6 caso la formación de estructuras especializadas para la reproducción. En el último caso la formación del saco o membrana se lleva a cabo por la esporangiogenesis; durante este proceso la hifa se ensancha para formar el esporangio (Bonifaz A. 2012). Nutrición de los hongos Los hongos son organismo heterótrofos que adquieren sus nutrientes por medio de absorción, es decir cuando estos agentes se encuentran cerca de un sustrato útil liberan enzimas que rompen las cadenas complejas del nutriente formando elementos más simples que pueden penetrar en el interior de la hifa. Esta característica es importante para el aislamiento e identificación de hongos patógenos ya que la adicción de nutrientes específicos junto con indicadores de ph permiten poner en evidencia la capacidad metabólica de los hongos. La utilización de determinados sustratos y nutrientes permiten en algunos agentes la formación de estructuras de importancia diagnóstica. (Bonifaz A, 2012) La mayoría de los hongos tiene un metabolismo aerobio, aunque algunos de los hongos patógenos, principalmente los dímorficos son capaces de desarrollarse en condiciones microaerofílicas; estas condiciones con alta concentración de CO2 obligan a las células fúngicas a entra en un proceso de anaerobios. Los metabolismos fúngico no solo se ve afectado por condiciones ambientales como la temperatura, el pH, la humedad, exposición a la luz solar etc. Debido a su distribución a nivel mundial y sus características metabólicas cada género o incluso cada especie presentan temperaturas en las cuales su desarrollo es óptimo. Existen tres clasificaciones de estos agentes. (Bonifaz A, 2012) Psicrófilos: se desarrollan entre 0°C y 20°C con una temperatura óptima de 17°C, esta disminución de temperatura puede generar cambios metabólicos de manera substancial (Mendez, L, 2006). Mesófilos: presentan un amplia rango de desarrollo que va de 0° a 50°C, sin embargo se desarrollan mejor entre 15° – 40°C. En este grupo encontramos a la 7 mayoría de los hongos patógenos para el ser humano y los animales; dentro de este grupo cabe destacar a los hongos dimorficos, aquellos que tienen la capacidad de cambiar de forma en función de la temperatura (Mendez, L, 2006). Termófilos: tienen un crecimiento optimo entre los 20° a 50° C se aíslan de aguas termales y desiertos. A pesar del que el rango de temperatura comprende a la temperatura humana pocos de estos hogos son patógenos, sin embargo algunos hongos como Aspergillus fumigatus pueden desarrollarse a 50° C e incluso sobrevivir a 70°C por un corto periodo de tiempo (Mendez, L, 2006). México y su situación geográfica México se considera un país multidiverso en cuanto a organismos, ocupa el quinto lugar a nivel mundial en diversidad de organismos sobre la tierra por sus condiciones ambientales y microambiantales. Su situación geográfica y accidentada topografía con variaciones de altitudes y climas han permitido la formación de un mosaico de ambientes para un gran número de organismos (Mittermeier y Goettsch, 1992; Conabio, 1998). En el caso de México se considera que existen aproximadamente 4,500 especies de hongos macroscópicos y 2,000 especies de hongos microscópicos, según estimaciones (Kirk, 2008). Esto representa solo el 6.6% de hongos conocidos a nivel mundial. Se considera que México cuenta con aproximadamente 20 000 hongos descritos, lo que equivale al 3.2% de los hongos existentes en el país. Pero solo entre 300 a 400 son patógenos para el ser humano (Schmit y Müeller, 2007). De acuerdo a la revisión realizada en 1998, se tenían registrados 2,000 hongos microscopicos de los cuales 120 eran mohos de suelo, 100 hongos de granos almacenados, 70 de bebidas fermentadas, 30 patógenos del hombre y/o animales, 30 acuáticos, 30 hongos parasitarios de invertebrados, 20 mohos de estiércol y 10 hongos del aire. (Guzman, 1998). 8 Su distribución puede ser cosmopolita o endémica. La distribución depende en gran parte de factores como la temperatura, pH, altitud, la disponibilidad de los sustratos y en ocasiones la presencia de vectores o reservorios. Existen algunos agentes que se consideran estrictos para determinadas especies o por sus requerimientos nutricionales restringidos a zonas geográficas especificas. (Martinez R, 2005) El desarrollo de la micología en México comienza en el siglo XX donde alrededor de 665 publicaciones en relación a los hongos son realizadas, dentro de estos trabajos se citan aproximadamente 1000 especies; se considera que la micología en México comienza la década de los 70´s cuando el 82.4% de los trabajos publicados son hechos por investigadores mexicanos. Se estima que en México existe el 6.6% de hongos a nivel mundial (Aguirre-Acosta, 2014). México y sus climas Geográficamente la Republica Mexicana se localiza en el hemisferio norte, tomando como referencia el ecuador, por su localización y extensión el territorio es divido en dos grandes grupos climáticos. Esta división se ve acentuada por el trópico de cáncer que atraviesa el territorio a una latitud de 23° norte. En su gran mayoría el subsuelo del territorio se encuentra conformado por roca calcárea, lo que permite la formación un gran número de estructura tanto superficial como internamente en el territorio (INEGI, 2016). La diversidad de climas y topografía en México determinan la distribución de los hongos patógenos en zonas geográficas, en el territorio Mexicano se consideran 4 grandes regiones climáticas: las zonas de clima seco que registran una temperatura entre lo 18° y 22°C con una precipitación anual entre los 300 a 600 mm anuales de lluvia, estas zonas abarcan aproximadamente el 28.3% de territorio mexicano abarcando principalmente la zona centro del país. (INEGI, 2016). 9 El clima muy seco registra un promedio de temperaturas entre los 18° a 22°C con un nivel de precipitaciones que abarca entre los 100 a 300 mm de lluvia al año, este clima abarca el 20.8% de territorio Mexicano. (INEGI, 2016). El clima cálido abarca el 27.7% del territorio nacional este a su vez se subdivide en cálido húmedo y cálido subhúmedo. El cálido húmedo ocupa solo el 4.7% del territorio, se caracteriza por una temperatura media que abarca entre los 22° y 26°C y precipitaciones que van desde los 2,000 a 4,000mm anuales. En cambio el clima cálido húmedo se encuentre en el 23% del país; en él se registran precipitaciones entre los 1,000 a 2,000mm anuales; com s observa en la ilustración 2. (INEGI, 2016). Ilustración 2. Mapa de la distribución de los diferentes climas de la republica mexicana (INEGI, 2016). 10 Dentro de la clasificación manejada por el INEGI no se consideran los ambientes cavernarios, estos presentan su propio microclima que se ve relacionado con la formación y desarrollo de estos entornos. La gran presencia de suelos calcáreos en la Republica Mexicana favorece la formación de cuevas por efecto Kárstico.(Servicio Geologico Nacional. 2013) Existen diversos tipos de cuevas, se pueden clasificar de forma general en 5 grupos; cuevas de Rocas Calcáreas, Cuevas de Hielo, Tubos de lava, cuevas de rocas evaporiticas y cuevas de conglomerados (Verde A, 2012) Cuevas kársticas Las cuevas kársticas obtienen su nombre del procesoque las forma; este proceso se conoce como “karts” o fenómeno kárstico. Este proceso se ve afectado por una serie de factores como la solubilidad y permeabilidad de la roca, ph del medio, cantidad de agua, composición química y presencia de CO2. La formación de estos ecosistemas está relacionada principalmente con el agua y su flujo a través de la corteza generando un proceso de meteorización que con el paso del tiempo genera la formación de la cavidad. (Ulloa A, 2011). Junto con la meteorización generada por el agua, el segundo proceso más importante para la formación de la caverna es el efecto del pH sobre la caliza. Este efecto se presenta en gran medida por la formación de acido carbónico a partir del CO2 y el agua. La formación de estas cavernas es un proceso continuo y en constante movimiento lo que implica la denominación de dos tipos de sistemas en estos entornos; cueva activas e inactivas. Las cuevas inactivas son aquellas en las que el flujo de agua o el proceso kárstico se ha detenido casi en su totalidad deteniendo la formación de nuevas cavidades. En el caso de las cuevas activas o de gran movimiento de energía se presenta un flujo constante de agua con la presencia de crecidas y arrastre de material orgánico al interior de la cueva. (Cuezva S, 2008). 11 El clima subterráneo. Las cuevas al igual que cualquier ecosistema presentan sus propias características y clasificaciones dentro del mismo sistema. De forma general una caverna se puede dividir en dos ambientes; el ambiente vadoso o superior que se caracteriza por ser el más próximo a la superficie. En esta zona se presenta la infiltración de agua por gravedad, la ausencia de espelotemas y es la zona con mayor actividad microbiana dentro de la cueva; la zona freática se caracteriza por la presencia de espeleotemas y la de mayor actividad hídrica, en esta zona se realiza el proceso de disolución y precipitación dentro del sistema (Cuezva S, 2008). A pesar de que se consideran estos sistemas ambientes parcialmente confinados, la interacción de la roca y el suelo cavernario llevan a cabo la función de regular el paso de energía y materiales de la atmosfera externa al ambiente subterráneo. Debido a esto se considera que la temperatura de los sistemas cavernarios se determina como la temperatura media climática de la zona donde se localizan las cuevas; la presencia constante de agua y los procesos de infiltración generan que en estos sistemas se presente un humedad a nivel de saturación, a su vez la presencia de agua proveniente del exterior genera el arrastre de nutrientes que permiten la supervivencia de organismos heterótrofos (Cuezva S, 2008). 12 Justificación. La diversidad de climas y topografía en México determinan la presencia de hongos patógenos en zonas geográficas específicas, de acuerdo a la literatura la distribución de estos agentes se plantea principalmente por los casos reportados en las entidades o a partir de la similitud entre los climas donde se han logrado aislar estos agentes. En este proyecto se busca utilizar el microclima poco variable de las cuevas como indicador de la presencia de hongos patógenos en las zonas aledañas. Estos ambientes en el caso de México son poco explorados por lo que se desconoce la gran diversidad de recursos que existen en estos entornos, el escaso interés y la dificultad del acceso a estos entornos dificultad la exploración con fines científicos. 13 Objetivo. Determinar la presencia de hongos patógenos en la zona central del valle de México a partir de muestras de tierra obtenidas de cuevas de diferentes zonas geográficas, con el fin de utilizar estos nichos ambientales poco variables como indicadores de la presencia de estos agentes en la zona. Objetivos particulares Evaluar si el ambiente subterráneo permite la supervivencia de hongos de diferentes géneros y especies. Conocer la importancia que tienen los hongos en los ambientes cavernarios como parte del ecosistema subterráneo 14 Zonas de muestreo Se seleccionaron 3 cuevas para la realización de este proyecto, para acceder a estos sistemas se conto con la ayuda de la Asociación de montañismo de la UNAM. (AMUNAM). Para su ingreso fue necesaria la utilización de equipo espeleológico para progresión en cuerdas. Tabla 1. Localización geográfica de las cuevas muestreadas Cueva Localización Cordenadas Fecha de muestreo Los Herrera Querétaro 20.899170, -99.576293 19 de octubre 2014 Cueva de tierra Veracruz 18.805959, -97.06722 2 de noviembre 2014 Los Hernández Querétaro 20, 90556, -99.588611 7 de diciembre 2014 Los herrera (ilustración 3) Cueva kárstica activa localizada en la sierra gorda de Querétaro cercana a la población de san Joaquín. La zona se caracteriza por un clima templado de lluvias moderadas, esta cueva presenta modificaciones internas ya que se utiliza de forma turística. Entre las modificaciones presentes se encuentra la pavimentación de la bóveda principal, instalación de iluminación y colocación de rejillas y pasamos para restringir el paso de los visitantes. Las zonas de muestreo seleccionadas fueron elegidas por la presencia de fauna dentro de la cueva, restos orgánicos y materiales arrastrados por el flujo de agua. 15 Cueva de tierra (ilustración 4). Este sistema de múltiples cuevas kársticas se localiza en el estado de Veracruz, en el municipio de Rafael delgado; el muestreo se realizo en el mes de noviembre, como se muestra en la tabla 1. La zona se caracteriza por un clima cálido de vegetación tropical y abundantes precipitaciones (INEGI 2016). Ilustración 3. Localización aproxima de la cueva "Los Herrera". Google maps 2016 16 Ilustración 4. Localización aproximada de la cueva de tierra. (Google maps, 2016) Los Hernández El sótano se ubica en la sierra gorda de Querétaro, cercano al pueblo de San Joaquín. El muestreo se realizo 7 el de diciembre del 2014. La zona se caracteriza por bosques de pinos y un terreno escabroso. La zona se presenta un clima de media montaña con temperaturas mínimas cercanas a los 0°C. (INEGI 2016) Ilustración 5. Localización aproximada del sótano los Hernández. Google map 2016 17 Ilustración 6. Mapa topográfico del sótano Los Hernández, la flecha indica la zona aproximada de la zona donde se realizo la toma muestra. Mapa realizado en 2001 por parte del instituto politécnico nacional. Debido a que la realización de un mapa topográfico dentro de estos entornos involucra un proceso de exploración y la intervención de diferentes especialistas como son topógrafos, geólogos, biólogos y espeleólogos capacitados; muchas de las cuevas en México no cuentas con este tipo de referencias Zona aproximada de toma de muestras 18 Metodología MATERIALES Frascos estériles de boca ancha Gasa estéril micrcultivos estériles Frascos estériles de 100 mL Embudo de filtración Medios de cultivo micológicos -Agar dextrosa de Sabourad (MCD LAB) - Agar dextrosa de Sabourad adicionado con 5% de cloranfenicol (MCD LAB) -Agar extracto de levadura (BD) -Agar Czapek Dox (BD) -Agar Borrelli -Agar Tricophyton -Agar Extracto de malta (MERCK) Solución estéril de agua peptonada al 10% (BIDICO) Azul de algodón lactofenol Cámara adaptable para microscopio AmScope MU300 19 Recolección de muestras La recolección se realizo en las zonas cercanas a la entrada de las cuevas, se seleccionaron estas zonas por la presencia de aves y murciélagos dentro de las cuevas, el flujo de agua y la presencia de materia orgánica; se tomaron muestras de la zona de aproximadamente100g de tierra en frascos estériles. Se considero la presencia de humedad, restos vegetales y accesibilidad a la zona para el muestreo. Procesamiento de la muestras De las muestras recolectadas se procedió a realizar un lavado una solución de agua peptonada estéril, aproximadamente 25 ml, posteriormente se filtro la solución por gasa estéril para terminar con el sobrenadante de la cual se trabajaría para el aislamiento. El aislamiento se realizo en placas de agar dextrosa de sabouraud con 5% de cloranfenicol. Para este procedimiento se tomaron 0.01 ml del lavado con ayuda de un asa calibrada para la colocación de la primera impronta, la dispersión de la muestras se realizo de forma masiva por triplicado en placas de agar SDA adicionado con cloranfenicol al 5%. Se mantuvo un monitoreo de las placas en periodos de 48 horas, las placas se mantuvieron a temperatura ambiente, la presencia de micelio aéreo con morfología diferente entre sí fueron resembrados en placas de agar SDA. Por cada aislamiento se realiza una tinción de cinta adhesiva con azul de algodón-lactofenol; a partir de la morfología presente se realiza el montaje de microcultivos, se utilizan medios nutritivos o diferenciales para promover el desarrollo de estructuras que permitieran su identificación. La identificación se realizo por medio de las características microscópicas y macroscópicas presentes en cada agente aislado; la presencia de micelio aéreo de diferente tonalidad, presencia de pigmento o micelio con variaciones durante el crecimiento fueron utilizadas a nivel macroscópico para seleccionar las colonias a 20 las que se les realizo la tinción de azul de algodón lactofenol. La tinción se realizo por la técnica de cinta adhesiva en primera instancia; a nivel microscópico se observo la forma general de las hifas, presencia de estructuras reproductivas y tabicaciones de las mismas. La promoción de estructuras reproductivas se realizo por medio de la utilización de medios diferenciales como fue el caso del agar Tricophyton y el Czapek Dox. Junto con estos se realizo el sembrado de medios como el Agar extracto de levadura, agar Borelli y extracto de malta con el fin de favorecer la formación de hifas y conidias. Se utilizo la técnica de microcultivo, utilizando los medios previamente citados con el fin de observar las estructuras microscópicas para la identificación. 21 Ilustración 7. Diagrama ecológico del procesamiento de muestras ( RecoI«don de ffiIH''',,"S ) f SoIudón de agua peptom.d<l estffil / ltMKIo con 25 mi f>1tr~ y alrl'l!!«",,,,.ento 1na<:tiviI:x.n de rrnt .... 1 ~de SOAaj ~ dedoranfeoicol / sembrado de pIauIs mon~oreo de 1&5 p""",,s mIceIiG dife.-~ 00 • purtl\alclldon y promoaon de estructur •• reproductO<1ls • / 7 M¡Icrocu~~os estériles 7 Precundórl de m;c,-ocu trvos / lnactivlldón de "",t~ ! OocumentlDón de canKtelÍSitCilS ! ( RecoI«don de ITIIM'~ "'S , ..t SoIudón de &glUl pe~ e;tffil ltIvedo con 25 mi filtrado y alrr..c,mi"rienlo / lnactivajo)n de rTWIlmal pac.r¡ de SO" al ~ de ÓOfanteolcol sembrado de ~s mon~oreo de ~" plllals mlafudif~ 00 • po.ri'IaIcedon y promoaon de eslJUctuno" r~oductonos • / 7 M¡~~",C)5 estkites 7 Prflllll"&d6n de mk:roaJ t".,s / ¡~ de "",tf!fi.ej ! Oocumentadón de call1Cterisitcios ! ( Ro ) 22 Resultados A partir de los aislamientos obtenidos en las 3 diferentes cuevas, se tomaron fotografías del micelio aéreo con ayuda de cámara adaptable para microscopio Amscope MU300, tomando específicamente estructuras de importancia para la identificación de los hongos. Agentes aislados en la cueva los Herrera 1. Bauveria sp. Ilustración 8. Bauveria sp: a) Medio SDA micelio aéreo algodonoso; b) hifas y conidios característicos del género, tinción azul de algodon 40X; c) Conidios alargados en forma de espiga, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b c 23 2. Madurella mycetomatis Ilustración 9. Fotografías del micelio aéreo de Madurella mycetomatis. a) hifas tabicadas con clamidioconidias intercalares en medio SDA, tinción azul de algodón 40X. b) microconidias obtenidas en medio cornmeal, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 3. Trichophyton verrucosum 4. Epidermophyton floccosum a b c Ilustración 10. Fotografías obtenidas de Trichophyton verrucosum. a) medios SDA, micelio aéreo algodonoso. b) hifas terminales con clamidioconidias en agar extracto de levadura, tinción azul de algodón 40X. c) cadenas de clamidioconidias encontradas en medio extracto de malta, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 24 4. Epidermophyton floccosum Ilustración 11. Fotografias de Epidermophyton floccosum. (a) Medio SDA, micelio aéreo polvoroso. b) hifas septadas con desarrollo joven de artroconidias, Tinción azul de algodón 40X. c) macroconidias septadas maduras, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 5. Trichophyton mentagrophytes Ilustración 12. Fotografías de Trichophyton mentagrophytes. a) micelio aéreo algodonoso de reverso incoloro, obtenido en medio SDA. b) microconidias obtenidas en medio Trichophyton, tinción azul de algodón 40X. c) hifas y microconidias en medio SDA, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a c b a b c 25 Agentes aislados en la cueva de tierra 6. Cladosporium sp Ilustración 13. Fotografias de Cladosporium sp. a) medio SDA, micelio aéreo color negro polvoroso. b) hifas tabicadas, tinción azul de algodón 40X. c y d) conidias y conidióforos característicos del genero, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 7. Cephalosporium sp Ilustración 14. Fotografías de Cephalosporium sp. a) medio SDA micelio aéreo de color blanco algodonoso. b) hifas delgadas con conidióforos delgados y largos, tinción azul de algodón 40X. c) cúmulos de conidios ligeramente ovalados, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b c d a b c 26 8. Sporotrichum sp Ilustración 15. Fotografías de Sporotrichum sp. a) hifas con conidias intercalares, tincion azul de algodón 40X. b) hifas tabicadas con prsencia de conidias terminale, sub terminales y centricas caracteristicas de genero, tincion azul d algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 9. Basidiobolus ranarum Ilustración 16. Fotografías de Basidiobolus ranarum. a) medio SDA micelio aéreo de color gris polvoroso. b) fase sexual del hongo obtenida en medios SDA, tinción azul de algodón 40X. c) conidioforo alargado con espora oval, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b a c b 27 10. Aspergillus fumigatus Ilustración 17. Fotografías de Aspergillus fumigatus. a). Cabeza conidial obtenida en medio Czapek Dox, tinción azul de algodón 40X. b) vesícula característica de la especie, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b 28 Hongos aislados en la cueva los Hernández 11. Verticillum sp Ilustración 18. Fotografías de Verticillum sp. a) medio SDA micelio aéreo algodonoso de color amarrillo. b y c) cabeza conidial en racimo, tinción azul de algodon. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado.12. Aspergillus fumigatus Ilustración 19. Fotografías de Aspergillus fumigatus. (a) crecimiento en medio SDA, micelio aéreo algodonoso de color verde. b) cabezas conidiales en diferentes fases obtenidas en medio SDA, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b c a b 29 13. Trichophyton violaceum Ilustración 20. Fotografias de Trichophyton violaceum. a) crecimiento en medio SDA, color blanco ligeramente algodonoso. b y c) hifas delgadas no septadas con clamidioconidias, se observa engrosamiento posterior a las camidioconidias, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 14. Mucor sp. Ilustración 21. Fotografías tomadas de Mucor sp. a) crecimiento en medio SDA, tonalidad grisácea de crecimiento rápido. b) zigospora perteneciente al phylum zigomycota, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b c a b 30 15. Beauveria sp Ilustración 22. Fotografías de Beauveria sp. a y b) conidios alargados en forma de cuña, estructuras características del genero, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 16. Cephalosporium sp Ilustración 23. Fotografías de Cephalosporuim sp a, b y c). Hifas y aglomerados de conidios característicos del género, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b c 31 17. Scopulariopsis sp Ilustración 24. Fotografías de Scopulariopsis sp. a, b y c). Conidióforos y distribución conidial características del género, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. 18. Trichophyton verrucosum Ilustración 25. Fotografías de Trichophyton verrucosum a y b). Hifas irregulares con cadenas de clamidioconidias obtenidas en medio trichophyton, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b 32 19. Cladosporium sp Ilustración 26.fotografias de Cladosporium sp a y b) .Conidias y conidióforos de color negro característicos del genero, tinción azul de algodón 40X. Fotografías tomadas en el laboratorio 10 de Microbiología Unidad de Posgrado. a b 33 Análisis de resultados De acuerdo a los hongos aislados a partir de las seis muestras obtenidas de las 3 cuevas se observa que la principal presencia de agentes son comensales o patógenos de plantas y animales; mientras que en el caso de los hongos de importancia clínica para el hombre la incidencia es menor a la esperada. La presencia en estos microambientes junto con la distribución que se reporta en la literatura (Bonifaz 2012), como se engloba en el anexo 1, en relación con lo encontrado en algunos casos no coincide con lo esperado, a su vez la gran diversidad de agentes presentes en estos ambientes ilustra la permanencia y la facilidad con la que estos se adaptan. Los herrera Ilustración 27. Entrada de la cueva Los herrera Respecto a la cueva Los Herrera se debe aclarar que a diferencia de las otras dos cavernas muestreadas esta presenta una infraestructura para su utilización con fines turísticos como se observa en la ilustración 27; a pesar de esto esta cueva se 34 considera como una cueva activa. Debido a la forma de la cavidad, el muestreo se realizo en la entrada de la cueva donde se localizo la presencia de sedimentos, restos vegetales y la presencia de fauna endémica. Dentro de los agentes aislados se encontraron 4 hongos patógenos para el ser humano; de estos 3 pertenecen a los dermatofitos: Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes y Epidermophyton floccosum como se observan en las ilustraciones 10, 11 y 12 respectivamente .Junto con estos microorganismos se aisló un causante de micetomas, Madurrella mycetomatis como se observa en la ilustración 9. Se ha descubierto que los dermatofitos pueden encontrarse sobre la piel de personas sanas en un porcentaje bajo (Martinez R, 2005), debido a que estos agentes han coexistido con el ser humano desde el mesozoico, la dependencia de estos hongos por la queratina humana los ha colocado como agentes casi en su totalidad restringidos al ser humano, esta relación permite el movimiento de este agente a nuevos ambientes y están relacionados directamente con la presencia del hombre, el constante movimiento del ser humano dentro de la cueva puede generar la entrada y establecimiento de microorganismo ajenos al ecosistema de la cueva (Morelio, 2012). A pesar de que estos agentes se consideran principalmente queratoliticos diversos estudios han conseguido el aislamiento de estos hongos a partir de suelos forestales; esta gran resistencia y adaptabilidad al suelo permite su sustentabilidad en estos ambientes. La presencia y modificaciones generadas por el hombre dentro de este ecosistema pueden llegar a modificar la temperatura, humedad y presencia de CO2 lo que a su vez repercute en las formas de vida presentes en la cueva (Cuevza, 2008). Las modificaciones generadas dentro de la cueva como la construcción e implementación de pasillos y barandales, instalación de iluminación y mantenimiento de los mismos repercuten en la cadena trófica presente en este ambiente (Morelio, 2012), por lo que la presencia de hongos ambientales en esta fue casi inexistente, de los 5 hongos aislados solo se aisló un hongo comensal Bauveria sp. como se observa en la ilustración 8. 35 Junto a los dermatofitos se logro el aislamiento de Madurella mycetomatis. Este agente se considera un hongo de distribución limitada a las zonas circundantes al trópico de cáncer, este hongo se ha relacionado con climas de lluvias moderadas a escasas pero principalmente con restos vegetales (Bonifaz, 2012). La ubicación de la cueva con respecto a la zona en la que se presenta el agente concuerda a su distribución dentro del territorio mexicano. A pesar de que este agente se considera patógeno para el hombre es necesario entrar en contacto directo con el microrganismo por medio de la inoculación con materiales contaminados; para las personas que visitan la cavidad de forma turística el contagio con este agente es poco probable, en el caso del personal y ocasionalmente los espeleólogos que visitan las cavidades adyacentes el riesgo aumenta por lo sería posible encontrar la presencia del hongo en estos grupos de riesgo. Cueva de tierra. Ilustración 28. Entrada de la cueva de tierra Analizando los resultados obtenidos en La cueva de tierra localizada en el estado de Veracruz se observa que la disposición y características de esta permiten la presencia de murciélagos solamente en la bóveda inicial de la cueva, esta zona 36 presenta una rampa de lodo de aproximadamente 20 m en la cual la tierra y restos vegetales arrastrados por el agua se mezclan con los sedimentos presente dentro de la cavidad generando una masa de lodo de aproximadamente 30 cm de profundidad como se observa en la ilustración 28. En esta zona se realizo la toma de muestra; esta cavidad se considera una cueva activa con un alto intercambio energético, este proceso es principalmente generado por la gran cantidad de agua que llega a ingresar a la caverna por lo que las expediciones a su interior se restringen a la temporada previa o posterior a las lluvias. De los agentes presentes dentro de la cueva de tierra se observa que la mayor presencia corresponde a hongos ambientales mientras que los hongos patógenos relacionados con el hombre solamente Basidiobulus ranarum y bajo algunas condiciones de inmunosuprsionAspergillus fumigatus presentan un riesgo para el humano. Basidiobulus ranarum como se observa en la ilustración 16, es un agente que se reporta en climas húmedos y temperaturas cálidas, a nivel mundial la mayor incidencia de casos se reportan en Asia, África y Sudamérica (Bonifaz, 2012); su aislamiento y presencia se ha relacionado con el guano de murciélago y algunos anfibios; por lo que la presencia de este agente en las cuevas es factible, también se ha relacionado su presencia con restos vegetales de los cuales se ha logrado principalmente su aislamiento. Se considera este agente como un patógeno ocasional llegando a causar problemas a nivel intradérmico y respiratorio, solo ocasionalmente a nivel sistémico (Bonifaz A, 2012). Su relación con su patogenicidad depende principalmente con el tamaño del inoculo en el caso de afecciones pulmonares mientras que en procesos intradérmicos es necesario su inoculación con materiales contaminados. A pesar de ser considerado un hongo patógeno su baja incidencia y el poco conocimiento que se tiene sobre su ciclo en el medio ambiente lo coloca como un agente potencial (Bonifaz, 2012). En el caso de Aspergillus fumigatus como se observa en la ilustración 19, su patogenicidad se ve relacionada con el estado inmunológico de hospedero, este agente se ha llegado a aislar del suelo, restos vegetales, el agua y el aire. Al ser la 37 cueva un sistema abierto que tiene una interacción directa con el ambiente circundante no es de extrañarse tenerlo presente como parte del ecosistema. Las condiciones de alta humedad constante, presencia de una gran variedad de nutrientes y la ausencia de luz permiten a este hongo subsistir de forma normal. De los 5 agentes aislados en la cueva de tierra se logro el aislamiento de tres hongos comensales: Cladosporium sp, Cephalosporium sp, y Sporotrichum sp, como se ven en las ilustraciones 13, 14 y 15 respectivamente, estos hongos se consideran principalmente comensales del medio ambiente aunque ocasionalmente se han relacionado con procesos alérgicos. Los Hernández Ilustración 29. Entrada de la cueva Los Hernández Los Hernández a diferencia de los otros dos sistemas explorados este se considera un sótano, esto genera que la entrada de la cueva presente un tiro de 70m de altura, este tipo de cavernas presentan el colapso del techo lo que permite la caída de materiales provenientes del exterior de forma directa. En este caso las muestras se tomaron de una repisa a una altura aproximada de 35 m como se muestra en la ilustración 6. En esta cueva se aislaron nueve hongos de los cuales 38 solamente 3 son considerados patógenos para el ser humano, la patogenicidad de Aspergillus fumigatus depende de la respuesta inmune del hospedero (Bonifaz A, 2015). De los patógenos aislados dos de ellos pertenecen al género Trichophyton: T. violaceum y T. verrucosum; como se observa en las ilustraciones 20 y 25 respectivamente, este grupo de hongos presenta una gran resistencia y la capacidad de sobrevivir en el suelo sin necesidad de una fuente de queratina, este grupo se relaciona con las queratinitis y afecciones dérmicas. Estos agentes por su gran adaptabilidad al suelo es común aislarlos en suelos no cultivados; existen registro de la presencia de estos agentes en diversas cuevas y ambientes por lo que su presencia a diferencia de la cuevas los herreras no se relaciona con la presencia del ser humano. A pesar de que se considera que los dermatofitos son en su mayoría exclusivos de hombre se ha llegado a observar la presencia de un considerable número de dermatofitos geofilicos (Bonifaz 2012), este grupo de hongos rara vez genera afecciones en los humanos ya que estas cepas no necesitan de la queratina como fuente de nutrientes para su crecimiento. La forma de esta cueva permite que la humedad y restos vegetales se depositen de forma constante en el interior permitiendo una renovación de los nutrientes, se considera un sistema activo, a diferencia de los dos sistemas anteriores, en esta la entrada de agua se genera principalmente como lluvia ingresando de forma directa al interior. Debido al proceso de meteorización generado por el agua dentro de la caverna, gran parte del primer tiro de 80 m, como se observa en la ilustración 6, presenta un relieve con una inclinación de aproximadamente 20°. Esto limita las zonas donde se presenta la acumulación de tierra y sedimentos reduciendo los puntos donde es posible obtener muestras. En el caso de Aspergillus fumigatus como se observa en la ilustración 19 y los hongos ambientales la presencia de estos agentes se ha relacionado con restos vegetales y material en descomposición. Debido que este sistema se encuentra en 39 una relación mas directa con su entorno la presencia de agentes comensales es mayor a comparación con las otras cuevas exploradas. Gran parte de los hongos aislados en estas cuevas son considerados ambientales o contaminantes, al revisar la literatura se observa que en algunos casos estos agentes toman relevancia ya que son utilizados por el ser humano con fines diversos a nivel industrial y agropecuario como es el caso de Bauveria sp que es utilizado como un agente controlador de plagas (Dirección general de sanidad vegetal, 1999). Debido a que las cuevas se encuentran interconectadas el ambiente exterior que las rodea no es de extrañarse la gran presencia de hongos saprofitos en su interior, gran parte de estos hongos se han aislado de restos vegetales en descomposición, en algunos casos de insectos y de tierras no cultivadas. La baja interferencia del hombre en estos ecosistemas ha permitido que estos organismos se desarrollen sin alteraciones y se adapten al suelo cavernario donde cumplen la función de degradadores (Cuevza, 2008). A pesar de que algunos de estos agentes se reportan como patógenos oportunistas las condiciones necesarias para que estos hongos llegaran a generar alguna patología se relacionan con el estado inmunológico de hospedero. El difícil acceso y la condición física que se requiere para adentrarse en estos sistemas disminuyen la posibilidad de contagio para personas que sean susceptibles a estos hongos. La investigación de estos entornos es una cuestión muy especial ya que el adentrarse en estos territorios involucra la utilización de equipos de espeleología para la progresión, el conocimiento de técnicas, la colocación de cuerdas y anclajes para la exploración segura. La exploración de las cuevas con fines científicos se considera un esfuerzo de múltiples disciplinas ya que es necesaria la intervención de un gran número de personas con capacidades y conocimientos diversos que permitan llevar a cabo 40 este tipo de proyectos. A su vez la condición física y mental que debe presentar una persona para entrar a varios de estos entornos es un punto crítico durante la realización de las actividades ya que estos ambientes siempre llevan consigo un riesgo inherente. Considerando los estudios realizados en México por asociaciones como la Ipan Tepeme Ihuan Oztome, dirigida por el Dr. Ismael Arturo Montero Garcia, proyectos por parte de la Unión Mexicana de Agrupaciones Espeleológicas perteneciente a la facultad de ciencias de la UNAM entre otras; avocados a las cuevas, se observa que principalmente estos se han realizado en sistemas cavernarios utilizados de forma turística y ocasionalmente por agrupaciones de espeleólogos (Cano, Martinez, 2000). Comparando los estudios realizados en el país con otros, como el caso de la cueva de Altamira y Catambria en España, estudiadas por la Doctora Soledad Cuevza Robleños (2008), en la que realiza un monitoreo exhaustivo de las condiciones y el impacto de la gente dentro de estos entornos, la investigación en estos entornos está centrada principalmente en la descripcióndel entorno y su aprovechamiento comercial. La descripción del ecosistema cavernario y sus diferentes extractos han sido poco explorados, la literatura sobre el mundo microscópico de estos lugares esta evocada principalmente a las bacterias; la presencia y relación de los hongos con este entorno ha sido descrita solamente como agentes degradadores. Estos ambientes en el caso de México han sido muy poco explorados por lo que se desconoce la gran diversidad de recursos que existen en estos entornos. México cuenta con aproximadamente 442 cuevas registradas, se desconoce cuál es la cantidad total y real de cuevas que existen en el territorio mexicano. De estas solo un pequeño número de cavernas han sido estudiadas o exploradas. La gran diversidad y el complejo ecosistema que se oculta en estos ambientes dejan en entredicho la gran cantidad de recursos naturales que presenta nuestro país. Lamentablemente el interés de estos sistemas está centrado principalmente para fines deportivos y ocasionalmente turísticos, la investigación científica de las 41 cuevas ha sido relegada a sistemas que presentan un interés específico para el hombre; como son cavernas turísticas o zonas para el aprovechamiento de minerales. El caso de Histoplasma capsulatum es un punto particular, este agente se reporta como un patógeno primario y se ha relacionado con las cuevas principalmente con el murciélago; ya que este organismos utiliza estas cavidades como refugios o hábitat, el ambiente cavernario presenta una temperatura estable, humedad constante y la escasa presencia de luz permite la conservación del hongo en el sustrato cavernario. (Tovar L, 2008) Durante el muestreo y la realización de las actividades espeleológicas se observo la presencia de quirópteros en las cuevas; en el caso de Los Hernández debido a la ubicación geográfica, geomorfología y ecosistema circundante no se observo la presencia de estos animales en las cercanías. De acuerdo a la literatura este agente debería de presentarse en estos ambiente tanto por las características que presentan las cuevas así como la presencia del hospedero; considerando estos rasgos y la distribución geográfica en la cual se reporta la presencia del hongo. En el caso de la Cueva de tierra localizada en el estado de Veracruz, por las condiciones ambientales de la zona la presencia endémica del hospedero y la información epidemiológica se considera la zona de mayor probabilidad para su aislamiento. En ninguna de las muestras obtenidas dentro de las 3 cuevas estudiadas fue posible recuperar al agente, esto puede indicar que no necesariamente la presencia del hospedero es un punto clave para su existencia en estos sistemas. En el caso de México existe una gran cantidad de huecos en la información epidemiológica del agente ya que principalmente se ha planteado su presencia y distribución a partir de datos epidemiológicos y tipificación de hongos aislados de muestras clínicas; ocasionalmente de aislamientos de vectores, ambientales. Autores como Taylor M, Chavez Tapia C y Vargas Yaez R (1999) indican que la muestra más factible para su aislamiento es el guano de coleópteros y en determinadas zonas de aves; al observar el terreno y la disposición de las cuevas 42 podernos observar que obtener una muestra de guano pura en estos entornos presenta una dificultad mas para el muestreo. El suelo de estos sistemas se considera una mezcla de detritos, restos vegetales y material de origen animal como son sus excretas, pelaje y restos animales; estos materiales componen la fase biológica mientras que la fase geológica está compuesta por arcillas, barro y restos calcareos; esto genera que el suelo cavernario sea una mezcla homogénea de todos estos componentes. Un punto importante en estos ambientes es la presencia de la humedad y el flujo de agua que es la responsable del abastecimiento de nutrientes y el arrastre de materiales al interior de la cueva. 43 Conclusiones Con base a los hongos aislados en las cuevas estudiadas se observa que la presencia de hongos patógenos en estos ambientes es muy baja, a diferencia de lo esperado con respecto a la literatura de acuerdo a la zona geográfica. Entre los puntos de importancia que se deben de resaltar en este trabajo es la ausencia de Histoplasma capsulatum, como agente patógeno principal en los sistemas cavernarios. Los resultados obtenidos muestran que la existencia de fauna como aves o murcielagos no necesariamente es indicativo del hongo en estos sistemas. Las condiciones de humedad, temperatura y la ausencia de luz generan un ambiente idóneo para un gran grupo de hongos, la entrada constante de nutrientes y materiales del exterior favorece esta condición generando en este hábitat la conservación de un gran número de especies. La baja modificación del ambiente cavernario permite que los organismos que viven en estos sistemas no presenten alteraciones significativas en el ciclo biologico. La gran diversidad y el complejo ecosistema subterráneo en la actualidad siguen siendo un misterio para la comunidad científica, el adentrarse en estos entornos no es una tarea fácil. La dificultad del terreno y la falta de personal capacitado para la exploración de una cueva son de los principales problemas que involucra el poder adentrarse a estos terrenos con fines de investigacion. Se debe considerar que la falta de apoyo para la realización de proyectos en esta área es un punto que ha detenido el estudio y la profundización sobre las cuevas. 44 ANEXOS 45 Distribución geográfica de los hongos en el territorio mexicano La gran variedad de climas en la republica mexicana permiten una distribución muy variada de agentes micoticos, esta distribución ha sido poco estudiada principalmente en agentes patógenos para animales y el ser humano. Cladosporium sp Los miembros de este género se distribuyen en un gran número de especies, su distribución es cosmopolita. Se han aislado de muestras de suelo, desechos vegetales, como endófitos y frecuentemente sus conidios se aíslan del aire en épocas de mayor humedad (caridad M, 2012) Existen aproximadamente 500 especies, considerados patógenos de plantas y solo en el caso de Cladosporium carrioni como agente patógeno en el ser humano causando cromoblastomicosis. En algunos casos Cladosporium cladosporoides se ha relacionado con infecciones cutáneas, nasales y oculares. La mayoría de las especies se consideran alérgenos importantes ya que los conidios, esporas o restos de hifas pueden llegar a generar procesos alérgicos desde el tipo I al III; por esta misma causa se plantea que el 10% de la población es alérgica a este hongo (borrego S. 2012) Bauveria sp Dentro de este género existen solamente 6 especies incluidas en el grupo taxonómico, no se consideran agentes patógenos para el ser humano, sin embargo este agente se llega a utilizar como insecticida para el control de plagas de forma natural. Este agente se ha conseguido aislar de la tierra aledaña a cultivos y ocasionalmente bosques. Los estudios sobre este género están centrados en su uso contra diferentes especies de insectos y su impacto en los ecosistemas en donde es introducido este agente(Direccion general de sanida vegetal, 1999). 46 Madurrella mycetomatis La distribución de este agente se encuentra delimitado geográficamente por las condiciones climatológicas; los puntos focales que caracterizan esta zona se encuentran en el tópico de cáncer y aéreas vecinas a él, las condiciones climatológicas que propician la presencia de este agente son principalmente precipitaciones pluviales entre los 500 – 1000 mm y temperaturas que oscilan entre los 10- 20°C y 20-40°C. En Méxicola presencia de este agente se reporta principalmente en Guerrero-Morelos, norte de Veracruz, San Luis Potosí y sur de nuevo león y sur de Sinaloa. (Bonifaz A. 2010) Este agente es un hongo filamentoso que se encuentra en el suelo o restos vegetales, la vía de infección se genera por medio de traumatismos con material infectado principalmente en las extremidades inferiores; la infección y evaluación clínica se centran principalmente en las lesiones y estudio de las mismas por cortes histológicos o cultivo de fragmentos de la misma; debido a su bajo crecimiento y desarrollo, la aparición de las primeras lesiones puede tomar de meses hasta años posterior a su inoculación(bonifaz A, 2012) DERMATOFITOS Se consideran agentes cosmopolitas aunque su presencia es más común en climas cálidos y húmedos, a pesar de esto existen especies de que se encuentran restringidas a zonas y poblaciones en específico T. violaceum y T. shoenleinii en oriente y Europa T. concentrcum. En India, China, Polinesia, Centro y Sudamérica Por lo que respecta a México y Latinoamérica los cinco dermatofitos más frecuentes son T.rubrum (70%), T, mentagrophytes (10%), t tonsurans (3%) t verrucosum y t concentricum. (3% considerando los dos 46ltimos). Los dermatofitos son en potencia ubicuos y pueden desarrollarse con distintos tipos de nutrientes desde escasos hasta muy elaborados. Existen hipótesis sobre 47 su habitad y origen pero se sugiere que aparecieron y se adaptaron al suelo desde la era paleozolica. El fenómeno de pleomorfismo es bastante común en los dermatofitos, esto genera problemas en los ceparios y la enseñanza ya que genera la perdida de de cepas (Bonifaz A). Acremonium sp (Cephalosporium sp) Los hongos ubicados en este género se consideran cosmopolitas y se aíslan con frecuencia de desechos vegetales y de diferentes suelos cultivados o sin cultivar. Estos hongos se caracterizan por un crecimiento algodonoso o aterciopelado y con una coloración que va de un tono blanco, amarrillo ha rosado. La importancia de este género se centra en la capacidad de producir cefalosporinas, aunque algunos son patógenos para humanos y animales. Como es el caso de A. falciforme, A.kiliense, A. recifei. El cuadro clínico que producen estos agentes se clasifica dentro de los micetomas, por lo que el agente se conoce como un eumicetoma blanco (Guarro J, 2012). Sporotrichum sp. Este género se considera un agente comensal del medio ambiente y principalmente un contaminante, su presencia se relaciona con restos vegetales en descomposición. En la actualidad la utilización de técnicas de biología molecular ha separado dentro de este grupo de hongos a 11 especies y una eliminado de la misma a una gran numero de las mismas. Basidiobolus ranarum Agente etiológico de la basidiobolomicosis, este agente se ha logrado aislar de restos vegetales, el tracto intestinal de anfibios y excretas de murciélagos; su distribución geográfica lo centra en zonas de climas cálidos con una alta precipitación pluvial, en América la mayor incidencia de la infección se genera en 48 .Se caracteriza por la formación de lesiones tumorales de localización subcutánea y ocasionalmente diseminación a ganglios y veceras. Existen tres tipos de formas clínicas en la que se presenta la enfermedad; la forma cutánea es la de mayor reporte, se caracteriza por la formación de pequeños nódulos planos durante las primeras fases, que posteriormente pasan a forman nódulos subcutáneos de gran tamaño, la fase gastrointestinal es de las mas reciente y ocasionalmente se ha llegado a confundir con apendicitis, colitis, y masas intraabdominales de proceso maligno. La basidiobolomicosis pulmonar es una entidad excepcional generada por la inhalación de las esporas, este proceso requiere un inoculo pesado sin importar la respuesta inmune del hospedero (Bonifaz A, 2012). Aspergillus fumigatus Hongo filamentoso causante de gran parte de las aspergilosis. Este género se considera cosmopolita ya que se ha reportado en gran parte de mundo; entre los reservorios presentes en la naturaleza se encuentran restos vegetales, el suelo, alimentos en descomposición y se ha relacionado con el aire acondicionado. Entre las formas clínicas que puede presentar el ser humano se encuentran en primer lugar las afecciones pulmonares, sinusitis alérgica, otomicosis y onicomicosis.los procesos de inoculación en el caso de las vías respiratorias es la inhalación de esporas mientras que en las afecciones cutáneas o keratoliticas se generan por inoculación o contacto con las esporas del agente (Bonifaz A, 2012). Verticilium sp Los agentes pertenecientes a este género se consideran contaminantes ambientales y principalmente patógenos de plantas y frutos. Dentro de las características de este grupo de hongos presenta un micelio algodonoso que puede ser de una gran cantidad de colores. A nivel microscópico se caracteriza por hifas delgadas con fialidez en forma de punzo. Scopulariopsis sp. 49 El género scopulariopsis es un grupo de hongos filamentosos asilados comúnmente de suelos, material vegetal e insectos; generalmente se considera un contamínate ambiental aunque en los últimos años se ha presentado un aumento de micosis en el ser humano. Entre las afecciones relacionadas encontramos a la onicomicosis, lesiones dérmicas, queratinitis, sinusitis invasora, endocarditis e infecciones invasoras en pacientes graves o que presentan alguna inmunosupresión. Junto con esto se ha observado la presencia de una gran resistencia de este género ante antimicóticos (Domsch et al. ,1993). Mucor sp Este agente es clasificado dentro del Subphylum Mucoromycotina, se considera un agente cosmopolita aunque su mayor incidencia se encuentra en climas cálidos y húmedos. Se aísla con frecuencia de del suelo, material en descomposición, frutos y en especial de pan de trigo y centeno; se considera que la principal vía de entrada es la respiratoria, seguida por la oral y la cutánea. A pesar de ser una afección extraña ha tomado relevancia en las últimas décadas por su relación con enfermedades y procesos de inmunosupresión así como su incidencia en pacientes diabéticos descompensados (Bonifaz A, 2012) Otros hongos patógenos relacionados con las cuevas Debido a la gran presencia de vectores, sedimentos, nutrientes y microambiente presente en las cuevas se han relacionados a diversos hongos con estas, en algunos casos se ha considerado la cercanía de una población o realización de actividades relacionadas con estas como factor de infección Histoplasma capsulatum Agente etiológico de la histoplasmosis, también conocida como enfermedad de las cavernas o de los espeleólogos; se relaciona directamente con el guano de los murciélagos y en algunos casos con la excretas de las aves infectadas. Se 50 considera un agente casi cosmopolita, aunque se han observado un aumento de casos en climas tropicales y subtropicales, en al caso de México se considerar las zonas de mayor prevalencias los estados de Campeche, Tabasco y Chiapas. Otros focos igual de importantes son los de los estados de Veracruz, Guerrero, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo León y Tamaulipas (Bonifaz A, 2012). Ilustración30. Distribución mundial de la histoplasmosis (Bonifaz A, 2012) Este agente se ha llegado a aislar de restos vegetales, en el suelo, excremento de aves domesticas pero principalmente del guano de murciélagos; este último se considera el vector principal de la enfermedad. Paracoccidioides brasiliensis Agente etiológico de la paracoccidiomicosis, infección sistémica restringida solo a América; se distribuye desde el centro de México hasta el sur del continente donde confluyen los ríos Uruguay y Paraná. En el caso de México se han reportado casos en diferentes estados pero los más importantes son Veracruz(Fortin- Orizaba) y Chiapas (Huixtla-Tapachula); se desconoce el nicho ecológico del hongo aunque se ha logrado aislar en algunas ocasiones del suelo, se ha 51 relacionado la presencia de este agente con ambientes con una alta acidez en el suelo, un precipitación fluvial entre 900 y 2,000m y una temperatura entre 17 a 24°C (Bonifaz A, 2012). 52 Referencias Bonifaz Trujillo, A. (2012). Micología médica básica. 4ed.mexico: Mc Graw Hill Cepero de Garcia, M. (2012). Biología de hongos. Bogotá. 1 edición. Universidad de los Andes. Hernández molina, J, (1998) aislamiento de telomorfos en muestras clínicas. Revista iberoamericana de micología. Vol. 20. pp. 235- 245 Delfin P, Ochoa J, Castillo C. Orengelns A. (2011). Santuario de fauna silvestre cuevas de Paraguana, Venezuela: lineamientos técnicos para su diseño. Vol 27 (41). pp. 13 – 45 Alcala L, Muñoz P, Pelaez T, Bouza E. 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