Produccion-de-inulinasas-utilizando-jugo-de-agave-tequilana-weber-var -azul-como-sustrato

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 PRODUCCIÓN DE INULINASAS UTILIZANDO JUGO 
 DE Agave tequilana Weber COMO SUSTRATO. 
 
 
 T E S I S 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
 PRESENTA 
 BLANCA ESTELA GARNICA GARCÍA 
 
 
 MÉXICO, D.F. AÑO 
 
JURADO 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE 
VOCAL 
SECRETARIO 
1er. SUPLENTE 
2do. SUPLENTE
 
RAÚL GENARO AGUILAR CABALLERO 
MARÍA DEL CARMEN WACHER RODARTE 
ABEL BLANCAS CABRERA 
FRANCISCO RUÍZ TERÁN 
MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS, UNIDAD DE 
BIOPROCESOS. UNAM. 
 
 ASESOR DEL TEMA SUPERVISOR TÉCNICO 
 
 
 ___________________________________ ____________________________________ 
 Ing. Abel Blancas Cabrera Biól. Jesús Villegas Cruz 
 
 
 
 
SUSTENTANTE 
 
 
 
 
______________________________________ 
Blanca Estela Garnica García 
 
 
ÍNDICE 
 
 
 
 
INDICE 
 
 Pág. 
 
CAPÍTULO I. RESUMEN 1 
CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN 3 
CAPÍTULO III. GENERALIDADES 6 
 3.1 Los Agaves y su Importancia Económica 6 
 3.2 Características del Agave tequilana Weber var. Azul 8 
 3.3 El Potencial del Agave tequilana para la Producción de 
Enzimas Comerciales 
 
10 
 3.4 Características de los Hongos y del Género Aspergillus 12 
 3.5 Efecto del Nitrógeno en las Células y en la Producción 
de Inulinasas 
 
16 
 3.6 Efecto de algunos Iones sobre la Producción Enzimática 19 
 3.7 Características de la Enzimas y su Importancia 21 
 3.8 Producción de las Inulinasas 24 
 3.9 Los Fructanos como Sustancias de Reserva 26 
 3.10 Características de la Inulina 27 
 3.11 Importancia de la Inulina, Agavinas y 
Fructooligosacáridos (FOS) como Prebióticos 
 
30 
 3.12 El Potencial de los Fructanos para la Producción de 
Biocombustibles 
 
33 
ÍNDICE 
 
 
 
 
CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS 
 
36 
 
CAPÍTULO V. OBJETIVOS 
 
37 
 5.1 OBJETIVO GENERAL 37 
 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 37 
CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
38 
 6.1 Aspergillus niger CH – A – 2010, microorganismo 
productor de inulinasas 
 
38 
 6.2 Elaboración de los Medios de cultivo 38 
 6.2.1 Reactivos Utilizados 38 
 6.2.2 Formulación del Medio de Cultivo para la 
Propagación de la Cepa 
 
38 
 6.2.3 Método para la Conservación de la Cepa 39 
 6.2.4 Medios de cultivo a nivel de matraz Fernbach 
para la producción de inulinasas de Aspergillus 
niger CH – A – 2010 
 
 
39 
 6.2.5 Medios de cultivo para fermentaciones de 2, 10 
y 12 L para la producción de inulinasas de 
Aspergillus niger CH – A – 2010 
 
 
40 
 6.3 Propagación del hongo Aspergillus niger CH – A – 2010 40 
 6.4 Proporción de Inóculo en los Medios de Cultivo 40 
 6.5 Tratamiento de la Fuente de Carbono: Jugo de Agave 
tequilana 
 
41 
 6.6 Fermentaciones y muestreo 41 
 6.7 Obtención de filtrados enzimáticos 41 
 6.8 Ensayo para la determinación de la actividad inulinolítica 42 
 6.9 Diseño Factorial para la Producción de Inulinasas 42 
ÍNDICE 
 
 
 
 
 6.10 Evaluación de algunos Iones sobre la Producción de 
Inulinasas 
 
 
44 
 6.11 Evaluación del Jugo de Agave sobre la Producción de 
Inulinasas 
 
44 
 6.12 Diagrama general de trabajo 45 
CAPÍTULO VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 46 
 7.1 El jugo de Agave tequilana Weber var. Azul como 
Fuente de Carbono para la Producción de Inulinasas de 
Aspergillus niger CH– A – 2010. 
 
 
 
46 
 7.2 Efecto del jugo de Agave tequilana sobre la Producción 
de Inulinasas de la cepa Aspergillus niger CH – A – 
2010 cuando es suplementado con Fuentes de 
Nitrógeno Orgánico a nivel de Matraz Fernbach 
 
 
 
47 
 7.3 Efecto de la harina de soya sobre la producción de 
inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 a nivel de 
fermentador de 2 y 12 L 
 
 
49 
 7.4 Efecto del extracto de levadura sobre la producción de 
inulinasas de A. niger CH – A – 2010 en fermentador 
con 2 L de medio de cultivo 
 
 
50 
 7.5 Producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 con 
las diferentes condiciones propuestas en el diseño 
factorial 
 
 
51 
 7.6 Efecto del extracto de levadura sobre la producción de 
inulinasas de A. niger CH – A - 2010 en fermentador de 
10 L 
 
 
56 
 7.7 Efecto de la adición de sulfato de magnesio sobre la 
producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 
2010 en fermentador de 2 L cuando se utiliza extracto 
de levadura como fuente de nitrógeno 
 
 
 
57 
ÍNDICE 
 
 
 
 
 7.8 Efecto de la mezcla de micronutrientes sobre la 
producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 a 
nivel de matraz Fernbach cuando se utiliza jugo de 
agave adicionado con extracto de levadura como fuente 
de nitrógeno 
 
 
 
 
58 
 7.9 Evaluación del efecto de la peptona de caseína sobre la 
producción inulinolítica de A. niger CH – A – 2010, en 
cultivos sumergidos a nivel de fermentador de 2 L, 
cuando se utiliza jugo de agave como fuente de carbono 
 
 
 
59 
 7.10 Efecto del jugo de agave sobre la producción de 
inulinasas en fermentador de 2 L utilizando extracto de 
levadura como fuente de nitrógeno 
 
 
61 
 7.11 Efecto del jugo de agave sobre la producción de 
inulinasas de A. niger CH – A – 2010 en fermentador de 
2 L cuando se utiliza peptona de caseína como fuente 
de nitrógeno 
 
 
 
62 
CAPITULO VIII. CONCLUSIONES 
 
 64 
 
CAPITULO IX. PERSPECTIVAS 
 
 66 
CAPITULO X. BIBLIOGRAFÍA 
 
 67 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
1 
 
CAPÍTULO I. RESUMEN 
El cultivo de Agave tequilana Weber var. Azul es importante en México porque es la 
única planta permitida por la NOM – 006 – SCFI – 1994 para la producción de 
tequila. Estudios realizados a estas plantas, muestran que su material de reserva 
está conformado principalmente por mezclas complejas de fructanos ramificados, 
los cuales, se encuentran unidos entre sí mediante enlaces β-2,1 y también β-2,6 
glicosídicos, por lo que esta característica, ha llevado a renombrar a estos fructanos 
como agavinas. 
De acuerdo con las características de las agavinas, se han realizado estudios sobre 
su potencial para la producción de enzimas de interés biotecnológico, dentro de las 
cuales destacan las inulinasas. Las aplicaciones de estas enzimas microbianas 
podrían abarcar desde la elaboración de alimentos y bebidas, hasta la obtención de 
azúcares reductores para la producción de bioetanol. 
Por otra parte, se ha observado que los microorganismos más empleados para 
producir inulinasas, son los del género Kluyveromyces spp. y Aspergillus spp. La 
cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger utilizada en el presente estudio, fue 
aislada de un campo de cultivo de agave en el estado de Jalisco y en un estudio 
previo se mostró que es capaz de producir inulinasas extracelulares en cultivos 
sumergidos cuando se utilizan pencas de agave como fuente de carbono 
adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno y fosfatos, las cuales 
generaron un nivel de actividad de 1.48 U/mL. 
Adicionalmente, otros estudios han demostrado que es posible incrementar el nivel 
de actividad de las inulinasas extracelulares de algunas cepas de Kluyveromyces 
sp., tales como: Kluyveromyces sp. Y-85 y K. marxianus YS-1, utilizando diferentes 
sustratos como son: extracto de Alcachofa de Jerusalén en la primera cepa y 
extractos de la raíz de Asparagus racemosus ó inulina extraída de tubérculos de 
Dalia en la segunda. En todos los casos, se observó que las fuentes de nitrógeno 
orgánico favorecen la producción de inulinasas, especialmente los extractos de 
carne, cuando se comparan con algunas fuentes de nitrógeno inorgánicas, dentroRESUMEN 
 
 
2 
 
de las que se encuentran el cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de 
amonio, nitrato de sodio y urea (Singh, et al., 2007). 
En este trabajo, se evaluó la producción de inulinasas extracelulares de Aspergillus 
niger CH – A – 2010 en cultivo en lote sumergido a nivel de matraz Fernbach con 1 
litro de medio de cultivo, utilizando jugo de Agave tequilana Weber var. Azul como 
fuente de carbono adicionado con diferentes fuentes de nitrógeno orgánico como: 
agua de cocimiento de maíz, extracto de levadura, harina de soya y peptona de 
caseína, en tanto que la fuente de nitrógeno inorgánico utilizada fue el sulfato de 
amonio, además del uso de fosfatos en todos los casos. 
Se estableció que a nivel de matraz Fernbach el jugo de agave puede ser utilizado 
como fuente de carbono, ya que la producción de inulinasas cuando se utilizó 
sulfato de amonio como fuente de nitrógeno fue de 0.98 U/mL. Por otra parte, se 
observó que las fuentes de nitrógeno orgánico incrementaban el nivel de actividad 
de las inulinasas en la cepa utilizada, siendo la harina de soya la fuente con la cual 
se obtuvo el mayor nivel de actividad inulinolítica (4.9 U/mL) entre las fuentes 
evaluadas. Posteriormente, se evaluó la producción de inulinasas bajo las 
condiciones anteriores en fermentadores con 2 y 12 L de medio, en los cuales se 
obtuvieron actividades máximas de 0.6 y 1.17 U/mL respectivamente. 
Adicionalmente, se elaboró un experimento factorial 23, en el cual se valoraron dos 
niveles de tres condiciones del cultivo que fueron: la velocidad de agitación, la 
concentración de la fuente de carbono (jugo de agave) y de la fuente de nitrógeno 
(extracto de levadura). Con dicho experimento, se estableció que la formulación del 
medio de cultivo que permite incrementar la producción de inulinasas de Aspergillus 
niger CH – A – 2010 con respecto a las otras condiciones evaluadas en el presente 
estudio, consta de jugo de agave como fuente de carbono al 1% suplementado con 
extracto de levadura como fuente de nitrógeno al 1% y 300 RPM de agitación, 
obteniendo un nivel de actividad inulinolítica de 5.4 U/mL hacia las 120 h de cultivo, 
esto es 5.51 veces mayor a la actividad encontrada cuando se utilizó el sulfato de 
amonio como fuente de nitrógeno. 
INTRODUCCIÓN 
 
 
3 
 
CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN 
A partir de la segunda mitad del siglo XX se introdujeron en la industria alimentaria 
los jarabes de fructosa obtenidos del maíz. En los últimos años se ha observado 
que la fructosa juega un papel importante debido a que tiene un bajo costo, es un 
producto estable, resalta sabores y colores, es un azúcar GRAS (generalmente 
reconocido como seguro) y su poder endulzante es aproximadamente 1.5 – 2 veces 
mayor que el de la sacarosa. Dichas características hacen que estos azúcares sean 
ampliamente utilizados en muchos alimentos y bebidas. En este sentido se 
destacan los fructanos, nombre genérico que se da a compuestos constituidos por 
largas cadenas de moléculas de fructosa unidas químicamente, y que pueden tener 
diferentes tipos de enlace, en el caso de la inulina son β-2,1-glicosídicos; mientras 
que en la levana son β-2,6-glicosídicos, en tanto que las agavinas contienen ambos 
tipos de enlaces. Estas moléculas constituyen el reservorio energético de una 
amplia diversidad de plantas, dentro de las que se incluyen: las raíces de Dientes 
de León y de Achicoria, los tubérculos de la Alcachofa de Jerusalén y de Dalia, los 
bulbos de Iris y los tallos o “piñas” de los agaves (Rocha, 2006; González-González, 
et al. 2007). 
Debido a que el Agave tequilana Weber var. Azul es una planta abundante y barata, 
es muy importante en México como materia prima para la producción de tequila, ya 
que posee un alto contenido de fructanos dentro de los que destacan las agavinas. 
A partir de dichos fructanos es posible generar otros productos con valor agregado, 
como es el caso de las inulinasas, que son enzimas útiles para obtener 
fructooligosacáridos (FOS). Los FOS podrían ser incorporados como ingredientes 
activos en los alimentos funcionales, pues son considerados sustancias prebióticas 
que se caracterizan por ser carbohidratos no digeribles para el intestino humano 
además de estimular selectivamente el crecimiento o la actividad de 
microorganismos probióticos benéficos, previniendo así enfermedades 
gastrointestinales e inflamatorias (Bautista, 2001; Jing, 2003; Stewart, 2008). 
INTRODUCCIÓN 
 
 
4 
 
Otro producto que es posible obtener con las inulinasas, son los llamados “jarabes 
de fructosa”, que pueden ser utilizados como sustitutos de la sacarosa por las 
siguientes razones: poseen un alto poder endulzante semejante al de la sacarosa, 
hay una disminución de costos, mayores rendimientos y existe una amplia 
disponibilidad de materias primas (Chen, 2011). 
Las inulinasas se clasifican como endo – inulinasas, cuando actúan sobre los 
enlaces internos de la molécula de inulina produciendo inulo – oligosacáridos, 
mientras que las exo – inulinasas cortan las unidades de fructosa en el extremo 
terminal de la cadena liberando monómeros de fructosa. Las principales fuentes 
para obtener estás enzimas son las de origen microbiano, sin embargo, los hongos 
producen tanto endo como exo inulinasas extracelulares, lo que facilita los procesos 
de separación y purificación. Es así que los hongos filamentosos del género 
Aspergillus han sido los microorganismos más estudiados. Particularmente la cepa 
Aspergillus niger CH – A – 2010, que fue aislada de un campo de cultivo de agave 
en el estado de Jalisco, demostró ser capaz de producir inulinasas en 
fermentaciones sumergidas cuando se utilizan pencas de agave como fuente de 
carbono, adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno (Rica, 2007; 
Kango, 2008; Stewart, 2008; Huitrón, 2008). 
Por otra parte, se han realizado diferentes investigaciones sobre la influencia de las 
fuentes de nitrógeno adicionadas al medio de cultivo sobre la producción de 
inulinasas de algunos microorganismos, como en el caso de la cepa Kluyveromyces 
marxianus YS-1, en el que se observó que la producción de inulinasas parece 
incrementarse en cultivos donde se utilizan sustratos de inulina extraída de 
tubérculos de dalia ó de extractos de la raíz de Asparagus racemosus, adicionados 
con algunas fuentes de nitrógeno orgánico en comparación con las fuentes de 
nitrógeno inorgánicas evaluadas en dicho estudio. Por otra parte, otro estudio 
demostró que utilizando extracto de alcachofa de Jerusalén como fuente de 
carbono en la cepa Kluyveromyces sp. Y–85, es capaz de producir más inulinasas 
cuando se adicionan fuentes de nitrógeno orgánico, especialmente con extracto de 
carne de cerdo; sin embargo, también se observó un incremento en la actividad 
INTRODUCCIÓN 
 
 
5 
 
cuando se utilizan conjuntamente la urea y el licor de maíz como fuentes de 
nitrógeno en el medio de cultivo, pues se obtiene una mayor actividad inulinolítica 
que las fuentes orgánicas por sí solas (Wei, 1998; Singh, 2006; Singh, 2007). 
Por lo tanto, el jugo de A. tequilana es un inductor en la producción de enzimas con 
actividad inulinolítica a partir de la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger y 
adicionalmente, las fuentes de nitrógeno orgánico incrementan el nivel de actividad. 
La producción de estas enzimas entonces, podría ser de gran valor para la industria 
de los alimentos, debido al potencial que ofrecen para la obtención de 
fructooligosacáridos y jarabes de fructosa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GENERALIDADES 
 
 
6 
 
CAPÍTULO III. GENERALIDADES 
 
3.1 Los Agaves y su Importancia Económica 
 
Los Agaves son plantas endémicas de América de distribución tropical y 
subtropical, frecuentemente presentes en zonas de clima árido, de las que el 
mayor número de especies son originarias de nuestro país. En las figuras 1 y 2 se 
muestra de manerageneral la anatomía de los agaves, que son plantas con 
variación en el tamaño dependiendo de cada especie; están conformadas por 
tallos gruesos y hojas rígidas lineales rodeadas de pequeñas espinas y algunas 
poseen inflorescencia en panícula densamente ramosa (Valenzuela, 2003; 
Verduzco-Martínez, 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig.1. Agave con inflorescencia Fig. 2. Anatomía general de las plantas de agave 
Durante el florecimiento de las culturas mesoamericanas, los agaves o magueyes 
como se les conoce comúnmente, desempeñaron un papel importante para el 
hombre, ya que le proporcionaban alimento, calor, techo, vestido, medicina, 
bebida, eran de uso religioso, de ornato, para muebles, para implementos 
agrícolas, como forrajes y otros usos diversos. 
GENERALIDADES 
 
 
7 
 
En la actualidad, las agavaceas representan un grupo de plantas con gran 
importancia biológica, ecológica y económica del país, dado que muchas especies 
son utilizadas como alimento, en la obtención de fibras para cordelería y textiles, 
como plantas ornamentales y principalmente en la producción de diferentes tipos 
de bebidas alcohólicas. Los agaves comprenden más de 200 especies, de las 
cuales aproximadamente tres cuartas partes se encuentran en México, área 
considerada como el centro de origen del género. 
La producción de bebidas alcohólicas es uno de los sectores industriales más 
exitosos en el mundo. En el caso de México, la bebida alcohólica emblemática que 
cubre una parte importante del mercado nacional es el tequila, que de acuerdo con 
la NOM-006-SCFI-1994 es una bebida alcohólica regional obtenida por destilación 
y rectificación de mostos, derivado de la molienda de las cabezas maduras del 
Agave tequilana Weber var. Azul, previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas 
a fermentación alcohólica con levaduras. Además esta bebida cuenta con 
denominación de origen, lo que significa que el Agave tequilana que es destinado 
para la elaboración de tequila, solamente se produce en un territorio protegido que 
comprende todo el estado de Jalisco y algunos municipios de los estados de 
Guanajuato, Michoacán, Nayarit y Tamaulipas (Vázquez – García, 2007). 
Sin embargo, también se elaboran otras bebidas tradicionales, como el pulque 
(Agave salmiana Otto ex Salm., A. mapisaga Trel., A. atrovirens Karw. Ex Salm., 
A. ferox Koch, A. hookeri Jacobi y A. americana L.), la bacanora (Agave 
angusifolia), el sotol (Dasylirion spp.) y los mezcales (Agave angusifolia, A. 
potatorum, A. salmiana y otras especies). El común denominador de estas bebidas 
es que todas ellas se producen a partir de diferentes especies de agave, siendo 
los fructanos la fuente principal de azúcares fermentables (Valenzuela, 2003; 
Lachenmeier, 2006). 
En las agaváceas existen diferencias interesantes en la estructura de sus 
fructanos, por ejemplo, en el Agave tequilana y Agave americana se había 
reportado la presencia mayoritaria de fructanos tipo inulina lineal, mientras que en 
GENERALIDADES 
 
 
8 
 
Agave veracruz los fructanos predominantes son de tipo levana, sin embargo en 
estudios más recientes se demostró que los fructanos del Agave tequilana no son 
inulinas lineales, sino más bien una mezcla de inulinas y levanas ramificadas. 
Dichas variedades estructurales pueden ser, en buena parte, responsables de las 
diferencias que caracterizan a las bebidas que de ellas se derivan (Olivera, 2007). 
 
3.2 Características del Agave tequilana Weber var. Azul 
En términos generales se cree que los agaves fueron usados para la producción 
de azúcares y fibras mucho antes de la llegada de los españoles. Estas plantas 
son monocotiledóneas y lentas en su crecimiento. Su tamaño varía de mediano a 
grande de 1.70 a 2.00 m de altura, 1.5 m de ancho, decreciendo significativamente 
en tamaño cuando florecen; extendidas radialmente, con tallos gruesos y ovoides. 
Hojas rígidas de 90 a 120 (-140) cm de largo y 8 a 12 cm de ancho, excluyendo el 
margen con dientes, es linear-lanceolada, generalmente azules a azul-verdosas. 
La forma del tallo es más oval en altitudes bajas y húmedas (menores a 1600 m) y 
oval esférica en áreas templadas y altas. Las hojas son elongadas en climas 
calientes sin restricción de humedad y menores en longitud en zonas templadas. 
Las plantas que crecen en predios sombreados (árboles de copa densa y 
construcciones) tienen hojas largas y flexas, con tallos pequeños (15 cm) de color 
verdoso y dificultad para madurar y florecer. Los suelos pobres en materia 
orgánica producen plantas de dimensiones menores (Valenzuela, 2003). 
Entre sus características, destaca la capacidad de acumular altas cantidades de 
fructanos en los tallos o piñas que son polímeros u oligómeros compuestos 
principalmente de unidades de fructosa (Waleckx, 2008). 
Análisis realizados a las piñas del Agave tequilana Weber var. Azul, muestran que 
es una planta que contiene la mayor cantidad de fructanos (20 – 24%), comparada 
con otras variedades como Carpintero, Pata de mula, Bermejo, Zopilochino, Sihuin 
GENERALIDADES 
 
 
9 
 
y chato (14.3 a 19.8%), por lo que es una materia prima perfecta para obtener 
fructanos de alta pureza (Bautista, 2001; Praznik, 2003). 
En la tabla 1 se muestra la composición de la piña de Agave tequilana 
determinada por métodos de la AOAC (Asociación de Comunidades Analíticas) y 
en la tabla 2, se muestra el contenido y composición de los carbohidratos 
presentes en la piña de agave, que fueron analizados con técnicas 
cromatográficas y enzimáticas (Gutiérrez, 2011). 
 
Tabla 1. Composición del Agave tequilana Weber var. Azul (Praznik et al, 2002) 
 
Determinación Piña y base de la penca (%) Penca zona media (%) 
Materia seca 31 -31.5 17.4 
Proteína 1.3 – 1.4 0.35 
Minerales 1.7 – 1.9 0,7 
Fibra dietética insoluble 5.9 – 7.1 6.8 
Carbohidratos 22.3 – 22.7 9.0 
 
 
Tabla 2. Composición aproximada de los carbohidratos en Agave tequilana Weber var. Azul 
(Praznik et al, 2002). 
Determinación 
Piña y base de la 
penca (%) 
Penca zona media (%) 
Monosacáridos (Glu – Fru) Ausentes 5.2 
Sacarosa 0.5 – 1.3 9.3 
Fructooligosacáridos DP 3 – 10 35 – 43 60 
Fructooligosacáridos DP 11 – 60 56 – 64 30 
 
Particularmente el Agave tequilana Weber var. Azul, es una de las especies 
mexicanas más importantes, no solo por ser la única planta permitida para la 
producción del tequila, sino porque también es una potencial fuente de prebióticos, 
ya que un estudio reveló que en las piñas de A. tequilana, se encuentran mezclas 
GENERALIDADES 
 
 
10 
 
complejas de fructooligosacáridos ramificados, conformados por enlaces β-2,1, 
pero también β-2,6. Esta característica, ha llevado a renombrar a estos fructanos 
como agavinas y en la figura 3 se muestra su estructura (López, 2003; Mancilla-
Margalli, 2006). 
 
 
 
 
 Fig. 3. Estructura de los fructanos encontrados en plantas de Agave tequilana 
 Weber var. Azul de 8 años de edad propuesta por López, et al 2003. 
 
 
3.3 El Potencial del Agave tequilana para la Producción de Enzimas 
Comerciales 
Debido a la composición de carbohidratos en el Agave tequilana, se ha 
investigado el potencial uso de esta planta como sustrato para la producción de 
enzimas de importancia comercal. 
Una investigación demostró que las cepas de Aspergillus niger CH – A – 2010 y 
CH – A – 2016, aisladas de un campo de cultivo de agave en el estado de Jalisco, 
son capaces de producir algunas enzimas de interés, tales como: inulinasas, 
GENERALIDADES 
 
 
11 
 
xilanasas, celulasas, exo y endo pectinasas principalmente, en cultivos 
sumergidos a nivel de matraz con 500 mL de medio, cuando se utilizan las pencas 
del Agave tequilana como sustrato (fuente de carbono) adicionadas con sulfato de 
amonio como fuente de nitrógeno y fosfatos. 
A continuación se muestra en la tabla 3 que en el caso de la cepaCH – A – 2016, 
existe mayor producción de xilanasas y endo – pectinasas con 1.52 U/mL y 2.7 
RFU respectivamente, mientras que la cepa CH – A – 2010, demostró ser capaz 
de excretar en su mayoría inulinasas con 1.48 U/mL (Huitron, 2008). 
 
Tabla 3. Actividades enzimáticas extracelulares producidas por los hongos aislados de los 
desperdicios de Agave tequilana. 
 
Por otra parte, se han establecido las condiciones de cultivo bajo las cuales el 
hongo A. niger CH – A – 2010 es capaz de producir enzimas en cultivos 
sumergidos a nivel de fermentador de 10 L cuando se utilizan pencas de Agave 
tequilana como fuente de carbono, adicionadas con sulfato de amonio como 
fuente de nitrógeno y fosfatos. Se obtuvieron extractos enzimáticos crudos con 
actividad de inulinasas que permitieron evaluar su capacidad de hidrólisis sobre 
sustratos ricos en fructanos como penca de agave, fructanos de agave en polvo y 
nanofiltrados, inulina de achicoria y jugo de agave, y se determinó que el nivel de 
las enzimas producidas por el hongo es muy semejante al de las enzimas 
comerciales (Gutiérrez, 2011). 
 
 
GENERALIDADES 
 
 
12 
 
3.4 Características de los Hongos y del Género Aspergillus 
Entre los organismos eucariotas, las especies más conocidas en el trabajo de la 
biotransformación son las levaduras y los mohos. Como organismos eucariotas, 
los hongos poseen núcleo y muchos organelos citoplasmáticos tales como: 
retículo endoplasmático, componentes del citoesqueleto y mitocondrias. La pared 
celular está constituida principalmente por quitina y en menor medida por celulosa, 
son organismos inmóviles que no contienen clorofila y se pueden reproducir 
sexual o asexualmente mediante las esporas. 
Muchos hongos filamentosos están naturalmente adaptados al crecimiento sobre 
superficies de diferentes sustratos, la mayoría son aerobios y algunos son 
anaerobios facultativos; no se conocen hongos anaerobios estrictos. Su tamaño 
celular es mayor que el de las bacterias, teniendo una anchura de 4 – 20 µm y 
longitudes de más de 100 µm. Los hongos exhiben como grupo una diversidad de 
posibilidades metabólicas casi tan grande como las bacterias. Su taxonomía se 
basa más en características morfológicas que en reacciones bioquímicas o 
tintoriales. Requieren un contacto cercano con el sustrato debido a su nutrición 
heterótrofa, secreción de enzimas extracelulares y absorción de nutrientes a 
través de la pared celular, muchas especies pueden crecer en medios mínimos 
siempre y cuando exista una fuente de carbono orgánico y nitrógeno en forma de 
NH4
+ ó NO3
-, suelen crecer mejor a pH ácido alrededor de 5.0 y son capaces de 
crecer sobre sustancias con poco contenido de humedad. Muchos necesitan 
determinados aminoácidos y vitaminas para crecer, sin embargo requieren poco 
menos nitrógeno que las bacterias. La mayoría de los hongos viven como 
saprófitos en el suelo y agua donde descomponen principalmente materia vegetal 
y son más resistentes que las bacterias a la presión osmótica, por tanto pueden 
crecer en concentraciones elevadas de azúcar y sal. También algunos de ellos 
pueden hidrolizar las complejas moléculas orgánicas de la madera, hueso, cuero 
curtido, quitina, ceras e incluso plásticos sintéticos (Tortora, 1993; Davis, 1996; 
Lee, 2002; Izarra, 2010). 
GENERALIDADES 
 
 
13 
 
Están conformados por una estructura vegetativa llamada micelio, que es un 
sistema muy ramificado de hifas. Dentro de esas hifas hay una masa móvil de 
citoplasma que contiene muchos núcleos. Los largos y finos filamentos de células 
dentro del micelio llamados hifas pueden formar esporas o conidios asexuales a 
menudo muy pigmentados y resistentes a la desecación, que sirven como forma 
de dispersión del hongo en nuevos hábitats y son considerados el principio y el 
final del desarrollo en el ciclo de los hongos. Una vez formados los conidios, 
cambia el color blanco del micelio adquiriendo distintos tonos de verde, pardo, 
amarillo, blanco, gris y negro, dicha coloración es la principal característica 
macroscópica para la identificación de los grupos de Aspergillus. Cuando las 
esporas latentes encuentran un lugar conveniente en el medio ambiente, 
comienza el proceso de germinación. 
Las cabezas conidiales presentan bajo el microscopio las formas básicas: globosa, 
radiada y columnar o claviforme como se muestra en la figura 5 y a simple vista 
las más grandes suelen parecer diminutos alfileres sobre el sustrato (Carrillo 2003; 
Herrera, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5. Estructura de los hongos del género Aspergillus spp. 
GENERALIDADES 
 
 
14 
 
Estos Aspergillus, son uno de los géneros más importantes de mohos a nivel 
industrial. La mayoría de los productos útiles de estos organismos son algunos 
medicamentos, ácidos orgánicos y enzimas (Lee, 2002) 
Este género, se encuentra dentro de la división Eumycota, subdivisión 
Deuteromycotina, clase Hyphomycetes, orden Moniliales y familia Moniliaceae. 
Incluye todos los hongos imperfectos que producen sus conidios en conidióforos 
hialinos, o directamente de hifas hialinas no diferenciadas en conidióforos. Se han 
descrito aproximadamente 200 especies y una gran cantidad de variedades. Los 
conidióforos de Aspergillus terminan en un hinchamiento llamado vesícula que en 
conjunto con las cadenas de conidios se le conoce como cabeza conidial. 
Aspergillus es de los hongos que presentan una mayor distribución geográfica, 
encontrándose desde las regiones árticas hasta el Ecuador. El aire y el suelo de 
casi cualquier parte del mundo contienen los conidios de diferentes especies. Son 
los hongos más omnívoros que existen, capaces de asimilar como alimento una 
enorme variedad de sustancias, debido al número de enzimas que pueden 
producir para degradarlas. Los dos requisitos principales que deben tener los 
diferentes sustratos para que se desarrollen estos hongos, son la presencia de 
algún tipo de materia orgánica y un poco de humedad; si ambos factores están 
presentes, los aspergilos pueden crecer casi en cualquier sustancia, sin embargo 
también debe existir nitrógeno ya sea como ion amonio o como nitrato ya que es 
un componente específico de proteínas y ácidos nucleicos como moléculas 
complejas que intervienen en la elaboración de materia viva. 
Debido a las grandes actividades enzimáticas que presentan los Aspergillus, 
varias especies son utilizadas en diversos procesos industriales para la 
elaboración comercial de productos que abarcan desde ácidos orgánicos hasta 
enzimas, antibióticos y alimentos fermentados de varias clases, éstos últimos 
principalmente en países orientales. Por ejemplo los ácidos cítrico y glucónico son 
sintetizados en una escala industrial utilizando cultivos seleccionados de A. niger 
(Herrera, 2004) 
GENERALIDADES 
 
 
15 
 
Entre las fuentes microbianas, son un grupo de mayor interés industrial en la 
producción de enzimas. Particularmente Aspergillus niger es uno de los 
microorganismos más utilizados para dicha producción a nivel industrial, debido a 
sus altos niveles de secreción de proteínas, lo que posibilita la producción a gran 
escala, sus productos son generalmente considerados como GRAS (generalmente 
reconocido como seguro), lo que permite su aplicación en la industria de alimentos 
tanto para el hombre como para los animales y cuenta con una amplia capacidad 
metabólica para la utilización de diversos sustratos. Por lo que desempeña un 
papel importante en el campo de la biotecnología. Estos hongos, son la fuente 
más importante del mundo para la producción algunas enzimas como las 
pectinasas, proteasas, amiloglucosidasas, celulasas, hemicelulasas y lipasas 
aunque también se ha observado que pueden secretar inulinasas (Huitron, 2008; 
Driouch, 2010; Izarra, 2010). 
El sistema de cultivo más empleado en la producción de enzimas comerciales es 
por fermentación sumergida. En este aspecto,la producción de enzimas con 
hongos filamentosos en procesos biotecnológicos a menudo se correlaciona con la 
morfología, la cual es de crucial importancia para lograr una mayor producción. 
Los factores que afectan la morfología incluyen el tipo y concentración de la fuente 
de carbono, la concentración del inóculo, los niveles de hidrógeno, fósforo y otros 
minerales traza, el O2 y CO2 disueltos, el pH y la temperatura, y factores físicos 
como geometría del fermentador, tipo de agitación, aireación y sistema de cultivo. 
Las principales morfologías desarrolladas por los hongos Aspergillus en los 
sistemas de fermentación sumergida, corresponden al crecimiento tipo pellet, que 
se caracteriza por ser una esfera de micelio y el crecimiento micelial o filamentoso 
que a menudo parece favorable y se considera como requisito previo para 
garantizar una alta productividad y rendimiento debido a que esta conformación 
permite un mayor suministro de oxígeno a las células para estimular el crecimiento 
y la producción (Papagianni, 2004; Driouch, 2010). 
 
GENERALIDADES 
 
 
16 
 
3.5 Efecto del Nitrógeno en las Células y en la Producción de Inulinasas 
Los principales elementos necesarios para la vida son; hidrógeno, oxígeno, 
carbono, nitrógeno, fósforo y azufre; éstos se pueden unir de varias maneras para 
formar moléculas de vida. 
Una característica importante de las células es su capacidad para llevar a cabo 
reacciones químicas y organizar sus moléculas para formar estructuras 
específicas. Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas 
y agua, y éstas macromoléculas a su vez, se componen de unidades más 
pequeñas denominadas monómeros. En esencia, la nutrición microbiana consiste 
en suministrar a la célula los ingredientes químicos (nutrientes) que necesitan para 
sintetizar monómeros. Diferentes organismos requieren diferentes tipos de 
nutrientes y a menudo los requerimientos son específicos. Además, no todos los 
nutrientes se requieren en las mismas cantidades; algunos llamados 
macronutrientes se precisan en grandes cantidades, tal es el caso del carbono y 
del nitrógeno. 
El carbono es el principal elemento de todas las clases de macromoléculas, en 
una célula típica constituye el 50% en peso seco. Después del carbono, el 
siguiente elemento más abundante en la célula es el nitrógeno. En una bacteria 
típica alrededor del 12% de su peso seco es nitrógeno, este elemento es 
importante como componente estructural de proteínas, ácidos nucleicos y otras 
biomoléculas como las vitaminas. En la naturaleza, el nitrógeno se presenta en 
forma orgánica e inorgánica. Sin embargo, la mayor parte del nitrógeno natural 
disponible está en forma inorgánica, como amoniaco, nitratos o nitrógeno 
atmosférico (N2). 
Sólo un número limitado de microorganismos puede utilizar el N2 mediante un 
proceso denominado fijación de nitrógeno; por lo tanto, el reciclado del nitrógeno 
de la tierra tiene lugar en su mayor parte con las formas más fácilmente 
disponibles, el amoniaco y el nitrato. El amoniaco se produce durante la 
descomposición de los compuestos orgánicos de nitrógeno tales como 
GENERALIDADES 
 
 
17 
 
aminoácidos y nucleótidos a pH neutro y se encuentra en forma de radical amonio 
(NH4
+). (Brock 2004) 
El nitrógeno, se encuentra en los compuestos orgánicos de la célula, 
principalmente en forma reducida como grupos amino, así los microorganismos lo 
toman en diferentes estados de oxidorreducción y también pueden actuar como se 
muestra a continuación: 
Fuente de nitrógeno; en cuyo caso es asimilado e incorporado al material celular, 
lo que ocurre en todos los microorganismos. La mayoría de los microorganismos 
fotosintéticos, muchas bacterias no fotosintéticas y los hongos, asimilan este 
elemento en estado inorgánico oxidado, como nitratos; su utilización implica, por 
tanto, una reducción preliminar; la reducción de nitritos a amoniaco para su 
incorporación al material celular se conoce como reducción asimilatoria de 
nitratos. Algunos microorganismos son incapaces de efectuar esa reducción, por 
lo que este elemento debe ser proporcionado en su forma reducida, como sales de 
amonio o como compuestos orgánicos que los contengan. 
Donadores de electrones; en este caso el amoniaco es oxidado a nitritos y éstos 
a nitratos, y a partir de estas oxidaciones las bacterias nitrificantes obtienen su 
energía. 
Aceptores de electrones; en este caso los nitratos se reducen a nitritos, óxidos 
de nitrógeno y nitrógeno elemental a través de un proceso desasimilatorio 
conocido como desnitrificación. Este proceso se lleva a cabo bajo condiciones de 
anaerobiosis. (Ramírez 2000) 
En cualquier medio de cultivo microbiano, la presencia de cantidad suficiente de 
nitrógeno es de primordial importancia, podría ser complementado en forma 
orgánica o inorgánica. Las fuentes de nitrógeno orgánicas más empleadas para la 
producción de inulinasas son; el extracto de levadura, agua de cocimiento de 
maíz, peptona y extractos de carne entre otros. La influencia de las fuentes de 
GENERALIDADES 
 
 
18 
 
nitrógeno orgánico en la producción inulinolítica ha sido descrita por muchos 
investigadores (Pandey, 1999). 
Citando algunos ejemplos de los efectos del nitrógeno, se encuentran casos como 
la producción de inulinasas por Kluyveromices fragilis estudiada por Snyder y 
Phaff (1960). Estos autores, encontraron que casaminoácidos son excelentes para 
el crecimiento del microorganismo y mejoran la producción enzimática, sin 
embargo, la purificación de estas inulinasas es difícil. En tanto que el uso de 
NH4H2PO4 demostró funcionar bien como amortiguador del medio. 
Con Candida kefyr, los niveles más altos de inulinasas fueron observados cuando 
se utiliza 0.35% de extracto de levadura y 0.2% de urea como una fuente de 
nitrógeno compleja, en un medio que contenía 5% de lactosa y 2% de inulina 
como sustrato. Por otra parte, Kim (1982) probó que un amplio número de fuentes 
de nitrógeno orgánico e inorgánico son efectivas para la producción de inulinasas 
en una cepa de Penicillium sp., sin embargo, la peptona y el licor de maíz 
estimulan dicha producción enzimática, mientras que la urea y el extracto de 
levadura tienen menor influencia. De las fuentes de nitrógeno inorgánicas, el 
(NH4)H2PO4 y el (NH4)2HPO4 dan altas producciones de enzimas, pero 
adicionalmente el sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio, nitrato 
de sodio y nitrato de potasio también fueron responsables en la producción. 
Resultados similares fueron obtenidos por Nakamura et al. (1978) con una cepa 
de Aspergillus niger (Vandamme, 1983). 
Sin embargo, otro aspecto interesante, es que en otras investigaciones recientes 
se ha observado que la producción de inulinasas en la cepa Kluyveromyces 
marxianus YS-1 se incrementó cuando se utilizaron fuentes de nitrógeno orgánico 
en comparación con las de origen inorgánico, cuando se utilizaron sustratos como 
inulina extraída de tubérculos de dalia ó con extractos de la raíz de Asparagus 
racemosus. En esta cepa la fuente de nitrógeno que incrementó la producción 
inulinolítica fue el extracto de carne, sin embargo cuando se valoró una 
concentración mayor de esta fuente se observó un efecto inhibitorio. Por otra parte 
GENERALIDADES 
 
 
19 
 
también se observó que algunas fuentes de nitrógeno inorgánico como son: el 
sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y la urea son inhibidores 
de la síntesis de inulinasas, presumiblemente por la liberación de iones amonio. 
Por otra parte, en 2007 se informó que las fuentes de nitrógeno complejas fueron 
mejores que las fuentes de nitrógeno inorgánico en la producción de inulinasas de 
Chrysosporium pannorum y Kluyveromyces sp. Y-85 (Singh, 2006; Singh, 2007). 
 
3.6 Efecto de algunos Iones sobre la Producción Enzimática 
De manera general, se ha observado que las células utilizanalgunos iones para 
funciones específicas como se mencionará a continuación: El fósforo se presenta 
en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e inorgánicos, y la célula lo 
necesita fundamentalmente para la síntesis de ácidos nucleícos y fosfolípidos. El 
azufre se requiere porque es un componente estructural de los aminoácidos 
cisteína y metionina y porque se presenta en ciertas vitaminas, como la tiamina, la 
biotina y el ácido lipoíco, así como también en la coenzima A. 
El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas 
lo requieren específicamente como por ejemplo, algunas implicadas en la síntesis 
de proteínas. El magnesio funciona como estabilizador de los ribosomas, las 
membranas celulares y los ácidos nucleícos, y también se necesita para la 
actividad de muchas enzimas. 
El calcio en algunos casos, ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene 
una función importante en la termorresistencia de las endosporas. 
En la tabla 3 se muestran otros micronutrientes con las funciones asociadas en las 
células. 
 
 
 
GENERALIDADES 
 
 
20 
 
 
Tabla 3. Micronutrientes asociados a funciones celulares. 
Elemento Función Celular 
Manganeso (Mn) 
Activador de muchas enzimas; presente en algunas superóxido 
dismutasas y en la enzima que rompe el agua en fotótrofos 
oxigénicos. 
Zinc (Zn) 
Anhidrasa carbónica, alcohol deshidrogenasa, RNA y DNA 
polimerasas y muchas proteínas que se unen al DNA. 
Hierro (Fe) a 
Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas de hierro y azufre, 
oxigenasas y todas las nitrogenasas. 
No todos los micronutrientes indicados son requeridos por todas las células; algunos se necesitan sólo en 
microorganismos muy específicos. 
 
a 
Necesario en mayores cantidades que otros metales. Normalmente no se considera elemento traza. 
 
Fuente: Brok et al., Biología de los microorganismos. 
 
El estudio del efecto de la adición de algunos iones sobre la producción de 
inulinasas se ha evaluado en algunas cepas y se ha observado que la adición de 
NaNO3 incrementa dicha producción en Fusarium oxysporum, sin embargo, dicha 
sal, causa un efecto inibitorio en la producción enzimática de Kluyveromyces 
fragilis 
En el caso de la cepa Aspergillus ficum, también se ha estudiado el efecto de 
algunos iones, como fueron: Mg2+ y Zn2+, los cuales favorecen la producción 
enzimática. Sin embargo, también se observo que la adición de otros iones como 
fueron: K+, Ca2+, Cu2+, Fe2+ y Mn2+, inhiben la producción de inulinasas (Pandey, 
et al., 2006). 
Otros estudios muestran que en la levadura Kluyveromyces marxianus, solamente 
Mn2+ (0.1 mM) y Ca2+ (0.5 mM), incrementan la producción de inulinasas, mientras 
que Mg2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, K+, BO3
3- y MoO4
2- no tienen influencia sobre la 
GENERALIDADES 
 
 
21 
 
producción enzimática, sin embargo, altas concentraciones de estos elementos, 
genera un impacto negativo en la síntesis de inulinasas. Fe2+ y Ni2+ disminuyeron 
dicha producción (Singh, 2007). 
En tanto que en la cepa Aspergillus ochraceus, la producción de inulinasas es 
estimulada por la adición de Mn2+, Mg2+, Na+ y Ba2+ y se inhibe con Cu2+ y Hg2+ 
(Guimarães, 2007). 
 
 
3.7 Características de la Enzimas y su Importancia 
Los fenómenos y las transformaciones biológicas han sido utilizados por el hombre 
en forma instintiva y práctica desde los inicios de la humanidad, siendo las 
industrias productoras de cerveza, quesos y similares, la base de la biotecnología 
enzimática, ya que por ellas se descubrió que los procesos biológicos se realizan 
por moléculas de naturaleza proteica conocidas como enzimas. Éstas presentan 
un gran potencial por las siguientes características: 
1. Son muy específicas. 
2. La velocidad de reacción es de dos a tres órdenes de magnitud mayor que 
la de los catalizadores inorgánicos. 
3. Las condiciones de reacción, temperatura y presión son relativamente 
bajas, hace que su uso sea poco costoso (Quintero, 1987). 
Con el propósito de manejar la nomenclatura de forma sistemática, la Unión 
Internacional de Bioquímica constituyó una Comisión cuyos informes, 
complementados con revisiones periódicas, se aceptan actualmente como base 
para la clasificación de enzimas. El sistema está basado en la división de enzimas 
en 6 categorías principales que dependen del tipo de reacción catalizada. Esto se 
muestra en la tabla 4. 
 
GENERALIDADES 
 
 
22 
 
 
Tabla 4. Clasificación de las enzimas en base a las reacciones que catalizan 
Clase Tipo de reacción 
 
Oxidorreductasa 
 
Oxidorreducción en la que se gana o se pierde oxígeno e 
hidrógeno. 
 
Transferasa Transferencia de grupos funcionales, como amino, 
acetilo o fosfato. 
 
Hidrolasa Hidrólisis (adición de agua). 
 
Liasa Eliminación de grupos de átomos sin hidrólisis. 
 
Isomerasa Reorganización de átomos dentro de una molécula. 
 
Ligasa Unión de dos moléculas con energía procedente de la 
rotura de ATP. 
 
Fuente: Tortora et al., Introducción a la microbiología 1993. 
 
A cada categoría se le asigna un número EC por sus siglas en inglés <<Enzyme 
Commission>> de 4 dígitos y un nombre sistemático para cada enzima: Todas las 
enzimas pertenecen a uno u otro grupo de los seis principales. El primer dígito 
denota la clase principal, el segundo la subclase en función del tipo de sustrato, el 
tercero la sub-subclase de acuerdo con el requerimiento por coenzima y 
finalmente el cuarto número hace referencia a la reacción que cataliza (Lee, 2002; 
García, 2004) 
Las enzimas obtenidas de fuentes microbianas pueden ser clasificadas en tres 
campos de aplicación: las que se pueden utilizar para sintetizar compuestos útiles, 
GENERALIDADES 
 
 
23 
 
por ejemplo la renina, la fumarasa ó la aminotransferasa, otras que pueden llevar 
a cabo reacciones importantes de bioconversión debido a que son 
estereoespecíficas, tales como: las transferasas, pectinasas e invertasas y otro 
campo de aplicación lo ocupan algunas otras enzimas que son capaces de 
hidrolizar los polímeros en monómeros interesantes, como es el caso de la 
pululanasa, α y β – amilasa, lactasa e inulinasa. Todas estas reacciones pueden 
ser desarrolladas bajo condiciones óptimas con recursos renovables como 
sustrato (Vandamme, 1983; García, 2004). 
Para la producción comercial de una enzima, se consideran algunos factores 
como son: el microorganismo a utilizar, la viabilidad económica, la toxicidad 
química relacionada con la actividad de la enzima, las reacciones alérgicas, los 
rendimientos y la materia prima entre otros. 
Los microorganismos producen una enorme gama de enzimas potencialmente 
útiles, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular. Por otra parte, son 
capaces de desarrollarse fácil y rápidamente en su medio de cultivo y la tecnología 
al respecto a gran escala se encuentra hoy bien establecida. 
Las enzimas extracelulares poseen tres ventajas. La primera es que dado a que la 
molécula es segregada fuera de la célula, no se requieren técnicas de ruptura 
celular, técnicas que a veces son difíciles de aplicar a gran escala, la segunda es 
que el número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es 
relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla amplia de 
sustancias, que incluye otras proteínas y materiales contaminantes, tales como los 
ácidos nucleicos y la tercera es que las enzimas extracelulares suelen presentar 
una estructura más compacta y son menos susceptibles a la desnaturalización que 
las enzimas intracelulares. En consecuencia se prefiere el uso de 
microorganismos que segregan enzimas (Gasesa, 1990). 
 
 
GENERALIDADES 
 
 
24 
 
 3.8 Producción de las Inulinasas 
Las inulinasas, son fructofuranosil hidrolasas que pueden fragmentar a la molécula 
de inulina y son producidas por muchos microorganismos incluyendo, bacterias, 
hongos y levaduras. La reacción general involucraprincipalmente la acción de dos 
enzimas; las exo-inulinasas (β – D – fructan fructohidrolasa) con número EC 
3.2.1.80 que cortan los enlaces glicosídicos de las unidades de fructosa en el 
extremo terminal de la molécula de inulina y puede continuar hasta llegar a la 
glucosa del extremo opuesto y las endo-inulinasas, (2,1-β-D-fructan 
fructanohidrolasa) con número EC 3.2.1.7 que cortan específicamente los enlaces 
internos β-2,1 de la inulina para producir inulotriosa, inulotetraosa e inulopentaosa 
como productos principales. Además ofrecen perspectivas interesantes en vista de 
la creciente necesidad para la producción de los llamados “jarabes fructosados” a 
partir de la hidrólisis parcial de la inulina y no del almidón, o bien para la obtención 
de fructooligosacáridos (FOS), que son ampliamente utilizados en la industria de 
los alimentos (Vandamme, 1983; Nakamura, 1995; Kango, 2008; Chi, 2010). 
Cuando las exo-inulinasas actúan sobre el extremo reductor de la molécula de 
inulina, liberan moléculas de fructosa y glucosa, que pueden ser fácilmente 
transformadas en etanol por Sacchromyces cerevisiae. Además, la inulina es un 
mejor material que el almidón, la celulosa y el xilano para producir altas 
concentraciones de etanol (Chi, 2010). 
Para la producción de fructosa, la inulina es hidrolizada por exo-inulinasas, este 
método, incluye fuentes microbianas que secretan grandes cantidades de 
inulinasas y pueden producir fructosa a partir de inulina en una reacción catalítica 
de un solo paso y con rendimientos mayores del 95%, o bien, cuando éstas actúan 
sinérgicamente con las endo-inulinasas, observándose un mayor rendimiento, 
debido a que las endo-inulinasas cortan a la inulina en varios oligosacáridos 
incrementando los sitios de ataque para las exo-inulinasas. (Nakamura, 1995; 
Kushi, 2000; Rocha, 2006; Rica, 2007; Muñoz-Gutiérrez, 2009; Chi 2010). 
GENERALIDADES 
 
 
25 
 
Se ha observado que muchas cepas de bacterias y hongos filamentosos 
mostrados en la tabla 5, producen inulinasas que pueden ser fácilmente utilizadas 
para hidrolizar inulina para la obtención de fructooligosacáridos (Chi, 2010). 
Tabla 5. Microorganismos empleados para la producción de inulinasas 
Microorganismo Tipo de enzima Referencias 
Hongos 
Aspergillus aureus Extracelular Gupta et al. 1994 b 
Aspergillus awamori Extracelular Kulminskaya et al. 2003 
Aspergillus ficuum 
 
 
 
Aspergillus fischeri 
Extracelular 
 
 
 
Extracelular 
Carniti et al. 1991, 
Tai-Boong et al. 1999, 
Jing et al. 2003, 
Ettalibi & Baratti 2001, 
Gupta et al. 1994 b 
Fusarium sp. Extracelular Roquette-Freres 1989 
Fusarium oxysporum Extracelular, Intracelular Gupta et al. 1998 
Penicillium sp. Extracelular Wenling et al. 1997 
P. purpurogenum Extracelular Sharma et al. 2003 
Rhizopus sp. Extracelular Ohta et al. 2002 
Streptomyces sp. 
 
Bacterias 
Extracelular Gill et al. 2003 
Acetobacter sp. 
Arthobacter sp. 
Extracelular 
Extracelular 
Roquette-Freres 1989 
Elyachioui et al. 1992 
Bacillus sp. Extracelular, Intracelular Allais et al. 1986 
Escherichia coli 
Flavobacterium mulivorum 
Staphylococcus sp. 
 
Levaduras 
Candida sp. 
Kluyveromyces marxianus 
Intracelular 
Intracelular 
Intracelular 
 
 
Extracelular 
Extracelular 
Yun et al. 1997 
Allais et al. 1986 
Selvakumar & Pandey 1997, 1998 a, b, 
1999 a, b 
 
Roquette-Freres 1989 
Selvakumar & Pandey 1998b, 1999b 
 
Fuente: Pandey Ashok et al. Enzyme Technology 
 
Tradicionalmente las inulinasas son producidas en fermentaciones sumergidas. 
Entre los productores de enzimas Aspergillus sp., es el hongo mejor estudiado y 
GENERALIDADES 
 
 
26 
 
puede producir tanto endo como exo inulinasas con alta termoestabilidad, el cual 
es un criterio sumamente importante que determina la conveniencia del uso de 
estas enzimas para aplicaciones industriales, ya que las altas temperaturas 
aseguran la solubilidad de la inulina y también previenen la contaminación 
microbiana (Singh, 2006; Chen, 2011). 
 
3.9 Los Fructanos como Sustancias de Reserva 
Tanto el almidón como la sacarosa se encuentran presentes en muchas plantas 
como carbohidratos de reserva. Algunos cereales como el maíz, el trigo y el arroz, 
o los tubérculos como la papa, la yuca o el camote, almacenan glucosa en forma 
de almidón como fuente de carbono y energía. Sin embargo, se ha observado que 
los fructanos son otra forma de almacenamiento de hidratos de carbono, éstos se 
encuentran como mezclas heterogéneas con diferentes estructuras y grados de 
polimerización, en un amplio número de plantas, tales como: la cebolla, el ajo, la 
achicoria, la alcachofa y los agaves, entre otros. Debido a que se ha descubierto 
que es un ingrediente saludable que puede ser adicionado en los alimentos 
funcionales, y a que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, ha 
incrementado el interés en estos carbohidratos (Ritsema, 2003). 
La presencia de fructanos en las plantas, se correlaciona con efectos muy 
variados, tales como la protección contra condiciones extremas de sequía o de 
bajas temperaturas, ya que pueden ser sintetizados por debajo de los 12ºC, 
mientras que a estas temperaturas el metabolismo del almidón es severamente 
inhibido. Además se pueden almacenar en mayor cantidad, porque se sintetizan 
en las vacuolas que ocupan alrededor del 70% del volumen de las células (Olvera, 
2007). 
Estructuralmente, constan de oligómeros o polímeros de fructosa y derivan de la 
molécula de sacarosa. Los fructanos de las plantas tienen diferentes estructuras y 
longitudes de cadena, aquellos con un grado de polimerización de 2 a 10 son 
GENERALIDADES 
 
 
27 
 
comúnmente llamados fructooligosacáridos, y cuando el grado de polimerización 
es de al menos 30 unidades de fructosa se le conoce como inulina (Vandamme, 
1983) 
Los fructanos de distinto origen pueden diferir por el grado de polimerización, la 
presencia de ramificaciones, el tipo de enlace entre las unidades de fructosa 
adyacentes y la posición de los residuos de glucosa. En la naturaleza se 
distinguen principalmente cinco clases estructurales de fructanos: inulina, levana, 
mezclas de fructanos ramificados denominados agavinas, neoseries de inulina y 
neoseries de levana. 
En los procesos de síntesis de fructanos de origen vegetal, se ha demostrado que 
estos se llevan a cabo mediante la acción concertada de al menos dos enzimas, la 
sacarosa-1F-fructosiltransferasa (inulosacarasa), en el caso de la inulina, y la 
sacarosa- 6F-fructosiltransferasa (levansacarasa) en el caso de la levana. En una 
primera etapa, la enzima sacarosa-sacarosa fructosiltransferasa (SST) se encarga 
de iniciar el proceso al incorporar un residuo de fructosa a una molécula de 
sacarosa formando un trisacárido denominado 1-kestosa. En una segunda etapa, 
mediante la acción de un segundo grupo de enzimas del tipo fructosiltransferasas, 
se añaden más residuos de fructosa a los trisacáridos, dando lugar a fructanos de 
mayor peso molecular (Olvera 2007; Muñoz-Gutiérrez 2009). 
 
3.10 Características de la Inulina 
La inulina es un fructano polidisperso que consta de una mezcla de polímeros 
lineales y oligómeros conformados por monómeros de fructosa unidos con enlaces 
fructosil-fructosa β-(2,1) y en el extremo de cada cadena, se encuentra una 
molécula de glucosa unida por un enlace α-(1,2), como se muestra en la figura 4 
(Nakamura, 1995; Kango, 2008). 
 
GENERALIDADES 
 
 
28 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructura de la inulina 
 
La longitud de las cadenas varía entre cada planta y de acuerdo con la estación 
del año, por lo cual diferentes grados de polimerización están presentes en los 
fructanos de la misma planta. Debido a esta variación en la longitud de las 
cadenas su peso molecular varía entre ± 3500 – 5000 Da. Se encuentra en 
órganos internos de muchas plantas como carbohidrato de reserva, entrelas que 
se encuentran; las raíces de dientes de león (Taraxacum officinale) y de achicoria 
(Cichorium intibus), los tubérculos de la alcachofa de Jerusalén (Helianthus 
tuberosus) y de dalia, (Dahlia pinnata) los bulbos de iris (Iris sp.) y las piñas de los 
agaves. No es tóxica, se disuelve fácilmente en agua caliente y una solución de 
alta concentración de inulina tiene baja viscosidad (Vandamme, 1983; Nakamura, 
1995; Pandey, 1998; Bautista, 2001; González-González, 2007; Kango, 2008; Chi 
2010). 
A pesar de la presencia de inulina en una gran variedad de especies vegetales, la 
principal fuente utilizada a nivel industrial es obtenida de la raíz de achicoria, dicha 
raíz es parecida al camote y es un cultivo bianual. El cuerpo de la raíz se forma en 
el primer año y en el segundo se forman las extensiones de la raíz y las flores. Las 
semillas para reproducir a la achicoria son relativamente pequeñas, anualmente se 
siembran millones de hectáreas por todo el mundo para extraer aproximadamente 
un millón de toneladas de inulina que el mundo consume (Praznik, 2004; Olvera, 
2007). 
GENERALIDADES 
 
 
29 
 
Debido a que este fructano es una materia prima renovable, barata y abundante, 
últimamente se ha estudiado su potencial uso para obtener otros productos con 
aplicación en los alimentos funcionales; como los jarabes de fructosa, 
fructooligosacaridos (FOS) y ácido cítrico. Dichos productos pueden ser 
sintetizados por algunas cepas de bacterias, levaduras y hongos que pueden 
degradar a la inulina casi en su totalidad (Pandey, 1998; Kango, 2008; Chi, 2010). 
Dado que la inulina no es completamente hidrolizada a nivel de intestino delgado, 
tiene funciones de fibra dietética y se promueve como alimento de bajo contenido 
calórico (<2 Kcal/g). Además tiene aplicaciones como promotor de la incorporación 
de calcio al organismo, agente gelificante en formulaciones alimenticias o como 
prebiótico, al estimular el desarrollo de la flora bacteriana benéfica. Técnicamente, 
la inulina comercial estabiliza una proporción importante de agua (1 g/g) en 
formulaciones grasas y genera una textura cremosa lo que permite disminuir el 
contenido de grasa en la formulación. Arriba de 20 g/día de inulina pueden ser 
consumidos para evitar efectos gastrointestinales adversos. La inulina no es 
digestiva y provee 6.3 KJ/g de energía. Es usada como sustituto de grasa y de 
azúcares en alimentos, tales como pan, galletas, productos lácteos, cereales y 
dulces (Olvera, 2007; Stewart, 2008). 
Observando las propiedades tecnológicas, las cadenas de inulina son poco 
solubles y viscosas, por lo que pueden ser usadas para estructurar alimentos 
bajos en grasa. Por otra parte, la hidrólisis enzimática de la inulina, parece ser un 
proceso prometedor para la obtención de fructosa, ya que libera alrededor de 
(95%) de este monosacárido y una fracción mínima de glucosa (Ricca, 2007; 
Tárrega, 2011) 
 
 
 
GENERALIDADES 
 
 
30 
 
3.11 Importancia de la Inulina, Agavinas y Fructooligosacáridos (FOS) como 
Prebióticos 
La importancia en la salud de la microbiota bacteriana es uno de los 
descubrimientos de mayor impacto en la nutrición de los seres humanos en los 
últimos años. El intestino grueso contiene más de 500 diferentes tipos de 
bacterias, las cuales contribuyen a un número importante de funciones biológicas. 
El mantenimiento de un número balanceado de bacterias benéficas, ayuda a 
controlar y a disminuir la cantidad de bacterias patógenas en el tracto digestivo 
entre muchos otros beneficios (Rocha, 2006; Olvera, 2007). 
Actualmente se ha observado que muchos oligosacáridos y polisacáridos tienen 
actividad prebiótica, dentro de los que destacan la inulina, las agavinas y los 
fructooligosacáridos (FOS), los cuales han sido descritos como sustancias 
prebióticas, sin embargo, no todos los hidratos de carbono son prebióticos. Para 
considerarlos como tales, dichos ingredientes deben cumplir con algunos criterios, 
como ser resistentes a la acidez gástrica para llegar intactos al colon y poder ser 
utilizados como sustrato por la microbiota intestinal para estimular selectivamente 
el crecimiento de bacterias intestinales “benéficas” (Rocha, 2006; Olvera, 2007; 
Dandan, 2008). 
Es así que un prebiótico se define como un ingrediente fermentativo selecto que 
permite cambios específicos en la composición y/o actividad en la microbiota 
gastrointestinal y a la vez confieren beneficios sobre la salud y el bienestar del 
hospedero (Kolinda, 2002) 
El mayor grupo de prebióticos actualmente en uso para suplementar los alimentos 
son los fructanos, ya que estimulan el crecimiento de bacterias benéficas para el 
organismo e inhiben el crecimiento de bacterias patogénicas, éstos fructanos 
pueden ser utilizados como ingredientes de algunos alimentos, tales como: 
galletas, cereales, chocolate, cremas de untar y algunos productos lácteos por 
ejemplo (Urías-Silvas, 2004; OMGE, 2008) 
GENERALIDADES 
 
 
31 
 
Los fructooligosacáridos son carbohidratos de bajo peso molecular (grado de 
polimerización [DP] 2-40) que interactúan entre sí mediante enlaces β-(1,2) y que 
no pueden ser hidrolizados en el tracto gastrointestinal por lo que han obtenido 
gran atención en el campo de la nutrición, debido a su capacidad edulcorante que 
puede sustituir a la sacarosa (Rocha, 2006; Olvera, 2007). 
Las cadenas de fructosa con 2 a 10 unidades son catalogadas como 
oligofructanos o fructooligosacáridos (FOS) y se producen por la hidrólisis de la 
inulina cuando se utilizan endo-inulinasas (Stewart, 2008). 
El instituto de medicina y la American Association of Cereal Chemists incluyen a 
los FOS en la definición de fibra basándose en sus efectos fisiológicos, ya que 
éstos son adicionados para incrementar el contenido de fibra y la absorción de 
minerales. Pueden ser utilizados para la elaboración de algunos alimentos, tales 
como: preparados de frutas, postres de leche, yogurt, queso fresco, chocolate, 
helado, confitería y salsas (Stewart, 2008). 
Dependiendo del contenido de mono y disacáridos, los fructooligosacáridos 
además de considerarse prebióticos, conservan un sabor más o menos dulce, 
contrario a las inulinas y las levanas que poseen un sabor neutro. (Muñoz-
Gutiérrez, 2009). 
En tanto, los fructooligosacáridos proporcionan efectos benéficos en los humanos 
y han sido caracterizados como edulcorantes funcionales. Se pueden usar como 
fibra soluble dietética, como edulcorante funcional ó como prebiótico para 
favorecer la población de las Bifidobacterias (Kango, 2008). 
Por tal motivo tanto los fructooligosacáridos u oligofructosa (FOS) como la inulina 
son los fructanos más utilizados y estudiados ya que ambos han demostrado ser 
resistentes a las enzimas digestivas humanas para ser fermentados en el colon 
por acción de las bacterias, dando lugar a la producción de ácidos grasos de 
cadena corta SCFA (por sus siglas en inglés Short-Chain Fatty Acids) como el 
butírico, el acético, el láctico y el propiónico. También se producen H2, CO2 como 
GENERALIDADES 
 
 
32 
 
producto del metabolismo anaeróbico y existe una disminución del pH intestinal 
<5.0. Esto último, previene el crecimiento de patógenos (clostridios y coliformes 
entre otros), permitiendo la proliferación de algunas colonias de bacterias 
asociadas a la salud intestinal, como son: Lactobacillus y Bifidobacterium, quienes 
pueden metabolizar fácilmente dichos fructanos (Stewart, 2008; Domínguez – 
Vergara, 2009). 
Éstos SCFA representan el sustrato energético fundamental y ejercen acciones 
tanto sistémicas como a nivel local en el colon. El propionato es un precursor 
gluconeogénico, el acetato pasa a tejidos periféricos y es metabolizado en el 
músculo. En el colon el butirato es metabolizado y utilizado selectivamente como 
combustible, y regula el metabolismo de los ácidos nucleicos de algunas bacterias 
del colon, también promueveel mantenimiento de la barrera intestinal y ha sido 
implicado en la prevención del cáncer de colon. La regulación del metabolismo de 
los lípidos también se adjudica a los SCFA. (Domínguez – Vergara, 2009) 
En estudios in vitro, se demostró que los fructanos de achicoria estimularon el 
crecimiento bacteriano y produjeron SCFA´s. También se han demostrado 
beneficios en estudios con animales principalmente en cáncer de colon, absorción 
de calcio, en estimulación del sistema inmunológico y en el metabolismo de 
lípidos. 
Dada la importancia de estos hidratos de carbono, un estudio evaluó el efecto de 
los fructanos de algunas especies de agaves (agavinas) sobre el crecimiento de 
Bifidobacterium breve, y también analizó los productos generados de la 
fermentación de dichos fructanos en el medio. Los resultados mostraron que las 
agavinas de menor longitud de cadena estimularon mejor el crecimiento de B. 
breve y también generaron los ácidos acético, propiónico y butírico, reportados 
como responsables de los efectos positivos en la salud. 
Por lo tanto, el género Agave en la última década ha sido de gran importancia 
debido a que se ha encontrado la presencia de fructanos en varias especies y 
principalmente en A. tequilana. (Urías-Silvas, 2004) 
GENERALIDADES 
 
 
33 
 
La principal ventaja del uso de prebióticos es que estimulan el crecimiento de las 
Lactobacillus y Bifidobacterium nativas del colon, sin necesidad de introducir una 
especie microbiana en un alimento (como es el caso de los probióticos). Una 
ventaja adicional es que los oligosacáridos son más fáciles de introducir en la 
formulación de un alimento, que los microorganismos, ya que estos últimos 
pueden perder su viabilidad durante el procesamiento y almacenamiento. En 
consecuencia los prebióticos pueden ser una estrategia más práctica y eficiente 
para modular la microbiota intestinal, que los probióticos (Domínguez – Vergara, 
2009). 
 
3.12 El Potencial de los Fructanos para la Producción de Biocombustibles 
En la actualidad los combustibles fósiles que son no renovables, son los más 
consumidos. Sin embargo el mundo se enfrenta al progresivo agotamiento de 
estos recursos energéticos. La quema de combustibles fósiles representa un gran 
problema debido a que genera gases contaminantes. Por lo tanto, muchas 
personas se han interesado en los biocombustibles desarrollados a partir de 
fuentes renovables (Chi, 2010). 
 La industria del alcohol proporciona combustibles que pueden utilizarse en 
combinación con derivados del petróleo en motores de gasolina o de gasoil. El 
empleo de alcohol industrial comenzó a principio del siglo XIX con el surgimiento 
de la industria de la síntesis química. Sin embargo durante muchos años, todo el 
etanol exceptuando el utilizado en bebidas se obtenía por medios químicos en 
lugar de usar la hidratación catalítica del etileno. Con la demanda energética 
actual, el etanol procedente de la fermentación ha ganado nueva relevancia. En 
países con grandes excedentes agrícolas como Brasil, Sudáfrica, Canadá y 
Estados Unidos, se han realizado intensas investigaciones para conseguir producir 
etanol a partir de materias ricas en carbohidratos (sacarosa, almidón, biomasa 
vegetal, etc). 
GENERALIDADES 
 
 
34 
 
Las materias primas pueden clasificarse en tres grupos principales que se 
mencionan a continuación: 
 Materiales azucarados como la caña de azúcar, la remolacha azucarera, las 
melazas y los sumos de fruta. 
 Materiales amiláceos como los cereales, patatas, pataca y mandioca. 
 Materiales celulósicos tales como la madera o el licor de cocción al sulfito. 
La eficiencia de conversión de etanol por fermentación varía considerablemente 
dependiendo del material utilizado. 
En base a la actual demanda energética industrial y comercial de biocombustibles, 
de dos de los productos finales más importantes de la conversión de carbohidratos 
son el etanol y el metanol. Sin embargo la producción de etanol es una apuesta 
más atractiva debido a los usos potenciales de éste como combustible y en la 
industria química (Lee, 2002). 
Por lo tanto, como parte de los estudios para producir etanol se han utilizado 
extractos de vegetales ricos en inulina como materia prima. La levadura 
Kluyveromyces marxianus además de ser empleada para producir enzimas que 
degradan a la inulina se ha aprovechado su capacidad para fermentar la fructosa y 
producir etanol. Es así que se utilizaron extractos de inulina derivados de la 
achicoria y de dalia para realizar hidrólisis y fermentación simultánea con dicha 
cepa. 
Por otra parte, se ha observado que la levadura Saccharomyces cerevisiae es 
más tolerante al etanol que K. marxianus y en la búsqueda de mejorar el 
rendimiento en la producción de etanol se han montado sistemas de hidrólisis y 
fermentación, que consisten en emplear la inulina como sustrato, obtenida de dalia 
y achicoria, exo y endo – inulinasas de Aspergillus niger para hidrolizar a la inulina 
de una manera eficiente hasta obtener fructosa y una vez completada la hidrólisis, 
se empleó una cepa de S. cerevisiae resistente al etanol para fermentar fructosa. 
GENERALIDADES 
 
 
35 
 
Así se obtuvieron concentraciones del 20 – 21% (V/V) de etanol, en un periodo de 
72 horas. El mismo sistema de producción de fructosa y fermentación alcohólica 
simultáneas utilizando cepas de A. niger y S. cerevisiae, se ha empleado para 
hidrolizar inulina en forma de polvo extraída de alcachofas de Jerusalén, que se 
obtuvo de tubérculos deshidratados y molidos. Por este medio se alcanzaron 
rendimientos de etanol superiores al 20% (V/V) (Gutiérrez, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS 
 
 
36 
CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS 
JUSTIFICACIÓN 
La industria productora del tequila utiliza el Agave tequilana Weber var. Azul para la 
obtención de azúcares que se usan en los procesos de fermentación para la 
producción de etanol. Actualmente se han realizado estudios para un 
aprovechamiento integral de esta planta. Es así que se ha encontrado que el hongo 
Aspergillus niger CH-A-2010, aislado de materia en descomposición de un campo de 
agave del estado de Jalisco, es capaz de producir enzimas de interés biotecnológico, 
tales como: xilanasas, celulasas, exo y endo pectinasas e inulinasas en 
fermentaciones sumergidas cuando se utilizan pencas de Agave tequilana como 
fuente de carbono adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. 
Dichas enzimas producidas por Aspergillus niger CH-A-2010 podrían ser 
potencialmente útiles para la elaboración de productos de interés biotecnológico con 
mayor valor agregado. En este estudio se evaluó y mejoró la producción de 
inulinasas, debido a que se pueden utilizar para la obtención de fructooligosacáridos, 
los cuales tienen efecto prebiótico, así como también para generar azúcares 
fermentables para la obtención de etanol y la producción de jarabes (mieles de 
agave). Por lo que es importante evaluar el efecto del jugo de Agave tequilana como 
inductor en la producción de inulinasas de esta cepa, asimismo, valorar algunas 
fuentes de nitrógeno orgánico y establecer las condiciones de cultivo que permitan 
incrementar la producción enzimática. 
 
HIPÓTESIS 
Debido a que las pencas de Agave tequilana se han utilizado como sustratos para la 
producción de inulinasas, el jugo de agave por su composición podría ser utilizado 
como inductor para la producción de las mismas. 
 
OBJETIVOS 
 
 
37 
CAPÍTULO V. OBJETIVOS 
 
5.1 OBJETIVO GENERAL 
 
Valorar el jugo de agave como fuente de carbono para la producción de inulinasas 
de Aspergillus niger CH – A – 2010 en fermentaciones sumergidas, así como 
evaluar el efecto de algunas fuentes de nitrógeno orgánico. 
 
 
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 
 Evaluar la producción de inulinasas a partir de la cepa Aspergillus niger CH 
– A – 2010en fermentaciones sumergidas a nivel de matraz Fernbach, 
utilizando jugo de agave como fuente de carbono con la adición de sulfato 
de amonio como fuente de nitrógeno. 
 
 Determinar el efecto de algunas fuentes de nitrógeno orgánico sobre la 
producción de inulinasas, empleando jugo de agave como fuente de 
carbono. 
 
 Evaluar la producción inulinolítica en fermentador de 2L a partir de las 
condiciones de cultivo que generen la mejor actividad a nivel de matraz 
Fernbach. 
 
 Diseñar un experimento factorial que permita incrementar la actividad 
inulinolítica con la ó las fuentes de nitrógeno seleccionadas a diferentes 
condiciones de cultivo. 
 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
38 
CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS 
6.1 Aspergillus niger CH – A – 2010, microorganismo productor de inulinasas 
En el presente estudio el microorganismo empleado para la producción de 
inulinasas, fue la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger, el cual es un hongo 
saprófito, aislado a partir de hojas secas en descomposición de un campo de 
cultivo de agave del estado de Jalisco, México. Este microorganismo es capaz de 
producir enzimas con actividad inulinolítica, cuando se utilizan pencas de Agave 
tequilana como única fuente de carbono en fermentaciones sumergidas (Huitron, 
2008). 
 
6.2 Elaboración de los Medios de cultivo 
6.2.1 Reactivos Utilizados 
Agar papa dextrosa (PDA; Merck), bacto agar (Oxoid), fosfato de potasio 
monobásico (Baker), fosfato de potasio dibásico (Baker), sulfato de amonio 
(Baker), extracto de levadura (Bioxon), peptona de caseína (Bioxon), agua de 
cocimiento de maíz grado industrial, harina de soya grado industrial (Industrial de 
Alimentos, S.A.), inulina de achicoria (Sigma), ácido acético glacial (Baker), 
acetato de sodio (Baker), ácido clorhídrico (Baker), hidróxido de sodio (Baker), 
ácido 3,5-dinitrosalicílico (Sigma), tartrato de sodio y potasio (Merck), metabisulfito 
de sodio (Baker), fenol (Baker), glicerol (Baker), cloruro de sodio (Baker), ácido 
sulfúrico concentrado (Baker). 
6.2.2 Formulación del Medio de Cultivo para la Propagación de la Cepa 
La preparación de las placas para la propagación de la cepa se realizó con los 
siguientes componentes: 
- Agar papa dextrosa (PDA) al 3.9% 
- Bacto agar al 2% 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
39 
Se esterilizó durante 15 min. a 121 °C y 15 lb. de presión; posteriormente se 
llenaron cajas Petri estériles con aproximadamente 25 mL de medio y se realizó 
prueba de esterilidad incubándolas 24 h a 37 °C. Terminado este periodo se 
conservaron en refrigeración a 4 °C. 
6.2.3 Método para la Conservación de la Cepa 
Para la construcción del banco de trabajo de la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus 
niger se sembraron esporas en una caja Petri con medio PDA y se incubó a 37 °C 
durante 5 días para permitir la esporulación. Transcurrido este tiempo se realizó la 
cosecha de esporas con 20 mL de una solución estéril de glicerol al 30% (V/V) 
ajustada con solución isotónica al 0.85% (P/V) y se colectó 1 mL del concentrado 
de esporas en crioviales estériles de 1.5 mL que posteriormente fueron 
resguardados a una temperatura de – 20 °C. 
6.2.4 Medios de cultivo a nivel de matraz Fernbach para la producción de 
inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 
Se prepararon diferentes medios de fermentación para cultivo sumergido a nivel 
de matraz Fernbach, todos contenían 1L de medio, se agregaron y disolvieron los 
componentes en agua destilada de acuerdo a las siguientes concentraciones: 
KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.05% y cada una de las fuentes de nitrógeno (FN) grado 
analítico (peptona de caseína, extracto de levadura y sulfato de amonio) y grado 
industrial (extracto de malta, agua de cocimiento de maíz y harina de soya) al 
0.4%. 
Se ajustó el pH de los medios de cultivo a 4.5 con HCl 1 M y se esterilizaron a 
121°C y 15 lb de presión, durante 15 min. 
El jugo de agave se trató por separado mediante un proceso de pasteurización a 
75 °C durante 5 min, y se adicionó a los medios de cultivo estériles una vez que 
alcanzan una temperatura aproximada de 37 °C, en una concentración del 1.0% 
(V/V), para todos los medios a nivel de matraz Fernbach. 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
40 
6.2.5 Medios de cultivo para fermentaciones de 2, 10 y 12 L para la 
producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 
En este caso, se seleccionaron los medios con mayor actividad inulinolítica para 
evaluar su comportamiento en fermentador con 2, 10 y 12 L. Dichos medios se 
prepararon bajo las siguientes condiciones: 
 2 L 10 L 12 L 
Agitación (RPM) 200 - 350 300 200 
Temperatura (°C) 37 37 37 
Fuente de carbono 
(Jugo de agave) 
1.0 % 1.0 % 1.0 % 
Fuente de 
nitrógeno 
1.0 % 1.0 % 1.0 % 
Aireación (vvm) 1 1 1 
Presión (atm) N / A N / A 0.2 
 
6.3 Propagación del hongo Aspergillus niger CH – A – 2010 
En dos cajas Petri con medio sólido PDA, se sembraron las esporas del banco de 
trabajo de la cepa Aspergillus niger CH – A – 2010 mediante la técnica de estría y 
se incubaron a 37 °C durante 5 días hasta lograr su esporulación. 
 
6.4 Proporción de Inóculo en los Medios de Cultivo 
Para inocular 1 L de medio de cultivo a nivel de matraz Fernbach, se cosecharon 
esporas de Aspergillus niger CH – A – 2010 propagadas en una placa Petri de 
PDA, con 20 mL de solución salina al 0.95% (solución stock) para su arrastre. 
Posteriormente del stock se realizó una dilución de esporas con una proporción 
1:20, a la cual se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a una densidad 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
41 
óptica de 550 nm y se inoculó cada medio de cultivo con un volumen de 0.5 mL 
de la solución stock, correspondiente a 0.5 en absorbancia. 
Los fermentadores de 2, 10 y 12 L fueron inoculados al 0.25% de solución stock. 
 
6.5 Tratamiento de la Fuente de Carbono: Jugo de Agave tequilana 
La piña de A. tequilana se partió en rectángulos de 4 x 10 cm aproximadamente y 
se extrajo el jugo con un extractor centrífugo de la marca Cafeteras 
Internacionales, modelo EX – S, posteriormente se filtró en una malla de 0.105 
mm de la marca Monti – Lat, para retirar el exceso de fibra. El jugo obtenido se 
pasteurizó a 75 °C durante 5 min, se envasó en recipientes de plástico estériles y 
finalmente se conservó a -20 °C. 
 
6.6 Fermentaciones y muestreo 
Las fermentaciones a nivel de matraz Fernbach se realizaron bajo las siguientes 
condiciones de cultivo: temperatura de 37 °C y agitación de 200 RPM en una 
agitadora orbital marca sol – bat durante 120 h. Por otra parte, las condiciones en 
las fermentaciones realizadas a nivel de fermentador de 2, 10 y 12 L fueron: 37 °C 
de temperatura, 200 – 350 RPM de agitación y 1 vvm de flujo de aire. 
Se tomaron muestras cada 24 h, desde el tiempo cero y hasta las 120 h de 
fermentación en todos los casos. 
 
6.7 Obtención de filtrados enzimáticos 
Para la obtención de los filtrados enzimáticos, cada muestra se centrifugó a 2500 
RPM durante 15 min, posteriormente se decantaron para retirar la biomasa y se 
conservaron en congelación a – 20 °C hasta su análisis. 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
42 
6.8 Ensayo para la determinación de la actividad inulinolítica 
Para este ensayo se preparó una solución de inulina de achicoria marca Sigma al 
2.5% disuelta en buffer de acetatos 0.1M y con pH= 5.5. 
La actividad inulinolítica se expresó de acuerdo al incremento de azúcares 
reductores liberados a partir de una solución de inulina comercial, por el filtrado 
enzimático en un minuto. Para dicho análisis, se preparó una mezcla de reacción 
que contenía 1 mL de solución de inulina comercial, 0.5 mL de agua destilada y 
0.5 mL de filtrado enzimático, a partir de éste último se determinó la actividad de 
inulinasas. Adicionalmente se preparó un control negativo para cada muestra, por 
lo cual se inactivaron 0.5 mL de filtrado enzimático en baño de agua hirviendo 
durante 5 min.