Regulacion-transcripcional-del-promotor-snon-humano-por-tgf-beta

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO 
EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 
 
 
 
REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL 
PROMOTOR snoN HUMANO POR TGF-β 
 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE : 
 
DOCTOR EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS) 
 
P R E S E N T A : 
 
ANGELES C. TECALCO CRUZ 
 
 
 
 
Tutor: DRA. MARINA MACIAS SILVA 
 
 
 
 
 
 
MÉXICO, D. F. AGOSTO 2012 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL 
DEL PROMOTOR snoN HUMANO POR TGF-β 
 
 
 
R E C O N O C I M I E N T O S 
 
 
El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Marina Macías Silva, en el 
laboratorio 225 Norte del Departamento de Biología Celular y del Desarrollo del Instituto de 
Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 
El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por: 
 
Dra. Marina Macías Silva Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
Dr. Alfonso León del Río Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
Dr. Fernando López Casillas Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
 
 
 
Se reconoce la cooperación, asesoría y participación de la Biól. Marcela Sosa Garrocho del 
Depto. de Biología Celular y del Desarrollo, del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. 
 
 
Se reconoce a los siguientes miembros del Depto. de Biología Celular y del Desarrollo, IFC, 
UNAM por su colaboración en el desarrollo experimental y discusión de este proyecto: 
 
Lic. en IBB Layla Ortiz García 
M. en C. Jaqueline Hernández Damián 
Biól. Elisa Domínguez Huttinger 
Lic. en IBB Genaro Vázquez Victorio 
 
 
 
Se reconoce por el apoyo técnico que otorgaron durante el progreso de esta investigación a: 
 
Dr. Adrian Fernando Álvarez Depto. de Genética Molecular, IFC, UNAM 
M.C. Valentín Mendoza Depto. Biología Celular y del Desarrollo, IFC, UNAM 
Dra. Ma. Teresa Romero Ávila Depto. Biología Celular y del Desarrollo, IFC, UNAM 
Biól. Claudia Rodríguez Rangel Depto. de Genética Molecular, IFC, UNAM 
M. en C. Aurelio Hernández Méndez Depto. Biología Celular y del Desarrollo, IFC, UNAM 
Dra. Ma. Cristina Castañeda Patlán Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM 
 
 
 
 
http://ifc.unam.mx/personal.php?id_personal=221&lang=es
Se reconoce por su contribución en reactivos, en sugerencias y discusión de este trabajo a: 
 
Dr. Jorge Ramírez Unidad de Microarreglos, IFC, UNAM 
Dra. Claudia Gonzalez Espinosa Depto. de Farmacobiología, CINVESTAV 
Dra. Guadalupe Reyes Cruz Depto. de Biología Celular, CINVESTAV 
Dr. José Vázquez Prado Depto. de Farmacobiología, CINVESTAV 
 
 
Se reconoce a los miembros de la Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología de 
la UNAM por su asesoría y apoyo técnico. 
 
Dra. Laura Ongay Larios 
M. en C. Minerva Mora Cabrera 
Biól. Ma. Guadalupe Codiz Huerta 
 
 
Se reconoce a los miembros del taller del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, el Ing. 
Aurey Lobato Galván y el Ing. Manuel Ortinez Benavidez por su colaboración en el 
mantenimiento del equipo empleado en este trabajo. 
 
 
 
El alumno fue apoyado por una beca otorgada por el CONACyT, en el programa de Ciencias 
Bioquímicas de la Facultad Química de la UNAM. 
 
El proyecto fue apoyado por el donativo IN222909 y por el donativo IN206012 de 
PAPIIT/DGAPA/UNAM y por los donativos del CONACyT No.49493-Q y No.101826. 
 
 
 
Esta tesis fue defendida en examen presentado en el mes de Agosto del 2012. 
 
 
 
El Jurado de Examen Doctoral estuvo constituido por: 
 
Presidente Dr. Carlos Rosales Ledezma Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
Vocal Dr. Angel Zarain Herzberg Facultad de Medicina, UNAM 
Vocal Dr. Félix Recillas Targa Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
Vocal Dra. Claudia González Espinosa Depto. de Farmacobiología, CINVESTAV 
Secretario Dr. José Pedraza Chaverri Facultad de Química, UNAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
ABREVIATURAS 
 
1 
 
RESUMEN 
 
3 
 
ABSTRACT 
 
4 
 
1. INTRODUCCION 
 
5 
 
1.1 Generalidades del TGF-β 5 
1.2 La cascada de señalización del TGF-β y las proteínas Smads 6 
1.3 Regulación transcripcional por la vía de señalización TGF-β/Smad 11 
1.4 Mecanismos de regulación de la señal del TGF-β 13 
1.5 Generalidades de SnoN y Ski 14 
1.6 SnoN y Ski regulan la señal de TGF-β 16 
1.7 El TGF-β regula la expresión de SnoN y Ski 18 
1.8 La importancia de la expresión de SnoN 19 
 
2. ANTECEDENTES 
 
22 
2.1 El gen snoN/skil es regulado por la vía del TGF-β/Smad 22 
 2.2 El requerimiento de Smad4 en la regulación de la expresión de snoN/skil por TGF-β 23 
2.2 El gen smad7 es blanco de las Smad, Ski y SnoN 23 
2.4 Ski se asocia con diversos correpresores y HDACs 24 
 2.5 Ski requiere a Smad4 para unirse al promotor del gen smad7 y reprimir su expresión 24 
2.6 SnoN como regulador transcripcional 26 
 
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
28 
 
4. HIPÓTESIS 
 
30 
 
5. OBJETIVOS 
 
30 
 
6. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
31 
6.1 Clonación de regiones promotoras del gen snoN/skil humano 31 
6.2 Mutagenesis dirigida 31 
6.3 Líneas celulares 32 
6.4 Ensayo de Luciferasa 32 
6.5 Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP y ChIP en plásmido) 32 
 
 
6.6 Inmunoprecipitación de cromatina secuencial (ReChIP) 34 
6.7 Inmunoprecipitaciones y Western blots 35 
6.8 RT-PCR y Northern blot 36 
6.9 Ensayo de migración celular 36 
 
7. RESULTADOS 
 
37 
7.1 La expresión del correpresor SnoN es regulada a diferentes niveles por el TGF-β 37 
7.2 Caracterización de la región 5´ del gen snoN/skil humano 41 
 7.3 El promotor del gen snoN/skil humano es activado por la vía del TGF-β/Smad 
 
45 
7.4 SnoN se une al promotor snoN/skil para autoregular negativamente su propia expresión a 
nivel transcripcional 
48 
7.5 Las proteínas HDACs están involucradas en la represión del gen snoN/skil por SnoN 51 
7.6 El TGF-β induce el recambio de SnoN por las proteínas Smads sobre el promotor del gen 
snoN/skil 
53 
7.7 La proteína Smad4 es requerida para la activación y represión transcripcional del gen 
snoN/skil en las células AD293 
55 
7.8 La regulación de la expresión del gen snoN/skil depende del tipo celular 58 
 7.9 El correpresor SnoN regula su propia expresión y la del gen smad7 a nivel transcripcional 62 
7.10 La proteína SnoN inhibe la migración de las células de cáncer de pulmón A549 64 
 
 
8. DISCUSIÓN 
 
66 
 
9. CONCLUSIONES 
 
76 
 
10. PERSPECTIVAS 
 
76 
 
11. REFERENCIAS 
 
78 
 
12. APÉNDICE 
 
82 
 
13. ANEXO 
 
88 
 
 
1 
 
ABREVIATURAS 
aa Aminoácidos 
ACD Actinomicina D 
ADN Ácido desoxirribonucléico 
ADNc ADN complementario 
ADNg ADN genómico 
ARN Ácido Ribonucléico 
ANISO Anisomicina 
APC Complejo promotor de la anafase 
bp Pares de bases 
BMP Proteínas morfogenéticas de hueso 
CDS Secuencia codificante 
ChIP Inmunoprecipitación de cromatina 
CHX CicloheximidaCOOH-terminal Región carboxilo terminal 
Co-Smad Smad común 
EMT Transición epitelio-mesenquima 
FTs Factores transcripcionales 
g Gravedad 
h Horas 
HAT Acetilasas de histonas 
HDAC Desacetilasas de histonas 
HGF Factor de crecimiento de hepatocitos 
I-Smad Smad inhibitoria 
IP Inmunoprecipitación 
Kb Kilobase 
LAP Proteína asociada a la latencia 
MAPK Cinasas de proteínas activadas por mitógenos 
MET Transición mesenquima-epitelio 
MH1 Dominio 1 homólogo a Mad 
MH2 Dominio 2 homólogo a Mad 
min Minutos 
NaB Butirato de sodio 
NH2-terminal Región amino terminal 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
pS2 Smad2 fosforilada 
R-Smad Smad regulada por receptor 
RI/II Receptor de TGF-β tipo I/II 
ReChIP ChIP secuencial 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
s Segundos 
SBE Elementos de unión a las Smads 
SB43 Inhibidor SB431542 de la señal del TGF-β 
Ski “Sloan-Kettering Institute” 
shRNA ARN tallo-asa interferente 
shS4 ARN tallo-asa interferente contra Smad4 
shSnoN ARN tallo-asa interferente contra SnoN 
SIE Elemento inhibitorio de las Smads 
Smurf Factor relacionado a la ubiquitinación de Smads 
S4, S2, S3 Smad 4, Smad 2, Smad 3 
SnoN “Ski-novel related gene” 
snoN/skil Gen que codifica para la proteína SnoN 
TGF-β Factor de Crecimiento Transformante Beta 
TRE Elementos de respuesta a TGF-β 
TSA Tricostatina 
TSS Sitio de inicio de la transcripción 
UPS Sistema Ubiquitina-Proteosoma 
UTR Región no traducida 
WB Western blot 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
RESUMEN 
 
El gen sno también conocido como snoN o skil codifica al correpresor 
transcripcional SnoN que antagoniza la señal del TGF-β. Los niveles de la 
proteína SnoN son regulados por la vía de señalización del TGF-β/Smad. Tras el 
estímulo con TGF-β, los niveles de SnoN disminuyen debido a su degradación 
vía el proteosoma, pero a tiempos largos de estimulación, los niveles de SnoN 
aumentan por la inducción de la expresión del gen snoN/skil. En este trabajo se 
investigaron los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la 
expresión del gen snoN/skil por el mismo SnoN y por el TGF-β. Un análisis 
bioinformático reveló que la región promotora proximal del gen snoN/skil humano 
contiene un TRE (Elemento de respuesta a TGF-β) conformado por 4 secuencias 
SBE (Elementos de unión a Smad) que se conservan en el ratón. Dos 
fragmentos del promotor del gen snoN/skil de 408 y 648bp (~3.1 kb río arriba del 
ATG) que contienen el TRE y el TSS se clonaron para su análisis funcional. Se 
demostró la unión de las proteínas Smads y SnoN al TRE del gen snoN/skil por 
ensayos de ChIP y ReChIP. Se determinó que el complejo SnoN/Smad4 se une 
a la secuencia TRE del promotor del gen snoN/skil y recluta HDACs para regular 
negativamente la expresión del gen snoN/skil en condiciones basales. En 
respuesta a la señal del TGF-β, SnoN es removido de su propio promotor de 
manera regulada por el complejo de las Smads para inducir la expresión del gen 
snoN/skil. El subsecuente incremento de la proteína SnoN, forma un complejo 
con Smad4 y reprime su propia expresión como parte de un asa de 
retroalimentación negativa, para regular la señal del TGF-β. Por lo tanto, la 
expresión del gen snoN/skil es finamente regulada tanta positivamente por el 
TGF-β y negativamente por el complejo SnoN/Smad4. La alteración en la 
formación y función del complejo SnoN/Smad4 afecta la regulación de la 
expresión del gen snoN/skil y de genes blanco del TGF-β y tiene importantes 
implicaciones en el desarrollo y progresión de cáncer. 
 
 
 
4 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The human sno, snoN or ski-like (snoN/skil) gene encodes the Smad transcriptional 
corepressor SnoN that antagonizes TGF-β signaling. SnoN protein levels are tightly 
regulated by TGF-β pathway: while a short stimulation with TGF-β decreases SnoN 
levels by its degradation via proteasome, longer TGF-β treatment increases SnoN levels 
by inducing skil gene expression. Here, we investigated the molecular mechanisms 
involved in the self-regulation of snoN/skil gene expression by SnoN. Bioinformatic 
analysis showed that the human snoN/skil gene proximal promoter contains a TGF-β 
response element (TRE) bearing four groups of Smad-binding elements (SBEs) that are 
also conserved in mouse. Two regions of 408 and 648 bp of human snoN/skil gene 
(~3.1 kb upstream of ATG initiation codon), containing the core promoter, transcription 
start site (TSS) and TRE, were cloned for functional analysis. Binding of Smad and 
SnoN proteins to the TRE region of snoN/skil gene promoter after TGF-β treatment was 
demonstrated by ChIP and Re-ChIP assays. Interestingly, the SnoN/Smad4 complex 
negatively regulated basal snoN/skil gene expression through binding the promoter and 
recruiting HDACs. In response to TGF-β signal, SnoN is removed from snoN/skil gene 
promoter and then the activated Smad complexes bind the promoter to induce snoN/skil 
gene expression. Subsequently, the upregulated SnoN protein in complex with Smad4 
represses its own expression, as part of the negative feedback loop regulating the TGF-
β pathway. Accordingly, when the SnoN/Smad4 complex is absent, like in some cancer 
cells lacking Smad4, the regulation of some TGF-β target genes is modified. 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
1. INTRODUCCION 
1.1 Generalidades del TGF-β 
La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) está integrada por 
más de 60 miembros, identificados en diferentes organismos desde nemátodos e 
insectos hasta mamíferos. Dentro de esta familia se incluyen a los TGF-βs, las activinas 
y las proteínas formadoras de hueso (BMPs), entre otros. Los miembros de la 
superfamilia del TGF-β están implicados en un amplio espectro de funciones celulares 
tales como proliferación, apoptosis, diferenciación y migración (1-6). 
 
 El TGF-β es el miembro prototipo mejor estudiado de la superfamilia del TGF-β, y se 
conocen cinco isoformas (TGF−β1, −β2, −β3, −β4 y −β5) de este mediador en diferentes 
organismos. En el caso de mamíferos, se han descrito las isoformas TGF−β1, −β2 y 
−β3, que son codificadas por genes independientes, pero presentan una gran identidad 
(~80%) en su secuencia de aminoácidos, así como una gran similitud estructural, 
funcional y en su mecanismo de señalización (4-7). En ratones “knockout” se ha 
demostrado que la carencia de cualquiera de las tres isoformas del TGF-β es letal, 
indicando que cada una de estas isoformas tiene funciones específicas y relevantes (3-
7). 
 
Durante la embriogénesis en los mamíferos las isoformas del TGF-β presentan un 
patrón de expresión temporal y espacial característico (3, 7). El TGF-β también se 
expresa diferencialmente y regula un gran número de procesos celulares en el tejido 
adulto como son la proliferación, diferenciación, apoptosis, respuesta inmune, migración 
y reparación tisular, entre otras (1-8). De todas las isoformas del TGF-β, la más 
ampliamente estudiada es el TGF-β1, la cual se encuentra conservada en diferentes 
especies; en humano y ratón, por ejemplo, la diferencia es de solo un aminoácido (4-6). 
 
6 
 
Dado que TGF-β regula importantes procesos celulares, diversas alteraciones en la vía 
de señalización del TGF-β pueden contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo 
autoinmune, de la fibrosis y del cáncer (7, 11, 12). 
 
Para poder llevar a cabo sus funciones, el TGF-β es sometido a un proceso de 
maduración. Esto se debe a que el TGF−β se sintetiza como una molécula inactiva que 
se encuentra unida a una proteína denominada péptido asociado a la latencia (LAP). El 
TGF-β solamente puede unirse a su receptor cuando se ha separado proteolíticamente 
del LAP. Esta forma activa o madura del TGF-β corresponde a un dímero de 25 kDa 
(112 aminoácidos), conformado por dos unidades monoméricas unidas por un solo 
puente disulfuro y por interacciones hidrofóbicas. Cada monómero presenta 7 residuos 
conservadosde cisteína que forman un anillo cerrado conectado por tres puentes 
disulfuro intracaterarios denominado “nudo de cisteínas”, al cual se unen dos pares de 
cadenas plegadas tipo beta antiparalelas (1, 3). 
 
1.2 La cascada de señalización del TGF-β y las proteínas Smads. 
El dímero TGF-β utiliza para transducir sus señales a dos receptores diméricos, el 
receptor tipo I (TβRI) o ALK-5 (RI) y el tipo II o TβRII (RII). Estos receptores presentan 
en su región intracelular un dominio con actividad de cinasa de residuos de serinas y 
treoninas, siendo únicamente la cinasa del RII la que esta constitutivamente activa. 
Inicialmente el TGF-β se une con alta afinidad a los RII para después reclutar a los RI, y 
formar un complejo heterotetramérico con estos receptores. Dentro de este complejo, la 
cinasa del RII fosforila la región GS (región rica en residuos de glicinas y serinas) del 
RI, activando su dominio de cinasa, para que éste actué sobre sus sustratos, las 
proteínas conocidas como R-Smad. Las R-Smads fosforiladas pueden oligomerizarse 
entre sí y/o con la proteína Co-Smad (Smad4). El complejo activo R-Smad/Co-Smad se 
transloca al núcleo celular, para asociarse con otros reguladores transcripcionales y de 
esta forma modular positiva o negativamente la expresión de genes regulados por el 
TGF-β (1-7) (Fig. 1). 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Vía de señalización canónica del TGF-β 
El TGF-β se une a los receptores tipo II (RII) y I (RI), para activar por fosforilación a las 
proteínas R-Smads, las cuales son Smad2 (S2) y Smad3 (S3). Cuando las R-Smads están 
fosforiladas pueden oligomerizarse entre ellas y con la proteína Co-Smad también llamada 
Smad4 (S4). La interacción de las R-Smads y S4 forma un complejo activo que se transloca al 
núcleo, en donde las Smads actúan como FTs (factores transcripcionales). Las Smads se unen 
a secuencias consenso denominadas SBE sobre promotores de diversos genes para regular su 
expresión. Para ello, las proteínas Smads se asocian con diversos FTs y cofactores. 
 
 
 
8 
 
Las proteínas Smads antes mencionadas son las proteínas mediadoras de las señales 
de los miembros de la familia del TGF-β. El término “Smad” resulta de la fusión de Mad 
y Sma que son los nombres que reciben las proteínas homólogas presentes en 
Drosophila y C. elegans, respectivamente, donde se identificaron inicialmente (2, 3). 
 
Las proteínas Smads se han clasificado considerando sus características estructurales 
y funcionales en 3 grupos: I-Smad, R-Smad y Co-Smad. Estructuralmente, las proteínas 
Smads tienen dos dominios conservados denominados MH1 (Mad Homology 1) y MH2 
(Mad Homology 2), conectados por una región llamada Linker. Una diferencia 
importante entre los grupos de las Smads radica en que el dominio MH1 de las I-Smads 
se encuentra truncado en comparación con el dominio MH1 de las R-Smads y la Co-
Smad (2, 8). Además de esta diferencia, las Smads se distinguen también por presentar 
distintos motivos, los cuales son clave para sus funciones o bien para regular su 
expresión o su estabilidad (Fig. 2). 
 
Por ejemplo, las R-Smads, corresponden a las proteínas Smads activadas por los 
receptores tipo I, y son: Smad 1, 2, 3, 5 y 8. Cada miembro de la superfamilia del TGF-
β, tiene sus propias proteínas mediadoras R-Smads. En el caso del TGF-β, las R-
Smads son Smad2 (S2) y Smad3 (S3). Estas proteínas pueden ser fosforiladas por la 
cinasa del TβRI (ALK5) debido a que en su dominio MH2 contienen el motivo SSXS. 
Esta modificación en las R-Smads induce un cambio conformacional que conlleva a la 
oligomerización de las R-Smads entre ellas y/o la Co-Smad y su translocalización al 
núcleo para llevar a cabo sus funciones transcripcionales (2, 3, 8). 
 
En cambio, Smad4 (S4) es conocida como la Co-Smad o Smad común, por estar 
presente en la vía de señalización de todos los miembros de la superfamilia del TGF-β. 
No presenta el motivo SSXS y está en constante recambio subcelular entre citoplasma 
y el núcleo, independientemente de la señal del TGF-β. Puede oligomerizarse con las 
R-Smads solo cuando éstas han sido activadas por la señal del TGF-β, para formar 
complejos transcripcionales que actúan en el núcleo sobre los promotores de sus genes 
blanco (1, 6). 
9 
 
 
Las R-Smads y S4 funcionan como factores transcripcionales (FTs). S4 y S3 presentan 
en su dominio MH1 una estructura “β-hairpin” u horquilla beta, a través de la cual se 
unen a secuencias consenso en el ADN que responden al TGF-β. S2 no tiene la 
capacidad de unirse al ADN, debido a que posee una inserción en el exón 3 que 
codifica para un péptido de 30 residuos de aminoácidos en el dominio MH1, y que se 
localiza en la región de la “β-hairpin” de unión al ADN y la hélice H2 (2-5). Sin embargo, 
S2 puede asociarse al ADN a través de S4, S3 u otros FTs, como por ejemplo los tipo 
Foxo (Forkhead box), para regular la expresión de ciertos genes (8-10). Las R-Smads y 
S4, a través de sus dominios MH1 y MH2, pueden interaccionar con una diversidad de 
FTs para regular la expresión de sus genes blanco (4, 7, 8). 
 
Las I-Smads o Smads inhibidoras incluyen a las proteínas Smad 6 y 7. La vía de 
señalización del TGF-β es inhibida principalmente por la Smad7. La función de esta 
proteína es importante para regular la temporalidad y la intensidad de la señal del TGF-
β (11). 
 
Por lo tanto, TGF-β puede regular diversos procesos celulares a través de su vía de 
señalización que involucra a las distintas proteínas Smads, cada una de las cuales tiene 
una función determinada por su estructura, con el objetivo final de activar un gran 
número de genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Representación de los diferentes dominios estructurales y motivos de las 
proteínas Smads 
Las proteínas Smads presentan 3 dominios: MH1, Linker y MH2 y se clasifican en Smad 
inhibidora (I-Smad) o Smad7, Smads activadas por el receptor (R-Smads), las cuales son 
Smad2 y Smad3 y la Smad común (Co-Smad) o Smad4. En el MH1 de Smad3 y Smad4 se 
observa el dominio de unión al ADN (“β-hairpin”). En el Linker se encuentran el motivo de 
interacción con la ligasa de ubiquitina Smurf (PY) y sitios de fosforilación para MAPKs. En el 
caso de Smad4 se identifica una señal de exportación nuclear (NES, Nuclear export signal), 
mientras que las R-Smad presentan además secuencias de motivos de localización nuclear 
(NLS, Nuclear localization sequence) en la región de la hélice H2. En Smad4 hay una región de 
interacción con activadores y represores transcripcionales (SAD, Smad4 activation domain). El 
MH2 de las R-Smads se presenta una asa L3 (loop L3), a través de la cual ocurre la interacción 
el RI del TGF-β, y se encuentra el motivo SSXS que es fosforilado por la cinasa del RI. Además 
el dominio MH2 es importante para la activación transcripcional y la oligomerización con Smad4. 
 
 
 
 
Exon3 PY NES
L3
SSXS
MAPK
H2
NLS
H2
NLS
SSXS
β hairpin
β hairpin
Smad2
Smad3
Smad4
Smad7
SADNES
R-
Sm
ad
Co
-S
m
ad
I-S
m
ad
MH1 MH2Linker
11 
 
1.3 Regulación transcripcional por la vía de señalización TGF-β/Smad 
Elementos de respuesta a la vía TGF-β/Smad para la regulación transcripcional.- La 
mayoría de los genes que responden al TGF-β presentan en su región promotora la 
secuencia consenso a la cual se une el complejo de Smads denominada Elemento de 
unión a Smad, conocido por sus siglas en inglés como SBE (Smad Binding Element). 
Éste consiste en una secuencia palindrómica identificada como 5´-CAGATCTG-3´, o 
bien una secuencia de 5 bp 5´-CAGAC-3´, pero también se ha demostrado que son 
suficientes para la unión solamente los 4 bp 5´-CAGA-3´ (6-8). Se predice que esta 
secuencia está presente cada 1024 bp en el genoma, y estos podrían estar localizados 
en la región reguladora de un gran número de genes. No obstante, se ha visto que la 
sola uniónde las Smads a los SBEs no media eficazmente la activación de los genes 
blanco del TGF-β, por lo que se requiere de la asociación de otros FTs para que 
confieran una mayor afinidad y especificidad en la unión de las Smads con el ADN (6). 
 
La activación de genes blanco del TGF-β es resultado de la unión de las Smads a los 
SBE, con la participación de diversos FTs y coactivadores. Muchos de los genes 
reportados presentan un SBE, y solo algunos otros presentan múltiples SBEs (8). Hasta 
ahora no es claro el requerimiento de concatámeros de SBEs en algunos promotores 
regulados por las Smads, pero es probable que en algunos casos sean necesarios para 
mediar interacciones cooperativas entre las Smads y diversos FTs que hagan posible la 
regulación génica (6, 8). 
 
En cambio, la represión de la expresión de un gen regulado por el TGF-β puede darse a 
través del complejo de Smads y correpresores capaces de reclutar la maquinaria 
represora para inhibir la expresión de un gen específico. Al respecto, se han descrito 
algunos correpresores de las Smads, entre ellos TGIF, SnoN y Ski, sin embargo se 
tienen pocos estudios acerca de sus genes blanco y mecanismos de regulación (6, 8, 
11). Se han propuesto también otras secuencias de regulación en los promotores tales 
como el TIE (elementos inhibidores del TGF-β) o los SIE (elementos de inhibidores de 
12 
 
las Smads). Estas secuencias son reconocidas por el complejo S3/S4 y tienen un 
efecto de represión en la expresión génica (8, 25). 
 
Regulación trancripcional dependiente de las proteínas Smads- Un aspecto importante 
en la actividad de las Smads como FTs, radica en su oligomerización. Estudios 
bioquímicos y estructurales han demostrado que tras el estímulo con el TGF-β se 
forman complejos activos de las Smads que consisten en trímeros que pueden ser 
homoligómeros o heteroligómeros (2-8). Los niveles de las Smads pudieran cambiar 
dependiendo del tipo y contexto celular, influyendo en la composición de los complejos 
activos formados por el estímulo del TGF-β (6). Al respecto, se han descrito genes 
blanco del TGF-β que parecen requerir preferentemente un tipo de Smad (S2 o S3 o 
S4) para poder ser regulados (9, 10). 
 
En conclusión, las proteínas Smads podrían constituir una gran diversidad de 
mecanismos de regulación transcripcional de genes en contextos específicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
1.4 Mecanismos de regulación de la señal del TGF-β 
 
Dada la importancia que tiene en distintos procesos celulares la vía de transducción del 
TGF-β, existen diferentes mecanismos de regulación a varios niveles de la cascada de 
señalización. Algunos de estos mecanismos implican la degradación de diferentes 
componentes de la vía a través del sistema ubiquitina-proteosoma (UPS), como ocurre 
por ejemplo con las proteínas S2/3 activadas, con los receptores del TGF-β y con 
algunos correpresores transcripcionales de las Smads como TGIF, Ski y SnoN. Otros 
mecanismos incluyen la desfosforilación de las Smads que conducen a su 
conformación monomérica y su exportación del núcleo y retención en citoplasma. 
También las proteínas HSP70 y HSP72 (Heat Shock Protein) se asocian a las R-Smads 
para prevenir su fosforilación y translocación al núcleo (1-8, 11, 12). 
 
La duración e intensidad de la señal del TGF-β también puede ser regulada por 
distintas proteínas que participan en un proceso de retroalimentación negativa, como 
por ejemplo Smad7 y TMEPAI, ambos genes blanco de las Smads. La proteína Smad7 
se une al receptor TβRI para evitar la unión de las R-Smad y reclutar ligasas E3 de 
ubiquitina para promover la degradación de los receptores del TGF-β a través del 
proteosoma (3-7, 11). La proteína Smad7 también puede reclutar fosfatasas al TβRI 
para desfosforilarlo y controlar la señalización e incluso se ha sugerido que puede 
actuar bloqueando la actividad transcripcional de complejos activos de las Smads en el 
núcleo. En cuanto a TMEPAI (transmembrane prostate androgen induced RNA), es una 
proteína transmembranal que secuestra a las proteínas R-Smads para evitar que sean 
activadas por la cinasa del TβRI (ALK5) (13). 
 
Otro mecanismo de regulación de la vía, el cual se tratará con más detalle, consiste en 
la inhibición de la función transcripcional de las Smads por algunos correpresores como 
Ski y SnoN. 
 
 
14 
 
1.5 Generalidades de SnoN y Ski 
Las proteínas SnoN y Ski son miembros de la familia de protooncoproteínas Ski, las 
cuales se identificaron por su homología con el producto del oncogen retroviral Sloan 
Kettering (v-ski) que causa la transformación de fibroblastos embrionarios de pollo e 
hipertrofia muscular en ratón (14, 15). A la fecha, se han descrito en el humano cuatro 
isoformas de SnoN: SnoN, SnoN2, SnoA y SnoI, resultado de procesamiento 
alternativo, mientras que en el ratón sólo se conocen dos isoformas que son SnoN y 
SnoN2 (14-19). Estructuralmente se sabe que la región NH2-terminal de estas proteínas 
presenta una región conservada de aproximadamente 270 aminoácidos, la cual es 
necesaria y suficiente para la actividad de transformación y diferenciación que tienen 
los miembros de esta familia de proteínas. En cambio, la región COOH-terminal 
presenta una baja similitud entre los miembros. En esta región se presentan dominios 
para la homo o heterodimerización de estas proteínas (14-19). 
 
Las proteínas SnoN y Ski tienen capacidad de asociarse a las proteínas Smads. Dentro 
de la región homóloga de estas proteínas, se exhibe el dominio conservado SAND, el 
cual mediante una asa llamada “I-loop” interacciona con el asa L3 de S4 
constitutivamente (1,16). Esta característica confiere la habilidad de SnoN y Ski de 
interactuar con S4 aun en ausencia de la señal del TGF-β. Además SnoN y Ski 
presentan una secuencia de aproximadamente 97 aminoácidos en la región NH2-
terminal, a través de la cual se pueden unir con el dominio MH2 de S2 y S3 de manera 
dependiente de la señal del TGF-β, es decir con S2 y 3 fosforiladas (20, 21). De esta 
forma se ha descrito que homo o heterodímeros de SnoN y Ski pueden asociarse con 
las proteínas Smads y reprimir su actividad transcripcional (47). 
 
 
 
 
 
15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Representación de la estructura de los miembros de la familia de 
protooncoproteínas Ski. 
Los miembros de esta familia tienen su región NH2-terminal altamente conservada y presentan 
una secuencia suficiente para la actividad transformante de estas proteínas. En la región 
COOH-terminal existen dominios de homo o heterodimerización. Aminoácidos, aa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
1.6 SnoN y Ski regulan la señal del TGF-β 
Se han sugerido algunos modelos para tratar de entender cómo SnoN y Ski a través de 
su unión con las proteínas Smads regulan la señal del TGF-β. Por una parte se ha 
propuesto que SnoN y Ski pueden unirse a las proteínas Smads cuando ya se 
encuentran posicionadas sobre sus promotores blanco, para entonces reclutar 
maquinaria represora que puede incluir a proteínas como N-CoR, mSin3A, HIPK2 y 
MeCP2, que a su vez reclutan otras proteínas con actividad de desacetilasas de 
histonas (HDACs), con lo cual además previenen la unión de coactivadores como 
p300/CBP y de esta forma reprimen la expresión de genes blanco del TGF-β (44-47). 
Sin embargo, pocos reportes se tienen al respecto. 
 
Otro mecanismo propuesto surge del estudio de la localización subcelular de las 
proteínas SnoN y Ski. Por ejemplo, se ha visto que SnoN se localiza en el citoplasma 
de tejidos normales, así como de células no malignas, mientras que en líneas 
cancerosas y en tejidos malignos, algunos autores han encontrado que es una proteína 
exclusivamente nuclear (22). Es probable que en ciertos tipos de tumores haya un 
cambio en la localización subcelular de SnoN, predominantemente en el núcleo. En 
cuanto a Ski, se ha caracterizadopor ser una proteína nuclear, pero en algunos tejidos 
o líneas celulares tumorales se ha reportado su localización citoplasmática (15, 16). 
 
En otro estudio se ha descrito que la sobreexpresión de SnoN silvestre mantiene su 
localización nuclear y no afecta la acumulación de las proteínas R-Smad activadas en el 
núcleo, mientras que la sobreexpresión de la mutante de SnoN cuyo motivo estructural 
para la importación nuclear fue eliminada, permanece y retiene a las R-Smads en el 
citoplasma en presencia del TGF-β, conduciendo a la falta de activación de genes 
reporteros que responden a la señal del TGF-β/Smad (22). Lo anterior sugiere que 
SnoN en el citoplasma es capaz de secuestrar a las R-Smads, con el objetivo de 
impedir que los complejos activos de las proteínas Smads se unan a sus promotores 
blanco y evitar así la activación de genes que responden al TGF-β; es posible que Ski 
pueda ejercer un mecanismo similar (Fig. 4). 
17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Mecanismos propuestos de regulación de genes blanco del TGF-β por SnoN y 
Ski 
A) Las proteínas Smads (S2, S3, S4) regulan positivamente sus genes blanco, al unirse a las 
secuencias SBE localizadas en los promotores de dichos genes, mediante la interacción con 
otros FTs (factores transcripcionales) y cofactores. 
B) Los genes blanco del TGF-β puede regularse negativamente por SnoN y Ski por dos 
mecanismos. 1) SnoN y Ski pueden unirse a las proteínas Smads y evitar su unión a los 
promotores. 2) SnoN y Ski pueden unirse a través de las Smads a promotores específicos y 
reclutar diversos correpresores para evitar la expresión de genes blanco de las Smads. 
 
 
 
A. 
B. 
1) 2) 
18 
 
1.7 El TGF-β regula la expresión de SnoN y Ski 
 
Las proteínas SnoN y Ski cumplen la función de regular la señal del TGF-β, por lo que 
su expresión y estabilidad repercute sobre esta función; interesantemente, el TGF-β es 
un factor clave en la regulación de la expresión de estas proteínas. En distintos tipos 
celulares, se ha reportado que el tratamiento con el TGF-β a tiempos cortos de 
estimulación (15-30 min) regula los niveles de las proteínas SnoN y Ski, al inducir su 
degradación vía el sistema ubiquitina-proteosoma (UPS). Lo anterior ocurre a través de 
una interacción directa de SnoN y Ski con las proteínas R-Smads activadas, que sirven 
como reclutadoras y adaptadoras para las ligasas E3 de ubiquitina APC, Smurf2, y 
Arkadia (28-36). 
 
Posteriormente, 1 ó 2 h después del estímulo con el TGF-β hay un incremento en los 
niveles del ARNm y de la proteína SnoN, pero no de Ski, indicando una diferencia 
importante entre ambas proteínas y destacando al gen que codifica para la proteína 
SnoN, como un gen inducible por el TGF-β. Este gen se conoce como sno, snoN o skil 
(snoN/skil). En este caso, se ha propuesto que el aumento en los niveles de la proteína 
SnoN podría funcionar como un asa de retroalimentación negativa para inactivar la 
señal del TGF-β (23, 26). 
 
En cuanto a Ski, se ha observado que tras su degradación inducida por el TGF-β los 
niveles de esta proteína se mantienen bajos mientras la señal del TGF-β se encuentre 
activa, y solamente ocurre una recuperación de los niveles de Ski al no detectarse la 
presencia de Smads activadas, es decir, cuando la señal del TGF-β ha terminado (23). 
De esta manera, tanto las proteínas SnoN y Ski como sus genes correspondientes son 
regulados diferencialmente por el TGF-β y por ende sus funciones en el contexto del 
TGF-β podrían ser distintas o independientes. Este trabajo se centrará en estudiar la 
regulación y relevancia de la expresión de SnoN, por ser parte de un proceso de 
retroalimentación negativa para controlar la señal del TGF-β. 
 
19 
 
1.8 La importancia de la expresión de SnoN 
SnoN es una proteína sintetizada en bajos niveles virtualmente en todos los tejidos 
adultos y embrionarios, sin embargo, existe un importante cambio de expresión en 
algunos estados fisiológicos específicos y en diversas patologías. Uno de los aspectos 
más relevantes es la implicación de SnoN en la tumorigénesis. En varios estudios se ha 
demostrado que SnoN es una oncoproteína, porque la sobreexpresión de dicho gen 
resulta en una transformación oncogénica de fibroblastos embrionarios de pollo. La 
proteína SnoN es abundante en diferentes tipos de cáncer y líneas celulares tumorales 
humanas derivadas de melanoma, de cáncer de seno, pulmón, esófago, estómago y 
próstata, entre otras (14-16, 34, 55). 
 
Se ha demostrado con ratones deficientes del gen snoN/skil un incremento en la 
susceptibilidad a carcinógenos químicos, mientras que en ratones knockout la ausencia 
de snoN/skil es letal para la embriogénesis (15). Además, recientemente en 
experimentos con ratones desnudos, se ha visto que el xenotransplante derivado de las 
células A549 (adenocarcinoma de pulmón humano), las cuales presentan niveles 
elevados de SnoN, favorece la formación de tumores, mientras que esto no ocurre en 
ratones con xenotransplante derivado de las mismas células pero con los niveles de 
SnoN abatidos por ARN interferente contra SnoN. Sin embargo, a pesar de que la 
ausencia de SnoN evita el desarrollo del tumor, favorece la metástasis (27). Tales 
resultados indican el papel dual de SnoN como oncogén o supresor de tumores 
dependiendo del tipo celular. 
 
La complejidad de la función de SnoN se ha relacionado con el papel dual que presenta 
el TGF-β. La proliferación es inhibida por las Smads en células no transformadas. En 
contraste, las células tumorales pierden su habilidad para responder a los efectos 
antiproliferativos del TGF-β y progresan a un estado maligno. En estas células el TGF-β 
funciona como un inductor de la transición de epitelio a mesénquima (EMT) 
conduciendo a un incremento de la metástasis e invasión (12, 27). En estos eventos la 
regulación de los niveles de Ski y SnoN pudiera estar implicada. 
20 
 
Se ha tratado de esclarecer la sobreexpresión de SnoN en diversos tipos de cáncer. La 
resistencia a la degradación de SnoN podría ser un mecanismo para explicar la 
resistencia a la antiproliferación inducida por el TGF-β en cáncer esofágico (34), y 
posiblemente en otros tipos de cáncer. SnoN junto con Ski han sido implicados además 
en otras patologías relacionadas con el efecto profibrótico del TGF-β tales como 
alteraciones renales crónicas. La disminución de los correpresores Ski y SnoN ocurre 
progresivamente con el curso de algunos modelos de fibrosis renal, es decir, que 
inicialmente en un riñón normal se encuentran niveles elevados de SnoN y Ski, los 
cuales se reducen en el riñón en un estado fibrótico inducido en ratón, lo que indica que 
estos correpresores de las Smads antagonizan la acción del TGF-β y su disminución 
puede jugar un papel importante en la patogénesis de la fibrosis renal crónica (33). 
 
La proteína SnoN también es importante en diversos procesos fisiológicos. En algunos 
estudios empleando un modelo de proliferación celular diferente al de cáncer, que 
consiste en la regeneración hepática, se ha observado un incremento en los niveles de 
Ski y SnoN, principalmente durante la fase de proliferación celular, indicando que estas 
proteínas son capaces de inhibir la actividad de las Smads con el objetivo de permitir la 
proliferación celular en el proceso de regeneración del hígado ante la presencia de las 
señales antiproliferativas del TGF-β (32). 
 
Otro proceso en donde SnoN ha sido implicado es la diferenciación celular. La 
sobreexpresión de SnoN conduce a la diferenciación muscular de células embrionarias 
de codorniz. El ratón transgénico que sobreexpresa a SnoN conduce a alteraciones en 
las fibras musculares tipo I, indicando la relevancia de SnoN en el proceso de 
diferenciación muscular (14-17). En nuestro laboratorio se han observado altos niveles 
del ARNm de snoN/skil en miotubos (células musculares diferenciadas) comparadocon 
los niveles en mioblastos (células musculares no diferenciadas). Por lo tanto la 
regulación a nivel transcripcional de snoN/skil en una célula diferenciada parece ser 
diferente que en una célula no diferenciada. 
 
21 
 
En cuanto a otros estímulos que regulen la expresión del gen snoN/skil y la abundancia 
de la proteína SnoN, existen al menos dos reportes. Uno de ellos demostró que el HGF 
(factor de crecimiento de hepatocitos) puede inducir la expresión expresión del gen e 
incrementar los niveles de la proteína SnoN en células epiteliales de riñón HKC-8 (35). 
 
También se ha demostrado que la anisomicina (ANISO), un inhibidor de la síntesis de 
proteínas y potente activador de las vías de MAPKs, es capaz de inducir la degradación 
de SnoN por un mecanismo independiente de las Smads, de la activación de MAPKs y 
de la inhibición de la síntesis de proteínas. Además el efecto de ANISO se ha obsevado 
solo en las células humanas Hela (cáncer cervical), A549 (cáncer de pulmón) y las 
AD293 (riñón embrionario) pero no en las células HepG2 (hepatoma humano) y Mv1Lu 
(pulmón de visón). Lo anterior sugiere que existen mecanismos alternos que pueden 
regular la expresión del gen y los niveles de la proteína SnoN que son independientes 
de la vía del TGF-β, pero que son dependientes del tipo y context celular (36). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
2. ANTECEDENTES 
 
2.1 El gen snoN/skil es regulado por la vía del TGF-β/Smad 
 
Se ha demostrado que las proteínas SnoN y Ski son degradadas vía UPS en respuesta 
al TGF-β a través de las R-Smads activadas. Este evento se presume, permite a las 
Smads activar la transcripción de genes de respuesta al TGF-β. Pero además, se ha 
visto que a tiempos largos de estimulación (1 h, 2 h o más), el TGF-β induce un 
incremento del ARNm y de la proteína SnoN. El efecto del TGF-β sobre la expresión del 
gen snoN/skil hace posible que se regule dicha señal mediante un asa de 
retroalimentación negativa (35, 36). Ante estas circunstancias un hecho importante es el 
tratar de entender cómo el TGF-β regula la expresión del gen snoN/skil a nivel 
transcripcional, siendo un punto clave el análisis y la caracterización de su promotor. 
 
Recientemente el promotor del gen snoN/skil de ratón se clonó y caracterizó 
parcialmente en fibroblastos de ratón (29). En dicho trabajo se señaló la presencia de 
un conjunto de varios elementos de unión a Smad (SBE) comprendida en la región 
promotora del gen de aproximadamente 400 bp (Fig. 5A). Mediante ensayos de 
“footprinting” se demostró que las proteínas Smads se unen al promotor de snoN/skil, 
en 4 secuencias específicas que denotaron como secuencia SBE 1, 2, 3 y 4; a través 
de geles de retardo (EMSAs), se observó que mutaciones específicas en estas 
secuencias SBE, afectan la interacción de las Smads con el promotor. Por medio de 
estudios con genes reporteros, señalan que mutaciones independientes en cualquiera 
de las secuencias SBE no influyen considerablemente en la actividad promotora, 
mientras que si las cuatro secuencias SBE son mutadas se abate dicha actividad (29). 
En este trabajo para su mejor comprensión denominamos al conjunto de las secuencias 
SBE 1, 2, 3 y 4 como elemento que responde al TGF-β (TRE). 
 
Otro dato interesante de este estudio, es que S2 y S3 regulan diferencialmente al gen 
snoN/skil. El complejo S2/4 se une a las secuencias SBE para inducir la expresión de 
snoN/skil, pero no así S3, la cual se une a una secuencia de ADN diferente a las 
23 
 
secuencias SBE, denominada SIE (elemento inhibidor de Smad), para inhibir la 
activación del promotor del gen snoN/skil (Fig.5) (29). 
 
2.2 El requerimiento de Smad4 en la regulación de la expresión de 
snoN/skil por el TGF-β 
 
En diversos estudios se ha destacado la importancia de Smad4 (S4) en la regulación de 
genes blanco del TGF-β. Hasta ahora, a través de ensayos con microarreglos, ARN 
interferente contra S4 y usando células cancerosas que no expresan al gen smad4, se 
han establecido grupos de genes que pueden ser regulados positivamente por el TGF-β 
en presencia o ausencia de S4 (S4-independientes), mientras que otros requieren 
forzosamente la presencia de dicha proteína para poder activarse (S4-dependientes) 
(37-43). 
 
Al respecto, algunos análisis de microarreglos sugieren que el gen snoN/skil podría ser 
inducido por TGF-β de forma independiente a la presencia de la proteína S4 (54), pero 
algunos otros, sugiere que TGF-β induce la expresión del gen snoN/skil de manera S4-
dependiente (40). Además, en un análisis global se identificó la unión de la proteína S4 
sobre el promotor del gen snoN/skil en células epiteliales HaCaT (42). Resulta por tanto 
importante definir el papel de S4 en la regulación del gen snoN/skil, considerando el 
hecho de que distintas líneas celulares cancerosas que incluyen las de cáncer de 
páncreas, colon, esófago y próstata presentan bajos o nulos niveles de S4 y una alta 
expresión de SnoN a nivel de ARNm y proteína (43). 
 
 
2.3 El gen smad7 es blanco de las proteínas Smad, Ski y SnoN 
 
A pesar de que dadas sus funciones TGF-β debe tener un gran número de genes 
blanco, a la fecha muy pocos han sido descritos, y poco se ha estudiado acerca de sus 
mecanismos de regulación. Además, se presume que SnoN y Ski potencialmente 
podrían reprimir a la mayoría de los genes blanco del TGF-β por ser correpresores de 
las Smads, sin embargo hasta ahora solo se ha caracterizado su participación en la 
24 
 
regulación de la expresión del gen smad7 (-408/+112 bp), un gen blanco del TGF-β, en 
cuyo promotor está presente un sitio de unión SBE (23,24,46). 
 
En las células HepG2 y A549, la expresión de smad7 es reprimida por SnoN y Ski en 
condiciones basales. El estímulo del TGF-β induce rápidamente la degradación de Ski y 
SnoN causando una disminución de los niveles de estas proteínas. Luego de 2 h del 
estímulo, el TGF-β induce un incremento del ARNm y de la proteína SnoN, la cual 
nuevamente se une y reprime al promotor del gen de smad7 (23). Es probable que este 
mecanismo de regulación de la señal del TGF-β por Ski y SnoN se lleve a cabo sobre 
otros genes regulados por las proteínas Smads, entre ellos el gen snoN/skil. 
 
2.4 Ski se asocia con diversos correpresores y HDACs 
 
En diversos estudios de “pull down”, coinmunoprecipitación y doble híbrido se ha 
demostrado que Ski, puede asociarse con un gran número de correpresores que 
incluyen NCoR, SMRT, mSin3, MeCP2 y a HDACs, además de asociarse a las Smads y 
a SnoN (37-43, 56, 57). Dada la homología de SnoN y Ski, se presume que SnoN 
puede también asociarse con dichas proteínas. Además en un estudio se purificaron 
complejos proteicos que contenían a Ski y se observó que éstos también estaban 
conformados por proteínas como HDAC3 (histone deacetylase 3) y PRMT5 (protein 
arginine methyltransferase) y las S2, 3 y 4 (46). Mediante ensayos de ChIP 
comprobaron que estos complejos están sobre la región promotora del gen smad7. Así, 
Ski es parte de un complejo que incluye a las proteínas HDACs y PRMT5 para 
mantener reprimido al gen smad7 (46). Lo anterior no ha sido demostrado para SnoN. 
 
2.5 Ski requiere a la proteína Smad4 para unirse al promotor del gen 
smad7 y reprimir su expresión 
 
La proteína S4 es importante en la regulación positiva de algunos genes por el TGF-
β (genes S4-dependientes), pero también S4 parece ser crítico en la represión génica 
por Ski. Recientemente se ha demostrado que Ski requiere a la proteína S4 para unirse 
al promotor de smad7 para reprimir su expresión en ausencia del estímulo del TGF-β 
25 
 
(24, 46). Se desconoce si SnoN también requiere la asociación de S4 para unirse a los 
promotores de sus genes blanco y poder regular su expresión. 
 
ATG
TRE
1 2 3 4
SIE
SBEs
-2.8 -2.4 +1
Promotor snoN/skil
Zhu K, 2005MeCP2
SMRT
Ski
NCoR
mSin3
SnoN
Shunsuke Ishii 1999, 2000, 2001
Denissova NG, Liu F, 2004
Shunsuke Ishii 2009
Briones Orta ,2007
PRMT5
HDAC3
SBE
Ski
smad7
SnoN
X SBE
smad7
SBE
smad7
SnoN
X
Basal
TGF-β (45min)
TGF-β (2h)
Briones Orta ,2007 Briones Orta ,2007
SnoN, Ski y las Smad regulan diferencialmente la expresión de smad7
Ski interacciona con Smad4, SnoN y diversos 
correpresores transcripcionales
El promotor snoN/skil de ratón tiene elementos 
responsivos a TGF-β
A.
B.
C.
 
 
Figura 5. Representación de algunos antecedentes importantes para este trabajo. 
A) En el promotor de snoN/skil de ratón se identificó: un elemento que responde a TGF-β (TRE) 
compuesto por 4 secuencias SBE y un elemento inhibidor de las Smads (SIE). 
B) Se ha demostrado que Ski puede asociarse con SnoN, Smad4 (S4) y distintos correpresores. 
C) Ski y TGF-β regulan diferencialmente la expresión del gen smad7. En ausencia del estímulo 
de TGF-β, Ski se une al promotor de smad7 a través de su unión con S4 y puede estar 
asociado a SnoN, HDAC3 y PRMT5. Las Smads activadas por TGF-β desplazan al complejo 
represor del promotor del gen de smad7 para inducir su expresión. Después de 2 h de estímulo 
con TGF-β, se ha detectado a SnoN unido al promotor smad7. 
 
A. 
B. 
C. 
26 
 
2.6 SnoN como regulador transcripcional 
 
Las evidencias de que SnoN funciona como un regulador transcripcional se han 
incrementado recientemente (23, 48-51). El estudio más completo, como ya se 
mencionó, se basa en la regulación del promotor del gen smad7, en donde SnoN actúa 
como un correpresor de las Smads (23). No obstante, otros estudios han surgido y 
revelan que el contexto y el tipo celular juegan un papel crítico sobre las funciones de 
SnoN. Por ejemplo, la proteína SnoN se asocia con las Smads, p53 y mSin3A para 
reprimir la transcripción de la alfa-fetoproteína (AFP) en las células hepáticas no 
transformadas. Sin embargo, esta regulación no ocurre en las células de hepatoma, en 
donde la expresión de la AFP esta desreprimida y es considerada como un marcador 
tumoral (48). Otro ejemplo es el gen que codifica para la proteína ADAM12, una 
metaloproteasa-desintegrina, el cual es regulado positivamente por el TGF-β y 
negativamente por SnoN en las células de fibroblastos de ratón NIH3T3 (49). 
 
Algunos otros estudios indican que SnoN actúa como un coactivador al asociarse con la 
proteína ING2 y favorecer la activación del gen reportero 3TP-Lux por el TGF-β en la 
línea Mv1Lu, que son células epiteliales de pulmón de visón, pero no en las células 
humanas de cáncer cervical HeLa o en las células de queratinocitos HaCat (50). 
Además, recientemente se ha demostrado que SnoN puede asociarse con el receptor a 
estrógenos alfa (ERα) en el promotor de gen TTF1, para aumentar su expresión e 
incrementar la tasa de proliferación de las células de cáncer de mama MCF7 (51). De 
esta forma, en estos estudios se establece la influencia del contexto y tipo celular sobre 
la actividad de regulador transcripcional de SnoN (Tabla 1). 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
En resumen estos antecedentes señalan que, la proteína SnoN es codificada por el gen 
snoN/skil, el cual podría ser inducido por la vía del TGF-β/Smad de forma dependiente o 
independiente de la proteína S4. Además, Ski, S4 y el propio SnoN podrían regular 
negativamente la expresión del gen snoN/skil como lo hacen con el gen de smad7. No 
obstante, la función de SnoN como regulador transcripcional parece depender del 
contexto y del tipo celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gen Proteínas 
asociadas 
Regulación 
por SnoN 
Tipo cellular Referencia 
Smad7 Smad4 Negativa A549 (cáncer pulmón) 
HepG2 (hepatocarcinoma) 
23 
AFP (alfafetoproteína) Smad/p53/mSin3 Negativa Tejido hígado ratón adulto 48 
ADAM12 -- Negativa NH3T3 (Fibroblasto 
embrionario de ratón) 
49 
3TP-lux (reportero) ING2 Positiva Mv1Lu (células epiteliales de 
visón) 
50 
TTF1 (Factor de 
transcripción tiroideo) 
ERα Positiva MCF7 (cáncer de mama) 51 
Tabla 1. Ejemplos de la participación de SnoN como regulador transcripcional 
28 
 
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
SnoN participa en diversos eventos celulares como la tumorigénesis, la regeneración 
hepática, la diferenciación muscular y la fibrosis renal, entre otros (15, 22, 27, 32-34). 
En distintos tipos de cáncer por ejemplo, se han identificado altos niveles tanto del 
ARNm como de proteína SnoN. Por ende, en la homeostasis celular son importantes 
los mecanismos de regulación de la expresión del gen snoN/skil y de los niveles de la 
proteína SnoN. Algunos estudios han demostrado que lós niveles de la proteína SnoN 
se regula de manera bifásica por el TGF-β. Esta regulación consiste en la disminución 
en los niveles de la proteína SnoN tras el estimulo del TGF-β (30 min) y el posterior 
incremento en los niveles de ARNm y la proteína SnoN a las 2 h después del estímulo. 
A pesar de ello, no son claros los mecanismos implicados en esta regulación, ni sus 
consecuencias en la regulación de genes blanco de las Smads y en los efectos 
fenotípicos resultantes en ciertos tipos celulares. 
 
A nivel transcripcional se sabe que el gen snoN/skil es inducido por el TGF-β a través 
del complejo S2/S4, pero dicha caracterización se llevo a cabo solo parcialmente para 
el gen snoN/skil murino y en líneas transformadas de fibroblastos de ratón. La 
caracterización del promotor del gen snoN/skil y su regulación por el TGF-β no se ha 
estudiado en humano (25). Además no se ha demostrado claramente el requerimiento 
de S4 en la inducción del gen snoN/skil por TGF-β. 
 
Si bien la activación del gen snoN/skil por el TGF-β resulta relevante, otro punto crucial 
es entender cómo se regula negativamente la expresión de dicho gen. Hasta ahora, no 
se ha estudiado si SnoN puede autoregular su expresión a nivel transcripcional y cuáles 
serían los mecanismos implicados en ello. El gen snoN/skil podría ser un nuevo gen 
regulado diferencialmente por SnoN y las Smads. 
 
 
 
 
29 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Modelos que describen el planteamiento del problema 
Los esquemas muestran los dos principales aspectos que se pretende abordar en este trabajo: 
A) La represión transcripcional. En este caso se busca entender cómo SnoN junto con Ski 
pueden estar participando en el control de la expresión del gen snoN/skil en ausencia de la 
señal del TGF-β, cuál es la participación de HDACs y cuál es la importancia de S4 en este 
proceso. B) La activación transcripcional. Se pretende entender cómo las Smad activadas por 
el TGF-β puede regular positivamente la activación de snoN/skil y el requimiento que S4 tiene 
en estos procesos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A. B. 
30 
 
4. HIPÓTESIS 
 
El correpresor SnoN a través de la proteína Smad4 podría unirse a la secuencia TRE 
del promotor del gen snoN/skil humano para reprimir su expresión génica. 
 
 
5. OBJETIVOS 
 
General: 
 
Establecer si la proteína SnoN se une a la secuencia TRE del promotor del gen 
snoN/skil humano para regular su expresión, así como los mecanismos implicados en 
ello y las consecuencias fisiológicas de dicha regulación. 
 
Particulares: 
 
1. Definir la región promotora del gen snoN/skil humano que responde al TGF-
β (TRE). 
2. Determinar el efecto del TGF-β sobre la actividad del promotor del gen 
snoN/skil que contiene la secuencia TRE, así como su efecto sobre los 
niveles de ARNm y de la proteína SnoN. 
3. Establecer si SnoN puede unirse a la secuencia TRE del promotor del gen 
snoN/skil y definir su función en la regulación de dicho gen. 
4. Estudiar el requerimiento de la degradación de la proteína SnoN en la 
regulación de la expresión del gen snoN/skil. 
5. Definir el requerimiento de la proteína Smad4 en la regulación de la expresión 
del gen snoN/skil por el TGF-β y SnoN. 
6. Demostrar la relevancia fisiológica de la regulación de la expresiónde SnoN 
en algunos tipos celulares. 
 
 
31 
 
6. MATERIAL Y MÉTODOS 
 
6.1 Clonación de regiones promotoras del gen snoN/skil humano 
 
Una secuencia de ~5 kb localizada río arriba del ATG del gen snoN/skil humano se 
obtuvo del GenBank (AC073288) y se analizó con distintas herramientas 
bioinformáticas (Apéndice, Tabla 1). 
 
Posteriormente, a partir de ADN genómico humano se amplificaron dos productos de 
PCR correspondiente al promotor del gen snoN/skil, uno que contiene la secuencia TRE 
y el TSS (408 bp) y otro que contiene la secuencias TRE, SIE y el TSS (648 bp), los 
cuales están localizados a -3100/-2692 y -3100/-2451 del ATG (+1), respectivamente. 
Se usó AccuPrime GC-rich DNA polimerasa (Invitrogen) y oligonucleótidos específicos 
(Apéndice, Tabla 2) que incluyen sitios de restricción para KpnI y SacI. El plásmido 
reportero usado para la clonación fue el vector pGL3-Basic (Promega), a través de los 
sitios KpnI y SacI, para generar las construcciones skilSBEs(408)-Luc (fragmento de 
ADN 408 bp) y skilSBEs(648)-Luc (fragmento de ADN 648 bp). La secuencia TRE se 
subclonó con la orientación invertida en pGL3-Basic. Primero, el fragmento de ADN de 
408 bp se clonó mediante los sitios KpnI y XhoI en pcDNA3.1 y luego el inserto se 
subclonó mediante los sitios XhoI y HindIII en pGL3-Basic para obtener la construcción 
skilSBEs(408, 3’-5’)-Luc. El fragmento de ADN de 408bp del promotor del gen snoN/skil 
también se clonó dentro de los sitios KpnI y SacI en el vector pGL3-E1B-Luc que 
contiene el promotor mínimo E1B, para generar la construcción skilSBEs(408)-E1B-Luc. 
Todas las construcciones se secuenciaron. 
 
6.2 Mutagénesis dirigida 
 
Las mutantes DmSnoN(∆S2/S3/S4) y UBmSnoN (KK437,446AA) se generaron por 
mutagenesis dirigida sobre pCIneo/HA-SnoN (WT) usando oligonucleótidos específicos 
para la mutación (Apéndice, Tabla 3), y de acuerdo a las instrucciones de Stratagene. 
Todas las mutaciones se corroboraron por secuenciación. 
32 
 
6.3 Líneas celulares 
 
Se utilizaron las células AD293 (epiteliales de riñón embrionario humano), las A549 
(adenocarcinoma de pulmón humano), las HepG2 (hepatoma de humano) y las células 
SW480 (cáncer de colon humano). Las células A549 y SW480 se cultivaron en medio 
F12-Ham’s (Gibco BRL), mientras que las HepG2 y AD293 en DMEM (Gibco BRL). En 
todos los casos el medio se complementó con 10% Suero Bovino Fetal (FBS), excepto 
en las SW480 en donde se utilizó 5% FBS (Multicell, Wisent) con 100 U/ml de 
penicilina/estreptomicina. Las células AD293 y A549 que expresan establemente 
pRS/shSnoN (Cat. No.TR309425 from OriGene), pRetroSuper/shSmad4J hygro 
(Addgene plasmid 19151) o pBabe/Smad4J Rescue (Addgene plasmid 19153) se 
mantuvieron en medio con 10 µg/mL puromicina o 200 µg/mL higromicina (Invitrogen) 
como antibiótico de selección. 
 
6.4 Ensayo de Luciferasa 
 
Para el ensayo de luciferasa, las células A549 se transfectaron transitoriamente usando 
lipofectamina (Invitrogen), y las células AD293, HepG2 y SW480 por el método de 
fosfato de calcio. Para estos ensayos, las células se transfectaron con los plásmidos 
reporteros, plásmidos con el cDNA para SnoN, Ski, o Smad, entre otros indicados en 
cada figura, y con el plásmido que contiene al gen de la β-galactosidasa bajo el 
promotor CMV (pCMV-βgal) que sirvió para evaluar la eficiencia de transfección y 
normalizar los datos de luciferasa. 
 
6.5 Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP y ChIP en plásmido ) 
 
Las soluciones empleadas para esta técnica se describen en el Apéndice. 
Preparación de la cromatina. La cromatina se obtuvo de las células A549, con un 90% 
de confluencia y en ayuno de ~12 h previas al experimento o 2 h antes del estímulo con 
el TGF-β. La estimulación se realizó durante 45 min o 2 h. Posteriormente las células 
se trataron con formaldehído al 11 %, a 37°C por 20 min, con el fin de entrecruzar a las 
33 
 
proteínas con el ADN. La reacción se detuvo con la adición de glicina 0.2 M a 4°C 
durante 5 min. Las células se recolectaron y lavaron en PBS, y se centrifugaron a 2000 
g. 
 
La extracción de núcleos se efectuó al resuspender la pastilla de células con 5 ml de 
amortiguador de lisis (amortiguador 1) incubando durante 10 min a 4°C en agitación y 
centrifugando a continuación a 2000 g. La pastilla obtenida se agitó 10 min a 4°C y se 
resuspendió en 4 ml de amortiguador 2. La pastilla conformada por los núcleos de las 
células, se resuspendió con 3 ml de amortiguador 3. En el amortiguador 3 se sonicó 10 
veces en hielo, con ciclos de 30 s de sonicación y 1 min de descanso, con un sonicador 
Fisher Sonic Dismembrator 300. 
 
La cromatina obtenida se preincubó con 30 µl de proteína G bloqueada previamente 
como se indica en el apéndice, mezclándola toda la noche a 4ºC. Al otro día se 
centrifugó a 16,000 g, y se transfirió el sobrenadante (cromatina “limpia”) a un tubo 
nuevo, y después se guardó a –70°C, o se continúo con el protocolo. 
 
Inmunoprecipitación de cromatina. Con la cromatina “limpia” se realizó la 
inmunoprecipitación de proteínas de interés, utilizando 250 µl de cromatina, 250 µl de 
amortiguador de precipitación y 5 μl del anticuerpo correspondiente. Se reservaron 100 
µl de cromatina en un tubo adicional, por cada condición experimental, para cuantificar 
la cantidad inicial de cromatina (“input”). La mezcla de cromatina y anticuerpo se incubó 
toda la noche a 4°C en agitación, al día siguiente se agregaron 20 µl de proteína G y se 
incubó a 4°C durante 3 h en agitación. Las muestras se centrifugaron a 2000 g por 1 
min, se eliminó el sobrenadante y se agregó 1 ml del amortiguador de lavado, y se 
mantuvo en agitación 2 min. Los lavados de las perlas se realizaron 7 veces con el 
amortiguador de lavado y una con TE. La pastilla de proteína G se resuspendió en 100 
µl de TE y se agregó también 1 µl de RNasa, 5 µl de SDS 10 % y 1 µl de proteinasa K 
a 20 mg/ml. Las muestras se incubaron a 55°C por 3 h, después se cambiaron a 65°C y 
se incubaron toda la noche. 
 
34 
 
Recuperación del ADN. Las muestras se centrifugaron 1 min a 16,000 g y se recuperó 
el sobrenadante, al cual se añadió 1 volumen de fenol-cloroformo-isoamílico y se agitó, 
luego se centrifugó a 16,000 g a temperatura ambiente por 5 min. La fase acuosa se 
trató agregando 1 volumen de cloroformo y nuevamente las muestras se centrifugaron 
a 16,000 g a temperatura ambiente por 5 min. La capa acuosa obtenida se recuperó y 
se precipitó con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2, y 2.5 volúmenes de 
etanol absoluto a -70°C por 30 min. La pastilla de ADN se resuspendió en 20 µl de H20 
y se guardó a –20°C, hasta su uso. 
 
PCR. Las muestras de ADN obtenidas se amplificaron por PCR con las condiciones 
específicas para el promotor del gen snoN/skil. Las muestras se corrieron en un gel de 
agarosa al 2%. Al gel se le tomó una fotografía bajo luz ultravioleta, para identificar las 
bandas correspondientes del producto de interés. 
 
Para la técnica de ChIP en plásmido, las células AD293 se transfectaron por el método 
de lipofectamina (Invitrogen) con el plásmido reportero skilSBEs(408). A las 48 h 
posteriores a la transfección, las células se ayunaron y se siguió el protocolo antes 
descrito para el ensayo de ChIP. La amplificación se efectuó con oligonucleótidos que 
se unen al plásmido y delimitan la región en donde se encuentra clonado el promotor 
transfectado (Apéndice, Tabla 2). 
 
6.6 Inmunoprecipitación de cromatina secuencial (ReChIP) 
 
Los complejos ADN/proteína inmunoprecipitados se eluyeron con 400 µl de 
amortiguador de elución (50 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM NaHCO3) 
incubándose primero 10 minutos a 65°C y luego 20 minutos a temperatura ambiente en 
agitación. Posteriormente se centrifugó a 16,000 g por un minuto para obtener el primer 
eluido. A la pastilla resultante se le adicionó 60 µl de DTT 10 mM y se incubó 30 min a 
37°C,para luego centrifugarse a 16,000 g 1 min para obtener el segundo eluido. Este 
paso se repitió una vez más para obtener un tercer eluido. Los eluidos resultantes 
fueron mezclados y diluidos 20X en buffer de Re-ChIP (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 
35 
 
150 mM NaCl, y 20 mM Tris-HCl, pH 8.0), y después 1 h con 20 µl de proteína G 
bloqueada. El sobrenadante recuperado se utilizó para una segunda 
inmunoprecipitación con los anticuerpos indicados y se prosiguió con el protocolo de 
ChIP. 
 
6.7 Inmunoprecipitaciones y Western blots 
 
Las soluciones empleadas para esta técnica se muestran en el Apéndice. 
Los extractos de proteína y Western blots se llevaron a cabo de acuerdo a lo reportado 
por Macías-Silva et al. (2002). La lisis de las células se efectuó con el amortiguador 
TNTE 0.5% con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Los extractos de proteína se 
mezclaron 15 min en agitación a 4°C, para centrifugarse a 16,000 g por 15 min. 
 
Los extractos celulares se cuantificaron por el método de Bradford. Se utilizaron 2 mg 
de proteína para las inmunoprecipitaciones de los extractos totales y se incubaron con 3 
µl de anticuerpo correspondiente contra SnoN, Ski o Smad2/3 (Santa Cruz) o bien 
contra Smad4 o pSmad2 (Millipore) toda la noche. Posteriormente, se adicionaron 50µl 
de proteína G-agarosa (Invitrogen) diluida 1:5 con el amortiguador TNTE 0.1%, 
incubando 2 h. Se realizaron 3 lavados de los complejos con la proteína G con el 
amortiguador TNTE 0.1% durante 30 s a 16,000 g. 
 
Las pastillas de proteína G se solubilizaron en 20 µl de solución Laemmli y las muestras 
se hirvieron 5 min. Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-
PAGE) al 7.5% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas se 
incubaron toda la noche con anticuerpos primarios específicos (dilución 1:1000), y 
posteriormente se incubaron con anticuerpos secundarios acoplados a la enzima 
peroxidasa (dilución 1:10,000), que se detectó empleando el ensayo de 
quimioluminiscencia (kit ECL de Amersham, Life Sciences). 
 
 
 
36 
 
6.8 RT-PCR y Northern blot 
 
El ARN total de las células se purificó por el método de Trizol (Invitrogen). El ADNc se 
sintetizó a partir de 2 µg del ARN total usando una mezcla de hexámeros y a la enzima 
MMLV-RT (Invitrogen), y enseguida se llevo a cabo la amplificación de los ARNm de 
SnoN y β-actina por PCR usando a la Taq PCR master mix (Qiagen). Los productos de 
PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%, el gel fue teñido con bromuro de etidio y 
después visualizado y fotografiado bajo luz UV. 
 
Para el Northern blot, el ARN total se purificó de las células HepG2 o hepatocitos de 
ratón usando Trizol (Invitrogen), y se continuó con el protocolo previamente descrito 
(32). 
 
6.9 Ensayo de migración celular 
 
Para evaluar la capacidad de migración de las células A549 bajo diferentes condiciones 
se recurrió a la técnica de cierre de herida. Para ello, las células se sembraron en 
placas de 12 pozos hasta confluencia. Posteriormente las células se ayunaron 12 h. 
Posteriormente, con una punta de plástico estéril se realizó una herida sobre la 
monocapa celular, con el objetivo de dejar un espacio entre las células, cuya longitud 
fue determinada. Las células fueron tratadas con o sin TGF-β 50 pM. El proceso de 
cierre de herida se monitoreo a las 0, 24, 48 y 72 h. Este proceso consistió en la 
migración de las células, de forma tal que la longitud del espacio inicial generado por la 
herida disminuyó respecto al tiempo. Los resultados se presentaron como el porcentaje 
del cierre de herida de las muestras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1 La expresión del correpresor SnoN es regulada a diferentes 
niveles por el TGF-β 
 
Para entender la participación del TGF-β en la regulación de la expresión del 
correpresor SnoN, inicialmente se analizaron los niveles de su ARNm por la técnica de 
Northern blot, usando ARN total de las células de hepatoma humano HepG2 tratadas 
sin y con TGF-β y/o CHX y empleando una sonda que reconoce la isoforma SnoN. 
 
El tratamiento con TGF-β 300 pM por 1 h, fue capaz de inducir la expresión de tres 
transcritos de SnoN de diferente tamaño (6.5, 3.5 y 3.0 Kb), mientras que el 
pretratamiento con CHX promovió la acumulación de dichos transcritos en condiciones 
basales y de estimulación con TGF-β (Fig. 7A). Todos estos transcritos corresponden a 
la isoforma SnoN y la diferencia en el tamaño de los mismos radica en la longitud del 
3´UTR, lo cual coincide con datos que previamente se han reportado (17,18). 
 
Además, recientemente se han descrito al menos dos sitios de poli-adenilación en el 
3´UTR del gen snoN/skil, uno de ellos ubicado a ~3 Kb y el otro a ~7.2 Kb (Fig. 8D), que 
podrían explicar las diferencias en el tamaño de los transcritos de SnoN. No se sabe 
cómo surgen y cuál es la importancia de estas diferencias en el 3´UTR del gen 
snoN/skil, pero podrían ser también inducidas por el TGF-β y ser transcendentales en el 
control de la expresión, estabilidad y/o transporte del ARNm de SnoN. De esta forma, el 
TGF-β regula a nivel transcripcional la expresión de SnoN y podría participar también en 
su regulación pos-transcripcional. 
 
Mediante RT-PCR se estudió el efecto del TGF-β sobre los niveles del ARNm de SnoN 
a tiempos prolongados después del estímulo en las células de cáncer pulmón A549. El 
TGF-β incrementó los niveles de ARNm a las 2 h y éstos se mantuvieron altos hasta las 
8 horas posteriores al tratamiento (Fig. 7B). Para saber, si el mantenimiento de los altos 
niveles de ARNm se debían a la constante transcripción inducida por el TGF-β/Smad o 
debido a la vida media del ARNm, se llevo a cabo un tratamiento con las células A549 
38 
 
tratadas con TGF-β por 2 h, a las que se les adicionó el inhibidor SB431542 (SB43) o 
actinomicina (ACD) (Fig. 7C, panel superior). El SB43 es un inhibidor de la señal del 
TGF-β que bloquea la fosforilación de las R-Smads, mientras que la ACD es un 
inhibidor de la transcripción. 
 
De esta forma, las células A549 inicialmente se estimularon 2 h con el TGF-β y 
posteriormente se adicionó SB43 o ACD por 3 y 5 h más para cubrir 5 y 7 h de 
incubación, respectivamente (Fig. 7C, esquema). A las 2 h del estímulo con TGF-β los 
niveles de ARNm se incrementaron. El tratamiento con SB43 abatió parcialmente los 
niveles de ARNm de SnoN a las 5 h y totalmente a las 7 h de tratamiento. Sin embargo, 
el tratamiento con ACD reveló una discreta disminución en los niveles de ARNm de 
SnoN a las 5 y 7 h (Fig. 7C). Estos resultados indican que el mantenimiento de los 
niveles de ARNm de SnoN a tiempos largos de tratamiento con TGF-β se debe en gran 
parte a la vida media del ARNm y no a una constante transcripción. De manera 
interesante la estabilidad del ARNm de SnoN parece ser conferida por la vía TGF-
β/Smad, dado que al inhibir dicha vía se disminuyen los niveles del ARNm de SnoN. 
 
Para demostrar que la concentración de ACD empleada (5 µg/ml) realmente fue capaz 
de inhibir la transcripción se hizo una preincubación con ACD por 1 h y posteriormente 
se estimuló con TGF-β por 2 h. El pretratamiento con ACD inhibió la transcripción del 
gen de snoN/skil inducida por el TGF-β (Fig. 7D). De esta forma, el TGF-β regula la 
expresión del gen snoN/skil a nivel transcripcional pero también la estabilidad de su 
ARNm. En ambos casos aparentemente están involucradas las Smads. 
 
Es relevante mencionar que el TGF-β regula también la expresión de SnoN a nivel de 
proteína, a través de las Smads. Se ha reportando que el TGF-β, a tiempos cortos (15-
45 min), induce la degradación de SnoN, ya que las proteínas Smads activadas sirven 
como adaptadoras y reclutadoras de ligasas E3 de ubiquitina (28-31). Estos datos se 
corroboraron en este trabajo, ya que el pretratamiento con SB43 bloquea el incremento 
de losniveles del ARNm de SnoN pero acumula los niveles de la proteína SnoN a 
tiempos cortos (Fig.7E). Este resultado se debe a que el SB43 bloquea la fosforilación 
39 
 
de las Smads y por ende, bloquea la inducción del gen snoN/skil y también bloquea la 
degradación de la proteína SnoN inducida por la vía TGF-β/Smads. Estos resultados 
demuestran que el TGF-β regula la expresión y los niveles de SnoN a múltiples niveles. 
 
Para analizar si el TGF-β también podría regular la expresión de SnoN en el caso del 
ratón se realizó un Northern blot con ARN de hepatocitos de ratón, usando una sonda 
que reconoce tanto la isoforma SnoN como la isoforma SnoN2, dada su alta identidad 
(Fig. 7F, esquema). Los resultados revelaron que el TGF-β induce la expresión de los 
transcritos del gen snoN/skil de ratón con un patrón similar al caso del humano (Fig. 
7A). Los ensayos de WB y RT-PCR con las células humanas HepG2 y A549, y con los 
mioblastos C2C12 de ratón, confirman que en el ratón se expresa principalmente el 
ARNm de SnoN2 y se sintetiza la proteína correspondiente, mientras que en el humano 
es SnoN quien principalmente se expresa (Fig. 7F). No obstante, el TGF-β es capaz de 
regular e inducir la expresión del gen snoN/skil en humano y en ratón. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. La expresión de SnoN es regulada por la señal del TGF-β/Smads a través de 
diferentes mecanismos. 
A) Northern blot de las células HepG2 y hepatocitos de ratón. El pretratamiento fue con CHX 
20 µg/ml 20 min y el tratamiento con o sin TGF-β 300 pM 1 h. rRNA (18S y 28S) se usó como 
control de carga. B) Las células A549 se trataron con o sin TGF-β por diferentes tiempos y 
mediante RT-PCR se analizaron los niveles del ARNm de SnoN. C) Las células A549 se 
trataron con o sin TGF-β, SB431542 10 µM o ACD 5 µg/ml en diferentes tiempos (esquema 
superior). Los niveles del ARNm de SnoN se evaluaron por RT-PCR. D) RT-PCR de las 
células A549 pretratadas con ACD 5 µg/ml 1 h y posteriormente tratadas con TGF-β 300 pM 2 
h. E) Las células A549 se trataron con SB431542 10 µM 30 min y con o sin TGF-β 300 pM 2 h 
para RT-PCR (arriba) y para la inmunoprecipitación y detección por WB de SnoN y pSmad2 
(pS2) (abajo). F) Las isoformas SnoN y SnoN2 (esquema). Extractos totales de las células 
humanas HepG2 y A549 y las células de ratón C2C12, se usaron para la inmunoprecipitación y 
detección de la proteína SnoN por WB (arriba), mientras que para medir los niveles de ARNm 
por RT-PCR se usó el ARN total de C2C12 y A549 con o sin el estímulo de TGF-β 300 pM por 
2 h (abajo). Como control de carga del RT-PCR se usó el ARNm de β-actina. 
 
 
0 2h 5h 7h
TGF-β
SB43 
/ACD Fin de tratamiento
B. RT-PCR
C. RT-PCR
D. RT-PCR
E. 
A.
RT-PCR
WB
F. 
WB
RT-PCR
41 
 
7.2 Caracterización de la región 5´ del gen snoN/skil humano 
 
Como se demostró en los puntos anteriores, tanto la expresión del gen como los niveles 
de la proteína SnoN parecen ser regulados por el TGF-β a través de las Smads. La 
regulación del gen snoN/skil a nivel transcripcional es uno de los puntos de control más 
importantes, el cual ha sido poco estudiado. Con el objetivo de profundizar en los 
mecanismos de regulación transcripcional del gen snoN/skil humano, se efectúo la 
caracterización de su región regulatoria 5´ mediante un análisis bioinformático y 
experimental. 
 
El gen snoN/skil humano se localiza dentro del cromosoma 3 (Fig. 8A) y en su extremo 
5´ se han identificado regiones regulatorias tales como TRE (elemento que responde a 
TGF-β), SIE (Elemento inhibidor de las Smad) y HGF (Elementos de respuesta a HGF) 
(25,35). Estas regiones regulatorias se encuentran conservadas en ratón, rata y 
humano. El TRE esta localizado a -3041 y -2716 bp respecto al ATG (+1) y conformado 
por 4 secuencias SBE (Fig. 8A y 8B). En el promotor del gen snoN/skil no se identificó 
ni caja TATA ni CAAT, pero en cambio se detectaron varias cajas GC. Al respecto, se 
identificó una isla CpG, la cual abarca al TRE y al SIE (Fig. 8B). También se 
identificaron sitios potenciales para diversos FT en el TRE de este promotor (Fig. 8C). 
 
La secuencia más completa disponible hasta ahora en el GenBank del transcrito de 
SnoN es la NM_005414.4 (Fig. 8D). Esta secuencia indica el CDS y los UTRs. En el 
3´UTR se hacen evidentes dos sitios de poli-adenilación en 3509 bp y 7196 bp. La 
secuencia parcial del 5´UTR reportada corresponde a 713 bp y esta conformada por el 
exón 1 y la mitad del exón 2. En cuanto al TSS, se usaron distintos programas y la base 
de datos de sitios de inicio de transcripción (DBTSS). Todos ellos coincidieron en que el 
TSS podría estar comprendido en una región que contempla al TRE y al SIE del gen 
snoN/skil. 
 
El ADNc sintetizado a partir de ARN total aislado de células HepG2, control o 
estimuladas con TGF-β se usó para un ensayo de RT-PCR. El oligo E, localizado en el 
42 
 
exón 2 se probó con diversos oligos específicos de la región 5´: A, B, C, D (Fig. 9A). 
Todos estos oligos generaron un producto, excepto el oligo A, que fue incapaz de 
amplificar. Este resultado indica que la región delimitada por el oligo A no forma parte 
del ADNc, pero que es parte de la región promotora del gen snoN/skil. Todos los 
productos generados aumentaron por el estímulo del TGF-β, confirmando que el 
incremento del transcrito de snoN/skil es inducido por esta señal (Fig. 9B). De acuerdo 
con estos resultados, el TSS se localiza entre el SBE3 y SBE4. 
 
La amplificación con los oligos F+B se realizó usando como molde ADN genómico 
(ADNg) o ADNc. Un producto de 839 bp se generó a partir de ADNc, mientras que 
usando DNA genómico se generó un producto de 2776 bp (Fig. 9B). Este resultado 
demuestra que el 5´UTR corresponde a aproximadamente 803 bp, esta conformado por 
el exón 1 y la parte del exón 2 y presenta un intron interno de 1.9 Kb (Fig. 9C). 
 
De esta forma, la región que responde al TGF-β (TRE) del gen snoN/skil esta 
conformada por 4 secuencias SBE. Las secuencias SBE 1, 2, 3 se localizan en la 
región promotora y la secuencia SBE4 esta en el primer exón. El TSS se sitúa entre el 
SBE 3 y SBE 4. El ATG esta presente a la mitad del segundo exón y el 5´UTR de ~803 
bp contiene un primer exón, parte de un segundo exón y la presencia de un intron 
interno de 1.9 Kb. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 8. Análisis bioinformático de la región 5´del gen snoN/skil humano 
A) Localización genómica del gen snoN/skil de humano. B) Elementos regulatorios del gen 
snoN/skil conservados en ratón, rata y humano. C) FTs potenciales para regular la expresión 
del gen snoN/skil humano D) Secuencia del transcrito SnoN disponible en el GenBank. Se 
indican los UTRs, el CDS y los sitios de poli-adenilación. 
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Figura 9. Caracterización de la región 5´del gen snoN/skil humano 
A) Representación de la secuencia TRE, el TSS, el exón 1/intron 1/exón 2 y el ATG del gen 
snoN/skil humano. Las flechas indican los distintos oligonucleótidos empleados. B) El ARNm 
de SnoN se amplificó por RT-PCR a partir de ARN total de células HepG2 tratadas con o sin 
TGF-β 300 pM por 2h. Las combinaciones de oligonucleótidos fueron E + A, B, C o D. C) La 
región 5’UTR del gen de SnoN fue amplificada por PCR usando los oligos F+B, y 
dosCdiferentes moldes: ADN genómico humano (ADNg) y ADNc de células HepG2. D) 
Representacón del 5’ UTR del gen snoN/skil humano. 
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7.3 El promotor del gen snoN/skil humano es activado por la vía del 
TGF-β/Smad 
 
La secuencia TRE del promotor del gen snoN/skil humano, dentro de la cual se localiza 
el TSS, se clonó en el vector reportero pGL3-basic. Una construcción contiene la