Regulacion-de-los-genes-E2348C_1012-y-E2348C_1013-por-los-reguladores-GrlA-y-GrlR-en-escherichia-coli-enteropatogena

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 Regulación de los genes E2348C_1012 y E2348C_1013 
por los reguladores GrlA y GrlR en 
Escherichia coli enteropatógena 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
PRESENTA: 
Q.B.P. EMILIO CADENA GUINTO 
 
 
TUTOR PRINCIPAL: 
 
Dr. JOSÉ LUIS PUENTE GARCÍA 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: 
 
Dra. KATY JUÁREZ LÓPEZ 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
Dr. GUILLERMO GOSSET LAGARDA 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
 
 
 
Cuernavaca, Mor. Noviembre, 2016. 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
I 
 
Agradecimientos 
Al Dr. José Luis Puente por permitirme formar parte de su grupo de investigación, 
por su confianza, apoyo y consejos en la realización de este proyecto y por la 
amistad brindada. 
Al Dr. Ramón Cervantes Rivera por sus consejos, disposición y gran apoyo 
académico para la realización de este proyecto. 
A mi comité revisor de tesis, por su disponibilidad en la revisión y por sus 
comentarios que enriquecieron y mejoraron el escrito final. 
Dr. David René Romero Camarena 
Dra. Cinthia Ernestina Núñez López 
Dr. Tomás Villaseñor Toledo 
Dr. Baltazar Becerril Luján 
Dra. Isabel Gómez Gómez 
 
A mi comité tutoral, por sus sugerencias y aportaciones durante el desarrollo del 
presente trabajo. 
Dra. Katy Juárez López 
Dr. Guillermo Gosset Lagarda 
 
A los técnicos del laboratorio, por su apoyo técnico. 
 
Dra. Alejandra Vázquez Ramos 
Biol. Francisco Javier Santana Estrada 
Dra. Lucia Perezgasga Ciscomani 
M.C. Marcos Fernández Mora 
 
A mis compañeros de laboratorio por las experiencias vividas durante mi estancia. 
Al Programa de Apoyo a los Estudios del Posgrado (PAEP), por su apoyo para la 
asistencia a congresos. 
Este trabajo fue realizado con apoyo de la Dirección General de Asuntos del 
Personal Académico (DGAPA-IN209713 e IN213516) y del Consejo Nacional de 
Ciencia y Tecnología (154287 y 239659). 
Durante el desarrollo del proyecto conté con el apoyo del Consejo Nacional de 
Ciencia y Tecnología (No. de registro 329401). 
 
 
II 
 
Dedicatorias 
 
A mi familia, especialmente a mi Padres, Silvia y Martín, a mi Mami Emiliana y mis 
hermanos, Jennifer, Magui y Martín, por su apoyo incondicional, confianza y sus 
consejos. 
 
A todos mis amigos, en especial a Claudia y Rogelio, por su valiosa amistad, 
consejos, su apoyo y todo lo que hemos vivido juntos durante mi estancia en el 
laboratorio. A Crispin, Tito, Frania, Lore y Lili por la gran amistad que forjamos. 
 
A todas las personas que directa o indirectamente han contribuido en mi formación 
y en la culminación del presente trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III 
 
Contenido 
Agradecimientos ....................................................................................................... I 
Dedicatorias ............................................................................................................ II 
Abreviaturas ............................................................................................................ V 
Resumen ................................................................................................................ VI 
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 
2. ANTECEDENTES ............................................................................................. 5 
3. HIPÓTESIS ..................................................................................................... 10 
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 10 
4.1 Objetivo General ...................................................................................... 10 
4.2 Objetivos específicos ............................................................................... 10 
5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 11 
5.1 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento .................................... 11 
5.2 Análisis de proteínas secretadas ............................................................. 13 
5.3 Oligonucleótidos ....................................................................................... 13 
5.4 Purificación de RNA total ......................................................................... 15 
5.5 Tratamiento del RNA total con DNasa ..................................................... 16 
5.6 Síntesis del cDNA (Reacción de retrotranscripción)................................. 16 
5.7 Análisis de la expresión mediante PCR cuantitativo en tiempo real ......... 16 
5.8 Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat ............. 16 
5.9 Ensayo de actividad de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) .............. 19 
5.10 Primer extension y reacción de secuencia ............................................ 19 
6. RESULTADOS ............................................................................................... 20 
6.1 Análisis in silico de las proteínas potencialmente codificadas por los genes 
E1012 y E1013 .................................................................................................. 20 
IV 
 
6.2 Los resultados obtenidos por qRT-PCR confirman los datos de los 
experimentos de transcriptómica por RNAseq ................................................... 21 
6.3 Actividad transcripcional mediante fusiones al gen reportero cat ............. 23 
6.4 GrlR y H-NS reprimen la expresión de E1012 .......................................... 25 
6.5 La expresión constitutiva de GrlR reprime la expresión de E1012 ........... 27 
6.6 Recortes de la región reguladora de E1012 ............................................. 28 
6.7 GrlA activa la expresión de E1013 mientras que GrlR la reprime ............ 30 
6.8 Identificación del promotor de E1013 ....................................................... 32 
6.9 Recortes de la región reguladora de E1013 ............................................. 35 
7. DISCUSION .................................................................................................... 38 
8. CONCLUSIONES ........................................................................................... 43 
9. PERSPECTIVAS ............................................................................................ 45 
10. ANEXOS ..................................................................................................... 46 
11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 59 
 
 
 
 
 
 
 
 
V 
 
Abreviaturas 
 
A/E: Attaching and effacing 
aEPEC: EPEC atípica 
DAEC: E. coli difuso-adherente 
DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium 
EAEC: E. coli enteroagregativa 
EHEC: E. coli enterohemorrágica 
EIEC: E. coli enteroinvasiva 
EPEC: E. coli enteropatógena 
ETEC: E. coli enterotoxigénica 
GrlA: Global Regulator of LEE Activator 
GrlR: Global Regulator of LEE Repressor 
H-NS: Histone-like Nucleoid Structuring 
LB: Lysogeny broth 
Ler: LEE-Encoded Regulator 
LEE: Locus of enterocyteeffacement 
NMEC: E. coli meningitis neonatal 
pb: Pares de bases 
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 
qPCR: PCR cuantitativo en tiempo real 
SST3: Sistema de secreción tipo tres 
tEPEC: EPEC típica 
Tir: Receptor translocado de Intimina 
UPEC: E. coli uropatógena 
 
VI 
 
Resumen 
Escherichia coli enteropatógena (EPEC) es un importante patógeno causante de 
diarrea en niños de países en vías de desarrollo. Una característica de la 
patogénesis de EPEC es la formación de las lesiones de adherencia y destrucción 
de las microvellosidades de los enterocitos, los genes necesarios para su 
formación están localizados en la isla de patogenicidad LEE (locus of enterocyte 
effacement), que incluye el sistema de secreción tipo III y tres reguladores 
asociados: Ler, GrlR y GrlA. Resultados obtenidos por transcriptómica, revelaron 
que los genes de función desconocida E2348C_1012 y E2348C_1013 de EPEC 
son regulados positiva y negativamente por GrlA y GrlR, respectivamente. En este 
trabajo se analizó el mecanismo mediante el cual, los reguladores GrlA y GrlR 
controlan la expresión de los genes E1012 y E1013 en EPEC. Con base en los 
resultados obtenidos, se sugiere que E1012 es regulado negativamente por GrlR y 
H-NS, y que los reguladores positivos GrlA y Ler no reflejan una actividad directa. 
En la región comprendida entre las posiciones -279 y -87 de la región reguladora 
de E1012 con respecto al supuesto inicio de su traducción, podría existir un 
elemento de regulación positiva. Por su parte, el estudio del mecanismo de 
regulación de E1013, sugiere que GrlA activa de manera directa su expresión y 
que GrlR la reprime. Es importante destacar que H-NS no participa de manera 
significativa en la represión de E1013. El análisis de la región reguladora de 
E1013, reveló que el sitio de inicio de transcripción corresponde a una G y que los 
elementos involucrados en su regulación se encuentran localizados entre las 
posiciones -89 y +26 respecto a dicho sitio. En la vecindad de esta zona se 
encuentra el promotor funcional que comprende las cajas -35 (TTGACA) y -10 
(TAGAAA), separadas por 18 nucleótidos. Dadas las características del 
mecanismo de regulación en el que participan los reguladores GrlA y GrlR, 
involucrados en la patogénesis causada por EPEC, se sugiere que la expresión de 
E1013 se coordina con los genes del LEE. Además, el contexto genómico en el 
que se encuentra ubicado E1013 y la gran similitud de su promotor con el de ler, 
sugieren que E1013 podría potencialmente jugar un papel novedoso en la 
virulencia de EPEC.
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
Se estima que la diarrea provoca aproximadamente 2 millones de muertes al año 
alrededor del mundo, siendo la diarrea persistente asociada a infecciones por 
virus, parásitos o bacterias una causa común en infantes. Entre los patógenos 
bacterianos, diferentes cepas de Escherichia coli siguen apareciendo como unos 
de los agentes causales más relevantes, principalmente en países en vías de 
desarrollo (Kotloff et al., 2013; Ochoa et al., 2008). 
E. coli es una de las bacterias residentes de la microbiota intestinal de humanos; 
sin embargo, diferentes aislados han sido implicados en una extensa gama de 
enfermedades que afectan tanto a animales como a humanos. De acuerdo al 
subconjunto de genes de virulencia y propiedades clínicas que presentan estos 
aislados se han clasificado en diferentes patotipos, tanto intestinales: E. coli 
enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli 
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa 
(EAEC) y E. coli difuso-adherente (DAEC); como extraintestinales: E. coli 
uropatógena (UPEC) y E. coli meningitis neonatal (NMEC). Se han identificado 
otras cepas que por sus características representan potencialmente nuevos 
patotipos, cuyos mecanismos de patogenicidad no están bien dilucidados (Croxen 
y Finlay, 2010; Hernandes et al., 2009). 
EPEC y EHEC son importantes patógenos humanos, que junto con el patógeno de 
ratones Citrobacter rodentium conforman a una familia de patógenos que inducen 
la formación de lesiones histopatológicas denominadas de adherencia y 
destrucción (A/E, attaching and effacing) en células del epitelio intestinal como se 
observa en la Fig. 1 (Croxen, et al., 2013). 
2 
 
 
Figura 1. Formación del pedestal por EPEC. A) Microscopía electrónica de barrido de células HEp-
2 infectadas con EPEC E2348/69 (www.helmholtz-hzi.de/en). B) Representación esquemática de la 
lesión de adherencia y destrucción en enterocitos intestinales por EPEC (Modificado de Lai et al., 
2013). 
EPEC es un importante agente etiológico de diarrea o enteritis crónica en infantes 
principalmente de países en vías de desarrollo, donde se encuentra asociada con 
al menos el 20% de los casos de diarrea; sin embargo, también provoca casos 
esporádicos y brotes en países industrializados. La transmisión de este patógeno 
a su hospedero es vía fecal-oral a través de alimentos o superficies contaminadas 
donde coloniza principalmente el intestino delgado, requiriendo un estimado de 
108 a 1010 bacterias como dosis infectiva (Croxen et al., 2013; Franzin y Sircili, 
2015; Rivas et al., 2015). 
Las cepas de EPEC se encuentran clasificadas en dos grupos, EPEC típica 
(tEPEC) y EPEC atípica (aEPEC), con base en la presencia o ausencia del 
plásmido EAF (E. coli adherence factor plasmid). Este plásmido contiene el operón 
bfp, que contiene los genes que codifican para las proteínas involucradas en la 
http://www.helmholtz-hzi.de/en
3 
 
biogénesis de la fimbria tipo IV conocida como BFP (Bundle-forming pilus), así 
como el operón perABC (plasmid encoded regulator) que codifica para PerA, el 
activador transcripcional del operón bfp. 
Sin embargo, ambos patotipos (tEPEC y aEPEC) tienen la habilidad de formar las 
lesiones A/E. Las cepas de tEPEC no se han encontrado en animales, sugiriendo 
que el humano es el único reservorio, en contraste las cepas atípicas han sido 
aisladas de animales y pueden servir como reservorio para la infección en 
humanos. Dada su relevancia desde el punto de vista médico y epidemiológico, y 
por su similitud con EHEC, agente causal de diarrea con sangre y el síndrome 
urémico hemolítico, el estudio de los mecanismos de virulencia por los cuales las 
cepas tEPEC causan enfermedad en humanos sigue siendo de gran interés 
(Bueris et al., 2015; Bustamante et al., 2011; Hernandes et al., 2009; Monagham 
et al., 2013; Ochoa et al., 2008; Trabulsi, et al., 2002). 
El desarrollo de las lesiones A/E se ha dividido en tres etapas (Fig. 2). La primera 
está caracterizada por la adherencia no íntima de EPEC a la superficie de las 
células epiteliales denominada adherencia localizada, la cual está asociada con la 
producción de BFP. Durante la segunda etapa, EPEC utiliza un sistema de 
secreción tipo III (SST3) para translocar proteínas efectoras hacia el interior de los 
enterocitos, los cuales subvierten vías de transducción de señales y otras 
funciones celulares a favor de la bacteria. Finalmente, en la etapa tres ocurre la 
adherencia íntima, mediada por la interacción entre una proteína de membrana 
externa llamada intimina y el receptor translocado de intimina (Tir). Esto permite la 
pérdida de las microvellosidades intestinales y la inducción de la formación de 
estructuras tipo pedestal, característica distintiva de las lesiones A/E, por medio 
del rearreglo del citoesqueleto de actina justo por debajo del sitio de adhesión de 
la bacteria (Lai et al., 2013). 
4 
 
 
Figura 2. Desarrollo de la patogénesis de EPEC. A) Adherencia localizada mediada por la 
producción de la fimbria BFP, cuyos genes se encuentran codificados en el plásmido EAF. B) 
Transducción de señales resultado de la translocación de proteínas efectoras hacia el interior de la 
célula hospedera mediante el SST3. C) Adherencia íntima, resultado de la interacción entrelas 
proteínas Tir e Intimina, que lleva finalmente a la formación del pedestal de actina (modificado de 
Strynadka y Ness, 2002). 
El desarrollo de la lesión A/E involucra la presencia de genes de virulencia 
codificados en la isla de patogenicidad LEE de 35 kb, cuyos 41 genes se 
encuentran organizados en cinco operones policistrónicos (LEE1-LEE5), dos 
operones bicistrónicos (rorf1-espG y grlRA) y cuatro unidades monocistrónicas 
(rorf3, cesF, map y escD) (Bustamante et al., 2011; Croxen y Finlay, 2010; Deng et 
al., 2004). 
Los operones LEE1-LEE3 codifican para la mayoría de los componentes 
estructurales del SST3 (Esc y Sep), LEE4 codifica proteínas involucradas en la 
translocación de efectores (EspA, B y D y SepL), y el operón LEE5 codifica para 
las proteínas requeridas durante la unión íntima (Intimina y Tir) (Deng et al., 2004). 
 
 
 
5 
 
2. ANTECEDENTES 
La expresión de los genes del LEE está altamente regulada (Fig. 3) y responde a 
condiciones in vitro de represión e inducción, emuladas por los medios LB y 
DMEM, respectivamente. La proteína Ler (LEE-encoded regulator), codificada por 
el primer gen del operón LEE1, el regulador maestro de la expresión de los genes 
del LEE, y por tanto esencial para el desarrollo de las lesiones A/E. Ler actúa 
contrarrestando la represión que ejerce el regulador global H-NS (Histone-like 
Nucleoid Structuring protein) sobre todos los promotores de la isla, ya sea 
compitiendo con H-NS por sus sitios de unión o alterando la arquitectura local del 
DNA para desestabilizar los complejos nucleorepresores formados por H-NS. Ler 
es una proteína de 129 aa paráloga de H-NS, cuya principal similitud se encuentra 
en el carboxilo terminal donde se localiza el sitio de unión a DNA (Bustamante et 
al., 2001; Mellies et al., 2007; Umanski et al., 2002). H-NS es una proteína de 137 
aa asociada al nucleoide bacteriano que actúa como regulador global modulando, 
en su mayoría negativamente, la expresión de genes involucrados en diferentes 
procesos celulares, incluyendo virulencia. H-NS se une al DNA preferentemente a 
secuencias ricas en AT formando un complejo núcleo-proteico que impide el 
reconocimiento del promotor por la RNA polimerasa (Ali et al., 2012). 
La isla LEE contiene dos genes reguladores adicionales formando el operón grlRA 
(Deng et al., 2004). Bajo condiciones de inducción (medio DMEM), GrlA (Global 
regulator of LEE activator) actúa como un regulador positivo de la expresión de ler, 
uniéndose a su región reguladora (Jiménez et al., 2010). Ler, a su vez, incrementa 
los niveles de expresión del operón grlRA, creando un circuito regulador positivo 
que robustece la expresión de los genes de la isla (Barba et al., 2005). Junto con 
GrlA se expresa GrlR (Global regulator of LEE repressor), una proteína dimérica 
que dependiendo de las condiciones de crecimiento reprime la expresión de los 
genes del LEE al interactuar con el monómero de GrlA (Deng et al., 2004; Jiménez 
et al., 2010; Padavannil et al., 2013; Lara-Ochoa, C., datos no publicados). 
GrlA posee un motivo de unión a DNA tipo HTH (Helix-Turn-Helix) en el amino 
terminal y pertenece a una pequeña familia de reguladores transcripcionales a la 
6 
 
fecha no caracterizados en detalle, con excepción de CaiF. Esta proteína es 
requerida para la activación de genes involucrados en el metabolismo de carnitina 
bajo condiciones anaerobias en E. coli. CaiF se une a una secuencia invertida 
repetida de 11 pb aparentemente como un dímero y formando un complejo con 
dímeros de la proteína CRP (Buchet et al., 1999). Además de su papel en la 
regulación del LEE, para EHEC se ha demostrado que GrlA regula genes fuera de 
la isla, incluyendo el operón ehxCABD que codifica para la entero-hemolisina al 
cual también regula positivamente, así como para genes flagelares como el 
operón flhDC al que regula negativamente (Iyoda et al., 2006; Saitoh et al., 2008). 
Sin embargo, los mecanismos moleculares mediante los cuales GrlA reprime el 
operón flhDC aún se desconocen. Por su parte, de acuerdo a la base de datos 
GrlR sólo cuenta con unos cuantos ortólogos lejanos y de función desconocida 
(Jiménez et al., 2010). 
Adicionalmente, diferentes mecanismos o factores modulan en conjunto con Ler la 
actividad transcripcional de la isla en respuesta al ambiente, tal es el caso de 
PerC, el producto del tercer gen del locus per codificado en el plásmido pEAF, que 
participa en la activación de ler, y por lo tanto de los genes del LEE, en 
condiciones de crecimiento estático y presencia de CO2. En esta cascada de 
regulación IHF (Integration Host Factor) es considerado un regulador positivo 
esencial en la activación de ler mediada ya sea por PerC o GrlA (Bustamante et 
al., 2011). 
7 
 
 
Figura 3. Regulación de la expresión del LEE en patógenos A/E. Ler es el regulador central 
positivo esencial para la expresión de los genes del LEE, ya que contrarresta la represión que 
ejerce H-NS. Adicionalmente, PerC codificado en el plásmido EAF, participa en la activación de ler 
en respuesta al ambiente, mientras que GrlR y GrlA, también codificadas en el LEE, controlan 
negativa y positivamente, respectivamente, la expresión de ler, así como de otros genes 
localizados fuera del LEE como es el caso de los genes ehxCABD y flhDC en EHEC (Bustamante 
et al., 2011; Deng et al., 2004; Jiménez et al., 2010; Padavannil et al., 2013). 
La adquisición de la isla de patogenicidad LEE impuso a la célula la necesidad de 
incorporar estos genes a las redes reguladoras pre-existentes que permitieran 
controlar su adecuada expresión, en tiempo y espacio, para beneficio de la 
bacteria, como lo ilustra la fuerte represión que ejerce el regulador ancestral H-NS 
sobre toda la isla. Sin embargo, este evento también haría suponer que la 
presencia de genes reguladores en dicha isla, generó a su vez la posibilidad de 
que estos reguladores adquirieran la capacidad de modular la expresión de genes 
ancestrales que ya formaban parte del genoma o que se adquirieron por eventos 
de transferencia horizontal independientes a la adquisición de la isla de 
patogenicidad LEE. En concordancia con esto, Ler regula otros genes de 
virulencia localizados fuera de la isla (Bingle et al., 2014; García-Angulo et al., 
2008; Mellies et al., 2007). 
8 
 
Con base en resultados de experimentos de expresión global por transcriptómica 
(RNAseq), los reguladores GrlA y GrlR también regulan varios genes fuera de la 
isla que codifican para funciones diversas (Cervantes-Rivera, R., datos no 
publicados). Tal es el caso de los genes de función desconocida E2348C_1012 y 
E2348C_1013 (Fig. 4), que se encuentran continuos, en dirección divergente, 
insertados en el profago PP4 de EPEC que también contiene genes que codifican 
para proteínas efectoras que son secretadas por el SST3 (Fig. 5). E1012 y E1013 
no parecen formar parte de operones con otros genes. Codifican para proteínas 
hipotéticas de 238 y 132 aminoácidos, respectivamente. De acuerdo a los datos 
de RNAseq, la expresión de los genes E1012 y E1013 es regulada positivamente 
por GrlA y negativamente por GrlR, como sucede para los genes del LEE; sin 
embargo, en condiciones de inducción Ler parece regularlos en menor medida que 
GrlA, lo cual contrasta con el papel esencial que juega Ler para los genes de la 
isla (Cervantes-Rivera, R., datos no publicados). 
 
Figura 4. Los genes E1012 y E1013 son regulados por GrlA y GrlR. Se incluye la información de 
algunos genes del LEE (espZ y tir), así como non-LEE (nleI y espC) con propósitos comparativos. 
Datos de experimentos de transcriptómica por RNAseq (Cervantes-Rivera, R., datos no 
publicados). 
9 
 
Se encuentran ortólogos de las proteínas predichas del gen E1012 en otros 
patógenos A/E, como EHEC O157:H7 (Marchés et al., 2005) y C. rodentium (Yang 
et al., 2010), presentando una identidad del 100 y 65%, respectivamente. En otros 
patógenosentéricos como Salmonella enterica sv.Typhimurium, se encuentra un 
probable ortólogo con 46% de identidad; la mutante en este gen está atenuada en 
bovinos y parcialmente en pollos (Morgan et al., 2004). Se encuentra un probable 
ortólogo en Shigella dysenteriae con 57% de identidad. Sin embargo, en ningún 
caso la función de la proteína ha sido establecida. 
Por su parte, ortólogos de E1013 se encontraron sólo en el genoma de algunas 
cepas secuenciadas de E. coli particularmente de EHEC, y por tanto que 
contienen el LEE. Será relevante determinar si estos ortólogos (100% idénticos) 
les confieren alguna ventaja particular sobre las cepas que no lo contienen. En 
resumen, por sus características, además de servir como modelo de estudio para 
profundizar en el mecanismo de acción de los reguladores específicos de la isla, 
E1012 y E1013 son candidatos a codificar factores de virulencia novedosos de 
este patógeno. 
 
Figura 5. Contexto genómico de los genes E1012 y E1013 que forman parte del profago PP4 en el 
genoma de EPEC E2348/69. 
 
 
 
10 
 
3. HIPÓTESIS 
 
GrlA regula positiva y directamente la expresión de los genes E1012 y E1013, en 
tanto que GrlR los reprime a través de su interacción con GrlA. 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 Objetivo General 
 
Estudiar la regulación de los genes E1012 y E1013 de E. coli enteropatógena. 
 
4.2 Objetivos específicos 
 
4.2.1 Analizar el papel de los reguladores GrlA y GrlR en la expresión de los 
genes E1012 y E1013. 
4.2.2 Identificar elementos reguladores en la región promotora de los genes 
E1012 y E1013. 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento 
Las características generales de las cepas y plásmidos usados en este trabajo se 
describen en la Tabla 1. Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento 
bacteriano fueron: LB (Lysogeny Broth, NaCl 10 g/L, triptona 10 g/L, extracto de 
levadura 5g/L) y DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium, GIBCO BRL Life 
Technologies, suplementado con piridoxal 25 mg/mL, 3.7 g/L de bicarbonato de 
sodio y 1% de LB). Los antibióticos según se requirieron, se usaron en las 
siguientes concentraciones: ampicilina (100 µg/mL), ácido nalidíxico (25 µg/mL), 
estreptomicina (100 µg/mL), kanamicina (25 µg/mL) y tetraciclina (10 µg/mL). 
12 
 
Tabla 1. Cepas y plásmidos utilizado 
 
Ce
pa
s
Ca
ra
ct
er
ís
tic
as
Re
fe
re
nc
ia
s
E
23
48
/6
9 
E
P
E
C
 s
ilv
es
tre
 O
12
7:
H
6 
S
m
r
Le
vin
e 
et
 a
l.
, 1
97
8
E
23
48
/6
9
E
23
48
/6
9 
Δ
le
r 
S
m
r
H
ue
rta
, A
.
E
23
48
/6
9
E
23
48
/6
9 
Δ
gr
lR
 S
m
r
H
ue
rta
, A
.
E
23
48
/6
9
E
23
48
/6
9 
Δ
gr
lA
 S
m
r
H
ue
rta
, A
.
E
23
48
/6
9
E
23
48
/6
9 
Δ
hn
s:
:K
m
 N
al
r K
m
r
V
áz
qu
ez
, A
., 
20
09
E
23
48
/6
9
E
23
48
/6
9 
Δ
hn
sC
::
K
m
 S
m
r K
m
r
G
on
zá
le
z-
P
ed
ra
jo
, B
.
M
C
41
00
D
er
iva
da
 d
e 
E
. c
ol
i 
K
-1
2.
 F
- a
ra
D
13
9 
Δ
(a
rg
F-
la
c
) U
16
9 
rp
sL
15
0 
re
lA
1 
flb
53
01
 d
eo
C
1 
pt
sF
25
 rb
sR
 S
m
r
C
as
ad
ab
an
, 1
97
6
JP
M
C
1
M
C
41
00
 Δ
hn
s:
:K
m
 S
m
r K
m
r
B
ar
ba
 e
t a
l.,
 2
00
5.
D
H
5a
su
pE
44
 Δ
la
cU
16
9 
(F
80
 la
cZ
D
M
15
 h
sd
R
17
 re
cA
1 
en
dA
1 
gy
rA
96
 th
i-1
 re
lA
1
) N
al
r 
In
vit
ro
ge
n
Pl
ás
m
id
os
pK
K
23
2-
8
D
er
iva
do
 d
el
 p
B
R
32
2,
 c
on
tie
ne
 e
l g
en
 re
po
rte
ro
 c
at
 (
cl
or
an
fe
ni
co
l a
ce
til
 tr
an
sf
er
as
a)
 s
in
 p
ro
m
ot
or
; A
m
pr
 
P
ha
rm
ac
ia
 L
K
B
 B
io
te
ch
no
lo
gy
pl
er
-2
60
D
er
iva
do
 d
e 
pK
K
23
2-
8 
co
nt
ie
nd
o 
la
 fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 le
r-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-2
60
 a
l +
21
7 
co
n 
re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
B
us
ta
m
an
te
 e
t a
l.
, 2
01
1
pS
E
P
Z-
11
D
er
iva
do
 d
e 
pK
K
23
2-
8 
co
nt
ie
nd
o 
la
 fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 L
E
E
2-
ca
t 
de
 E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-4
69
 a
l +
12
1 
co
n 
re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
B
us
ta
m
an
te
 e
t a
l.
, 2
00
1
pK
K
10
12
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
12
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-5
00
 a
l +
21
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
ad
uc
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
12
-R
27
9
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
12
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-2
79
 a
l +
21
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
ad
uc
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
12
-R
87
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
12
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-8
7 
al
 +
21
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
ad
uc
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
13
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-4
95
 a
l +
26
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
-R
13
7
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
13
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-1
37
 a
l +
26
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
-R
89
Fu
si
ón
 tr
an
sc
rip
ci
on
al
 E
10
13
-c
at
 d
e 
E
P
E
C
 d
el
 n
uc
le
ót
id
o 
-8
9 
al
 +
26
 c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
m
-3
5
D
er
iva
do
 d
e 
pK
K
10
13
-R
89
 c
on
 c
am
bi
os
 e
n 
la
s 
ba
se
s 
-3
6 
a 
-3
1 
(d
e 
TT
G
A
C
A
 a
 T
G
TC
TG
) c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
m
-1
0(
TA
)
D
er
iva
do
 d
e 
pK
K
10
13
-R
89
 c
on
 c
am
bi
os
 e
n 
la
s 
ba
se
s 
-1
3 
y 
-1
2 
(d
e 
TA
G
A
A
A
 a
 C
G
G
A
A
A
) c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pK
K
10
13
m
-1
0(
T)
D
er
iva
do
 d
e 
pK
K
10
13
-R
89
 c
on
 u
n 
ca
m
bi
o 
en
 la
 b
as
e 
-1
1 
(d
e 
TA
G
A
A
A
 a
 T
A
TA
A
A
) c
on
 re
sp
ec
to
 a
l i
ni
ci
o 
de
 tr
an
sc
rip
ci
ón
E
st
e 
es
tu
di
o
pM
P
M
-T
3
V
ec
to
r d
e 
cl
on
ac
ió
n 
de
 b
aj
o 
nú
m
er
o 
de
 c
op
ia
s 
de
riv
ad
o 
de
l p
15
A
; T
cr
M
ay
er
, 1
99
5
pT
E
P
Le
r1
D
er
iva
do
 d
el
 p
M
P
M
-T
3 
qu
e 
ex
pr
es
a 
el
 g
en
 q
ue
 c
od
ifi
ca
 p
ar
a 
Le
r a
 p
ar
tir
 d
el
 p
ro
m
ot
or
 la
c
B
us
ta
m
an
te
 e
t a
l.,
 2
01
1
pT
3-
G
rlR
D
er
iva
do
 d
el
 p
M
P
M
-T
3 
qu
e 
ex
pr
es
a 
el
 g
en
 q
ue
 c
od
ifi
ca
 p
ar
a 
G
rlR
 a
 p
ar
tir
 d
el
 p
ro
m
ot
or
 la
c
La
ra
 O
ch
oa
, n
o 
pu
bl
ic
ad
o.
 
pT
E
P
G
rlA
1
D
er
iva
do
 d
el
 p
M
P
M
-T
3 
qu
e 
ex
pr
es
a 
el
 g
en
 q
ue
 c
od
ifi
ca
 p
ar
a 
G
rlA
 a
 p
ar
tir
 d
el
 p
ro
m
ot
or
 la
c
B
us
ta
m
an
te
 e
t a
l.
, 2
01
1
pM
A
L-
c2
X
V
ec
to
r d
e 
cl
on
ac
ió
n 
pa
ra
 c
on
st
ru
ir 
fu
si
on
es
 a
 M
B
P
; A
m
pr
 
N
ew
 E
ng
la
nd
 B
io
la
bs
pM
B
P
-G
rlA
D
er
iva
do
 d
el
 p
M
A
L-
c2
X 
qu
e 
ex
pr
es
a 
M
B
P
-G
rlA
 b
aj
o 
el
 c
on
tro
l d
el
 p
ro
m
ot
or
 P
ta
c 
in
du
ci
bl
e 
po
r I
P
TG
Ji
m
én
ez
 e
t a
l.,
 2
01
0 
 
 
 
 
 
 
 
 
 T
ab
la
 1
. C
ep
as
 y
 p
lá
sm
id
os
 u
til
iz
ad
os
.
13 
 
5.2 Análisis de proteínas secretadas 
Para el ensayo de secreción de proteínas dependientes del SST3 por EPEC, los 
cultivos de las diferentes cepas se crecieron a 37°C en agitación en LB y DMEM 
(condición de represión e inducción, respectivamente) con los antibióticos 
correspondientes hasta llegar a una D.O600=1, estos cultivos 1se precipitaron con 
ácido tricloroacético (TCA)al 10 %, se separaron mediante un gel SDS-PAGE al 
12 % y observaron mediante tinción con azul de Coomassie (anexo 1). 
5.3 Oligonucleótidos 
Los oligonucleótidos utilizados se sintetizaron en la Unidad de Síntesis del Instituto 
de Biotecnología-UNAM y se enlistan en la tabla 2. Todos los oligonucleótidos se 
diluyeron a una concentración de 20 µM. 
El oligonucleótido SEQ1-RvpKK232-8 (utilizado en las reacciones de primer 
extension) se marcó con (-32P) ATP y con la enzima T4 cinasa (Fermentas) 
incubando por media hora a 37°C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados 
Nombre Secuencia (5´→3´)**,*** Uso y características* 
EPEC-1012-RT-F TCC CAT GGT GGA TTG TAG GT qRT-PCR, Fwd 
EPEC-1012-RT-R CCG GCA CAA ACA ATA ATT CC qRT-PCR, Rev 
EPEC-1013-RT-F2 AACCGGAATCAAATCACAGG qRT-PCR, Fwd 
EPEC-1013-RT-R TTA AGG GCA CGT AGC GAG TT qRT-PCR, Rev 
EPEC-1012-C500F TCAGGATCCAGTGGGGGATAGTTGCTGAGA Fusiones de E1012, 
BamHI, Fwd 
EPEC-1012-C500R TCAAAGCTTGAGCAGTGCACCATCCTTCAT Fusiones de E1012, 
HindIII, Rev 
EPEC-1013-C500F ATAGGATCCACGCCAACGATATCTTCGTAT Fusiones de E1013, 
BamHI, Fwd 
EPEC-1013-C500R CCGAAGCTTTGGAGAAATGATATGTAACAC Fusiones de E1013, 
HindIII, Rev 
E-1012-R279-F1 TCAGGATCCCGCCATGATTGCCACGGATGG Fusiones de E1012, 
BamHI, Fwd 
E-1013-R142-F ATAGGATCCACCCCGTCTCCCGTTATCCGG Fusiones de E1013, 
BamHI, Fwd 
E-1012-R87-F TCAGGATCCTTTTTTTAGCCTGTAACCTCT Fusiones de E1012, 
BamHI, Fwd 
E-1013-R94-F ATAGGATCCTTAATTCCTGATGGCCCTGAT Fusiones de E1013, 
BamHI, Fwd 
E-1013-M35(14)F GACTGTTATGATgtctggTAATGATAATGT Fusiones de E1013, 
cambios en la caja -35, 
Fwd 
E-1013-M35(14)R ACATTATCATTAccagacATCATAACAGTC Fusiones de E1013, 
cambios en la caja -35, 
Rev 
E1013Δ-10(TA)2 CCGAAGCTTTGGAGAAATGATATGTAACAC 
ACATCGGGAACCTTTCcgTATAAACATTAT 
Fusiones de E1013, 
cambios en la caja -10, 
Rev 
E1013Δ-10(T) CCGAAGCTTTGGAGAAATGATATGTAACAC 
ACATCGGGAACCTTTaTATAT 
Fusiones de E1013, 
cambios en la caja -10, 
Rev 
SEQ1-RvpKK232-8 CAACGGTGGTATATCCAGTG Secuenciación de 
fusiones contenidas en 
15 
 
el plásmido pKK232-8, 
Rev 
SEQ2-FwpKK232-8 GAGGCCCTTTCGTCTTCAAG Secuenciación de 
fusiones contenidas en 
el plásmido pKK232-8, 
Fwd 
PMPM-Fwd2 AATCGGAACCCTAAAGGGAGCC Checar clonaciones a 
pMPM-T3, Fwd 
PMPM3-Rv1 GCGTTATCCCCTGATTCTGTGG Checar clonaciones a 
pMPM-T3, Rev 
Hfq-F ACGATGAAATGGTTTATCGAG qRT-PCR, Fwd 
Hfq-R ACTGCTTTACCTTCACCTACA qRT-PCR, Rev 
EPEC-gyrB-RT-F ACC ATT CAC GCC GAT AAC TC qRT-PCR, Fwd 
EPEC-gyrB-RT-R GGG CGT TTA CTA CCG AAA CA qRT-PCR, Rev 
espZ-RT-F TTA AGC CCT TCT GGT GCA GT qRT-PCR, Fwd 
espZ-RT-R TTT GTG AAG GGT CGT CAA CA qRT-PCR, Rev 
EPEC- ler-RT-F GAC TGC GAG AGC AGG AAG TT qRT-PCR, Fwd 
EPEC- ler-RT-R CAG GTC TGC CCT TCT TCA TT qRT-PCR, Rev 
EPEC- grlR-RT-F AAG ACT CCT GTG GGG AAG GT qRT-PCR, Fwd 
EPEC- grlR-RT-R AAT GTT TAG CAC CGA GGG AAT qRT-PCR, Rev 
EPEC- grlA-RT-F TTT TCT TTT TGG TCC GGT TG qRT-PCR, Fwd 
EPEC- grlA-RT-R AAG ACT CCT GTG GGG AAG GT qRT-PCR, Rev 
*Fwd. Con respecto al extremo 5´ del gen. Rev. Con respecto al extremo 3´del gen. 
**En minúsculas se señalan cambios con respecto a la secuencia silvestre. 
***En negritas se indican sitios de restricción 
5.4 Purificación de RNA total 
El RNA total de las diferentes cepas se purificó por el método de fenol ácido 
caliente de acuerdo al protocolo descrito en el anexo 2. El RNA total se usó para 
los experimentos de qRT-PCR. De manera general, las cepas EPEC WT, ΔgrlR, 
ΔgrlA y Δler se inocularon en 100 mL de medio LB y DMEM y se incubaron a 37°C 
en agitación, hasta llegar a una D.O.600=0.3, momento en el cual se adicionó 
rifampicina a una concentración final de 25µg/mL para detener la transcripción, 
para finalmente obtener pastillas a partir de 20 mL del cultivo celular, de las cuales 
se purificó el RNA total. 
16 
 
5.5 Tratamiento del RNA total con DNasa 
Una vez purificado el RNA total, se realizó un tratamiento con DNasa I (Roche) 
siguiendo lo descrito en el anexo 3. Finalmente se realizó un PCR control para 
verificar que el RNA estaba libre de DNA, utilizando oligonucleótidos para el gen 
hfq (Tabla 2) que generan un fragmento de aproximadamente 900 pb. 
5.6 Síntesis del cDNA (Reacción de retrotranscripción) 
Finalmente con las muestras de RNA libres de cualquier contaminación por DNA, 
se realizó la reacción de retrotranscripción para la obtención de cDNA de acuerdo 
al protocolo descrito en el anexo 4, utilizando una mezcla de oligonucleótidos (solo 
reversos) correspondientes a los genes gyrB, E1012, E1013, espZ, grlR y grlA 
(Tabla 2). El cDNA obtenido se diluyó 1:10 (10 µL de cDNA en 90 µL de H2O 
DEPC), y éste se utilizó como templado para la realización del qPCR. 
5.7 Análisis de la expresión mediante PCR cuantitativo en tiempo real 
Los ensayos qPCR se realizaron en el equipo Light Cycler 480 II (Roche) como se 
describe en el anexo 5, utilizando 1 µL del cDNA obtenido de las diferentes cepas 
y empleando los oligonucleótidos que corresponden a los genes gyrB, E1012, 
E1013, espZ, grlR y grlA. El gen gyrB se utilizó como control en el análisis ya que 
en términos generales se expresa de manera constitutiva sin mostrar mucha 
variabilidad entre cepas y condiciones de crecimiento, asimismo se utilizaron como 
controles positivos los genes espZ, grlR y grlA de los cuales se conoce su 
regulación. Adicionalmente los productos del PCR se analizaron en geles de 
agarosa al 1 % (datos no mostrados). 
5.8 Construcción de fusiones transcripcionales al gen reportero cat 
Para la construcción de las fusiones transcripcionales descritas en la Tabla 1 se 
diseñaron oligonucleótidos (Tabla 2) para amplificar fragmentos conteniendo 
diferentes longitudes de las regiones reguladoras y los primeros codones de los 
genes E1012 y E1013 (Fig. 7B y C). 
Los PCRs se realizaron utilizando como templado el DNA de la cepa EPEC WT y 
la enzima Taq polimerasa (FERMENTAS). Los productos resultantes se limpiaron 
17 
 
utilizando el estuche comercial High Pure PCR Product Purification Kit (ROCHE) y 
digeridos con las enzimas de restricción BamHI y HindIII (Thermo Scientific). 
Posteriormente fueron ligados con la enzima T4 DNA Ligasa (Thermo Scientific) al 
plásmido pKK232-8 (Pharmacia LKB Biotechnology), el cual contiene el gen cat 
(que codifica para la cloranfenicol acetiltransferasa) carente de promotor (Fig. 6), 
digerido con las mismas enzimas. Los productos de la reacción de ligación se 
electroporaron con pulsos de 2.50 kV a células electrocompetentes (anexo 6) de la 
cepa E. coli DH5a. La correcta generación de las fusiones fue confirmada 
mediante secuenciación del fragmento insertado en los plásmidos resultantes (Fig. 
7, tabla 1). La secuenciación se realizó en la Unidad de Síntesis y Secuenciación 
del Instituto de Biotecnología-UNAM. 
Las fusiones pKK1013m-10(TA), pKK1013m-10(T) y pKK1013m-35 se 
construyeron por PCR sobrelapado. Utilizando los oligonucleótidos enlistados en 
la tabla 2, en una primera reacción se amplificaron por separado los dos 
fragmentos con los cambios a generar en la región en la que ambos sobrelapan. 
Dichos productos se utilizaron como DNA molde para el PCR sobrelapado y 
usando los oligonucleótidos E-1013-R94-F y EPEC-1013-C500R. Las digestiones 
y ligaciones de estos productos se realizaron como se describió anteriormente. 
18 
 
 
Figura 6. Representación esquemática del plásmido pKK232-8 conteniendo el gen reportero cat 
sin promotor utilizado para la clonación de las secuencias reguladoras de los genes E1012 y 
E1013. 
 
Figura 7. Representación esquemática de las primeras fusiones transcripcionales pKK1012 (A) y 
pKK1013 (B). 
19 
 
5.9 Ensayo de actividad de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) 
Los ensayos de CAT y determinación de proteína para calcular la actividad 
específica se realizaron de acuerdo al protocolo descrito en el anexo 7 a partir de 
cultivos en DMEM o LB de las cepas de EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA y Δler, asícomo 
las cepas E. coli MC4100 WT y Δhns, las cuales fueron transformadas 
adicionalmente con el vector pMPM-T3 vacío o sus derivados pT3-GrlR, 
pTEPGrlA1 o pTEPLer1, que codifican para GrlR, GrlA y Ler, respectivamente. 
5.10 Primer extension y reacción de secuencia 
Las cepas de EPEC WT y sus mutantes ΔgrlR y ΔgrlA conteniendo el plásmido 
pKK1013 se crecieron en 50 mL de DMEM a 37°C en agitación hasta alcanzar una 
D.O600=0.6. El RNA total fue aislado como se describe en el anexo 2. El 
oligonucleótido SEQ1-RvpKK232-8, que alinea con la secuencia ubicada 70 pb 
corriente abajo del sitio de clonación múltiple del plásmido pKK232-8, se marcó 
con (-32P) ATP y la cinasa T4 (Fermentas) siguiendo las instrucciones del 
fabricante (anexo 8). La mezcla de reacción conteniendo el oligonucleótido 32P- 
SEQ1-RvpKK232-8 y 20 µg de RNA total, se calentó a 65°C por 5 minutos, se dejó 
enfriar y posteriormente se realizó la retrotranscripción con la enzima RevertAid H 
Minus Reverse Transcriptase (ThermoFisher SCIENTIFIC) incubando 1 hora a 
42°C. El cDNA generado se precipitó y se separó en un gel de poliacrilamida al 
8% y se visualizó por autorradiografía (anexo 9). La reacción de secuencia se llevó 
a cabo utilizando el estuche Thermo-Sequenase (USB, Cleveland, OH), como 
especifica el fabricante y utilizando el mismo oligonucleótido 32P-SEQ1-RvpKK232-
8 utilizado en la reacción de primer extension y DNA del plásmido pKK1013 como 
templado. La reacción de secuencia fue analizada en el mismo gel, en los carriles 
adyacentes a las muestras del primer extension. 
 
 
 
 
20 
 
6. RESULTADOS 
6.1 Análisis in silico de las proteínas potencialmente codificadas por 
los genes E1012 y E1013 
De acuerdo a la predicción realizada con los programas en línea ProtcompB, 
PSIPRED y SignalP 4.1, el producto del gen E1012 (Fig. 8) sería una proteína de 
238 aa (27.577 kDa de acuerdo a la secuencia de aminoácidos), que a pesar de 
no contener péptido señal podría estar en la membrana interna debido a la 
presencia de 5 posibles dominios transmembranales. 
 
Figura 8. Representación esquemática del análisis del producto del gen E1012. Composición de 
aminoácidos y predicción de estructura secundaria por PSIPRED (A) y gráfico de la predicción de 
péptido señal vía SignalP 4.1 (B). 
Por su parte, la secuencia del posible producto del gen E1013 (Fig. 9) sugiere una 
proteína hipotética de 132 aa (15.243 kDa de acuerdo a la secuencia de 
aminoácidos) que no presenta un péptido señal. 
21 
 
 
Figura 9. Representación esquemática del análisis del producto del gen E1013. Composición de 
aminoácidos y predicción de estructura secundaria por PSIPRED (A) y gráfico de la predicción de 
péptido señal vía SignalP 4.1 (B). 
6.2 Los resultados obtenidos por qRT-PCR confirman los datos de los 
experimentos de transcriptómica por RNAseq 
Para validar los datos del RNAseq sobre la regulación de los genes E1012 y 
E1013 mediada por GrlA y GrlR, se realizaron ensayos de qRT-PCR para 
determinar los niveles de expresión de estos genes a partir de RNA total obtenido 
de la cepa EPEC WT y sus mutantes en grlR y grlA. Adicionalmente, investigamos 
si, efectivamente, Ler posee un papel poco relevante con respecto al de GrlA, y 
dado que Ler juegan un papel importante en la regulación de los genes de la isla 
LEE incluyendo el operón grlRA, se utilizó en este ensayo la cepa mutante en ler. 
El fenotipo de las cepas EPEC WT, Δler, ΔgrlR y ΔgrlA se verificó mediante el 
perfil de proteínas secretadas dependientes del SST3 (ver anexo 1, Fig. 25). 
22 
 
De acuerdo a los datos mostrados en la Fig. 10, ambos genes se desreprimen en 
la cepa EPEC ΔgrlR crecida en condiciones de represión (medio LB) donde el 
fenotipo de la mutante es más evidente para los genes del LEE (ver control de 
LEE2). Para el caso de E1012 los valores de expresión son aproximadamente el 
doble de la cepa EPEC WT cuyo valor corresponde a la línea basal 0 de la gráfica, 
mientras que la expresión de E1013 alcanzó niveles más altos, observándose 
cerca de cuatro veces más expresión. Por su parte, la eliminación de los 
reguladores positivos tiene un impacto moderado en la expresión de estos genes 
en las condiciones probadas. Se observa una tendencia a la disminución en los 
niveles de expresión con respecto a la cepa WT para E1012 en la Δler, mientras 
que para el gen E1013 la expresión tiende a disminuir en la mutante en grlA en 
ambas condiciones. En conjunto los resultados mostrados en la Fig. 10, confirman 
la participación de GrlR y GrlA en la regulación de ambos genes. Sin embargo, por 
qRT-PCR la regulación de E1012 y E1013 a una D.O600=0.3 es más evidente en la 
mutante en grlR, como se observó por RNAseq, y no para los reguladores 
positivos (Fig. 4). Lo anterior sugiere que a pesar de la baja actividad de los 
promotores en estudio, el RNAseq es más sensible para detectar las diferencias 
entre cepas y que por qRT-PCR los resultados no son del todo contundentes, por 
lo cual sería necesario analizar la expresión en un futuro a D.Os más avanzadas. 
Por ello se continuó la validación del RNAseq mediante el análisis de fusiones 
transcripcionales al gen reportero cat, las cuales además permitieron realizar un 
estudio más detallado de las regiones reguladoras de E1012 y E1013. 
23 
 
 
Figura 10. Niveles de expresión de los genes E1012, E1013 y espZ analizados por qRT-PCR a 
partir de RNA total obtenidos de muestras colectadas a una D.O600=0.3 de cultivos de cepas EPEC 
WT, ΔgrlR, ΔgrlA y Δler en medio LB (A) y DMEM (B) a 37°C en agitación. Los datos representan 
el promedio de dos experimentos independientes. 
6.3 Actividad transcripcional mediante fusiones al gen reportero cat 
La actividad de las fusiones transcripcionales al gen reportero cat analizadas en 
este estudio, se determinó en las cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA, Δler y Δhns, así 
como en E. coli MC4100 y su mutante en hns con o sin plásmidos adicionales a la 
fusión para efectos de complementación. Los ensayos de CAT se realizaron a 
partir de muestras de cultivos crecidos a una D.O600=1.2 en medio LB y DMEM, 
condiciones de represión e inducción in vitro de la expresión de factores de 
virulencia en EPEC, respectivamente (Bustamante et al., 2001). Se utilizó como 
control negativo el vector vacío, para el cual no se observó actividad 
transcripcional (datos no mostrados), y como control positivo la fusión pSEPZ-11 
(tabla 1), la cual contiene la región reguladora del operón LEE2 cuyo perfil 
transcripcional coincide con los datos reportados previamente (Fig. 11) 
(Bustamante et al., 2001, 2011). 
24 
 
 
Figura 11. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen espZ (operón 
LEE2) en las cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA, Δler y Δhns, y E. coli MC4100 y su mutante en hns. 
Las muestras provienen de cultivos en medio LB y DMEM a 37°C en agitación a una D.O600=1.2. 
Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes. 
Posteriormente, las diferentes cepas con la fusión pSEPZ-11, se complementaron 
ya sea con el vector pMPM-T3 vacío o sus derivados pT3-GrlR, pTEPGrlA o 
pTEPLer1 (tabla 1) que codifican para GrlR, GrlA o Ler, respectivamente. Los 
ensayos de actividad en las condiciones descritas anteriormente, mostraron que la 
expresión constitutiva de GrlA o Ler restaura la expresión en las mutantes 
correspondientes aun en condiciones de represión, siendo más marcado el 
fenotipo al complementar con el plásmido que codifica para Ler, tanto en la cepa 
mutante de EPEC como en el fondo de E. coli MC4100, en donde solo se observa 
el efecto directo de Ler. Por su parte, GrlR reprime de manera drástica la 
expresión de esta fusión (Fig. 12). Estos resultados demuestran que las 
herramientas usadas en este estudio funcionan adecuadamente. 
25 
 
 
Figura 12. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen espZ (operón 
LEE2) en las cepasEPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA y Δler (A) y E. coli MC4100 (B) en presencia del vector 
pMPM-T3 o sus derivados pT3-GrlR, pTEPGrlA1 o pTEPLer1, expresando GrlR, GrlA o Ler, 
respectivamente. Las muestras fueron colectadas a una D.O600=1.2 de cultivos en medio LB y 
DMEM para las cepas de EPEC y solo en LB para la MC4100 a 37°C en agitación. Los datos 
representan el promedio de tres experimentos independientes. 
6.4 GrlR y H-NS reprimen la expresión de E1012 
La búsqueda de elementos reguladores en la secuencia corriente arriba del codón 
de inicio del gen E1012, utilizando el programa en línea BPROM (Solovyev et al., 
2011, http://www.softberry.com), predijo la presencia de un promotor atípico con 
las cajas -10 y -35 ubicadas a 41 pb y 62 pb, respectivamente, corriente arriba del 
primer ATG y con una secuencia espaciadora de 15 pb (Fig. 13). Este promotor 
putativo está contenido en la fusión E1012-cat. 
26 
 
 
Figura 13. Identificación in silico del posible promotor en la región 5´ no codificante del gen E1012. 
Las bases en color rojo representan los nucleótidos conservados de la secuencia consenso para 
promotores dependientes de sigma 70 en E. coli. 
Los niveles de expresión de la fusión contenida en el plásmido pKK1012 (Fig. 14) 
aumentan de manera significativa en ausencia de GrlR sobre todo cuando la 
bacteria crece en LB, lo cual correlaciona con las condiciones de represión en 
donde el fenotipo de dicha mutante es más evidente para los genes del LEE (Lara-
Ochoa, C., datos no publicados). También se observa desrepresión en la mutante 
en hns, particularmente en DMEM. 
En el caso de los reguladores positivos los resultados no son tan evidentes. Sin 
embargo, la actividad del promotor de la fusión pKK1012 muestra un incremento 
de alrededor de 3 veces entre LB y DMEM como sucede para los genes del LEE. 
Dicha actividad se ve ligeramente reducida en condiciones de inducción (DMEM) 
en las mutantes en grlA y ler, consistentemente con lo observado por RNAseq y 
qRT-PCR. En conjunto estos datos sugieren que el gen E1012 es regulado 
negativamente por GrlR y H-NS; sin embargo, nuestros datos demuestran que la 
regulación positiva no depende directamente de GrlA y Ler. 
27 
 
 
Figura 14. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen E1012 en las 
cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA, Δler y Δhns, así como en E. coli MC4100 y su mutante en hns. Las 
muestras provienen de cultivos en medio LB y DMEM a 37°C en agitación a una D.O600=1.2. Los 
datos representan el promedio de tres experimentos independientes. 
De manera interesante, a pesar del papel que como represor parece jugar H-NS 
en la expresión de este gen, los datos de actividad en el fondo de la cepa MC4100 
derivada de E. coli K12 y su mutante en hns, muestran niveles similares 
independientemente del medio; sin embargo, en el fondo de EPEC, en ausencia 
de H-NS los niveles de expresión son significativamente más altos. Esto sugiere la 
existencia de un regulador positivo presente únicamente en EPEC, y que 
contrarresta el efecto represor ejercido por GrlR y H-NS sobre la actividad del 
promotor del gen E1012. 
6.5 La expresión constitutiva de GrlR reprime la expresión de E1012 
Los datos descritos anteriormente, indican que GrlR reprime la expresión del gen 
E1012. De acuerdo con esta observación, la expresión de GrlR a partir del 
plásmido pT3-GrlR revoca el efecto de la mutante (Fig. 15A), disminuyendo los 
niveles de expresión incluso por debajo de los observados en la cepa EPEC WT, 
sin importar las condiciones de crecimiento. Sin embargo, el efecto de los 
reguladores positivos continúa siendo indefinido porque si bien en las mutantes 
con el vector vacío no se observan diferencias significativas con respecto a la 
28 
 
cepa WT, la expresión de Ler y GrlA a partir de los plásmidos incrementa su 
expresión en forma evidente en condiciones de represión o inducción, 
respectivamente. Esta activación no parece ser directa, ya que los reguladores del 
LEE no favorecen mayores niveles de expresión de la fusión E1012-cat contenida 
en el plásmido pKK1012 en el fondo de E. coli MC4100 (Fig. 15B). 
 
Figura 15. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen E1012 en las 
cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA y Δler (A) y E. coli MC4100 (B) en presencia del vector pMPM-T3 o 
sus derivados pT3-GrlR, pTEPGrlA1 o pTEPLer1, expresando GrlR, GrlA o Ler, respectivamente. 
Las muestras fueron colectadas a una D.O600=1.2 de cultivos en medio LB y DMEM para las cepas 
de EPEC y solo en LB para la MC4100 a 37°C en agitación. Los datos representan el promedio de 
tres experimentos independientes. 
6.6 Recortes de la región reguladora de E1012 
Para delimitar la región mínima reguladora del gen E1012, se generaron fusiones 
transcripcionales adicionales. Las fusiones abarcan diferentes longitudes de la 
región reguladora 5´ del gen (Fig. 16). De acuerdo a la posición 5´ con respecto al 
inicio de la traducción, las fusiones fueron llamadas pKK1012-R279 y pKK1012-
R87. 
De acuerdo a nuestros resultados, la fusión pKK1012-R279 no mostró un cambio 
significativo en la actividad de CAT con relación a pKK1012. Sin embargo, la 
actividad de pKK1012-R87 se abate casi por completo (Fig. 16). Este resultado 
sugiere que en la región eliminada existen elementos necesarios involucrados en 
la regulación positiva de gen E1012. 
29 
 
 
Figura 16. Representación esquemática y actividad transcripcional de los recortes de la región 
reguladora del gen E1012 en EPEC WT, en medio DMEM a 37 °C en agitación. Las muestras 
fueron colectadas a una D.O600=1.2. Los datos representan el promedio de tres experimentos 
independientes. 
En conjunto, los resultados obtenidos sobre la regulación del gen E1012 no 
reflejan una actividad directa de los reguladores positivos probados, pero sí la 
represión ejercida por GrlR, ilustrando una variante del circuito regulador que 
establecen GrlR, GrlA y Ler para los genes del LEE ya que podrían existir otros 
factores que pueden estar involucrados en la expresión de este gen. El estudio 
detallado del mecanismo, así como la identificación de otros posibles reguladores 
quedan abiertas para trabajo futuro. En este trabajo nos centramos más en la 
caracterización de elementos reguladores para el gen E1013, los cuales se 
describen a continuación. 
30 
 
6.7 GrlA activa la expresión de E1013 mientras que GrlR la reprime 
La actividad transcripcional de la fusión pKK1013 en la cepa silvestre crecida en 
LB fue muy baja pero aumenta aproximadamente 10 veces en cultivos en DMEM, 
lo cual refleja el comportamiento que tienen los promotores del LEE en respuesta 
a las condiciones de represión (LB) e inducción (DMEM) (Fig. 17). Cuando esta 
fusión se transfirió a una mutante ΔgrlR los niveles de expresión aumentaron 
dramáticamente en LB con respecto a la cepa WT donde la expresión de este gen 
es casi nula, de ahí que el efecto de los reguladores positivos no sea evidente. En 
contraste, en condiciones de inducción (DMEM) la expresión en la mutante en grlR 
no es tan diferente a la de la cepa WT, pero en ausencia de los reguladores 
positivos GrlA y Ler la actividad se abate de de 3 a 4 veces (Fig. 17). 
Consistentemente con los datos obtenidos tanto por RNAseq (Fig. 4) como por 
qRT-PCR (Fig. 10), a diferencia de los promotores del LEE, excepto el de ler 
(LEE1), la expresión de E1013 tiende a disminuir más en la mutante carente de 
GrlA, lo cual sugiere que este regulador juega un papel más directo en la 
activación del gen E1013. Por su parte, en la cepa EPEC Δhns la expresión 
aumentó pero sólo ligeramente en ambas condiciones de crecimiento, indicando 
que GrlR es el principal represor de este gen. 
En E. coli MC4100 no se observó actividad de la fusión en LB y es muy baja en 
DMEM, mientras que en la mutante en hns la actividad transcripcional aumenta 
sólo ligeramente en ambas condiciones de crecimiento, lo cualdifiere de los altos 
niveles de expresión que alcanzan los genes del LEE en ausencia de H-NS tanto 
en EPEC como en E. coli K12 (Bustamante et al., 2001). En su conjunto estos 
resultados sugieren que la activación de E1013 depende del circuito regulador que 
establecen los reguladores GrlR, GrlA y Ler (Fig. 3). Sin embargo, la participación 
de H-NS no parece ser relevante lo cual coincide con el papel secundario que 
parece jugar Ler en la activación. 
31 
 
 
Figura 17. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen E1013 en las 
cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA, Δler y Δhns, y E. coli MC4100 y su mutante en hns. Las muestras 
provienen de cultivos en medio LB y DMEM a 37 °C en agitación a una D.O600=1.2. Los datos 
representan el promedio de tres experimentos independientes. 
Los resultados anteriores plantearon la posibilidad de que GrlA es el activador 
directo de E1013 y para evaluarla se realizaron experimentos de complementación 
con el plásmido pTEPGrlA1 y la fusión E1013-cat tanto en EPEC ΔgrlA como en 
E. coli MC4100 donde la actividad del promotor es basal. En EPEC ΔgrlA se 
observa un aumento en la expresión de la fusión tras la complementación en 
condiciones de represión donde sólo se detectan niveles basales en presencia del 
vector vacío (Fig. 18A). 
Por su parte, cuando la complementación se realiza en E. coli MC4100 donde la 
fusión no se expresa, la presencia de GrlA, y no de los otros reguladores, 
claramente activa la expresión de la fusión E1013-cat con respecto al vector vacío 
(Fig.18B). De forma contraria, cuando la cepa EPEC ΔgrlR, en la que la fusión del 
plásmido pKK1013 se encuentra desreprimida (Fig. 17), se complementa con el 
plásmido pT3-GrlR, los niveles de expresión se reducen parcialmente en LB, pero 
drásticamente en DMEM. 
Aunque no es claro porqué se dan algunas diferencias dependientes del medio; 
conjuntamente estos datos reflejan el papel del sistema GrlR-GrlA en la expresión 
32 
 
de E1013 y apoyan la noción de que GrlA podría activar directamente la expresión 
de E1013 como sucede para el caso del gen ler (operón LEE1) y que GrlR lo 
regula de manera negativa al secuestrar al activador (Barba et al., 2005; Jiménez 
et al., 2010). Se realizaron intentos por demostrar el mecanismo por el cual GrlA 
activa la expresión de E1013 mediante ensayos de interacción proteína-DNA tipo 
EMSA; sin embargo, no se logró observar el pegado de GrlA a la región promotora 
de E1013, por lo cual es importante adecuar las condiciones del experimento o 
implementar otro método que permita corroborar la interacción de este regulador y 
de esta manera detallar el mecanismo de activación de E1013 mediada por GrlA. 
 
Figura 18. Actividad de la fusión correspondiente a la región reguladora del gen E1013 en las 
cepas EPEC WT, ΔgrlR, ΔgrlA y Δler (A) y E. coli MC4100 (B) en presencia del vector pMPM-T3 o 
sus derivados pT3-GrlR, pTEPGrlA1 o pTEPLer1, expresando GrlR, GrlA o Ler, respectivamente. 
Las muestras fueron colectadas a una D.O600=1.2 de cultivos en medio LB y DMEM para las cepas 
de EPEC y solo en LB para la MC4100 a 37°C en agitación. Los datos representan el promedio de 
tres experimentos independientes. 
6.8 Identificación del promotor de E1013 
Con el fin de identificar el promotor que controla la expresión de E1013 y 
comenzar un análisis detallado de su región reguladora, primero se realizó una 
predicción in silico usando el programa de reconocimiento de promotores 
bacterianos (Softberry BPROM) (Solovyev et al., 2011, http://www.softberry.com). 
Esta predicción ubica la caja -10 a 44 pb y la caja -35 a 68 pb corriente arriba del 
codón de inicio del gen con una secuencia espaciadora de 19 pb (Fig. 19). 
33 
 
 
Figura 19. Identificación in silico del posible promotor en la región 5´ no codificante del gen E1013. 
Las bases en color rojo representan los nucleótidos conservados de la secuencia consenso para 
promotores dependientes de sigma 70 en E. coli. 
Con el objetivo de valorar esta predicción y determinar experimentalmente el inicio 
de transcripción, se realizaron experimentos de primer extension usando muestras 
de RNA obtenidas de las cepas EPEC WT, ΔgrlR y ΔgrlA, llevando el plásmido 
pKK1013. El RNA total se hibridó con el oligonucleótido SEQ1-RvpKK232-8 
marcado con 32P que corresponde al extremo 5´ del gen reportero cat. La finalidad 
de determinar el sitio de inicio a partir del transcrito de la fusión en las diferentes 
cepas, fue el de incrementar la señal, ya que los intentos por hacerlo a partir del 
transcrito endógeno fueron infructuosos. 
Los resultados de estos experimentos revelaron que el sitio de inicio de 
transcripción corresponde a una guanina (G) localizada 5 nucleótidos corriente 
arriba del codón de inicio del gen estructural de acuerdo a la anotación del 
genoma de EPEC (Fig. 20). Las posibles cajas -35 (TTGACA) y -10 (TAGAAA) 
están separadas por 18 nucleótidos y contienen seis y cuatro de las seis bases 
representadas en la secuencia consenso de las cajas -35 y -10, respectivamente 
de promotores dependientes de sigma 70 en E. coli (Fig. 21). Este promotor no 
corresponde al promotor predicho in silico, lo cual resalta la importancia del 
análisis experimental de la región reguladora de genes con potencial en virulencia. 
34 
 
 
Figura 20. Determinación del inicio de transcripción del gen E1013. RNA total de EPEC WT y sus 
mutantes en grlR y grlA conteniendo la fusión pKK1013, purificado a partir de muestras obtenidas a 
una D.O600=0.6 de cultivos en DMEM, se hibridó con un oligonucleótido marcado con 32P dirigido 
contra la secuencia del transcrito para producir cDNA marcado. La reacción se resolvió en un gel 
de acrilamida al 8% y se visualizó por autorradiografía. 
Además, la misma señal se detectó a diferentes intensidades dependiendo de la 
cepa utilizada en la extracción del RNA total, obteniéndose la señal más intensa 
en la cepa EPEC ΔgrlR, seguida de la cepa silvestre y la mutante en grlA, lo cual 
correlaciona con los niveles de expresión diferencial de E1013 observados con las 
fusiones transcripcionales (Fig. 17). 
De manera interesante, tomando en cuenta la ubicación del inicio de transcripción 
así como el promotor identificado experimentalmente, el codón de inicio de 
traducción anotado en la base de datos no parece corresponder al inicio de 
E1013, esto debido a la cercanía a la que se encuentran estos elementos del GTG 
anotado, lo que deja un espacio limitado para que se ubique un posible sitio de 
unión a ribosoma. El codón de inicio real podría estar ubicado corriente abajo de 
este GTG, por lo cual es importante realizar experimentos adicionales que 
permitan identificarlo, además de demostrar que E1013 codifica en realidad para 
un producto proteico. 
35 
 
 
Figura 21. Representación esquemática de la secuencia nucleotídica de la región reguladora de 
E1013, las cajas -35 y -10 se muestran dentro de rectángulos y las bases conservadas de acuerdo 
al consenso se encuentran subrayadas. La flecha indica el inicio de transcripción identificado por 
primer extension. La escala está indicada con respecto al codón de inicio de E1013 (GTG) anotado 
en la base de datos. 
Con base en la identificación del inicio de transcripción y ubicación del promotor 
de E1013 se realizó un alineamiento con el promotor de ler (Fig. 22), en donde se 
observa un alto grado de conservación entre las secuencias de ambos 
promotores, llama la atención que la identidad se encuentra principalmente en la 
región espaciadora entre las cajas -35 y -10, que además contiene parte del 
posible sitio de unión de GrlA descrito por Islam et al., 2011. 
 
Figura 22. Alineamiento del promotor de E1013 con el promotor de ler. Las bases conservadas se 
marcan con un asterisco y las bases en color rojo representan parte del posible sitio de unión de 
GrlA (Islam et al., 2011). 
6.9 Recortes de la región reguladora deE1013 
Para confirmar la funcionalidad del promotor e identificar elementos reguladores 
adicionales, se construyeron una serie de fusiones transcripcionales al gen 
reportero cat, las cuales comprenden diferentes longitudes de la región reguladora 
del gen E1013. Adicionalmente, se generó una variante que presenta cambios en 
36 
 
la secuencia de nucleótidos de la caja -35 y otras dos que modifican la caja -10 del 
gen E1013 (Fig. 23). 
Las fusiones fueron llamadas pKK1013-R137, pKK1013-R89, pKK1013m-10(TA), 
pKK1013m-10(T) y pKK1013m-35 de acuerdo a la posición 5´ y/o 3´ del inserto 
con respecto al inicio de transcripción identificado experimentalmente y a los 
cambios realizados en su secuencia. Las fusiones pKK1013-R137 (que contiene 
un fragmento que va de la posición -137 a +26 de acuerdo al inicio de 
transcripción (SIT) experimental) y pKK1013-R89 (posiciones -89 a +26) se 
expresan a niveles similares a los de la fusión pKK1013 (posiciones -495 a +26 ); 
sin embargo, la expresión de las fusiones pKK1013m-10(TA) (en la cual se alteró 
la secuencia de la caja -10) y pKK1013m-35 (en la cual se modificó la secuencia 
de la caja -35), que son derivadas de la fusión pKK1013-R89, se abate por 
completo (Fig. 23). En conjunto, estos resultados confirman la funcionalidad del 
promotor y la localización del inicio de transcripción identificados mediante primer 
extension, e indican que todos los elementos involucrados en la regulación del gen 
E1013 están contenidos entre las posiciones -89 y +26 con respecto al inicio de 
transcripción. Llama la atención que, en la fusión pKK1013m-10(T) en donde se 
realizó el cambio de un solo nucleótido en la secuencia de la caja -10, se observa 
un aumento de hasta 30 veces en los niveles de expresión tanto en LB (en donde 
la fusión es inactiva) y de hasta 6 veces en DMEM con respecto a la fusión 
parental pKK1013-R89, lo cual refleja el efecto que tiene la secuencia consenso 
del promotor dependiente de σ70 en la expresión genética bacteriana. Hasta el 
momento no sabemos si este aumento es dependiente de GrlA, pero esta 
observación abre la posibilidad de utilizar esta fusión para conocer más sobre el 
mecanismo de acción de GrlA en el contexto de un promotor más activo. 
37 
 
 
Figura 23. Representación esquemática y actividad transcripcional de los recortes de la región 
reguladora del gen E1013 en EPEC WT. Las muestras provienen de cultivos en medio LB y DMEM 
a 37 °C en agitación a una D.O600=1.2. Los datos representan el promedio de tres experimentos 
independientes. Las bases en color rojo representan los cambios realizados en la secuencia de las 
cajas -10 y -35 del promotor. 
 
38 
 
7. DISCUSION 
La disponibilidad de miles de secuencias de genomas de patógenos bacterianos y 
el uso de diferentes enfoques genéticos como la transcriptómica, ha permitido la 
identificación de genes que codifican para factores potenciales de virulencia, a la 
fecha no caracterizados, y que carecen de similitud con proteínas funcionalmente 
anotadas en las bases de datos. Lo anterior se ha basado, entre otras cosas, en la 
comparación de la expresión diferencial de genes a partir de muestras obtenidas 
de la cepa silvestre cultivada bajo diferentes condiciones de crecimiento que 
reprimen o activan la expresión de factores de virulencia conocidos, así como de 
mutantes en genes que codifican para reguladores transcripcionales que controlan 
la expresión de más de un factor de virulencia (Hammarlöf et al., 2013). Estos 
estudios han evidenciado, a su vez, que genes de virulencia adquiridos por 
transferencia horizontal han sido incorporados a redes reguladoras pre-existentes 
en la célula, así como que, en el caso de reguladores transcripcionales, éstos 
evolucionaron para regular más de un gen. Tal es el caso del gen ler que codifica 
para el regulador maestro de la isla de patogenicidad LEE, el cual es regulado por 
diferentes reguladores globales como IHF, H-NS, SdiA, el sistema de dos 
componentes QseEF, entre otros; a su vez, Ler regula, además del LEE, genes 
adicionales localizados fuera de la isla como es el caso de los genes espC y nleA 
(García-Angulo et al., 2012; Mellies et al., 2007, Mellies y Lorenzen, 2014). 
Experimentos de transcriptómica por RNAseq revelaron que la expresión de los 
genes de función desconocida E1012 y E1013 de EPEC, cuya localización en el 
genoma en el contexto del profago PP4 que también codifica para las proteínas 
efectoras no codificadas en el LEE (Nle, non LEE-encoded effector) NleI, NleB, 
NleC y NleD es modulada positivamente por el regulador GrlA, ya que en la 
mutante en grlA la expresión de ambos genes disminuye, particularmente la del 
gen E1013, con respecto a la expresión en la cepa silvestre (Fig. 4). En contraste, 
en ausencia del regulador negativo GrlR la expresión de E1012 y E1013 se 
incrementa considerablemente, sobretodo bajo condiciones de crecimiento que 
reprimen la expresión de los genes del LEE (medio LB). Esta tendencia observada 
inicialmente por RNAseq también se reflejó en los ensayos de qRT-PCR que se 
39 
 
muestran en la Fig. 10, en donde la expresión de E1012 disminuye en las 
mutantes en grlA y en ler con respecto a la cepa silvestre. Esto coincide con las 
características del circuito de regulación positiva que establecen los reguladores 
GrlR, GrlA y Ler para los genes del LEE (Barba et al., 2005). Para el caso de 
E1013 la expresión en la cepa ΔgrlA disminuye, mientras que en la mutante en ler 
pareciera no haber efecto, lo cual sugiere que GrlA directamente activa la 
expresión de este gen, como previamente se ha reportado para ler en EPEC y C. 
rodentium (Deng et al., 2004; Barba et al., 2005; Bustamante et al., 2011; Jiménez 
et al., 2010) y el operón ehxCABD que codifica para una hemolisina en EHEC 
(Padavannil et al., 2013; Saitoh et al., 2008), a cuyas regiones reguladoras se une 
directamente in vitro. Contrario a lo observado para GrlA, GrlR regula de manera 
negativa la expresión de E1012 y E1013 ya que ésta aumenta en la mutante 
correspondiente. Este comportamiento coincide con el modelo de regulación 
negativa mediado por GrlR sobre ler a través de la interacción con el dominio de 
unión a DNA de GrlA (Jiménez et al., 2010). La estructura cristalográfica del 
complejo GrlR-GrlA apoya este modelo de regulación (Padavannil et al., 2013), en 
el cual la formación del heterotrímero GrlA:GrlR2X evita la interacción de GrlA con 
la región reguladora de sus genes blanco, incluido ler que codifica para el 
regulador maestro de los genes de la isla LEE. 
Los ensayos realizados con las fusiones transcripcionales de las regiones 
reguladoras de los genes E1012 (Fig.14) y E1013 (Fig. 17) mostraron la misma 
tendencia observada por RNAseq (Fig. 4) y por qRT-PCR (Fig. 10), en cuanto al 
papel que juegan los reguladores de la isla LEE en su regulación. 
De acuerdo a los resultados obtenidos para la fusión E1012-cat, la ausencia de H-
NS tanto en el fondo de EPEC como de E. coli MC4100 permite niveles de 
expresión mayores a los de la cepa silvestre (Fig. 14), tanto en condiciones de 
represión como de inducción, siendo más marcado el aumento de la expresión en 
la cepa EPEC Δhns en condiciones de inducción. Lo anterior indica que H-NS, ya 
sea por sí misma o en forma cooperativa con GrlR, regula de manera negativa la 
expresión del gen E1012, como se ha observado para los genes de la isla LEE 
40 
 
(Lara-Ochoa, C., datos no mostrados). En contraste con el efecto antagonista que 
presentan GrlA y Ler frente a la represión ejercida por H-NS sobre el LEE 
(Bustamante et al., 2001; Mellies et al., 2007; Jiménez et al., 2010), estos dos 
reguladores actúan de manera indirecta en la regulación de E1012 y el efecto de 
represión que se observa al complementar con GrlR, pudiera ser debido a su 
interacción con GrlA (Fig. 15A). Esto se corroboró en el fondo de E. coli MC4100 
en donde niLer, GrlR o GrlA tienen un efecto directo en la expresión de E1012 
(Fig. 15B). En conjunto estos datos sugieren que en la regulación de E1012 
pueden estar involucrados uno o más reguladores, a la fecha desconocidos, que 
responden a las condiciones de inducción de la isla LEE, y que éstos son 
necesarios para contrarrestar el efecto represor de GrlR y H-NS, y/o para la 
activación del promotor del gen E1012. 
De hecho, el análisis por deleción de la región reguladora de E1012 sugiere que 
en la región comprendida entre las posiciones -279 a -87 con respecto al inicio 
predicho de su traducción, existe un elemento de regulación positiva donde 
pudiera unirse un regulador adicional que favorece la activación del promotor y/o 
donde se encuentra el promotor funcional de E1012 que no corresponde al 
predicho in silico y que no pudo ser determinado por primer extension. En 
resumen, por el mecanismo de regulación que sugiere la participación de 
reguladores específicos de EPEC que responden a las condiciones de inducción 
reportadas para los genes del LEE (Lara-Ochoa, C., datos no publicados) y por las 
características que presenta E1012 (Fig. 5 y 8), sería importante analizar el 
mecanismo de regulación y los posibles reguladores involucrados, además de 
identificar qué elementos son los que se encuentran en la posición -279 a -87 de 
su región promotora y cómo afectan la expresión de este gen con posible función 
en virulencia. 
Por su parte, el estudio del mecanismo de regulación de E1013 por ensayos de 
RNAseq (Fig. 4), qRT-PCR (Fig. 10) y fusiones transcripcionales tanto en cepas 
de EPEC mutantes y complementadas (Figs. 17 y 18A), como en E. coli K-12 (Fig. 
41 
 
18B), proporcionó elementos más claros para proponer que GrlA activa 
directamente su expresión y que GrlR la reprime. 
Se ha descrito que GrlA podría actuar tanto como un activador clásico y/o como un 
antagonista de H-NS, evitando así la represión que ésta ejerce sobre el promotor 
de ler (Jiménez et al., 2010; Bustamante et al., 2011); sin embargo, fue interesante 
observar que H-NS no juega un papel importante en la represión de E1013. Lo 
anterior sugiere que GrlA podría estar actuando como un regulador clásico al 
interactuar con elementos en cis localizados en la región reguladora de E1013, y/o 
desplazando a otro represor. De acuerdo con nuestros resultados, las secuencias 
de los promotores ler y E1013 (Fig. 22) muestran un alto grado de conservación 
incluyendo la distancia del espaciador entre las cajas -35 y -10 del promotor (18 
pb), la cual no es una distancia canónica, así como 14 de estas 18 bases que 
incluyen el motivo ATGT previamente señalado como parte del posible sitio de 
unión de GrlA al promotor de ler (Islam et al., 2011). De acuerdo a lo reportado por 
Islam et al., 2011, se sugiere que el efecto activador de GrlA lo ejerce modificando 
la distancia entre las cajas -10 y -35 del promotor mediante una torsión del DNA, 
que permite acercar dichas cajas para un reconocimiento eficiente de la RNA 
polimerasa. Tal es el caso de varios miembros de la familia MerR de factores 
transcripcionales, los cuales para activar se unen a sitios localizados entre las 
cajas -35 y -10 de promotores cuya secuencia espaciadora es mayor a las 17 pb 
óptimas. Sin embargo, fue interesante observar que una mutación puntual en la 
caja -10 de E1013 (Fig. 23), aumentó la actividad del promotor hasta 30 veces en 
LB y 6 veces en DMEM, queda por determinar si esta actividad sigue siendo 
dependiente de GrlA. 
Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el sistema de regulación 
GrlR-GrlA no solo coordina el control de la expresión de genes del LEE (Barba et 
al., 2005; Bustamante et al., 2001; Islam et al., 2011; Jiménez et al., 2010), sino 
también genes que se encuentran fuera de esta isla de patogenicidad. Tal es el 
caso del gen E1013 evaluado en este trabajo, así como de los operones ehxCABD 
y flhDC en EHEC a los cuales regula de manera positiva y negativa, 
42 
 
respectivamente (Iyoda et al., 2006; Saitoh et al., 2008). El mecanismo molecular 
de dicha regulacoión no se ha caracterizado en detalle. 
En resumen, dada las características del mecanismo de regulación en el que 
participan dos reguladores importantes (GrlA y GrlR) involucrados en la 
patogénesis de EPEC, se sugiere que la expresión de E1013 posiblemente se 
encuentra de manera orquestada con los genes del LEE. Además, el contexto 
genómico en el que se encuentra ubicado E1013 y la gran similitud de su promotor 
con el de ler, sugieren que E1013 podría potencialmente jugar un papel novedoso 
en la virulencia de EPEC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
8. CONCLUSIONES 
 
 La regulación de los genes E1012 y E1013 responde a las condiciones de 
inducción y represión mediadas por los medios de cultivo DMEM y LB 
respectivamente, como sucede para los genes del LEE. 
 Los reguladores Ler, GlrR y GrlA no regulan de manera directa la 
expresión del gen E1012; sin embargo parecen participar como 
intermediarios en la vía de regulación. 
 El regulador global H-NS sólo reprime la expresión de E1012. 
 El mecanismo de regulación de E1013 es más claro y permite proponer un 
modelo de regulación (Fig. 24). Es probable que GrlA induce directamente 
la expresión de E1013, mientras que GrlR la reprime al interaccionar con 
GrlA. De manera interesante, H-NS no reprime la expresión de este gen, lo 
cual representa una variante en el mecanismo que regula los genes del 
LEE en EPEC. 
 La región comprendida entre los nucleótidos -89 y +26 de E1013 contiene 
los elementos necesarios para su expresión y reconocimiento por parte de 
GrlA, así como un promotor activo cuyas cajas -35 (TTGACA) y -10 
(TAGAAA) poseen secuencias conservadas para promotores dependientes 
de sigma 70 en E. coli. 
 La secuencias de los promotores de ler y E1013 muestran un alto grado de 
conservación, que incluye la distancia del espaciador entre las cajas -35 y -
10 del promotor, así como el posible sitio de unión (ATGT) de GrlA 
previamente descrito para ler. 
44 
 
 
Figura 24. Modelo de regulación propuesto para los genes E1012 y E1013. E1012 codifica 
para una proteína hipotética de membrana, en cuya regulación podrían estar involucrados uno o 
más reguladores a la fecha desconocidos, que responden a las condiciones de inducción de la isla 
LEE y que son necesarios para contrarrestar el efecto represor que ejercen GrlR y H-NS y/o para la 
activación de su promotor. Por su parte, E1013 codifica una proteína hipotética y su expresión es 
activada directamente por GrlA, mientras que GrlR la reprime al interaccionar con GrlA. A 
diferencia del gen ler, que es también regulado por GrlA, E1013 no es reprimido por H-NS, lo cual 
representa una variante del mecanismo que regula los genes del LEE en EPEC. Por sus 
características y la participación de GrlR-GrlA en su regulación (reguladores de genes de virulencia 
como ler y los operones ehxCABD y flhDC), sugieren un posible papel de E1012 y E1013 como 
potenciales genes de virulencia. 
 
 
 
 
 
45 
 
9. PERSPECTIVAS 
 
 Identificar los elementos reguladores de la región comprendida entre los 
nucleótidos -279 y +21 del gen E1012 y caracterizar su mecanismo de 
regulación. 
 Corroborar si GrlA se une a la región reguladora de E1013 y de esta forma 
activa su expresión. 
 Determinar la secuencia especifica requerida por GrlA para el 
reconocimiento del promotor de E1013. 
 Identificar el inicio de traducción de E1013 y de esta manera corregir su 
anotación en las bases de datos. 
 Determinar si los productos de E1012 y E1013 se traducen y evaluar su 
destino, incluyendo el que sean posibles sustratos del sistema de secreción 
tipo III. 
 Investigar la función y caracterizar el papel en virulencia de E1012 y E1013, 
mediante la generación de cepas mutantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
46