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Estudiando Biologia

10/8/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

“Purificación de auto-anticuerpos contra IL-10
humana mediante cromatografía de afinidad y su análisis
de reactividad con la IL-10 viral”

TESIS

Que para obtener el título de:
LICENCIADA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

P R E S E N T A

Claudia Itayetzi Luna Reyes

Asesora: Dra. Gabriela Barcenas Morales
Coasesora: Dra (c). Marcela Autran Martínez

Cuautitlán Izcalli, Estado de México, 2019

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

AGRADECIMIENTOS
Muy profundamente a la Universidad Nacional Autónoma de México y a todos
aquellos profesores que tuve a lo largo de todo este camino, los cuales me forjaron
como persona y especialmente como profesionista hasta la culminación de mi
licenciatura.

A la Dr. Gabriela Barcenas Morales por abrirme las puertas del laboratorio 2 de
Inmunología para la realización de este trabajo, por su tiempo, dedicación,
confianza, apoyo, paciencia y consejos recibidos en todo momento desde el punto
de vista personal y académico.

A la M. en Ciencias Paulina Cortes Acevedo por todo su tiempo, apoyo, consejos
y dedicación para enriquecer y concluir este trabajo. Muchas gracias Pau por
brindarme tu amistad, quiero que sepas que puedes contar conmigo en cualquier
momento.

A la C. a Dr. Marcela Autran Martínez por su apoyo para la culminación de este
trabajo.

Al Dr. Rainer Doffinger por apoyar siempre al equipo del Laboratorio de
Inmunología de la FESC.

Al equipo del Laboratorio de Inmunología de la FESC por su apoyo, por
compartir su conocimiento para aquellos a quienes nos gusta la ciencia.

Al jurado asignado quienes han incremento la calidad de este trabajo con sus
revisiones.

Al proyecto PIAPI, FES-Cuautitlán, UNAM, “Infección e inmunidad” con Clave
PIAPI1642 y PIAPI1811.

DEDICATORIAS
Este trabajo va dedicado a lo más bonito que Dios me ha regalado, mi Familia. Ustedes
son lo más importante que tengo, quiero que sepan que los amo mucho.

Mami, eres de las pocas personas que siempre han apostado por mí, gracias por creer y
depositar toda tu confianza, por nunca dejarme caer y siempre tener un consejo y una
palabra de aliento para mí, gracias por todo el esfuerzo que tuviste que hacer para
convertirme en lo que soy ahora, jamás me alcanzará la vida para agradecerte todo lo que
me has apoyado y todo el amor que me has dado ¡este trabajo es tuyo mami! te Amo.

Papi, me duele en el alma que no estés conmigo, pero sé que donde quiera que estés,
estás sumamente orgulloso de “Tu Clau”, gracias papi por todas las veces que me
corregías, por siempre darme ánimo para seguir adelante. No pude haber tenido a alguien
mejor para motivarme a aprender más, eres el mejor maestro y guerrero de vida que
conozco, te amo.

Karlita mi niña, gracias por tener mucha paciencia, gracias por tus consejos de niña
grande, por abrazarme y escucharme cuando lo necesitaba, sé que algún día llegarás más
lejos que yo, te amo.

Fanny, gracias por tu apoyo y consejos, por tener siempre una palabra llena de aliento y
por creer en mí, te Amo.

A mis abuelos Toñita y Abel, gracias por los consejos, guía y apoyo. Fueron una parte
importante para superarme y terminar mis estudios, jamás me alcanzará la vida para
agradecerles, los admiro mucho.

Padrinos Fernando y Violeta, gracias por ser parte fundamental a lo largo de mi carrera y
mi vida personal y por ser esa inspiración para seguir adelante. Gracias por todo el apoyo
que me han dado. Los quiero mucho.

Andrés, eres mi compañero de vida desde hace mucho tiempo, has sido parte de toda esta
etapa, me has visto caer, levantarme y crecer, gracias por el apoyo que me has dado, por
tus consejos y aliento para seguir superándome. Espero que sigamos compartiendo
muchos triunfos, así como buenos y malos momentos juntos. Te Amo amor.

Irving eres mi mejor amigo, gracias por todos los consejos que me diste cuando las cosas
se tornaban difíciles, por tu dedicación e inmensa paciencia conmigo, por no dejarme caer
y estar siempre ahí ayudándome a ser mejor persona. Eres un amigo incondicional que ha
estado conmigo no solo en los momentos buenos de mi vida y eso lo tendré grabado en lo
más profundo de mi corazón. Deseo que sigas tan presente en mi vida como lo has hecho
hasta ahorita. Vamos a llegar muy lejos, lo sé. Te quiero mucho Gordish.

Liz muchas gracias por todos tus consejos, por alentarme a seguir y nunca dejarme caer,
jamás olvidaré todas esas veces en que me apoyaste cuando sentía que no podía. Te
quiero amiga.

CONTENIDO TEMÁTICO

AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................... 3
DEDICATORIAS ................................................................................................................... 4
CONTENIDO TEMÁTICO ..................................................................................................... 5
ÍNDICE DE ESQUEMAS ..................................................................................................... VII
ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................................... VIII
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... IX
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ X
RESUMEN ........................................................................................................................... XII
1.INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1
1.1. Antecedentes .............................................................................................................. 1
1.2. Inmunodeficiencias ..................................................................................................... 2
1.2. Autoinmunidad ............................................................................................................ 3
1.4. Citocinas ..................................................................................................................... 5
1.5. Interleucina 10 humana (hIL-10) y su función reguladora ......................................... 8
1.6. IL-10 Viral (vIL-10) y su evolución con el hospedero ................................................. 9
1.7. Auto-anticuerpos contra citocinas en las enfermedades infecciosas ...................... 11
1.8. Interacción antígeno-anticuerpo ............................................................................... 14
1.9. Avidez y afinidad de los anticuerpos ........................................................................ 15
1.10. Ensayo Luminex o multianálisis ............................................................................. 17
1.11. Cromatografía de Afinidad...................................................................................... 19
2.JUSTIFICACIÓN ..............................................................................................................21
3.HIPÓTESIS ....................................................................................................................... 24
4.OBJETIVOS ..................................................................................................................... 25
5.MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 26
5.1. Muestras séricas ....................................................................................................... 26
5.2. Análisis de la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 en muestras séricas
mediante la técnica de ensayo de arreglo de microesferas en suspensión múltiple
(Luminex) ......................................................................................................................... 27
5.3. Técnica de cromatografía de afinidad por columna para la obtención de auto-
anticuerpos anti-hIL-10 presentes en muestras séricas humanas ................................. 28
5.3.1. Preparación del material .................................................................................... 29
5.3.2. Procedimiento para el acoplamiento de la proteína (citocina hIL-10) .............. 29
5.3.3. Procedimiento general para la purificación por afinidad ................................... 31
5.3.4. Lavado y almacenamiento de la columna de afinidad ...................................... 33
5.4. Ensayo de avidez para el análisis de los auto-anticuerpos anti-hIL-10 mediante la
técnica BioPlex en un sistema múltiple de microesferas ................................................ 34
5.5. Estandarización del ensayo para determinar la reactividad cruzada de los auto-
anticuerpos anti-IL-10 humana con la IL-10 viral de Cytomegalovirus (CMV) y Epstein
Barr mediante la técnica de Luminex en un sistema múltiple de microesferas ............. 36
6. RESULTADOS ................................................................................................................ 37
6.1.Determinación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 en muestras séricas humanas ...... 37
6.2 .Purificación de auto-anticuerpos anti-IL-10 en diferentes fracciones obtenidas por la
técnica de cromatografía de afinidad por columna ......................................................... 39
6.3. Análisis del índice de avidez para los auto-anticuerpos anti-hIL-10 empleando la
técnica Luminex en un sistema múltiple de microesferas .............................................. 50
6.4. Estandarización de la prueba para determinar la reactividad cruzada de los
anticuerpos contra IL-10 humana, viral de Cytomegalovirus y Epstein Barr mediante la
técnica de Luminex en un sistema múltiple de microesferas ......................................... 52
7. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 55
8. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 61
9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 62

VII

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1. Causa de inmunodeficiencias secundarias. 3
Esquema 2. Etiología de las enfermedades autoinmunes. 5
Esquema 3. Características de mecanismos de acción de las citocinas. 6
Esquema 4. Papel de las citocinas en la Inmunidad Innata y Adaptativa. 7
Esquema 5. Estructura de la hIL-10 unida al hIL-10R. 8
Esquema 6. Estructura de la hIL-10 (A), vIL-10 de (B) Epstein- Barr
virus y (C) Cytomegalovirus.
11
Esquema 7. Afinidad y avidez de anticuerpos. 16
Esquema 8. Ensayo de arreglo de micropartículas en suspensión
múltiple. 18
Esquema 9. Cromatografía de Afinidad, mecanismo general de
separación.
20

VIII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Muestras séricas positivas a la presencia de auto-
anticuerpos anti-hIL-10 con sus respectivos folios y
observaciones.
26
Tabla 2. Detección de la presencia de auto-anticuerpos
específicos contra hIL-10 en muestras séricas humanas.
37
Tabla 3. Valores promedio de IF de auto-anticuerpos
purificados anti- hIL-10 después del tratamiento utilizando una
concentración de urea 9 M y su índice de avidez.
51

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Detección de la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 en
muestras séricas positivas.
38
Figura 2. Purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 del suero
DS291272 y BSA incluido como control negativo.
40
Figura 3. Purificación de auto- anticuerpos anti-hIL-10 del suero
TB310311 (2016) y BSA incluido como control negativo.
43
Figura 4. Purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 del suero
OH200314 y BSA incluido como control negativo.
45
Figura 5. Purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 del suero
OH200315 (2028) y BSA incluido como control negativo.
48
Figura 6. Purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 del suero
AG010463 y BSA incluido como control negativo.
49
Figura 7. Mapa de calor de la reactividad cruzada entre hIL-10, vIL-10
de Cytomegalovirus y Epstein Barr mediante el uso de un sistema de
BSA como control negativo.
54

LISTA DE ABREVIATURAS

µl Microlitros
AIRE Regulador autoinmune
APS-1 Síndrome Poliendocrino autoinmune
BCRF1 Proteína 1 EN EBV que inhibe la síntesis de interferón gama.
BSA Albúmina sérica bovina (Del inglés Bovine Serum Albumine)
CD Célula dendrítica
CMV Cytomegalovirus
cmvIL-10 Interleucina 10 de Cytomegalovirus
DC Célula dendrítica
EBV Virus de Epstein Barr
ebvIL-10 Interleucina 10 de virus de Epstein Barr
ELISA Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas
GPCR Proteína heterodimérica G
hIL Interleucina humana
hIL-10R Receptor 1 de la Interleucina 10 humana
hIL-10R2 Receptor 2 de la interleucina 10 humana
HIV Virus de Inmunodeficiencia Humana
HLA Antígenos de leucocitos humanos
IDP Inmunodeficiencias primarias
IDS Inmunodeficiencias secundarias
IFN-γ Interferón gamma
IL Interleucina
JAK Jak cinasa (Del inglés Janus kinase)
KDa Kilo Dalton
LES Lupus eritematoso sistémico
M Molar
MFI Intensidad de fluorescencia media
mL Mililitros
𝑁𝑎𝐶𝑁𝐵𝐻3 Ciano borohidruro de sodio
𝑁𝑎𝐻3 Azida de sodio
NaOH Hidróxido de sodio
NK Natural Killer
Nm Nanómetros
XI

ORF Marco abierto de lectura (Del inglés open reading frame)
PBS-T
Solución amortiguadora de fosfato salino con Tween (Del inglés
Phosphate buffer saline- Twen)
Pg Pico gramos
PMT Tubo fotomultiplicador.
rpm Revoluciones por minuto
SA-PE Estreptavidina- Ficoeritrina (Streptavidin -Phyco Erytrin)
SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Humana
SNC Sistema Nervioso Central
SNP Sistema Nervioso Periférico
STAT
Transductor de la señal y activación de la transcripción (Del inglés
Signal transducers and activators of transcription)
STAT3
Transductor de la señal y activación de la transcripción 3 (Del inglés
Signal transducers and activators of transcription 3)
TGF- β Factor de crecimiento transformante beta
Th1 Célula T cooperadora perfil 1 (Del inglés T helper cell)
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa
Tris- HCI Ácido clorhídrico con tris
vIL-10 Interleucina 10 viral

XII

RESUMEN
Hoy en día se han realizado numerosos estudios donde detectan la presencia de
niveles considerables de auto-anticuerpos contra varias citocinas, interferones,
factores de crecimiento y quimiocinas en muestras séricas de pacientes. Se ha
reportado la presencia de auto-anticuerpos anti-IL-10 como una nueva causa de
inicio temprano de enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), donde se sugiere que
la deficiencia funcional de hIL-10 es debida a niveles altos de auto-anticuerpos
neutralizantes contra esta citocina. Actualmente se sabe muy poco de las razones
por las cuales se generan auto-anticuerpos anti-hIL-10, lo que se ha sugerido es la
existenciade una posible reacción cruzada entre la IL-10 humana y IL-10 viral, ya
que se ha demostrado que algunas interleucinas (hIL-10 y ebvIL-10) presentan
dominios conservados, los cuales son esenciales para su función; además la vIL-
10 induce la fosforilación del factor de transcripción STAT-3 en monocitos muy
similar a la inducida por la hIL-10.
Objetivo: Aplicar la técnica de cromatografía de afinidad por columna para
obtener la purificación de auto-anticuerpos contra la hIL-10 presentes en muestras
séricas humanas, para permitir un análisis más claro y preciso de su posible
reactividad con IL-10 virales.
Métodos. Se analizaron cinco muestras séricas para confirmar la presencia de
auto-anticuerpos anti-hIL-10, dichos auto-anticuerpos se purificaron mediante la
técnica de cromatografía de afinidad en columna, empleando el kit de acoplamiento
proteínico de micro enlace (Micro Link protein coupling kit); acoplándose a una
columna la citocina humana (hIL-10), y a otra la proteína BSA (como testigo
negativo). La detección de los auto-anticuerpos purificados en las diferentes
fracciones eluidas fue confirmada por el ensayo de Luminex. Posteriormente, con
este mismo ensayo, se determinaron los valores de índice de avidez de los auto-
anticuerpos de dos muestras utilizando la urea 9 M como agente caotrópico;
finalmente se determinó la reactividad cruzada entre hIL-10 con ebvIL-10 y cmvIL-
10, mediante el uso de anticuerpos específicos para dichas citocinas.
Resultados. El ensayo de Luminex resultó ser útil para confirmar la presencia
de auto-anticuerpos anti-hIL-10 en muestras séricas y en los eluidos obtenidos de
la purificación de estas mediante la técnica de cromatografía de afinidad en
columna. La mayoría de los auto-anticuerpos anti-hIL-10 purificados se obtuvieron
en las fracciones eluidas con un pH de 2.8 (del E-1 al E-7) a excepción de una
muestra, de la cual también se obtuvieron auto-anticuerpos contra hIL-10 en la
fracción eluida (E-8) con un pH más ácido (pH de 2.0). Así mismo, se determinaron
los valores de índice de avidez de los auto-anticuerpos purificados y de las
muestras séricas completas. Finalmente, se definió la posible reactividad cruzada
entre los anticuerpos anti-hIL-10, con anticuerpos anti-ebvIL-10 y anti-cmvIL-10,
determinando la existencia de esta reactividad únicamente entre anticuerpos anti-
hIL-10 y anti-ebvIL-10, la cual no se observó con los anti-cmvIL-10.
Conclusiones. Una vez que se realizó exitosamente la técnica de cromatografía
de afinidad en columna para la purificación de los auto-anticuerpos anti-hIL-10, fue
posible determinar los valores de los índices de avidez, los cuales resultaron ser
más confiables cuando se emplearon las preparaciones purificadas en lugar de las
muestras séricas completas; finalmente se determinó la existencia de una
reactividad cruzada por parte de anticuerpos anti-hIL-10 y anti-ebvIL-10, capaces
de reconocer a ambas citocinas.
1

1. INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes

Las enfermedades infecciosas son consideradas un grave problema de salud a
nivel mundial desde tiempos remotos. El incremento de viajes, los cambios
demográficos y la resistencia a antimicrobianos contribuye significativamente a este
fenómeno entre muchos otros factores, ocasionando que cada año miles de
personas se vean afectadas y como consecuencia la tasa de mortalidad y
morbilidad crece de manera descontrolada (Quero, 2016).
La Organización Mundial de la Salud menciona que las enfermedades
infecciosas son causadas por diferentes grupos de patógenos como las bacterias,
virus, parásitos u hongos; actualmente se conoce que además del microorganismo,
la condición del individuo puede generar predisposición a dichas enfermedades,
por ejemplo, en personas inmunosuprimidas y/o inmunocomprometidas estos
agentes patógenos provocan que dicho agente logre invadir y afectar
considerablemente al hospedero, sin dejar aún lado el papel tan importante que
juega la genética del individuo y el medio ambiente (Carratala, 2008).
A pesar del enorme avance para el control de enfermedades infecciosas tales
como las vacunas, antibióticos de nuevas generaciones y el gran desarrollo de
terapias con anticuerpos monoclonales y sueros policlonales, las enfermedades
infecciosas siguen planteando una gran amenaza para la población de todo el
mundo. Un claro ejemplo de esto es el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) que ha continuado su tendencia ascendente con más de 6,000 infecciones
por día, esto tiene una correlación importante entre individuos
inmunocomprometidos y la susceptibilidad a infecciones por microorganismos
intracelulares representando un riesgo importante (Ezequiel, 2008).
Ante este panorama el sistema inmunitario sufre un gran desequilibrio y se
generan cambios considerables, dando origen a inmunodeficiencias y
autoinmunidades, las cuales incrementan la susceptibilidad del individuo a diversas
enfermedades infecciosas.
2

1.2. Inmunodeficiencias

El término inmunodeficiencia comprende un conjunto de desórdenes causados
por alteraciones cualitativas y cuantitativas de uno o más componentes específicos
o inespecíficos del sistema inmunitario. Éstas pueden clasificarse en 2 grandes
grupos, inmunodeficiencias hereditarias, fisiológicas o primarias e
inmunodeficiencias adquiridas o secundarias (Liu, 2007).
Las inmunodeficiencias primarias (IDP) se originan por defectos genéticos
hereditarios, presentan un patrón de herencia predominante autosómico recesivo,
sin embargo, hay entidades escasas con herencia autosómica dominante. Se
suelen diagnosticar en la infancia, especialmente en el primer año de vida. Sin
embargo, hasta en un 25 % de los casos se diagnostican en la edad adulta; dichas
IDP cursan la mayoría de las veces con infecciones recurrentes y persistentes, por
microorganismos oportunistas e incluso con fenómenos autoinmunes y alergias
(Galle, 2004; Oliveira, 2011).
Por otro lado, las inmunodeficiencias secundarias (IDS) presentan causas
multifactoriales, son adquiridas e interrumpen el desarrollo y función del sistema
inmunitario del individuo al momento de montar una respuesta innata o adaptativa.
Existen múltiples condiciones que pueden afectar el funcionamiento de este
sistema (Esquema 1), por ejemplo, infecciones por diferentes patógenos, aparición
de tumores, trastornos de carácter autoinmune, alimentación, fármacos,
traumatismos, drogas, alteraciones metabólicas y agentes ambientales, entre los
más relevantes (Chinen J, Shearer WT 2010).
Recientemente, las IDS se han asociado a la presencia de auto-anticuerpos anti-
citocinas, donde niveles altos de estos auto-anticuerpos neutralizantes contra
mediadores químicos de la respuesta inmunitaria, pueden predisponer a pacientes
a una susceptibilidad a infecciones por diversos microorganismos y con ello se abre
un amplio panorama de posibles enfermedades que alteran el equilibro del
organismo (Maddur, F; Sommer, M 2010; Browne y Holland, 2010).
3

Esquema 1. Causas de inmunodeficiencias secundarias (Chinen J, Shearer W
2010).

En algunas ocasiones las IDP e IDS se complican con problemas autoinmunes
y en algunos casos con hipersensibilidades. Esto debido a la desregulación del
sistema inmune y a la activación policlonal debida a infecciones recurrentes. Las
enfermedades autoinmunes pueden ser la primera manifestación de una
inmunodeficiencia, por lo que es importante analizar la situación especialmente si
la enfermedad autoinmune es atípica; por lo tanto, identificar y conocer la diferencia
entre una inmunodeficiencia y una autoinmunidad es vital para definir un cuadro
clínico asociado a cualquiera de estas dos manifestaciones (Marinovic, 2012).
1.2. Autoinmunidad

La autoinmunidad es una respuesta inmunológica contra uno o varios antígenos
propios, para que se produzca es necesario que exista un reconocimiento
específicoprevio del sistema inmunitario a autoantígenos, este reconocimiento está
mediado por linfocitos T y B principalmente. Actualmente la autoinmunidad es
considerada como la pérdida de la tolerancia, la cual emerge cuando los
mecanismos de tolerancia central o periférica no logran eliminar o inactivar las
clonas de células autorreactivas (Bellanti, 2016; Díaz, 2017).
Esta desregulación en el sistema inmunitario genera una enfermedad
autoinmune, mediante la activación de un linfocito T 𝐶𝐷4+ efector cuando este
4

reconoce un péptido propio, para ello es preciso que se produzca una pérdida de la
tolerancia central, un fracaso de la regulación periférica, la presentación del auto
antígeno y una estimulación externa (Peakman, 2011).
Las enfermedades autoinmunes son crónicas y suelen ser progresivas,
generando en muchas ocasiones la pérdida de función fisiológica en órganos y
tejidos debido a la respuesta autoinmune contra estos; además, se desarrollan en
individuos genéticamente susceptibles y cuya expresión clínica es modificada por
ambientes permisivos y protectores. Desde el punto de vista genético, estas
enfermedades son complejas, es decir, su herencia no es mendeliana y son
poligénicas. Por ejemplo, el alelo del TNF-α es un alelo común de susceptibilidad
para enfermedades autoinmunes como Lupus Eritematoso Sistémico y el Síndrome
de Sjögren, los cuales sustentan la hipótesis de mecanismos inmunogenéticos
similares para estas enfermedades; por lo que la herencia de patologías
autoinmunes, con fenotipos diferentes puede tener un ancestro genético común
para varias de ellas (Anaya, 1999; Heward, 1997; Myerscough, 2000; Díaz, 2017).
Existen también, algunos defectos en genes individuales que conducen a la
autoinmunidad, si bien son muy poco prevalentes (Esquema 2), estos genes son
importantes en el mantenimiento de la tolerancia a lo propio y suelen heredarse de
manera autosómica dominante; por ejemplo el gen AIRE situado en el cromosoma
21, es esencial en los mecanismos de tolerancia central, donde mutaciones que
generan pérdida de la función en este gen provocan el Síndrome poliendocrino
autoinmune tipo 1 (APS-1), haciendo que exista una baja expresión de antígenos
propios en el timo y se presente una selección negativa defectuosa de células T
autorreactivas. Además, los factores ambientales que se muestran en el esquema
2, como el tabaco, alcohol, contaminación, sustancias tóxicas, entre otras. también
pueden estar involucrados con la aparición de condiciones autoinmunes (Chinen J,
Shearer WT, 2010).
Además de estos factores, se ha identificado que, en pacientes diabéticos
caucásicos con un cuadro clínico autoinmune, estos presentan una evolución
propia de la diabetes tipo 1 A con un 100 % respecto a diabéticos no caucásicos
quienes presentan una tendencia minoritaria a diabetes tipo 1 A. Esto quiere decir
que, la raza podría predisponer al organismo a desarrollar ciertas enfermedades
autoinmunes que junto a factores ambientales, metabólicos y alimentarios hacen
que la condición del individuo sea devastadora (Díaz, 2017).
5

Esquema 2. Etiología de las enfermedades autoinmunes. (A) Modelo mendeliano
simple, la relación entre la variante genética causal (genotipo) y el estado de enfermedad
es determinista. (B) En el modelo de rasgos complejos, la enfermedad clínicamente
reconocida es el resultado de interacciones entre los múltiples genotipos y el ambiente
(Díaz, 2017).

1.4. Citocinas

Las citocinas son polipéptidos o glicoproteínas extracelulares, hidrosolubles que
varían entre 8 y 30 kDa. Se generan por medio de diversos tipos de células en la
región de la lesión y por células del sistema inmunitario a través de la activación de
proteínas cinasas. Así mismo las citocinas, así mismo pueden actuar sobre muchos
objetivos celulares diferentes (Esquema 3) mediante mecanismos paracrinos (en
células vecinas), autocrinos (en las propias células productoras) y en algunas
ocasiones, con una acción endocrina, uniéndose a células distantes (Oliveira, 2011;
Vinken, 2016).
6

Esquema 3. Características de mecanismo de acción de las citocinas (Vinken,
2016)

Las citocinas juegan un papel crítico en el montaje de las respuestas
antimicrobianas, regulan el sistema inmune innato y adaptativo, polarizan las
respuestas de células T y actúan como moléculas efectoras; estas moléculas
estimulan a su célula blanco mediante receptores específicos de membrana
activando mensajeros intracelulares que regulan la transcripción génica y por ende
secretan más citocinas para aumentar (citocinas proinflamatorias) o atenuar
(citocinas antiinflamatorias) la respuesta inmune (Esquema 4). Algunas de las
citocinas proinflamatorias se encuentran la IL (interleucina) 1, 6 y TNF (factor de
necrosis tumoral); por otro lado, las consideradas antiinflamatorias se conocen a IL-
4, IL-10, IL-13 y TGF- β (factor de crecimiento transformante β). Además, las
citocinas se caracterizan por su redundancia (varias citocinas distintas comparten
funciones similares) y su pleiotropía, es decir, actúan sobre muchos tipos celulares
7

diferentes y una célula puede expresar receptores para más de una citocina
(Maddur,F; Sommer, M, 2010).

Esquema 4. Papel de las citocinas en la Inmunidad Innata y Adaptativa (Toche,
2012).

Otra característica importante es su capacidad para ayudar a reparar lesiones y
conservar la salud, ya que sus señales mantienen la homeostasis entre funciones
diferentes. Sin embargo, en otros casos esas mismas moléculas pueden provocar
reacciones perjudiciales de hipersensibilidad en los tejidos, particularmente en el
sistema nervioso, la piel y el aparato respiratorio (García, 2005).
Como se mencionó anteriormente, para que todos estos mecanismos implicados
con la funcionalidad de las citocinas se lleven a cabo requieren de receptores
específicos de membrana, estos receptores de citocinas son receptores del dominio
transmembrana acoplados a la proteína G, similares a los utilizados por una amplia
gama de agonistas incluyendo el aparato cardiovascular (receptores β-
adrenérgicos) y el sistema nervioso central (SNC) (Camarillo, 2011).

1.5. Interleucina 10 humana (hIL-10) y su función reguladora

La hIL-10 es sintetizada por células del sistema inmunitario (linfocitos T y B)
además de monocitos, macrófagos, células dendríticas y mastocitos de aparatos
como endocrino y neural. Esta citocina actúa sobre las células presentadoras de
antígeno mediante la inhibición de la síntesis de citocinas, moléculas co-
estimuladoras y moléculas HLA clase II, es decir, suprime la respuesta inmunitaria
inmune bloqueando la síntesis de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, IL-1, IL-6,
IFN-γ y TNF-α en células T, monocitos y macrófagos e inhibiendo la expresión de
moléculas de superficie celular implicadas en la presentación y co-estimulación del
antígeno. Además de sus propiedades inmunosupresoras, la hIL-10 también es un
potente factor de crecimiento y diferenciación para timocitos, mastocitos y células B
(Jones, 2002; Oliveira, 2011; Camarillo, 2011).
Como todas las citocinas, las respuestas celulares de la hIL-10 dependen de las
interacciones con sus receptores de superficie, para el caso de la hIL-10 es el hIL-
10R (Esquema 5). El receptor de hIL-10 (hIL-10R) consiste en dos subunidades
diferentes (hIL-10R1 e hIL-10R2). La hIL-10 se une primero a hIL-10R1 con alta
afinidad y el complejo hIL-10 / hIL-10R1 se une después con una afinidad más baja
al hIL-10R2; este complejo de señalización activo resultante induce la ruta de
transducción de señales JAK / STAT (Brooks, 2006; Josephson et al 2001).

Esquema 5. Estructura de la hIL-10 unida al hIL-10R (Slobedman, 2009)
En el contexto de la patogénesis viral, se ha documentado que las infecciones
virales regulan positivamente laexpresión de hIL-10, por ejemplo, en algunos casos,
se ha demostrado que esta regulación positiva mejora la eliminación del virus al
9

exacerbar la respuesta que se genera contra dicho agente, lo que sugiere que
alcanzar los efectos de esta citocina tiene muchas ventajas para eliminar patógenos,
generando como consecuencia la mejora del hospedero (Slobedman, 2009; Bijjiga,
2013).

1.6. IL-10 Viral (vIL-10) y su evolución con el hospedero

Durante millones de años, los virus han evolucionado con sus hospederos
desarrollando estrategias para desregular la respuesta inmunitaria del individuo con
el fin de evitar la inmunovigilancia y su eliminación (Brodeur, 2010).
Gracias a los enormes avances científicos sobre el estudio de los diferentes
efectos que generan los virus en un organismo, se observa que existen una gran
variedad de moléculas que desencadenan mecanismos de regulación o
desregulación; además se ha podido demostrar la existencia de otras moléculas
que son sintetizadas por virus y que tienen la particularidad de ser muy similares a
las producidas por los humanos, tal es el caso de la hIL-10 (Winthrop, et al 2009).
Se ha demostrado que muchos virus estimulan la producción de hIL-10,
incluyendo virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de hepatitis C y virus de
hepatitis B, mientras que otros como Herpesvirus y Poxvirus codifican sus propios
ortólogos virales de IL-10 (vIL-10) (Brooks, 2006).
La capacidad de generar sus propios ortólogos virales de la IL-10 se ha
demostrado utilizando clonación y secuenciación de la IL-10 humana y de ratón,
que condujeron a la identificación del primer ortólogo vIL-10. Se descubrió que el
ORF BCRF1 no caracterizado de Epstein-Barr virus (EBV, Herpesvirus humano 4)
codificaba una proteína que exhibía una alta identidad de secuencia (83 %) con IL-
10 humana. Después, varios estudios documentaron que esta proteína poseía
algunas de las actividades biológicas específicas de hIL-10, por lo tanto, se
concluyó que BCRF1 codificaba un ortólogo viral funcional de IL-10 humana.
Después de esto, la secuenciación de un número creciente de genomas virales ha
revelado una lista creciente de vIL-10; hasta la fecha, se han informado ortólogos
vIL-10 para 12 miembros de la familia Herpesviridae, dos miembros de la familia
Alloherpesviridae y siete miembros de la familia Poxviridae (Ouyang, 2014;
Josephson et al, 2001).
10

Otro virus que tienen esta capacidad es Cytomegalovirus, del cual la primera
identificación de un homólogo de IL-10 (cmvIL-10) expresada por este virus fue
reportada casi simultáneamente por dos grupos separados. Uno de estos grupos
fue el de Barry y el otro fue dirigido por Pestka, quienes aislaron DNAc de la región
UL111A de CMV en células infectadas, Barry infectó células MRC-5 y Pestka HEL
299; al aislarlas y caracterizarlas revelaron la presencia de una transcripción
generada a partir de tres exones y dos intrones que se predijo que codificaba una
proteína de 175 aminoácidos con homología a la hIL-10 (Josephson et al, 2001;
Pestka et al, 2004; Barry et al, 2009).
La hIL-10, ebvIL-10 y cmvIL-10 forman un homodímero que se une a dos
subunidades del hIL-10R1, en contraste con las dos primeras, el homodímero de
cmvIL-10 está unido a través de un enlace disulfuro formado entre dos residuos de
cisteína haciendo que estos enlaces sean mucho más fuertes y por lo tanto la unión
sea más estable. De igual manera estos residuos de cisteína se ven reflejados en
los ángulos que se forman en el dominio superior de la cmvIL-10, ebvIL-10 y la hIL-
10 (Esquema 6), en donde este ángulo es mucho mayor en la cmvIL-10 a diferencia
de las otras dos. A pesar de que aún no se comprueba que relevancia tiene esta
diferencia entre ángulos de las tres moléculas si se ha demostrado que la cmvIL-
10 tiene mayor afinidad por el IL-10R1, seguido de la ebvIL-10 y por último la hIL-
10 (Josephson; etal, 2001; Pestka et al, 2004).

Esquema 6. Estructura de la hIL-10 (A), vIL-10 de (B) Epstein Barr virus y (C)
Cytomegalovirus (Josephson, 2001).

1.7. Auto-anticuerpos contra citocinas en las enfermedades infecciosas

Actualmente, un proceso autoinmune y una inmunodeficiencia pueden coexistir
en el mismo individuo, en el caso de algunas inmunodeficiencias en las que
predomina una deficiencia de anticuerpos generalmente se asocia a procesos
autoinmunes. Estas dos condiciones están frecuentemente relacionadas ya que
presentan un carácter bidireccional, pues una enfermedad autoinmune puede ser
causa de una inmunodeficiencia y viceversa; así mismo, ambas condiciones hacen
susceptible a un individuo a padecer enfermedades infecciosas recurrentes.
Ejemplo de ello, es el desarrollo de auto-anticuerpos contra citocinas, lo cual
recientemente se ha catalogado como una IDS que podría predisponer a una
susceptibilidad a enfermedades infecciosas; sin embargo, el mecanismo
subyacente al desarrollo de auto-anticuerpos sigue sin estar claro a pesar del
creciente reconocimiento de su impacto clínico (Dinarello, 2003; Winthrop et al
2009; Marodi, 2009; Doffinger, 2004; Hofflich, 2004; Maddur, F; Sommer, M , 2010).
12

En el año 2004 Hoflich y colaboradores reportaron un caso de un paciente adulto
previamente sano que presentó lesiones graves causadas por Burkholderia
cocovenenan y como consecuencia infección con Mycobacterium cheloneae, en
este paciente se identificaron auto-anticuerpos anti-IFN-γ neutralizantes de alta
afinidad. En el mismo año se evaluó a un paciente con una infección diseminada
por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium chelonae, el cual desarrolló
diabetes autoinmune (tipo I) e hipotiroidismo primario, el suero de dicho paciente
contenía títulos altos de auto-anticuerpos anti-IFN- capaces de bloquear la
respuesta de esta citocina in vitro por células mononucleares de sangre periférica
de donantes normales. Ambos estudios sugirieron que los auto-anticuerpos anti-
IFN− pueden inducir susceptibilidad a infecciones micobacterianas diseminadas,
que puede ser refractaria a la quimioterapia (Doffinger, R; Matthew, R; Hofflich,
2004).
El IFN-gamma (IFN-) es una citocina clave en la defensa intracelular del
hospedero, es producida principalmente por células TH1 y asesinas naturales (NK)
en respuesta a varias activaciones empleando la coestimulación mediada por IL-
12/23; el IFN- actúa sobre los macrófagos y otras células en las cuales induce la
destrucción intracelular de patógenos fagocitados. Además de los trabajos
mencionados en el párrafo anterior, existen distintos estudios que reportan altos
títulos de auto-anticuerpos contra IFN- que se encuentran asociados a
enfermedades micobacterianas de inicio tardío, a menudo acompañadas con más
infecciones oportunistas, éstos auto-anticuerpos neutralizan al IFN- en cultivo de
sangre completa, inhiben la fosforilación de STAT-1 dependiente de IFN-, la
producción de TNF- e IL-12 por PBMC y macrófagos, e inhiben la expresión de
HLA-DR en los monocitos normales. Las características clínicas de los pacientes
con IgG anti-IFN- son análogas a aquellos con defectos genéticos en la vía IFN-
/IL-12, que se caracteriza por una infección diseminada por micobacterias de baja
virulencia, indicando que IgG anti-IFN- induce un estado de inmunodeficiencia
adquirida y predispone a las infecciones por micobacterias (Doffinger 2004; Hoflich
2004; Kampmann 2005; Patel 2005; Tanaka 2007; Koya 2009; Baerlecken 2009;
Browne et al 2012; Chinnen et al 2010).
La IL-6 es una citocina pleiotrópica, la cual es rápidamente producida en
respuesta a daño tisular e infecciones y juega un papel importante en la inmunidad
13

innata y adaptativa. En 2014, se reportó en un niño altos niveles de auto-
anticuerpos anti-IL-6, donde el curso de los acontecimientos clínicos en el paciente
fue sugestivo de una aparición deauto-anticuerpos anti-IL-6 que precedió a la
infección por Staphylococcus. Así mismo, otros dos pacientes con altos títulos de
auto-anticuerpos neutralizantes contra la IL-6 han sido reportados hasta la fecha.
Estos anticuerpos se presentan acompañados de infecciones bacterianas severas,
incluyendo Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius y Escherichia coli
(Puel et al, 2008; Browne, 2012).
Las citocinas IL-17 están implicadas en la protección contra las infecciones por
hongos, como Candida en las superficies mucosas, por lo tanto, los auto-
anticuerpos neutralizantes a las citocinas Th17 predisponen a las infecciones
fúngicas. Los auto-anticuerpos neutralizantes dirigidos contra citocinas IL-17A, IL-
17F e IL-22, se han reportado en la candidiasis mucocutánea crónica (CMC) y en
pacientes con el síndrome-1 poliendocrinopatía autoinmune (APS-1) o timoma
(Kisand 2010; Puel 2010; Dubin 2008; Conti 2009; Lin 2009).
Por otro lado, pacientes que sufren de proteinosis alveolar pulmonar (PAP)
presentan auto-anticuerpos neutralizantes contra el factor estimulante de colonias-
granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y muestran una alta mortalidad debido a la
infección, los autores confirman la relación causal entre el funcionamiento
defectuoso de GM-CSF, los auto-anticuerpos y PAP (Kitamura 1999; Picard et al
2002).
La IL-10 es sintetizada por células inmunológicas, tejidos neuroendocrinos y
neurales. La producción de IL-10 se ve inhibida por varias citocinas, como la IL-4,
IL-13 e IFN-γ, para su autorregulación. La IL-10 actúa sobre las células
presentadoras de antígeno mediante la inhibición de la síntesis de citocinas,
moléculas co-estimuladoras y moléculas HLA clase II. Así mismo, la IL-10 regula la
proliferación y diferenciación de las células T, destacando en particular su
capacidad para inhibir citocinas proinflamatorias, aumentar proliferación de
mastocitos e impedir la producción de IFN-γ; esta citocina tiene una función
pleiotrópica, ya que inhibe de manera general mecanismos inmunológicos.
Recientemente, se ha reportado la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 como
una nueva causa de inicio muy temprano de enfermedad inflamatoria intestinal
(IBD), donde se sugiere que la deficiencia funcional de IL-10 es debida a un alto
título de auto-anticuerpos neutralizantes contra hIL-10; así mismo, la identificación
14

de estos auto-anticuerpos se ha propuesto como un nuevo mecanismo patogénico
para IBD, lo cual ha permitido realizar una terapia inmunológica dirigida que
prevenga la inmunosupresión a largo plazo y la resolución, más que el control del
proceso inflamatorio (Oliveira et al., 2011).
Se sabe muy poco de las razones por las cuales se generan auto-anticuerpos
anti-hIL-10, lo que se ha sugerido es la existencia de una estimulación cruzada
entre la IL-10 viral y la IL-10 humana, ya que se ha demostrado que ambas
interleucinas (hIL-10 y vIL-10) presentan dominios conservados, los cuales son
esenciales para su función; además la vIL-10 induce la fosforilación del factor de
transcripción STAT3 en monocitos muy similar a la inducida por la hIL-10
(Ouyang,2014; Brodeur, 2010).
Por otro lado, existen pruebas fehacientes que anticuerpos anti-hIL-10 pueden
reconocer y neutralizar tanto la hIL-10 como la IL-10 de Epstein Barr virus (ebvIL-
10), pero estos anticuerpos no detectan la IL-10 de Cytomegalovirus (cmvIL-10), ni
neutralizan su actividad biológica. Por ello, ante la gran evolución que tienen los
virus para lograr evadir respuestas del sistema inmunitario se requieren estudios
que revelen más a detalle el poder que tienen para poder inducir la transcripción de
moléculas que cada vez más se asemejan a moléculas de su hospedero (Brodeur,
2010; Ouyang, 2014).

1.8. Interacción antígeno-anticuerpo

Los anticuerpos son moléculas que reconocen epítopos en los antígenos. Por lo
general cuanto mejor es la correspondencia o interacción existente entre el
anticuerpo y el antígeno con el epítopo, más favorables son las interacciones que
se forman entre ellos, haciendo que la afinidad entre ambos sea mayor (Roitt,
2008).
Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no
por uniones covalentes. La asociación específica del antígeno y el anticuerpo es
dependiente de los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas, fuerzas
electrostáticas y las fuerzas de Van Der Waals; por lo general solo son efectivas en
distancias cortas. Todos estos son uniones débiles no covalentes, aunque algunas
de las asociaciones entre antígeno y anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al
15

igual que los anticuerpos, los antígenos pueden ser multivalentes, ambos a través
de múltiples copias del mismo epítopo, o a través de la presencia de múltiples
epítopos que son reconocidos por múltiples anticuerpos. Las interacciones que
involucran multivalencias pueden producir mayor estabilidad a los complejos, sin
embargo, la multivalencia puede también resultar en dificultades estéricas, por lo
tanto, reduciendo la posibilidad de unión entre los diferentes epítopos presentes en
un antígeno y las moléculas de anticuerpos específicos a éstos (Stock, 2007; Roitt,
2008; Winthrop et al 2009).

1.9. Avidez y afinidad de los anticuerpos

La afinidad de un anticuerpo es la fuerza de la reacción entre un único
determinante antigénico y un único sitio de combinación del anticuerpo, siendo el
resultado de la suma de las fuerzas atractivas y repulsivas que operan entre un
determinante antigénico y el sitio de combinación de este. Por otro lado, la avidez
indica la fuerza total de la interacción entre anticuerpos multivalentes y un antígeno
con varios determinantes antigénicos. La avidez es más que la suma de las
afinidades individuales. Los conceptos tanto de afinidad como de avidez se ilustran
en el Esquema 7 (Mayer, 2010; Voet,2009).
Por ejemplo, si un anticuerpo de la clase IgG y uno de la clase IgM tuvieran la
misma afinidad por un antígeno (igual energía de enlace), sin embargo, por razones
relacionadas con la estructura, la avidez de ambos es obligadamente diferente. Los
anticuerpos IgM tienen una estructura polimérica y por tanto un mayor número de
sitios de combinación, por lo tanto, será mayor su avidez que los de la clase IgG
aun cuando ambos estén dirigidos contra el mismo determinante antigénico (Voet,
2009).
Reafirmando, afinidad se refiere a la fuerza de unión entre un único determinante
antigénico y un sitio de combinación de un anticuerpo, mientras que la avidez se
refiere a la fuerza unión total de un anticuerpo con la unión a su antígeno
multivalente (Rojas, 2006; Mayer, 2010).
Por otra parte, los agentes caotrópicos son iones o moléculas orgánicas
pequeñas que aumentan la solubilidad de las sustancias no polares en agua. Su
16

eficiencia como desnaturalizantes radica en su habilidad de romper interacciones
hidrófobas, aunque su mecanismo de acción no se comprende bien (Rojas, 2006).
Los agentes caotrópicos como la urea en concentraciones de 5 a 10 M, son los
desnaturalizantes de proteínas más usados. Para la estimación de la avidez, se
utiliza un agente para interrumpir los puentes de hidrógeno, como la urea, que
llevará que estas proteínas con baja avidez se disocien, mientras que las que
poseen avidez alta permanecen unidos al antígeno (Voet, 2009; Syed-Hussain,
2014).

Alta atracción - baja repulsión. Alta repulsión - baja atracción.
B

Esquema 7. Afinidad y avidez de anticuerpos. (A) La afinidad de los anticuerpos se
define como la suma de las fuerzas de atracción y repulsión. (B) Avidez es la suma de las
afinidades individuales (Mayer, 2010).
17

1.10. Ensayo Luminex o multianálisis

El ensayo Luminex, es un sistema basado en citometría de flujo, que utiliza
microesferas de poliestireno con un diámetro de 5.6 micras como soportesólido
para un inmunoensayo convencional; las microesferas son clasificadas en regiones
las cuales presentan un código de color específico que permite la discriminación e
identificación de ensayos individuales, éste código es establecido mediante 2
colorantes fluorescentes diferentes que se presentan en proporciones que varían
de acuerdo a cada región de microesfera. Actualmente se estima que hasta 100
parámetros individuales pueden ser medidos simultáneamente en una sola etapa
del ensayo siendo ésta una de las principales ventajas que tiene sobre muchos
otros ensayos (Araujo, 2011, Voet, 2006).
Cada región de microesfera utilizada puede ser conjugada con una molécula
diferente; por lo que éstas pueden ser mezcladas y depositadas en un pozo de
microplaca de fondo con filtro, para ser incubadas con la muestra y permitir las
reacciones antígeno-anticuerpo específicas. Las microesferas se detectan
utilizando un flujo de dos láseres del citómetro, un láser excita los colorantes
internos que identifican la región de cada microesfera y el segundo láser excita el
colorante informador capturado durante el ensayo (Araujo, 2011).
La sensibilidad de este método es comparable a un ELISA convencional, pero
permite investigaciones complejas usando pequeñas alícuotas de reactivos para
realizar el ensayo; de igual forma existe una gran flexibilidad para realizar una serie
de variaciones en el análisis serológico (Castañeda; etal, 2017).
De manera estandarizada el ensayo implica que cada analito (citocina) es
acoplado covalentemente a microesferas con una región en particular.
Posteriormente, se añade la muestra problema para la unión de los anticuerpos
específicos al analito y finalmente se agrega un anticuerpo anti-inmunoglobulina
especie específico, el cual puede estar conjugado con un fluorocromo (PE,
ficoeritrina) o con biotina, para este último caso es necesario utilizar la
estreptavidina-ficoeritrina como molécula indicadora (Esquema 8, Panel A).
Después de la incubación se realiza la lectura del sistema empleando el lector de
Bio-Plex, donde los fluidos de precisión alinean las microesferas a través de una
18

celda de flujo donde dos láseres las excitan individualmente, el láser de clasificación
rojo excita los colorantes en cada microesfera, para su identificación específica,
mientras que el láser verde excita la molécula indicadora asociada con la
microesfera, lo que permite la cuantificación del analito capturado. El sistema emite
señales fluorescentes simultáneamente para cada microesfera, traduciendo las
señales en datos (valores promedio de intensidad de fluorescencia) de cada
muestra para todos los parámetros medidos (analitos) (Esquema 8, Panel B)
(Araujo, 2011; Castañeda, et al 2017).

Esquema 8. Ensayo de arreglo de micropartículas en suspensión múltiple
(Luminex): Panel A Inmunoensayo indirecto para la detección de auto-anticuerpos contra
los diferentes mediadores químicos (Tomado de Araujo, 2011). Panel B Microesferas
codificadas ópticamente utilizando una mezcla de diferentes colorantes que son
decodificados por un citómetro de flujo (Tomado de www.Luminexcorp.com).

http://www.luminexcorp.com/
19

1.11. Cromatografía de Afinidad

La cromatografía de afinidad por columna es una técnica con una aplicación muy
amplia, es usada en el aislamiento y purificación de anticuerpos o antígenos. En
ella, el antígeno o el anticuerpo son unidos a través de sus grupos aminos libres a
partículas de agarosa activadas con bromuro de cianógeno que escinde enlaces
peptídicos en el lado carboxílico de residuos de metionina (Sweden, 2002).
La unión que se genera es altamente específica y se realiza sobre una matriz
inerte y porosa, cuando se coloca la muestra a través de este material
cromatográfico la proteína de interés se une al ligando inmovilizado y las otras
sustancias se eliminan de la columna por arrastre del líquido de lavado (Esquema
9). La proteína se obtiene purificada en gran medida mediante un cambio en las
condiciones de elución (pH) que hacen que se libere de la matriz cromatográfica
(Voet, 2006; Castaños, 2015; Sweden, 2002).
Además de las características mencionadas (químicamente inerte y porosa) la
matriz debe poseer un número elevado de grupos funcionales capaces de formar
uniones covalentes con los ligandos, esta unión posee la fuerza necesaria para
evitar eliminar a la proteína evitando que sea inmovilizada para poder ser removida
posteriormente. Entre los pocos materiales que cumplen con estos requisitos, la
agarosa (posee grupos hidroxilo libres) es la más utilizada (Voet, 2006; Castaños,
2015).
Cuando la proteína se unió a la resina y se eliminaron las impurezas por lavado,
ésta debe liberarse de la columna. Una de las formas de hacerlo es eluir la columna
con una solución de un compuesto que tiene más afinidad por el sitio de unión de
la proteína que el ligando unido. Otra forma en que se pueden alterar las
condiciones de la columna y eliminar fácilmente la proteína de interés es mediante
un cambio de pH, fuerza iónica o temperatura. Sin embargo, se debe tener cuidado
de que las condiciones de la solución no produzcan un daño irreversible a la
proteína (Voet,2006; Gimeno, 2017).

Esquema 9. Cromatografía de Afinidad, mecanismo general de separación
(Castaños 2015).

2. JUSTIFICACIÓN
La reciente incidencia de las inmunodeficiencias secundarias causadas por altos
niveles de auto-anticuerpos contra algunos mediadores químicos de la respuesta
inmunitaria, como son las citocinas, podrían estar afectando las funciones celulares
y por ende la eliminación de los patógenos, donde finalmente predispone al
hospedero a enfermedades infecciosas producidas por hongos, bacterias, virus o
cualquier microorganismo oportunista (Doffinger et al., 2004; Hoflich et al., 2004;
Kampmann et al., 2005; Patel et al., 2005; Puel et al., 2008; Dubin 2008; Maddur,
F; Sommer, M 2010, Browne y Holland, 2010).
Debido a esto, Beerli y colaboradores utilizaron células de mamífero para aislar
auto-anticuerpos específicos contra IL-17A provenientes de un paciente con
timoma, dicho análisis identificó tres clonotipos distintos capaces de neutralizar
eficazmente a la IL-17A; al probar las potencias de cada uno de ellos y compararlas
con otros anticuerpos comerciales, encontraron que estos eran muy parecidos en
cuanto a su actividad neutralizante hacia la citocina; abriendo un panorama en el
desarrollo de tratamientos para diversos trastornos inflamatorios obteniendo auto-
anticuerpos contra citocinas con alto potencial terapéutico (Beerli, at al, 2014).
Así mismo, resulta interesante llevar a cabo una mejor caracterización de estos
auto-anticuerpos anti-citocinas analizando in vitro la capacidad neutralizante de
estos sobre su actividad biológica (producción de citocinas, fosforilación de factores
de transcripción, entre otro), según la molécula blanco de cada auto-anticuerpo
considerando los trabajos que analizan las inmunodeficiencias secundarias
originadas por la presencia de auto-anticuerpos contra citocinas, donde sugieren
que altos niveles de éstos pueden exacerbar las enfermedades infecciosas en
curso o predisponer al individuo a infecciones que podrían resultar fatales. Siendo
importante considerar que estudios enfocados al análisis de auto-anticuerpos con
actividad neutralizante contra citocinas en pacientes con infecciones, pueden
generar conocimientos básicos que aporten una visión interesante hacia un enlace
desconocido entre la respuesta autoinmune y la predisposición a enfermedades
infecciosas y/o autoinmunes o ambas. Y finalmente, la detección de estos auto-
anticuerpos podría considerarse como un marcador de gran utilidad para propósitos
22

de diagnóstico, que permitan decidir una terapia y un tratamiento adecuados para
cada paciente en particular.Resultando de suma importancia disponer de técnicas, como es la cromatografía
de afinidad en columna, que logren la purificación adecuada de auto-anticuerpos
específicos para la citocina blanco, permitiendo en futuros estudios realizar el
análisis in vitro de la función neutralizante de los auto-anticuerpos sobre la actividad
biológica de ciertas citocinas; involucrando ensayos con estimulación y detección
de la producción de citocinas inducidas o suprimidas según la especificidad de cada
auto-anticuerpo, así como pruebas para llevar a cabo la determinación de la función
biológica de los auto-anticuerpos purificados contra ciertos mediadores químicos
de la respuesta inmunitaria (IFN-, IL-6 y IL-10), donde se podría analizar la
inhibición de la fosforilación de STAT-1 y STAT-3 regulada por estas citocinas.
Entre otros, ensayos donde sería de gran utilidad disponer de preparaciones
purificadas de los auto-anticuerpos contra citocinas es en la determinación del
grado de avidez de éstos y la identificación de los epítopos reconocidos por estos
auto-anticuerpos.
En forma particular, no existen reportes respecto a la función y caracterización
detallada de auto-anticuerpos contra hIL-10 presentes en muestras séricas de
individuos con predisposición a infecciones virales y/o autoinmunes.
Ante este panorama y considerando la importancia que tienen los auto-
anticuerpos anti-hIL-10 en el desarrollo y regulación de la respuesta inmunológica,
resulta de gran relevancia realizar estudios utilizando auto-anticuerpos contra hIL-
10 purificados. La técnica de cromatografía de afinidad por columna ha sido
empleada para lograr la purificación de auto-anticuerpos contra citocinas, por lo
tanto, en el presente trabajo se realizó la purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-
10 mediante dicha técnica. La técnica de un sistema múltiple de microesferas
Luminex, basado en citometría de flujo, se utilizó para la detección de auto-
anticuerpos anti-hIL-10 presentes en las muestras séricas originales (precolumna),
en las muestras postcolumna y en las diferentes fracciones obtenidas durante el
proceso de purificación.
Por otra parte, debido a que ciertos homólogos virales a la hIL-10 poseen cierta
afinidad hacia el receptor 1 de esta citocina y considerando que los auto-
anticuerpos anti-hIL-10 se encuentran presentes en pacientes con infecciones
atípicas provocadas específicamente por Cytomegalovirus y Epstein Barr virus, se
23

sugiere que se podría presentar una correlación entre la presencia de estos auto-
anticuerpos y su función en la respuesta frente a agentes infecciosos de tipo viral.
Por ello, la determinación de una posible reactividad entre la hIL-10 y estos
homólogos virales resulta de suma importancia para poder entender el mecanismo
que utilizan estos virus para evadir la respuesta inmune en el organismo y entender
aún más el papel regulador que tiene esta citocina (hIL-10) ante una infección de
tipo viral (Cheung, 2009; Ding, 2000, Slobedman, 2009; Kotenko et al. 2000; Moore
et al, 1990; Jones et al, 2002).

3. HIPÓTESIS

La técnica de cromatografía de afinidad por columna permite la purificación de
auto-anticuerpos anti-IL-10 humana, presentes en muestras séricas de pacientes
con enfermedades infecciosas recurrentes y/o autoinmunes. Así mismo, existe una
reactividad entre los anticuerpos específicos contra la IL-10 humana, la viral de
Cytomegalovirus y Epstein Barr virus.

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general
 Aplicar la técnica de cromatografía de afinidad por columna para obtener
la purificación de auto-anticuerpos contra la hIL-10 presentes en muestras
séricas humanas, para permitir un análisis más claro y preciso los índices
de avidez. Además determinar la posible reactividad entre los anticuerpos
específicos contra la IL-10 humana, la viral de Cytomegalovirus y Epstein
Barr virus.
4.2. Objetivos específicos
 Llevar a cabo la técnica de multianálisis con microesferas en suspensión
múltiple (Luminex) basado en citometría de flujo, para corroborar la
presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 a partir de muestras séricas
humanas provenientes de pacientes con enfermedades infecciosas
recurrentes y/o autoinmunes
 Emplear la técnica de cromatografía de afinidad por columna para realizar
la purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 a partir de muestras séricas
humanas.
 Identificar las fracciones eluidas que contengan los auto-anticuerpos
contra hIL-10 específicos purificados, mediante la técnica de Luminex.
 Emplear el agente caotrópico como la Urea (9 M) en la técnica de
Luminex, para determinar el índice de avidez de auto-anticuerpos anti-
hIL-10 purificados.
 Analizar la probable reactividad entre los anticuerpos específicos contra
la IL-10 humana la IL-10 viral de CMV y Epstein Barr virus.

5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Muestras séricas
La colección de sueros humanos empleada en este estudio fue donada por el
Dr. R. Döffinger (Department of Clinical Biochemistry and Immunology,
Addenbrooke's Hospital, Cambridge, U.K.). Todos los sueros se distribuyeron en
alícuotas de 20 μl y se conservaron a -20 °C.
Las muestras séricas positivas a la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10
provenían de pacientes con las características clínicas pertenecientes a
susceptibilidad selectiva de inicio tardío a infecciones atípicas o recurrentes
causadas por bacterias, virus y hongos; así como de pacientes con enfermedades
autoinmunes, dichas muestras séricas junto con su valor promedio de Intensidad
de Fluorescencia fueron enlistadas en la Tabla 1.

FOLIO OBSERVACIONES
OH 200315 (2028)
Las muestras séricas son provenientes de
pacientes con inmunodeficiencias severas, sepsis
o enfermedad inflamatoria intestinal recurrente.
.
DS 291272
OH 200314 (2027)
TB 310311 (2016)
AG 010493 (2663)
Tabla 1. Muestras séricas positivas a la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 con
sus respectivos folios y observaciones. Dichas muestras fueron proporcionadas por el Dr.
R. Döffinger (Department of Clinical Biochemistry and Immunology, Addenbrooke´s Hospital,
Cambridge, U.K.).
27

5.2. Análisis de la presencia de auto-anticuerpos anti-hIL-10 en muestras
séricas mediante la técnica de ensayo de arreglo de microesferas en
suspensión múltiple (Luminex)

1. Las microplacas de 96 pozos con filtro-BV de 1.2 m el tamaño del poro,
(Millipore, Núm. Cat. MSBVN1210) se humedecieron agregando 150 L por pozo
de PBS-T, después de 1 a 2 minutos el líquido fue removido empleando un sistema
de vacío.
2. La suspensión de trabajo de las microesferas con la citocina de interés (rhIL-10)
acoplada se preparó a partir de las alícuotas almacenadas a -70 °C, (incluyendo
como control negativo a las microesferas con la BSA; los 20 l de cada alícuota
fueron diluidos en el volumen necesario de solución amortiguadora pre-
bloqueadora para disponer de 5 mL volumen final.
3. Posteriormente 50 L de la suspensión de trabajo de las microesferas acopladas
(previamente agitadas en el vórtex) se agregaron a cada pozo, y el líquido fue
removido por medio de filtración a vacío.
4. A continuación, en los pozos correspondientes se depositaron 50 L/pozo de
cada una de las muestras séricas problemas diluidas 1/100, del anticuerpo anti-IL-
10 específico biotinilado diluido 1/100 (Human IL-10 Biotynilated Antibody, R&D
Systems, No. Cat. BAF 217, Lot Number JW2015081) o del diluente (control
negativo), empleando la solución bloqueadora como diluente; posteriormente las
microplacas fueron incubadas por 90 min, con agitación lenta (1 000 g) en un
agitador orbital a temperatura ambiente.
5. El líquido de cada pozo fue removido empleando el sistema de vacío y se llevó a
cabo una serie de tres lavados con 200 L de PBS-T.
6. Posteriormentea los pozos donde se llevó a cabo la incubación con las muestras
séricas problemas se les agregó 50 L/pozo del anticuerpo secundario anti-IgG
humano acoplado a ficoeritrina (PE) (Leinco Technologies, I-127) previamente
diluido 1/50; mientras que a los pozos incubados con los controles positivos se les
agregó el mismo volumen de una solución de estreptavidina acoplada a PE (Leinco
Technologies I-127) diluida 1/50, se empleó la solución bloqueadora como diluente.
Las microplacas se incubaron protegidas de la luz durante 60 min a temperatura
28

ambiente con una agitación lenta (1 000 g) empleando un agitador orbital horizontal
para microplacas.
7. El líquido se removió y se repitió la serie de tres lavados con 200 L de PBS-T.
8. Finalmente se adicionaron 100 L/pozo de PBS-T, se agitaron las microplacas
en un agitador orbital (1 000 g) durante 2-3 minutos para resuspender las
micropartículas y se colocó la microplaca en el lector Luminex 100 para realizar el
análisis correspondiente.
5.3. Técnica de cromatografía de afinidad por columna para la obtención de
auto-anticuerpos anti-hIL-10 presentes en muestras séricas humanas

Para la purificación de auto-anticuerpos anti-hIL-10 se realizó la técnica de
cromatografía de afinidad por columna empleando el kit de acoplamiento proteico
de microenlace (Micro Link protein coupling kit, Thermo Scientific Núm. Cat. 20475).
De forma general el procedimiento se describe a continuación:

a) Columnas de centrifugación con resina de acoplamiento amino enlace: cada
columna contiene 400 µl de una suspensión al 4 % de perlas de agarosa con 25 %
de un compuesto acuoso.
b) Solución amortiguadora de acoplamiento pH= 7.2 (Coupling Buffer): Solución salina
amortiguadora de fosfatos, 1 paquete rinde en fosfato de sodio [0.1 M], Cloruro de
sodio [0.15 M], pH 7.2 cuando se reconstituye con 400 mL de agua.
c) Solución amortiguadora de enfriamiento (Quenching Buffer): 50 mL, 1 M Tris-HCl,
0.05 % de azida de sodio (𝑁𝑎𝑁3), pH= 7.4.
d) Solución de Cianoborohidruro de sodio al 5 M (𝑁𝑎𝐶𝑁𝐵𝐻3, mw 62.84): 0.5 mL,
disuelto en NaOH 0.01 M.
e) Solución de lavado (Wash Solution): 25 mL, 1 M NaCl, 0.05 % 𝑁𝑎𝑁3.
f) Solución amortiguadora de Elución (Elution Buffer): 50 mL, pH 2.8, contiene aminas
primarias.
g) Tubos de colección para microcentrifuga: Viales con tapa y con una capacidad de
0.5 mL.
h) Solución amortiguadora de almacenamiento: Se prepararon 100 mL de la solución
amortiguadora de fosfatos (PBS; igual que la solución amortiguadora de
acoplamiento pH 7.2) conteniendo 0.05 % de 𝑁𝑎𝑁3.
29

Almacenamiento del kit: almacenar a 4° C, aunque el producto sea
transportado a temperatura ambiente.

5.3.1. Preparación del material

Solución amortiguadora de acoplamiento pH 7.2: Se disolvió el contenido del
sobre en 500 mL de agua ultra pura; cuando fue necesario obtener una solución a
10X se disolvió todo el contenido en 50 mL. Para un almacenamiento por largos
periodos de la solución amortiguadora filtrar la solución empleando una membrana
con un tamaño de poro de 0.22 μm o añadir azida de sodio a una concentración
final de 0.02 % y almacenar a 4 °C.
Muestra de proteína: Se resuspendió la hIL-10 recombinante en 400 µl de
solución amortiguadora de acoplamiento, tratando de ajustar a una concentración
final de 0.5-1 mg/mL.
En el presente estudio se utilizó el producto comercial Immunokin (Boehringer
Ingelheim), IL-10 (ImmunoTools) para llevar a cabo la purificación de auto-
anticuerpos contra hIL-10.
5.3.2. Procedimiento para el acoplamiento de la proteína (citocina hIL-10)

A) Preparación de la columna e inmovilización de la proteína
Para todos los pasos se requirió mezclar la resina de acoplamiento con la
solución amortiguadora suavemente golpear la columna cerca del paquete de la
resina varias veces hasta resuspender y luego cuidadosamente se agitó la columna
en un vórtex a baja velocidad. Sé aseguró que la resina permaneciera húmeda todo
el tiempo se realizaron los pasos de centrifugación a 1 000 g ~3 500 en
BioFugePico-Heraeus) por 1 minuto.
1. La columna de centrifugación conteniendo la resina de acoplamiento amino
enlace, y todos los reactivos a utilizar se equilibraron a temperatura ambiente (37
°C).
2. Primero se aflojó la tapa superior de la columna y luego se removió el tapón
inferior para evitar aspirar aire dentro de ésta. Se colocó la columna en un tubo de
colección y se centrifugó a 1 000 x g por 1 min, para remover la solución
amortiguadora de almacenamiento.
30

3. Se removió la tapa superior y se insertó el tapón. La resina fue suspendida,
adicionando 400 µl de la solución amortiguadora de acoplamiento utilizado para
disolver la muestra. Después se removió el tapón, se colocó la columna en un tubo
de colección, se centrifugó a 1 000 x g por 1 minuto y se descartó el fluido pasante.
Este paso se repitió dos veces más.
4. Sé tapó la parte inferior de la columna y se adicionaron 400 µl de la muestra (0.5
mg/mL) directamente en la resina, se reemplazó la tapa y se mezcló. Para
determinar la eficiencia del acoplamiento, se reservó una porción de la muestra (5
µl) que fue utilizada como referencia de la cantidad inicial de proteínas (Vial: A).
Nota: Para todos los pasos se mezcló la resina, agitando la columna
suavemente o cuidadosamente en un vórtex a baja velocidad.
5. En una campana de extracción, se destapó la columna y se añadieron 5 µl de la
solución cianoborohidruro de sodio a la reacción acuosa. Se volvió a colocar la tapa
y se mezcló.
6. Se dejó incubar la columna durante 2 horas a temperatura ambiente (37 °C),
agitando el vial cada hora, para posteriormente incubar toda la noche a 4 °C, con
un mezclado rotatorio suave.
Nota: Antes de incubar durante toda la noche se aseguró que la resina se mezclara
adecuadamente, por lo que se adicionó una concentración final de 0.05 % de
Tween-20 (se agregaron a la columna 0.5 µl de Tween-20 para 400 µl de muestra
utilizada), esto ayudó para que la resina fluyera libremente en la columna.
7. Posteriormente, se aflojó la tapa de la columna y se removió el tapón. Se colocó
la columna en un tubo de colección y se centrifugó 1 000 x g por 1 minuto (para
colectar el fluido con la proteína no unida). Para determinar la eficacia del
acoplamiento, se evaluó el fluido pasante con un ensayo de proteínas y comparar
con la concentración o la cantidad inicial. (Vial: B).
8. Se removió la tapa de la columna y se insertó el tapón. Se adicionaron 500 µl de
la solución amortiguadora de acoplamiento, se reemplazó la tapa y se mezcló. Se
removió el tapón, después se aflojó la tapa, y se colocó la columna en un tubo de
colección y se centrifugó. Se repitió este paso una vez más. Se guardó el fluido
pasante para evaluar la eficiencia de acoplamiento (Vial: C y D).
Nota: Como la reacción fue incubada toda la noche, sé invirtió
cuidadosamente la columna 10 veces para desalojar cualquier resina restante en
la tapa. Sé aflojó la tapa de la columna y se removió el tapón. Se colocó la columna
31

en un tubo de colección y se centrifugó, se guardó el fluido pasante para evaluar la
eficacia del acoplamiento. Se repitió este paso dos veces más.

B) Bloqueo de los sitios activos de unión remanentes

1. Se destapó la columna y se insertó el tapón. Posteriormente se adicionaron 500
µl de solución amortiguadora de enfriamiento a la resina, se reemplazó la tapa y se
mezcló.
2. Se retiró la tapa de la columna y el tapón. Se colocó la columna en un tubo de
colección, se centrifugó y se descartó el fluido que paso.
3. Se repitieron los pasos 1-2.
4. Se colocó el tapón a la columna y se adicionaron 500 µl de solución
amortiguadora de enfriamiento directamente a la resina. Se reemplazó la tapa y se
mezcló.
5. En una campana de extracción se quitó la tapa de la columna y se adicionaron
10 µl de lasolución Cianoborohidruro de sodio a la reacción acuosa. Se tapó la
columna y se mezcló. Se incubó la reacción a temperatura ambiente durante 60
minutos, mezclando cada 15 minutos.
6. Sé quitó el tapón. Se colocó la columna en un tubo de colección, se centrifugó y
se descartó el fluido que paso.
Nota: Como la columna se utilizó en forma inmediata fue necesario
equilibrarla adicionando 500 µl de solución amortiguadora de acoplamiento y se
centrifugó a 1 000 x g por 1 minuto, se realizó esto dos veces. Y se continuó con el
paso 2 del Procedimiento general para la purificación por afinidad.

5.3.3. Procedimiento general para la purificación por afinidad

C) Formación del complejo unido a la resina.
1. La columna con la resina conteniendo la citocina se equilibró a temperatura
ambiente (37 °C).
2. Se removió primero la tapa de la columna y después el tapón. Se colocó la
columna en un tubo de colección, se centrifugó y se descartó el fluido que paso.
32

3. Se colocó el tapón a la columna y se adicionaron 500 µl de la muestra sérica
diluida vol:vol en solución amortiguadora de acoplamiento directamente en la
resina, se reemplazó la tapa y se mezcló.
4. Se incubó la reacción con un mezclado suave en forma de rotación. Se dejó
incubar la columna durante 2 horas a temperatura ambiente (37 °C), para
posteriormente incubar toda la noche a 4 °C, con un mezclado rotatorio suave.
5. Se aflojó la tapa de la columna y se removió el tapón. Se colocó la columna en
un tubo de colección y se centrifugó. Se guardó el fluido pasante para análisis (Vial:
E). Para la evaluación se utilizó el sistema citocina-microesfera Bio-Plex.
6. Para reducir las posibles interacciones no específicas se preparó 1 mL de una
solución de NaCl a 0.5 M, con la cual se diluyó la solución de lavado vol:vol, y se le
adicionó Tween-20 para una concentración final de 0.05%. Se quitó la tapa de la
columna, se insertó el tapón y se adicionaron 300 µl de la solución. Se reemplazó
la tapa y cuidadosamente se invirtió la columna 10 veces. Se aflojó la tapa, se
removió el tapón y se colocó la columna en un tubo de colección. Se centrifugó el
tubo y se descartó el fluido pasante. Se repitió este pasó dos veces más (Viales: F,
G y H).
7. Se destapó la columna y se colocó el tapón, se adicionaron 300 µl de solución
de amortiguadora de acoplamiento, se reemplazó la tapa y gentilmente se invirtió
la columna 10 veces. Se aflojó la tapa y se removió el tapón. Se colocó la columna
en un tubo de colección, se centrifugó y se descartó el fluido obtenido en el vial, se
repitió esta pasó una vez más. (Viales: I y J).
8. Se destapó la columna y se colocó el tapón, se adicionaron 300 µl de la solución
amortiguadora de acoplamiento, en incrementos de 100 µl, en la superficie interior
de la columna para lavar y bajar la resina, fue muy importante no mezclar la resina.
Se removió el tapón, se colocó la columna en un tubo de colección, centrifugar y
colectar el fluido pasante (Vial: K).

D) Elución.
1. Se colocó el tapón a la columna y se adicionaron 300 µl de la solución
amortiguadora de Elución a un pH 2.8 a lo largo de los lados de la columna sobre
la resina. Se reemplazó la tapa y se mezcló. La columna se incubó durante 5
minutos a temperatura ambiente (37 °C).
33

2. Se destapó la columna y se colocó el tapón. Se colocó la columna en un tubo de
colección y centrifugar (Vial: E-1). Se neutralizó el pH bajo de la fracción eluida
añadiendo 15 µl de Tris 1 M, pH 9.0 (para 300 µl de volumen de elución)
3. Se repitieron los pasos 1 y 2 seis veces o según sea necesario (mínimo 3 veces)
(Viales: E-2, E-3, E-4, E-5 E-6 y E-7).
4. Para asegurar la elución completa del anticuerpo de la columna se realizó un
cambio de pH de la solución amortiguadora de elución, ajustando 5 mL de esta
solución amortiguadora a un pH 2.0 (empleando una solución 1 M de HCl), y un
aumento en el volumen empleado, como se indica en los pasos posteriores.
5. Se colocó el tapón a la columna y adicionar 300 µl de la solución amortiguadora
de Elución a lo largo de los lados de la columna sobre la resina. Se reemplazó la
tapa y se mezcló. Se incubó la columna durante 5 minutos a temperatura ambiente
(37 °C).
6. Se destapó la columna y se colocó el tapón. La columna se colocó en un tubo de
colección y se centrifugó (Vial: E-5). Se neutralizó el pH bajo de la fracción eluida
añadiendo 18 µl de Tris 1 M, pH 9.0 (para 300 µl de volumen de elución).
7. Se repitieron los pasos 5 y 6 según sea necesario (Viales: E-9, E-10, E-11 y E-
12).
8. Se regeneró la resina tan pronto como fue posible después de la elución
mediante el lavado una vez con 300 µl de Solución amortiguadora de acoplamiento
conteniendo azida de sodio al 0.02 %. Almacenar la columna a 4 °C.
9. Finalmente, a cada fracción de eluido (12 fracciones) se le agregaron 30 μl de
una solución de BSA al 4.5 %; y se conservaron en refrigeración hasta el análisis.
5.3.4. Lavado y almacenamiento de la columna de afinidad

1. Se tapó la parte inferior de la columna y se adicionar 500 µL de la solución de
lavado. Se reemplazó la tapa y se mezcló. Se removió la tapa y el tapón, se colocó
la columna en un tubo de colección, se centrifugó y se descartó el fluido pasante.
Se repitió este paso dos veces más.
2. Se tapó la parte inferior de la columna y se adicionaron 400 µL de Solución
amortiguadora de acoplamiento, se reemplazó la tapa y se mezcló. Se removió la
tapa y el tapón inferior, se colocó la columna en un tubo de colección, se centrifugó
y se descartó el fluido pasante. Se repitió este paso dos veces más.
34

3. Se tapó la parte inferior de la columna y se adicionaron 400 µL de solución
amortiguadora de acoplamiento a lo largo de los lados de la columna para lavar la
resina. Se reemplazó la tapa y se almacenó a 4 °C.
Nota: Para un almacenamiento por largos periodos (ej.>2 semanas),
adicionar azida de sodio a la solución amortiguadora de acoplamiento hasta obtener
una concentración final de 0.02 %.
5.4. Ensayo de avidez para el análisis de los auto-anticuerpos anti-hIL-10
mediante la técnica BioPlex en un sistema múltiple de microesferas

Partiendo de las muestras evaluadas, se seleccionaron los sueros y fracciones
eluidas o mezclas de ellas que resultaron ser positivas en estudios anteriores a la
presencia de altos niveles de auto-anticuerpos contra hIL-10 se utilizaron para este
ensayo de avidez basado en una técnica descrita por Rachel M. Stenger (Stenger,
2011). Por lo tanto, para las muestras séricas positivas a auto-anticuerpos anti-hIL-
10 se empleó únicamente la dilución de 1/50.
Cada dilución se realizó por duplicado para todas las condiciones trabajadas. La
metodología se describe a continuación:
1. La microplaca de 96 pozos con filtro-BV de 1.2 μm el tamaño del poro, (Millipore,
Núm. Cat. MSBVN1210) se humedeció agregando 150 μL por pozo de solución de
lavado (PBS-T: 10 mM PBS pH 7.4, 0.05 % vol/vol Tween 20), después de 2
minutos el líquido se extrajo empleando un sistema de vacío.

2. La suspensión de trabajo de las microesferas acopladas a una citocina en
particular se preparó a partir de alícuotas (20 μL), los sistemas de citocinas
necesarios para el análisis (incluyendo el control negativo, BSA-microesfera) se
diluyeron en un volumen final de 5,000 μl de solución amortiguadora pre-
bloqueadora (10 mM PBS pH 7.4, 1 % BSA, 0.05 % de 𝑁𝑎𝑁3).

3. Posteriormente 50 μL de la suspensión de trabajo de las microesferas acopladas
(previamente agitadas en el vórtex) se agregaron a cada pozo, y el líquido fue
removido por medio de filtración a vacío.

4. En los pozos correspondientes se agregaron 50 μL/pozo de cada una de las
muestras problemas (suero o anticuerpos purificados) o anticuerpos anti-IL-10
biotinilados como control positivo. Las muestras séricas fueron diluidas a 1/50, cada