Restaurando-la-autoincompatibilidad-sexual-en-hbridos-autocompatibles-de-nicotiana-a-traves-de-la-funcion-de-NaStEP

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
RESTAURANDO LA AUTOINCOMPATIBILIDAD SEXUAL EN HÍBRIDOS 
AUTOCOMPATIBLES DE NICOTIANA A TRAVÉS DE LA FUNCIÓN DE 
NASTEP 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
 
PRESENTA 
JIMENA BELLIDO MORA 
 
 MÉXICO, Ciudad de México 2018 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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2 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: J. Eleazar Martínez Barajas 
VOCAL: Profesor: Sobeida Sánchez Nieto 
SECRETARIO: Profesor: Felipe Cruz García 
1er. SUPLENTE: Profesor: Euclides Ávila Chávez 
2° SUPLENTE: Profesor: Francisca Morayna Gutiérrez Luna 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Laboratorio 104, Departamento de 
Bioquímica, Edificio E, Conjunto D-E. Facultad de Química. Universidad Nacional 
Autónoma de México. 
 
 
asesor del tema: __________________________ 
 Dr. Felipe Cruz García 
 
supervisor técnico: ________________________ 
 M. en C. Yuridia Cruz González Zamora 
 
SUSTENTANTE: _________________________ 
 Jimena Bellido Mora 
 
 
3 
Agradecimientos 
 
El proyecto fue financiado por el proyecto CONACyT 236602, DGAPA IN217816 y PAIP 
5000-9128. 
A la Facultad de Química de la UNAM por el apoyo para realizar mi tesis a través del 
Subprograma 127 “Formación Básica en Investigación”. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Dedicatorias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Índice 
Agradecimientos ....................................................................................................................... 3 
Dedicatorias .............................................................................................................................. 4 
Índice de figuras ....................................................................................................................... 6 
Índice de tablas ........................................................................................................................ 7 
Resumen ................................................................................................................................... 8 
Antecedentes .......................................................................................................................... 10 
Estructura de la flor .......................................................................................................................... 10 
Polinización ...................................................................................................................................... 11 
Autoincompatibilidad sexual............................................................................................................ 12 
AI esporofítica ............................................................................................................................................ 14 
AI gametofítica ........................................................................................................................................... 15 
Justificación ............................................................................................................................ 28 
Hipótesis.................................................................................................................................. 28 
Objetivos ................................................................................................................................. 28 
Metodología ............................................................................................................................ 29 
Purificación de NaStEP nativa de pistilos de N. alata .................................................................. 29 
Monitoreo de la purificación de NaStEP .................................................................................................. 30 
Inmunodetección de NaStEP .................................................................................................................... 30 
Actividad de NaStEP como inhibidor de subtilisina ...................................................................... 31 
Inmunolocalización de NaStEP y calosa. ...................................................................................... 32 
Squash de estilos polinizados y tinción con azul de anilina de tubos polínicos ......................... 34 
Resultados .............................................................................................................................. 35 
Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata. ................................................................ 35 
NaStEP inhibe a la subtilisina ......................................................................................................... 39 
NaStEP aplicada de manera exógena ingresa a los tubos polínicos en cruzas compatibles e 
incompatibles.................................................................................................................................... 41 
Restableciendo la autoincompatibilidad de híbridos de Nicotiana autocompatibles mediante la 
función de NaStEP ........................................................................................................................... 45 
Discusión ................................................................................................................................. 50 
Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata. ................................................................ 50 
 
 
6 
NaStEP inhibe a la subtilisina ......................................................................................................... 51 
NaStEP aplicada de manera exógena ingresa a los tubos polínicos en cruzas compatibles e 
incompatibles.................................................................................................................................... 52 
Restableciendo la autoincompatibilidad de híbridos de Nicotiana autocompatibles mediante la 
función de NaStEP ........................................................................................................................... 53 
Conclusiones .......................................................................................................................... 55 
Perspectivas ........................................................................................................................... 55 
Referencias ............................................................................................................................. 56 
 
Índice de figuras 
Figura 1. Estructura de la flor hermafrodita.………………………………………………...11 
Figura 2. AI esporofítica……………….………………………………………………………14 
Figura 3. AI gametofítica…………………………………..…………………………………..16 
Figura 4. NaStEP se incorpora a los tubos polínicos compatibles e 
incompatibles………………………..………………………………………………………….20 
Figura 5. La supresión de NaStEP resulta en la pérdida del rechazo S-
específico………………………………………………………..………………………………21 
Figura 6. Los niveles de HT-B disminuyen en una planta con NaStEP 
suprimida………………………………………………………………………………………..21 
Figura7. Modelo de la estructura tridimensional de 
NaStEP………………………………………………………………………………………….22 
Figura 8. NaStEP es un inhibidor de subtilisina…………………………………………….23 
Figura 9. NaStEP inhibe diferentes tipos de proteasas...................................................24 
Figura 10. La interacción entre NaStEP y NaSIPP ocurre en la mitocondria de los tubos 
polínicos..........................................................................................................................24 
Figura 11. Modelo de AI en Solanaceae…………………………………….………………27 
Figura 12. Cromatograma del intercambio catiónico débil DEAE………………………...35 
Figura 13. Cromatograma de la filtración molecular Hi-Trap Desalting….………………36 
Figura 14. Cromatograma del intercambio catiónico fuerte Hi-Trap Capto S…….……..36 
 
 
7 
Figura 15. Acercamiento de la figura 14 en la fase de elución…………………….….….37 
Figura 16. Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata…………….……….....38 
Figura 17. Actividad proteolítica de la subtilisina………………………………..………....39 
Figura 18. Inhibición de la actividad proteolítica de la subtilisina…………………….…..40 
Figura 19. Inmunolocalización de NaStEP en estigmas de híbridos autocompatibles de 
Nicotiana con NaStEP silenciado……….……………………………………………………42 
Figura 20. Inmunolocalización de NaStEP en estigmas de N. alata……………….…….43 
Figura 21. NaStEP aplicada de manera exógena ingresa a los tubos polínicos 
compatibles e incompatibles………………………………………………………………….44 
Figura 22. Evaluación del restablecimiento de la autoincompatibilidad de los híbridos N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0………………………………....…46 
Figura 23. Histograma del conteo de tubos polínicos……………………………..…….....48 
Figura 24. Porcentaje de TPs en la base del estilo entre los que germinaron……….....49 
 
Índice de tablas 
Tabla 1. Cuantificación de tubos polínicos a las 72 h post-polinización agregando 
NaStEP nativa y polen incompatible (SC10)………………..………………………………..47 
Tabla 2. Porcentaje de TPs que alcanzaron la base del estilo entre los que 
germinaron………………………………………………………………………………………48 
 
 
 
 
 
 
 
8 
Resumen 
Los angiospermas muestran diversas estrategias reproductivas para generar y 
mantener la diversidad genética, una de ellas son los sistemas de autoincompatibilidad 
sexual (AI). Este mecanismo les permite a las plantas discriminar entre su propio polen 
y el polen de otra planta. En la familia Solanaceae, la AI está controlada por un solo 
locus altamente polimórfico, el locus S. En este locus se encuentran codificadas las 
determinantes esenciales para que se lleve a cabo la respuesta de AI: la S-RNasa y 
SLF/SFB. La S-RNasa es una ribonucleasa que se expresa en el estigma y estilo, 
mientras que SLF/SFB es una proteína de caja F expresada exclusivamente en el 
polen. La interacción de estas dos proteínas, determina si el polen es compatible o 
incompatible. En Nicotiana alata, hay otros genes no ligados al locus S que participan 
en el mecanismo de la AI; estos genes son denominados genes modificadores (GM). 
Hasta la fecha se han descrito tres GM que se expresan en el pistilo (120K, HT-B y 
NaStEP) y un GM expresado en polen (NaSIPP). 
Durante la polinización en N. alata, las S-RNasas ingresan al tubo polínico y se 
almacenan en vacuolas. En una cruza compatible, estas vacuolas permanecen intactas 
mientras que en una cruza incompatible, las vacuolas se rompen liberando a las S-
RNasas al citoplasma del tubo polínico donde degradan el RNA siendo éste un evento 
irreversible. 
En nuestro grupo de investigación se describió al GM NaStEP (Nicotiana alata Stigma-
Expressed Protein), el cual es un inhibidor de proteasas que se expresa de forma 
abundante en estigmas de especies incompatibles del género Nicotiana. Su 
participación en la respuesta de AI fue determinada por ensayos de pérdida de función 
utilizando RNA interferente en plantas transgénicas de Nicotiana. La supresión de esta 
proteína, dio como resultado que las plantas transgénicas aceptaran su propio polen. 
También se observó que durante la polinización, NaStEP se relocaliza e ingresa al tubo 
polínico sin importar el genotipo de la cruza. Asimismo, se propone que NaStEP 
participa en la estabilidad de HT-B (una proteína producto de un GM que se localiza en 
la periferia de las vacuolas que contienen a las S-RNasas) ya que en las líneas donde 
NaStEP está suprimida, HT-B se degrada tanto en una cruza compatible como en una 
 
 
9 
incompatible, no así, en N. alata silvestre, donde en una cruza incompatible HT-B 
permanece estable mientras que en una cruza compatible, se degrada. 
En la actualidad no se sabe si NaStEP en una cruza compatible también se degrada 
como HT-B pero se hipotetiza que sí, y para probarlo, en este trabajo se comenzó con 
el establecimiento de las condiciones y parámetros para determinar si la aplicación 
exógena de NaStEP nativa y funcional en plantas silenciadas con RNAi:NaStEP, 
restablece la AI. Con este sistema bien establecido se podrá evaluar la degradación de 
NaStEP en los tubos polínicos en una cruza compatible. 
Para realizar este proyecto se purificó NaStEP nativa de pistilos de N. alata y se aplicó 
de manera exógena a plantas silenciadas RNAi:NaStEP, en las que mediante 
inmunolocalización se observó su ingreso a los tubos polínicos en cruzas compatibles e 
incompatibles. Además, para determinar si su aplicación exógena restablece la AI, se 
agregó NaStEP a estigmas de plantas silenciadas RNAi:NaStEP y se polinizó con polen 
compatible e incompatible. Aquí mediante aplastados de estilos polinizados y tinción 
con azul de anilina se hicieron observaciones de los tubos polínicos que alcanzaban la 
base del estilo. Se observó el rechazo de la mayoría de los tubos polínicos 
incompatibles, con lo cual se concluye que la aplicación exógena de NaStEP en plantas 
silenciadas RNAi:NaStEP resulta en un restablecimiento de la autoincompatibilidad 
sexual. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Antecedentes 
 
Estructura de la flor 
La flor es la unidad estructural y funcional que caracteriza a los angiospermas, y se 
especializa en la reproducción sexual. Está involucrada en los procesos de polinización 
y fecundación, que lleva a la formación de semillas y frutos maduros (Cruz Durán y 
Rosas López, 2013). En una flor hermafrodita, cuatro verticilos de órganos pueden 
distinguirse. El verticilo más externo y basal consiste en sépalos (llamados en conjunto 
cáliz). Cuando se forma la flor, estos son los primeros órganos en aparecer y 
permanecen cerrados durante el desarrollo de la misma. Por lo tanto, el botón es la flor 
que se está desarrollando envuelta en un verticilo de sépalos (generalmente verdes). 
Adentro de los sépalos, están los pétalos, y el verticilo completo se llama corola. Los 
pétalos generalmente son más delicados que los sépalos y su superficie es suave al 
tacto. Esto se debe a la presencia de células con forma de domo, llamadas células 
papilares, las cuales incrementan la reflexión de color y también pueden secretar 
quimioatrayentes. La función principal de los colores llamativos de los pétalos es atraer 
polinizadores. Los verticilos más externos descritos previamente son los componentes 
estériles de la flor, aunque juegan un papel importante en la función floral (Hodson y 
Bryant, 2012). 
Los otros dos verticilos internos son los órganos reproductivos en los que se forman los 
gametos. El más externo de los dos es la parte masculina llamada androceo, que se 
compone de estambres. El número de estambres varía entre especies. El verticilo más 
interno de los órganos florales son los carpelos, las estructuras reproductivas femeninas 
que en conjunto se llaman gineceo. El carpelo consiste en tres regiones: la basal es el 
ovario, donde los óvulos se desarrollan y se almacenan. La parte más externa del 
carpelo es el estigma, donde el polen aterriza. Entre el estigma y el ovario, la mayoría 
de las plantaspresenta una estructura en forma de tallo, donde los tubos polínicos 
(TPs) crecen para fecundar los óvulos y se llama estilo (Hodson y Bryant, 2012). 
 
 
11 
 
Figura 1. Estructura de la flor hermafrodita. El gineceo (parte femenina) se compone de estigma, estilo y ovario, el 
androceo (parte masculina) se compone de los estambres (antera y filamento). Se ilustra el crecimiento de los 
tubos polínicos a lo largo del estilo hasta llegar a fecundar los óvulos (García-Valencia et al., 2013). 
 
Polinización 
La polinización es un proceso fundamental en la reproducción sexual de las plantas. 
Esta inicia con la liberación del polen de la antera y su transporte al estigma por 
factores bióticos o abióticos. Los granos de polen maduro se liberan de la antera y son 
transportados por el viento o por vectores animales y algunos llegan al estigma 
receptivo. Cuando se liberan los granos de polen, generalmente están deshidratados, y 
se rehidratan cuando llegan al estigma receptivo. Los gametos masculinos son 
inmóviles, lo cual es una ventaja para las plantas terrestres, ya que no necesitan al 
agua como medio para alcanzar a los óvulos (Hodson y Bryant, 2012). 
La interacción inicial entre el polen y el estigma, de adhesión y rehidratación, depende 
de las propiedades de la cubierta del polen (exina) y de la superficie estigmática (ya sea 
húmeda o seca). En estigmas secos, como en el género Lilium la adhesión del polen es 
específica mediada por receptores (Swanson et al., 2004). En el género Nicotiana, 
 
 
12 
donde el estigma es húmedo, se hidrata el grano de polen por el exudado estigmático 
(Cruz-García y Cruz González-Zamora, 2013). Mutaciones que eliminan el exudado 
estigmático de Nicotiana tabacum causan esterilidad femenina y se revierte el fenotipo 
agregando lípidos de manera exógena (Goldman et al., 1994; Wolters-Arts et al., 1998). 
Una rehidratación exitosa lleva a la germinación de polen, en donde la célula vegetativa 
se elonga a través uno de los poros en la exina formando el tubo polínico (TP), el cual 
es una estructura altamente polarizada, con un crecimiento regulado por gradiente de 
iones calcio (Franklin-Tong et al., 1995). La pared del tubo polínico se compone de una 
capa externa que contiene pectina y una interna que contiene calosa y microfibras de 
tipo celulosa. La punta del tubo polínico no tiene la capa interna de calosa (Steer y 
Steer, 1988). Las actividades de fosfatasa, esterasa, amilasa y proteasa cruciales en 
los tubos polínicos para invadir el estigma (Knox y Heslop-Harrison, 1970). 
El tubo polínico crece a través del tejido de transmisión del estilo (figura 1) y se 
mantiene en constante comunicación con las células del estilo, lo cual en algunas 
especies es un punto de control crítico para que la fecundación sea exitosa. El 
crecimiento del tubo polínico culmina con la descarga de las células espermáticas en el 
saco embrionario, lo que provoca la doble fecundación, que resulta en la formación del 
cigoto y del endospermo (Cruz-García y Cruz González-Zamora, 2013). 
La polinización puede llevarse a cabo con polen de la misma flor o flores del mismo 
individuo, lo que se denomina autopolinización; o también puede ocurrir con polen de 
otro individuo de la misma especie, denominada polinización cruzada. 
 
Autoincompatibilidad sexual 
Las flores hermafroditas, al tener sus órganos sexuales masculinos y femeninos muy 
cercanos, tienen una alta probabilidad de autopolinizarse. Charles Darwin en su libro 
The Effect of Cross and Self Fertilization in the Plant Kingdom (1876), observó que unas 
especies de plantas eran completamente estériles con su propio polen, pero fértiles con 
el polen de otros individuos de la misma especie. El estudio de Darwin tenía como 
objetivo dilucidar por qué la reproducción cruzada prevalece en la naturaleza, y sus 
 
 
13 
experimentos con 57 especies de plantas respaldaron la hipótesis de que la endogamia 
es perjudicial para la progenie producida, ya que disminuye el vigor y la fertilidad en la 
mayoría de las especies estudiadas. Estudios de genética clásica y enfoques 
moleculares sugieren que la depresión por endogamia es causada predominantemente 
por aumento de mutaciones deletéreas recesivas en las poblaciones (Charlesworth y 
Willis, 2009). 
Como consecuencia, algunas especies desarrollaron adaptaciones para mantener la 
diversidad genética en las generaciones siguientes, estas adaptaciones son de tipo 
morfológico, fisiológico y genético (de Nettancourt, 2001). 
La hercogamia es una estrategia morfológica de separación espacial de estambres y 
pistilo. La dicogamia, es una estrategia fisiológica, en la que la maduración de los 
órganos reproductivos ocurre de manera diferencial en el tiempo (Cruz-García y Cruz 
González-Zamora, 2013). Por ejemplo, las anteras pueden madurar y liberar el polen 
antes o después de que el estigma esté receptivo, lo que reduce considerablemente la 
probabilidad de autopolinización (Hodson y Bryant, 2012). 
Las estrategias antes descritas no son del todo eficientes. La autoincompatibilidad (AI) 
sexual es un mecanismo genético-bioquímico que ha evolucionado para promover la 
polinización cruzada en los angiospermas y se define como la incapacidad de una 
planta hermafrodita fértil de producir cigotos después de la autopolinización. La AI 
promueve un aumento en la diversidad genética, evita la depresión por endogamia y 
restringe las cruzas con padres y otros individuos de la progenie (de Nettancourt, 2001). 
Se propone que uno de los factores más importantes que han contribuido al éxito 
evolutivo de los angiospermas es la AI (Whitehouse, 1950). 
 
La AI se clasifica a nivel genético en esporofítica y gametofítica. La AI esporofítica está 
determinada por el genoma diploide del polen, mientras que la AI gametofítica por el 
genoma haploide del polen (de Nettancourt, 2001). East y Magelsdorf (1925) 
encontraron que la compatibilidad está controlada por un solo locus altamente 
polimórfico, el locus S (Sterility). Este locus multialélico tiene dos genes fuertemente 
 
 
14 
ligados, la determinante femenina que se expresa en pistilo y la determinante masculina 
que se expresa en polen. El locus S se encuentra cerca del centrómero 
(heterocromatina) en Lycopersicon peruvianum y Petunia hybrida, en los cromosomas I 
y III respectivamente (Tanksley y Loaiza-Figueroa, 1985; Entani et al., 1999). Además, 
las secuencias de ambas determinantes están muy cercanas entre sí, lo que provoca 
que no haya recombinación entre ambos genes y que se hereden como una sola 
unidad mendeliana llamada haplotipo (Cruz-García y McClure, 2001). 
 
AI esporofítica 
En los sistemas de AI esporofítica, que se han estudiado principalmente en 
Brassicaceae, las determinantes de compatibilidad se producen en el tapete de la 
antera, un tejido esporofítico y se depositan en la cubierta del polen. La respuesta de 
rechazo del polen se manifiesta en la superficie del estigma, condicionando si el polen 
germina o no (Takayama e Isogai, 2005). En la figura 2 se ejemplifica como una planta 
S1S2 producirá granos de polen con las proteínas S1 y S2 en su superficie, y si polinizan 
la misma planta, estos no germinarán (García-Valencia et al., 2013). 
 
 
Figura 2. La AI esporofítica está determinada por el 
haplotipo S del genotipo diploide del polen. Si alguna de las 
dos proteínas S del polen coinciden con una de las 
expresadas en el pistilo S1S2, el polen será rechazado (en 
este caso S1S2, S2S3 y S1S4). Si no hay coincidencia alélica, el 
polen podrá germinar y crecer hasta fecundar el óvulo (en 
este caso S3S4) (García-Valencia et al., 2013). 
 
 
 
 
 
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El locus S en Brassica alberga tres genes, SRK, SP11 y SLG. La determinante 
femenina SRK es un receptor de cinasa que se extiende en la membrana plasmática de 
la célula papilar estigmática. SP11 es la determinante masculina, que se expresapredominantemente en el tapete de la antera y se acumula en la cubierta del polen 
durante su maduración. Después de la polinización, SP11 penetra la pared celular de la 
célula papilar y se une con SRK, de manera S-específica. Esta unión induce la 
autofosforilación de SRK y una cascada que termina en el rechazo del polen propio. 
SLG no es esencial para el mecanismo de AI esporofítica pero aumenta la respuesta de 
rechazo en algunos haplotipos S (Takayama e Isogai, 2005). 
 
AI gametofítica 
Las familias Solanaceae, Rosaceae y Plantaginaceae, presentan AI gametofítica, que 
también está controlada por el locus S. En el locus S, se encuentran ligados dos genes: 
la determinante femenina que codifica a una ribonucleasa (S-RNasa) y se expresa en 
pistilo, y la determinante masculina que es una proteína de caja F (SLF/SFB) y se 
expresa en el polen. La interacción entre la S-RNasa y SLF/SFB determina si el polen 
es compatible o incompatible (De Nettancourt, 2001). Por ejemplo, (ver figura 3) en una 
planta con genotipo S1S2 se producirán unos granos de polen S1 y otros S2, y el 
genotipo del pistilo diploide será S1S2. Si llega polen S1 o S2 al estigma de esta planta, sí 
podrá germinar, pero se verá inhibido el crecimiento del tubo polínico a nivel del estilo. 
En cambio, si llega un grano de polen con un haplotipo S diferente, este podrá crecer 
hasta alcanzar el ovario (García-Valencia et al., 2013). 
Papaver rhoeas también presenta AI gametofítica, pero el mecanismo es diferente, la 
determinante femenina (proteína S) induce una cascada de señalización dependiente 
de calcio que resulta en la muerte del tubo polínico incompatible, por lo que es 
independiente de S-RNasa (Wheeler et al., 2009). 
 
 
 
 
 
16 
 
 
 
Los productos del alelo S en Solanaceae 
Las proteínas S presentes en pistilo en la familia Solanaceae tienen actividad de 
ribonucleasa, por lo que se conocen como S-RNasas. Las células del estigma, estilo y 
ovario secretan S-RNasa a la matriz extracelular, que guía el tubo polínico hacia el 
óvulo (Anderson et al., 1989; Cornish et al., 1987). Son glicoproteínas básicas de 30-35 
kDa que se pueden acumular en altas concentraciones (Jahnen et al., 1989). La 
actividad de ribonucleasa es necesaria para el rechazo del polen (Huang et al., 1994) y 
se encontró que el RNA del polen es degradado en polinizaciones incompatibles, lo que 
no ocurre en compatibles (McClure et al., 1990). Las S-RNasas son altamente 
polimórficas, aunque tienen 5 regiones conservadas. Por cristalización de dos 
diferentes S-RNasas, se encontraron regiones conservadas en el centro hidrofóbico de 
la proteína y en el sitio activo (Ida et al., 2001; Igik y Kohn, 2001). Las regiones 
variables se encuentran en la superficie donde se da la interacción con factores del 
polen o del pistilo (Cruz-García et al., 2005). 
Las S-RNasas entran al tubo polínico en cruzas compatibles e incompatibles y son 
almacenadas en una vacuola. En cruzas incompatibles, se observa la ruptura de la 
vacuola liberando a las S-RNasas al citoplasma del tubo polínico, donde se degrada su 
RNA e inhiben su crecimiento. En cambio, en una cruza compatible la vacuola se 
mantiene estable y el tubo polínico crece hasta el ovario (Goldraij et al., 2006). 
Figura 3. La AI gametofítica está determinada por el 
haplotipo S del genotipo haploide del polen. El polen 
que tenga el mismo haplotipo S que pistilo S1S2, será 
rechazado (en este caso polen S1 y S2). Si no hay 
coincidencia alélica, el polen podrá germinar y crecer 
hasta fecundar el óvulo (en este caso S3) (García-
Valencia et al., 2013). 
 
 
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El primer antecedente para encontrar a la determinante masculina se obtuvo al analizar 
la secuencia del locus S de Antirrhinum hispanicum, de la familia Scrophulariaceae 
(Takayama e Isonagai, 2005). La región analizada contenía un gen que codificaba para 
una proteína de caja F, que se expresa de manera específica en antera y polen. Se 
localizaba a 9 kb río abajo del gen de la S2-RNasa y codificaba un polipéptido de 376 
aminoácidos con un dominio conservado de caja F cerca del amino terminal (Lai et al., 
2002). Posteriormente, se encontró en Prunus mume un candidato del gen de la 
determinante S en polen, llamado SLF (S-locus F-box) con los siguientes criterios: 1) se 
encontraba en una región altamente divergente del locus S, 2) presentaba diversidad 
haplotipo S específica dentro de los haplotipos S analizados, y 3) se expresaba 
específicamente en polen y no en pistilo (Entani et al., 2003). Finalmente, la evidencia 
contundente de que SLF codificaba la determinante masculina en polen, fue que al 
transformar granos de polen con el mismo haplotipo S del pistilo, estos eran rechazados 
(Sijacic et al., 2004). 
 
Genes modificadores 
Aunque la especificidad del rechazo del polen en la autoincompatibilidad sexual está 
determinada por la interacción entre la S-RNasa y SLF, no son suficientes para causar 
la respuesta de rechazo. Otros genes no ligados al locus S, son esenciales para el 
mecanismo de la AI, y son denominados genes modificadores (GM). Los genes 
modificadores se pueden clasificar en tres grupos (McClure et al., 2000): los factores 
del grupo I afectan de manera directa la expresión de los genes que determinan la 
especificidad (SLF y S-RNasa), por ejemplo, el locus MDF en Petunia axillaries, suprime 
la expresión de la S13-RNasa lo que resulta en un fenotipo de autocompatibilidad 
(Tsukamoto et al., 1999; 2003). 
El grupo II se compone por factores que interaccionan genética o bioquímicamente con 
las determinantes de especificidad sin afectar su expresión, por lo que su función radica 
en la respuesta de autoincompatibilidad. Los factores del grupo II identificados a la 
fecha son 120K (Hancock et al., 2005), HT-B (Goldraij et al., 2006), MdABCF (Meng, D 
 
 
18 
et al., 2014), NaStEP (Jiménez-Durán et al., 2013) y NaSIPP (Garcia-Valencia et al., 
2017), los cuales se describen posteriormente. 
Los factores del grupo III incluyen genes que se involucran en el mecanismo de rechazo 
del polen y también en otras interacciones de polen-pistilo. Algunas proteínas que 
podrían clasificar dentro de este grupo son: TTS (Trasmitting Tissue Specific), una 
proteína que atrae a los tubos polínicos en N. tabacum y N. alata (Cheung et al., 1995; 
Wu et al., 2000), PELPIII (class III Pistil-specific Extensin-like Protein), una proteína tipo 
extensina (de Graaf et al., 2003), SBP1 (S-RNase Binding Protein 1) que interacciona 
con dominios conservados de la S-RNasa (O’Brien et al., 2004), y NaTrxh, una 
tiorredoxina h que se secreta a la matriz extracelular del tejido de transmisión de N. 
alata y que reduce específicamente a las S-RNasas in vitro (Juárez-Díaz et al., 2006). 
 
120K 
120K es una glicoproteína que se encuentra en estilos de especies de Nicotiana y se 
une a la S-RNasa in vitro (Cruz-García et al., 2005). Tiene alto polimorfismo en tamaño 
entre diferentes especies de este género; un mayor tamaño de la proteína, correlaciona 
con que la especie presente rechazo S-específico. Usando RNA de interferencia (RNAi) 
se suprimió la expresión de 120K en híbridos de AC N. plumbaginifolia x AI N. alata, y 
se encontró que estas plantas transgénicas pierden la capacidad de rechazar el polen 
con el mismo haplotipo S, por lo que está participando en la AI. Sin embargo, conservan 
la capacidad de rechazar el polen de N. plumbaginifolia (rechazo interespecífico) 
(Hancock et al., 2005). Por inmunolocalización se determinó que 120K se incorpora a 
las vacuolas de los tubos polínicos en la que se encuentran las S-RNasas, en cruzas 
compatibles e incompatibles (Goldraij et al., 2006). 
 
HT-B 
El gen HT-B (High Top-Band) codifica para HT-B, una proteína pequeña (101 residuos) 
con una región rica en asparagina cerca del carboxilo terminal (Kondo y McClure, 
2008). Se expresa en N. alata, una especie autoincompatible,y no en N. plumbaginifolia 
 
 
19 
(autocompatible) (McClure et al., 1999). Se ha descrito en diferentes géneros de 
Solanaceae: Petunia (Kondo et al., 2002b; Sassa e Hirano, 2006; Puerta et al., 2009), 
Solanum (O’Brien et al., 2002; Kondo et al., 2002a), y Nicotiana (McClure et al., 1999). 
El análisis de RNA-blot muestra que el transcrito de HT se acumula en el estigma y en 
el estilo antes de la antesis (apertura de la flor) y se correlaciona con el 
desencadenamiento del rechazo S-específico en el estilo. Con RNAi se suprimió la 
expresión de HT-B en plantas transgénicas de Nicotiana y se evaluó su capacidad de 
rechazar el polen propio. Se encontró que estas plantas pierden la capacidad de 
hacerlo, por lo que se concluyó que HT-B es un gen modificador de la AI (McClure et 
al., 1999). Lo mismo ocurre en Petunia y Solanum (Sassa e Hirano, 2006; Kondo et al., 
2002a; O’Brien et al., 2002; Kondo et al., 2002b). Por inmunolocalización, se encontró 
que HT-B, al igual que las S-RNasas, entran a los tubos polínicos. Cuando el pistilo no 
expresa HT-B, en las plantas trangénicas RNAi:HT-B, la vacuola con las S-RNasas 
permanece estable, por lo que no hay rechazo del polen. Algo parecido ocurre en 
plantas de N. alata AI cuando la cruza es compatible, ya que se degrada HT-B y la 
vacuola con las S-RNasas permanece estable, por lo que el tubo polínico llega al 
ovario. Se propone que la estabilidad de HT-B es fundamental para el rechazo S-
específico (Goldraij et al., 2006). 
 
MdABCF 
El gen MdABCF se encontró en manzana (Malus domestica), el cual codifica para un 
transportador del grupo F de la familia de transportadores ABC, que está involucrado en 
el transporte de la S-RNasa al tubo polínico y se localiza en la membrana del mismo. 
Cuando se silencia con RNAi el gen MdABCF, la S-RNasa no puede entrar al tubo 
polínico y se pierde la capacidad de rechazar el polen propio. Además, se encontró que 
MdABDF transporta a la S-RNasas independiente del genotipo de la cruza (compatible 
o incompatible) y que se coordina con el citoesqueleto para transportarla (Meng et al., 
2014). 
 
 
 
20 
NaStEP 
NaStEP (Nicotiana alata Stigma Expressed Protein) es un homólogo de inhibidores de 
proteasas tipo Kunitz, que se expresa específicamente en estigmas maduros de 
Nicotiana alata AI y no en otras especies de Nicotiana compatibles (N. plumbaginifolia, 
N. tabacum, N. longiflora). Se localiza en vacuolas de las células estigmáticas y cuando 
el estigma es polinizado, se observa un aumento en su síntesis, y posteriormente su 
liberación al exudado estigmático involucrando rompimiento celular (Busot et al., 2008). 
Por inmunolocalización (figura 4) se observó que NaStEP ingresa a los tubos polínicos 
en cruzas compatibles e incompatibles en etapas tempranas posteriores a la 
polinización (6-9 horas) (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Figura 4. NaStEP se incorpora a los tubos polínicos compatibles e incompatibles, se muestran observaciones a las 6 
y 9 horas post-polinización. PT, tubo polínico; STC célula estigmática. (Modificado de Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Para probar si NaStEP se requería para el rechazo S-específico, se silenció el gen con 
RNAi:NaStEP en híbridos de N. plumbaginifolia AC x N. alata AI (figura 5). Los híbridos 
transformados se polinizaron con polen compatible e incompatible, y se encontró que 
hay pérdida del rechazo S-específico del polen, por lo que es un gen modificador 
estigmático de la AI sexual (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
 
 
21 
 
Además, se observó que en estas plantas transgénicas con NaStEP suprimida, los 
niveles de HT-B están disminuidos cuando los pistilos son polinizados en cruzas tanto 
compatibles como incompatibles (figura 6), en contraste con N. alata AI, en que 
solamente en las cruzas compatibles HT-B es degradado (Goldraij et al., 2006). Esto 
indica que NaStEP es necesaria para la estabilidad de HT-B en la respuesta de rechazo 
S-específico del polen propio (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Figura 6. Los niveles de HT-B disminuyen en una planta con NaStEP suprimida. A, pistilos del híbrido transformado 
con NaStEP suprimida se polinizaron con polen SC10 (incompatible) o S105 (compatible) y se evaluaron los niveles de 
HT-B y SC10-RNasa a las 16, 36 y 72 h después de la polinización. B, pistilos de N. alata con genotipo silvestre se 
polinizaron con polen SC10 (incompatible) o S105 (compatible) y se evaluaron los niveles de HT-B y SC10-RNasa a las 
16, 36 y 72 h después de la polinización (modificado de Jiménez-Durán et al., 2013). 
NaStEP se compone de 243 residuos (Busot et al., 2008) y tiene un punto isoeléctrico 
teórico de 4.9 (Cruz González Zamora, no publicado). Se realizó un modelo 
tridimensional de NaStEP y se utilizó para compararla estructuralmente con otros 
inhibidores tipo Kunitz, con el fin de inferir su posible función. Por análisis 
Figura 5. La supresión de NaStEP resulta en la pérdida del 
rechazo S-específico del polen propio. Cuando se poliniza 
un híbrido sin transformar Nicotiana plumbaginifolia AC 
RNAiStEP x Nicotiana alata AI S105S105, sólo el polen SC10 
(compatible) llega a la base del estilo. En contraste, en el 
híbrido transformado el polen S105 (incompatible) al igual 
que el SC10 (compatible) llegan a la base del estilo, lo que 
indica que se perdió el rechazo S-específico (modificado de 
Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
 
22 
bioinformático, se encontró similitud con un inhibidor de subtilisina/amilasa de cebada 
(ver figura 7) (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Figura 7. Modelo de la estructura tridimensional de NaStEP. A, Estructura muestra en amarillo las hebras β. El sitio 
reactivo de inhibidor de subtilisina se muestra en morado. Los puentes disulfuro se muestran según el esquema 
coloreado. B, topología del modelo en A, mostrando la conectividad clásica de la superfamilia Kunitz. C, 
comparación STAMP de la secuencia de aminoácidos con el inhibidor de subtilisina/α-amilasa de cebada. En la caja 
gris se marca el sitio reactivo de inhibidor de subtilisina (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Para probar su actividad como inhibidor de subtilisina, se realizó un ensayo de 
zimograma reverso (ver figura 8). El ensayo consiste en separar las proteínas en un 
SDS-PAGE con gelatina añadida al gel y después incubarlo con subtilisina, la cual 
degrada a la gelatina por su actividad proteolítica. Si se presentan bandas donde no se 
 
 
23 
degrada la gelatina, corresponden a las proteínas que están inhibiendo a la subtilisina. 
La aprotinina se utiliza como control, ya que presenta alta actividad como inhibidor. Se 
encontró que NaStEP presentó bandas donde no hubo degradación, lo que confirmó su 
actividad como inhibidor de subtilisina (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
Figura 8. NaStEP es un inhibidor de subtilisina. A, 
tinción con azul de Coomassie de NaStEP purificada. B, 
zimograma reverso donde NaStEP inhibe la actividad 
proteolítica de la subtilisina. C, Inmunoblot anti-NaStEP 
después de zimograma. (Jiménez-Durán et al., 2013). 
 
 
 
 
 
 
NaStEP no sólo presenta actividad como inhibidor de subtilisina (serin-proteasa), sino 
que también inhibe otras proteasas (figura 9). Usando azocaseína como sustrato, 
NaStEP inhibe diferentes proteasas como tripsina (serin-proteasa), termolisina 
(metaloproteasa) y papaína (cisteín-proteasa) (Nájera-Torres, no publicado). Sin 
embargo, se desconoce si su función como inhibidor de proteasas se requiere para el 
mecanismo de rechazo del polen. 
 
 
 
 
 
24 
NaSIPP 
NaSIPP (Nicotiana alata Self-Incompatibility Pollen Protein) es una proteína 
mitocondrial con actividad de acarreador de fosfatos que interacciona con NaStEP. 
Cuando se coexpresa NaStEP y NaSIPP en tubos polínicos de N. tabacum (figura 10), 
colocalizan en la mitocondria. Sin embargo, cuando sólo se expresa NaStEP, esta 
permanece en el citoplasma, lo que implica que es necesario la interaccióncon NaSIPP 
para que NaStEP se transloque a la mitocondria (García-Valencia et al., 2017). 
 
 
Figura 9. NaStEP inhibe diferentes tipos de proteasas. Se presenta la actividad total de diferentes proteasas en 
presencia y ausencia de NaStEP como inhibidor. (Nájera-Torres, no publicado). 
Figura 10. La interacción entre NaStEP y NaSIPP ocurre en la 
mitocondria de los tubos polínicos. A, Expresión de NaSIPP-
Tomate (rojo) muestra un patrón punteado característico de 
mitocondrias. B, La expresión de NaStEP-GFP (verde) se observa 
en el citosol del tubo polínico. C, Coexpresión de NaSIPP-tomate 
con NaStEP-GFP en canal rojo. D, canal verde. E, solapamiento de 
canal rojo y verde muestra colocalización de NaStEP y NaSIPP en 
mitocondria (García-Valencia et al., 2017). 
 
 
25 
El transcrito de NaSIPP se acumula de manera específica en polen maduro de 
Nicotiana spp., y en especies compatibles, el gen ha acumulado mutaciones, por lo que 
difícilmente producen una proteína funcional. El que tenga actividad de acarreador de 
fosfatos mitocondrial y se exprese específicamente en polen maduro, sugiere que su 
función puede estar relacionada con los requerimientos energéticos del crecimiento del 
tubo polínico. La supresión de NaSIPP en tubos polínicos se realizó bombardeando 
polen de N. alata con RNAi:NaSIPP, y el fenotipo observado fue la incapacidad de 
rechazar el polen con el mismo haplotipo S que el pistilo receptor, demostrando que 
NaSIPP es esencial para la AI. Los resultados son consistentes con un modelo en que 
la interacción de NaStEP y NaSIPP en tubos polínicos incompatibles desestabilizan la 
mitocondria y contribuyen a la muerte del tubo polínico por un mecanismo de muerte 
celular programada (García-Valencia et al., 2017). 
 
Modelo de rechazo del polen en Solanaceae 
La figura 11 incorpora tanto los eventos conocidos (texto en recuadros) después de la 
polinización en Solanaceae, como las hipótesis (texto sin recuadros) relacionadas con 
la función de NaStEP en el sistema de rechazo del polen. 
Tanto en cruzas compatibles como incompatibles, el polen germina y NaStEP entra a 
los tubos polínicos en etapas tempranas (Jiménez-Durán et al., 2013). Las S-RNasas, 
HT-B y 120K también ingresan a los tubos polínicos sin importar el haplotipo S (Goldraij 
et al., 2006). Las S-RNasas ingresan mediante el transportador ABCF (Meng et al., 
2014), y se compartamentalizan en una vacuola. Las proteínas 120K y HT-B se asocian 
al sistema endomembranoso (Goldraij et al., 2006). 
En una cruza compatible (parte superior del esquema), en la cual hay una interacción 
alelo S inespecífica entre S-RNasa y SLF (por ejemplo, SLF1-S2RNasa), resulta en la 
degradación de la proteína HT-B (Goldraij et al., 2006), por lo que la vacuola con las S-
RNasas se mantiene intacta, se traduce el RNA y el TP crece hasta alcanzar el ovario. 
La estabilidad de HT-B es dependiente de NaStEP (Jiménez-Durán et al., 2013), por lo 
 
 
26 
que se hipotetiza que en una cruza compatible NaStEP también se degrada, dejando 
libre a una posible proteasa que degrada HT-B. 
En una cruza incompatible (parte inferior del esquema), al haber una interacción S alelo 
específica (por ejemplo, SLF1-S1RNasa), HT-B se mantiene estable dentro del TP, por 
lo que favorece el rompimiento de la vacuola y se liberan las S-RNasas al citoplasma, 
hay una degradación del RNA y se inhibe el crecimiento del tubo polínico (Goldraij et 
al., 2006). Como en una cruza incompatible HT-B se mantiene estable y depende de la 
presencia de NaStEP (Jiménez-Durán et al., 2013), se hipotetiza que el posible 
mecanismo consiste en que NaStEP inhibe a la proteasa de HT-B, ya que NaStEP 
presenta actividad de inhibidor de proteasas in vitro (Jiménez-Durán et al., 2013; 
Nájera-Torres, no publicado). Por otro lado, también se conoce que NaStEP 
interacciona con NaSIPP en mitocondria, lo cual ha llevado a proponer que en una 
cruza incompatible la interacción NaStEP-NaSIPP podría desestabilizar la mitocondria y 
contribuir a la muerte del TP por un mecanismo de muerte celular programada (García-
Valencia et al., 2017). 
 
 
 
27 
 
 
 
NaStEP entra al TP S-RNasas entran al TP mediante ABCF
S-RNasas se 
comparta-
mentalizan en 
vacuolas
120K y HT-B entran 
al TP y se asocian al 
sistema endomem-
branoso
Interacción S-alelo 
inespecífica
SLF1-S2RNasa
HT-B se degrada
Vacuolas con las S-
RNasas se 
mantienen intactas
Traducción del RNA
TP crece hasta 
alcanzar el ovario
NaStEP interacciona 
con NaSIPP en 
mitocondria de TP
NaStEP entra al TP S-RNasas entran al TP mediante ABCF
S-RNasas se 
comparta-
mentalizan en 
vacuolas
120K y HT-B entran 
al TP y se asocian al 
sistema endomem-
branoso
Interacción S-alelo 
específica
SLF1-S1RNasa
HT-B se mantieneVacuolas con las S-
RNasas se rompen
Degradación del 
RNA
Inhibición del 
crecimiento del TP
NaStEP interacciona 
con NaSIPP en 
mitocondria de TP
Cruza compatible
Cruza incompatible
¿NaStEP se degrada?
¿Proteasa de HT-B activa?
¿NaStEP se mantiene?
¿NaStEP inhibe 
proteasa de HT-B?
¿Desestabilización 
mitocondrial que 
lleva a MCP?
Figura 11. Modelo de AI en Solanaceae. Esquema que indica los eventos conocidos después de la 
polinización en Solanaceae (en recuadros) y los eventos que se hipotetizan (texto sin recuadros) con relación 
a la función de NaStEP en cruzas compatibles e incompatibles (modificado de Cruz-García, no publicado y 
García-Valencia, 2018). 
 
 
28 
Justificación 
En la actualidad se conoce que la estabilidad de la vacuola que contiene a las S-
RNasas en una cruza compatible depende de que HT-B se degrade, y también se sabe 
que NaStEP es un regulador positivo de HT-B. Sin embargo, no se conoce si NaStEP 
en una cruza compatible también se degrada pero se hipotetiza que sí, y para probarlo, 
en este trabajo se comenzó con el establecimiento de las condiciones y parámetros 
para determinar si la aplicación exógena de NaStEP nativa y funcional en plantas 
silenciadas con RNAi:NaStEP, restablece la AI. Con este sistema establecido se podrá 
evaluar la degradación de NaStEP en los tubos polínicos en una cruza compatible. 
 
Hipótesis 
En una planta transgénica de Nicotiana con NaStEP suprimida, al aplicar la proteína 
nativa de manera exógena se debe restablecer la autoincompatibilidad. 
 
Objetivos 
• Purificar a NaStEP nativa de pistilos de N. alata. 
• Determinar si NaStEP nativa aplicada de manera exógena ingresa a los tubos 
polínicos en cruzas compatibles e incompatibles. 
• Determinar si la aplicación exógena de NaStEP nativa restablece la 
autoincompatibilidad. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
Metodología 
 
Purificación de NaStEP nativa de pistilos de N. alata 
1. Pulverizar 2 g pistilos de N. alata con nitrógeno líquido y agregar solución 
amortiguadora de extracción (acetato de potasio 50 mM pH 5.5 + PMSF 2mM) en 
el mortero, revolver hasta obtener una consistencia de helado. 
2. Pasar la muestra a tubo de teflón e incubar en hielo durante 20 minutos. 
3. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 minutos a 4ºC. Tomar sobrenadante sin la nata 
que se forma en la superficie. 
4. Pasar la muestra por la columna de intercambio aniónico débil Hi-Trap Capto 
DEAE 1 mL (GE 17505501) previamente equilibrada con solución de acetato de 
potasio 50 mM pH 5.5 y colectar la fracción no unida. Después lavar con solución 
de acetato de potasio 50 mM pH 5.5 + NaCl 1M sin agradiente. 
5. Precipitar la fracción no unida con sulfato de amonio al 60% O/N a 4ºC. 
6. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 20 minutos y resuspender botón con 1.5 mL de 
acetato de potasio 50 mM pH 4.0. 
7. Desalar la muestra con Hi-Trap Desalting de 5 mL (GE17-1408-01 SIGMA), 
fraccionando de mL en mL. 
8. Juntar las fracciones sin sulfato de amonio, con proteína. 
9. Aplicar las fracciones a columna HiTrap Capto S 1 mL (GE 17371751) previamente 
equilibrada con acetato de potasio 50 mM pH 4.0. 
10. Eluir con gradientede NaCl 1M de 0 al 100%, fraccionando cada 500 µL. 
11. Precipitar las fracciones que tengan proteína con 4 volúmenes de acetona al 100% 
O/N a -20ºC. 
12. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 20 minutos y resuspender botón con 100 µL de 
acetato de potasio 50 mM pH 4.0. Cuantificar la cantidad de proteína en la muestra 
a 280 nm en BioDrop µLite Spectrophotometer (80-3006-51). 
Los pasos de cromatografía se realizaron en un equipo de FPLC Äkta Pure 25 L (GE 
29018224). 
 
 
 
30 
Monitoreo de la purificación de NaStEP 
1. Preparar las muestras de los pasos de purificación colocando por cada 5 µL de 
estas, 1 µL de amortiguador de carga (3.75% SDS, 0.05M DTT, 5 mM EDTA, 15% 
sacarosa, 0.0012% azul de bromofenol y 0.15M Tris-HCl pH 6.8). El extracto crudo 
y la fraccion no unida a DEAE hervirlas por 10 minutos. 
2. Separar electroforéticamente 5 µL de extracto crudo, 5 µL de la fracción no unida a 
DEAE, 5 µL de filtración molecular y 10 µL de la fracción 7 de Capto S en un gel 
SDS-PAGE al 12%. Realizar por duplicado. 
3. Teñir las proteínas de un gel con azul de Coomassie. 
 
 
Inmunodetección de NaStEP 
1. Transferir el segundo gel a una membrana de Immobilon-P Transfer Membrane 
con un tamaño de poro de 0.45 µm (Millipore IPVH00010) 40 minutos a 80 mA. 
2. Incubar con solución de bloqueo: 5% leche en PBS 1X (diluído de una solución 
10X: 1.37 M NaCl, 27mM KCl, 43 mM Na2HPO4⋅7H2O, 14 mM NaH2PO4⋅H2O, pH 
7.3 ajustado con NaOH y esterilizado en autoclave) durante 1 h a temperatura 
ambiente. 
3. Desechar solución y agregar anticuerpo primario policlonal hecho en conejo anti-
NaStEP (contra el péptido WEGSKDGMPVKFFT) dilución 1:10,000 en solución 
de bloqueo. Dejar toda la noche a 4ºC. 
4. Guardar anticuerpo primario a -20ºC y lavar la membrana 2 veces con PBS 1x + 
0.1% Tween-20 5 min y 10 min. 
5. Agregar anticuerpo hecho en cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina 
(invitrogen G21079) dilución 1:10,000 e incubar por 1 h a temperatura ambiente. 
6. Lavar con PBS 1x + 0.1% Tween-20 3 veces 10 min cada uno. 
7. Incubar membrana con amortiguador pH 9.5 (12.1 g/L tris-HCl, 5.8 g/L NaCl,1 g/L 
MgCl2) durante 10 minutos. 
 
 
31 
8. En 10 mL de amortiguador pH 9.5 agregar 100 µL de nBT (nBT 33 mg/mL en 
70% DMSO) y 100 µL de BCIP (BCIP 17 mg/mL en 100% DMSO). Dejar revelar 
hasta la intensidad deseada. 
9. Detener la acción de la fosfatasa alcalina con agua y 20 µL de EDTA 0.5 M. 
 
Actividad de NaStEP como inhibidor de subtilisina 
1. Preparar lo siguiente en tubos de 600 µL por separado: 
• Blanco: 50 µL solución amortiguadora (acetato de potasio 50 mM pH 4.0, 
acetato de potasio 50 mM pH 5.5, fosfato de sodio 50 mM pH 6.0, y tris-HCl 
50 mM pH 7.0, dependiendo del ensayo). 
• Proteasa: 20 mU subtilisina + solución amortiguadora para volumen final de 
50 µL. 
• Proteasa + inhibidor: 20 mU subtilisina + 1 µg de NaStEP + solución 
amortiguadora para volumen final de 50 µL. 
 
2. Incubar 15 minutos a 37ºC. 
3. Agregar a cada tubo 50 µL de azocaseína al 1% en la solución amortiguadora con 
el pH correspondiente a cada ensayo. 
4. Incubar 10 minutos a 37ºC. 
5. Agregar 20 µL de TCA al 20% para detener la reacción y agitar con vortex. 
6. Centrifugar a 14,000 rpm durante 10 minutos. 
7. En una placa de 96 pozos Nunc MaxiSorp flat-bottom (Invitrogen 44-2404-21) 
colocar 20 µL de NaOH 2N por cada muestra. 
8. Agregar al pozo 100 µL del sobrenadante de la reacción. 
9. Agitar en agitador de placas IKA MS 3 digital (Z645044 ALDRICH) por 30 
segundos. 
10. Medir absorbancia a 450 nm en lector de placas Epoch (BioTek 1310301). 
 
 
 
32 
Inmunolocalización de NaStEP y calosa. 
 
Material vegetal: polen de N. alata SA2SA2 y de N. alata SC10SC10 , pistilos del híbrido 
transformado N. plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0 y de N. alata 
SC10SC10. 
1. Emascular flores 48 h antes de antesis. 
2. Después de 3 días, ya que los estigmas estén receptivos (húmedos), colocar en el 
estigma 1 µL de NaStEP (200 ng). 
3. Esperar 1 hora a que se absorba y colectar una antera de una flor de N. alata 
SC10SC10 (incompatible) y otra de SA2SA2 (compatible). 
4. Polinizar las flores emasculadas con el polen (compatible o incompatible) que 
corresponda, cubriendo toda la superficie del estigma. 
5. Fijar el tejido en una solución de formaldehído al 4% en amortiguador de PBS 1X 
durante 2 h a temperatura ambiente. 
6. Realizar 3 lavados con amortiguador PBS 1X durante 10 min cada uno. 
7. Deshidratar el tejido en una serie gradual de etanoles (30, 50, 70, 85, 96, y 100%) 
por 30 min en cada uno y en hielo. 
8. Colocar el tejido en etanol absoluto por 30 min a 37ºC (hacer lavados cada 30 min 
hasta que el color verde sea extraído completamente). 
9. Infiltrar el tejido en una mezcla de EtOH absoluto - Steedman’s wax (Electron 
Mycroscopy Sciences 19312) 3:1, 1:1 y 1:3 por 12 h en cada uno a 37ºC. 
10. Infiltrar en Steedman’s wax pura por 12h a 37ºC. Repetir cambiando la cera por 
cuatro veces. 
11. Incluir el tejido en un molde de metal con Steedman’s wax líquida. Orientar el tejido 
con ayuda de una aguja de disección. 
12. Obtener los bloques del tejido con ayuda de una navaja. 
13. Montar los bloques en pedazos de madera. 
14. Realizar cortes de 10 µm de grosor en un microtomo de rotación. 
15. Colocar los cortes en un baño de flotación con agua destilada a temperatura 
ambiente y capturarlos en portaobjetos Poly-Prep Slides (SIGMA P0425-72EA). 
 
 
33 
16. Dejar secar los cortes perfectamente por dos días a temperatura ambiente y 
posteriormente guardarlos libres del polvo a 4ºC hasta su uso. 
17. Eliminar la cera sumergiendo los cortes en EtOH absoluto por 10 min. Repetir tres 
veces. Nota: la primera vez a 37ºC. 
18. Hidratar el tejido en una serie gradual de EtOH (75, 50, 25%) por 15 min en cada 
uno. 
19. Colocar las preparaciones en PBS 1X por 15 min. 
20. Secar las preparaciones con papel filtro o gasa y marcar alrededor de los cortes 
con un plumón Aqua-Hold Pap (Electron Microscopy Sciences 71311). 
21. Colocar las preparaciones en una cámara húmeda y aplicar 100 µL de solución de 
bloqueo (10% BSA en amortiguador de PBS 1X) por cada preparación. Incubar por 
1 h a temperatura ambiente con agitación. 
22. Eliminar la solución de bloqueo y colocar los anticuerpos primarios (dilución 
1:2,000 anti-NaStEP y anti-calosa). Incubar el anticuerpo primario por toda la 
noche a 4°C. 
23. Guardar los anticuerpos primarios y lavar tres veces con PBS 1X por 10 min cada 
uno con agitación. 
24. Aplicar los anticuerpos secundarios: goat a-rabbit Alexa 488 dilución 1:200 para 
anti-NaStEP y goat anti-mouse Alexa 568 1:200 para anti-calosa. Incubar por 4 h a 
temperatura ambiente con agitación. Mantener en obscuridad. 
25. Lavar 3 veces con PBS 1X por 10 min cada uno y en obscuridad. 
26. Agregar a las preparaciones medio de montaje Clarion Mounting Medium (C0487 
SIGMA) y sellar con barniz de uñas transparente. 
27. Guardar las preparaciones a 4ºC en obscuridad. 
28. Las observaciones se realizan en un microscopio confocal de fluorescencia ZEISS 
LSM 510 META. 
 
 
 
 
 
 
34 
Squash de estilos polinizados y tinción con azul de anilina de tubos polínicos 
 
Material vegetal: polen de N. alata SA2SA2 y de N. alata SC10SC10 , pistilos del híbrido N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0 y del híbrido no transformado N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI SC10S0. 
 
1. Emascular flores 48 h antes de antesis. 
2. Después de 3 días, ya que los estigmas estén receptivos, colocar en el estigma 1 
µL de NaStEP (200 ng). 
3. Esperar 1 hora a que se absorba y mientras colectar una antera de una flor 
SC10SC10 (incompatible) y otra de SA2SA2 (compatible). 
4. Polinizar las flores emasculadas con el polen (compatible o incompatible) que 
corresponda. 
5. Colectar a las 72 h post-polinización y fijar en etanol-ácido acético 3:1 durante 1 
día. 
6. Transferirestilos a una solución de sulfito de sodio al 10% y meter en autoclave 
durante 5 minutos (comienza a contar cuando se llega a 121ºC). 
7. Transferir estilos a solución de azul de anilina 0.1% por lo menos 12 h. 
8. Montar estilos en portaobjetos adicionando azul de anilina y hacer el aplastado con 
un cubreobjetos. 
9. Sellar con barniz de uñas transparente. 
10. Observar en microscopio de epifluorescencia a 360 nm. 
Nota: siempre mantener las preparaciones en obscuridad y a 4ºC. 
 
 
 
 
 
 
 
35 
Resultados 
 
Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata. 
Se realizó un protocolo de purificación de NaStEP distinto al reportado por Busot et al. 
(2008) con el propósito de mejorar el rendimiento y simplificar los pasos de purificación. 
NaStEP es una proteína de aproximadamente 26 kDa y tiene un punto isoeléctrico 
teórico de 4.9 (Cruz González-Zamora, no publicado). Dado su carácter ácido, se 
utilizaron cromatografías de intercambio iónico para purificarla, modificando el protocolo 
reportado por Uchikoba et al., (1995). 
La primera cromatografía fue de intercambio aniónico débil DEAE GE 17505501 (figura 
12). La fracción no unida se precipitó con sulfato de amonio al 60%. Posteriormente, la 
muestra se desaló utilizando una cromatografía de filtración molecular con la columna 
Hi-trap desalting GE17-1408-01 SIGMA (figura 13). Finalmente, se realizó una 
cromatografía de intercambio catiónico Hi-trap Capto S (GE 17371751), eluyendo con 
un gradiente de cloruro de sodio (figuras 14 y 15). Se precipitaron con acetona las 
fracciones resultantes y se resuspendieron con solución amortiguadora de acetatos 50 
mM pH 4.0. 
 
Figura 12. 
Cromatograma del 
intercambio catiónico 
débil DEAE. Se colectó 
la fracción no unida 
que corresponde al 
pico de mayor 
absorbancia del 
minuto 19 al 26 (en 
azul). 
 
 
36 
 
Figura 13. Cromatograma de la filtración molecular con la columna Hi-Trap desalting. Se colectó el pico de mayor 
absorbancia a 280 nm del minuto 2 al 3 (pico azul), para descartar el sulfato de amonio (pico naranja de mayor 
conductividad). 
 
Figura 14. Cromatograma del intercambio catiónico fuerte Hi-Trap Capto S. Se colectaron las fracciones de la 
elución 7 a 15 de la fase de elución con gradiente de cloruro de sodio 1 M. 
Cond 
 NaCl (1M) 
UV 
 
 
37 
 
Figura 15. Acercamiento de la figura 14 en la fase de elución con gradiente de cloruro de sodio 1M. Se colectaron 
las fracciones 7 a 15. 
 
En la figura 16 se muestra la separación por SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en 
los diferentes pasos de la purificación y un ensayo tipo réplica de Western-blot con 
anticuerpo anti-NaStEP. El anticuerpo reconoció una banda de aproximadamente 26 
kDa y en algunos pasos de purificación también reconoció una banda de menor peso 
molecular. 
 
UV 
Cond 
NaCl (1M) 
 
 
38 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata. A; 5 µL de Extracto Crudo, fracción No 
Unida a DEAE y de Filtración Molecular, 10 µL de fracción 7 unida a Capto S (Capto S 7) se separaron por SDS-
PAGE con gel de poliacrilamida al 12% y se realizó una tinción con azul de Coomassie. B. Las proteínas se 
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se inmunodetectaron con anticuerpo anti-NaStEP 1:10,000. 
NaStEP corresponde a la banda de aprox. 26 kDa y está presente en todas las fracciones. MP, marcador de 
peso molecular; EC, extracto crudo; NU DEAE, fracción no unida a columna de intercambio aniónico DEAE; 
FM, filtración molecular Hi-Trap desalting; CS 7. fracción 7 de la elución con gradiente de NaCl de 
cromatografía de intercambio catiónico fuerte Hi-Trap Capto S. 
 
 
 
39 
NaStEP inhibe a la subtilisina 
NaStEP es un inhibidor de proteasas tipo Kunitz e inhibe a la subtilisina (Jiménez-Durán 
et al., 2013). Con el fin de determinar si las fracciones obtenidas de la purificación 
inhibían a la subtilisina, se realizó un ensayo de actividad. Se utilizó azocaseína como 
el sustrato de degradación de la subtilisina, y la propiedad que se midió fue la 
absorbancia a 450 nm del colorante azoico liberado por la proteólisis. A mayor 
absorbancia, mayor actividad proteolítica de la subtilisina, y cuando se realiza el ensayo 
agregando NaStEP, se espera que la actividad proteolítica disminuya. Se hizo el 
ensayo sin agregar NaStEP (únicamente con subtilisina) a diferentes valores de pH 
(figura 17), y se observa que la actividad proteolítica aumenta al incrementar el pH, 
presentando su máxima actividad a pH 7. Como a pH 4 y 5.5 no presentó suficiente 
actividad como para medir su inhibición, el ensayo con NaStEP como inhibidor se 
realizó únicamente a pH 6.0 y 7.0, utilizando fracciones de NaStEP resuspendidas en 
solución amortiguadora de acetatos pH 4.0. En estos valores de pH, la actividad de 
subtilisina fue diferente estadísticamente en presencia y ausencia de NaStEP. 
 
Figura 17. Actividad proteolítica de la subtilisina. Se midió la actividad de 10 mU de subtilisina a pH 4.0, 5.5, 
6.0 y 7.0, y se evalúa la actividad en presencia de 1 µg de NaStEP a pH 6.0 y 7.0. Letras diferentes indican 
diferencia significativa *p<0.05, n=3. 
 
 
40 
 
 
A partir de los datos de la gráfica anterior (figura 17), a pH 6.0 y 7.0 se calculó el 
porcentaje de inhibición que presentó NaStEP sobre la actividad proteolítica de la 
subtilisina (figura 18). Se utilizó la siguiente fórmula: 
		%	𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 100 − .(012	345	657616849)
(012;<= 657616849)
𝑥	100? 
Se encontró que presentó una inhibición de 78% y 85% (a pH 6.0 y 7.0) 
respectivamente, con lo que se concluyó que la proteína está activa y se podía utilizar 
para los experimentos subsecuentes. 
 
 
 
Figura 18. Porcentaje de inhibición de la actividad proteolítica de la subtilisina. Se muestran los porcentajes de 
inhibición de 10 mU de subtilisina en presencia de 1 µg de NaStEP a pH 6.0 y 7.0 respectivamente. Letras 
diferentes indican diferencia significativa con *p<0.05, n=3. 
b 
 
 
41 
NaStEP aplicada de manera exógena ingresa a los tubos polínicos en cruzas 
compatibles e incompatibles 
 
Para evaluar si NaStEP aplicada de manera exógena a los híbridos de Nicotiana 
RNAi:NaStEP ingresa a los tubos polínicos en cruzas compatibles e incompatibles, se 
agregó NaStEP nativa a estigmas receptivos y posteriormente se polinizó con polen 
compatible e incompatible. Pasadas 6 horas, se colectaron los pistilos y se evaluó 
mediante ensayo de inmunolocalización su ingreso a los tubos polínicos. Se utilizaron 
como anticuerpos primarios anti-NaStEP y anti-calosa. Este último para delimitar los 
tubos polínicos porque inmunodetecta su pared celular de calosa. 
En la figura 19 panel A, los híbridos transformados N. plumbaginifolia AC X N. alata AI 
RNAi:NaStEP SC10S0 al polinizarlos con polen compatible e incompatible, crecieron los 
tubos polínicos y NaStEP (verde) no se observa, únicamente se detecta una señal roja 
que corresponde a la calosa de los tubos polínicos. En N. alata silvestre (figura 20, 
panel A) se observa que NaStEP es muy abundante en el estigma después de la 
polinización, y se incorpora a los tubos polínicos en cruzas compatibles como 
incompatibles, lo cual concuerda con lo reportado en Jiménez-Durán et al., (2013). 
Ahora, al agregar NaStEP pura en estigmas de las plantas silenciadas para NaStEP (N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0) y después de polinizar (figura 
21, panel A), se observa su presencia en el estigma (aunque en menor abundancia que 
en N. alata silvestre) y se incorpora a los tubos polínicos en crecimiento, en cruzas 
tanto compatibles como incompatibles. En el panel B de las figuras 19, 20 y 21, se 
muestra un diagrama del pistilo con el área de observación de los tubos polínicos, la 
cual fue muy cercana a la superficie estigmática. 
 
 
42 
 
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45 
Restableciendo la autoincompatibilidad de híbridos de Nicotiana autocompatibles 
mediante la función de NaStEP 
Para determinar si la aplicación exógena de NaStEP restablece la respuesta de 
autoincompatibilidad en la línea de plantas silenciadas RNAi:NaStEP, se agregó 
NaStEP a estigmas receptivos y se polinizaron flores con polen incompatible y 
compatible. Se colectaron los pistilos a las 72 horas post-polinización y mediante tinción 
con azul de anilina (que tiñe la calosa de los tubos polínicos), se observó con el 
microscopio de fluorescencia si los tubos polínicos habían alcanzado la base del estilo, 
o si había ocurrido la respuesta de rechazo del polen (figura 22). En el híbrido no 
transformado N. plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0 (panel A), son 
numerosos los tubos polínicos compatibles (SA2) que alcanzan la base del estilo, 
mientras que no se observa ninguno incompatible (SC10). En contraste, en el híbrido 
transformado N. plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0 (panel B), tanto 
los tubos polínicos compatibles como incompatibles llegan a la base del estilo. Cuando 
se agregó de manera exógena NaStEP desnaturalizada por calor (panel C), los TPs 
que llegaron a la base del estilo en cruzas compatibles e incompatibles también fueron 
numerosos. Cuando se agregó de manera exógena NaStEP nativa a pistilos de N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0, los tubos polínicos compatibles 
son numerosos pero el número de tubos polínicos incompatibles es muy reducido (0 a 
4). Se hicieron 20 repeticiones del ensayo con polen incompatible (tabla 1), y se 
cuantificaron tanto los tubos polínicos en la base del estilo (TP BE) y como los que 
habían germinado (TP G), para calcular un porcentaje. 
Se hizo un análisis de residuos utilizando la prueba de Grubbs con a=0.01 en el 
programa Prism 7 (tabla 1) para saber si algún dato se comportaba de manera 
aleatoria (outliers) y se eliminó el valor de 73.7%, obteniéndose así un porcentaje de 
tubos polínicos incompatibles que alcanzan la base del estilo agregando NaStEP de 
manera exógena en los híbridos silenciados RNAi:NaStEP de 20.5	 ± 9.5	%, lo que en 
términos de inhibición del crecimiento corresponde a 79.5	 ± 9.5	%. Se realizó un 
histograma del conteo de tubos polínicos en la base del estilo (figura 23), en el cual se 
observa que en la mayoría de las repeticiones del ensayo únicamente llegaron de 0 a 4 
tubos polínicos incompatibles. 
 
 
46 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pistilo
A.
híbrido no 
transformado N. 
plumbaginifolia AC X 
N. alata AI SC10S0 
B.
híbrido transformado 
N. plumbaginifolia
AC X N. alata AI 
RNAi:NaStEP SC10S0 
C. 
híbrido transformado 
N. plumbaginifolia AC 
X N. alata AI 
RNAi:NaStEP SC10S0 + 
NaStEP 
desnaturalizada
D.
híbrido transformado 
N. plumbaginifolia AC 
X N. alata AI 
RNAi:NaStEP SC10S0 + 
NaStEP 
Polen compatible SA2 Polen incompatible SC10
E. 
Estigma 
Base del 
estilo 
EP
EP
EP
EP
EP
EP
TPs
TPs
TPs
TPs
TPs
0 a 4 TPs
no hay TPs
TPs
Figura 22. Evaluación del restablecimiento de la autoincompatibilidad de los híbridos N. plumbaginifolia AC X N. alata 
AI RNAi:NaStEP SC10S0. Aplastados de cruzas compatibles e incompatibles de 72 h pp (post polinización), teñidos con 
azul de anilina y observados por microscopia de fluorescencia. Los tubos polínicos (TPs) se distinguen por la presencia 
de tapones de calosa (se señalan con una flecha). Polinizando con polen compatible (SA2), los tubos polínicos en la 
base del estilo fueron numerosos en todos los ensayos (A-D). Polinizando con polen incompatible (SC10), no se 
observaron TPs en el híbrido no transformado (A), los TPs son numerosos en el híbrido RNAi:NaStEP (B) y en el 
híbrido RNAi:NaStEP agregando NaStEP desnaturalizada (C). Sin embargo, cuando se agregó NaStEP nativa (D), se 
observaron de 0 a 4 TPs incompatibles en la base del estilo, por lo que se restablece la AI. Barras = 50 µm. E, en todos 
los ensayos se verificó que el polen hubiera germinado a nivel del estigma. TPs, tubos polínicos; EP, epidermis. 
 
 
47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ensayo TP BE TP G X TP BE X TP G % (TP BE/TP G)
An.R (Grubbs 
alfa=0.01)
Datos 
ordenados
% inhibición 
crecimiento
1 5 a 9 20-39 7 29.5 23.7 23.7 6.8 93.2
2 0 a 4 20-39 2 29.5 6.8 6.8 6.8 93.2
3 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 6.8 93.2
4 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 6.8 93.2
5 5 a 9 0 a 19 7 9.5 73.7 14.1 85.9
6 15 a 19 40 a 59 17 49.5 34.3 34.3 21.1 78.9
7 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 21.1 78.9
8 0 a 4 20-39 2 29.5 6.8 6.8 21.1 78.9
9 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 21.1 78.9
10 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 21.1 78.9
11 5 a 9 40 a 59 7 49.5 14.1 14.1 21.1 78.9
12 15 a 19 40 a 59 17 49.5 34.3 34.3 21.1 78.9
13 5 a 9 20 a 39 7 29.5 23.7 23.7 21.1 78.9
14 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 23.7 76.3
15 5 a 9 20 a 39 7 29.5 23.7 23.7 23.7 76.3
16 0 a 4 20 a 39 2 29.5 6.8 6.8 23.7 76.3
17 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 34.3 65.7
18 0 a 4 0 a 19 2 9.5 21.1 21.1 34.3 65.7
19 10 a 14 20 a 39 12 29.5 40.7 40.7 40.7 59.3
20 0 a 4 20 a 39 2 29.5 6.8 6.8
N 20.0 19.0 19.0 19.0
Promedio 23.0 20.5 20.5 79.5
Mediana 21.1 21.121.1 78.9
Moda 21.1 21.1 21.1 78.9
DE 15.0 9.5 9.5 9.5
CV(%) 65.4 46.2 46.2 11.9
0
5
10
15
2 7 12 17
Fr
ec
ue
nc
ia
 
Número de TPs en la BE
Histograma de TPs en la base del estilo
Híbrido RNAi:NaStEP SC10S0 + NaStEP exógena + 
polen incompatible (SC10)
Tabla 1. Cuantificación de tubos polínicos a las 72 h post-polinización que alcanzan la base del estilo en 
el híbrido N. plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP SC10S0 agregando NaStEP nativa y polen 
incompatible (SC10). 
TP BE: tubos polínicos en la base del estilo, TP G: tubos polínicos que germinaron, X TP BE: promedio de tubos 
polínicos en la base del estilo, X TP G: promedio de tubos polínicos que germinaron, % (TP BE/TP G): 
porcentaje de tubos polínicos que llegan a la base del estilo entre los que germinaron, An.R: análisis de 
residuos para identificar datos aleatorios (prueba de Grubbs con a=0.01) identifica 73.7% como dato 
aleatorio, una vez eliminado el dato aleatorio, se ordenaron los datos de menor a mayor y el promedio de TPs 
que llegaron a la base del estilo fue de 20.5%, % inhibición del crecimiento = 100 - %(TP BE/ TP G). 
 
 
48 
 
 
En la tabla 2 se muestran las polinizaciones compatibles (100%) y las incompatibles 
(0%) que se obtuvieron en los ensayos de la figura 22. En todas las polinizaciones 
compatibles los TPs en la base del estilo fueron incontables (se reporta como 100%). 
En el híbrido no transformado, ningún TP incompatible que germinó llegó a la base del 
estilo (0%). En el híbrido RNAi:NaStEP, todos los TPs incompatibles que germinaron 
llegaron a la base del estilo, lo cual sucedió de la misma manera al agregar a NaStEP 
desnaturalizada. Cuando se agregó de manera exógena NaStEP nativa y polen 
incompatible, el 20.5% de los tubos polínicos que germinaron llegaron a la base del 
estilo. En la figura 24, se presenta una gráfica de los resultados de la tabla 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2. Porcentaje de tubos polínicos que alcanzaron la base del estilo entre los que germinaron a las 72 h 
post-polinización en cruzas compatibles (polen SA2) e incompatibles (polen SC10) 
(100%) polinización compatible (TPs incontables que alcanzan la base del estilo), (0%) polinización 
incompatible (ningún TP que germinó creció hasta la base del estilo), (n) número de réplicas independientes en 
cada ensayo de polinización. 
Pistilo
Hibrido No 
transformado 
SC10 S0
Híbrido SC10S0
RNAi: NaStEP
Híbrido SC10S0
RNAi:NaStEP + 
NaStEP 
desnaturalizada
Híbrido SC10S0
RNAi:NaStEP + 
NaStEP 
Polen 
compatible 
SA2
100 % (n=3) 100 % (n=3) 100 % (n=3) 100 % (n=3)
Polen 
incompatible 
SC10
0 % (n=3) 100 % (n=3) 100 % (n=3)
20.5 ± 9.5 %
(n=19)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hibrido No
transformado SC10 S0
Híbrido SC10S0 RNAi:
NaStEP
Híbrido SC10S0
RNAi:NaStEP + NaStEP
desnaturalizada
Híbrido SC10S0
RNAi:NaStEP + NaStEP
%
 (
T
P
s
b
a
se
 d
e
l e
st
ilo
/T
P
s
q
u
e
 g
e
rm
in
a
ro
n
)
% TPs base del estilo/TPs que germinaron
Polen compatible (SA2)
Polen incompatible (SC10)
Híbrido No 
transformado SC10S0
Híbrido SC10S0 
RNAi:NaStEP
Híbrido SC10S0 
RNAi:NaStEP + NaStEP 
desnaturalizada
Híbrido SC10S0 
RNAi:NaStEP + NaStEP
Polen compatible SA2
Polen incompatible SC10
Figura 23. Histograma del conteo de tubos 
polínicos a las 72 h post-polinización que 
alcanzan la base del estilo en el híbrido N. 
plumbaginifolia AC X N. alata AI RNAi:NaStEP 
SC10S0 agregando NaStEP exógena y polen 
incompatible (SC10). En la mayoría de las 
repeticiones llegaron de 0 a 4 tubos polínicos a la 
base del estilo. 
 
 
49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 24. Gráfica de la tabla 2. Porcentaje de TPs en la base del estilo entre los que germinaron (% TPs BE/ TPs 
G). En todas las polinizaciones compatibles (color verde), los TPs en la base del estilo fueron incontables 
(100%). En el híbrido no transformado, ningún TP incompatible que germinó llegó a la base del estilo (0%). En 
el híbrido RNAi:NaStEP, todos los TPs incompatibles que germinaron llegaron a la base del estilo (100%), lo 
mismo sucedió al agregar a NaStEP desnaturalizada (100%). Cuando se agregó NaStEP nativa y polen 
incompatible, el 20.5% de los tubos polínicos que germinaron llegaron a la base del estilo. 
 
 
50 
Discusión 
En el modelo de rechazo del polen, en cruzas compatibles la vacuola que contiene las 
S-RNasas permanece estable y depende de la degradación de HT-B (Goldraij et al., 
2006). La presencia de NaStEP es necesaria para la estabilidad de HT-B (Jiménez-
Durán et al., 2013), por lo que en una cruza compatible se esperaría que NaStEP 
también se degradará. Con este trabajo se buscó determinar si la aplicación exógena 
de NaStEP en plantas silenciadas RNAi:NaStEP restablecía la AI, lo cual debería de 
ocurrir si NaStEP ingresa a los tubos polínicos. Si es así, más adelante se podría 
determinar si NaStEP aplicada de manera exógena se degrada en una cruza 
compatible. 
Purificación de NaStEP de pistilos de Nicotiana alata. 
Para la purificación de NaStEP, se modificó el protocolo de Uchikoba et al., 1995. Se 
utilizó primero una cromatografía de intercambio aniónico DEAE, el cual es un 
intercambiador débil ya que la muestra está muy saturada de componentes celulares, 
por lo que se considera una fase preparatoria. A pH 5.5, NaStEP se esperaría que 
estuviera cargada negativamente por desprotonación, ya que su punto isoeléctrico 
teórico es 4.9 (Cruz González Zamora, no publicado). Sin embargo, se podría estar 
comportando de manera anómala al tener aminoácidos básicos expuestos cargados 
positivamente o estar asociada a una proteína básica (Cruz García comunicación 
personal). Otra alternativa es que el punto isoeléctrico de la proteína sea mayor al valor 
teórico (Sánchez Nieto comunicación personal), por lo que a pH 5.5 NaStEP se 
encontraría cargada positivamente (por protonación) al igual que la resina, y por 
repulsión de cargas la encontramos en la fracción no unida (figura 12). 
Se precipita con 60% de sulfato de amonio y se pasa por una columna de filtración 
molecular. En el cromatograma (figura 13), las moléculas pequeñas se retienen en los 
poros de la resina, mientras que las moléculas grandes no entran en los poros, es por 
ello que en el primer pico (de mayor absorbancia a 280 nm color azul) eluyen las 
proteínas y después sale el sulfato de amonio (mayor conductividad pico naranja), así 
obtenemos las proteínas sin sulfato de amonio y en el mismo paso las cambiamos a 
solución amortiguadora a pH 4.0. 
 
 
51 
En la cromatografía de intercambio catiónico (figura 14), a pH 4.0, NaStEP está cargada 
positivamente por protonación y la resina está cargada negativamente. En 
consecuencia, por atracción de cargas NaStEP se une a la resina, mientras que las 
proteínas básicas se encuentran en la fracción no unida. Para obtener NaStEP se hace 
un gradiente de cloruro de sodio, rompiendo las interacciones electrostáticas entre la 
proteína y la matriz. Se obtuvo un pico de mayor absorbancia a 280 nm, y colectamos 
las fracciones 7 a 15 (ver figura 15). 
Para monitorear la purificación se realizó una separación por SDS-PAGE y su 
subsecuente inmunodetección con el anticuerpo anti-NaStEP, en la cual se puede 
observar que efectivamente se logró purificar a homogeneidad la proteína NaStEP de 
pistilos de Nicotiana alata (figura 16). Aunque la purificación se realizó en presencia del 
inhibidor de proteasas comercial PMSF, el anticuerpo reconoce también una banda de 
menor peso molecular, hecho que nos llevó a pensar que NaStEP podría estar siendo 
degradada. Para contestar esta pregunta, la banda correspondiente se secuenció por 
espectrometría de masas en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación y a la 
Industria (USAII) de la Facultad de Química UNAM. La secuencia obtenida muestra que 
sí es un producto de degradación de NaStEP (Cruz González-Zamora, no publicado). 
Esto significa que una proteasa degrada