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[Escriba aquí] UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA “Síntesis de análogos y derivados del alcaloide Caulerpina, así como la evaluación de su actividad contra Mycobacterium tuberculosis H37Rv” TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA PRESENTA FÁTIMA LÓPEZ SALAZAR MÉXICO, D.F. 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Simón Hernández Ortega VOCAL: Juan Gómez Dueñas SECRETARIO: Roberto Martínez 1er. SUPLENTE: Guillermina Yazmín Arellano Salazar 2° SUPLENTE: Sonia Contreras García SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Laboratorio 2-11, Departamento de Química Orgánica, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México ASESOR DEL TEMA: Dr. Roberto Martínez ____________________________ SUPERVISOR TÉCNICO: Dr. Rubén Omar Torres Ochoa __________________________ SUSTENTANTE: Fátima López Salazar ____________________________ El presente trabajo de investigación se desarrolló en el laboratorio 2-11 del Instituto de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la dirección y asesoría del Dr. Roberto Martínez y el Dr. Rubén Omar Torres Ochoa; se agradece el apoyo otorgado por la DGAPA (Proyecto PAPIIT IN208015), así como el apoyo del Programa Institucional Nuevas Alternativas de Tratamiento para Enfermedades Infecciosas (NUATEI-IIB-UNAM) y a la beca de Ayudante de Investigador Nacional Nivel III o Emérito (No. 12016). ÍNDICE GENERAL i ÍNDICE GENERAL PÁGINA ABREVIATURAS Y FÓRMULAS iii I. INTRODUCCIÓN 1 II. ANTECEDENTES 3 II.1 La Tuberculosis 3 II.2 Productos naturales marinos empleados para combatir a M. tuberculosis 5 II.3 Alcaloides marinos en la búsqueda de nuevos agentes anti-TB 7 II.4 Un producto natural marino: la Caulerpina 9 II.5 Reactividad del indol frente a radicales libres 13 II.6 El uso de los xantatos para la formación de enlaces C-C 14 II.7 Sustitución radical-oxidativa aromática 16 III. HIPÓTESIS 19 IV. OBJETIVOS 19 IV.1 Objetivo general 19 IV.2 Objetivos particulares 19 V. DISCUSIÓN DE DE RESULTADOS 20 V.1 Esquema general de síntesis de la Caulerpina (1a) y sus análogos (1b-1d) 20 V.2 Síntesis de la Caulerpina (1a) 21 V.3 Síntesis de los análogos de la Caulerpina (1b-1d) 25 V.4 Esquema de síntesis de los derivados de la Caulerpina (54-57) 33 V.5 Síntesis de los derivados de Caulerpina (54-60) 34 VI. CONCLUSIONES 45 VII. PERSPECTIVAS 45 VIII. SECCIÓN EXPERIMENTAL 46 VIII.1 Consideraciones generales 46 VIII.2 Parte sintética 47 VIII.2.1 Procedimiento general para la obtención de los xantatos 47 2-(Etoxicarboniltio)acetato de metilo (45) 47 2-(Etoxicarboniltio)acetato de etilo (49a) 47 2-(Etoxicarboniltio) acetato de tert-butilo (49b) 47 ÍNDICE GENERAL ii VIII.2.2 Procedimiento general para la N-protección de los indoles 3- carbaldehídos 48 3-Formil-1H-indol-1-carboxilato de tert-butilo (46) 5-Ciano-3-formil-1H-indol-1-carboxilato de tert-butilo (51) 48 VIII.2.3 Procedimiento general para la alquilación de los indoles carbaldehídos N-Boc protegidos 49 3-Formil-2-(2-metoxi-2-oxoetil)-1H-indol-1-carboxilato de tert-butilo (47) 49 2-(2-Etoxi-2-oxoetil)-3-formil-1H-indol-1-carboxilato de tert-butilo (52b) 50 5-Ciano-3-formil-2-(2-metoxi-2-oxoetil)-1H-indol-1-carboxilato de tert-butilo (52c) 50 VIII.2.4 Procedimiento general para la desprotección de los indoles 2- alquilados 51 2-(3-Formil-1H-indol-2-il)acetato de metilo (9) 51 2-(3-Formil-1H-indol-2-il)acetato de etilo (53b) 51 2-(5-Ciano-3-formil-1H-indol-2-il)acetato de metilo (53c) 52 Síntesis del 2-(3-formil-1H-indol-2-il) acetato de tert-butilo (52a) 52 VIII.2.5 Procedimiento general para la síntesis de Caulerpina y sus análogos 53 5,12-Dihidrocicloocta[1,2-b:5,6-b']-diindol-6,13-dicarboxilato de dimetilo (1a) 53 5,12-Dihidrocicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-6,13-dicarboxilato de di-tert-butilo (1b) 54 5,12-Dihidrocicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-6,13-dicarboxilato de dietilo (1c) 54 2,9-Diciano-5,12-dihidrocicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-6,13-dicarboxilato de dimetilo (1d) 55 VIII.2.6 Síntesis de los derivados de Caulerpina 55 Ácido 5,12-dihidrocicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-6,13-dicarboxílico (55) 56 13,6-Dimetil-cicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-5,6,12,13-tetracarboxilato de 12,5-di-tert-butilo (56) 56 6-Metil-13-(hidroximetil)cicloocta[1,2-b:5,6-b']diindol-5,6,12-tricarboxilato de 12,5-di-tert-butilo (58) 57 9-Metil-3-oxo-2-oxa-3a,10-diazaindeno[2',1':6,7] cicloocta[1,2,3-jk] fluoreno-9,10(1H)-dicarboxilato de 10-tert-butilo (59) 58 3-Oxo-1,10-dihidro-2-oxa-3a,10-diazaindeno[2',1':6,7] cicloocta[1,2,3-jk] fluoreno-9-carboxilato de metilo (60) 59 IX. Anexo de espectros 60 IX.1 Síntesis de la Caulerpina (1a) 60 IX.2 Síntesis de los análogos de la Caulerpina (1b-1d) 65 IX.3 Síntesis de los derivados de la Caulerpina (54-56 y 58-60) 81 ABREVIATURAS Y FÓRMULAS iii ABREVIATURAS Y FÓRMULAS AcOEt Acetato de etilo AcOH Ácido acético ATF Ácido trifluoroacético atm Atmósfera Boc2O Dicarbonato de ditertbutilo Bu3SnH Hidruro de tributilestaño ºC Grados Celsius ccf Cromatografía en capa fina CDCl3 Cloroformo deuterado CH2Cl2 Cloroformo CH3CN Acetonitrilo cm-1 Recíproco de centímetros CMI Concentración mínima inhibitoria CN Nitrilo δ Desplazamiento químico DCE Dicloroetano DDQ 2,3-Dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona DIBAL-H Hidruro de diisobutilaluminio DLP Peróxido de dilauroílo DMAP Dimetilamino piridina DMSO-d6 Dimetilsulfóxido hexadeuterado eq. Equivalente EM Espectrometría de masas EM AR Espectrometría de masas de alta resolución EM DART Espectrometría de masas EM FAB Espectrometría de masas por bombardeo rápido de electrones EM IE Espectrometría de masas por impacto electrónico Et Etilo EtOH Etanol EU Estados Unidos Et3B Trietilborano FDA Siglas en inglés de “Food and Drug Administration” (Agencia de alimentos y Drogas) FeSO4⋅7H2O Sulfato de hierro pentahidratado g Gramos h Horas H2 Hidrógeno molecular HCl Ácido clorhídrico H2O Agua H3PO2 Ácido hipofosforoso H2SO4 Ácido sulfúrico Hx Hexano CI50 Concentración inhibitoria50 IR Espectroscopía de infrarrojo ABREVIATURAS Y FÓRMULAS iv J Constante de acoplamiento KBr Bromuro de potasio KOH Hidróxido de potasio LiBH4 Borohidruro de litio M Molar [M+.] Ión molecular MDR-TB Cepas de TB multirresistente a los fármacos de primera línea Me Metilo MeOH Metanol MeONa Métoxido de sodio µg Microgramos MgSO4 Sulfato de magnesio MHz Megahertz min Minutos µL Microlitros mL Mililitros µM Micromolar mm Milímetro mmol Milimol m/z Relación masa carga N2 Nitrógeno molecular NaBH4 Borohidruro de sodio Na2CO3 Carbonato de sodio Na2SO4 Sulfato de sodio O2 Oxígeno molecular OMS Organización Mundial de la Salud Pd/C Paladio sobre carbón p.f. Punto de fusión PhNHNH2 Fenilhidrazina Ppm Partes por millón ref. Referencia RMN 13C Resonancia magnética nuclear de carbono 13 RMN 1H Resonancia magnética nuclear de protón SN2 Sustitución nucleofílica bimolecular t. a. Temperatura ambiente TB Tuberculosis t-Bu Tert-butilo t-BuOH Tert-butanol TEA Trietilamina THF Tetrahidrofurano TMS Tetrametilsilano VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana XDR-TB Cepas de TB extremadamente resistentes a los fármacos de primera y segunda línea. ZnCl2 Cloruro de zinc UV Radiación ultravioleta INTRODUCCIÓN 1 I. INTRODUCCIÓN La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa que suele afectar a los pulmones y es causada por el bacilo de Mycobacterium tuberculosis; este padecimiento representa, según datos publicados por la Organización Mundial de la Salud (OMS),1 una de las dos causas de mayor mortalidad ocasionadas por un agente infeccioso a nivel mundial. Tanto el aumento en el número de casos, la presencia de cepas de M. tuberculosis resistentes a los fármacos comúnmente utilizados, la larga duración del tratamiento así como los efectos adversos de las drogas empleadas, han conducido a que una parte de la comunidad científica se dedique a la búsqueda de nuevos compuestos que puedan ayudar a sortear los problemas mencionados anteriormente. En este sentido, los productos naturales marinos representan una amplia fuente para el descubrimiento de nuevas moléculas que puedan servir para el desarrollo de nuevos fármacos útiles en el tratamiento de un gran número de enfermedades, entre ellas la TB. La Caulerpina (1a) es un alcaloide bis-indólico de origen marino, que fue aislado de las algas Caulerpa racemosa, C. serrulata y C. sertularioides en muy pequeñas cantidades,2 del cual se ha reportado que posee propiedades biológicas muy variadas, entre ellas una actividad antituberculosa destacada y promisoria, exhibiendo una concentración inhibitoria 50 (CI50) de 0.24 µM sobre M. tuberculosis H37Rv, y resultó ser dos veces más activo que el fármaco utilizado como referencia en el estudio (rifampicina, CI50=0.55 µM).3 Lo anterior fue de gran relevancia y por ello se llegó a considerar a la Caulerpina como un compuesto líder para el desarrollo de un posible fármaco antituberculoso. 1 Global Tuberculosis Report 2014. Disponible en línea: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (Consultado el 3 de agosto de 2015). 2 Maiti, B.C.; Thomson, R.H.; Mahendran, M. J. Chem. Res. Synop. 1978, 4, 126–127. 3 Canché-Chay, C. I.; Gómez-Cansino, R.; Espitia-Pinzón, C. I.; Torres-Ochoa R. O.; Martínez R. Mar. Drugs 2014, 12, 1757-1772. INTRODUCCIÓN 2 Figura 1. Estructura de la Caulerpina (1a). Debido a que el compuesto no se obtiene en cantidades suficientes de la fuente natural, no ha sido posible realizar estudios más detallados y profundos acerca del mecanismo por el cual actúa el alcaloide sobre las células bacterianas, o bien acceder a derivados mucho más activos. Es aquí donde la síntesis orgánica juega un papel importantísimo, ya que a través de metodologías simples y eficientes se puede acceder a una vasta cantidad de Caulerpina en un tiempo corto. A la fecha se han reportado sólo dos síntesis de este compuesto, en la primera de ellas Maiti obtuvo el compuesto 1a en muy bajo rendimiento (5%),2 en tanto que en el segundo método, desarrollado por Canché y colaboradores se sintetizó con un rendimiento del 11%.3 El presente trabajo retoma el método desarrollado por Canché, para preparar más Caulerpina (1a), así como nuevos análogos (1b-1d, ver página 20) y derivados (54-57, ver página 33), usando como paso clave una reacción de sustitución radical-oxidativa aromática N N OO O O H H 1a ANTECEDENTES 3 II. ANTECEDENTES II.1 La Tuberculosis La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada principalmente por el bacilo Mycobacterium tuberculosis,4 actualmente se ubica como la segunda causa de muerte a nivel mundial ocasionada por una padecimiento infeccioso, después del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), según datos de la OMS. Esta misma organización reportó que en el 2014 se presentaron 9.6 millones de casos nuevos de TB y 1.5 millones de personas murieron por esta enfermedad, de las cuales 1.1 millones fueron muertes ocasionadas por TB y 0.4 millones fueron resultantes de la co-infección de VIH y TB.5 El tratamiento actualmente recomendado para los casos de TB susceptible a fármacos tiene una duración de por lo menos seis meses, el cual se divide en dos fases: dos meses con el uso de cuatro de los fármacos de primera línea (isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol y estreptomicina) durante la fase intensiva, seguida de cuatro meses con el uso de isoniazida más rifampicina durante la fase de continuación.6 Sin embargo existen problemas asociados como son la intolerancia y toxicidad al fármaco, lo cual hace necesario interrumpir el tratamiento o realizar cambios en el régimen.7 La TB multirresistente a fármacos (MDR-TB por sus siglas en inglés) se define como la resistencia a isoniazida y rifampicina (los dos medicamentos antituberculosos más potentes), la duración de su tratamiento llega a ser mayor de dos años, y requiere medicamentos más caros y tóxicos.8 En el tratamiento de la MDR-TB se emplean fármacos de segunda línea, los cuales son menos efectivos que los de 4 Rawat, B.; Rawat, D. S. Med. Res. Rev. 2013, 33, 693-764. 5 Organización Mundial de la Salud. Nota descriptiva No. 104. Octubre de 2015. Disponible en línea: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/es/ (Consultado el 28 de noviembre de 2015). 6 Zumla A.; Gillespie, S.; Hoelscher, M.; Philips, P.; Cole S.; Abubakar, I.; McHugh, T.; Schito, M.; Maeurer, M.; Nunn, A. Lancet Infect Dis. 2014, 14, 32-340. 7 Zumla, A.; Nahid. P.; Cole, S. T. Nature Reviews: Drug Discovery. 2013, 12, 388-404. 8 Yan, M.; Ma, S. ChemMedChem. 2012, 7, 2063-2075. ANTECEDENTES 4 primera línea, y como ejemplo de algunos de ellos están: la amikacina, la kanamicina, el ciprofloxacino, la etionamida y la capreomicina.4 La TB extremadamente resistente a fármacos (XDR-TB por sus siglas en inglés) además de presentar resistencia a isoniazida y rifampicina también exhibe resistencia a fármacos de segunda línea, requiere de más tiempo de tratamiento y del uso de fármacos de tercera línea, los cuales llegan a ser mucho más caros y presentan más efectos adversos que los fármacos de primera y segunda línea.7 Entre estos fármacos se encuentran el linezolid, la rifabutina, la claritromicina, la vitamina D, la tioacetazona, la tioridazina y la arginina. Figura 2. Ejemplos de fármacos utilizados para el tratamiento de la TB. N HO OH O OH NH2N NH2 O O O H2N H2N O HO OH OH OH NH O O OH OH OH N N H N N OH OH O O O O O N NO H NH2 N N O NH2 N N HO H H OH O O O OHO OH OHH2N OH OH HO NH2 HN NH2 NH2HO O OH O O O O H2N OH OH HO OH OH OH HO NH2 H2N NH2 N N NH HO O O F N H O N H N NH2 S EstreptomicinaRifampicina Isoniazida Pirazinamida Etambutol Amikacina Kanamicina Ciprofloxacino Linezolid Tioridazina Tioacetazona Fármacos de1ra línea Fármacos de 2a línea Fármacos de 3ra línea O N N O H H N O F O S N N S ANTECEDENTES 5 El surgimiento de nuevos casos, el aumento en la incidencia de cepas de M. tuberculosis resistentes a fármacos, los tratamientos de larga duración, los efectos adversos de los fármacos de primer, segunda y tercera línea, así como el aumento en la incidencia de TB asociada a infecciones virales (VIH) han conducido a la búsqueda de nuevos compuestos con la espera de descubrir nuevos prototipos para tratar la TB. En este contexto, los productos naturales han probado ser un componente esencial del desarrollo terapéutico en casi todas las áreas de la salud humana. En particular, los metabolitos secundarios (y los análogos sintéticos de estas estructuras) se han vuelto indispensables en el área de desarrollo farmacéutico de enfermedades infecciosas.9 Tal es su importancia que los dos fármacos más usados para el tratamiento de TB, isoniazida y rifampicina, son análogos de los productos naturales nicotinamida (la amida de la vitamina B3) y rifamicina, respectivamente.10 A pesar del éxito histórico de los productos naturales como compuestos líderes para el tratamiento de la TB, no se han introducido nuevas clases de estructuras de antibióticos anti-TB desde el descubrimiento de la rifampicina en 1960.11 II.2 Productos naturales marinos empleados para combatir a M. tuberculosis. Del medio marino se han aislado, identificado y probado biológicamente un gran número de compuestos con estructuras muy diversas, tales como péptidos, esteroles, terpenos alifáticos o aromáticos, etc.12 A muchas de estas moléculas se les ha determinado su actividad antituberculosa. Dichos estudios dieron inicio con Andersen13 y Hamann14, el primero describió la actividad in vitro anti-TB del massetólido A (2a) [Concentración mínima inhibitoria, CMI= 5-10 µg/mL] y de la viscosina (2b) [CMI= 10-20 µg/mL], péptidos aislados de un alga marina y un gusano 9 Newman, D.J.; Cragg, G.M. J. Nat. Prod. 2007, 70, 461-477. 10 Salomon, C. E.; Schmidt L. E. Curr Top Med Chem. 2012, 12, 735-765. 11 Maggi, N.; Pasqualucci, C.R.; Ballotta, R.; Sensi, P. Chemotherapy. 1966, 11, 285-292. 12 Nora De Souza, M.V. Scientific World J. 2006, 6, 847-861. 13 Gerard, J.; Lloyd, R.; Barsby, T.; Haden, P.; Kelly, M.T.; Andersen, R.J. J. Nat. Prod. 1997, 60, 223-229. 14 Hamann, M.T.; Scheuer, P.J. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 5825-5826. ANTECEDENTES 6 marino, respectivamente; por su parte, Hamann y su grupo identificaron la actividad anti-TB de los polipéptidos Kahalálido A (3) y F (4), aislados del molúsco Elysia rufescens. El primero demostró una actividad in vitro significativa, inhibiendo un 83% el crecimiento de M. tuberculosis H37Rv a una concentración 12 µg/mL, y el segundo inhibiendo un 67% a la misma concentración. Adicionalmente, Hamann hizo una importante contribución probando las actividades in vitro contra M. tuberculosis de 48 compuestos naturales marinos y semisintéticos de clases muy diversas.15 Este trabajo mostró candidatos potenciales para nuevos agentes anti- TB y resaltó la importancia de investigar los productos marinos naturales como una nueva fuente de agentes antimicobacteriales. Como ejemplo de algunos compuestos probados por Hamann y su grupo, se pueden mencionar los C-19 hidroxiesteroides: litoesterol (5a), nefalesterol B (5b) y C (5c), que fueron aislados del coral Nephthea sp. Los compuestos 5a, 5b y 5c tuvieron CMI de 3.13, 12.5 y 12.5 µg/mL, respectivamente, inhibiendo una cepa de M. tuberculosis H37Rv en un 90, 69 y 96%. 15 Sayed, K.A.; Bartyzel, P.; Shen, X.; Perry, T.L.; Zjawiony, J.K.; Hamann, M.T. Tetrahedron, 2000, 56, 949- 953. ANTECEDENTES 7 Figura 3. Estructuras de productos naturales marinos que poseen actividad contra M. tuberculosis. II.3 Alcaloides marinos en la búsqueda de nuevos agentes anti-TB Los alcaloides son compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno y son relativamente básicos, en la naturaleza estos se encuentran en plantas, animales y microorganismos; dado que contienen un átomo de nitrógeno en la molécula, el grupo funcional más común es el amino, en sus variantes primaria, secundaria y terciaria. El átomo de nitrógeno en los alcaloides contribuye de manera significativa en las propiedades del fármaco; el par libre de electrones del nitrógeno usualmente actúa como aceptor de protones, mientras que en aminas primarias y secundarias actúa como donador de protones necesarios para formar el enlace de hidrógeno. Es importante resaltar que la unión proteína-ligando emplea en gran medida este tipo de enlace. Estas propiedades de aceptor y donador de protones del nitrógeno y del hidrógeno, junto a las propiedades de aceptor y donador de protones de otros grupos funcionales, permiten a los alcaloides ser moléculas bioactivas ideales que H N N H H N O OHN O NH OH O NH O HN O HN O OHO O O OH OH NH O O R 2a, R= CH3 Massetólido A 2b, R= H Viscosina HN H N N H H N O O O O HN O N H HO H N O O HO OO 3, Kahalálido A NH N H H N N H O OHO O O N O NH O H2N N H H N N H O O O HN O N H O NH O NH O O O 4, Kahalálido F H H R H HO HO 5a, R= H Litoesterol 5b, R= OH Nefalesterol B 5c, R= OAc Nefalesterol C ANTECEDENTES 8 tienen la capacidad de unirse (o interaccionar) con dianas de fármacos (proteínas, enzimas y receptores); en consecuencia, la mayoría de los alcaloides naturales generalmente presentan actividades biológicas que son de interés farmacéutico. Los alcaloides han demostrado a lo largo de los años que son una fuente importante de nuevas drogas. En 2012, la FDA (Food and Drug Administration, EU) aprobó 39 nuevos fármacos, incluyendo 33 moléculas orgánicas y 6 fármacos biológicos. De los 33 fármacos, por lo menos 16 estructuras eran alcaloides o moléculas relacionadas a ellos.16 Es por lo anterior que la búsqueda de nuevas estructuras alcaloideas en fuentes marinas con potencial actividad anti-TB, se ha venido incrementando cada vez con el transcurso de los años. Algunos ejemplos de alcaloides naturales marinos antituberculosos son las manzaminas, estos compuestos de tipo β-carbolínicos fueron aislados por primera vez por Higa y colaboradores en 1986 de la esponja Haliclona sp.17 En la búsqueda de nuevos tipos de agentes anti-TB, Hamann y su grupo aislaron y probaron nuevas manzaminas18, como ejemplos se pueden mencionar a las manadomanzaminas A (6a) y B (6b), aislados de la esponja Acanthostrongylophora sp., las cuales exhiben una actividad sobresaliente contra M. tuberculosis con valores de CMI de 1.9 y 1.5 µg/mL, respectivamente. Por su parte, Rodríguez y colaboradores aislaron del coral Pseudopterogorgia elisabethae tres alcaloides: el pseudopteroxazol (7a), el homopseudopteroxazol (7b) y el seco-homopseudopteroxazol (8), los cuales presentaron actividad inhibidora potente y moderada contra M. tuberculosis H37Rv (97, 88 y 66%) a una concentración de 12.5 µg/mL.19 Otro ejemplo de alcaloide al cual recientemente se le determinó su actividad anti-TB es la Caulerpina (1a), dicha molécula se detalla más a profundidad en el siguiente capítulo. 16 Kittakoop,P.; Mahidol, C.; Ruchirawat, S. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, 14, 239-252. 17 Sakai, R.; Higa, T.; Jefford, C.W.; Bernardinelli, G. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 6404-6405. 18 Yousaf, M.; El Sayed, K.A.; Rao, K.V.; Lim, C.W.; Hu, J.F.; Kelly, M.; Frazblau, S.G.; Zhang, F.; Peraud, O.; Hill, R.; Hamann, M.T. Tetrahedron, 2002, 58, 7397-7402. 19 Rodriguez, A.D.;Ramirez, C. J. Nat. Prod, 2001, 64, 100-102. ANTECEDENTES 9 Figura 4. Estructuras de alcaloides con actividad contra M. tuberculosis. II.4 Un producto natural marino: la Caulerpina La Caulerpina (1a) es un alcaloide de origen marino, que en su estructura posee dos grupos indólicos unidos por un anillo de ocho miembros, y en dicho anillo están presentes dos grupos carboximetilo. Este producto fue aislado en 1970 de las algas Caulerpa racemosa, C. serrulata y C. sertularioides con un rendimiento del 0.55- 0.63% del peso seco.20 Adicionalmente, 1a se ha logrado aislar de otras variedades de Caulerpa sp.,21 así como de otras algas verdes como Codium decorticatum22 y Halimeda incrassate,23 además de las algas rojas Laurencia majuscula, Hypnea concornis,24 Caloglossa leprieurii25 y Chondria armata.26 20 Aguilar-Santos, G. J. Chem. Soc. 1970, 6, 842-843. 21 Schwede, J. G.; Cardellina, J. H.; Grode, S. H.; James, T. R.; Blackman, A. J. Phytochemistry. 1987, 26, 155-158. 22 Anjaneyulu, A.S.R.; Prakash, C.V.S.; Mallavadhani, U.V. J. Indian Chem. Soc. 1991, 68, 480. 23 Yan, S.; Su, J.; Wang, Y.; Zeng, L. Redai Haiyang 1999, 18, 91–94. 24 Xu, X.; Su, J. Ziran Kexueban 1996, 35, 64–66. 25 Xu, X.H.; Su, J.Y.; Zeng, L.M.; Wang, M.Y. Gadeng Xuexiao Huaxue Xuebao 1998, 19, 249–251. 26 Govenkar, M.B.; Wahidulla, S. Phytochemistry 2000, 54, 979–981. N N H O H H OHH H N HN 22 6a, Manadomanzamina A: 22 β-H 6b, Manadomanzamina B: 22 α-H N O H CH3 H H3C R 7a, R= H Pseudopteroxazol 7b, R= CH2(CH2)3CH3 Homopseudopteroxazol N O H CH3 H H3C 8, Seco-pseudopteroxazol ANTECEDENTES 10 En 1978 Maiti y colaboradores2 reportaron la primera síntesis de 1a a partir del 2- (3-formil-1H-indol-2-il)acetato de metilo 9 con un rendimiento del 5% en un periodo de 2 días de reacción, lo cual permitió corregir su estructura (Esquema 1). En 1984, se informó que 1a presenta baja toxicidad27 y posteriormente se ha informado que actúa como: regulador de crecimiento,28 antitumoral,29 antiinflamatorio y antinociceptivo,30 insecticida,31 inhibidor de la corrosión,32 antiherpético, antidiarreico33 y espasmolítico.34 Esquema 1. Síntesis de 1a reportada por Maiti y colaboradores.2 Debido a la estructura aparentemente sencilla, la simetría C2 y las actividades biológicas informadas de 1a, este compuesto ha llamado el interés de los químicos sintéticos para intentar realizar su síntesis o la de algunos análogos. Por ejemplo, la síntesis del análogo 13 descrita por Talaz se basó en una reacción de indolización de Fischer utilizando la cicloocta-1,5-diona y fenilhidrazina para obtener el esqueleto base de la Caulerpina (11). Posteriormente, 11 fue transformado al análogo tetrasustituido (13) en dos pasos (Esquema 2).35 27 Vidal, J. P.; Laurent, D.; Kabore, S.A.; Rechencq, E.; Boucard, M.; Girard, J.P.; Escale, R.; Rossi, J.C. Bot. Mar. 1984, 27, 533–537. 28 Raub, M. F.; Cardellina II, J. H.; Schwede, J. G. Phytochemistry. 1987, 26, 619-620. 29 Ayyad, S. E. N.; Badria, F. A. Alex. J. Pharm. Sci. 1994, 8, 217-219. 30 Tenório de Souza, E.; Pereira de Lira, D.; Cavalcanti de Queiroz, A.; Costa da Silva, D. J.; Bezerra de Aquino, A.; Campessato-Mella, E. A.; Prates-Lorenzo, V. C.; De Miranda, G. E.; Araújo-Júnior, J. X.; De Oliveira Chaves, M. C.; Barbosa-Filho, J. M.; De Athayde-Filho, P. F.; De Oliveira-Santos, B. V.; Alexandre-Moreira, M. S. Mar. Drugs. 2009, 7, 689-704. 31 Walied, M. A.; Zeinab, S. A.; Seif-Eldin, N. A.; Sultan, S. A. Clean-Soil. Air. Water. 2010, 38, 548-557. 32 Kamal, C.; Sethuraman, M. G. Ind. Eng. Chem. Res. 2012, 51, 10399-10407. 33 Porto-Vieira Macedo, N. R.; Ribeiro, M. S.; Villaça, R. C.; Ferreira, W.; Pinto, A. M.; Teixeira, V. L.; Cirne- Santos, C.; Paixão, I. C. N. P.; Giongo, V. Braz. J. Pharmacogn. 2012, 22, 861-867. 34 Cavalcante-Silva, L. H. A.; De Carvalho-Correia, A. C.; Barbosa-Filho, J. M.; Araújo da Silva, B.; De Oliveira Santos, B. V.; Pereira de Lira, D.; Ferreira Sousa, J. C.; De Miranda, G. E. C.; De Andrade Cavalcante, F.; Alexandre-Moreira, M. S. Mar. Drugs. 2013, 11, 1553-1564. 35 Talaz, O.; Saracoglu, N. Tetrahedron. 2010, 66, 1902-1910. N N OO O O H H 1a 5% N O O O H Una gota de Piperidina y Dietilamina MeOH Reflujo, 2 días 9 ANTECEDENTES 11 Esquema 2. Síntesis del esqueleto de la Caulerpina (11) y su análogo 13. En 2014, Canché y colaboradores sintetizaron la estructura de la Caulerpina (1a) en tres pasos de reacción con un rendimiento global del 11%.3 La etapa clave del proceso fue la utilización de una sustitución radical oxidativa aromática empleando el xantato 15 y el 3-formilindol (14) para obtener el indol C-2 sustituido 16. Posteriormente, se realizó una descarboxilación y una transesterificación del indol 16 con el fin de acceder al indolacetato 9, ya con este último se emplearon y optimizaron las condiciones de reacción de Maiti et al.2 para lograr la síntesis del producto natural. O O N N H H N N H H O O N N H H N N H H DDQ THF-H2O 90% 10 11 1213 PhNHNH2 AcOH-ZnCl2 53% PhNHNH2 ZnCl2, EtOH 82% ANTECEDENTES 12 Esquema 3. Síntesis de Caulerpina (1a) reportada por Canché et al.3 Por otra parte, en este mismo estudio Canché y colaboradores3 evaluaron la Caulerpina (1a) y algunos de sus análogos (17a-17c) contra el bacilo de M. tuberculosis (H37Rv) a una concentración de 50 µM, comparando su valor de CI50 con uno de los fármacos de primera línea en el tratamiento de tuberculosis, la rifampicina. Figura 5. Estructura de la Caulerpina (1a) y análogos (17a-17c) reportados por Canché.3 N H O + EtO OEt O O S S OEt DLP DCE N H O CO2Et CO2Et N H O CO2Me MeONa MeOH N H N HOO O O Dietilamina 0.023 M Piperidina 0.023 M Xileno 14 15 16 91a N N OO O O H H 1a, R= H, CI50=0.24 µM 17a, R= F, CI50= 1.68 µM 17b, R= Br, CI50= 1.98 µM 17c, R= I, CI50= 3.89 µM R R ANTECEDENTES 13 La Caulerpina (1a) y sus análogos (17a-17c) mostraron un porcentaje de inhibición mayor al 75%, posteriormente se evaluó el valor de CI50, encontrando que la Caulerpina (1a) es el compuesto con mayor actividad con una CI50 de 0.24 µM, dos veces más potente que la rifampicina, la cual exhibió una CI50 de 0.55 µM. Este hallazgo fue de gran importancia ya que a partir de ese momento, se consideró a la Caulerpina como un compuesto líder para el desarrollo de un posible fármaco antituberculoso. II.5 Reactividad del indol frente a radicales libres Los indoles reaccionan frente a los radicales libres de diferentes maneras, entre las que destacan las adiciones radicalarias intramoleculares y ciclaciones vía radicales. El hidruro de tributil estaño (Bu3SnH) es el reactivo más empleado en reacciones radicalarias, desafortunadamente la química basada en estaño se asocia con dos grandes inconvenientes, la toxicidad de los compuestos orgánicos de estaño y lo difícil de sus procedimientos de purificación. Algunas metodologías libres de estaño utilizadas sobre indoles incluyen el empleo de: trietilborano (Et3B) usando O2 como iniciador, acido hipofosforoso (H3PO2) e hipofosfito de N-etilpiperidina y agentes como yoduro de samario, cloruro de cobre (I) e indio.36 En lo que concierne a las adiciones intermoleculares, hay pocos ejemplos de este tipo de procesos para la creación de enlaces C-C en la posición C-2 o C-3 del anillo de indol. Algunos utilizan peróxido de hidrógeno y FeSO4·7H2O, u oxidantes con Mn(III), Fe (II) o Ce (IV), sin embargo estos procedimientos tienen la desventaja de requerir un gran exceso de reactivos además de que muchas de las veces los rendimientos que se obtienen son bajos.36 Una alternativa para la creación de enlaces C-C mediante reacciones intermoleculares, es el uso de los xantatos(ditiocarbonatos) y sus derivados. La química de radicales basada en xantato ha ganado popularidad desde 1997, gracias 36 Badenock, J. C. Heterocyclic Scaffolds II: Reactions and Applications of Indoles. Topics in Heterocyclic Chemistry, ed. Gribble, G.W., Springer. 2010, 26, pp 235, 236. ANTECEDENTES 14 a los trabajos de Zard et al.,37 debido a que se pueden tolerar una amplia variedad de grupos funcionales, ya que las condiciones que se utilizan son suaves y neutras, así como por el bajo costo y disponibilidad de los reactivos empleados. Este tipo de reacciones no sólo se pueden llevar a cabo en ausencia de metales pesados, y en condiciones libres de estaño, sino también evita la reducción prematura de los radicales intermedios. Además, los radicales libres generados a partir de xantatos han demostrado tener una vida útil más larga y se pueden agregar de manera eficiente a los alquenos no activados.38 Estos compuestos han hecho posible la creación de rutas más cortas en la síntesis de nuevas estructuras de diversa índole. Uno de los métodos más socorridos para la preparación de diversos xantatos es mediante el desplazamiento de un buen grupo saliente (por ejemplo, haluros de alquilo, tosilatos, metisulfonatos)37 por parte de la sal de potasio del ditiocarbonato de O-etilo (19), quien es un excelente nucleófilo y que además se puede adquirir comercialmente (Esquema 4). Esquema 4. Síntesis general de xantatos. II.6 El uso de los xantatos para la formación de enlaces C-C. Hay muy pocas reacciones generales para la creación de uniones C-C mediante reacciones intermoleculares en alquenos no activados. La baja reactividad de los alquenos ordinarios los hace malos copartícipes en la mayoría de los procesos de formación de enlaces C-C y por tanto las especies reactivas involucradas prefieren reaccionar con otros grupos funcionales presentes en la molécula. Una solución a este problema es el uso de xantatos y sus derivados que han demostrado ser de 37 Zard S. Z. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 672-685. 38 Zard, S. Z. Radicals in Organic Synthesis, ed. Renaud, P. y Sibi, M. Wiley VCH, Weinhem, 2001, pp. 90-108. O R Gs O O R S O O S KS OEt S 18, Gs= Grupo saliente CH3CN 20 19 ANTECEDENTES 15 gran utilidad para llevar a cabo reacciones de adición radicalarias inter- e intra- moleculares. La química radicalaria de los xantatos ofrece una alternativa al uso de estaño para la formación de enlaces C-C mediante radicales libres, siendo descrito inicialmente por Zard.39 La mayor ventaja en el uso de los xantatos es la adición- fragmentación reversible del radical alquilo del xantato, así como de otros tiocarbonilos relacionados, como se muestra en el mecanismo general (Esquema 5). Esquema 5. Mecanismo de reacción propuesto para la adición de los xantatos sobre olefinas. Este proceso comienza con la etapa de iniciación, a partir de la cual se produce el radical alquilo (22), el cual tiene tres posibles destinos, en la ruta A el radical 22 puede adicionarse a una segunda molécula del xantato 21 para dar el radical estabilizado 23, este radical está muy impedido para dimerizarse, así que este paso puede ser reversible. Posteriormente, 23 puede fragmentarse tanto en el enlace C- 39 El Qacemi, M.; Petit, L.; Quiclet-Sire, B.; Zard, S. Z. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 5707-5719. S O S EtR R S O S EtR R G G R G R S S OEtR G R S S OEt R S O S RR + Et + G R Iniciador Ruta A Ruta B Ruta C21 25 26 27 22 242223 21 21 ANTECEDENTES 16 S como en C-O, sin embargo, este último es raro debido a la fuerza del enlace C- O, así como a la inestabilidad del radical etilo resultante. Por lo tanto, la ruptura homolítica del enlace C-S es la única ruta viable y en consecuencia, la formación de 23 es reversible y degenerativa. Como se muestra en el mecanismo, el tiempo de vida útil del radical alquilo en el medio aumenta considerablemente, ya continuamente se regenera, lo que hace posible la adición a alquenos no activados. En términos más generales el radical alquilo permite que sucedan las reacciones que son lentas o difíciles de llevar a cabo, incluyendo las adiciones intermoleculares. En la ruta B, la adición del radical 22 a un alqueno produce el radical 24 y la subsecuente adición de otro equivalente de 21 resulta en la generación del aducto 26, este paso también puede ser reversible o bien formar el aducto 27 y el radical 22. Para que la reacción en cadena tenga éxito, el radical 22 debe ser más estable que el aducto 24 afín de que el equilibrio sea desplazado hacia la formación de 27. Si el aducto 24 es menos estable, entonces la reacción podrá ser forzada a continuar utilizando cantidades estequiométricas del iniciador. Adicionalmente, en la ruta C el radical 24 puede ser oxidado mediante la transferencia de electrones por parte de un agente oxidante, pasando de un radical a una especie catiónica (25). Esta ruta es favorecida cuando el grupo G es una entidad que estabiliza al carbocatión formado y hay una especie oxidante en el medio.40 Los peróxidos, tales como el peróxido de dilauroílo (DLP) son generalmente empleados como iniciadores para este tipo de reacciones radicalarias ya que al mismo tiempo pueden actuar como oxidantes. Aunque también pueden ser usados otros iniciadores como los diazocompuestos o una combinación de trietilborano (Et3B) y oxígeno.41 II.7 Sustitución radical-oxidativa aromática La reacción de sustitución radical-oxidativa aromática es un método atractivo para la generación de enlaces C-C en heterocíclicos aromáticos, en este proceso radical- 40 Canché-Chay C. I. (2015). Tesis de Doctorado. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 41 Quiclet-Sire, B.; Zard, S. Z. Chem. Eur. J. 2006, 12, 6002 – 6016. ANTECEDENTES 17 iónico se forma un radical centrado en un átomo de carbono promovido por la fragmentación homolítica de un peróxido, posteriormente dicho radical es oxidado por la transferencia del electrón desapareado hacia el peróxido, generando una especie catiónica, cuya pérdida de un protón (-H+) permite la recuperación de la aromaticidad en el sistema aromático. En 2003, Miranda y colaboradores42 llevaron a cabo una sustitución radical- oxidativa aromática mediada por los xantatos 29a y 29b para añadir radicales α- acetil y α-acetonil a los indoles 28a y 28b, emplearon DLP como agente iniciador de radicales libres y también como oxidante, generando de esta manera los indoles 30a y 30b sustituidos regioselectivamente en la posición C-2 (Esquema 6). Esta metodología ha sido sobresaliente ya que por este medio pueden realizarse alquilaciones sobre sistemas heteroaromáticos (pirroles, indoles, furanos y tiofenos), como sustituciones directas en la posición 2 de indoles y pirroles, no importando la presencia de un sustituyente en C-3 o si el átomo de nitrógeno se encuentra o no protegido, lo cual representa una ventaja en síntesis. Esquema 6. Sustitución radical-oxidativa de indoles propuesta por Miranda.42 El mecanismo de reacción propuesto para la sustitución radical-oxidativa de Miranda42 se encuentra representado en el Esquema 7, en donde el radical α-acetil o el radical α-acetonil 32 generado por la acción del DLP sobre el xantato 31, se adiciona al anillo aromático 33 produciendo el radical conjugado 34. La recuperación de la aromaticidad del compuesto 34 puede ocurrir por medio de dos diferentes 42 Osornio, Y. M.; Cruz Almanza, R.; Jiménez Montaño, V.; Miranda L. D. Chem Commun. 2003, 2316-2317. N R2 R1 + N R2 R1 R3 S O S O DLP R3 O 28a:R1=H; R2=H 28b: R1= CH2Ph; R2=CHO 29a: R3= OEt 29b: R3= CH3 30a: R1=H; R2=H; R3=OEt (60%) 30b: R1= CH2Ph; R2= CHO; R3=CH3 (44%) DCE Reflujo 12 h ANTECEDENTES 18 rutas: la vía oxidativa mediada por DLP en una reacción en cadena (Esquema 7, vía i) o por la abstracción directa de un hidrógeno por el radical alquilo derivado de la fragmentación del DLP (Esquema 7, vía ii). En ambas rutas se requiere una cantidad estequiométrica de DLP para completar la reacción. Esquema 7. Mecanismo propuesto para la reacción radical-oxidativa aromática. Adicionalmente, en nuestro grupo de trabajo se ha utilizado esta reacción por medio de la cual se han preparado moléculas complejas como el núcleo pentacíclico de la tronocarpina (36)43 y el esqueleto ABDE del alcaloide indólico Dipinina B (38) productos naturales que presentan actividad antineoplásica.44 Esquema 8. Síntesis del esqueleto ABDE de la Dipinina B. 43 Torres-Ochoa, R. O.; Reyes-Gutiérrez, P. E.; Martínez, R. Eur. J. Org. Chem. 2014, 48-52. 44 Morales-Chamorro, M. C. (2015). Tesis de Maestría. Universidad Nacional Autónoma de México. México. S OEt S R1 O R DLP R1 O X R3 R2 X R3 R2 R1 O H R X R3 R2 R1 O DLPRO- + CO2 Vía i Vía ii 31 32 33 3435 N H CO2Me Co2Me 37 N CO2Me COMe 38 A B D E N CO2Me NH O O 36 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 19 III. HIPÓTESIS Es posible optimizar las rutas de síntesis descritas para obtener la Caulerpina (1a) y preparar algunos análogos y derivados que presenten actividad contra Mycobacterium tuberculosis H37Rv. IV. OBJETIVOS IV.1 OBJETIVO GENERAL El objetivo del presente trabajo es la síntesis de la Caulerpina (1a), los análogos 1b- 1d (ver página 20) y los derivados 54-57 (ver página 33). IV.2 OBJETIVOS PARTICULARES • Realizar la protección de los 3-formil indol 14 y 50. • Preparar los xantatos 45, 49a y 49b, mediante una reacción de sustitución nucleofílica entre el correspondiente α-haloéster y la sal de potasio del ditiocarbonato de O-etilo (19). • Obtener los compuestos 47 y 52a-52c, efectuando la sustitución radical-oxidativa aromática entre los correspondientes indoles 14, 46 y 51 con los respectivos xantatos 45, 49a y 49b. • Realizar la desprotección de los indoles 47, 52b y 52c. • Obtener los análogos 1b-1d llevando a cabo la dimerización de los compuestos 9, 52a, 53b y 53c. • Obtener los derivados 54-57 de la Caulerpina (1a). DISCUSIÓN DE RESULTADOS 20 V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS V.1 Esquema general de síntesis de la Caulerpina (1a) y sus análogos (1b- 1d). La síntesis de la Caulerpina (1a) y de sus análogos 1b-1d se propuso llevar a cabo como se muestra en el siguiente esquema: Esquema 9. Ruta general de síntesis de la Caulerpina (1a) y los análogos 1b-1d. La síntesis iniciaría con la preparación de los xantatos 41 mediante una reacción de sustitución nucleofílica de un haloacetato de alquilo. A continuación se prepararía el indol 40, por medio de la protección del nitrógeno del 3-formilindol 39. Después, se realizaría una reacción de sustitución radical-oxidativa aromática sobre el C-2 del indol 40, utilizando los xantatos 41 para obtener los indoles carbaldehídos N-Boc protegidos 42. Posteriormente el compuesto 43 se generaría por la desprotección del indol 42, a través de una hidrólisis ácida. Finalmente, la Caulerpina (1a) y sus N O N O N N O O OO R2 R2 N O O O R2 N O O O R2 39 40 43 EtO S S (Boc)2O TEA, DMAP CH2Cl2 DLP, DCE reflujo ATF, CH2Cl2 reflujo 42 Piperidina, AcOH Tolueno reflujo 1a, R1=H, R2= Me 1b, R1=H, R2= t-Bu 1c, R1=H, R2= Et 1d, R1=CN, R2=Me O O 41 R2 H Boc Boc H H H R1 R1 R1 R1R1 R1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 21 análogos (1b-1d) se obtendrían mediante la condensación aldólica del indol alquilado 43. V.2 Síntesis de la Caulerpina (1a). La síntesis del producto natural Caulerpina (1a) se inició con la preparación del xantato 45, el cual es utilizado en un paso posterior como agente alquilante, mediante la sustitución nucleofílica bimolecular (SN2) del cloroacetato de metilo 44 por el anión de la sal de potasio del ditiocarbonato de O-etilo (19), en acetonitrilo a 0ºC, obteniendo 45 como un aceite amarillo en excelente rendimiento (Esquema 10). Es importante mencionar que al evaporar el disolvente para obtener el crudo de reacción se debe mantener una temperatura moderada ya que de otro modo el xantato podría descomponerse. Esquema 10. Condiciones de reacción para la síntesis de 45. La estructura del xantato 45 fue corroborada por RMN 1H, la cual coincide con los datos espectroscópicos descritos.40 Después se continuó con la N-protección del 3-formilindol (14), adquirido comercialmente, utilizando el dicarbonato de diterbutilo [(Boc)2O] como agente protector. Antes de adicionar el (Boc)2O, se agregaron al matraz que contenía la materia prima y el disolvente, la base TEA y después DMAP como catalizador nucleofílico; obteniendo de esta manera 46 en rendimiento cuantitativo (Esquema 11). Esta reacción siempre fue seguida por ccf con el fin de determinar el momento en el que toda la materia prima se hubiera consumido. O Cl O O S O O S KS OEt S CH3CN 0ºC, 1h44 45 100% 19 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 22 Esquema 11. Condiciones de reacción para la protección de 14. La protección es necesaria ya que si se parte del indol 14 la reacción de alquilación radicalaria en el C-2 no procede.40 Lo anterior puede deberse a que el hidrógeno unido al nitrógeno del indol 14 influye en la reactividad de la posición C-2 desfavoreciendo el proceso de alquilación. El compuesto 46 es un sólido blanco con p.f. de 126ºC que coincide con el reportado (ref. 128-129ºC) y con los datos espectroscópicos descritos.45 Una vez obtenidos los intermediarios 45 y 46, se llevó a cabo la reacción de sustitución radical-oxidativa aromática del indol N-Boc 46.46 Para empezar, se desgasificó el matraz, que contenía las materias primas disueltas en DCE, con N2 durante 30 minutos. Posteriormente, se realizó cada hora la adición directa del DLP, empleado como agente iniciador de radicales libres y oxidante. Es importante mantener la atmósfera de reacción libre de oxígeno lo cual se logró manteniendo la reacción bajo atmósfera de N2, para así evitar la posible oxidación de los radicales intermedios. Una vez terminado el tiempo de reacción, se realizó el tratamiento para eliminar los restos de DLP mediante su extracción con hexano; además fue necesario realizar la purificación por cromatografía en columna del crudo de reacción, obteniendo el compuesto 47 en un rendimiento promedio del 51% (esquema 12). 45 Davies, J. R.; Kane, P. D.; Moody, C. J.; Slawin, A. M. Z. J. Org. Chem. 2005, 70, 5840-5851. 46 Reyes-Gutiérrez. P. E.; Torres-Ochoa, R. O.; Martínez, R.; Miranda L. D. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 1388-1396. N O N O 14 46 100% (Boc)2O TEA, DMAP CH2Cl2 H Boc DISCUSIÓN DE RESULTADOS 23 Esquema 12. Condiciones de reacción para la síntesis de 47. El indol carbaldehído N-Boc 47 se obtuvo como un sólido blanco con p.f. de 122ºC. La elucidación estructural de 47 se llevó a cabo por métodos usuales de espectroscopia y espectrofotometría. Así, su espectro de RMN 1H mostró en 10.34 ppm un singulete propio del aldehído H-C3’; H-C4 apareció como un multiplete centrado en 8.26 ppm cuya integración correspondió a 1H; H-C7 se observó como un multiplete centrado en 8.08 ppm que integró para 1H; la señal correspondiente a H-C5 y H-C6 se presentó como un multiplete centrado en 7.37 ppm que integró para 2H; en tanto que en 4.53 ppm apareció un singulete del H-C2' cuya integración correspondió a 2H; el metilo H-C2’’’ se observó como un singulete a 3.73 ppm, cuya integracióncorrespondió a 3H; mientras que a 1.69 ppm se observó un singulete correspondiente a los metilos H-C1’’’ que integró para 9H. La información antes descrita se complementó con su espectro de RMN 13C, identificando en éste cuatro señales alifáticas en 86.3 ppm, 52.4 ppm, 32.7 ppm y 28.0 ppm, que correspondieron a C1’’, C2’’’, C2’ y C1’’’, respectivamente. También se observaron ocho señales aromáticas, de las cuales cuatro correspondieron a metinos y cuatro a carbonos cuaternarios, los desplazamientos fueron los siguientes: 142.2 ppm, 135.7 ppm, 126.1 ppm, 125.5 ppm, 124.5 ppm, 120.6 ppm, 119.1 ppm y 115.4 ppm. En tanto que la señal del aldehído C3’ apareció a 185.5 ppm, la señal del carbón del éster C2’’ y del carbamato C1’ se encontraron a 169.2 ppm y 149.8 ppm, respectivamente. Por otra parte, en su espectro de IR se observaron bandas características para los grupos funcionales presentes en la molécula: la banda que aparece en 2852 cm-1 corresponde al estiramiento del CHO, en 1735 cm-1 el estiramiento del carbonilo del éster y en 1660 cm-1 el estiramiento de carbonilo del carbamato. En tanto en el O S O O S 45 N O 46 DLP DCE N O O O 47 51% + Reflujo 6 h Boc Boc DISCUSIÓN DE RESULTADOS 24 espectro de masas se observó un ion molecular a m/z 318, que es el que se espera para esta molécula. Figura 6. Caracterización del compuesto 47. Después se continuo con la desprotección del indol N-protegido 47 mediante una hidrólisis ácida con ATF y CH2Cl2 como disolvente. Se dejó la reacción en reflujo durante una hora, obteniendo 9 en un rendimiento promedio del 86% (Esquema 13). En esta reacción la protonación del carbonilo del carbamato da lugar a un ácido carbámico inestable, lo cual conduce a la pérdida de un catión tert-butilo, relativamente estable. La descarboxilación del ácido carbámico da lugar al grupo amino desprotegido del indol, mientras que la pérdida de un protón del catión tert- butilo da lugar a isobutileno. Esquema 13. Condiciones de reacción para la desprotección de 47. El compuesto 9 es un sólido café-rojizo con p.f. de 112ºC que coincide con el reportado (ref. 114-116ºC) y con los datos espectroscópicos descritos.3 El último paso para sintetizar la Caulerpina consistió en someter a 9 a la reacción de condensación aldólica, usando piperidina y ácido acético en reflujo de tolueno, manteniendo la temperatura elevada durante media hora (Esquema 14); además se N O OO 1 2 33a 4 5 6 7 7a 3' 1' 1'' 1''' 1''' 1''' O O 2' 2'' 2''' N O O O 47 Boc N O O O 9 86% H ATF CH2Cl2 Reflujo 1h DISCUSIÓN DE RESULTADOS 25 utilizó una trampa de Dean-Stark para remover el agua del medio y favorecer así la formación del dímero. Después de la purificación por cromatografía en columna, 1a se obtuvo con un rendimiento del 64% y un rendimiento global del 28%. Cabe resaltar que con este método, el tiempo de reacción para la obtención de 1a fue menor que en las metodologías reportadas por Canché-Chay3 y Maiti,2 siendo el rendimiento de la reacción mayor que el de ambas metodologías. Esquema 14. Condiciones de reacción para la síntesis de 1a. La Caulerpina 1a es un sólido rojizo que presenta un p.f. de 315°C valor que coincide con el valor reportado (ref. 318°C3). Además la estructura de 1a fue corroborada por RMN de 1H y 13C, así como por EM, datos que coinciden con los datos espectroscópicos reportados para el producto natural.3 V.3 Síntesis de los análogos de la Caulerpina (1b-1d). La síntesis de los análogos 1b-1d inició con la preparación de los xantatos 49a y 49b. El ditiocarbonato 49a se obtuvo usando como materia prima al 2-bromoacetato de etilo, y para el xantato 49b el 2-cloroacetato de tert-butilo. La reacción de sustitución nucleofílica de las materias primas antes mencionadas, con la sal de potasio del ditiocarbonato de O-etilo (19), en acetonitrilo a 0ºC, dió 49a y 49b en excelentes rendimientos (Esquema 15). N N O O OO 1a N O O O Piperidina, AcOH 9 64% Tolueno Reflujo, Dean-Stark 30 minH H H DISCUSIÓN DE RESULTADOS 26 Esquema 15. Obtención de los xantatos 49a y 49b. Ambos ditiocarbonatos se obtuvieron como dos aceites amarillos. Las estructuras de los xantatos 49a y 49b fueron corroboradas por RMN 1H, las cuales coinciden con los datos espectroscópicos reportados.46, 47 Posteriormente se continuó con la protección N1 del formilindol 50, utilizando las mismas condiciones con las que se obtuvo 46, produciendo el indol N-Boc 51 en rendimiento cuantitativo (Esquema 16). Esquema 16. Condiciones de para la protección de 50. El compuesto 51 es un sólido blanco cuya estructura fue corroborada al comparar el punto de fusión del producto (244ºC) con el valor descrito para el mismo compuesto (ref. 240°C48). Una vez sintetizadas las materias primas, se realizó la alquilación aromática radicalaria-oxidativa sobre los carboxaldehídos 14, 46 y 51.46 La reacción se llevó a 47 Woulfe, S. R.; Miller, M. J. J. Org. Chem. 1986, 51, 3133-3139. 48 Bardiot, D.; Carlens, G.; Dallmeier, K.; Kaptein, S.; Mcnaughton, M.; Marchand, A.; Neyts, J.; Smets, W. PCT Int. Appl. 2013, Patent WO2013045516 A1. OR1 X O OR1 S O O S KS OEt S CH3CN 0ºC, 1h48a, X= Br 48b, X=Cl 49a, R1= Et, 94% 49b, R1= t-Bu, 96% 19 N O N O 50 51 100% (Boc)2O TEA, DMAP CH2Cl2 H Boc NC NC DISCUSIÓN DE RESULTADOS 27 cabo adicionando cada hora de manera directa, el iniciador (DLP) a la solución, previamente desgasificada de las materias primas en DCE y manteniendo la reacción en reflujo bajo atmósfera de N2, generando los índoles 52a-52c con rendimientos de bajos a buenos (Esquema 17 y Tabla 1). Esquema 17. Condiciones de reacción para la alquilación aromática radicalaria- oxidativa de 14, 46 y 51. Tabla 1. Condiciones de reacción para la síntesis de 52a-52c. Compuesto R1 R2 R3 Equivalentes de xantato Equivalentes de DLP Rendimiento (%) 52a H H t-Bu 1.5 1.8 61 52b H Boc Et 1.5 1.8 36 52c CN Boc Me 1.5 1.8 23 El compuesto 52b también se intentó preparar mediante una reacción de transesterificación del indol 47, utilizando la base Na2CO3 y EtOH como disolvente. Sin embargo, después de 4 días de reacción solo se observó, por ccf, trazas de 52b y otros subproductos (Esquema 18). Esquema 18. Condiciones de reacción para la transesterificación de 47. OR3 S O O S 45, 49a y 49b N O 14, 46 y 51 DLP DCE N O O O R3 + Reflujo 6 h R2 R2 R1 R1 52a-52c N O O O 47 Boc N O O O 52b Trazas Boc Na2CO3 EtOH 4 días DISCUSIÓN DE RESULTADOS 28 El compuesto 52a se obtuvo como un sólido café-rojizo con p.f. de 52-54°C, el indol 52b como un sólido rojizo con p.f. de 108°C, en tanto que 52c es un sólido naranja con p.f de 102-104°C. La identificación estructural de los compuestos 52a-52b se llevó a cabo por los métodos convencionales de espectroscopia y espectrometría. Por ejemplo, en el espectro de RMN 1H del compuesto 52b se observó un singulete en 10.34 ppm, que integró para 1H, que se asignó a H-C3’; dos multipletes, uno centrado en 8.27ppm y otro en 8.07ppm, que integraron para 1H; se adjudicaron a H-C4 y H-C7, respectivamente; mientras que el multiplete centrado en 7.37 ppm, cuya integración correspondió a 2H, se atribuyó a H-C5 y HC6; un singulete en 4.51 ppm, que integró para 2H, corresponde a H-C2’; el cuadruplete en 4.20 ppm (J= 7.2 Hz), que integró para 2H, se asigno a H-C2’’’; el singulete, que integró para 9H; en 1.69 ppm se atribuyó a los hidrógenos de los metilos unidos a H-C1’’’; finalmente, el triplete en 1.27 ppm (J= 7.2 Hz), que integró para 3H, se asignó al metilo del éster etílico H- C2’’’’. En el espectro de RMN 13C de 52b se observaron cinco señales alifáticas en 86.2 ppm, 61.4 ppm, 32.9 ppm, 28.0 ppm y 14.1 ppm; que correspondena C1’’, C2’’’, C2', C1’’’ y C2’’’’ respectivamente. También se observaron ocho señales aromáticas, de las cuales cuatro correspondieron a CH (125.5 ppm, 124.5 ppm, 120.7 ppm y 115.4 ppm) y cuatro a carbonos cuaternarios, los desplazamientos fueron los siguientes: 142.5 ppm, 135.7 ppm, 126.1 ppm y 119.1 ppm. El carbono del aldehído (C3’) apareció en 185.6 ppm, el carbono del éster (C2’’) se observó en 168.8 ppm, mientras que el carbono del carbamato (C1’) se mostró en 149.8 ppm. En cuanto al espectro de IR de 52b, la banda que aparece en 2850 cm-1 corresponde al estiramiento del CHO, en 1731 cm-1 el estiramiento del carbonilo del éster, en 1676 cm-1 el estiramiento de carbonilo del carbamato. En su espectro de masas se observó un ion molecular a m/z 332, que es el que se espera para esta molécula. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 29 Figura 7. Caracterización del compuesto 52b. Una vez sintetizados los indoles 52b y 52c, el siguiente paso consistió en la desprotección del N-Boc mediante una hidrólisis ácida, empleando las mismas condiciones usadas para desproteger 47, obteniendo 53b y 53c en buenos rendimientos (Esquema 19). Esquema 19. Condiciones de reacción para la N-Boc desprotección de 52b y 52c. El compuesto 53b se obtuvo como un sólido de naranja-rojizo con p.f. de 138°C, mientras que el producto 53c es un sólido amarillo con p.f. de 194°C. La estructura de ambos indoles 53b y 53c fue determinada por métodos de espectroscopia y espectrometría; el espectro de RMN 1H del indol 53b mostró en 10.24 ppm un singulete, que integró para 1H, asignado al H-N1; en 9.98 ppm apareció un singulete ancho, que integró para 1H, correspondiente a H-C3’; por otra parte, los dos multipletes centrados en 8.18 ppm y 7.41 ppm, y que integraron para 1H cada uno, se adjudicaron a H-C4 y H-C7; el multiplete centrado en 7.28 ppm, que integró para 2H, se atribuyó a H-C5 y H-C6; el cuadruplete en 4.27 ppm (J= 5.7, 13.4 Hz), que integró para 2H; se asignó a H-C2’’’; también en 4.27 ppm se sobrepone un singulete, que integró para 2H, que se adjudicó a H-C2’; finalmente N O OO O O 1 2 33a 4 5 6 7 7a 1' 1'' 1''' 1''' 1''' 3' 2' 2'' 2''' 2'''' N O O O R2 52b y 52c Boc N O O O R2 53b, R1= H, R2= Et, 78% 53c, R1= CN, R2= Me, 62% H ATF CH2Cl2 Reflujo 1h R1 R1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 30 el triplete, que integró para 3H, en 1.33 ppm (J= 7.2 Hz) se atribuyó a los hidrógenos del metilo del éster H-C2’’’’. En el espectro de RMN 13C de 53b se observaron tres señales alifáticas en 62.0 ppm, 31.4 ppm y 14.1 ppm; que corresponden a C2’’’, C2’ y C2’’’’, respectivamente. Además, se presentaron ocho carbonos aromáticos, de los cuales cuatro fueron C- H en 123.7 ppm, 122.8 ppm, 120.1 ppm, y 111.4 ppm; y los restantes cuatro correspondieron a carbonos cuaternarios en 140.3 ppm, 135.0 ppm, 126.0 ppm y 114.5 ppm. Por último, los carbonos carbonílicos C3’ y C2’’ se presentaron en 184.3 ppm y 170.0 ppm. El espectro de IR de 53b mostró en 3151 cm-1 la banda de estiramiento del NH, en 2847 cm-1 la señal de estiramiento del aldehído y en 1723 cm-1 se observó la banda de estiramiento del éster. Su espectro de masas mostró el ion molecular esperado a m/z 232. Figura 8. Caracterización del compuesto 53b. Los análogos de la Caulerpina (1b-1d) fueron sintetizados mediante la reacción de condensación aldólica de los índoles 52a, 53b y 53c, bajo las mismas condiciones utilizadas para la obtención de la Caulerpina (1a), con buenos rendimientos (Esquema 20, Tabla 2). Esquema 20. Condiciones de reacción para la condensación aldólica de 52a, 53b y 53c. N O H O O 1 2 33a 4 5 6 7 7a 3' 2' 2'' 2''' 2'''' N N O O OO R2 R2 1b-1d N O O O R2 Piperidina, AcOH 52a, 53b y 53c Tolueno Reflujo, Dean-Stark 30 minH H H R1 R1 R1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 31 Tabla 2. Condiciones de reacción para la obtención de los análogos de Caulerpina (1b-1d). Compuesto R1 R2 Relación piperidina: AcOH Rendimiento (%) Rendimiento global (%) 1b H t-Bu 1:1 41 25 1c H Et 1:1 69 19 1d CN Me 1:1 87 12 También se intentó sintetizar el compuesto 1b mediante la esterificación del ácido carboxílico 46 con tert-butanol, en medio ácido,49 sin embargo la materia prima no reaccionó incluso cuando se cambió el disolvente a AcOEt, pensando que era un problema de solubilidad (Esquema 21). Esquema 21. Condiciones de reacción para la esterificación de 55. El compuesto 1b es un sólido café-rojizo que se descompone a 220°C, 1c se obtuvo como un sólido naranja-rojizo con p.f. de 258°C, en tanto que 1d es un sólido naranja con p.f. mayor a 300°C. La elucidación estructural de los análogos de la Caulerpina (1b-1d) se llevó a cabo por métodos espectroscópicos y de espectrometría. Debido a la simetría C2 del compuesto 1b su espectro RMN 1H mostró un singulete ancho en 9.38 ppm, que 49 Wright, S. W.; Hageman, D. L.; Wright, A. S.; McClure, L. D. Tetrahedron Letters, Vol. 38, No. 42, pp. 7345- 7348, 1997 N N O OH OHO H H N N O O OO 1b H H H2SO4, MgSO4, t-BuOH 55 CH2Cl2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 32 integró para 2H, y que se asignó a H-N5 y H-N12; el singulete en 7.93 ppm, que integró para 2H, se adjudicó a H-C7 y H-C14; el doblete en 7.42 ppm (J= 7.8 Hz), el cual integró para 2H, se atribuyó a H-C1 y H-C8; el doblete en 7.29 ppm (J= 8.1 Hz), que integró para 2H, se asignó a H-C4 y H-C11; el triplete en 7.17 ppm (J= 6.9 Hz), cuya integración fue de 2H, se adjudicó a H-C3 y H-C10 en tanto que el triplete a 7.09 ppm (J= 7.8 Hz), que integró para 2H, se atribuyó a H-C2 y H-C9; finalmente, el singulete en 1.62 ppm, integró para 18 H, se asignó a los hidrógenos de los metilos de los grupos tert-butilo. La información antes descrita se complementó con las señales del espectro de RMN 13C de 1b en el cual se observaron dos señales alifáticas en 82.2 ppm (C6’’, y C13’’) y en 28.2 ppm (C6’’’ y C13’’’). También se observaron diez señales aromáticas, de las cuales cinco corresponden a metinos cuyos desplazamientos son 141.6 ppm, 123.1 ppm, 120.5 ppm, 117.8 ppm y 111.5 ppm; y cinco a carbonos cuaternarios en 137.7 ppm, 133.3 ppm, 128.2 ppm, 127.2 ppm y 112.3 ppm. Finalmente los carbonos carbonílicos (C6’ y C13’) aparecieron en 165.6 ppm. El espectro de IR de 1b mostró la banda del NH en 3341 cm-1, el estiramiento del éster apareció en 1681 cm-1, en tanto que en 1392 cm-1 se distinguió la señal del tert-butilo. Por último, en su espectro de masas se observó un ion molecular a m/z 483 que es el que se esperaba para esta molécula. Figura 9. Caracterización del compuesto 1b. N N OO O O H H 5 5a 14a 14b 1 2 3 4 4a 14 13 13' 13'' 13'''13'''13''' 6 6' 6'' 6''' 6'''6''' 7 7a 7b 8 9 10 11 11a12 12a DISCUSIÓN DE RESULTADOS 33 V.4 Esquema de síntesis de los derivados de la Caulerpina. A partir de la Caulerpina, se planteó llevar a cabo la síntesis de los compuestos 54- 57 de acuerdo al siguiente esquema: Esquema 22. Síntesis de los derivados de la Caulerpina (54-57). Condiciones de reacción: i) Pd/C, H2 en AcOEt/MeOH (1:1) a t. a.; ii)KOH, EtOH ac.; iii) Boc2O, TEA, DMAP en CH2Cl2; iv) LiBH4 en MeOH. N N O O OO 1a H H N N O O OO 54 H H N N OO Boc Boc 56 O O N N O OH OHO 55 H H N N HO Boc Boc 57 OH ii iii i iv DISCUSIÓN DE RESULTADOS 34 V.5 Síntesis de los derivados de Caulerpina (54-57). Una vez obtenida la Caulerpina (1a) se procedió a realizar la síntesis de sus derivados (54-57). El proceso se inició con la hidrogenación catalítica de la Caulerpina (1a), utilizando como catalizador Pd/C y como disolvente una mezcla de AcOEt/MeOH. El producto que se obtuvo fue el pentaciclo 54, resultado de la adición de una sola molécula de hidrógeno, en un rendimientoregular (Esquema 23); observando, por ccf, que 54 es ligeramente más polar que la Caulerpina (1a). Esquema 23. Condiciones de reacción para la síntesis de 54. El compuesto 54 se obtuvo como un sólido naranja rojizo con p.f. de 208°C. Su espectro de resonancia magnética de protón mostró las señales de H-N5 y H-N12 como dos singuletes, que integraron para 1H cada uno, en 8.91 ppm y 8.67 ppm, respectivamente; H-C7 apareció como un singulete en 8.38 ppm, que integró para 1H; H-C1 se expreso como un doble de dobles en 7.67 ppm (J=6.9, 1.8 Hz), que integró para 1H; H-C8 y H-C4 se observaron como dos dobletes en 7.63 ppm (J= 7.8 Hz) y 7.35 ppm (J= 8.1 Hz), respectivamente, e integraron cada uno para 1H; el multiplete centrado en 7.20 ppm, que integró para 5H, se atribuyó a los hidrógenos H-C9, H-C10, H-C11, H-C2 y H-C3; el doble de dobles en 4.35 ppm (J= 10.8, 3.9 Hz), que integró para 1H, se asignó a H-C13; los metilos H-C6’’ y H-C13’’ aparecieron como dos singuletes en 3.97 ppm y 3.77, respectivamente, integrando para 3H cada uno; por último, H-C14 se observó como un multiplete centrado en 3.43 ppm que integró para 2H. N N O O OO 1a H H N N O O OO 54 65% H H Pd/C, H2 AcOEt/MeOH (1:1), t. a. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 35 El espectro de RMN 13C de 54 confirmó su estructura, ya que en el se identificaron dos señales alifáticas en 52.7 ppm y 52.4 ppm, que corresponden a C6’’ y C13’’, respectivamente. También se observaron veinte señales aromáticas, de las cuales nueve fueron carbonos metínicos a 134.3 ppm, 123.3 ppm, 123.1 ppm, 120.6 ppm, 119.4 ppm, 118.7 ppm, 117.6 ppm, 111.1 ppm y 110.6 ppm; además, se observaron nueve carbonos cuaternarios en 136.1 ppm, 134.5 ppm, 134.4 ppm, 134.4 ppm, 131.1 ppm, 129.3 ppm, 126.8 ppm, 115.3 ppm y 109.7 ppm; las señales restantes de los metinos C7 y del C14 se observaron a 46.1 ppm y 23.8 ppm, respectivamente. Por último, los carbonilos C13’ y C6’ originaron las señales a 172.2 ppm y 168.3 ppm, respectivamente. El espectro de IR del dicarboxilato de metilo 54 mostró la señal del estiramiento de las aminas secundarias a 3394 cm-1 y 3295 cm-1; los estiramientos de los carbonilos de éster en 1708 cm-1 y 1683 cm-1. En su espectro de masas se observó un ion molecular de m/z 401 que es el que se espera para esta molécula. Figura 10. Caracterización del compuesto 54. La siguiente transformación que se realizó fue la hidrólisis de la Caulerpina (1a) en medio básico de KOH, en reflujo de EtOH acuoso (Esquema 24). Un posible mecanismo de reacción es que el ion hidróxido formado ataca al átomo de carbono electrofílico de los esteres metílicos, en una reacción reversible, para dar lugar a un ion carboxilato que conduce a la eliminación del métoxido, los posteriores equilibrios ácido-base favorecen la formación del producto. El ácido carboxílico 55 se obtuvo en excelentes rendimientos. N N OO O O H H 5 5a 14a14b 1 2 3 4 4a 6 6' 6'' 7 7a 12a 13 13' 13'' 14 12 11a 11 10 9 8 7b DISCUSIÓN DE RESULTADOS 36 Esquema 24. Condiciones de reacción para la hidrólisis de 1a. El compuesto 55 es un sólido café con p.f. mayor a 350°C. La caracterización de 55 se logró utilizando métodos espectroscópicos usuales: su espectro de RMN de protón mostró los hidrógenos de los hidroxilos H-O6’’ y HO-13’’ como un singulete ancho que integró para 2H en 12.87 ppm; la señal de H-N5 y H-N12 se observó también como un singulete ancho en 11.26 ppm, que integró para 2H; H-C7 y H- C14 se mostraron como un singulete en 8.12 ppm cuya integración correspondió a 2H; H-C8 y H-C1 aparecieron como un doblete en 7.40 ppm (J= 9.0 Hz), que integró para 2H; H-C4 y H-C11 se identificaron como un doblete en 7.32 ppm (J= 8.1 Hz), que integró para 2H; H-C3 y H-C10 se observaron como un triplete en 7.12 ppm (J= 7.2 Hz), que integró para 2H; finalmente las señales de H-C2 y H-C9 aparecieron como un triplete en 7.02 ppm (J= 7.5 Hz) cuya integración correspondió a 2H. El espectro de RMN 13C de 55 confirmó su estructura, ya que en el se identificaron diez señales aromáticas, de las cuales cinco fueron para CH aromáticos (140.9 ppm, 122.4 ppm, 119.7 ppm, 117.6 ppm y 111.6 ppm), y cinco correspondieron a señales de carbonos aromáticos cuaternarios (137.4 ppm, 133.3 ppm, 126.9 ppm, 126.8 ppm y 111.0 ppm). Por último, la presencia de los carbonos carboxílicos C6’ y C13’ fue manifestada por la señal en 166.7 ppm. En su espectro de IR se logró identificar la aparición de la banda de estiramiento del COOH en 3423 cm-1. Su espectro de masas mostró la presencia del ion molecular de m/z 371 que era el esperado para esta molécula. N N O O OO 1a H H N N O OH OHO 55 100% H H KOH EtOH ac DISCUSIÓN DE RESULTADOS 37 Figura 11. Caracterización del compuesto 55. Después, se preparó el compuesto N,N-diBoc de la Caulerpina (1a) con (Boc)2O, utilizando las mismas condiciones bajo las que se protegió el indol 14, obteniendo 56 en rendimiento cuantitativo (Esquema 25). Esta reacción se siguió con ccf, con el fin de determinar el momento en el que toda la materia prima se hubiera consumido variando el tiempo de la reacción entre 2-3h . Esquema 25. Condiciones de reacción para la protección de 1a. El N,N-di-tert-butilo 56 es un sólido amarillo con p.f. de 188-190°C. La elucidación estructural del compuesto 56 se logró examinando su espectro de RMN 1H en el cual se pudo apreciar que las señales correspondientes a H-C1 y H-C8 aparecen como un doblete en 8.07 ppm (J= 8.4 Hz), que integró para 2H; H-C7 y H-C14 dan un singulete en 7.96 ppm, que integró para 2H; H-C4 y H-C11 se detectaron como un doblete en 7.39 ppm (J= 7.8 Hz), que integró para 2H; mientras que H-C3 y H- C10 dan un triplete en 7.27 ppm (t, J= 7.2 Hz, 2H), que integró para 2H; H-C2 y H- C9 aparecen como un multiplete centrado en 7.18 ppm, que integró para 2H; H-C6’’ y H-C13’’ se visualizan en 3.69 ppm como un singulete que integró para 6H; N N O OH OHO H H 12 12a 7a 7b 8 9 10 11 11a 7 6 6' 6'' 13 13' 13'' 14 14a 14b 1 2 3 4 4a 5 5a N N OO 1a Boc Boc N N O O OO 56 100% H H (Boc)2O TEA, DMAP CH2Cl2 O O DISCUSIÓN DE RESULTADOS 38 finalmente la señal de los metilos H-C5’’’ y H-C12’’’ aparecen como un singulete en 1.50 ppm que integró para 18H. La información descrita anteriormente fue corroborada por el espectro de RMN de 13C de 56, en el cual fue posible observar tres señales alifáticas en 84.9 ppm, 52.3 ppm y 27.9 ppm, la primera señal corresponde a C5’’ y C12’’, la segunda a C6’’ y C13’’ y la tercera a C5’’’ y C12’’’. También se observaron diez señales aromáticas, de las cuales cinco correspondían a carbonos metínicos en 135.4 ppm, 125.6 ppm, 123.2 ppm, 118.7 ppm y 115.8; asimismo, se observaron cinco carbonos aromáticos cuaternarios presentes en 137.2 ppm, 132.2 ppm, 131.3 ppm, 128.0 ppm y 121.0 ppm. Por último, la señal de los carbonilos de los esteres C6’ y C13’ apareció a 165.7 ppm y la señal de C5’ y C12’ se observó en 149.6 ppm. El espectro de IR del N,N-di-tert-butilo 56 mostró la señal del estiramiento del carbonilo del éster en 1734 cm-1 y la señal del estiramiento del tert-butilo en 1394 cm-1 y 1359 cm-1, en tanto en el espectro de masas se observó un ion molecular a m/z 598, que es el que se espera para esta molécula. Figura 12. Caracterización del compuesto 56. Cuando se intentó realizar la conversión de los ésteres de la Caulerpina (1a) al correspondiente diol 57, utilizando LiBH4 como agente reductor en MeOH, se observó que 1a no se disolvía homogéneamente en el disolvente por lo que se decidió cambiar por THF, no obstante la reacción no procedió a la formación de 57 (Esquema 26). N N O O O OO O O O 5 5a 14a 14b 1 2 3 4 4a 5' 5'' 5''' 5''' 5''' 6' 6'' 6 7 7a 7b 8 9 10 11 11a12 12a 13 14 13' 13'' 12' 12'' 12'''12''' 12'''DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39 Esquema 26. Condiciones de reacción para la síntesis de 57. Lo anterior pudo pasar debido a que la Caulerpina (1a) no era soluble por completo en el disolvente. Debido a los inconvenientes mencionados anteriormente, se optó por utilizar la caulerpina N,N-diprotegida 56 como materia prima y cambiar de agente reductor, empleando esta vez DIBAL-H y CH2Cl2 como disolvente (Esquema 27). Esquema 27. Reducción del compuesto N,N-diprotegido 56 con DIBAL-H. A pesar de haber realizado los cambios en las condiciones de reacción, sólo se redujo uno de los dos ésteres de 56 formándose únicamente el alcohol 58 a las 4 horas de reacción con un rendimiento del 40%, mientras que el compuesto 59 se formó después de 96 horas de reacción con un rendimiento del 19%, además de la formación de subproductos. Con el objetivo de aumentar el rendimiento del alcohol 58 se aumentó la cantidad de equivalentes de DIBAL-H, lo que provocó, además del incremento, una reducción en el tiempo de reacción (Tabla 3). N N OO H H 1a O O N N HO H H 57 OH LiBH4 THF N N OO Boc Boc 56 O O N N HO Boc Boc 58 O O DIBAL-H CH2Cl2 -78ºC + N N O Boc 59 O O O DISCUSIÓN DE RESULTADOS 40 Tabla 3. Condiciones de reacción para la síntesis de 58 y 59. Compuesto Equivalentes de DIBAL-H Tiempo de reacción Rendimiento (%) 58 2.5 4 h 40 58 3 3 h 52 59 2.5 96 h 19 El alcohol 58 se obtuvo como un sólido amarillo con p.f. de 190°C. Su espectro de RMN 1H muestra a campo bajo dos dobletes en 8.06 ppm (J= 8.4 Hz) y 8.00 ppm (J= 8.1 Hz), que integraron para 1H cada uno, asignados a H-C1 y H-C8; la señal para H-C7 aparece como un singulete en 7.90 ppm, cuya integración correspondió a 1H; en 7.37 ppm (J= 7.8 Hz) se observó un doblete que integró para 2H correspondiente a H-C13’; en tanto que la señal de H-C2 y H-C9 y la señal de H-C3 y H-C10 se observaron como dos tripletes en 7.24 ppm y 7.15 ppm, respectivamente, que integraron para 2H cada uno; H-C14 apareció en 6.84 ppm como un singulete que integró para 1H; en 5.22 ppm se detectó la señal del H-O13’’ como un singulete ancho que integró para 1H; en 4.35 ppm (J= 13.2 Hz) se identificó H-C11 como un doblete que integró para 1H; H-C4 se mostró como un doble de dobles en 4.27 ppm (J= 13.4 Hz), que integró para 1H; los hidrógenos del metilo H- C6’’ dan un singulete en 3.70 ppm que integró para 3H; finalmente las señales de H-C5’’’ y H-C12’’’ aparecieron en 1.54 ppm y 1.49 ppm, respectivamente, como dos singuletes que integraron para 9H cada uno. El espectro de RMN 13C de 58, confirmó su estructura, ya que en el se identificaron seis señales alifáticas en 84.8 ppm, 84.4 ppm, 66.0 ppm, 52.2 ppm, 28.0 ppm, 27.9 ppm; que correspondieron a C12’’, C5’’, C13’, C6’’, C5’’’ y C12’’’, respectivamente. Además se observaron veinte señales aromáticas, de las cuales diez fueron C-H que correspondieron a 134.6 ppm, 125.3 ppm, 125.2 ppm, 123.3 ppm, 122.7 ppm, 122.5 ppm, 118.7 ppm, 118.6 ppm, 115.8 ppm y 115.6 ppm; de igual manera se observaron diez carbonos aromáticos cuaternarios presentes en 142.5 ppm, 137.3 ppm, 137.0 ppm, 134.8 ppm, 132.4 ppm, 130.2 ppm, 128.4 ppm, 128.4 ppm, 122.4 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 41 ppm y 121.2 ppm. Los carbonos carbonílicos del éster C6’ y de los carbamatos C12’ y C5’ aparecieron en 166.1 ppm, 149.8 ppm y 149.7 ppm, respectivamente. El espectro de IR del alcohol 58 mostró la señal del estiramiento del grupo hidroxilo en 3512 cm-1, las señal del estiramiento del carbonilo del éster en 1731 cm-1 y las señales de los estiramientos de los tert-butilo en 1393 cm-1 y 1364 cm-1. Por último, su espectro de masas mostró un ion molecular de m/z 570 que es el esperado para esta molécula. Figura 13. Caracterización del compuesto 58. El 1,3-oxazino 59 es un sólido naranja. La caracterización del compuesto 59 se realizó mediante el análisis de su espectro de RMN de protón que mostró a H-C1 y H-C8 como dos dobletes en 8.15 ppm (J= 8.1 Hz ) y 8.04 ppm (J= 8.1 Hz ), respectivamente, que integraron para 1H cada uno; en 7.77 ppm se observó H-C14 como un singulete que integró para 1H; mientras que H-C4 apareció en 7.46 ppm (J= 7.5 Hz) como un doblete que integró para 1H; en 7.36 ppm (J= 6.9 Hz) se visualizó un triplete que integró para 2H que se asignó a H-C2 y H-C9; se identificó un multiplete centrado en 7.28 ppm correspondiente a H-C3 y HC10, el cual integró para 2H; en 7.18 ppm (J= 7.2 Hz) se observó a H-C11 como un triplete que integró para 1H; H-C7 dio un singulete en 6.88 ppm, que integró para 1H; el doble de dobles a 4.97 ppm( J= 8.4 Hz), que integró para 2H, se atribuyó a H-C6’; el singulete que integró para 3H, a 3.69 ppm correspondió a H-C13’’; finalmente la señal que se N N O O O OO HO O 5 5a 14a 14b 1 2 3 4 4a 5' 5'' 5''' 5''' 5''' 6' 6'' 6 7 7a 7b 8 9 10 11 11a 12 12a 13 14 13' 12' 12'' 12'''12''' 12''' 13'' DISCUSIÓN DE RESULTADOS 42 visualizó en 1.54 ppm como un singulete a 1.54 ppm, que integró para 9H, se asignó a los hidrógenos H-C12’’’. El espectro de RMN 13C de 59, confirmó su estructura, ya que mostró cuatro señales para carbonos alifáticos en 85.0 ppm, 73.6 ppm, 52.3 ppm y 27.8 ppm, que corresponden a C12’’, C6’, C13’’ y C12’’’, respectivamente. Además de veinte señales para carbonos aromáticos, de los cuales diez fueron metinos a 137.1 ppm, 128.1 ppm, 126.5 ppm, 125.6 ppm, 124.6 ppm, 123.1 ppm, 118.9 ppm, 117.9 ppm, 115.7 ppm y 115.4 ppm; las diez señales restantes correspondieron a carbonos cuaternarios en 137.3 ppm, 136.2 ppm, 131.9 ppm, 131.6 ppm, 131.4 ppm, 128.9 ppm, 128.3 ppm, 125.2 ppm, 119.6 ppm y 117.5 ppm. Finalmente, los carbonos carbonílicos C13’, C5’ y C12’ aparecieron en 165.8 ppm, 149.6 ppm y 147.3 ppm, respectivamente. Figura 14. Caracterización del compuesto 59. Posteriormente se realizó la desprotección del N-Boc de 59 mediante su hidrólisis en medio ácido con ATF y CH2Cl2 como disolvente. La reacción se mantuvo en reflujo durante una hora, obteniendo 60 en un rendimiento del 84% y un rendimiento global del 16% (Esquema 28). N N O O 5 5a 14a 14b 1 2 3 4 4a 5' 6' 6 7 7a 7b 8 9 10 11 11a 12 O O O O 12'' 12'''12'''12''' 12' 12a 1313' 13'' 14 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 43 Esquema 28. Condiciones de reacción para la desprotección de 59. El compuesto 60 es un sólido café-rojizo con p.f. de 190°C. La elucidación estructural del carboxilato de metilo 60 se llevó a cabo por métodos usuales de espectroscopia y espectrometría, así su espectro de RMN 1H mostró en 9.00 ppm un singulete ancho atribuido a H-N12; H-C1 se observó en 8.14 ppm (J= 8.1 Hz) como un doblete que integró para 1H; en 7.68 ppm apareció H-C7 como un singulete que integró para 1H; en 7.37 ppm (J= 7.8 Hz) se observó un triplete que integró para 2H correspondiente a H-C4 y H-C11; en tanto que H-C8, H-C10 y H-C3 se mostraron como un multiplete centrado en 7.27 ppm que integró para 3H; en 7.13 ppm (J= 7.2) y 7.05 (J= 8.1) ppm se encontraron las señales de H-C9 y H-C2, respectivamente, como dos tripletes que integraron para 1H cada uno; H-C14 se observó en 6.81 ppm como un singulete que integró para 1H; en tanto que H-C6’ apareció en 4.88 ppm como un singulete que integró para 2H; finalmente H-C13’’ apareció en 3.85 ppm como un singulete cuya integración correspondió a 3H. La información antes descrita se complementó con las señales del espectro de RMN 13C de 60, en el cual se observaron dos señales alifáticas en 73.9 ppm y 52.8 ppm; que corresponden a C6’ y C13’’, respectivamente. También se observaron veinte señales aromáticas, de las cuales diez corresponden a metinos (140.7 ppm, 131.4 ppm, 126.2 ppm, 124.5 ppm, 123.6 ppm, 120.9 ppm, 118.1 ppm, 117.9 ppm, 115.5 ppm y 111.6 ppm) y los diez restantes a carbonos cuaternarios (138.2 ppm, 138.1 ppm,
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