Transfeccion-genica-de-un-parasito-taenido

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
Instituto de Investigaciones Biomédicas 
Biología Experimental 
 
 
TRANSFECCIÓN GÉNICA DE UN PARÁSITO TAENIDO 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA: 
Bárbara Beatriz Moguel Rodríguez 
 
TUTOR PRINCIPAL: Dr. Juan Pedro Laclette San Román, Instituto de Investigaciones 
Biomédicas, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: Dr. Luis Herrera Estrella, Langebio/Centro de Investigaciones y 
Estudios Avanzados, Irapuato 
 
Dr. Raúl José Bobes Ruiz, Instituto de Investigaciones Biomédicas, 
UNAM 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. Noviembre, 2015 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
Instituto de Investigaciones Biomédicas 
Biología Experimental 
 
 
TRANSFECCIÓN GÉNICA DE UN PARÁSITO TAENIDO 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA: 
Bárbara Beatriz Moguel Rodríguez 
 
TUTOR PRINCIPAL: Dr. Juan Pedro Laclette San Román, Instituto de Investigaciones 
Biomédicas, UNAM 
 
COMITÉ TUTOR: Dr. Luis Herrera Estrella, Langebio/Centro de Investigaciones y 
Estudios Avanzados, Irapuato 
 
Dr. Raúl José Bobes Ruiz, Instituto de Investigaciones Biomédicas, 
UNAM 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. Noviembre, 2015 
 
 
 
 
 
 
 
Dr. IsIdro Avll .... rtinez. 
Olrec:.tor General de Adminiatr.e lón fecol." UNAM. 
Pr • • • nt . 
COORDINACiÓN 
Me perm ito informar a usted que en l. reunión OIdlnañl del ComIté Ac:ad6mico dlf Posgrado en 
Cl80CiaS BIOlógICas cetebrada el OI'a 28 de M pt!embre del 201 5, se aprobO ell6gulente juradO para 
.. ex¡men de grado de DOCTORA EN CENeIAS de la alumna BÁRIIAAA BEATRIZ "OGUEL 
ROORlOUEZ con número de cuenta 511<151218 con la tel ls ~ulada "1RANSFECCIÓN GENteA 
DE UN PARASITO TAENIDO· , ~ balO la direcci6n dll OR JUAN PEDRO LAClETTE SAN 
ROMAN: 
Presidente. 
Vocal 
Secretan..: 
Suplente' 
Suplente 
Dra. María Imekja l6pez Villasenor 
Dr AOfaham l anda Piedra 
Dr. Raül Jose Sobes RulZ 
Ora. Norma Angélu MOteno Mendoz8 
Ola Marfa Dolores Cortaa Btttrán 
Sin otro particu lar, me es grato enviarte un cordillsaaudo. 
ATENTAMENTE 
"POR .. RAZA HABLARA EL ESptRIYU" 
Cd Un.IVfQi!aril, O F , a 9 de oclubre ct.l 2015 
DR!i~EL~~r.~A 
COOR~NADORADElPROGRAMA 
Urm1lKl de: ro,.,n.oo · Coordinadón dtl P indo en CiCft('laJ Biológicas Ed,fX:lo D. Jer. Pl'iO. CIrcUIto de rt'l,grad~ Cd llll\"t.""itana 
OeI~~u,n CoytJftC"Jin C r ().$~I O Méll";:O, Il,F Tel 5(;237002 hit,.·, pcb,ol. f'O~grado.un:lm. rru; 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Al posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM 
 
 
Al programa de becas para estudios de doctorado del CONACYT, CVU/becario: 365865 
 
 
Al financiamiento otorgado por los proyectos de Conacyt 61334 (JPL) y PAPIIT-UNAM 
IN 213711 (JPL) 
 
 
A los miembros del comité tutor 
 
Dr. Juan Pedro Laclette San Román, Instituto de Investigaciones Biomédicas, 
UNAM 
 
Dr. Luis Herrera- Estrella, Langebio/Centro de Investigaciones y Estudios 
Avanzados, Irapuato 
 
Dr. Raúl José Bobes Ruiz, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
 
 
Gracias 
Al Ser supremo que me acompaña en cada paso que doy sin dejarme caer 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, en especial al Instituto de 
Investigaciones Biomédicas, donde me abrieron las puertas y me permitieron continuar 
mi formación académica. 
A México país de oportunidades y gente amable, en donde he cumplido muchos sueños. 
A Guatemala mi país y a la Universidad de San Carlos de Guatemala por prepararme 
para los retos venideros. 
Al Dr. Juan Pedro Laclette por ser más que un guía académico en esta etapa del 
doctorado, por haber aceptado el reto de dirigir mi tesis sin conocerme y por haberme 
dado la oportunidad de comprender que para saber vivir hay que saber disfrutar ver más 
allá de lo que el día a día nos da. 
A mi comité tutor el Dr. Luis Herrera-Estrella y el Dr. Raúl Bobes, por su asesoría y 
apoyo. 
A la Dra. Norma Angélica Moreno Mendoza por aceptarme en su laboratorio de tiempo 
completo y con muy buena disposición asesorarme en el trabajo de las células 
germinales. Además, por su cariño y apoyo más allá de la academia. Y a sus alumnos que 
siempre me hicieron sentir parte del grupo y en quienes encontré grandes amigos 
Al Dr. Julio Carrero y a la M. en C. Patricia de la Torre por su disposición a brindarme 
asesorías. 
Al Dr. Paul Brindley por recibirme en su laboratorio en la Universidad G. Washington, 
por su asesoría y apoyo. Al Dr. Gabriel Rinaldi y a la Dra. Victoria Mann, por su apoyo 
durante mi estancia. 
A mis compañeros de laboratorio, quienes son más que compañeros ya que a lo largo 
de estos años hemos compartido éxitos y fracasos, risas y llantos, lo cual nos ha 
consolidado como amigos seguramente de vida. Juli, Adriana, Milka, José, Hugo, Jean, 
Oscar, Yanis. A los que estuvieron por poco tiempo pero dejaron huella. 
A las personas que me apoyaron con el desarrollo de diferentes técnicas 
Biol. Beatriz Hernández Téllez por su apoyo en la estandarización de la 
inmunoperoxidasa, Pedro Medina por su apoyo en los cortes semi-finos y finos para 
microscopia electrónica, Ing. José Navarrete Perea y M. en C. Yuliet Marcela Díaz por 
su apoyo en los de western blots, M. en C. Patricia de la Torre por su apoyo constante 
en el laboratorio, Dr. Miguel Tapia por su apoyo en la unidad de microscopia y al QFB 
Carlos Castellanos por su apoyo en la unidad de citofluorometría. 
A mi mamá Elvia Rodríguez mujer de fuerza y decisión quien me ha guiado con amor en 
este camino de vida. 
A mi papá Romeo Moguel porque cada consejo brindado ha sido invaluable para 
continuar subiendo peldaños y por enseñarme que el amor mueve montañas. 
A Julio Israel Guerrero Hernández y nuestra pequeña Matilde por hacer mi mundo un 
mundo maravilloso y llenarlo de nuevos colores. 
A mis hermanos José Gabriel y Mariana porque sin su amor y respaldo el mundo no 
sería igual. Además, a mis cuñados Mayra y Jacobo por su amor fraternal. 
A mis sobrinos Zoe Monserrat y José Andrés, que con sus sonrisas transforman mi 
mundo. 
 
 
 
 
 
A mis abuelitas Adelina y Yolanda por ser mujeres ejemplares llenas de sabiduría, 
quienes me han llenado de amor de abuelitas. 
A mis tíos, tías, primos, primas, sobrinos y sobrinas, quienes me han enseñado el 
verdadero valor de la familia. Han estado cerca de mí recorriendo este desafío y 
llenándome de bendiciones. Especialmente a Guda y Sylvia que han estado muy 
cerquita desde el inicio hasta el final de este reto. 
A mi tía Sylvia Rivera Rodríguez, por su apoyo y dedicación en la revisión de documentos 
y manuscritos, tanto en inglés como en español. 
A mis amigos de la vida quienes son solidarios a pesar de las distancias o circunstancias 
de la vida. Dicen que los amigos son tesoros que se van guardando a lo largo del camino, 
y yo en esta etapa de mi vida me siento millonaria por esos amigos con quienes nos 
identificamos de diversas maneras y me hacen sentir dichosa porque puedo decir tengo 
tesoros regados por el mundo. 
A mis amigos en elexilio académico, porque sin ustedes la tristeza no bailaría. Me 
siento muy unida a ustedes, quizás por las circunstancias o quizás por la identificación 
de lo vivido, aunque yo más creo que es por el amor que hemos construido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 A Isra y Mati, mis amores perfectos 
 
 
Tarda meses el paciente 
Juego con cuerdas proteicas para construir un embrión 
Juego que recién hoy cumple 6 semanas 
Los genes compiten en este momento 
Por ocupar un lugar de expresión en esta maquinaria que se forma 
Y que culminará en el ser más maravilloso en mi vida 
Un ser que viene a transformar mi forma egoísta y animal de ver el mundo 
El poder que continúa mis genes por otra generación 
Una transición bella y compartida 
Mitad y mitad con el compañero ideal 
Amor que va más allá de la preservación genética 
En un acto de egoísmo acompañado del altruismo puro 
Para poder permitir a toda costa que un nuevo ser 
Tome forma y sobreviva 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
I. RESUMEN .................................................................................................................... 1 
ABSTRACT ..................................................................................................................... 2 
II. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 3 
1. Teniasis y Cisticercosis ............................................................................................ 3 
2. Taenia solium (Linnaeus, 1758) ............................................................................... 5 
3. Taenia crassiceps (Zeder, 1800) .............................................................................. 6 
4. Transfección ............................................................................................................. 8 
5. Estrategias para la transfección estable .................................................................... 9 
6. Células germinales .................................................................................................. 11 
III. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 13 
1. Objetivos específicos ............................................................................................. 13 
IV. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 14 
V. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 16 
1. Cultivo y mantenimiento de cisticercos de T. crassiceps cepa ORF ...................... 16 
2. Transfección de cisticercos de T. crassiceps cepa ORF ......................................... 16 
3. Inmunohistoquímica ............................................................................................... 18 
4. Análisis por RT-PCR .............................................................................................. 20 
5. Análisis por western blot ........................................................................................ 21 
6. Búsqueda de las secuencias de genes PL10 (similares a Vasa) en la base de datos 
del genoma de T. solium ............................................................................................. 22 
7. Aislamiento de células germinales de T. crassiceps............................................... 22 
8. Citometría de flujo .................................................................................................. 23 
9. Diseño de plásmidos para transfección estable en células aisladas y cisticercos de 
T. crassiceps ............................................................................................................... 23 
10. Clonación y expansión de los plásmidos .............................................................. 23 
11. Transfección estable de cisticercos de T. crassiceps por microinyección ............ 24 
VI. RESULTADOS ........................................................................................................ 25 
1. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps ................................. 25 
2. Stem cell-like tissue and phenotypes in cultures of cysticerci of Taenia crassiceps 
(Manuscrito en Preparación) ...................................................................................... 34 
3. Transfección estable en cisticercos de Taenia crassiceps utilizando dos promotores 
de Taenia solium ......................................................................................................... 52 
VII. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 57 
VIII. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 62 
IX. ANEXOS .................................................................................................................. 69 
1. Differential antigenic protein recovery from Taenia solium cyst tissues using 
several detergents. Navarrete-Perea J, Orozco-Ramírez R, Moguel B, Sciutto E, 
 
 
 
 
 
Bobes RJ, Laclette JP.Mol Biochem Parasitol. 2015 Sep 1; 202(1):22-28. doi: 
10.1016/j.molbiopara.2015.08.005. ............................................................................ 69 
2. Transfection of Platyhelminthes. Moguel B, Bobes RJ, Carrero JC, Laclette JP. 
Biomed Res Int. 2015;2015: 206161. doi: 10.1155/2015/206161. Epub 2015 May 18. 
Review. ....................................................................................................................... 70 
3. Identification and quantification of host proteins in the vesicular fluid of porcine 
Taenia solium cysticerci. Navarrete-Perea J, Moguel B, Mendoza-Hernández G, 
Fragoso G, Sciutto E, Bobes RJ, Laclette JP. Exp Parasitol. 2014 Aug; 143:11-7. doi: 
10.1016/j.exppara.2014.04.011. ................................................................................. 71 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
I. RESUMEN 
Taenia solium es un parásito cestodo que causa teniasis en humanos y cisticercosis en 
humanos y cerdos. La neurocisticercosis es la manifestación más severa de esta 
parasitosis, la cual está distribuida a nivel mundial y está relacionada con pobreza. Por 
varias décadas Taenia crassiceps ha sido usado como el modelo murino de la cisticercosis, 
permitiendo avances importantes en la comprensión de esta enfermedad. El objetivo de 
este estudio de tesis fue lograr la introducción de genes heterólogos en cisticercos 
completos o células germinales de T. crassiceps. Los resultados se dividieron en tres 
secciones que hacen referencia a los tres objetivos específicos propuestos. La primera 
sección describe la estandarización exitosa del protocolo para lograr la transfección 
transitoria en cisticercos completos de T. crassiceps. El procedimiento se basa en la 
administración de un plásmido con un promotor de citomegalovirus y un gen reportero 
para la proteína verde fluorescente. La segunda sección hace referencia a la localización, 
identificación y aislamiento de células de la línea germinal en cisticercos de T. crassiceps. 
Esta caracterización se desarrolló utilizando el anticuerpo policlonal α-DDX4/Vasa. En la 
tercera sección se hace referencia a los resultados obtenidos utilizando construcciones 
diseñadas para lograr una transfección estable, a través de la integración de un gen 
heterólogo al genoma de T. crassiceps. Estas construcciones se diseñaron utilizando la 
maquinaria del transposón piggyBac y promotores de genes altamente transcritos de T. 
solium. Los resultados mostraron expresión de la GFP hasta 8 días después de la 
transfección. La disponibilidad de una transfección transitoria fácil y reproducible hace 
factible diversasintervenciones genéticas en estos organismos, entre las cuales pudieran 
estar: dilucidar interacciones proteína-proteína, vías de señalización, localización de 
genes blancos para el desarrollo de nuevas drogas y vacunas, etc. Por otro lado, contar 
con una línea de células germinales de estos parásitos, abre muchas opciones de 
experimentación en los cisticercos. Con este trabajo se sientan las bases para desarrollar 
una genómica funcional en parásitos cestodos dirigida a resolver preguntas aún sin 
contestar en relación a la cisticercosis. Finalmente, los avances en este parásito pueden 
servir como modelo en parásitos relacionados. 
 
 
 
 
 
2 
 
ABSTRACT 
Taenia solium is a tapeworm parasite that causes human taeniasis and cysticercosis in 
humans and pigs. Neurocysticercosis is the most severe manifestation of the disease, 
which is related to poverty and distributed worldwide. Taenia crassiceps for decades has 
been used as a murine model for cysticercosis, enabling significant advances in the 
understanding of this disease. The aim of this thesis was to achieve the introduction of 
heterologous genes in whole or germinal cells cysticerci of T. crassiceps. The results are 
divided into three sections that refer to the three specific objectives proposed. The first 
section describes the successful standardization of the protocol for transient transfection 
in complete cysticerci of T. crassiceps, as the first step to answer several questions still 
inaccessible in relation to cysticercosis. The second section refers to the location, 
identification, and isolation of germinal cells from cysticerci of T. crassiceps. This 
characterization was developed using polyclonal marker α-DDX4/Vasa. In the third 
section shows the results obtained using constructions to achieve stable transfection, 
through heterologous gene integration into the genome of T. crassiceps. Using piggyBac 
transposon machinery and highly transcribed promoters of T. solium, GFP expression was 
observed up to 8 days after transfection. The availability of an easy and reproducible 
transfection makes possible various genetic interventions in these organisms, to 
elucidate protein-protein interactions, signaling pathways, localization of target genes for 
the development of new drugs and vaccines, etc. In addition, having cells lines from these 
parasites will facilitate specific in vitro assays. This work establishes the basis for 
developing functional genomics in these tapeworm parasites and gives a new direction 
to resolve unanswered questions in relation to cysticercosis. Moreover, advances utilizing 
this parasite can serve as a model in related parasites. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
II. INTRODUCCIÓN 
1. Teniasis y Cisticercosis 
Los términos “cisticercosis” y “teniasis”, se refieren a una infección del ser humano y del 
cerdo, provocada por el estadio larvario y gusano adulto del genero Taenia (Murrell 2013). La 
cisticercosis es una de las zoonosis más frecuentes a nivel mundial (Takayanagui 2013) y está 
incluida dentro del listado de las 17 enfermedades tropicales desatendidas (NTDs) 
identificadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), ver tabla 1 (Berkowitz et al. 
2015). Además, se considera una enfermedad desatendida relacionada con la pobreza, la falta 
de higiene, las deficiencias en la vigilancia epidemiológica y otros aspectos socioculturales 
(Willingham and Engels 2006). Dentro del cuerpo humano los cisticercos pueden desarrollarse 
en diversos tejidos, así como en el sistema nervioso central causando la neurocisticercosis, la 
forma más severa de la enfermedad (Murrell-WHO 2005). 
 En países en desarrollo, en los cuales la infección por Taenia solium es endémica en humanos 
y cerdos, la neurocisticercosis es una infección del sistema nervioso central (SNC) y la causa 
más frecuente de epilepsia (Flisser et al. 2006). Una revisión publicada en 2015 coloca a la 
neurocisticercosis dentro de las 4 NTDs que reportan complicaciones neurológicas de manera 
frecuente, junto a Chagas, equinococosis y rabia. Estas enfermedades mantienen una alta 
incidencia y una asociación con las manifestaciones neurológicas (Berkowitz et al. 2015). Se 
estima que alrededor de 50 millones de personas a nivel mundial padecen 
Teniasis/cisticercosis, dentro de las cuales 7.5 millones sufren de epilepsia y de estas el 29% 
se encuentran en países considerados endémicos (Berkowitz et al. 2015; Murrell 2013). La 
incidencia de la Teniasis/cisticercosis es difícil de evaluar, debido a que los síntomas son 
altamente heterogéneos y su diagnóstico requiere estudios neuro-radiológicos, los cuales no 
siempre están disponibles para todas las poblaciones en riesgo. 
Actualmente, existen dos visiones en cuanto a la situación de la enfermedad en México; 
algunos estudios muestran que aún existe una transmisión activa en zonas rurales (Fleury et 
al. 2010; Michelet et al. 2011), y se argumenta que el número de pacientes hospitalizados por 
neurocisticercosis en el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía no muestra una 
disminución significativa entre 1995 y 2001 (Velasquez-Perez and Jimenez-Marcial 2004). En 
contraste, otros reportes de México sugieren que la enfermedad no constituye actualmente 
un problema de salud pública, debido a campañas de educación y vigilancia (Flisser and Correa 
2010; Garcia et al. 2005). Sin embargo, en Estados Unidos y otros países no endémicos la 
cisticercosis se considera una enfermedad emergente debido a la inmigración de personas 
 
 
 
4 
 
portadoras de Taenia solium provenientes de regiones endémicas (Keane 2010; Larralde et al. 
1990; Leshem et al. 2011; Moskowitz and Mendelsohn 2010; Sorvillo et al. 2011). 
 
Tabla 1: Características de las enfermedades descuidadas relacionadas con manifestaciones 
neurológicas. 
 
 
Tomada de (Berkowitz et al. 2015) 
 
 
 
 
 
 
5 
 
2. Taenia solium (Linnaeus, 1758) 
El agente causal de la cisticercosis humana y porcina es el cisticerco de la T. solium (Larralde et 
al. 1990). Las especies de Taenia se encuentran dentro de los gusanos ténidos más característicos 
que infectan carnívoros y humanos como huésped definitivo, además la familia Taenidae es única 
dentro de Eucestoda ya que requiere dos huéspedes mamíferos obligatorios para su transmisión. 
Las especies de Taenia fueron los primeros helmintos conocidos en humanos, con registros muy 
antiguos (Hoberg et al. 2000). En términos ontogénicos, la historia de vida y ecología, las especies 
de Taenia han recibido considerable atención y son las que mejor se comprenden entre todos los 
eucéstodos (Hoberg 2006). En la tabla 2 se presenta la clasificación que presenta el NCBI (National 
Center for Biotechnology Information) para Taenia solium, basada en las actualizaciones que se 
hacen constantemente a esta base de datos. 
 
Tabla 2: Clasificación taxonómica de Taenia solium 
 Eukaryota 
 Opisthokonta 
 Metazoa 
 Eumetazoa 
 Bilateria 
 Platyhelminthes 
 Cestoda 
 Eucestoda 
 Cyclophillidae 
 Taeniidae 
 Taenia 
Taenia solium 
 
El ciclo de vida de la T. solium (Fig. 1) incluye tres estadios: huevo (embrión hexacanto), larva 
(cisticercos o metacéstodos) y adulto (lombriz solitaria). El ciclo de vida consiste en el desarrollo 
de los cisticercos a partir de los huevos, tras ser ingeridos por humanos o cerdos. Los cisticercos 
se convierten en adultos al ser ingeridos por los humanos en la carne de cerdo infestada. La 
solitaria (gusano adulto) vive en el intestino delgado del humano y produce cientos de miles de 
huevos que se expulsan al ambiente diariamente, los cuales pueden ser ingeridos por el cerdo y 
así completar el ciclo. Cada huevo tiene el potencial para convertirse en un cisticerco, 
ocasionando la cisticercosis porcina o humana. Parte del ciclo implica que el humanoconsuma 
http://es.wikipedia.org/wiki/Carolus_Linnaeus
 
 
 
6 
 
carne de cerdo mal cocida e infestada con cisticercos. La falta de higiene y la convivencia con un 
portador del parásito adulto son factores que favorecen la transmisión de la cisticercosis humana, 
desarrollando principalmente la neurocisticercosis (Willms, Vargas-parada y Laclette, Portal 
Cistimex (dirección); Willingham A.L. et al., 2006). Ver ciclo de vida de T. solium en figura 1. 
 
 
 
Figura 1. Ciclo de vida de la T. solium (Ilustración de A. Viniegra, tomada del portal Cistimex) 
 
Existe una extensa literatura acerca de diversos temas relacionados a la cisticercosis: biología, 
inmunología, patofisiología, y tratamiento entre otros (Flisser et al. 2010; Mahanty et al. 2010; 
Takayanagui 2013). Sin embargo, un enfoque relevante para facilitar el estudio de la cisticercosis 
fue establecer modelos usando parásitos similares a la T. solium que permitiera su manipulación 
in vivo e in vitro (Willms and Zurabian 2010). 
 
3. Taenia crassiceps (Zeder, 1800) 
T. crassiceps ha sido un buen modelo murino de cisticercosis debido a su capacidad de producir 
gemaciones, lo cual permite mantener una línea viable por inoculación de metacéstodos al 
peritoneo de un ratón que no ha tenido contacto previo con el parásito (Chernin 1975; Dorais 
and Esch 1969; Freeman 1962), siendo posible además mantenerlos en cultivo in vitro por algunos 
días (Esch and Smyth 1976; Taylor 1963). Este modelo murino ha facilitado el avance en el estudio 
 
 
 
7 
 
de la biología del parásito, ayudando a conocer y comprender el requerimiento de factores 
hormonales (Castellanos-Sanchez et al. 2009; Escobedo et al. 2010; Fragoso et al. 2008; Morales-
Montor et al. 2002), genéticos (Fragoso et al. 1996; Hill and Zarlenga 1996; Sciutto et al. 1990) e 
inmunológicos del huésped para su desarrollo (Toenjes and Kuhn 2003; Toenjes et al. 1999; 
Toledo et al. 1999; Valdez et al. 1994; Vazquez-Talavera et al. 2001). Una peculiaridad de la T. 
crassiceps consiste en que el cisticerco puede multiplicarse por gemación y regenerar cisticercos 
completos a partir de agregados celulares aislados in vitro (Toledo et al. 1997). Se han logrado 
aislar cuatro cepas de T. crassiceps las cuales han sido mantenidas en condiciones de laboratorio: 
WFU, ORF, HYG y KBS. La cepa ORF es la más utilizada por su rápida taza de reproducción, la cual 
ha perdido la capacidad de formar escólex y alcanzar el estadio adulto (Dorais and Esch 1969; 
Everhart et al. 2004). En la tabla 3 se presenta la clasificación taxonómica de la T. crassiceps. 
 
Tabla 3: Clasificación taxonómica de Taenia crassiceps 
 Eukaryota 
 Opisthokonta 
 Metazoa 
 Eumetazoa 
 Bilateria 
 Platyhelminthes 
 Cestoda 
 Eucestoda 
 Cyclophillidae 
 Taeniidae 
 Taenia 
 Taenia crassiceps 
 
Estos céstodos infectan naturalmente zorros rojos y del ártico, lobos y perros como huéspedes 
definitivos y pequeños roedores incluyendo ratones como huéspedes intermediarios (Willms and 
Zurabian 2010). También se han reportado infecciones por T. crassiceps en humanos, incluyendo 
pacientes inmunocomprometidos e inmunocompetentes. T. crassiceps ha sido reportada en 
Francia y otros países de Europa, especialmente Alemania y Noruega, así como en Norte América 
y el este y norte de Asia (Francois et al. 1998; Stien et al. 2010). Los metacéstodos han sido 
encontrados en diferentes tejidos incluyendo músculo subcutáneo y SNC, así como en el cerebelo 
(Francois et al. 1998; Ntoukas et al. 2013). Ciclo de vida de T. crassiceps figura 2. 
 
 
 
8 
 
 
Figura 2: Ciclo de vida de T. crassiceps: A) condiciones de laboratorio; B) Condiciones naturales. 
 
4. Transfección 
La transfección o transgénesis, consiste en la introducción y expresión de material genético ajeno 
en un organismo eucarionte (Davis et al. 1999), semejante a la transformación en bacterias. Esta 
transfección puede ser transitoria y utilizar la maquinaria transcripcional del organismo receptor 
de manera episomal, o ser estable e integrarse a los cromosomas. Es una herramienta esencial 
para evaluar la función de genes en cualquier organismo, y sería de gran utilidad en parásitos, ya 
que también permitiría validar blancos moleculares para el desarrollo de nuevas drogas y vacunas 
(Lok 2012). 
Durante las pasadas décadas se han conseguido grandes avances en la capacidad para introducir 
genes funcionales en células eucariotas. En algunos casos, la transfección logra incorporar el 
material génico heterólogo al genoma del organismo receptor, mientras que en otros casos solo 
se logran transfecciones transitorias (Kalinna and Brindley 2007). Actualmente, es posible 
transformar o transfectar células de una variedad de organismos que van desde organismos 
unicelulares hasta células de mamíferos y organismos completos (Boyle and Yoshino 2003; 
Kalinna and Brindley 2007). La transformación genética es una herramienta potencial para el 
análisis de la función de genes y para identificar nuevos blancos para drogas y vacunas en gusanos 
parásitos (Shao et al. 2012). 
Entre los parásitos, se han logrado transformaciones funcionales en protozoos, por ejemplo en 
Trypanosoma cruzi, Entamoeba histolytica (DaRocha et al. 2004; Hamann et al. 1995; Nickel and 
Tannich 1994; Purdy et al. 1994) y T. brucei, por medio de electroporación y el bombardeo de 
partículas (Hara et al. 2002). Los promotores más utilizados incluyen al del citomegalovirus (CMV) 
(Hara et al. 2002), la actina (Hamann et al. 1995; Moguel et al. 2015a; Nickel and Tannich 1994; 
Condiciones de laboratorio Ciclo de vida naturalA 
B 
 
 
 
9 
 
Purdy et al. 1994), y otros específicos de parásitos como: hgl1 (Purdy et al. 1994), 1F8 (Thomas 
and Gonzalez 1997), gapdh (DaRocha et al. 2004), entre otros. 
Entre los gusanos nematodos, sin duda el organismo más utilizado en estudios de genética 
funcional es el Caenorhabditis elegans, en el cual se realizaron los primeros intentos de 
transfección en 1985 (Mello et al. 1991; Stinchcomb et al. 1985). Desde entonces se ha 
acumulado una considerable experiencia en la expresión funcional y el silenciamiento de genes, 
así como en la manipulación con RNA de interferencia (Brooks et al. 2003; Fire 2007; Tabara et 
al. 1998; Timmons et al. 2003). Entre los gusanos parásitos, se han transfectado nemátodos como 
Ascaris suum, Brugia malayi, Litomosoides sigmodontis (Lok 2012). Por ejemplo, en B. malayi, se 
han transfectado larvas infectantes y embriones a través de microinyección y bombardeo de 
partículas (Higazi et al. 2002). Entre los gusanos planos o Platelmintos, se han transfectado 
tremátodos del género Schistosoma, en el caso de S. mansoni, se han logrado avances exitosos 
utilizando diferentes metodologías de transfección (Brindley and Pearce 2007; Kalinna and 
Brindley 2007). Por ejemplo, al comparar la eficiencia de transfección en S. mansoni, por 
bombardeo de partículas o por electroporación, se demostró que la electroporación era más 
efectiva tanto en esporoquistes como en esquistosómulas (Cheng and Davis 2007). En otro 
ejemplo, utilizando el bombardeo de partículas se logró la expresión de genes reporteros como 
la proteína verde fluorescente dirigida por el promotor de la proteína de estrés calórico (Hsp70) 
(Heyers et al. 2003). Además, se reportó la expresión citoplasmática de la proteína fluorescente 
en S. japonicum, al transfectar por medio de electroporación, utilizando el plásmido PEGF-C1, con 
el promotor de CMV, (Yang et al. 2007). Parece claro que en Schistosoma la transfección por 
electroporación ha sido la técnica más efectiva (Kalinna and Brindley 2007). 
En el caso de los céstodos, solo se han reportado transfecciones transitorias y de silenciamiento 
por iRNA para Echinococcus multilocularis, Hymenolepis microstomaand Moniezia expansa 
(Brehm and Spiliotis 2008; Pierson et al. 2010; Pouchkina-Stantcheva et al. 2013; Spiliotis et al. 
2008; Spiliotis et al. 2010). Se trata de un grupo de organismos parásitos que claramente requiere 
de mayor experimentación. 
 
5. Estrategias para la transfección estable 
En estudios que pretenden evaluar la expresión o función de genes, la transfección transitoria es 
suficiente. Sin embargo, en investigaciones que quieren abordar aspectos celulares o moleculares 
de la respuesta inmune del huésped en contra del parásito, la expresión heredable es necesaria 
(Hagen et al. 2012). Existen diversas estrategias para abordar la integración de genes heterólogos 
al genoma de un organismo huésped. Una estrategia muy novedosa y que se propone como un 
 
 
 
10 
 
buen sistema para introducir genes heterólogos en parásitos helmintos es CRISPR/Cas, que hasta 
el momento ha sido utilizado en diversas líneas celulares, obteniendo resultados exitosos (Burt 
2003; Oye et al. 2014). Sin embargo, en parásitos helmintos, los avances son escasos debido a su 
amplia diversidad celular poco caracterizada, a sus ciclos de vida complejos, a la dificultad para 
lograr penetrar superficies resistentes (p. ej. tegumento y cutícula), y a la ausencia de líneas 
celulares inmortalizadas (Hagen et al. 2012). La mayoría de reportes sobre transfección estable 
son en Schistosoma (Moguel et al. 2015a), y las estrategias más utilizadas que permiten la 
recombinación homóloga con resultados positivos han sido los retrovirus y los transposones 
(Alrefaei et al. 2011; Kines et al. 2008; Kines et al. 2010; Mann et al. 2014; Morales et al. 2007). 
Los transposones son una herramienta útil en el estudio de genómica funcional en diversos 
taxones (Lok 2012). El transposón PiggyBac del genoma de la polilla del gusano falso medidor 
Trichoplusia ni (Morales et al. 2007), tiene la capacidad de transferir información genética a 
diversas especies (Lok 2012; Sumitani et al. 2003). Asimismo, tiene capacidad para introducir 
relativamente largas cadenas de DNA a otros trasposones, generando un rango eficiente de 
transgenes sin reducción en la frecuencia de inserción, a diferencia de otros transposones como 
“sleeping beauty” que pierde la eficiencia de transposición con transgenes grandes (Ding et al. 
2005; Geurts et al. 2003; Karsi et al. 2001; Wilson et al. 2007). Tiene la habilidad de insertarse en 
diversas unidades transcripcionales y re-movilizarse sin dejar un patrón de secuencias no 
escindidas o huellas en el genoma (Lok 2012). Diversos estudios in vitro, han demostrado que la 
sobreproducción del plásmido ayudante que expresa la transposasa, en relación con el plásmido 
donante, no disminuyen la eficiencia y frecuencia de la transposición, fenómeno que 
normalmente afecta a otros elementos genéticos móviles (MGEs) (Geurts et al. 2003; Wilson et 
al. 2007; Zayed et al. 2004). Naturalmente los MEGs se encuentran en el genoma de parásitos y 
algunos parecen originarse por transferencia horizontal del huésped, siendo conductores 
importantes en la evolución genómica en organismos eucariotas (Lok 2012). Asimismo, se han 
obtenido buenos resultados en la producción de transgénesis de parásitos helmintos y 
nemátodos (Morales et al. 2007; Shao et al. 2012). Actualmente, una ventaja en el uso de la 
transgénesis como herramienta de manipulación genética, ha sido contar con la información de 
los genomas de diversos parásitos (Alrefaei et al. 2011). Estos esfuerzos de secuenciación, son 
una fuente de información invaluable que permite avanzar en el conocimiento de la biología y la 
evolución de parásitos helmintos. Desde otra perspectiva, esta información nos ayuda a 
comprender las interacciones huésped-parásito en función del descubrimiento de blancos para 
el desarrollo de nuevas drogas y/o vacunas (Hagen et al. 2012). 
 
 
 
 
11 
 
6. Células germinales 
Los modelos de homeostasis más utilizados en invertebrados han sido Drosophila melanogaster 
y C. elegans, sin embargo, son en gran medida post-mitóticos y debido a esto no sirven como 
modelos para regeneración de tejidos, ni para estudios biológicos de células troncales (stem cells) 
somáticas. Las células troncales de vertebrados han sido estudiadas por sus implicaciones de 
relevancia médica, pero la accesibilidad a este grupo celular es limitada (Agata and Umesono 
2008). Se ha descrito que el citoplasma de las células germinales está compuesto de diversos 
organelos electro-densos, los cuales no delimitan la membrana plasmática. Los gránulos polares 
parecen estar asociados con RNAs solo en los estadios de oogénesis y embriogénesis cuando el 
plasma polar es capaz de incluir el desarrollo germinal, pero no en estadios tardíos (Hay et al. 
1988b). Estos organelos electro-densos en Drosophila reciben el nombre de gránulos polares, en 
C. elegans gránulos-P, en ratón y en planarias cuerpos cromatoides, mientras en los anfibios son 
los gránulos germinales (Balinsky 1966; Mahowald 1968), el conjunto de estos organelos se 
conocen como “nuage” (Solana and Romero 2009). Desde hace ya varias décadas estos gránulos 
se han propuesto como candidatos para marcadores de células germinales, por su localización 
exclusiva en citoplasma germinal (Hay et al. 1988a). 
Es bien conocido que los gusanos planos contienen un grupo de células totipotenciales 
pertenecientes a un sistema de células troncales. Estas células proliferativas también llamadas 
“neoblastos” en gusanos de vida libre, “células germinales” en el caso de parásitos obligados 
(Spiliotis et al. 2008) y “células germinativas” exclusivamente en cestodos (Koziol et al. 2014), son 
la única fuente de células regenerativas durante la homeostasis, desarrollo y regeneración. 
Además, dan lugar a todos los tipos celulares incluyendo las células germinales (De Mulder et al. 
2009; Newmark and Sanchez Alvarado 2000; Pfister et al. 2007). En gusanos planos las células 
germinales han sido principalmente descritas en Dugesia japónica (Shibata et al. 1999) y 
Macrostomus lignano (Pfister et al. 2007), los cuales son buenos modelos para el estudio de 
líneas celulares, ya que son fáciles de mantener en cultivo y de manipular. Otro organismo 
propuesto como modelo para el estudio de células germinales fue Isodiametra pulchra, este 
organismo se describió como un gusano plano y recientemente se posicionó filogenéticamente 
en la base de los Bilateria (De Mulder et al. 2009). 
Dentro de los marcadores más utilizados para células germinales está una proteína llamada Vasa, 
que fue originalmente identificada en Drosophila como un gen esencial en el desarrollo de la línea 
germinal (Hay et al. 1988b). La función de Vasa está relacionada a la regulación de la traducción 
en la determinación y mantenimiento de células germinales. Vasa ha sido encontrada típicamente 
dentro del nuage (Hay et al. 1988a; Hay et al. 1988b). La función de Vasa en el nuage como 
 
 
 
12 
 
regulador de la traducción podría ser como un control de calidad en la depuración de mRNA, 
siempre en la primer ronda de la traducción (Maquat et al. 2010). Vasa es parte de la familia de 
proteínas DEAD-box y posee una secuencia consenso L-D-E-A-D-X-(M/L)-L-X-X-G-F, la cual se 
comparte con otros miembros de esta familia (elF4A, p68 y PL10), estas reflejan un único motivo-
B de proteínas de unión a ATP (Linder et al. 1989). En la planaria D. japonica se describió “Vasa-
like gene A” (DjvlgA), un gen perteneciente a las RNA helicasas DDX3/PL10 DEAD-box, una familia 
cercanamente relacionada a Vasa. DjvlgA se expresa en la línea germinal y neoblasto de las 
planarias (Shibata et al. 1999). En el caso de Schmidtea polychroa el gen homólogo a DjvlgA, 
“Vasa-like gene A” (SpolvlgA) fue estudiado y se observó que tenía un patrón de expresión similar 
a DjvlgA, distribuido a lo largo del parénquima en gusanos asexuales, y en testículos y ovarios en 
gusanossexuales (Solana and Romero 2009). Vasa (DDX4), el marcador por excelencia de células 
de línea germinal y células troncales está ausente en ténidos y tremátodos. En su lugar dos copias 
del gen PL10/DDX3 (estructuralmente muy similar) han sido encontradas en ambos linajes. 
Además, en una publicación de nuestro grupo, se ha especulado que PL10 en gusanos planos de 
vida libre suple funcionalmente a Vasa, por la pérdida de la funcionalidad redundante del gen 
Vasa en el ancestro común de gusanos planos y tremátodos (Tsai et al. 2013). Ambos, Vasa y PL10 
han sido reportados para el monogeneo Neobenedenia girellae. Sin embargo, en Gyrodactylus 
salaris, otro monogeneo, solo se encontró una copia del gen de la proteína PL10/DDX3. Por lo 
que se discute que la pérdida de Vasa no es una característica específica para gusanos planos y 
trematodos. La razón de por qué estos dos monogeneos monopistocotílidos difieren en la 
ausencia o presencia de Vasa, aún no es clara, posiblemente se trate de grupos parafiléticos1 
(Hahn et al. 2014). Esto resalta la necesidad de estudiar estos genes Vasa/DDX4 y PL10/DDX3 en 
otros platelmintos, para dilucidar en qué momento evolutivo se perdió Vasa para que PL10 
asumiera su función. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
III. OBJETIVO GENERAL 
El objetivo del presente proyecto de tesis fue el de establecer un método reproducible para la 
transfección de cisticercos enteros y de células germinales de Taenia crassiceps, usando diversos 
métodos, tales como la microinyección. Alcanzar este objetivo permitirá un mejor acercamiento 
a preguntas sobre la biología del parásito, además de abrir nuevas posibilidades para la 
manipulación de los Ténidos. 
 
1. Objetivos específicos 
A. Lograr una transfección funcional para la expresión transitoria de la proteína verde 
fluorescente en cisticercos de T. crassiceps 
B. Localizar y aislar células de línea germinal de Taenia crassiceps. 
C. Lograr una transfección estable en cisticercos o células germinales de T. crassiceps 
 
 
 
 
 
 
14 
 
IV. JUSTIFICACIÓN 
Durante décadas se han implementado métodos de transfección en diferentes organismos 
incluyendo diversas líneas celulares de mamíferos. Sin embargo, el avance en células de parásitos 
helmintos es limitado (Brindley and Pearce 2007; Suttiprapa et al. 2012). En el caso de la 
transfección directa sobre gusanos planos o platelmintos, y en especial en céstodos, el avance es 
aún más limitado (Davis et al. 1999). En contraste, en el caso de los organismos del género 
Schistosoma los avances han sido mayores (Moguel et al. 2015a). La carencia de líneas celulares 
en los platelmintos ha sido un factor limitante en el avance de la genómica funcional, por lo que 
varios grupos han propuesto diferentes métodos para la obtención de células de la línea germinal 
(Albani et al. 2013; Brehm and Spiliotis 2008). En el presente proyecto de tesis, pretendemos 
combinar una serie de herramientas para introducir DNA heterólogo en los tejidos del cisticerco 
para lograr su expresión funcional, así como avanzar en la identificación y localización de células 
germinales de T. crassiceps. Alcanzar los objetivos planteados tendrá una considerable 
repercusión en los estudios relacionados con parásitos planos, especialmente ténidos, puesto 
que abre nuevas avenidas para la experimentación y comprensión de la regulación de la expresión 
génica. Adicionalmente, disponer de cisticercos con genes heterólogos activos, podría permitir el 
uso de estos parásitos, que establecen relaciones extraordinariamente estables con sus 
huéspedes, como vehículos para la expresión de antígenos vacúnales en contra de otras 
enfermedades. 
La elección de T. crassiceps para este proyecto, obedece no solo a la facilidad con que se 
mantienen los cisticercos en condiciones de laboratorio sino también a ser un modelo murino 
para el estudio de la cisticercosis. Cabe hacer notar que los cisticercos de T. crassiceps se pueden 
mantener y crecer tanto in vitro como en la cavidad peritoneal de ratones singénicos BALB/c. La 
elección de este parásito, obedece también a la posibilidad de utilizar organismos genéticamente 
homogéneos, ya que al propagarlos por transferencia de los cisticercos de un ratón infectado a 
otro receptor, se obtienen poblaciones clonales. Tomando en cuenta que los huéspedes (ratones) 
son singénicos, se reduce la diversidad entre individuos (entre huéspedes y parásitos), y por ende 
la variabilidad de los resultados experimentales. Además, la capacidad de estos cisticercos para 
multiplicarse por gemación, permite aprovecharla durante la propagación y selección de células 
de la línea germinal y de cisticercos enteros transfectados. En caso de lograr la transfección de 
células de la línea germinal, será posible obtener cisticercos totalmente transgénicos. 
El primer reporte de clonación y caracterización de algún gen de un tenido ocurrió en 1990 
(Campos et al. 1990), marcó el inicio de una era para este grupo de parásitos que culminó con la 
descripción de los primeros cuatro genomas de céstodos: T. solium, E. multilocularis, E. 
 
 
 
15 
 
granulosus e H. microstoma (Tsai et al. 2013). Disponer del genoma completo para estos 
organismos parásitos inició una nueva etapa, haciendo posible la caracterización funcional de 
múltiples genes que codifican proteínas hasta ahora desconocidas. Los objetivos planteados en 
el presente proyecto, aportarán información para el desarrollo de la genómica funcional en 
parásitos helmintos y abrirán las puertas para nuevos estudios que aumenten nuestra 
comprensión de los ténidos, más allá de los términos meramente descriptivos que caracterizan 
la situación actual. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
V. MATERIALES Y MÉTODOS 
1. Cultivo y mantenimiento de cisticercos de T. crassiceps cepa ORF 
Todos los experimentos se realizaron utilizando cisticercos de T. crassiceps cepa ORF, los cuales 
se caracterizan por la ausencia de escólex. Los cisticercos fueron mantenidos por pasaje 
intraperitoneal entre ratones hembra BALB/cAnN. Normalmente, se transfieren diez cisticercos 
de un ratón infectado (de tres meses de infección que se sacrifica humanitariamente) a otro no 
infectado de 8 semanas de edad (Sciutto et al. 2011). Los cisticercos colectados de la cavidad 
peritoneal del ratón BALB/cAnN de tres meses de infección, se mantuvieron en condiciones de 
cultivo in vitro a 37˚C y 5% CO2, por 24 horas en medio RPMI suplementado con 10% de Suero 
Bovino Fetal (SBF) y 1 µg/mL de penicilina/estreptomicina (Vazquez-Talavera et al. 2001). 
2. Transfección de cisticercos de T. crassiceps cepa ORF 
Plásmido GFP-TOPO: Se eligió un plásmido que incluyera el gen reportero de la proteína verde 
fluorescente (GFP) bajo el control del promotor de CMV, con el objetivo de poder visualizar la 
proteína por microscopia de fluorescencia. El mapa del plásmido se muestra en la figura 3. 
 
Figura 3: NT-GFP Fusión TOPO (life technologies) 
 
 
 2.1 Electroporación y empapado (soaking) 
Utilizando el sistema de electroporación Neon (Life Technologies) se realizaron varios 
experimentos para estandarizar las condiciones óptimas de transfección. Se colocaron 5 
cisticercos en la cubeta de electroporación en 1 ml de buffer de electroporación (proporcionado 
por el proveedor, específico para este equipo) y se agregaron 3mg del plásmido GFP-TOPO en la 
punta de la pipeta Neon™. Se insertó la pipeta en la posición del dispositivo de transfección 
Neon™ y se seleccionó el protocolo que se requería. Cabe hacer notar que se utilizaron diversos 
 
 
 
17 
 
protocolos de tiempo y descarga antes de determinar las condiciones óptimas. Se sacó la pipeta, 
se colectaron los cisticercos transfectados y se pasaron al medio de cultivo RPMI suplementado 
con SBF y antibiótico.Se incubó a 37˚C y 5% de CO2 y se observó si había evidencia de 
fluorescencia por GFP a las 24 horas. 
En el caso del método de empapado, se colocaron 20 cisticercos en una caja de Petri con 25 ml 
de medio RPMI suplementado con SBF y antibiótico. Al medio con los cisticercos se le agregó 
1µl/ml de plásmido a una concentración de 1µg/µl, se incubó a 37˚C y 5% de CO2. El cultivo se 
observó cada 24 horas, en un microscopio invertido de fluorescencia para evaluar la expresión de 
GFP. 
 
 2.2 Microinyección 
Se seleccionaron cisticercos entre 4-5 mm de diámetro para ser microinyectados. Las agujas para 
micro-inyección fueron fabricadas a partir de capilares de vidrio comerciales (Glass thinW, World 
Precision Instruments, Inc. TW100F-6), usando un extractor “pull type PC-10” (Narishige, Japan) 
que tira el capilar de vidrio verticalmente, usando calor y la fuerza gravitacional de su propio peso. 
Las microagujas fueron cargadas con 3 µg/µL del plásmido GFP-TOPO con trazas de tinta china. 
Cada cisticerco fue inmovilizado en LB agar al cual se le realizó una cavidad de 5 mm en cajas de 
cultivo de 25 mm, para evitar desecación se agregó 50µL de medio de cultivo. Cada cisticerco se 
microinyectó con 3µg del plásmido dentro de la vesícula, permitiendo que se difundiera en el 
fluido vesicular, se utilizó el microinyector “Eppendorf Cell Tram”, ver figura 4. Como control 
negativo algunos cisticercos se transfectaron con agua, otros con tinta china sola y otros con 3µg 
del plásmido pCMV-VSV-G (addgene) el cual está vacío en la región de la GFP. Los cisticercos 
microinyectados fueron transferidos a medio RPMI fresco, manteniéndolos en cultivo in vitro a 
37˚C y 5% de CO2. Los cisticercos sobrevivieron en cultivo hasta una semana después de la 
microinyección y fueron evaluados cada 6 horas, para establecer el tiempo de expresión de la 
GFP. 
 
 
Figura 4: imagen de un cisticerco en el momento de la micro-inyección con el plásmido GFP-TOPO 
mezclado con trazas de tinta china, fijado en LB-agar. 
 
 
 
 
18 
 
La observación de la expresión de la fluorescencia por GFP se realizó utilizando el microscopio 
confocal DSU Olympus, acoplado a una lámpara de fluorescencia con filtros FITC 
(excitación/emisión 450-490/515 nm). Para evitar movilidad de los cisticercos, se colocaron uno 
a uno en un cubreobjetos excavado y se mantuvieron en hielo por 30 min. 
 
Para establecer la diferencia entre la fluorescencia endógena y la fluorescencia por GFP, se 
realizaron mediciones cuantitativas, utilizando un lector de ELISA acoplado a fluorescencia 
llamado “Modulus II Microplate Multimode Reader” (Turner Biosystems). Se colocaron 5 
cisticercos microinyectados con GFP y 5 microinyectados con agua, uno en cada pozo de la placa. 
Las lecturas se realizaron cada hora durante un día, excitando a 478 nm y con una emisión de 507 
nm. Este experimento fue repetido tres veces y se establecieron las diferencias entre tratamiento 
y control utilizando la prueba t-student. 
Para obtener fotografías de buena calidad, puesto que los cisticercos se mueven continuamente, 
fueron fijados con paraformaldehído al 4% en buffer de fosfatos (PBS), pH 7.2, a temperatura 
ambiente durante 20 minutos y rehidratados en sacarosa al 4% en PBS dejándolos toda la noche. 
Después se montaron en portaobjetos utilizando medio de montaje DABCO 2.5%, y se colocaron 
en cubreobjetos excavados. La fluorescencia por GFP en los cisticercos microinyectados fue 
capturada utilizando el microscopio confocal Zeiss (LSM5Pascal; Carl Zeiss). 
 
 
3. Inmunohistoquímica 
3.1 Localización de GFP en tejido de cisticercos de T. crassiceps microinyectados 
Los cisticercos microinyectados con GFP-TOPO, pCMV-VSV-G y con agua fueron procesados para 
inmunohistoquímica después de 24 horas de transfección. Además se procesaron secciones de 
tejido de testículo de ratón transgénico que expresan GFP (B5.GFP), los cuales se incluyeron como 
controles positivos (Hadjantonakis et al. 1998). Todos los tejidos fueron fijados como se describió 
en la sección anterior, posteriormente se les colocaron en medio OCT (optimal cutting 
temperature) (Tissue-Tek; Sakura Finetek) y se congelaron en hexano (J.T. Baker) en hielo seco. 
Se realizaron cortes de 20 μm de grosor. Las secciones fueron permeabilizadas con Triton X-100 
al (Sigma-Aldrich) 0.1% en PBS por 10 minutos y luego se bloquearon utilizando albúmina de 
suero bovino (BSA) (Gibco) a 1% en PBS por dos horas. Luego las secciones fueron incubadas toda 
la noche en anticuerpo policlonal IgG α-GFP hecho en conejo (Life technology), en una dilución 
1:250. Las secciones fueron lavadas cuatro veces con PBS 1X, e incubadas a temperatura 
 
 
 
19 
 
ambiente (TA) por una hora en anticuerpo (en cabra) α- IgG de conejo acoplado a CY3 (Life 
technology), a una dilución 1:200. Finalmente, las secciones fueron montadas en medio de 
montaje para fluorescencia permanente (Dako Cytomation) y fueron guardados a 4°C, para 
posteriormente observarlos al microscopio confocal y capturar las imágenes. Secciones seriadas 
de cada tejido fueron incubadas paralelamente sin anticuerpo primario para descartar 
reconocimiento inespecífico del anticuerpo secundario. Las secciones fueron revisadas y 
capturadas usando un microscopio confocal (LSM5Pascal; Carl Zeiss), equipado con láser de 
“argon–crypton” y “helio–neon lasers”, se utilizaron los filtros FITC y Cy3, y el contraste de 
interferencia de fases Nomarski. 
 
 3.2 Localización de la proteína PL10 (similar a Vasa) en los tejidos de cisticercos de T. 
crassiceps 
 Inmunoperoxidasa 
Cisticercos de T. crassiceps y T. solium fueron lavados con PBS 1X y fijados en solución de Zamboni 
(2% formaldehído, 0.2% ácido pícrico, pH 7.0). Después de ser fijados, los cisticercos fueron 
deshidratados y embebidos en parafina. Los cisticercos fueron cortados en secciones de 5 mm de 
grosor, y transferidos a porta-objetos tratados con poly-l-Lysine (Sigma/PO425) antes de ser 
desparafinados y rehidratados. Para inhibir la actividad de peroxidasa endógena, las secciones 
fueron incubadas con 0.3% of H2O2 por 10 minutos. Después de la inhibición, se realizaron 5 
lavados con PBS 1X y se incubaron con 5% albumina/0.05%Tween 20-PBS, por una hora a 37⁰C. 
Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo policlonal IgG α-DDX4/Vasa (ABCAM) a 37°C 
durante 1 h, en una dilución 1:250 en albúmina al 2% en PBS-Tween 20 al 0.01%. Después de 5 
lavados con albúmina al 2% en PBS-Tween 20 al 0.01%. El tejido fue incubado a 37 ◦C por 30 min 
con el anticuerpo α-IgG de conejo, acoplado a peroxidasa de rábano (HPR) (Life 
Technology/G21234). Luego se reveló utilizando 3-3 DAB (DAKO/K3468). La observación y la 
captura de imágenes se realizaron en el microscopio Olympus BX51. 
Inmuno-oro 
Cinco cisticercos de T. crassiceps y cinco de T. solium fueron fijados con formaldehído al 2% y 
glutaraldehído al 0.25% en PBS 1X (pH 7.4) a 4⁰C, por 2 horas. Los cisticercos fueron 
deshidratados en una solución de etanol (JT Baker) y transferidos a soluciones graduales de etanol 
que iban desde el 30 al 70%. Posteriormente, se pasaron a una solución 2:1 LRW (LR White)–
etanol durante una hora. Se cambiaron a LRW puro (Sigma-Aldrich/62661) y se dejaron por una 
hora. Finalmente, las muestras fueron incubadas en LRW fresco toda la noche y polimerizado en 
capsulas a 60 ⁰C por 24 h. El tejido fue cortado en secciones ultra delgadas de 1 µm. Las secciones 
 
 
 
20 
 
fueron colectadas en rejillas cubiertas con membranas de formvar-carbon, y se dejaron secar 
toda la noche. Las rejillas con el tejido se lavaron con PBS- 0.05% Tween 20 por 15 minutos a TA. 
Luego se colocaron cara arriba PBS-BSA 1% y se incubaron por 15 min. Luego se incubaron toda 
la noche a 4⁰C con el mismo anticuerpo α-DDX4/Vasa a una dilución 1:200. Se realizaron dos 
lavados de 15 minutos conPBS-0.05% Tween 20, seguidos por la incubación de una hora a 
temperatura ambiente (TA), con el anticuerpo (de cabra) α-IgG de conejo acoplado a oro coloidal 
(Electronic microscopy sciences/ 25115), en una dilución 1:20 en PBS 1X. Las rejillas fueron 
lavadas con PBS-Tween20 por 5 min. Finalmente, se lavaron con abundante H2O destilada y se 
dejaron secar. Una vez secas se procedió a la tinción de contraste que consiste en teñir los cortes 
con acetato de uranilo por 15 min y luego con citrato de plomo por 2 minutos. Posteriormente, 
se lavaron con abundante H2O destilada. El tejido se observó y fotografió en un microscopio 
electrónico de transmisión (JEOL JEM 1010). 
 Inmunofluorescencia 
Los cisticercos de T. crassiceps se fijaron como se describió en la sección IV.III.I. Cortes de 20 μm 
de grosor fueron permeabilizadas con Triton X-100 (Sigma-Aldrich/T8787) al 0.1% en PBS por 10 
min y luego fueron bloqueados con BSA al 1% en PBS por dos horas. Los cortes fueron incubados 
toda la noche a 4⁰C con el mismo anticuerpo policlonal α-DDX4/Vasa, descrito en la sección 
anterior. Los cortes de tejido fueron lavados cuatro veces con PBS 1X, y luego incubados a TA por 
una hora con el anticuerpo (de cabra) α-IgG de conejo acoplado a CY3 (Life tech/A10520). 
Finalmente, todos los cortes fueron montados utilizando medio de cultivo para fluorescencia 
permanente (Dako Cytomation/S3023) y guardados a 4°C, para su posterior observación y 
fotografía en el microscopio confocal (LSM5Pascal; Carl Zeiss). Cortes seriados de cada tejido 
fueron incubados paralelamente sin anticuerpo primario para descartar un reconocimiento 
inespecífico del anticuerpo secundario. Este mismo procedimiento se siguió directamente en 
células aisladas de cisticercos de T. crassiceps, adheridas a cubre-objetos incluidos en los cultivos 
después de 72 horas y 6 días. 
 
4. Análisis por RT-PCR 
4.1 Evaluación de la transcripción de GFP en cisticercos de T. crassiceps transfectados 
La transcripción de la GFP fue evaluada por medio de RT-PCR en una reacción de dos pasos. El 
RNA total se aisló de los cisticercos después de 24 h de ser microinyectados, utilizando 
Trizol/cloroformo. La síntesis de cDNA se realizó a partir del RNA total utilizando el SuperScripttm 
III First-Strand (Invitrogen), seguido por un PCR anidado con la Hot StarTaq DNA polimerasa 
(Quiagen), usando dos grupos de cebadores para GFP: secuencia sentido (forward) 5’ 
 
 
 
21 
 
AAGGAGAAGAACTTTTCACTGG y secuencia anti-sentido (reverse); 5´CCGTACCTACTCGAGATGTTT 
para la amplificación inicial que da un fragmento resultante de 707 pb, y un segundo par: 5’ 
AAGGAGAAGAACTTTTCACTGG y 5´GTTTTAAGCGGTGTTGTAAC, para amplificar un fragmento de 
228 pb. Además, se aisló RNA total de células Hek 293 (donación de Marta Romano) (Graham et 
al. 1977), las cuales fueron transfectadas por lipofección con el plásmido GFP-TOPO, y fueron 
utilizadas como otro control positivo. Para visualizar las bandas obtenidas de la amplificación, se 
utilizó un gel 1% en TAE (Tris-Acetate-EDTA) para electroforesis, agregando 0.25 mg/ml de 
bromuro de etidio (Bio-Rad Laboratories). Los geles fueron visualizados y fotografiados utilizando 
el sistema de Bio-imagenes (MiniBis pro, DNS). Para descartar la posibilidad que restos de DNA 
plasmídico (GFP-TOPO) estuvieran actuando como templados para el RT-PCR, se realizó un PCR 
anidado, esta vez excluyendo la reacción de transcriptasa reversa, usando los mismos grupos de 
cebadores y el mismo RNA aislado de los cisticercos microinyectados con el plásmido GFP-TOPO. 
 
5. Análisis por western blot 
 5.1 Identificación de la expresión de la GFP en cisticercos de T. crassiceps transfectados 
Se realizó un ensayo de western blot para evaluar la presencia de la proteína GFP en los cisticercos 
transfectados que mostraban fluorescencia por GFP. Se obtuvieron extractos crudos de proteína 
de los cisticercos a las 24, 48 y 72 h post-transfección con GFP-TOPO, con pCMV-VSV-G, o con 
agua. Además se incluyeron extractos de células Hek 293 transfectadas con GFP-TOPO como 
controles positivos de transfección. La homogenización se realizó usando buffer Laemli 2%: 
50mM Tris-HCL (pH 6.8), 100mM dithiothreitol (DTT), 2% SDS, 0.1% azul de bromofenol y 10% 
glicerol en agua. Las proteínas fueron resueltas en un gel de poliacrilamida, SDS-PAGE al 15% y 
transferidas a una membrana de nitrocelulosa para evaluar la presencia de la proteína GFP a 27 
kDa. Las membranas fueron bloqueadas utilizando leche descremada al 10% en PBS 1X, 
incubando toda la noche a 4 °C. Después se inhibió la peroxidasa endógena incubando con el 
reactivo de bloqueo de peroxidasa (Biocare Medical) por 15 minutos a TA. Posteriormente, las 
membranas fueron incubadas con el anticuerpo policlonal α-GFP (Life technology) por dos horas 
a TA, en una dilución 1:1000, seguido del anticuerpo secundario, (de cabra) α-IgG de conejo 
acoplado a peroxidasa de rábano (INVITROGEN), en una dilución 1:10,000. Como control de carga 
para el western blot se utilizó el anticuerpo policlonal (conejo) α-IgG de ratón (Abcam), en una 
dilución 1:1,000, seguido por un anticuerpo α-IgG de cabra acoplado a peroxidasa de rábano 
(Abcam), en una dilución 1:10,000. En todos los caso se reveló utilizando el kit de 
quimioluminiscencia mejorado (Amersham, NJ). 
 
 
 
 
22 
 
5.2 Identificación de la proteína PL10 (similar a Vasa) en cisticercos de T. crassiceps 
Se realizó un ensayo de inmunoelectrotransferencia (western blot) para detectar la proteína PL10 
en cisticercos de T. crassiceps y T. solium. El extracto crudo de proteínas se realizó por 
homogenización manual usando un buffer con 7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 10mM Tris y 
una mezcla de proteasas (0.5 M EDTA, 0.2 PMSF, 10mM Leupeptina, 1mM Pepstatina). Las 
proteínas fueron resueltas en SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 12% y transferidas a una 
membrana de nitrocelulosa. La membrana fue bloqueada por incubación en 10% de leche 
descremada en PBS, toda la noche a 4°C. Luego, se incubó con el anticuerpo policlonal α-
DDX4/VASA, en una dilución 1:250, 2 horas a TA, seguido por el anticuerpo secundario α-igG de 
conejo acoplado a HRP, en una dilución 1:1,000 por 2h a TA. Se reveló utilizando la reacción de 
quimioluminiscencia mejorada (Amersham, NJ/RPN2109). 
 
6. Búsqueda de las secuencias de genes PL10 (similares a Vasa) en la base de datos del 
genoma de T. solium 
Se realizaron búsquedas de secuencias que coincidieran con RNAs helicasas que tuvieran los 
dominios DEAD/DEAH (DDX) en el genoma de T. solium: 
http://www.genedb.org/Homepage/Tsolium. Nueve proteínas predichas fueron ortólogas con el 
dominio DEAD-box usando Blastp en la base de datos del NCBI. Las proteínas con identidad del 
90% que reconocieran proteínas PL10/DDX3 en la base general de datos con un valor-e menor a 
0.001 fueron elegidas como posibles secuencias del gen PL10. Se realizaron comparaciones 
pareadas con secuencias de Schistosoma ya reportadas como PL10/DDX3, utilizando el programa 
“pairwise BLAST” del NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. 
 
7. Aislamiento de células germinales de T. crassiceps 
Se obtuvieron cisticercos del peritoneo de un ratón BALB/c que tenían una infección con T. 
crassiceps de tres meses. Los cisticercos fueron disgregados utilizando un homogenizador 
“Dounce” (American/198-10040). El homogenizado fue centrifugado a 3000 RPMI por 5 minutos. 
El precipitado fue disgregado enzimáticamente con 0.25% trypsin-EDTA (Life Sciences) + 0.4% 
hyaluronidase (Sigma-Aldrich/ H3506-100MG) + 20mg/ml DNAsa (invitrogen/1868-015), se 
incubó a 37°C por 15 minutos y se agitó por 10 minutos para obtener una suspensión de células 
aisladas. La tripsina fue desactivada con SBF (Byproductos). Luego se centrifugó a 3000 RPMI por 
5 minutos, descartando el sobrenadante. El precipitado fue utilizado para cultivo in vitro, 
citometría de flujo o para detectarpor inmunohistoquímica células germinales. 
http://www.genedb.org/Homepage/Tsolium
 
 
 
23 
 
8. Citometría de flujo 
Las células se aislaron como se describió anteriormente e incubadas por 15 minutos a TA. 
Posteriormente, fueron lavadas con PBS 1X y bloqueadas con BSA (SIGMA/A3059-100G) al 1% en 
PBS por 30 minutos. Las células se incubaron toda la noche con el mismo anticuerpo α-DDX4/Vasa 
a una dilución 1:100. Después de cuatro lavados con PBS 1X por 30 minutos cada uno, se 
incubaron por 30 min a TA con el anticuerpo (en cabra) α-IgG de conejo acoplado a CY3. Las 
muestras fueron lavadas dos veces y resuspendidas en PBS 1X en un volumen final de 1 ml. Las 
células fueron analizadas en un citómetro FACS Calibur flow (Becton Dickinson), y los datos fueron 
analizados con el programa CellQuest. 
9. Diseño de plásmidos para transfección estable en células aisladas y cisticercos de T. 
crassiceps 
Considerando la maquinaria del transposón piggyBac (Morales et al. 2007), decidimos diseñar 
dos plásmidos, uno ayudante (helper), el cual contiene la secuencia de la “transposasa”, enzima 
encargada de ayudar a que las secuencias del transposón puedan moverse e integrarse al 
genoma. Y un plásmido donador (donor), el cual contiene las secuencias repetidas invertidas 
terminales (TIR), que flanquean el gen que se pretende integrar al genoma (Morales et al. 2007). 
Además, la información generada por el genoma de T. solium sugiere que regiones promotoras 
de genes como “actina” y “Spliced leader 1” (SL1), son altamente transcritos por este parásito. 
En el caso de la actina en el genoma de T. solium se encontró que representa el 1.8% de todos 
los transcritos y es el segundo gen más expresado tanto en larva como en adulto, segundo 
exclusivo para larva y tercero para adulto. En el caso del SL1, le confiere el líder al 2.5% de los 
transcritos y se sugiere que es más común en larva que en adulto (comunicación personal del Dr. 
Alejandro García Rubio). Basándonos en esta información se diseñaron 4 construcciones, 
utilizando el programa Geneious R8, dos construcciones con el promotor de actina (ayudante y 
donador) y dos utilizando como promotor al SL (ayudante y donador). Estas cuatro construcciones 
se mandaron a sintetizar a Genscript en Hong Kong. Ambos vectores donantes tienen como 
reportero a la proteína verde fluorescente y un casete de resistencia a neomicina, además se 
dejaron sitios de restricción para futuras modificaciones (Ver figura 1 en el capítulo V.III). Las 
cuatro construcciones plasmídicas fueron secuenciadas a cabalidad para asegurar que tenían la 
secuencia que se había diseñado para cada una. 
10. Clonación y expansión de los plásmidos 
Los plásmidos fueron re-suspendidos en 40 µl de agua estéril, para tener una concentración de 
100ng/µl. Se expandieron en bacterias competentes E. coli dh5α en medio Luria Bertani (LB). Las 
 
 
 
24 
 
bacterias fueron transformadas por calor con cada plásmido, obteniendo una buena cantidad de 
bacterias transformadas. Se incluyó un control negativo de bacterias sometidas a calor pero sin 
plásmido; no creció ninguna colonia. Cada uno de los cuatro plásmidos fue purificado utilizando 
el Kit de purificación de plásmido “Plasmid Midi (100)” (QuiaGen). Los plásmidos quedaron en 
una concentración de ̴2µg/µl cada uno. Listos para ser microinyectado en cisticercos de T. 
crassiceps. 
 
11. Transfección estable de cisticercos de T. crassiceps por microinyección 
Se seleccionaron cisticercos entre 4-5 mm de diámetro para ser microinyectados. Las microagujas 
(se hicieron como se describe en la sección 2.2) fueron cargadas con una mezcla 1:1 de 2 µg/µL 
del plásmido donador y 2 µg/µL del plásmido ayudante. Para hacer la transfección más eficiente, 
se realizó una modificación agregando por cada 10 µL de la mezcla de DNA plasmídico, 1 µL de 
plus reagent + 0.4 µL de lipofectamina (Thermo scientific/15338100). Se agregaron trazas de tinta 
china para observar la descarga del material genético dentro de la vesícula del cisticerco. Cada 
cisticerco fue inmovilizado en LB agar al cual se le realizó una cavidad de 5 mm en cajas de cultivo 
de 25 mm y para evitar desecación se agregaron 50µL de medio de cultivo. Cada cisticerco se 
microinyectó con la mezcla 1:1 de plásmidos dentro de la vesícula, permitiendo que se difundiera 
en el fluido vesicular, utilizando el microinyector “Eppendorf Cell Tram”. Como control negativo 
algunos cisticercos se transfectaron con agua y otros con tinta china sola. Los cisticercos 
microinyectados fueron transferidos a medio RPMI suplementado, manteniéndolos en cultivo in 
vitro a 37˚C y 5% de CO2. Los cisticercos sobrevivieron en cultivo hasta una semana después de la 
microinyección y fueron evaluados cada 24 horas por 8 días para establecer el tiempo de 
expresión de la GFP. Para observar la expresión de la fluorescencia por GFP se utilizó un 
microscopio invertido de fluorescencia OLYMPUS IX71 con filtros FITC (excitación/emisión 450-
490/515 nm). Para evitar movilidad de los cisticercos, se colocaron uno a uno en un cubreobjetos 
excavado y se mantuvieron en hielo por 30 min. Las imágenes se capturaron con una cámara 
Olympus acoplada al microscopio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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VI. RESULTADOS 
1. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps 
 
 
 
 
 
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2. Stem cell-like tissue and phenotypes in cultures of cysticerci of Taenia crassiceps 
(Manuscrito en Preparación) 
 
Bárbara B. Moguel1, Norma Moreno-Mendoza1, Gabriel Rinaldi3, Raúl J. Bobes1, Luis Herrera-
Estrella2, Paul Brindley3 and Juan P. Laclette1*. 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 
2Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, CINVESTAV/Irapuato, 3Microbiology, 
Immunology and Tropical Medicine, George Washington University. 
 
Abstract 
Neurocysticercosis, which is caused by the larval stage of the flatworm Taenia solium, is the most 
frequent parasite disease of the human brain. Considerable advances on the understanding of 
cysticercosis have been achieved using the murine model organism, Taenia crassiceps. Recent 
reports describe methods for the stable transfection and the development of cell cultures with 
different parasite organisms, as the case of transfection into germinal cells from Echinococcus 
multilocularis. To this date, there is only one available study describing isolation of Taenia 
crassiceps cells; however, no germinal cells identification and location until today has been 
described in this parasite. The goal of our study was to identify, locate, and characterize 
germinative cells of T. crassiceps cysts, the former by the use of α-Vasa antibody. Results of the 
Immunolocalization studies showed positive mark in sub-tegumentary cytons and tegument in T. 
crassiceps. Additionally, western blot detection confirmed the Vasa-like expression in crude 
extracts of T. crassiceps. Our results, prove the presence of Vasa-like protein, thus being the first 
to contribute to the understanding of these cell populations and in the advancement in the 
research of "neoblast/germinative” cells in T. crassiceps, a model flatworm parasite. In addition, 
we developed the basic tools to develop stable transfection of T. crassiceps. Germinal cells in vitro 
cultivation and transfection procedure will increase our understanding of parasite diseases 
further enabling genetic manipulation. 
Keywords: Cysticercosis, Taenia solium, Taenia crassiceps, Germinative cells, Vasa-like gene 
Introduction 
Asexual reproduction/stem cell activity is a characteristic of Platyhelminthes (Whitfieldand Evans 
1983). It is well know that these types of worms include totipotent cells belonging to a stem cells 
system. These stem cells are also called “neoblast” in the case of free living worms and 
“germinative cells” in the case of cestodes (Koziol et al. 2014; Spiliotis et al. 2008). They are the 
 
 
 
35 
 
only source of regenerative cells during homeostasis, development and regeneration giving rise 
to all cell types including germ cells (De Mulder et al. 2009; Newmark and Sanchez Alvarado 2000; 
Pfister et al. 2007). The Vasa gene is a vital germline marker used for the study of the origin and 
development of germ cells and gonads in many organisms (Diao et al. 2015). The expanding 
catalogue of Vasa roles and locations beyond the germ line includes multipotent stem cells, 
embryonic cells, tumors, primordial germ cell specification, stem cell maintenance, cell cycle 
progression, and piRNA biogenesis (Skinner et al. 2012). A recent report describes that flukes and 
tapeworms lack of the true Vasa ortholog and suggests instead that the Vasa/PL10 homolog of 
Vasa-like gene 3 (vlg3) may have assumed a ‘Vasa-like’ role in stem cell maintenance (Tsai et al. 
2013). 
Stem cells have been described in flatworms, especially in Dugesia japonica (Shibata et al. 1999), 
Schmidtea mediterranea (Sanchez Alvarado and Kang 2005) and Macrostomus lignan (Pfister et 
al. 2007), which could make them good models for the study of cell lines, because of their 
feasible maintenance and handling in culture systems. Such is the case of Isodiametra pulchra, a 
flatworm recently phylogenetically positioned at the base of the bilateria and already been 
proposed as model for the study of germinal cells (De Mulder et al. 2009). 
In the helminth parasite Schistosoma mansoni adult somatic stem cells, have also been described. 
The proliferative cell populations in S. mansoni exhibit many transcriptional and functional 
similarities with the neoblasts of free-living planarians and stem cells of other organisms (Wang 
et al. 2013). In the genius Taenia exist tissues with germinal activity as described in the 
metacestode Echinococcus; are able to self-regeneration from isolated germinal cells in axenic 
cultures (Albani et al. 2013; Brehm and Spiliotis 2008; Spiliotis et al. 2008). In the adult form of 
Taenia solium, regenerative skills are well known, as in worm necks high populations of 
germinative cells has been previously observed (Willms et al. 2001). 
The study of germinal cells in other organisms such as in helminth parasites is a pivotal step to 
understand not only the biology of these organisms, but because they pose as a great threat to 
 
 
 
36 
 
the health of humans. The causal agent of Teniasis/cysticercosis is the tapeworm T. solium. 
Infection in humans occurs by the ingestion of T. solium eggs in contaminated food finally 
developing in neurocysticercosis (Berkowitz et al. 2015; Murrell 2013). Considerable advances on 
the understanding of cysticercosis has been achieved using the murine model T. crassiceps. In the 
present study, we investigated the stem cell-like in the cysticerci of T. crassiceps, in order to 
describe its phenotype and understand their regenerative skills by immunohistochemical 
recognition using a polyclonal α-Vasa antibody. 
Results of the immunolocalization studies showed positive mark in sub-tegumentary cytons and 
tegument in T. crassiceps. Additionally, western blot detection confirmed the Vasa-like expression 
in crude extracts of T. crassiceps. The availability of germinal cells in vitro cultivation and 
transfection procedure will increase our understanding of flatworm’s parasite diseases further 
enabling genetic manipulation. 
 
 
Materials and Methods 
1. Parasites 
The experiments were carried out using the cysticerci of T. crassiceps ORF strain, which were 
maintained through intraperitoneal passage from mouse to mouse using 8 weeks old Balb/cAnN 
females (Sciutto et al. 2011). Cysts were thereafter collected from the peritoneal cavity of three 
month infected mice that were set for humanitarian sacrifice. Collected cysts were immediately 
set and maintained in vitro at a temperature of 37˚C under 5% CO2, for 24 hrs in RPMI medium 
supplemented with 10% Fetal Bovine Serum and 1 µg/ml penicillin/streptomycin (Vazquez-
Talavera et al, 2011). All procedures involving mice were carried out according to the guidelines 
of the Biomedical Research Institute, UNAM, and were approved by the Committee for the Care 
and Use of Experimental Animals. 
 
 
 
 
37 
 
2. Immunohistochemistry 
2.1 Immunoperoxidase 
Tissues from T. crassiceps and T. solium cysticerci were thoroughly washed in PBS and fixed in 
Zamboni solution (2% formaldehyde, 0.2% picric acid, pH 7.0). After fixation, the tissue was 
dehydrated and embedded in paraffin. Tissue was cut in sections of 5 m, transferred to poly-l-
Lysine (Sigma/PO425) coated slides before being de-paraffinized and rehydrated. In order to 
inhibit the peroxidase activity, tissue sections were incubated with 0.3% of H2O2 for 10 min. After 
five PBS washes, tissue sections were incubated with 5% albumin/0.05%Tween 20-PBS. After 
treatment, tissue sections were incubated at 37 °C during 1 h, with the polyclonal α-DDX4/Vasa 
(ABCAM/Ab13840) antibody, in a dilution of 1:250 in 2% albumin, 0.01% Tween 20-PBS. After 
stringent washing with 2% albumin in 0.1% Tween 20-PBS, tissues were again incubated at 37 °C 
for 30 min with a goat anti-rabbit IgG secondary antibody, HPR conjugate (Life tech/G21234). 
Finally, tissues was developed with 3-3 DAB (DAKO/K3468), followed by a hematoxylin contrast 
to show the nuclei. The observation and image capture were performed using an Olympus BX51 
microscope. 
 
2.2 Immuno-fluorescence 
Cysticeri tissues of T. crassiceps were fixed as described in section 2.1. The cysts were placed in 
OCT (optimal cutting temperature) medium (Tissue-Tek; Sakura Finetek/4583) and shock-frozen 
in hexane (J.T. Baker/9262) on dry ice. 20 μm thick sections were cut and thereafter permeated 
with Triton X-100 solution (Sigma-Aldrich/T8787) at 0.1% in PBS for 10 min followed by their 
blocking with bovine serum albumin (Gibco-Life tech/1556-020) at 1% in PBS for 2 hr. Sections 
were then incubated overnight with the same α-DDX4/Vasa antibody, mintion above. After 
incubation, sections were washed on four consecutive times with PBS, and later on incubated at 
room temperature for 1 h with a fluorescent α-rabbit CY3 conjugate (Life tech/A10520) antibody. 
Finally, all sections were mounted in permanent fluorescence mounting medium (Dako 
 
 
 
38 
 
Cytomation/S3023) and stored at 4°C for subsequent revision and photography under confocal 
microscopy. Serial sections of each tissue sample were incubated in parallel without the primary 
antibody to check for unspecific binding of the secondary antibody. All sections were reviewed 
and photographed using a confocal microscope (LSM5Pascal; Carl Zeiss), equipped with argon–
krypton and helium–neon lasers, using FITC and Cy3 filters and Nomarski interference contrast. 
 
2.3 Immuno-gold 
Five T. crassiceps and five T. solium cysticerci were fixed in 2% formaldehyde and 0.25% 
glutaraldehyde in 0.1 M PBS (pH 7.4) at 4°C, for 2 hr. Tissues were dehydrated in ethanol solution 
(JT Baker) ranging from 30 to 70%, followed by a second dehydration with 2:1 LRW (LR White)–
ethanol solution for 1 h. Afterwards the solution was changed to pure LRW (Sigma-Aldrich/62661) 
and left for an additional hour. Finally, samples were incubated in fresh pure LRW overnight and 
polymerized in beam capsules at 60 °C for 24 h. The tissues were cut in ultrathin sections at 1 µm. 
Sections were collected on formvar-carbon coated nickel grids, a dried overnight. After drying, 
the grids were placed into a staining tray with tissues facing up. Thereafter the tray was placed