Vas-de-glicosilacion-en-linfocitos-T-asociadas-al-transductor-y-activador-de-la-transcripcion-6-en-un-modelo-de-raton-knockout

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
“Vías de glicosilación en linfocitos T asociadas al 
transductor de señales y activador de la transcripción-6 
en un modelo de ratón knockout” 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULODE: 
 BIÓLOGA 
 P R E S E N T A : 
 
 JANETTE ARIAS ESCOBEDO 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
Dr. FRANCISCO JAVIER URREA RAMÍREZ 
2014 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
Agradecimientos	
  
	
  
	
  
	
  
	
  A	
  mis	
  padres	
  Francisco	
  y	
  Leticia,	
  por	
  todo	
  ese	
  cariño	
  y	
  confianza	
  que	
  han	
  depositado	
  en	
  
mí.	
  Son	
  los	
  mejores	
  padres	
  del	
  mundo,	
  los	
  quiero	
  mucho.	
  
	
  
	
  A	
  mis	
  hermanos	
  Adriana,	
  Gerardo,	
  Paco	
  y	
  Oscar	
  por	
  estar	
  conmigo	
  en	
  todo	
  momento	
  y	
  
ayudarme	
   cuando	
   lo	
   necesitaba,	
   a	
   pesar	
   de	
   que	
   se	
   desesperaban	
   y	
  me	
   gritaban	
   se	
   les	
  
agradece.	
  Sobre	
  todo	
  por	
  formar	
  esta	
  bonita	
  familia.	
  
	
  
	
  A	
  mis	
  tíos	
  Bulmaro	
  y	
  Lucia,	
  por	
  todo	
  ese	
  apoyo	
  que	
  me	
  han	
  brindado	
  y	
  estar	
  al	
  pendiente	
  
de	
  su	
  sobrina/ahijada	
  gracias	
  infinitas	
  ya	
  que	
  ustedes	
  son	
  como	
  mis	
  segundos	
  padres.	
  
	
  
	
  Al	
   Taller	
   de	
   “Respuesta	
   inmune	
   humoral	
   y	
   celular	
   en	
   diferentes	
   tipos	
   de	
  
hipersensibilidad”	
  de	
   la	
  Facultad	
  de	
  Ciencias	
  de	
   la	
  UNAM,	
  que	
  me	
  permitió	
  ampliar	
  mis	
  
habilidades	
  y	
  criterios	
  en	
  el	
  tema	
  con	
  ayuda	
  de	
  los	
  académicos	
  que	
  forman	
  parte	
  de	
  este.	
  
	
  
	
  A	
  los	
  sinodales:	
  Dr.	
  Ricardo	
  Lascurain,	
  Dr.	
  Edgar	
  Zenteno,	
  M.	
  en	
  C.	
  Erasmo	
  Martínez	
  y	
  Dr.	
  
Mario	
  Moreno	
  por	
  regalarme	
  un	
  poco	
  de	
  su	
  tiempo	
  al	
  revisar	
  este	
  trabajo	
  y	
  porque	
  con	
  
sus	
  comentarios	
  y	
  sugerencias	
  mejoraron	
  la	
  calidad	
  del	
  mismo.	
  
	
  
	
  Al	
  mejor	
  profesor,	
   tutor	
  y	
  amigo	
  que	
  se	
  puede	
  pedir	
  Dr.	
  Francisco	
  Urrea	
  por	
   todo	
  este	
  
apoyo	
  y	
  confianza	
  que	
  me	
  ha	
  brindado	
  a	
  lo	
  largo	
  de	
  estos	
  años.	
  Por	
  esas	
  tortas	
  y	
  “bebidas	
  
energizantes”	
  que	
  después	
  de	
  una	
  larguísima	
  jornada	
  laboral	
  nos	
  caían	
  muy	
  bien.	
  
	
  
	
  Y	
  por	
  último	
  pero	
  no	
  menos	
  importante	
  a	
  mis	
  amigos	
  de	
  la	
  carrera.	
  De	
  no	
  haber	
  sido	
  por	
  
ustedes	
  me	
  habría	
  aburrido	
  un	
  buen,	
  son	
  bien	
  buena	
  onda	
  muchachos	
  y	
  muchachas,	
  me	
  
caen	
  re-­‐bien.	
  
	
  
	
  Y	
   no,	
   no	
   soy	
   tan	
   miserable	
   como	
   piensan	
   para	
   no	
   dedicarle	
   unas	
   bellas	
   y	
   hermosas	
  
palabras	
  a	
  cada	
  uno	
  de	
  ustedes.	
  
	
  
	
  
	
  
 
Eric,	
   por	
   convertirte	
   en	
   mi	
   pambolero	
  
favorito,	
  no	
  debería	
  de	
  agradecerte	
  ya	
  que	
  
siempre	
   me	
   sonsacabas	
   para	
   no	
   entrar	
   a	
  
clases	
   y	
   ver	
   el	
   fut.	
   Sin	
   embargo,	
   nos	
   la	
  
pasábamos	
  muy	
  bien	
  ;)	
  
	
  
	
  	
  
	
  
Olivia	
  por	
  prestarnos	
   tu	
  casa	
  y	
  armar	
  esas	
  
noches	
   imparables	
   de	
   peleas	
   con	
   sangre,	
  
groserías	
  y	
  demás,	
  ya	
  que	
  eso	
  nos	
  unió	
  más	
  
como	
  amigos,	
  obvio	
  me	
  refiero	
  a	
  las	
  noches	
  
gamer	
  ;)	
  
	
  
	
  
	
  Daniel	
   y	
   Armando,	
   por	
   fomentar	
   el	
  
bullying,	
   no	
   seríamos	
   nada	
   sin	
   el.	
   Nunca	
  
olvidaré	
   esa	
   bonita	
   clase	
   que	
   tomamos	
  
juntos	
   donde	
   aprendimos	
   que	
   “camarón	
  
que	
   se	
   duerme	
   se	
   lo	
   lleva	
   la	
   corriente”	
  
verdad	
  Daniel	
  xD	
  	
  
	
  
	
  
Luis,	
   por	
   organizar	
   esos	
   seminarios	
   y	
  
promover	
   el	
   conocimiento	
   científico,	
   que	
  
bueno	
  que	
  esa	
   tradición	
  no	
  se	
  ha	
  perdido.	
  
Y	
   gracias	
   por	
   hacer	
   mi	
   estancia	
   en	
   el	
  
laboratorio	
  más	
  divertida	
  :D	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Laura	
   ¡¡Regina!!	
  No	
  cabe	
  duda	
  alguna	
  que	
  
siempre	
  me	
  contagias	
  con	
  tu	
  buen	
  humor.	
  
Gracias	
   por	
   tomar	
   plantas	
   conmigo,	
   la	
  
verdad	
   odiaba	
   el	
   horario	
   pero	
   cada	
   clase	
  
hacías	
  que	
  fuera	
  muy	
  amena	
  :D	
  
	
  
	
  
	
  
Rubén	
  a	
  ti	
  te	
  debo	
  ese	
  bonito	
  sobrenombre	
  
que	
   tengo	
   ahora	
   ⌐_⌐	
   gracias	
   por	
   eso.	
   Al	
  
igual	
   que	
   por	
   esas	
   sarta	
   de	
   tonterías	
   que	
  
solemos	
  decir	
  que	
  nos	
  hace	
  morir	
  de	
  risa	
  :b	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Miguel	
   por	
   esos	
   pocos,	
   pero	
   increíbles	
  
momentos	
   que	
   hemos	
   pasado	
   juntos.	
   Y	
   el	
  
ser	
   serio	
   no	
   te	
   hace	
   aburrido,	
   te	
   hace	
   ser	
  
interesante	
  :D	
  
	
  
	
  
	
  
Teresa,	
  por	
  soportar	
  todo	
  el	
  bullying	
  que	
  te	
  
hago	
  xD	
   la	
  verdad	
  desde	
  el	
  primer	
  día	
  que	
  
te	
   conocí	
   (cuando	
   te	
   presentaste	
   en	
   filos)	
  
supe	
  que	
  nos	
  llevaríamos	
  muy	
  bien,	
  lo	
  cual	
  
confirmo	
   cada	
   vez	
   que	
   nos	
   juntamos	
   y	
  
hacemos	
   tonterías.	
   Espero	
   y	
   nunca	
   se	
  
acaben	
  ;)	
  
	
  
	
  A	
   todos	
   ustedes,	
  muchas	
   gracias	
   por	
   esos	
  momentos	
   que	
   hemos	
   pasado	
   a	
   lo	
   largo	
   de	
  
estos	
   años,	
   nunca	
   se	
   los	
   he	
   dicho	
   pero	
   los	
   quiero	
   mucho.	
   Mejores	
   amigos	
   no	
   pude	
  
encontrar	
   	
   
 
	
  
ÍNDICE	
  
 
 
Lista	
  de	
  abreviaturas	
  
	
  
Resumen..........................................................................................................................................	
  
	
  
	
  3	
  
I. Introducción………………………………………………………………………………………………………………......	
  4	
  
Generalidades	
  sobre	
  los	
  sacáridos	
  en	
  proteínas…………………………………………………………….	
  4	
  
Glicosilación	
  de	
  proteínas………………………………………………………………………………………………	
  4	
  
N-­‐glicosilación………………………………………………………………………………………...................	
  5	
  
O-­‐glicosilación…………………………………………………………………………………………................	
  6	
  
Lectinas	
  y	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  en	
  linfocitos	
  T……………………………..………………………….	
  8	
  
	
   	
  
Linfocitos	
  T……………………………………………………………………………...........................................	
  10	
  
Respuestas	
  celulares	
  tipo	
  Th1,	
  Th2	
  y	
  Th17……………………………………………………………………..	
  12	
  
Vías	
  de	
  señalización	
  involucradas	
  en	
  la	
  generación	
  de	
  las	
  subpoblaciones	
  Th……………….	
  13	
  
	
   	
  
Transductor	
  de	
  Señales	
  y	
  Activador	
  de	
  la	
  Transcripción	
  (STAT)……………………………………..	
  14	
  
Estructura……………………………………………………………………………………………………………….16	
  
STAT-­‐6……………………………………………………………………………………………………………………………	
  16	
  
	
   	
  
II. Antecedentes.......................................................................................................................	
  18	
  
	
   	
  
III. Planteamiento	
  del	
  problema…………………………………………………………………………………………	
   19	
  
	
   	
  
IV. Hipótesis………………………………………………………………………………………………………………………….	
  19	
  
	
   	
  
V. Objetivos………………………………………………………………………………………………………………………...	
  20	
  
General…………………………………………………………………………………………………………………………..	
  20	
  
Particulares…………………………………………………………………………………………………………………….	
  20	
  
	
   	
  
VI. Materiales	
  y	
  método………………………………………………………………………………………………………	
  21	
  
Ratones…………………………………………………………………………………………………………………………..	
  21	
  
Anticuerpos…………………………………………………………………………………………………………………….	
  21	
  
Lectinas………………………………………………………………………………………………………………………….	
  21	
  
Sacrificio	
  de	
  ratones	
  y	
  obtención	
  de	
  células……………………………………………………………………………….	
  22	
  
PCR	
  en	
  punto	
  final	
  para	
  genotipificación	
  de	
  ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  BALB/c	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐………	
  22	
  
Ensayo	
  de	
  inhibición	
  de	
  lectinas	
  mediante	
  la	
  unión	
  con	
  sacáridos……………………………..	
   23	
  
Determinación	
  de	
   los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  por	
  citometría	
  
de	
  flujo…………………………………………………………………………………………………………………………..	
  
	
  
24	
  
 
Cultivo	
  celular	
  para	
  la	
  determinación	
  de	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  
CD8+	
  por	
  citometría	
  de	
  flujo…………………………………………………………………………………………..	
  
	
  
25	
  
Modelo	
  para	
  la	
  inducción	
  de	
  asma	
  murino…………………….………………………………………………	
  25	
  
Análisis	
  estadístico………………………………………………………………………………………………………….	
  26	
  
	
   	
  
VII. Resultados……………………………………………………………………………………………………………………..	
  27	
  
Genotipificación	
  de	
  los	
  ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐…………………………………..………………	
  27	
  
	
   	
  
Determinación	
  de	
  la	
  especificidad	
  de	
  las	
  lectinas……………..………………………………………..…	
  28	
  
	
   	
  
Proporción	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐……………………………………….	
   29	
  
	
   	
  
Porcentaje	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  reposo	
  reconocidos	
  por	
  lectinas………………………..	
   30	
  
	
   	
  
Cambios	
  en	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  inducidos	
  por	
  la	
  activación	
  de	
  
células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐...........................................................	
  
	
  
31	
  
	
   	
  
Comparación	
  de	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  
reposo	
  y	
  activados	
  entre	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐……………………………………………………………	
  
	
  
34	
  
	
   	
  
Participación	
  de	
  STAT-­‐6	
  en	
  la	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  un	
  
modelo	
  murino	
  de	
  respuesta	
  tipo	
  Th2	
  inducido	
  por	
  Ovoalbúmina	
  (Asma)…………………….	
  
	
  
36	
  
	
   	
  
Confirmación	
  del	
  modelo	
  murino	
  asmático	
  por	
  pletismografía	
  e	
  histopatología……………	
  36	
  
	
   	
  
Posible	
  participación	
  de	
  STAT-­‐6	
  en	
  la	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  
CD8+	
  durante	
  una	
  respuesta	
  de	
  tipo	
  Th2	
  (Asma)……………………………………………………..	
  
	
  
38	
  
	
   	
  
VIII. Discusión………………………………………………………………………………………………………………….	
  40	
  
	
   	
  
IX. Conclusiones................................................................................................................	
  47	
  
	
   	
  
X. Perspectivas…………………………………………………………………………………………………………....	
  48	
  
	
   	
  
XI. Referencias………………………………………………………………………………………………………………	
  49	
  
Página | 1 
 
	
  
Lista	
  de	
  abreviaturas	
  
 
 
 
AAL	
   Aleuria	
  aurantia	
  lectina	
  
ALL	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   Amaranthus	
  leucocarpus	
  lectina	
  
Asn	
  	
  	
  	
  	
   Asparagina	
  
Con	
  A	
  	
  	
  	
  	
  	
   Concanavalina	
  A	
  lectina	
  
DNA	
  	
  	
  	
  	
  	
   Ácido	
  desoxirribonucleico	
  
Dol-­‐P	
  	
  	
  	
   Dolicol	
  fosfato	
  
Dol-­‐P-­‐Glc	
   Dolicol	
  fosfato	
  glucosa	
  
Dol-­‐P-­‐Man	
   Dolicol	
  fosfato	
  manosa	
  
ECL	
   Erythrina	
  cristagalli	
  lectina	
  
Fuc	
   Fucosa	
  
FucT-­‐VII	
   Fucosiltransferasa-­‐VII	
  
GDP-­‐Man	
   Guanosín	
  difosfato	
  manosa	
  
Gal	
  	
  	
  	
   Galactosa	
  
Gal-­‐I	
   Galectina-­‐I	
  
GalNAc	
  	
  	
  	
   N-­‐acetilgalactosamina	
  
GlcNAc	
   N-­‐acetilglucosamina	
  
GlcNAc-­‐P	
  	
  	
  	
   N-­‐acetilglucosamina	
  fosfato	
  
GlcNAc-­‐PP-­‐Dol	
  	
  	
  	
   N-­‐acetilglucosamina	
  pirofosfato	
  dolicol	
  
Glc	
  	
  	
  	
   Glucosa	
  
LacNAc	
   N-­‐Acetillactosamina	
   	
  
MAA	
   Maackia	
  amurensis	
  lectina	
  
Página | 2 
 
Man	
   Manosa	
  
MFI	
   Media	
  de	
  la	
  intensidad	
  de	
  fluorescencia	
  
OVA	
   Ovoalbúmina	
  
PBA	
   PBS	
  +	
  albumina	
  sérica	
  bovina	
  y	
  azida	
  de	
  sodio	
  
PBS	
   Amortiguador	
  de	
  fosfatos	
  
PHA	
   Aglutinina	
  de	
  Phaseolus	
  vulgaris	
  
PNA	
   Aglutinina	
  de	
  Arachis	
  hypogaea	
  
pp-­‐GalNAcT	
   Polipéptido	
  N-­‐acetilgalactosaminatransferasa	
  
RE	
   Retículo	
  endoplasmico	
  
Ser	
   Serina	
  
SNA	
   Sambucus	
  nigra	
  lectina	
  
ST3Gal	
  	
  	
  	
   β-­‐Galactosidasa	
  α2-­‐3-­‐sialiltransferasa	
  
ST6Gal	
  	
  	
  	
   β-­‐Galactosidasa	
  α2-­‐6-­‐sialiltransferasa	
  
STAT	
  	
  	
  	
   Transductores	
  de	
  señales	
  y	
  activadores	
  de	
  la	
  transcripción	
  
STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   Mutante	
  no	
  codificante	
  para	
  STAT-­‐6	
  
Thr	
   Treonina	
  
UDP-­‐GalNAc	
   Uridina	
  difosfato	
  N-­‐acetilgalactosamina	
  
UDP-­‐GlcNAc	
   Uridina	
  difosfato	
  N-­‐acetilglucosamina	
  
WT	
   Tipo	
  silvestre	
  
 
 
 
 
 
 
Página | 3 
 
Resumen	
  
 
 
	
  La	
  glicosilación	
  de	
  proteínas	
  es	
  una	
  modificación	
  postraduccional	
  que	
  confiere	
  un	
  control	
  
de	
   calidad	
   para	
   la	
   proteína,	
   así	
   como	
   diversas	
   propiedades	
   para	
   su	
   estabilidad	
   y	
  
resistencia	
   a	
   proteasas,	
   sin	
   embargo	
   no	
   está	
   claro	
   cuáles	
   son	
   los	
   mecanismos	
   que	
  
pudieran	
  estar	
  regulando	
  este	
  proceso.	
  Actualmente,	
  	
  son	
  muy	
  pocos	
  los	
  trabajos	
  que	
  han	
  
relacionado	
   la	
  expresión	
  de	
  azúcares	
  de	
  membrana	
  con	
   la	
  actividad	
  enzimática	
  regulada	
  
por	
  factores	
  de	
  transcripción.	
  STAT-­‐6	
  es	
  un	
  factor	
  de	
  transcripción	
  esencial	
  para	
  la	
  vía	
  de	
  
síntesis	
  de	
   la	
   IL-­‐4	
   y	
   junto	
   con	
  GATA-­‐3	
  participa	
  en	
   la	
  diferenciación	
  de	
   linfocitos	
  T	
  CD4+	
  
tipo	
   Th2.	
   Se	
   ha	
   reportado	
   que	
   los	
   factores	
   de	
   transcripción	
   T-­‐bet	
   y	
   GATA-­‐3	
   regulan	
   la	
  
expresión	
   de	
   glicosiltransferasas	
   como	
   FucT-­‐VII	
   y	
   ST6Gal-­‐I,	
   enzimas	
   claves	
   para	
   la	
  
migración	
   y	
   susceptibilidad	
   a	
   apoptosis	
   en	
   linfocitos	
   T	
   CD4+	
   Th1	
   y	
   Th2,	
   estos	
   datos	
  
sugieren	
   que	
   STAT-­‐6	
   regula	
   mediante	
   su	
   interacción	
   con	
   GATA-­‐3	
   diversas	
   vías	
   de	
  
glicosilación	
   que	
   son	
   esenciales	
   para	
   la	
   funcionalidad	
   de	
   los	
   linfocitos	
   T.	
   Sin	
   embargo,	
  
estos	
  datos	
  han	
  sido	
  obtenidos	
  mediante	
  la	
  manipulación	
  de	
  GATA-­‐3	
  y	
  no	
  de	
  STAT-­‐6	
  por	
  lo	
  
que	
  no	
  se	
  conocen	
  cualesson	
  las	
  vías	
  que	
  podrían	
  estar	
  siendo	
  reguladas	
  por	
  este	
  factor	
  
de	
   transcripción	
   de	
   manera	
   directa	
   o	
   indirecta	
   mediante	
   la	
   interacción	
   con	
   otras	
  
moléculas	
  blanco	
  diferentes	
  a	
  GATA-­‐3.	
  El	
  objetivo	
  de	
  este	
  estudio	
  es	
  identificar	
  el	
  patrón	
  
de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  regulado	
  por	
  STAT-­‐6	
  en	
  las	
  células	
  T	
  CD4+	
  y	
  T	
  CD8+	
  durante	
  
el	
   proceso	
   de	
   activación	
   celular	
   utilizando	
   como	
   estimulo	
   anti-­‐CD3	
   y	
   anti-­‐CD28	
   para	
  
posteriormente	
   analizar	
   mediante	
   el	
   uso	
   de	
   lectinas	
   y	
   citometría	
   de	
   flujo.	
   También	
   se	
  
utilizo	
  un	
  modelo	
  de	
  Asma	
  alérgica	
  inducida	
  por	
  Ovoalbúmina	
  para	
  simular	
  una	
  respuesta	
  
tipo	
   Th2	
   y	
   estudiar	
   el	
   proceso	
   de	
   glicosilación	
   durante	
   esta	
   respuesta	
   humoral	
  
dependiente	
  de	
  STAT-­‐6.	
  Los	
  resultados	
  mostraron	
  que	
  la	
  ausencia	
  de	
  STAT-­‐6	
  aumenta	
  el	
  
reconocimiento	
  de	
   linfocitos	
  T	
  CD4+	
  45%	
  (±15.6)	
  con	
  respecto	
  a	
   los	
  WT	
  13.8%	
  (±4.1),	
  de	
  
manera	
   similar	
   en	
   linfocitos	
   T	
   CD8+	
   69.8%	
   (±9.9)	
   con	
   respecto	
   a	
   los	
   WT	
   25.6%	
   (±6.3)	
  
reconocidos	
  por	
   la	
   lectina	
  PHA.	
  La	
  activación	
  policlonal	
  con	
  anti-­‐CD3	
  y	
  anti-­‐CD28	
  mostró	
  
que	
  en	
  ratones	
  deficientes	
  en	
  STAT-­‐6,	
  con	
  respecto	
  a	
  los	
  WT,	
  incrementaron	
  los	
  ligandos	
  
de	
  las	
  lectinas	
  Con	
  A,	
  PNA,	
  SNA,	
  MAA	
  y	
  PHA	
  en	
  linfocitos	
  T	
  CD4+	
  y	
  Con	
  A,	
  PNA,	
  SNA,	
  MAA,	
  
PHA	
   y	
   ECL	
   en	
   linfocitos	
   T	
   CD8+.	
   Mientras	
   que	
   en	
   linfocitos	
   T	
   CD4+	
   y	
   T	
   CD8+,	
   en	
   una	
  
respuesta	
   tipo	
   Th2,	
   se	
   observó	
   una	
   tendencia	
   aparentemente	
   contraria	
   al	
   modelo	
   de	
  
activación	
   in	
   vitro,	
   ya	
   que	
   los	
   linfocitos	
   tanto	
   T	
   CD4+	
   como	
   T	
   CD8+	
   de	
   ratones	
   WT	
  
mostraron	
   un	
   patrón	
   de	
   glicosilación	
   mayor	
   que	
   las	
   células	
   de	
   los	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐,	
   para	
   las	
  
lectinas	
  MAA,	
   SNA,	
   AAL,	
   PNA	
   y	
   PHA.	
   Estos	
   resultados	
   sugieren	
   un	
   papel	
   regulador	
   por	
  
parte	
  de	
  STAT-­‐6	
  en	
  los	
  ligandos	
  sacarídicos	
  reconocidos	
  por	
  las	
  lectinas	
  Con	
  A,	
  ECL,	
  MAA,	
  
PHA,	
  PNA	
  y	
  SNA	
  abriendo	
  un	
  nuevo	
  panorama	
  para	
  el	
  estudio	
  de	
   las	
  glicosiltransferasas	
  
responsables	
   de	
   la	
   creación	
   de	
   estos	
   ligandos	
   sacarídicos.
Página | 4 
 
	
  
I. Introducción	
  
 
Generalidades	
  sobre	
  los	
  sacáridos	
  en	
  proteínas	
  
 
 
	
  Los	
  sacáridos	
  son	
  componentes	
  importantes	
  de	
  todos	
  los	
  organismos	
  vivos	
  y	
  desempeñan	
  
diversas	
  funciones.	
  Algunos	
  son	
  componentes	
  estructurales	
  de	
  las	
  células,	
  otros	
  funcionan	
  
como	
  sitios	
  de	
  reconocimiento	
  en	
  las	
  superficies	
  celulares,	
  y	
  otros	
  más	
  sirven	
  como	
  fuente	
  
principal	
   de	
   energía	
   metabólica	
   [Yurkanis,	
   2008].	
   Todas	
   las	
   células	
   e	
   innumerables	
  
macromoléculas	
  en	
  la	
  naturaleza	
  presentan	
  cadenas	
  de	
  azúcares	
  unidos	
  covalentemente;	
  
denominados	
  genéricamente	
  como	
  “glicoconjugados”	
  [Horton	
  et	
  al.,	
  2008].	
  Los	
  sacáridos,	
  
junto	
   con	
   los	
   lípidos,	
   proteínas	
   y	
   ácidos	
   nucleicos,	
   conforman	
   uno	
   de	
   los	
   cuatro	
  
componentes	
   básicos	
   de	
   la	
   célula	
   y	
   también	
   de	
   los	
   más	
   abundantes	
   y	
   diversos	
  
biopolímeros	
   de	
   la	
   naturaleza	
   [Yurkanis,	
   2008].	
   El	
   proceso	
  mediante	
   el	
   cual	
   se	
   enlazan	
  
estos	
  sacáridos	
  a	
  proteínas,	
  lípidos	
  y	
  ácidos	
  nucleicos	
  se	
  denomina	
  “glicosilación”	
  [Varki	
  et	
  
al.,	
  2009].	
  
Glicosilación	
  de	
  proteínas	
  
 
 
	
  La	
  glicosilación	
  de	
  proteínas	
  es	
  una	
  modificación	
  postraduccional	
  que	
  ocurre	
  por	
  la	
  unión	
  
enzimática	
   de	
   sacáridos	
   [Spiro,	
   2002];	
   no	
   confundir,	
   con	
   el	
   proceso	
   no	
   enzimático	
   de	
  
unión	
  de	
  sacáridos	
  a	
  proteínas	
  conocido	
  como	
  glicación	
  [Gugliucci,	
  2000].	
  La	
  glicosilación	
  
es	
  de	
  suma	
  importancia	
  para	
  la	
  proteína	
  ya	
  que	
  confiere	
  un	
  control	
  de	
  calidad	
  durante	
  su	
  
conformación,	
  así	
  como	
  diversas	
  propiedades	
  para	
  su	
  estabilidad	
  y	
  resistencia	
  a	
  proteasas	
  
Página | 5 
 
[Ohtsubo	
  &	
  Marth,	
  2006].	
  Se	
  sabe	
  que	
  los	
  sacáridos	
  pueden	
  ser	
  una	
  parte	
  esencial	
  en	
  las	
  
interacciones	
  glicoproteína-­‐glicoproteína	
  participando	
  en	
  la	
  regulación	
  celular	
  evitando	
  o	
  
promoviendo	
  dichas	
  interacciones	
  [Rudd	
  et	
  al.,	
  2001].	
  La	
  glicosilación	
  de	
  proteínas	
  puede	
  
ser	
  específica	
  de	
  especie	
  y	
  hasta	
  del	
  tipo	
  celular	
  dentro	
  de	
  un	
  mismo	
  organismo	
  [Freire	
  et	
  
al.,	
  2002].	
  En	
  mamíferos	
  la	
  glicosilación	
  de	
  proteínas	
  puede	
  estar	
  dispuesta	
  en	
  dos	
  grupos	
  
principales,	
  N-­‐glicosilación	
  y	
  O-­‐glicosilación.	
  
N-­glicosilación	
  
 
 
	
  La	
  N-­‐glicosilación	
   es	
   el	
   resultado	
   de	
   la	
   unión	
   covalente	
   entre	
   una	
   N-­‐acetilglucosamina	
  
(GlcNAc)	
  a	
  residuos	
  de	
  Asparagina	
  (Asn),	
  en	
  una	
  secuencia	
  consenso	
  de	
  tres	
  aminoácidos	
  
iniciando	
   con	
   Asn	
   seguida	
   de	
   cualquier	
   otro	
   aminoácido,	
   excepto	
   Prolina,	
   y	
   Serina	
   o	
  
Treonina	
  (Ser	
  o	
  Thr)	
  [Freire	
  et	
  al.,	
  2002].	
  La	
  síntesis	
  general	
   inicia	
  con	
  el	
  precursor	
  de	
  N-­‐
glicanos	
   en	
   la	
   cara	
   citoplásmica	
   del	
   retículo	
   endoplásmico	
   (RE)	
   por	
   la	
   transferencia	
   de	
  
GlcNAc-­‐fosfato	
   (GlcNAc-­‐P),	
   a	
   partir	
   de	
   uridina	
   difosfato-­‐GlcNAc	
   (UDP-­‐GlcNAc),	
   a	
   la	
  
molécula	
  de	
  dolicol	
  fosfato	
  (Dol-­‐P)	
  formando	
  GlcNAc-­‐pirofosfato	
  dolicol	
  (GlcNAc-­‐PP-­‐Dol),	
  
esta	
   etapa	
   está	
   catalizada	
   por	
   la	
   transferasa	
   GlcNAc-­‐I-­‐P.	
   Posteriormente	
   una	
   segunda	
  
GlcNAc	
   y	
   cinco	
   residuos	
   de	
  Manosa	
   (Man)	
   se	
   transfieren	
   de	
   forma	
   gradual	
   a	
   partir	
   de	
  
UDP-­‐GlcNAc	
   y	
   Guanosín	
   Difosfato-­‐Man	
   (GDP-­‐Man),	
   respectivamente,	
   para	
   generar	
   la	
  
molécula	
  Man5GlcNAc2-­‐PP-­‐Dol	
  en	
  el	
  lado	
  citoplásmico	
  del	
  RE	
  (Fig.	
  1)	
  [Varki	
  et	
  al.,	
  2009].	
  
Cada	
   una	
   de	
   las	
   uniones	
   sacaridicas	
   son	
   catalizadas	
   por	
   glicosiltransferasas	
   específicas	
  
[Spiro,	
   2002].	
   Por	
   un	
   mecanismo	
   de	
   volteo	
   o	
   traslocación,	
   denominado	
   “flipped”,	
   los	
  
precursores	
  trasladan	
   la	
  Man5GlcNAc2-­‐PP-­‐Dol	
  a	
   través	
  de	
   la	
  bicapa	
  de	
   la	
  membrana	
  del	
  
Página | 6 
 
RE	
  de	
  modo	
  que	
  el	
  glicano	
  se	
  expone	
  al	
  lumen	
  del	
  mismo.	
  La	
  agrupación	
  del	
  precursor	
  de	
  
Dol-­‐PP-­‐glicano	
  se	
  completa	
  con	
   la	
  unión	
  de	
  cuatro	
  manosas	
  y	
  tres	
  glucosas	
  donadas	
  por	
  
Dol-­‐P-­‐Man	
  y	
  Dol-­‐P-­‐Glucosa(Dol-­‐P-­‐Glc),	
  respectivamente.	
  Este	
  glicano	
  de	
  14	
  azúcares	
  está	
  
listo	
   para	
   la	
   transferencia	
   a	
   la	
   Asn,	
   en	
   la	
   secuencia	
   Asn-­‐X-­‐Ser/Thr.	
   Todos	
   los	
   N-­‐glicanos	
  
comparten	
   el	
   núcleo	
   sacarídico	
   común	
   Man3GlcNAc2Asn,	
   el	
   cual	
   continúa	
   siendo	
  
modificado	
  por	
  diferentes	
  glicosiltransferasas	
  en	
  el	
  aparato	
  de	
  Golgi,	
  que	
  dan	
  lugar	
  a	
  tres	
  
patrones	
  de	
  N-­‐glicanos:	
  oligomanosas,	
  complejos	
  e	
  híbridos	
  [Varki	
  et	
  al.,	
  2009]	
  (Fig.	
  2).	
  
	
  
Figura	
  1.	
  Síntesis	
  general	
  de	
  N-­‐glicanos.	
  En	
  la	
  imagen	
  se	
  observa	
  la	
  síntesis	
  completa	
  de	
  N-­‐glicanos	
  a	
  partir	
  
de	
   Dol-­‐P	
   y	
   la	
   serie	
   de	
   uniones	
   de	
   sacáridos	
   como	
   GlcNAc,	
   Man	
   y	
   Glc	
   hasta	
   llegar	
   al	
   dolicol-­‐PP-­‐
Glc3Man9GlcNac2,	
  el	
  cual	
  se	
  une	
  a	
  la	
  secuencia	
  Asn-­‐X-­‐Ser/Thr	
  de	
  la	
  proteína.	
  Imagen	
  tomada	
  de	
  Essentials	
  
of	
  Glycobiology.	
  2nd	
  edition.	
  Cold	
  Spring	
  Harbor	
  (NY):	
  Cold	
  Spring	
  Harbor	
  Laboratory	
  Press;	
  2009.	
  Chapter	
  
8.Available	
  from:	
  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1917/.	
  
O-­glicosilación	
  
 
 
	
  La	
  O-­‐glicosilación	
   denominada	
   también	
   como	
   de	
   tipo	
  mucina	
   es	
   producto	
   de	
   la	
   unión	
  
covalente	
  de	
  una	
  N-­‐acetilgalactosamina	
  (GalNAc)	
  a	
  la	
  fracción	
  hidroxilo	
  de	
  una	
  Ser	
  o	
  Thr	
  
Página | 7 
 
de	
   una	
   proteína	
   en	
   tránsito	
   en	
   el	
   aparato	
   de	
   Golgi	
   [Spiro,	
   2002].	
   A	
   diferencia	
   de	
   la	
   N-­‐
glicosilación,	
  en	
  los	
  O-­‐glicanos	
  no	
  se	
  ha	
  identificado	
  una	
  secuencia	
  consenso,	
  sin	
  embargo,	
  	
  
y	
  contrariamente	
  a	
  lo	
  que	
  sucede	
  en	
  la	
  N-­‐glicosilación,	
  en	
  la	
  glicosilación	
  tipo	
  O,	
  los	
  sitios	
  
susceptibles	
   para	
   este	
   tipo	
   de	
   glicosilación	
   pueden	
   contener	
   cercano	
   un	
   residuo	
   de	
  
Prolina,	
  aunque	
  no	
  es	
  estrictamente	
  necesario;	
  además,	
  se	
  sabe	
  que	
  la	
  unión	
  sacarídica	
  de	
  
GalNAc	
   es	
   catalizada	
  por	
   diversas	
   glicosiltransferasas.	
   El	
   primer	
   paso	
  para	
   la	
   síntesis	
   de	
  
estas	
  glicoproteínas,	
  se	
  asocia	
  con	
  la	
  transferencia	
  de	
  GalNAc	
  a	
  partir	
  de	
  UDP-­‐GalNAc,	
  esta	
  
reacción	
   está	
   catalizada	
   por	
   el	
   polipéptido	
   N-­‐acetilgalactosaminatransferasa	
   (pp-­‐
GalNAcT),	
  directamente	
  a	
   la	
   región	
  hidroxilo	
  de	
   la	
  Ser	
  o	
  Thr	
  de	
  una	
  proteína.	
  La	
  GalNAc	
  
unida	
   a	
   la	
   proteína	
   se	
   denomina	
   antígeno	
   Tn	
   (Fig.3)	
   [Varki	
   et	
   al.,	
   2009].	
   La	
   unión	
   de	
  
galactosa	
   (Gal)	
  al	
  antígeno	
  Tn	
  en	
  posición	
  β1-­‐3,	
  mediante	
   la	
   transferasa	
  Galβ1-­‐3	
  core	
  1,	
  
genera	
   al	
   núcleo-­‐1	
   (antígeno	
   T)	
   [Spiro,	
   2002].	
   Actualmente,	
   se	
   han	
   identificado	
   ocho	
  
diferentes	
  núcleos	
  de	
  O-­‐glicanos,	
  a	
  partir	
  de	
  los	
  cuales	
  ocurre	
  la	
  elongación	
  de	
  la	
  cadena	
  
oligosacarídica	
  (Fig.	
  3)	
  [Freire	
  et	
  al.,	
  2002].	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  
Figura	
   2.	
   Tipos	
   de	
   N-­‐glicanos.	
   Los	
   N-­‐glicanos	
   se	
   disponen	
   en	
   tres	
   tipos	
   que	
   son:	
   Oligomanosa,	
   cuenta	
  
únicamente	
  con	
  manosas	
  unidas	
  al	
  núcleo;	
  complejo,	
  presenta	
  dos	
  ramificaciones,	
  cada	
  una	
  con	
  GlcNAc,	
  Gal	
  
y	
  	
  ácido	
  N-­‐Acetilneuramínico	
  además	
  de	
  una	
  fucosa	
  en	
  la	
  primer	
  GlcNAc;	
  híbrido,	
  cuenta	
  con	
  una	
  porción	
  de	
  
los	
   dos	
   anteriores.	
   También	
   se	
   puede	
   apreciar	
   el	
   núcleo	
   sacarídico	
   en	
   común	
   que	
   comparten	
   los	
   tres	
  
patrones	
  de	
  N-­‐glicanos	
  (líneas	
  punteadas).	
  
Página | 8 
 
	
  
Figura	
  3.	
  Núcleos	
   en	
  O-­‐glicanos.	
   Durante	
   la	
   primera	
   etapa	
  de	
   la	
  O-­‐glicosilación,	
   la	
   unión	
  de	
  GalNAc	
   a	
   un	
  
residuo	
  de	
  Thr	
  o	
  Ser	
  en	
  la	
  cadena	
  polipeptídica,	
  se	
  forma	
  la	
  estructura	
  conocida	
  como	
  antígeno	
  Tn,	
  este	
  será	
  
el	
   punto	
  de	
  partida	
  para	
   la	
   formación	
  de	
   los	
   8	
   núcleos	
   de	
  O-­‐glicanos.	
   La	
   diferencia	
   entre	
   el	
   núcleo	
  5	
   y	
   7	
  
radica	
  en	
  el	
  enlace	
  GalNAc-­‐GalNAc,	
  α1-­‐3	
  y	
  α1-­‐6	
  respectivamente.	
  
	
  
Lectinas	
  y	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  en	
  linfocitos	
  T	
  
 
 
	
  Al	
  conjunto	
  de	
  N-­‐	
  y	
  O-­‐glicanos	
  presentes	
  en	
   la	
  superficie	
  celular	
  en	
  un	
  tiempo	
  o	
  estado	
  
determinado	
  suele	
  denominarse	
  	
  “patrón	
  de	
  glicosilación”,	
  este	
  tipo	
  de	
  patrones	
  han	
  sido	
  
estudiados	
  con	
  lectinas	
  y	
  han	
  permitido	
  conocer	
  la	
  importancia	
  de	
  la	
  glicosilación	
  celular	
  y	
  
su	
   relación	
   con	
   diversos	
   procesos	
   inmunológicos	
   [Daniels	
   et	
   al.,	
   2002].	
   Las	
   lectinas	
   son	
  
glicoproteínas	
   (de	
   plantas	
   o	
   animales),	
   con	
   la	
   capacidad	
   de	
   reconocer	
   específicamente	
  
determinados	
   azucares	
   o	
   cadenas	
   oligosacaridicas;	
   se	
   han	
   utilizado	
   ampliamente	
   para	
  
estudiar	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  y	
  los	
  cambios	
  estructurales	
  que	
  sufren	
  las	
  proteínas	
  
durante	
   la	
  maduración	
   y	
   activación	
   de	
   los	
   linfocitos	
   T;	
   también,	
   se	
   han	
   empleado	
   para	
  
Página | 9 
 
distinguir	
  o	
  aislar	
  distintos	
  subgrupos	
  celulares	
  dentro	
  de	
   las	
  poblaciones	
  de	
   linfocitos	
  T	
  
[Amado	
  et	
  al.,	
  2004;	
  Hernández	
  et	
  al.,	
  2005;	
  Ashraf	
  &	
  Khan,	
  2003].	
  
	
  
	
  Las	
   lectinas	
   poseen	
   especificidad	
   a	
   secuencias	
   sacarídicas,	
   por	
   ejemplo,	
   la	
   lectina	
   de	
  
Amaranthus	
   leucocarpus	
   (ALL)	
   y	
   la	
   aglutinina	
   de	
  Arachis	
   hypogaea	
   (PNA)	
   reconocen	
   al	
  
disacárido	
  Galβ1-­‐3GalNAc	
   [Hernández	
  et	
   al.,	
   2002].	
   No	
   obstante	
   de	
   poder	
   reconocer	
   la	
  
misma	
  estructura	
  estas	
  lectinas	
  no	
  reconocen	
  los	
  mismos	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  sobre	
  
la	
   superficie	
   celular	
   de	
   los	
   linfocitos	
   T	
   [Ortíz	
  et	
  al.,	
   2002;	
  Daniels	
  et	
  al.,	
   2002].	
   Esto	
  nos	
  
habla	
   de	
   la	
   capacidad	
   selectiva	
   que	
   presentan	
   las	
   lectinas,	
   al	
   reconocer	
   no	
   sólo	
   a	
   su	
  
ligando	
  en	
  una	
  glicoproteína,	
  sino	
  también	
  a	
  la	
  conformación	
  y	
  distribución	
  de	
  su	
  ligando	
  
dentro	
  de	
  la	
  misma	
  estructura	
  glicoproteínica.	
  
	
  
	
  Dentro	
  de	
  las	
  células	
  que	
  conforman	
  al	
  sistema	
  inmunitario,	
   los	
   linfocitos	
  T	
  han	
  sido	
  los	
  
más	
  estudiados	
  acerca	
  de	
  su	
  patrón	
  de	
  glicosilación,	
  el	
   cual,	
   cambia	
   tras	
  su	
  activación	
  y	
  
diferenciación	
  en	
   células	
   efectoras	
   [Amado	
  et	
  al.,	
   2004;	
  Galvan	
  et	
  al.,	
   1998].	
  Diferentes	
  
trabajos	
  han	
  identificado	
  el	
  patrón	
  de	
  glicosilación	
  que	
  siguen	
  los	
  linfocitos	
  desde	
  que	
  se	
  
encuentran	
  en	
  el	
  timo	
  hasta	
  quese	
  convierten	
  en	
  células	
  T	
  efectoras	
  [Amado	
  et	
  al.,	
  2004;	
  
Daniels	
  et	
  al.,	
  2002].	
  Durante	
  el	
  desarrollo	
  de	
   los	
   linfocitos	
  T	
  se	
  han	
  observado	
  cambios	
  
con	
   respecto	
   a	
   sus	
   glicoproteínas	
   de	
  membrana,	
   dichos	
   cambios	
   han	
   sido	
   relacionados	
  
con	
   la	
   actividad	
   y	
   expresión	
   enzimática	
   de	
   glicosiltransferasas	
   como	
   β-­‐
Galactosiltransferasa,	
   α2-­‐6-­‐sialiltransferasa	
   (ST6Gal)	
   y	
   α2-­‐3-­‐sialiltransferasa	
   (ST3Gal),	
   en	
  
N-­‐glicanos	
  de	
   la	
  molécula	
  CD45,	
   las	
  cuales	
  tienden	
  a	
   incrementar	
  o	
  disminuir	
  durante	
  el	
  
desarrollo	
   de	
   los	
   linfocitos	
   T	
   [Baum	
   et	
   al.,	
   1996].	
   Una	
   modificación	
   muy	
   común	
   en	
   la	
  
Página | 10 
 
glicosilación,	
  es	
  la	
  unión	
  de	
  ácido	
  siálico	
  a	
  las	
  glicoproteínas	
  de	
  membrana,	
  este	
  evento	
  es	
  
potencialmente	
  un	
  mecanismo	
  eficiente	
  para	
  la	
  modulación	
  de	
  interacciones	
  célula-­‐célula	
  
durante	
   el	
   desarrollo	
   de	
   los	
   timocitos	
   medulares	
   y	
   propiamente	
   de	
   los	
   linfocitos	
   T	
  
maduros;	
   estas	
   estructuras	
   unidas	
   ya	
   sea	
   mediante	
   enlaces	
   α2-­‐3	
   o	
   α2-­‐6	
   pueden	
   ser	
  
reconocidas	
  específicamente	
  por	
  las	
  lectinas	
  de	
  Maackia	
  amurensis	
  (MAA)	
  o	
  de	
  Sambucus	
  
nigra	
  (SNA),	
  respectivamente	
  (Tabla	
  1)	
  [Comelli	
  et	
  al.,	
  2006].	
  Un	
  ejemplo	
  de	
  este	
  proceso	
  
de	
  sialidación	
  ocurre	
  tras	
   la	
  diferenciación	
  de	
  los	
   linfocitos	
  T	
  cooperadores,	
  en	
  la	
  cual	
  se	
  
ha	
  observado	
  una	
  mayor	
  expresión	
  de	
  la	
  enzima	
  ST3Gal-­‐I,	
  impidiendo	
  así	
  la	
  formación	
  del	
  
núcleo-­‐2	
  de	
  O-­‐glicanos	
  en	
  células	
  Th2	
  [Grabie	
  et	
  al.,	
  2002].	
  Además	
  del	
  reconocimiento	
  de	
  
carbohidratos,	
  hay	
  lectinas	
  que	
  poseen	
  actividad	
  mitogénica	
  sobre	
  los	
  linfocitos	
  T,	
  tal	
  es	
  el	
  
caso	
  de	
  la	
  aglutinina	
  de	
  Phaseolus	
  vulgaris	
  (PHA)	
  y	
  la	
  lectina	
  Concanavalina	
  A	
  (Con	
  A)	
  las	
  
cuales	
   se	
   unen	
   a	
   sus	
   receptores	
   en	
   los	
   linfocitos	
   T	
   estimulando	
   la	
   permeabilidad	
   de	
   la	
  
membrana	
  a	
  diferentes	
  metabolitos	
   como	
  el	
  Ca+	
   	
   e	
   iniciando	
  así	
   la	
   activación	
   y	
  división	
  
celular	
  [Ashraf	
  &	
  Khan,	
  2003].	
  
Linfocitos	
  T	
  
 
 
	
  Los	
   linfocitos	
  T	
  se	
  subdividen	
  en	
  tres	
  subpoblaciones:	
   los	
   linfocitos	
  T	
  cooperadores	
  (Th),	
  
linfocitos	
   T	
   citotóxicos	
   y	
   los	
   linfocitos	
   Treg	
   [Abbas	
   et	
   al.,	
   2008].	
   Los	
   linfocitos	
   T	
  
cooperadores	
   presentan	
   CD4	
   como	
  marcador	
   de	
  membrana,	
   estos	
   linfocitos	
   colaboran	
  
tanto	
  con	
  linfocitos	
  B	
  en	
  el	
  desarrollo	
  de	
  una	
  respuesta	
  humoral,	
  como	
  con	
  los	
  linfocitos	
  T	
  
citotóxicos,	
   además,	
   pueden	
   modular	
   la	
   función	
   de	
   macrófagos	
   y	
   regular	
   la	
   respuesta	
  
inmune	
   contra	
   agentes	
   patógenos.	
   Los	
   linfocitos	
   T	
   citotóxicos	
   presentan	
   CD8	
   como	
  
Página | 11 
 
marcador	
  de	
  membrana,	
  su	
  función	
  es	
  contribuir	
  con	
  la	
  respuesta	
  inmunitaria	
  celular	
  en	
  la	
  
eliminación	
   de	
   células	
   que	
   han	
   sido	
   infectadas	
   por	
   virus	
   o	
   diferentes	
   patógenos	
  
intracelulares	
  [Kindt	
  et	
  al.,	
  2007].	
  Por	
  su	
  parte,	
   los	
   	
   linfocitos	
  T	
  reguladores	
  desempeñan	
  
un	
  papel	
   fundamental	
  para	
  mantener	
   la	
   tolerancia	
  a	
  antígenos	
  propios	
  y	
   la	
  homeostasis	
  
[Vergara,	
  2009].	
  El	
  linfocito	
  T	
  CD4+	
  se	
  puede	
  dividir	
  en	
  subpoblaciones	
  celulares:	
  como	
  las	
  
células	
   cooperadoras	
   Th1	
   y	
   Th2,	
   responsables	
   de	
   la	
   inmunidad	
   celular	
   y	
   la	
   inmunidad	
  
humoral,	
  respectivamente	
  [Glimcher	
  &	
  Murphy,	
  2000];	
  las	
  células	
  T	
  cooperadoras	
  Th17,	
  a	
  
las	
   cuales	
   se	
   les	
   ha	
   relacionado	
   con	
   la	
   inflamación	
   del	
   tejido	
   y	
   la	
   exacerbación	
   de	
   la	
  
patología	
  autoinmune	
  [Zhu	
  &	
  Paul,	
  2008].	
  
	
  
Tabla	
  1.	
  Algunas	
  de	
  las	
  Lectinas	
  vegetales	
  empleadas	
  para	
  el	
  estudio	
  de	
  glicoproteínas.	
  
Lectina	
   Abreviatura	
   Especificidad	
  
Aleuria	
  aurantia	
  
Amaranthus	
  leucocarpus	
  
Arachis	
  hypogaea	
  
Concanavalina	
  A	
  
Erythrina	
  cristagalli	
  
Jacalina	
  
Maackia	
  amurensis	
  
Phaseolus	
  vulgaris	
  
Pisum	
  sativum	
  
Sambucus	
  nigra	
  
Vicia	
  villosa	
  
AAL	
  
ALL	
  
PNA	
  
Con	
  A	
  
ECL	
  
Jacalina	
  
MAA	
  
PHA	
  
PSA	
  
SNA	
  
VVL	
  
Fucα6GlcNAc	
  
GalNAc	
  
Galβ1-­‐3GalNAc	
  
αMan,	
  αGlc	
  
Galβ1-­‐4GlcNAc	
  
Galβ1-­‐3GalNAc	
  
Neu5Acα2-­‐3Galβ1-­‐4GalNAc	
  
Galβ1-­‐4GlcNAcβ1-­‐6(GlcNAcβ1-­‐2Manα3)Man-­‐α3	
  
αMan,	
  αGlc	
  
Neu5Acα2-­‐6Gal/GalNAc	
  
GalNAc	
  
Página | 12 
 
	
  
Respuestas	
  celulares	
  tipo	
  Th1,	
  Th2	
  y	
  Th17	
  
	
  
	
  
	
  La	
   respuesta	
   celular	
  o	
  Th1,	
   es	
   la	
   encargada	
  de	
   regular	
  una	
   respuesta	
   contra	
  patógenos	
  
intracelulares,	
   a	
   través	
   	
   de	
   la	
   activación	
  de	
  macrófagos,	
   células	
  NKs	
   y	
   linfocitos	
   T	
   CD8+.	
  
Esta	
   respuesta	
   se	
   caracteriza	
   por	
   una	
   producción	
   predominante	
   de	
   IFN-­‐γ	
   e	
   IL-­‐2,	
   dichas	
  
citocinas	
  ayudan	
  a	
  regular	
  la	
  respuesta	
  al	
  activar	
  macrófagos	
  [Glimcher	
  &	
  Murphy,	
  2000].	
  
La	
   respuesta	
   Th2	
   interviene	
   en	
   la	
   defensa	
   contra	
   parásitos	
   extracelulares,	
   como	
   los	
  
helmintos;	
   así	
   mismo	
   se	
   le	
   ha	
   relacionado	
   con	
   la	
   inducción	
   de	
   alergias	
   como	
   el	
   asma	
  
alérgica	
  y	
  diversas	
  autoinmunidades	
   [Zhu	
  &	
  Paul,	
  2008].	
  Entre	
   las	
   citocinas	
   relacionadas	
  
con	
   este	
   tipo	
   de	
   respuesta	
   están:	
   IL-­‐4,	
   IL-­‐5,	
   IL-­‐10	
   e	
   IL-­‐13;	
   siendo	
   la	
   IL-­‐4	
   e	
   IL-­‐10	
   las	
  más	
  
importantes	
  por	
  conducir	
  a	
   la	
  diferenciación	
  de	
  la	
  subpoblación	
  Th2	
  e	
  inhibición	
  de	
  Th1,	
  
respectivamente	
   [Noble,	
   2000;	
   Vergara,	
   2009].	
   La	
   subpoblación	
   de	
   células	
   Th17	
   está	
  
implicada	
  en	
  la	
  defensa	
  contra	
  bacterias	
  y	
  hongos	
  extracelulares,	
  así	
  como	
  la	
  exacerbación	
  
de	
   enfermedades	
   autoinmunes	
   y	
   la	
   actividad	
   proinflamatoria	
   del	
   tejido;	
   	
   la	
   principal	
  
citocina	
  secretada	
  por	
  esta	
  población	
  es	
  la	
  IL-­‐17	
  [Zhu	
  &	
  Paul,	
  2008].	
  La	
  generación	
  de	
  las	
  
diferentes	
   subpoblaciones	
   de	
   linfocitos	
   T	
   CD4+	
   dependen	
   de	
   las	
   citocinas	
   presentes	
  
durante	
  su	
  activación,	
  ya	
  sea	
  IFN-­‐γ,	
  IL-­‐4	
  o	
  IL-­‐17;	
  sin	
  embargo,	
  esta	
  diferenciación	
  también	
  
está	
  regulada	
  por	
  la	
  expresión	
  de	
  distintos	
  factores	
  de	
  transcripción	
  como	
  T-­‐bet	
  y	
  STAT-­‐4	
  
para	
  los	
  linfocitos	
  Th1,	
  GATA-­‐3	
  y	
  STAT-­‐6	
  para	
  los	
  Th2,	
  RORγt	
  y	
  STAT-­‐3	
  para	
  Th17	
  y	
  Foxp3	
  
para	
  T	
  reguladoras	
  [Vergara,2009;	
  Zhu	
  &	
  Paul,	
  2008;	
  Noble,	
  2000].	
  
	
  
Página | 13 
 
Vías	
  de	
  señalización	
  involucradas	
  en	
  la	
  generación	
  de	
  las	
  subpoblaciones	
  
Th	
  
 
 
	
  Durante	
   la	
   activación	
   del	
   linfocito	
   T	
   se	
   pueden	
   inducir	
   directamente	
   la	
   expresión	
   de	
  
factores	
   de	
   transcripción	
   que	
   son	
   expresados	
   selectivamente	
   en	
   células	
   que	
   van	
   a	
  
diferenciarse	
  finalmente	
  en	
  linfocitos	
  Th1	
  o	
  Th2.	
  Estos	
  factores	
  de	
  transcripción	
  incluyen	
  a	
  
T-­‐bet,	
  un	
  factor	
  específico	
  de	
   linfocitos	
  Th1	
  que	
   induce	
  a	
   la	
  producción	
  de	
   IFN-­‐γ	
  [Noble,	
  
2000].	
  Las	
  vías	
  de	
  señalización	
  que	
  emanan	
  del	
  TCR	
  y	
  el	
  receptor	
  de	
  IL-­‐12	
  conducen	
  a	
  la	
  
diferenciación	
  de	
  estas	
  células,	
  mediante	
  la	
  inducción	
  de	
  la	
  expresión	
  de	
  T-­‐bet.	
  La	
  IL-­‐12	
  e	
  
IFN-­‐α	
   (por	
   la	
  producción	
  de	
   IFN-­‐γ)	
  activan	
  a	
  STAT-­‐4/T-­‐bet	
  e	
   inducen	
  el	
  desarrollo	
  de	
   los	
  
linfocitos	
  Th1	
  al	
  mismo	
  tiempo	
  inhiben	
  la	
  producción	
  de	
  las	
  citocinas	
  IL-­‐4	
  e	
  IL-­‐5	
  necesarias	
  
para	
  la	
  respuesta	
  Th2	
  [Glimcher	
  &	
  Murphy,	
  2000].	
  
	
  
	
  GATA-­‐3	
   y	
   STAT-­‐6,	
   son	
   dos	
   de	
   los	
   factores	
   de	
   transcripción	
   que	
   juegan	
   un	
   papel	
  
importante	
   para	
   el	
   desarrollo	
   de	
   los	
   linfocitos	
   Th2.	
   De	
   igual	
   manera	
   que	
   en	
   la	
   vía	
   de	
  
diferenciación	
  Th1,	
  las	
  señales	
  que	
  emanan	
  del	
  TCR	
  intervienen	
  para	
  la	
  diferenciación	
  de	
  
los	
  linfocitos	
  Th2	
  [Noble,	
  2000].	
  La	
  IL-­‐4	
  junto	
  con	
  la	
  IL-­‐13	
  son	
  las	
  citocinas	
  responsables	
  de	
  
la	
  diferenciación	
  de	
  la	
  respuesta	
  Th2,	
  y	
  STAT-­‐6	
  es	
  el	
  factor	
  de	
  transcripción	
  encargado	
  de	
  
su	
  síntesis	
  y	
  de	
  sus	
  funciones.	
  La	
  activación	
  de	
  STAT-­‐6	
  se	
  da	
  por	
  la	
  unión	
  del	
  receptor	
  de	
  
IL-­‐4	
  con	
  su	
  ligando,	
  esta	
  interacción	
  desencadena	
  la	
  vía	
  de	
  señalización	
  JAK/STAT	
  [Vergara,	
  
2009].	
   Esta	
   vía	
   de	
   señalización	
   activa	
   a	
   las	
   Jak	
   Kinasas	
   del	
   receptor	
   de	
   IL-­‐4	
   que	
  
posteriormente	
  fosforila	
  a	
  STAT-­‐6,	
  traslocandola	
  al	
  núcleo,	
  donde	
  se	
  une	
  a	
  genes	
  blanco	
  
que	
  activan	
  la	
  transcripción	
  y	
  promueven	
  la	
  proliferación	
  y	
  secreción	
  de	
  IL-­‐4.	
  La	
  activación	
  
de	
  STAT-­‐6	
  es	
  necesaria	
  y	
  suficiente	
  para	
  incrementar	
  los	
  niveles	
  de	
  expresión	
  de	
  GATA-­‐3	
  
Página | 14 
 
[Zhu	
  &	
  Paul,	
  2008].	
  Los	
  altos	
  niveles	
  en	
  GATA-­‐3	
  conducen	
  al	
   incremento	
  en	
   las	
  citocinas	
  
para	
   la	
   respuesta	
   Th2	
   (IL-­‐4,	
   IL-­‐5	
   e	
   IL-­‐13)	
   uniéndose	
   a	
   los	
   promotores	
   de	
   los	
   genes	
   de	
  
dichas	
   citocinas.	
   La	
  expresión	
  de	
  ambos	
   factores	
  de	
   transcripción	
   reprimen	
   las	
   citocinas	
  
para	
   la	
   respuesta	
   Th1,	
   esto	
   se	
   debe	
   a	
   que	
   STAT-­‐6	
   y	
  GATA-­‐3	
   inhiben	
   la	
   transcripción	
  de	
  
señales	
  del	
  receptor	
  de	
  IL-­‐12	
  [Glimcher	
  &	
  Murphy,	
  2000].	
  
Transductor	
  de	
  Señales	
  y	
  Activador	
  de	
  la	
  Transcripción	
  (STAT)	
  
 
 
	
  Los	
   transductores	
  de	
   señales	
   y	
   activadores	
  de	
   la	
   transcripción	
  o	
   STAT	
  por	
   sus	
   siglas	
   en	
  
inglés	
   (Signal	
  Transductors	
  and	
  Activators	
  of	
  Transcription)	
   son	
  una	
   familia	
  de	
  proteínas	
  
citoplasmáticas	
   que	
   son	
   activadas	
   por	
   la	
   interacción	
   ligando-­‐receptor	
   de	
   uno	
   o	
   más	
  
factores	
   de	
   crecimiento,	
   citocinas	
   u	
   hormonas	
   [Nikol'skii	
   &	
   Vasilenko,	
   2000].	
   Estas	
  
proteínas	
   se	
   componen	
   por	
   alrededor	
   de	
   750	
   a	
   950	
   aminoácidos	
   y	
   poseen	
   dominios	
  
conservados.	
   Sobre	
   su	
   función	
   biológica	
   se	
   sabe	
   que	
   participan	
   en	
   la	
   regulación	
   de	
  
procesos	
  de	
  proliferación	
  y	
  diferenciación	
  celular,	
  así	
  como	
  en	
  el	
  control	
  de	
  la	
  respuesta	
  
inmunitaria	
  [Levy	
  &	
  Darnell,	
  2002].	
  
	
  
	
  Las	
  proteínas	
  STAT	
  forman	
  parte	
  de	
  las	
  vías	
  de	
  señalización	
  conocidas	
  como	
  JAK/STAT	
  que	
  
permiten	
  a	
  las	
  células	
  responder	
  a	
  estímulos	
  de	
  citocinas,	
  su	
  activación	
  se	
  da	
  por	
  la	
  unión	
  
de	
  un	
   ligando	
  a	
  su	
  receptor,	
   tras	
  el	
  cambio	
  conformacional	
  que	
  sufre	
  el	
   receptor,	
  por	
   la	
  
unión	
  a	
  su	
   ligando,	
  se	
  activan	
   las	
  tirosinas	
  Kinasas	
   (JAK)	
  que	
  posteriormente	
  fosforilan	
  a	
  
las	
   proteínas	
   STAT	
   (Fig.	
   4)	
   [Darnell,	
   1997].	
   Una	
   vez	
   fosforiladas	
   las	
   proteínas	
   STAT,	
  
dimerizan	
  a	
  través	
  de	
  sus	
  dominios	
  SH2	
  y	
  se	
  trasladan	
  del	
  citosol	
  al	
  núcleo,	
  donde	
  se	
  unen	
  
a	
  secuencias	
  del	
  DNA	
  específicas	
  para	
   iniciar	
   la	
   transcripción	
  [Abbas	
  et	
  al.,	
  2008;	
  Levy	
  &	
  
Página | 15 
 
Darnell,	
   2002].	
   En	
   el	
   núcleo	
   estas	
   proteínas	
   pueden	
   ser	
   “reutilizadas”	
   ya	
   que	
   son	
  
inactivadas	
  por	
   fosfatasas	
  nucleares	
  que	
  promueven	
   su	
   regreso	
  al	
   citoplasma	
  hasta	
  que	
  
sean	
  activadas	
  de	
  nuevo	
  [Nikol'skii	
  &	
  Vasilenko,	
  2000].	
  
	
  
	
  
Figura	
  4.	
  Mecanismo	
  de	
  activación	
  de	
  STAT.	
  Se	
  observan	
  las	
  tres	
  fosforilaciones	
  por	
  las	
  que	
  se	
  debe	
  pasar	
  
antes	
   de	
   la	
   activación	
   de	
   las	
   STAT;	
   una	
   vez	
   que	
   llega	
   el	
   ligando	
   a	
   su	
   receptor	
   y	
   se	
   une	
   hay	
   un	
   cambio	
  
conformacional	
  del	
  receptor	
  provocando	
  la	
  activación	
  de	
  las	
  JAK	
  y	
  su	
  fosforilación.	
  La	
  segunda	
  fosforilación	
  
ocurre	
  en	
  las	
  tirosinas	
  del	
  receptor	
  debido	
  a	
  la	
  activación	
  de	
  las	
  JAK,	
  por	
  último	
  la	
  fosforilación	
  de	
  las	
  STAT	
  
que	
  se	
  unen	
  a	
  la	
  parte	
  citoplásmica	
  del	
  receptor,	
  lo	
  que	
  promueve	
  su	
  unión	
  con	
  otra	
  STAT	
  formando	
  homo	
  o	
  
heterodímeros	
   que	
   se	
   dirigen	
   al	
   núcleo	
   para	
   unirse	
   a	
   secuencias	
   específicas	
   del	
   DNA	
   y	
   regular	
   la	
  
transcripción	
  de	
  genes.	
  	
  Imagen	
  tomada	
  de	
  Darnell,	
  J.	
  E.	
  Jr.,	
  1997.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Figura	
  5.	
  Dominios	
  de	
  las	
  proteínas	
  STAT.	
  Se	
  observa	
  cada	
  uno	
  de	
  los	
  dominios	
  que	
  conforman	
  a	
  la	
  proteína	
  
y	
  el	
  número	
  de	
  aminoácidos	
  con	
  los	
  que	
  cuenta	
  cada	
  uno.	
  Imagen	
  tomada	
  y	
  modificada	
  de	
  Darnell,	
  J.	
  E.	
  Jr.,	
  
1997.	
  
Página | 16 
 
	
  
Estructura	
  
 
 
	
  La	
   estructura	
   de	
   las	
   proteínas	
   STAT	
   cuenta	
   con	
   7	
   dominios	
   conservados	
   (Fig.	
   5).	
   El	
  
primero	
  de	
  ellos	
  es	
  el	
  dominio	
  amino	
  terminal	
   (NH2),	
  seguido	
  del	
  dominio	
  “Coiled-­‐Coil”;	
  
mientras	
   que	
   en	
   el	
   centro	
   de	
   la	
   molécula	
   se	
   localiza	
   el	
   dominio	
   de	
   unión	
   al	
   DNAy	
   el	
  
dominio	
  de	
  enlace,	
  lo	
  que	
  respecta	
  a	
  	
  la	
  región	
  del	
  carboxilo	
  terminal	
  se	
  localiza	
  el	
  domino	
  
SH2,	
   siendo	
   este	
   el	
   más	
   conservado	
   con	
   respecto	
   a	
   los	
   demás,	
   y	
   que	
   sirve	
   para	
   dos	
  
funciones	
   fundamentales:	
   la	
   unión	
   de	
   la	
   molécula	
   de	
   STAT	
   al	
   receptor	
   de	
   citocina	
  
fosforilado	
   y	
   la	
   de	
   ser	
   fosforilado	
   en	
   los	
   residuos	
   tirosina	
   conservados	
   por	
   las	
   tirosinas	
  
Kinasas;	
   le	
  sigue	
  el	
  dominio	
  de	
  activación	
  de	
  tirosina	
  y	
  el	
  dominio	
  TAD	
  (Trans	
  Activation	
  
Domain)	
  [Levy	
  &	
  Darnell,	
  2002].	
  
	
  
STAT-­6	
  
 
 
	
  STAT-­‐6	
   	
   es	
   un	
   miembro	
   de	
   la	
   familia	
   de	
   las	
   STAT	
   y	
   es	
   activado	
   principalmente	
   por	
   la	
  
interacción	
   de	
   IL-­‐4	
   e	
   IL-­‐13	
   con	
   sus	
   respectivos	
   receptores	
   para	
   la	
   diferenciación	
   de	
   la	
  
respuesta	
  Th2	
  [Kaplan	
  et	
  al.,	
  1996;	
  Wurster	
  et	
  al.,	
  2000];	
  además,	
  promueve	
  el	
  cambio	
  de	
  
isotipo	
  a	
  IgE	
  y	
  regula	
  la	
  expresión	
  de	
  algunas	
  moléculas	
  de	
  superficie	
  celular	
  responsables	
  
de	
   la	
   presentación	
   de	
   antígeno	
   por	
   linfocitos	
   B	
   como	
  MHC-­‐II,	
   receptor	
   de	
   IL-­‐4	
   y	
   CD23	
  
[Goenka	
  &	
  Kaplan,	
  2011;	
  Kaplan	
  et	
  al.,	
  1996].	
  Una	
  vez	
  que	
  los	
  linfocitos	
  T	
  son	
  activados	
  se	
  
induce	
   la	
   vía	
   de	
   señalización	
   JAK/STAT-­‐6	
   por	
   las	
   JAK1	
   y	
   JAK3.	
   STAT-­‐6	
   reconoce	
   a	
   las	
  	
  
tirosinas	
   fosforiladas	
   de	
   la	
   cadena	
   α	
   del	
   receptor	
   de	
   citocinas	
   como	
   la	
   IL-­‐4,	
   	
   forma	
   un	
  
Página | 17 
 
homodímero	
  que	
  se	
  trasloca	
  al	
  núcleo	
  y	
  se	
  une	
  a	
  genes	
  blanco	
  activando	
  su	
  transcripción	
  
[Wurster	
  et	
  al.,	
  2000].	
  
	
  
	
  Por	
   otro	
   lado,	
   STAT-­‐6	
   afecta	
   diferentes	
   mecanismos	
   moleculares	
   los	
   cuales	
   están	
  
relacionados	
  con	
  la	
  activación	
  de	
  diversos	
  factores	
  de	
  transcripción	
  como	
  Notch,	
  mTORC2	
  
y	
   Wnt	
   [Maier	
   et	
   al.,	
   2012;	
   Elo	
   et	
   al.,	
   2010].	
   Además,	
   se	
   le	
   ha	
   involucrado	
   durante	
   el	
  
desarrollo	
  de	
  enfermedades	
  que	
  implican	
  inflamación	
  en	
  el	
  tejido,	
  como	
  las	
  autoinmunes,	
  
las	
  parasitosis	
  mediadas	
  por	
  helmintos	
  [Urban	
  et	
  al.,	
  2000]	
  y	
  en	
  padecimientos	
  alérgicos	
  
[Kaplan	
  et.	
  al.,	
  1996].	
  También	
  se	
  ha	
  observado	
  que	
  en	
  ausencia	
  de	
  STAT-­‐6	
  los	
  individuos	
  
tienen	
   problemas	
   para	
   desarrollar	
   una	
   respuesta	
   de	
   tipo	
   Th2	
   [Goenka	
  &	
   Kaplan,	
   2011;	
  
Kaplan	
  et.	
  al.,	
  1996;	
  Tuomela	
  et.	
  al.,	
  2009].	
  
	
  
Página | 18 
 
	
  
II. Antecedentes	
  
 
 
	
  Se	
   ha	
   reportado	
   que	
   los	
   factores	
   de	
   transcripción	
   T-­‐bet	
   y	
   GATA-­‐3	
   participan	
   en	
   la	
  
regulación	
  de	
  la	
  expresión	
  de	
  glicosiltransferasas,	
  de	
  tal	
  modo,	
  modifican	
  los	
  patrones	
  de	
  
glicosilación	
   de	
   la	
   célula.	
   En	
   PNAS	
   [Guo-­‐Yun	
   Chen	
   et	
   al.,	
   2006]	
   evaluaron	
   el	
   papel	
   que	
  
desempeñan	
  ambos	
  factores	
  de	
  transcripción	
  (T-­‐bet	
  y	
  GATA-­‐3)	
  durante	
  la	
  transcripción	
  de	
  
la	
   fucosiltransferasa-­‐VII	
   (FucT-­‐VII)	
   y	
   la	
  expresión	
  del	
   sacárido	
  Sialil	
   Lewis-­‐X	
  en	
  diferentes	
  
líneas	
  celulares	
  que	
  no	
  expresan	
  este	
  azúcar.	
  FucT-­‐VII	
  es	
  la	
  responsable	
  de	
  la	
  síntesis	
  del	
  
carbohidrato	
  Sialil	
  Lewis-­‐X,	
   ligando	
  para	
   la	
   interacción	
  con	
  Selectinas	
  en	
  células	
  Th1.	
  Sus	
  
resultados	
   mostraron	
   que	
   T-­‐bet	
   promueve	
   la	
   transcripción	
   de	
   FucT-­‐VII	
   y	
   GATA-­‐3	
   la	
  
disminuye.	
  
	
  
De	
  manera	
  similar	
  en	
  Nature	
  immunology	
  [Toscano	
  et	
  al.,	
  2007]	
  determinaron	
  que	
  existen	
  
diferencias	
  en	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  entre	
  los	
  linfocitos	
  T	
  cooperadores	
  CD4+	
  	
  tipo	
  
Th1,	
  Th2	
  y	
  Th17	
  que	
  favorecen	
  la	
  unión	
  a	
  Galectina-­‐I	
  (Gal-­‐I),	
  especifica	
  para	
  la	
  estructura	
  
Galβ1-­‐3GalNAc	
   y	
  promotora	
  de	
  apoptosis.	
  Dentro	
  de	
  estas	
  poblaciones,	
   únicamente	
   los	
  
linfocitos	
  Th1	
  y	
  Th17	
  presentaron	
  mayormente	
   los	
   ligandos	
  para	
  Gal-­‐I,	
   haciéndolos	
  más	
  
susceptibles	
   a	
   muerte	
   por	
   apoptosis;	
   a	
   diferencia	
   de	
   los	
   linfocitos	
   Th2,	
   los	
   cuales	
  
presentaron	
  más	
  ácidos	
  siálicos	
  α2-­‐6	
  los	
  cuales	
  bloqueaban	
  los	
  sitios	
  de	
  unión	
  para	
  Gal-­‐I,	
  
mismos	
   que	
   fueron	
   identificados	
   con	
   las	
   lectinas	
   SNA	
   y	
   PNA,	
   respectivamente.	
   Los	
  
resultados	
   de	
   Chen	
   y	
   Toscano	
   confirman	
   que	
   T-­‐bet	
   y	
   GATA-­‐3	
   inducen	
   estados	
   de	
  
Página | 19 
 
glicosilación	
   de	
   membrana	
   diferenciales	
   en	
   los	
   linfocitos	
   Th1	
   y	
   Th2	
   los	
   cuales	
   pueden	
  
tener	
  un	
  importante	
  impacto	
  en	
  su	
  supervivencia.	
  
III. Planteamiento	
  del	
  problema	
  
 
 
	
  STAT-­‐6	
  es	
  un	
  factor	
  de	
  transcripción	
  importante	
  para	
  la	
  diferenciación	
  de	
  Linfocitos	
  T	
  el	
  
cual	
   se	
   encuentra	
   participando	
   desde	
   el	
   proceso	
   de	
   activación	
   celular.	
   Varios	
   trabajos	
  
indican	
  que	
  STAT-­‐6	
  participa	
  de	
  manera	
  indirecta	
  en	
  la	
  remodelación	
  de	
  la	
  glicosilación	
  de	
  
superficie	
   del	
   Linfocito	
   T	
   al	
   inducir	
   GATA-­‐3,	
   no	
   obstante	
   en	
   estos	
   trabajos	
   solo	
   se	
   ha	
  
manipulado	
   a	
   GATA-­‐3	
   por	
   lo	
   tanto	
   no	
   se	
   conoce	
   el	
   alcance	
   de	
   STAT-­‐6	
   como	
  molécula	
  
reguladora	
   del	
   proceso	
   de	
   glicosilación	
   celular	
   en	
   los	
   linfocitos	
   T.	
   	
   	
   De	
   tal	
  manera,	
   nos	
  
preguntamos	
  el	
  papel	
  que	
  juega	
  STAT-­‐6	
  en	
  la	
  modificación	
  de	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  
de	
  membrana	
  de	
  los	
  linfocitos	
  T	
  CD4+	
  y	
  T	
  CD8+	
  durante	
  el	
  proceso	
  de	
  activación	
  in	
  vitro	
  y	
  
en	
  un	
  modelo	
  murino	
  in	
  vivo	
  de	
  respuesta	
  tipo	
  TH2	
  (Asma).	
  
	
  
	
  
IV. Hipótesis	
  
 
 
-­‐ STAT-­‐6	
   regula	
   la	
   expresión	
   de	
   azúcares	
   de	
   membrana	
   en	
   células	
   CD4+	
   y	
   CD8+	
  
activadas	
  y	
  durante	
  una	
  respuesta	
  tipo	
  Th2.	
  
	
  
Página | 20 
 
	
  
V. Objetivos	
  
	
  
 
 
General	
  
 
 
-­‐ Determinar	
  el	
  patrón	
  de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  regulado	
  por	
  STAT-­‐6	
  en	
  células	
  
CD4+	
  y	
  CD8+	
  durante	
  el	
  proceso	
  de	
  activación	
  celular.	
  
	
  
Particulares	
  
 
 
-­‐ Validar	
  el	
  modelo	
  murino	
  “knockout”	
  para	
  STAT-­‐6.	
  
-­‐ Determinar	
  si	
  STAT-­‐6	
  interfiere	
  en	
  la	
  proporción	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+.	
  
-­‐ Determinar	
   los	
   patrones	
   de	
   glicosilación	
   de	
   membrana	
   inducidos	
   durante	
   la	
  
activación	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  usando	
  un	
  estímulo	
  policlonalin	
  vitro	
  (anti-­‐CD3	
  y	
  
anti-­‐CD28).	
  
-­‐ Determinar	
   los	
   patrones	
   de	
   glicosilación	
   de	
   membrana	
   en	
   células	
   CD4+	
   y	
   CD8+	
  
durante	
   una	
   respuesta	
   tipo	
   Th2	
   inducida	
   por	
   un	
   estímulo	
   con	
   Ovoalbúmina,	
   in	
  
vivo.	
  
	
  
Página | 21 
 
	
  
VI. Materiales	
  y	
  método	
  
 
 
Ratones	
  
 
 
	
  Se	
  utilizaron	
   ratones	
  hembras	
  BALB/c	
  de	
  6	
  a	
  8	
   semanas	
  de	
  edad,	
  de	
  genotipo	
   silvestre	
  
(WT)	
   y	
   deficientes	
   en	
   STAT-­‐6	
   (STAT-­‐6-­‐/-­‐).	
   Todos	
   los	
   ratones	
   se	
   mantuvieron	
   con	
   libre	
  
acceso	
   a	
   comida	
   y	
   agua;	
   fueron	
   tratados	
   según	
   las	
   normas	
   del	
   Comité	
   de	
   Ciencia	
   y	
  
Bioética	
  del	
  Instituto	
  Nacional	
  de	
  Enfermedades	
  Respiratorias	
  y	
  la	
  NOM-­‐062-­‐ZOO-­‐1999.	
  
Anticuerpos	
  
 
 
	
  Los	
  anticuerpos	
  anti-­‐CD3,	
  anti-­‐CD28	
  y	
  estreptavidina-­‐Cychromo	
  fueron	
  comprados	
  en	
  BD	
  
Pharmingen	
   (New	
   York,	
   NY,	
   U.S.A.).	
   Los	
   anticuerpos	
   marcados	
   con	
   isotiocianato	
   de	
  
fluoresceína	
  (FITC)	
  para	
  CD4	
  y	
  ficoeritrina	
  (PE)	
  para	
  CD8	
  se	
  obtuvieron	
  de	
  BD	
  Biosciences	
  
(San	
  Diego,	
  CA,	
  U.S.A.).	
  
Lectinas	
  
 
 
	
  Las	
  lectinas	
  biotinadas	
  (Tabla	
  2)	
  AAL,	
  Con	
  A,	
  ECL,	
  MAA,	
  PNA,	
  PHA,	
  SNA,	
  fueron	
  adquiridas	
  
de	
  Vector	
  Laboratories	
  (Burlingame,	
  CA,	
  U.S.A.).	
  La	
  lectina	
  de	
  ALL	
  fue	
  purificada	
  a	
  partir	
  de	
  
la	
  semilla	
  de	
  Amaranthus	
  leucocarpus	
  obtenida	
  en	
  Tulyehualco,	
  México,	
  y	
  se	
  purificó	
  por	
  
cromatografía	
  de	
  afinidad	
  en	
  estroma	
  de	
  eritrocito	
  humano	
  tipo	
  O	
  según	
  Zenteno	
  et	
  al.,	
  
1988.
Página | 22 
 
	
  
Sacrificio	
  de	
  ratones	
  y	
  obtención	
  de	
  células	
  
 
 
	
  Se	
   utilizó	
   la	
   eutanasia	
   con	
   bióxido	
   de	
   carbono	
   (CO2),	
   induciendo	
   así	
   la	
   muerte	
   por	
  
hipoxia.	
  Se	
  obtuvieron	
  células	
  de	
  ganglios	
  linfáticos	
  y	
  suspendieron	
  en	
  solución	
  salina	
  en	
  
amortiguadores	
   de	
   fosfatos	
   (PBS:	
  NaCl	
   0.15	
  M,	
  Na2PHO4	
  0.05	
  M,	
   pH	
  7.2).	
   La	
   viabilidad	
  
celular	
  se	
  determinó	
  por	
  el	
  método	
  de	
  exclusión	
  de	
  azul	
  tripano.	
  
PCR	
  en	
  punto	
  final	
  para	
  genotipificación	
  de	
  ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
	
  
	
  
	
  Se	
   tomó	
   una	
   pequeña	
   muestra	
   de	
   tejido	
   de	
   los	
   animales	
   experimentales,	
   la	
   cual	
   se	
  
disgregó	
   utilizando	
   amortiguador	
   de	
   lisis	
   con	
   Proteinasa	
   K	
   comprados	
   en	
   Invitrogen	
  
(Carlsbad,	
   CA,	
   USA)	
   durante	
   toda	
   la	
   noche	
   a	
   56°C.	
   Posteriormente	
   se	
   centrifugó	
   y	
   el	
  
sobrenadante	
   fue	
   homogenizado	
   con	
   isopropanol	
   frío	
   para	
   precipitar	
   el	
   DNA.	
  
Nuevamente,	
  se	
  centrífugo	
  y	
  el	
  botón	
  de	
  DNA	
  fue	
  lavado	
  con	
  etanol	
  frío.	
  Una	
  vez	
  disuelto	
  
el	
   DNA	
   se	
   dejó	
   evaporar	
   el	
   etanol	
   a	
   temperatura	
   ambiente	
   y	
   el	
   botón	
   de	
   DNA	
   se	
  
resuspendió	
  con	
  agua	
  grado	
  biología	
  molecular	
  de	
  Sigma	
  (Chemical	
  Co.	
  St	
  Louis,	
  MO,	
  USA)	
  
incubando	
  durante	
  toda	
  la	
  noche	
  a	
  56°C.	
  
	
  
	
  Para	
  la	
  PCR	
  se	
  utilizaron	
  los	
  siguientes	
  reactivos:	
  Buffer	
  10X;	
  DNTPmix;	
  Primers;	
  DNA	
  Taq	
  
polimerasa;	
   muestras	
   de	
   DNA	
   y	
   agua	
   grado	
   biología	
   molecular.	
   Una	
   vez	
   con	
   los	
  
respectivos	
  reactivos,	
   los	
   tubos	
  para	
   la	
  PCR	
  se	
  sometieron	
  a	
  diferentes	
   temperaturas	
  de	
  
reacción:	
  94°C	
  por	
  30	
   segundos,	
   54°C	
  por	
  30	
   segundos	
   y	
  72°C	
  por	
  30	
   segundos,	
   con	
  35	
  
Página | 23 
 
repeticiones	
  en	
  el	
  termociclador.	
  Para	
  la	
  electroforesis	
  se	
  evaluó	
  el	
  amplificado	
  mediante	
  
un	
  gel	
  de	
  agarosa	
  1%.	
  
Ensayo	
  de	
  inhibición	
  de	
  lectinas	
  mediante	
  la	
  unión	
  con	
  sacáridos	
  
 
 
	
  Para	
   analizar	
   la	
   unión	
   de	
   las	
   lectinas	
   a	
   células	
   CD4+	
   y	
   CD8+,	
   se	
   realizó	
   un	
   ensayo	
   de	
  
inhibición	
  competitiva	
  agregando	
  200	
  mM	
  del	
  sacárido	
  correspondiente	
  (Tabla	
  2).	
  Células	
  
de	
  ganglios	
  linfáticos	
  de	
  ratones	
  WT	
  fueron	
  lavadas	
  con	
  PBS	
  conteniendo	
  1%	
  de	
  albumina	
  
sérica	
   bovina	
   y	
   0.1%	
   de	
   azida	
   de	
   sodio	
   (PBA)	
   y	
   posteriormente	
   se	
   incubaron	
   con	
   las	
  
lectinas	
  AAL,	
  Con	
  A,	
  ALL,	
  ECL,	
  MAA,	
  PNA,	
  PHA	
  y	
  SNA	
  por	
  20	
  minutos	
  a	
  4°C	
   junto	
  con	
  el	
  
azúcar	
  especifico	
  de	
  cada	
  lectina	
  a	
  200	
  mM	
  (Fetuina,	
  Fucosa,	
  Manosa,	
  Galactosa	
  y	
  lactosa)	
  
a	
  37°C.	
  
	
  
Tabla	
  2.	
  Lectinas	
  y	
  patrón	
  de	
  reconocimiento	
  
Lectina	
   Abreviatura	
   Especificidad	
   Inhibidor	
  
Aleuria	
  aurantia	
  
Amaranthus	
  leucocarpus	
  
Arachis	
  hypogaea	
  
Concanavalina	
  A	
  
Erythrina	
  cristagalli	
  
Maackia	
  amurensis	
  
Phaseolus	
  vulgaris	
  
Sambucus	
  nigra	
  
AAL	
  
ALL	
  
PNA	
  
Con	
  A	
  
ECL	
  
MAA	
  
PHA	
  
SNA	
  
Fucα6GlcNAc	
  
GalNAc	
  
Galβ1-­‐3GalNAc	
  
αMan,	
  αGlc	
  
Galβ1-­‐4GlcNAc	
  
Neu5Acα2-­‐3Galβ1-­‐4GalNAc	
  
Galβ1-­‐4GlcNAcβ1-­‐6(GlcNAcβ1-­‐2Manα3)Man-­‐α3	
  
Neu5Acα2-­‐6Gal/GalNAc	
  
Fucosa	
  
GalNAc	
  
	
  
Lactosa	
  
	
  
Manosa	
  y/o	
  Glucosa	
  
	
  
Galactosa	
  
	
  
Lactosa	
  
	
  
GalNAc	
  
	
  
Lactosa	
  
	
  
	
  
Página | 24 
 
	
  
Determinación	
  de	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  por	
  
citometría	
  de	
  flujo	
  
 
 
	
  Las	
  células	
  se	
  lavaron	
  con	
  PBA,	
  fueron	
  incubadas	
  con	
  los	
  anticuerpos	
  anti-­‐CD4	
  y	
  anti-­‐CD8	
  
por	
  20	
  minutos	
  a	
  4°C.	
  Posteriormente,	
  fueron	
  lavadas	
  con	
  PBA	
  e	
  incubadas	
  con	
  las	
  lectinas	
  
indicadas	
  por	
  20	
  minutos	
  a	
  4°C.	
  Después	
  de	
  la	
  incubación,	
  las	
  células	
  fueron	
  lavadas	
  con	
  
PBA	
  e	
  incubadas	
  con	
  estreptavidina-­‐Cychromo	
  20	
  minutos	
  a	
  4°C.	
  Al	
  finalizar	
  la	
  incubación	
  
las	
  células	
  fueron	
  lavadas	
  con	
  PBA	
  y	
  fijadas	
  con	
  PBS	
  conteniendo	
  1%	
  de	
  p-­‐formaldehido.	
  
	
  
	
  Las	
  células	
  se	
  lavaron	
  con	
  PBA	
  y	
  se	
  analizaron	
  por	
  citometría	
  de	
  flujo	
  en	
  un	
  FACScalibur	
  
(Becton	
  &	
  Dickinson,	
   Franklin	
   Lakes,	
  NJ).	
   Se	
   adquirieron	
  un	
  mínimo	
  de	
  2x104	
   células	
   en	
  
todos	
   los	
   experimentos;	
   analizando	
   la	
   región	
   correspondiente	
   a	
   los	
   linfocitos	
   T,	
  
considerando	
  tamaño	
  y	
  granularidad	
  celular.	
  Los	
  datos	
  fueron	
  analizados	
  con	
  el	
  software	
  
FlowJo	
  (TreeStar	
  Inc.	
  Ashland	
  Oregon).	
  	
  En	
  los	
  análisis	
  por	
  citometría	
  de	
  flujo,	
  se	
  analizó	
  	
  la	
  
región	
   correspondiente	
   a	
   los	
   linfocitos	
   T	
   CD4+	
   y	
   linfocitos	
   T	
   CD8+	
   y	
   posteriormente	
   la	
  
unión	
   a	
   las	
   lectinas	
   en	
   las	
   diferentes	
   condiciones	
   experimentales.	
   La	
   densidad	
   de	
   las	
  
lectinas	
   unidas	
   a	
   la	
   superficiecelular,	
   se	
   expresó	
   como	
   la	
   media	
   de	
   la	
   intensidad	
   de	
  
fluorescencia	
  relativa	
  (MFI-­‐R),	
  para	
  cada	
  experimento.	
  
	
  
Página | 25 
 
	
  
Cultivo	
  celular	
  para	
  la	
  determinación	
  de	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  células	
  
CD4+	
  y	
  CD8+	
  por	
  citometría	
  de	
  flujo	
  
 
 
	
  Se	
  cultivaron	
  1x106	
  de	
  células	
  en	
  placas	
  de	
  96	
  pozos	
  (Costar,	
  Cambridga,	
  MA,	
  U.S.A.)	
  en	
  
medio	
  de	
  cultivo	
  RPMI	
  Sigma	
  (Chemical	
  Co.	
  St	
  Louis,	
  MO,	
  USA)	
  suplementado	
  con	
  1	
  mM	
  
de	
  piruvato	
  de	
  sodio,	
  2	
  mM	
  de	
  L-­‐glutamina,	
  50	
  µg/mL	
  de	
  gentamicina,	
  0.075%	
  de	
  piruvato	
  
de	
   sodio,	
   0.1	
  mM	
  de	
   aminoácidos	
  Non-­‐essential,	
   5	
  mM	
  de	
  HEPES	
   buffer,	
   50	
  mM	
  de	
   2-­‐
mercaptoetanol	
  y	
  10%	
  de	
  suero	
  fetal	
  bovino;	
  las	
  células	
  fueron	
  estimuladas	
  con	
  anti-­‐CD3	
  
(5	
  µg/mL)	
   y	
   anti-­‐CD28	
   (1	
  µg/mL)	
  o	
   con	
  OVA	
  Sigma	
   (Chemical	
   Co.	
   St	
   Louis,	
  MO,	
  USA)	
   (4	
  
µg/mL).	
  Posteriormente,	
  los	
  cultivos	
  se	
  incubaron	
  a	
  37°C	
  con	
  una	
  concentración	
  de	
  5%	
  de	
  
CO2	
   en	
   una	
   incubadora	
   con	
   humedad	
   constante	
   durante	
   72	
   horas	
   o	
   cinco	
   días	
   (células	
  
estimuladas	
  con	
  OVA).	
  
	
  Posteriormente,	
  las	
  células	
  fueron	
  lavadas	
  con	
  PBA	
  y	
  marcadas	
  con	
  los	
  anticuerpos	
  anti-
CD4	
  y	
  anti-­‐CD8	
  para	
  después	
  ser	
  incubadas	
  con	
  las	
  lectinas	
  mencionadas	
  y	
  analizadas	
  por	
  
citometría	
  de	
  flujo.	
  
Modelo	
  para	
  la	
  inducción	
  de	
  asma	
  murino	
  
 
 
	
  Ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  BALB/c	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  fueron	
  sensibilizados	
  al	
  día	
  0	
  administrando	
  100	
  µg	
  
de	
  OVA	
  de	
  forma	
  intraperitoneal	
  y	
  subcutánea.	
  Para	
  el	
  día	
  7	
  sólo	
  se	
  administró	
  de	
  forma	
  
intraperitoneal.	
  Los	
  días	
  14,	
  15	
  y	
  16,	
  los	
  ratones	
  fueron	
  sedados	
  con	
  sevoflurano	
  y	
  se	
  les	
  
administro	
  vía	
  intranasal	
  10	
  µg	
  de	
  OVA.	
  El	
  nebulizado	
  se	
  realizó	
  en	
  los	
  días	
  17,	
  23,	
  32	
  y	
  39;	
  
los	
   ratones	
   fueron	
   colocados	
   en	
  una	
   cámara	
   de	
   acrílico	
   con	
  OVA	
   (5	
  mg/mL)	
   nebulizada	
  
Página | 26 
 
durante	
  30	
  minutos	
  (Fig.	
  6).	
  24	
  horas	
  posteriores	
  al	
  reto	
  con	
  la	
  OVA	
  nebulizada	
  se	
  realizó	
  
la	
   curva	
   concentración-­‐respuesta	
   a	
   metacolina,	
   para	
   evaluar	
   el	
   índice	
   	
   de	
  
broncoconstricción.	
   Cada	
   ratón	
   fue	
   colocado	
   en	
   una	
   cámara	
   de	
   pletismografía,	
   la	
   cual	
  
registra	
   los	
   cambios	
   en	
   el	
   patrón	
   respiratorio	
   de	
   cada	
   ratón,	
   nebulizando	
   al	
   interior	
   de	
  
cada	
   cámara	
   concentraciones	
   crecientes	
   de	
   metacolina	
   para	
   realizar	
   la	
   curva	
   de	
  
concentración-­‐respuesta.	
  
	
  
	
  
Figura	
   6.	
  Modelo	
   de	
   sensibilización	
   con	
  OVA.	
   Línea	
   del	
   tiempo	
   para	
   volver	
   a	
   los	
   ratones	
  WT	
   y	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
asmáticos.	
  
	
  
Análisis	
  estadístico	
  
 
	
  
	
  A	
   las	
   variables	
   cuantitativas	
   se	
   les	
   realizó	
   una	
   prueba	
   de	
   “t”	
   y	
   se	
   les	
   consideró	
  
estadísticamente	
  significativos	
  cuando	
  contaban	
  con	
  una	
  p	
  ≤	
  0.05.	
  El	
  análisis	
  estadístico	
  se	
  
realizó	
  utilizando	
  el	
  software	
  GraphPad	
  PRISM™	
  5.0a.	
  
	
  
Página | 27 
 
	
  
VII. Resultados	
  
 
Genotipificación	
  de	
  ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  BALB/c	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
 
 
	
  Para	
   validar	
   el	
   modelo	
   experimental	
   con	
   ratones	
   “knockout”	
   se	
   determinó	
   la	
   variante	
  
mutante	
  no	
  codificante	
  para	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  en	
  dichos	
  ratones	
  utilizando	
  una	
  prueba	
  de	
  PCR	
  en	
  
punto	
  final.	
  Los	
  resultados	
  mostraron	
  que	
  los	
  ratones	
  WT	
  presentan	
  una	
  secuencia	
  de	
  275	
  
pb	
  y	
   los	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   una	
  de	
  380	
  pb	
   las	
   cuales	
   representan	
  al	
   gen	
  de	
  STAT-­‐6	
   y	
  mutante	
  no	
  
codificante,	
   respectivamente	
   (Fig.	
   7).	
   Este	
   resultado	
   indica	
   que	
   los	
   ratones	
   “knockout”	
  
utilizados	
  en	
  nuestros	
  experimentos	
  poseen	
  la	
  variante	
  mutante	
  no	
  codificante	
  de	
  STAT-­‐6.	
  
	
  
	
  
Figura	
  7.	
  Genotipificación	
  de	
  ratones	
  BALB/c	
  WT	
  y	
  BALB/c	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  por	
  PCR.	
  Determinación	
  del	
  gen	
  para	
  
STAT-­‐6	
   a	
   partir	
   de	
  DNA	
  obtenido	
   de	
   ratones	
  WT	
   y	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  mediante	
   PCR	
   en	
   punto	
   final.	
   En	
   la	
   figura	
   se	
  
muestra	
  el	
  gel	
  de	
  agarosa	
  con	
  los	
  siguientes	
  carriles:	
  pb,	
  muestra	
  las	
  referencias	
  en	
  pares	
  de	
  bases;	
  en	
  el	
  1	
  y	
  
2,	
  las	
  muestras	
  por	
  duplicado	
  de	
  ratones	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  que	
  arrojan	
  una	
  banda	
  de	
  380	
  pb	
  y	
  en	
  3	
  y	
  4	
  las	
  muestras	
  
de	
  los	
  ratones	
  WT	
  con	
  una	
  banda	
  de	
  275	
  pb.	
  
Página | 28 
 
	
  
Determinación	
  de	
  la	
  especificidad	
  de	
  las	
  lectinas	
  
	
  
	
  
	
  Para	
  determinar	
  si	
  la	
  unión	
  de	
  las	
  lectinas	
  con	
  a	
  las	
  células	
  es	
  dependiente	
  de	
  sacáridos,	
  
se	
   realizaron	
   ensayos	
   de	
   inhibición	
   competitiva	
   de	
   todas	
   las	
   lectinas	
   en	
   uso	
   con	
   su	
  
respectivo	
   ligando	
   (Tabla	
  2).	
  En	
   la	
  Figura	
  8	
   se	
  muestran	
  resultados	
  representativos	
  para	
  
las	
   lectinas	
   AAL,	
   Con	
   A,	
   ECL	
   y	
   PNA,	
  mostrando	
   que	
   los	
  monosacáridos	
   Fuc,	
  Man,	
   Gal	
   y	
  
lactosa,	
  respectivamente,	
  inhiben	
  la	
  unión	
  de	
  las	
  lectinas	
  antes	
  mencionadas.	
  Por	
  lo	
  tanto,	
  
existe	
  una	
  interacción	
  dependiente	
  de	
  sacáridos	
  entre	
  las	
  lectinas	
  y	
  sus	
  ligandos	
  celulares.	
  
	
  
Figura	
  8.	
  Ensayo	
  de	
  inhibición	
  competitiva.	
  Los	
  histogramas	
  representan	
  el	
  reconocimiento	
  por	
  parte	
  de	
  las	
  
lectinas	
   a	
   células	
   de	
   ganglios	
   linfáticos	
   en	
   presencia	
   (histogramas	
   de	
   abajo)	
   o	
   ausencia	
   de	
   sacáridos	
  
(histograma	
  de	
  arriba).	
  
	
  
Página | 29 
 
	
  
Proporción	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
	
  
	
  
	
  Para	
  determinar	
  si	
  	
  la	
  ausencia	
  de	
  STAT-­‐6	
  induce	
  alteraciones	
  en	
  la	
  proporción	
  de	
  células	
  
CD4+	
  y	
  CD8+	
  se	
  evaluó	
   la	
  expresión	
  mediante	
  citometría	
  de	
  flujo	
  de	
   las	
  moléculas	
  CD4	
  y	
  	
  
CD8,	
   en	
   células	
   no	
   estimuladas.	
   Los	
   resultados	
  mostraron	
   que	
   la	
   proporción	
   de	
   células	
  
CD4+	
   y	
   CD8+	
   no	
   presentan	
   diferencias	
   entre	
   los	
   ratones	
   WT	
   y	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   (Fig.	
   9).	
   Estos	
  
resultados	
   indican	
   que	
   STAT-­‐6	
   no	
   está	
   relacionado	
   con	
   la	
   proporción	
   de	
   células	
   CD4+	
   y	
  
CD8+.	
  
	
  
	
  
Figura	
   9.	
   Porcentaje	
   de	
   células	
   CD4+	
   y	
   CD8+	
   en	
   ratones	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  Determinación	
   de	
   la	
   expresión	
   de	
   los	
  
marcadores	
  de	
  superficieCD4	
  y	
  CD8	
  a	
  partir	
  de	
  células	
  no	
  estimuladas	
  obtenidas	
  de	
  ganglios	
   linfáticos	
  de	
  
ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  Gráficas	
  de	
  puntos	
  representativas	
  al	
  porcentaje	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+.	
  n	
  =	
  3	
  o	
  4	
  
experimentos	
  independientes	
  de	
  al	
  menos	
  1	
  ratón	
  cada	
  uno.	
  
	
  
Página | 30 
 
	
  
Porcentaje	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  	
  en	
  reposo	
  reconocidos	
  por	
  lectinas	
  
	
  
	
  
	
  El	
  control	
  de	
  la	
  expresión	
  de	
  diversos	
  azúcares	
  de	
  membrana	
  puede	
  estar	
  controlado	
  por	
  
diversos	
  factores	
  de	
  transcripción	
  como	
  T-­‐bet	
  y	
  GATA-­‐3	
  [Chen	
  et	
  al.,	
  2006;	
  Underhill	
  et	
  al.,	
  
2005].	
   Por	
   tal	
   motivo,	
   para	
   conocer	
   si	
   la	
   ausencia	
   de	
   STAT-­‐6	
   induce	
   cambios	
   en	
   los	
  
patrones	
  de	
  reconocimiento	
  de	
  lectinas	
  en	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  en	
  reposo,	
  se	
  determinó	
  el	
  
porcentaje	
   de	
   estas	
   células	
   reconocidas	
   por	
   cada	
   una	
   de	
   las	
   lectinas	
   en	
   estudio	
   (ver	
  
materiales	
  y	
  método).	
  Para	
  lograr	
  lo	
  anterior	
  se	
  marcaron	
  las	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  con	
  cada	
  
una	
  de	
  las	
  lectinas,	
  para	
  posteriormente	
  analizarse	
  por	
  citometría	
  de	
  flujo.	
  Los	
  resultados	
  
obtenidos	
  muestran	
   que	
   sólo	
   la	
   lectina	
   PHA	
   reconoció	
   un	
   porcentaje	
   de	
   células	
   CD4+	
   y	
  	
  
CD8+	
   mayor,	
   45%	
   y	
   69.8%	
   respectivamente,	
   y	
   estadísticamente	
   significativo	
   (p	
   ≤	
   0.05)	
  
(Tabla	
  3,	
  Fig.	
  10)	
  en	
  las	
  células	
  provenientes	
  de	
  ratones	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  Sugiriendo	
  que,	
  dentro	
  
de	
  las	
  lectinas	
  utilizadas,	
  sólo	
  PHA	
  reconoce	
  un	
  tipo	
  de	
  N-­‐glicano	
  complejo	
  (lactosaminico)	
  
el	
  cual	
  está	
  siendo	
  sobre-­‐expresado	
  en	
  un	
  mayor	
  número	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
en	
  reposo.	
  
	
  
Figura	
  10.	
  Proporción	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  no	
  estimulados	
  reconocidos	
  por	
  lectinas.	
  (A)	
  células	
  CD4+.	
  (B)	
  
células	
  CD8+.	
  n=	
  3	
  o	
  4	
  experimentos	
  independientes	
  de	
  al	
  menos	
  1	
  ratón	
  cada	
  uno,	
  *p	
  ≤	
  0.05.	
  
	
  
Página | 31 
 
	
  
Tabla	
  3.	
  Porcentaje	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  reconocidos	
  por	
  lectinas.	
  
	
   Células	
  CD4+	
  
	
   WT	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
Con	
  A	
   92.2%	
  (±3.4)	
   84.2%	
  (±20.8)	
  
PNA	
   22.7%	
  (±8.1)	
   22.1%	
  (±16.8)	
  
MAA	
   96.9%	
  (±3.2)	
   96.3%	
  (±6.1)	
  
SNA	
   72.5%	
  (±26)	
   82.5%	
  (±17.9)	
  
ECL	
   9.3%	
  (±3.4)	
   11.5%	
  (±3.3)	
  
AAL	
   99.8%	
  (±0.1)	
   99.3%	
  (±0.7)	
  
PHA	
   13.8%	
  (±4.1)	
   45%	
  (±15.6)*	
  
	
   	
  
	
   Células	
  CD8+	
  
	
   WT	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
Con	
  A	
   96.7%	
  (±2.7)	
   96.9%	
  (±3)	
  
PNA	
   21.2%	
  (±11.6)	
   22.3%	
  (±12)	
  
MAA	
   97.8%	
  (±2.9)	
   98.4%	
  (±2.1)	
  
SNA	
   91.2%	
  (±10.1)	
   92.8%	
  (±3.8)	
  
ECL	
   6%	
  (±1.7)	
   9.5%	
  (±2.1)	
  
AAL	
   99.5%	
  (±0.4)	
   99.5%	
  (±0.5)	
  
PHA	
   25.6%	
  (±6.3)	
   69.8%	
  (±9.9)*	
  
n=	
  3	
  o	
  4	
  experimentos	
  independientes	
  de	
  al	
  menos	
  1	
  ratón	
  cada	
  uno,	
  *p	
  ≤	
  0.05.	
  
	
  
Cambios	
   en	
   los	
   patrones	
   de	
   glicosilación	
   de	
   membrana	
   inducidos	
   por	
   la	
  
activación	
  de	
  células	
  CD4+	
  y	
  CD8+	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
 
 
	
  Para	
  determinar	
  si	
  la	
  ausencia	
  de	
  STAT-­‐6	
  durante	
  el	
  proceso	
  de	
  activación	
  celular	
  es	
  capaz	
  
de	
   inducir	
   cambios	
   en	
   la	
   glicosilación	
   de	
   membrana	
   de	
   las	
   células	
   CD4+	
   y	
   CD8+,	
   se	
  
realizaron	
   estimulaciones,	
   in	
   vitro,	
   mediante	
   anti-­‐CD3	
   y	
   anti-­‐CD28,	
   utilizando	
   células	
  
obtenidas	
  de	
  ganglios	
  linfáticos	
  provenientes	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  72	
  horas	
  después	
  
de	
  iniciado	
  el	
  cultivo	
  las	
  células	
  se	
  marcaron	
  con	
  los	
  anticuerpos	
  y	
  lectinas	
  mencionados,	
  
determinándose	
   posteriormente	
   la	
   intensidad	
   media	
   de	
   fluorescencia	
   (MFI)	
   con	
   el	
  
objetivo	
  de	
  conocer	
   la	
  disponibilidad	
  de	
   ligandos	
  de	
  cada	
   lectina	
  en	
   los	
  grupos	
  celulares	
  
Página | 32 
 
de	
  estudio.	
  Los	
   resultados	
  mostraron	
  un	
  aumento	
  en	
  el	
  número	
  de	
   ligandos	
  expresados	
  
en	
   células	
  CD4+	
   y	
  CD8+	
  activados	
  WT	
   (Fig.	
   11A-­‐B)	
   y	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   (Fig.	
   11C-­‐D)	
   para	
   todas	
   las	
  
lectinas,	
  a	
  excepción	
  de	
  SNA	
  en	
  las	
  células	
  CD8+	
  activadas	
  con	
  respecto	
  a	
  los	
  no	
  activadas	
  
de	
  ratones	
  WT	
  (Fig.	
  11B).	
  
	
  
Figura	
  11.	
  Cambios	
   inducidos	
  por	
   la	
  activación	
  en	
   los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  de	
  células	
  
CD4+	
  y	
  CD8+	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  Determinación	
  del	
  patrón	
  de	
  glicosilación	
  que	
  siguen	
  las	
  células	
  CD4+	
  
y	
   CD8+	
   a	
   partir	
   de	
   un	
   estímulo	
   de	
   activación	
   con	
   los	
   anticuerpos	
   anti-­‐CD3	
   y	
   anti-­‐CD28	
   en	
   células	
  
provenientes	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  (A)	
  Células	
  CD4+	
  de	
  ratones	
  WT;	
  (B)	
  células	
  CD8+	
  de	
  ratones	
  WT;	
  (C)	
  
células	
   CD4+	
   de	
   ratones	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   y	
   	
   (D)	
   células	
   CD8+	
   de	
   ratones	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
   n=	
   3	
   o	
   4	
   experimentos	
  
independientes	
  de	
  al	
  menos	
  1	
  ratón	
  cada	
  uno,	
  *p	
  ≤	
  0.05.	
  
	
  
Página | 33 
 
	
  
Tabla	
  4.	
  Cambios	
  en	
  los	
  patrones	
  de	
  glicosilación	
  de	
  membrana	
  inducidos	
  por	
  la	
  activación	
  de	
  células	
  CD4+	
  
y	
  CD8+	
  en	
  reposo	
  contra	
  activados	
  de	
  ratones	
  WT	
  y	
  STAT-­‐6-­‐/-­‐.	
  
	
   Células	
  CD4+	
   Células	
  CD8+	
  
	
   WT	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
   WT	
   STAT-­‐6-­‐/-­‐	
  
	
   Sin	
  
estímulo	
  
Con	
  
estimulo	
  
Sin	
  
estímulo	
  
Con	
  
estimulo	
  
No	
  es.	
  Sin	
  
estímulo	
  
Con	
  
estimulo	
  
Sin	
  
estímulo	
  
Con	
  
estimulo	
  
Con	
  A	
   1820.5	
  
(±411.84)	
  
2641.66	
  
(±713.71)	
  
1940.5	
  
(±406.73)	
  
4247	
  
(±664.76)	
  
2007.66	
  
(±110.11)	
  
3652.33	
  
(±1075.5)	
  
2414	
  
(±438.4)	
  
6832	
  
(±1002.15)	
  
PNA	
   731.75	
  
(±427.09)	
  
1265.66	
  
(±220.51)	
  
904	
  
(±244.41)	
  
2539.5	
  
(±594.2)	
  
529.66	
  
(±211.21)	
  
1936.33	
  
(±298.35)	
  
1011.5	
  
(±280.81)	
  
4345.5	
  
(±349.15)	
  
ALL	
   500.75	
  
(±275.83)	
  
2082.33	
  
(±950.26)	
  
690.25	
  
(±293.99)	
  
1544.75	
  
(±430.8)	
  
458.33	
  
(±326.31)	
  
1349.66	
  
(±634.22)	
  
824	
  
(±279.27)	
  
2183	
  
(±604.68)	
  
MAA	
   2135.25	
  
(±255.9)	
  
3875.66	
  
(±260.40)	
  
2556	
  
(±349.13)	
  
5302.25	
  
(±898.28)	
  
2298.33	
  
(±304.64)	
  
3179.66	
  
(±541.04)	
  
2855.75	
  
(±419.43)	
  
4816.25	
  
(±697.13)	
  
SNA	
   1239.25	
  
(±453.89)	
  
2593	
  
(±479.18)	
  
1829.5	
  
(±525.61)	
  
4111.75	
  
(±417.62)	
  
1368.66	
  
(±484.5)	
  
2327	
  
(±969.11)*	
  
2010.5	
  
(±488.73)	
  
4269	
  
(±456.34)	
  
ECL	
   522.3	
  
(±336.12)	
  
1524.25	
  
(±1049.33)	
  
742	
  
(±273.02)	
  
2389.75	
  
(±278.63)	
  
403.33	
  
(±315.08)	
  
1690.66	
  
(±518.44)