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FFAACCUULLTTAADD DDEE OODDOONNTTOOLLOOGGÍÍAA MANUAL BÁSICO DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA DIAGNÓSTICO DE LESIONES DE CABEZA Y CUELLO. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE C I R U J A N A D E N T I S TA P R E S E N T A: ROCIO PEÑA GALICIA TUTOR: Dr. JAVIER PORTILLA ROBERTSON ASESORA: Dra. ELBA ROSA LEYVA HUERTA PAPIME PE209016 Ciudad Universitaria, Cd. Mx. 2017 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 AGRADECIMIENTOS A Dios: Por ser mi guía y llenar mi vida de bendiciones así como permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida toda la gloria y honra. A mis padres: Armando y Alicia por todo su cariño y apoyarme siempre para conseguir ,mis sueños han estado conmigo y son un ejemplo para mí , a pesar de algunas dificultades recibí siempre su apoyo sus oraciones y amor me han enseñado que a pesar de problemas siempre se puede seguir adelante teniendo fe , los quiero mucho. A mis hermanos: Mónica que con tu cariño y consejos siempre me has ayudado y enseñado que siempre se puede lograr los sueños con perseverancia y dedicación Luis por tu cariño y apoyo en mi vida siempre A mis abuelitos que físicamente ya no están pero recuerdo su gran amor y ejemplo. A mi Tía Lupita: Por todo tu cariño, apoyo y por creer siempre en mi gracias hasta el cielo. A mis sobrinos: Alexandra y Max, a mi Hermana América. A la UNAM: Por permitirme tener mi formación académica. Al Dr. Javier Portilla Robertson: Por brindarme su apoyo y ser mi tutor desde que estuve en el servicio social de la clínica de Medicina y Patología Bucal, y permitirme realizar la tesis en el laboratorio de Patología Bucal en posgrado, por siempre creer en mí y enseñarme lo hermoso que es la Patología Bucal así como la importancia de un diagnóstico oportuno con pacientes y culminar mis estudios de licenciatura en la especialidad de Patología Bucal, lo aprecio mucho Dr. A la Dra. Elba Rosa Leyva Huerta, por asesorarme en la elaboración de este trabajo y apoyo. Al Dr. Luis Fernando Jacinto Alemán: Por su apoyo en el laboratorio con la técnica de inmunohistoquimica. A la Dra. Bere: por siempre confiar en mí y por su apoyo ayudándome con sus consejos y brindarme su amistad. A la Dra.: Paty Alquicira Vargas por su apoyo incondicional y ayudarme siempre enseñándome no solo académicamente si no un lado muy humano de la carrera de odontología. 3 A la Dra. Gaby Fuentes: por apoyarme y darme ánimos para creer en mí y poder lograr lo que me proponga y seguir siempre mis sueños, y por brindarme su conocimiento. A la Dra. Olimpia Vigueras Gómez. Por su apoyo y darme ánimo para lograr mis sueños. A la Dra. Adriana Molotla Fragoso: Por su apoyo desde que hice servicio Social en la Clínica de Patología Bucal y compartirme su conocimiento. A la Dra. Carlita Ramirez Martinez: Por su apoyo y explicarme inmunología y brindarme siempre tú amistad. A la Dra. Rosa Merino Ramos: por su apoyo y brindarme su conocimiento en la clínica periférica Venustiano Carranza y a la Dra. Sarita Al Dr. Gustavo Argüello Regalado por brindarme su conocimiento y enseñanzas pero sobre todo, a perseguir mis sueños con dedicación y trabajo. A mis Amigos: Rosario Almazán Pérez, Sophie Ordaz Kücks, Sara Martínez Olivares, Karina Juárez, Hugo Daniel Castillo Hidalgo y Blanca gracias por todo su cariño y apoyo estuvimos juntos en tantos momentos en la carrera tengo los mejores recuerdos y por brindarme siempre su amistad, y creer siempre que yo lograría esta meta. Los quiero mucho son grandes personas. Edgardo Caballero Dávila: Gracias por tu linda amistad, eres una gran persona y por el ánimo que siempre me diste y creer en mi para este trabajo, vivimos varios momentos tan agradables en Patología Bucal estoy muy agradecida te quiero mucho. Ivonne Salvador: Gracias por todo tu apoyo y ánimo que me diste amiga, vivimos momentos difíciles pero también muy lindos. Te quiero amiga eres una gran persona Hugo Alcocer Camarero: Gracias por esta hermosa amistad tu apoyo incondicional hemos vivido varios momentos tan especiales y siempre me diste ánimo para seguir, te quiero mucho eres una gran persona. Lulú: gracias por tu amistad y apoyo en la Periférica Javier Cedillo Olamendi: por tu apoyo y brindarme tu amistad vivimos grandes momentos en la clínica de Medicina Bucal pero siempre con alegría, te quiero mucho. Josué: Gracias por tu amistad y apoyo siempre A mis pacientes por su tiempo y apoyo Él les dijo:” Lo que es imposible para los hombres, es posible para Dios” Lucas 18.27 4 Índice. Introducción………………………………………………………………........5 Capítulo 1. Fundamentos de la Inmunohistoquímica…………………..7 1.1 Antecedentes históricos de la Inmunohistoquímica…………………....7 1.2 Bases inmunológicas……………………………………………………...8 1.3 Inmunidad Natural y Adquirida…………………………………………...9 1.4 Antígeno………………………………………………………………........9 1.5 Anticuerpo…………………………………………………………………10 1.6 Complejo antígeno-anticuerpo…………………………………………..11 Capítulo 2. Técnica de Inmunohistoquímica…………………………...13 2.1 Utilidad de la inmunohistoquímica……………………………………...14 2.2 Consideraciones del uso de la inmunohistoquímica………………....15 2.3 Obtención de la muestra de tejidos blandos…………………………..15 2.4 Inmunohistoquímica en tejidos fijados y embebidos en parafina…...17 2.5 Análisis inmunohistoquímico asistido con Softwares…………………21 Capítulo 3. Marcadores biológicos……………………………………….22 Capítulo 4. Marcadores de diferenciación epitelial……………………25 Capítulo 5. Marcadores de diferenciación mesenquimatosa………..33 Capítulo 6. Marcadores neuroectodérmicos……………………………45 Capítulo 7. Marcadores de linaje hematopoyético o linfoide………..50 Capítulo 8. Marcadores tumorales……………………………………..…60 Conclusiones…………………………………………………………………67 Referencias……………………………………………………………………69 5 Introducción El objetivo del presente manual es sintetizar la información útil y actualizada sobre los métodos de inmunotinción de mayor utilidad en Odontología. No pretende ser una referencia pero sí que sea de utilidad como guía para los odontólogos y especialistas, particularmente los cirujanos maxilofaciales, a modo de poder facilitar la interpretación de esta técnica cuando se solicitan estudios de histopatología y estos son auxiliados de la inmunohistoquímica. Constituye en la actualidad una herramienta diagnostica fundamental que permite demostrar antígenos presentes en células o en los tejidos utilizando anticuerpos marcados, estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos para unirse a los correspondientes antígenos, la reacción solo se hace visible si el anticuerpo está marcado con una sustancia la cual absorbe luz o emite luz y produce coloración. El contenido de este manual se ha organizado de una manera sencilla y clara. Tradicionalmente los especialistas en Patología Bucal se han basado en la morfología de los tejidos teñidos con Hematoxilina y Eosina para identificar el tipo de lesión, su naturalezay los componentes celulares que la conforman; frecuentemente el patólogo se apoya en la histoquímica utilizando tinciones especiales como: Ácido Periódico de Shiff, Tricrómica de Masson, Rojo Congo, Azul Alciano, por citar algunos ejemplos. Así mismo se describen las bases de la inmunología como un recordatorio con el propósito de facilitar la comprensión de los fundamentos biológicos de la inmunohistoquímica y su interrelación con la morfología y la biología molecular. Los procesos neoplásicos frecuentemente, requieren para su diagnóstico esta técnica para confirmar su estirpe, ya que ésta perdura en las proteínas que se expresan y visualizan inequívocamente con la inmunohistoquímica. 6 Importancia de la Inmnunohistoquimica Como técnica de laboratorio la Inmunohistoquimica es de vital importancia para el marcaje selectivo de proteínas y otros elementos que pueden estar presentes, tanto en las membranas celulares, citoplasma, y demás compartimientos citoplásmicos, así como también en la matriz extracelular. Es de gran utilidad en la identificación de las estirpes celulares de los tejidos básicos, de receptores de membranas, proteínas citosólicas, y de cualquier otra estructura para la cual se halla desarrollado un anticuerpo específico. Su aplicación es de indiscutible valor en anatomía patológica en el diagnóstico de lesiones tumorales y su pronóstico y en la investigación en general, sobre todo en la definición del inmunofenotipo de las células de los tejidos. Es un proceso de numerosos pasos que requiere de un entrenamiento especializado sobre todo en el procesamiento de los tejidos, la selección de todos y cada uno de los reactivos necesarios apropiados, y lo más importante: la interpretación de los inmunomarcajes en las preparaciones histológicas. Se fundamenta en la reacción Antígeno - Anticuerpo. El anticuerpo es el reactivo fundamental y la disponibilidad de antisueros, fracciones de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales que permiten marcar antígenos celulares y tisulares es cada vez mayor. Los anticuerpos pertenecen a un grupo de proteínas denominadas Inmunoglobulinas, presentes en cinco clases y sintetizadas por células conocidas como plasmocitos, que no son más que un último grado de diferenciación de los linfocitos B. 7 Capítulo 1. Fundamentos de la Inmunohistoquímica. La inmunohistoquímica es una herramienta muy útil que permite la identificación in situ de proteínas específicas para los componentes celulares respetando su sustrato morfológico. 1.1. Antecedentes históricos de la Inmunohistoquímica. Coons en 1941 describió una forma para detectar antígenos celulares en cortes de tejido basándose en los conocimientos que existían en ese momento sobre Biología Celular y que actualmente conocemos como Inmunofluorescencia; 25 años después Nakane, Pierce y Avrameus mejoraron la técnica utilizando con éxito la peroxidasa. El método que utilizaron fue descrito poco antes por Graham y Karnovsky y consiste en hacer reaccionar la peroxidasa con su sustrato específico (peróxido de hidrógeno) en presencia de un cromógeno.1 La técnica se fue modificando hasta hacerla práctica, útil, de fácil realización y con aplicación clínica. La Inmunohistoquímica es una técnica que se basa en la utilización de un anticuerpo (Ac) específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un estrato invisible en visible al microscopio, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno (Ag) en una muestra de tejido fresco o fijado e incluido en parafina, por lo que se puede realizar en tejidos de biopsia, autopsia y material citológico. Se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, que para hacer evidente esta reacción se utilizan métodos como la reacción estrato-enzima que convierte el cromógeno sin color en un compuesto teñido. El anticuerpo es el reactivo fundamental que consiste en fracciones de inmunoglobulinas, existen dos tipos de clonas: Los Anticuerpos monoclonales y los Anticuerpos policlonales. Como su nombre lo indica, los monoclonales derivan de un clon de células plasmáticas mientras que los policlonales son producidos por células plasmáticas diferentes, y en consecuencia 8 pueden reaccionar con varios fragmentos del antígeno para el que fueron creados4,5 El animal más utilizado para la producción de anticuerpos policlonales es el conejo y para los monoclonales el ratón. 1.2. Bases inmunológicas. El sistema inmune se puede definir como un conjunto de órganos, tejidos, células y moléculas que actúan coordinadamente para llevar a cabo una respuesta de defensa y protección en el organismo, está constituido por unas variedades de células morfológicas y funcionalmente diferentes y distribuidas estratégicamente. Las células que forman el sistema inmune se encuentran ubicadas en los órganos linfoides primarios y secundarios. Los órganos linfoides primarios: Medula ósea y el timo son el sitio de la linfopoyesis, es decir el lugar donde se originan los linfocitos y los órganos linfoides secundarios corresponden a los ganglios linfáticos y el bazo el sistema inmunitario cutáneo y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT). Estos son los sitios donde ocurre la respuesta inmunitaria provocada por las interacciones celulares en un ambiente propicio. Desde el punto de vista anatómico, los órganos linfoides son de dos tipos; los que tienen una cápsula bien definida como el bazo, timo y ganglios linfáticos, y el formado por acumulaciones difusas de tejido linfoide como el asociado a las mucosas. 9 1.3. Inmunidad Natural y Adquirida. Es parte de los seres vivos; es sistema de defensa de los vertebrados, consiste en un conjunto de mecanismos que nos defienden de los agentes patógenos. En este tipo de inmunidad participan las barreras físicas como las mucosas, piel, moco, secreciones y fluidos corporales, así como células fagocíticas y las células matadoras naturales conocidas como células NK (en inglés Natural Killer) y un grupo de moléculas solubles como son las citocinas o interleucinas (IL), el interferón (INF) y el factor de necrosis tumoral (TNF), entre muchos otros; esta respuesta no discrimina entre las diferentes sustancias extrañas y no crea memoria inmunológica. Una característica de la inmunidad natural es su capacidad de defensa frente a infecciones, pero teniendo un potencial limitado, por lo que esta no especifica es reemplazada por la inmunidad adquirida o específica. La inmunidad adquirida o específica: es un mecanismo de defensa de los vertebrados, alcanzando su desarrollo más complejo en mamíferos; las principales características de este tipo de respuesta es su especificidad, memoria, carácter clonal, diversidad, capacidad para discriminar lo propio y lo ajeno y la capacidad de autolimitarse. En esta respuesta participan numerosas células y moléculas que actúan en cooperación, los más importantes son los linfocitos, anticuerpos y las citocinas. 1.4. Antígeno. Es toda molécula capaz de generar una respuesta inmune; todos los antígenos son reconocidos por los linfocitos o anticuerpos específicos, pero solo algunos tienen la capacidad de activar a los linfocitos, las moléculas que estimulan las respuestas inmunitarias se conocen como inmunógeno y son de alto peso molecular. (10,000 kD). 10 La mayoría de los antígenos, son proteínas solas o combinadas con azucares (glucoproteínas) estas moléculas son estructuralmente complejas. Los azucares, suelen ser Ag débiles, pero existen excepciones como el caso de los Ag capsulares bacterianos, los Ag somáticos (Ag, O) y algunas moléculas que integran ciertos grupos sanguíneoscomo el sistema ABO. Los lípidos y ácidos nucléicos tienen escasa o nula capacidad antigénica. En general, cuanto mayor sea el peso molecular de una molécula, mayor será su capacidad antigénica. Así sus características son: Alto peso molecular = antigenicidad Complejidad estructura= Secuencia de a.a. Antígenos de superficie CMH Los haptenos son moléculas que por su bajo peso molecular carecen de actividad antigénica, estos pueden unirse covalentemente a una proteína acarreadora de mayor peso y formar un inmunógeno y pueden inducir la formación de Ac o linfocitos sensibilizados en contra de ellos. 1.5. Anticuerpos. Los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig) son proteínas circulantes que se producen en respuesta a la exposición a estructuras extrañas conocidas como antígenos, son los responsables de la inmunidad humoral. Existen dos tipos de Ac; los que están unidos a la membrana en la superficie de los linfocitos B y que actúan como receptores para el antígeno y los anticuerpos secretados que al ponerse en contacto directa o indirectamente con un agente extraño el linfocito B, se diferencía a células plasmáticas y sintetiza los anticuerpos que cumplen funciones dirigidas a eliminar agentes patógenos , el reconocimiento del antígeno por los anticuerpos que están unidos a la membrana de los linfocitos B vírgenes , activa a estos linfocitos e inicia la respuesta humoral. 11 Los linfocitos B, son las únicas células que sintetizan moléculas de anticuerpo, los linfocitos expresan el Ac en la superficie celular actuando como receptor del Ag en el plasma, secreciones mucosas y liquido intersticial de los tejidos. Todas las moléculas del Ac comparten las mismas características estructurales básicas pero presentan una variabilidad en la regiones que se unen a los antígenos; esta variabilidad es responsable de la capacidad de diferentes anticuerpos de unirse a un número de antígenos con estructura diversa, las funciones efectoras y las propiedades físico-químicas comunes de los anticuerpos se asocian a los fragmentos que no se unen al antígeno. La diversidad de las regiones variables de los Ac en los sitios de unión para el antígeno es responsable del amplio repertorio que tienen de unirse específicamente a una cantidad de Ag, esta diversidad es producida por un mecanismo exclusivo de los genes de las inmunoglobulinas y receptores del linfocito T.(Fig.1.) Figura 1 1.6. Complejo Ag-Ac. Es la unión específica entre el anticuerpo y el antígeno con el objetivo de inhibir o neutralizar el daño del agente patógeno. La reacción se caracteriza por ser específica, rápida espontánea y reversible; esta unión se lleva a cabo en dos sitios específicos del antígeno y del anticuerpo, en el antígeno se conoce como epitopes y en el anticuerpo parátope o determinante antigénico (Fig.2) 12 Epitopes: Son regiones inmunológicamente activas y corresponden a cada uno de los sitios de una macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un receptor de los linfocitos T. Parátope: es el sitio específico de unión del Anticuerpo al Antígeno y está constituido por 15 o 20 aminoácidos, corresponde a la Región Variable del Anticuerpo o del Receptor del Linfocito T; formado por seis regiones variables de complementariedad (CDR) de la región variable de las cadenas, que son: las cadenas ligeras y pesadas de los Acs o las cadenas alfa/Beta y Gamma/Delta para el receptor antigénico de la Célula T. Así el parátope es la parte del Ac que reconoce a una estructura antigénica. Figura 2. IMG. Modificado del Departamento de Enfermedades Infecciosas ; Azienda Ospedaliera - Fuente Spedali Civili Brescia Anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo es una molécula específica para otra molécula conocida como antígeno. Un anticuerpo se llama monoclonal cuando se produce de forma industrial por una sola línea de células por lo general por un clon de linfocitos B, así que desciende de una sola y única célula madre. Es posible producir http://www.infettivibrescia.it/sito2005/ http://www.infettivibrescia.it/sito2005/ 13 anticuerpos monoclonales que se unan específicamente con cualquier sustancia y es de gran utilidad en Bioquímica, Biología Molecular y Medicina. Debido a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son excelentes para detectar antígenos en un tejido y frecuentemente dan significativamente menos tinción de fondo que los anticuerpos policlonales; su homogeneidad es muy alta y si las condiciones experimentales se mantienen constantes, los resultados provenientes de anticuerpos monoclonales son altamente reproducibles entre experimentos; su especificidad los hacen muy útiles para la unión al antígeno dentro de una mezcla de moléculas relacionadas. Anticuerpo policlonal: Son derivados de diferentes líneas de células B, son una mezcla de inmunoglobulinas secretadas, reconociendo diferentes epítopes. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopes haciéndolos más tolerantes a pequeños cambios en la naturaleza del antígeno, frecuentemente son la opción preferida para la detección de proteínas desnaturalizadas y pueden ser generados por una variedad de especies, incluyendo conejos y ovejas. Capítulo 2. Técnica de inmunohistoquímica. La Inmunohistoquímica es cada vez más utilizada en los departamentos de anatomía patológica y en los laboratorios de patología bucal como auxiliar en el diagnóstico histopatológico de alteraciones, lesiones y enfermedades, fundamentalmente en el diagnóstico de neoplasias. Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permiten localizar las reacciones de manera específica, la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y ser evaluada con microscopio de campo claro. Existen diversos tipos de técnicas cuyas indicaciones dependerán si el anticuerpo a utilizar es monoclonal o policlonal o el tipo de material disponible, tomando en consideración si el tejido es en fresco, congelado o fijado en formalina, así como los antígenos a estudiar si es que son 14 de superficie, membranales, transmembranales, intracitoplasmáticos o nucleares. El principio básico de cualquier técnica inmunoquímica es el de que un anticuerpo específico se unirá con un antígeno específico para dar un complejo anticuerpo- antígeno exclusivo. 2.1. Utilidad de la inmunohistoquímica. Esta técnica nos ofrece la posibilidad de localizar componentes tisulares, siendo especialmente útil en el campo de la oncología para la clasificación de neoplasias con alto grado de anaplasia, metástasis y para determinar un tumor primario. También es de suma utilidad en patología bucal para diagnosticar lesiones , conocer la estirpe de algunas neoplasias; para identificar diferenciación celular y como marcador pronóstico de neoplasias; por ejemplo, es posible identificar productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; identificar marcadores de diferenciación como, AE1 para carcinomas, Vimentina para sarcoma CD45 para leucocitos en linfomas y HMB-45 para melanocitos en los casos de melanoma. En resumen se utiliza para: Diagnóstico y clasificación de tumores indiferenciados. Como marcadores predictivos y pronósticos del desarrollo de tumores Identificación de agentes infecciosos como virus, bacterias, hongos y parásitos. En la clasificación de Leucemias y Linfomas En la determinación del origen de tumores metastásicos con origen desconocido. 15 2.2. Consideraciones del uso de la Inmunohistoquímica Un elemento importante a considerar es la óptima preservación del tejido y por ende de los antígenos. La mayoríade los antígenos se conservan adecuadamente después de la fijación en formalina e inclusión en parafina. Uno de los problemas actuales con estas técnicas no es la técnica ya sea, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretación de los resultados. Los errores de interpretación disminuyen a nivel aceptable cuando el patólogo tiene experiencia en estas técnicas y los resultados se relacionan con los demás hallazgos clínico-patológicos. La inmunohistoquímica, requiere de controles de calidad, respetando las indicaciones de uso, las técnicas, la lectura e interpretación de los resultados. Estas técnicas requieren de controles positivos y negativos conocidos como controles internos. El control negativo se obtiene realizando la misma técnica, pero con omisión del paso de incubación con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tinción de un gran número de casos simultáneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarización de las variables. 2.3. Obtención de la muestra de tejidos blandos. Fijación: Todo tejido vivo una vez que es extirpado tiene que ser conservado para evitar su lisis, este proceso se llama fijación. Para las técnicas de inmunohistoquímica el fijador más empleado es el formaldehido (formol al 10%), el tejido debe permanecer en el fijador 24 horas. Las muestras grandes deben seccionarse para permitir que el fijador llegue al centro del tejido, cuidando que sean 10 partes de fijador por una de tejido. 16 Cuando el tejido permanece menos de 24 horas en formol, se produce una fijación híbrida debido a que en la periferia la fijación será con el formol y en las partes profundas los alcoholes que se emplean durante el procesamiento lo fijaran; provocando que los tejidos profundos sean más sensibles a los métodos de recuperación antigénica, dando como resultado falsos positivos. Inclusión en parafina. Una vez que el tejido ha sido fijado en el formol y para que pueda ser incluido en parafina es necesario eliminar el agua que contienen los tejidos normalmente; para lo cual se deshidratan los tejidos por medio de alcoholes de diferentes grados de concentración y de manera ascendente empezando con alcohol de 60° hasta alcohol absoluto (Etílico), el siguiente paso es aclaración que consiste en embeber en xilol los tejidos, para eliminar los lípidos y el resto de agua y permitir que los espacios libres puedan ser embebidos en parafina caliente y líquida; así esta ocupara los espacios antes ocupados por agua y lípidos. La inclusión en parafina se lleva a cabo con el objetivo de tener un medio propicio para realizar los cortes histológicos sin deterioro de las estructuras; para lograrlo la muestra con la parafina embebida se coloca en una caja vertiéndole parafina caliente y dejándolo enfriar para que solidifique. Los cortes histológicos se realizan en un micrótomo y miden entre 4 a 7 micras. Tratamiento y preparación de portaobjetos. El procedimiento de inmunohistoquímica es un proceso largo, por lo cual si se emplea un portaobjetos común el corte de tejido se desprenderá fácilmente entorpeciendo todo el proceso; la solución para evitar el desprendimiento es tratar las laminillas con Poli-L-Lisina a una dilución 1:10, con silano al 2% o bien adquirir portaobjetos electrocargados que se venden comercialmente. Estas laminillas preparadas serán utilizadas en el momento de realizar los cortes histológicos permitiendo una mejor adhesión del tejido al portaobjetos. 17 2.4. Inmunohistoquímica en tejidos fijados y embebidos en parafina. Desparafinado y rehidratado: Una vez depositado el tejido sobre el portaobjeto, se desparafina en xilol o en compuestos equiparables; posteriormente se pasan las laminillas por alcoholes en concentraciones decrecientes (alcohol etílico), con la finalidad el permitir que los compuestos hidrofílicos puedan interaccionar con el tejido. Recuperación de antígenos: En el procesamiento de las muestras para microscopía fotónica el formol es utilizado como fijador. El formaldehído al 10%, produce enlaces cruzados en los tejidos (“cross-links”) que se establecen entre las cadenas polipeptídicas. Estos enlaces cruzados enmascaran los epitopes, lo que provocaría su unión con los paratopes. Una de las formas de desenmascarar los antígenos es realizar técnicas de recuperación antigénica. El método de recuperación antigénica se realiza fundamentalmente mediante incubación con calor, (cerca de 100 ºC) en buffers de citrato o EDTA, o por medio de enzimas proteolíticas, cuyas diferencias presentamos a continuación. Incubación con calor: se recomienda emplear buffers de citratos al 0.01M pH6 o Tris/EDTA pH9 y un microondas domestico de 900-1000 watts de potencia. Las laminillas deben colocarse en vasos Coplin con el buffer seleccionado, dentro del horno de microondas ajustando el tiempo a 5 minutos a potencia máxima seguido de otro ciclo de 15 minutos a potencia media; es importante vigilar entre los dos ciclos que el buffer siga cubriendo los tejidos, si es necesario rellenar para evitar que el tejido se seque, al final del segundo ciclo dejar reposar a temperatura ambiente de 20 a 30 minutos. 18 Digestión enzimática: en este método se emplean enzimas tales como tripsina, fisina, pronasa, pepsina o proteinasa K, la mayoría son obtenidas de fabricantes, por lo que cada uno recomienda sus instrucciones de uso. Es necesario seguir las recomendaciones del fabricante para evitar la degradación excesiva e incluso el desprendimiento del tejido. Bloqueo de enzima endógena: Con la finalidad de evitar falsos positivos es necesario neutralizar la función de enzimas endógenas como la peroxidasa o fosfatasa alcalina, debido a que al agregar un sustrato para estas enzimas se genera marca de positividad donde no existe antígeno ni anticuerpo, es decir un resultado falso positivo. La técnica más empleada es la de peroxidasa, donde utiliza una solución de peróxido de hidrogeno al 3% como mecanismo de bloqueo. Bloqueo de fondo inespecífico: También conocido como eliminación de “background” que se genera por la fijación inadecuada o bien por una técnica de recuperación de antígenos excesiva. Este fenómeno deriva de la precipitación o unión de los anticuerpos a zonas no específicas. El método más usado es el de bloqueadores proteicos tales como la albumina de suero bovina (1-10%), se podrá emplear tween-20 si existiera background excesivo, pero se debe cuidar la conveniencia ya que los detergentes no iónicos como el tween-20 podría solubilizar proteínas. Permeabilización del tejido: Este paso se realiza para favorecer la penetración de los anticuerpos al interior del tejido. Para ello se utiliza una solución de detergente que pueden ser: Tritón X-100, saponina. En ocasiones este tratamiento es suficiente para asegurar una fácil penetración de los anticuerpos, no obstante se podría adicionar detergente en la soluciones de lavado a concentraciones muy bajas (Tritón X-100 al 0.05- 0.2%), esto se recomienda si los cortes superan las 6-8 µm. pero si el antígeno a localizar se encuentra en membrana se podría omitir este pasó. 19 Incubación con anticuerpo primario: Se considera un anticuerpo primario a aquel que es dirigido específicamente contra el antígeno problema a detectar. Para hacer uso de un anticuerpo comercial se debe conocer la especie (ratón, conejo, rata, humano, etc.), su tipo y estructura de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, Fab IgG u otro), su clonalidad (monoclonal o policlonal) para poder determinar a través de ensayos de titulación o dilución la concentración optima de trabajo (1:100, 1:200, etc.); cabe mencionar que en la mayoría de los casos el fabricanterecomendara un rango. El diluyente podrá ser el buffer de lavado que se ha empleado o bien un preparado de la solución de bloqueo inespecífico a menor concentración. Es importante mencionar que la incubación debe realizarse en una cámara de incubación, la cual evita la evaporación de la solución de anticuerpo. El tiempo y temperatura de incubación dependerán de lo recomendado por el fabricante, aunque la mayoría de los protocolos recomiendan 4 °C durante toda la noche para permitir la unión específica del anticuerpo a la mayoría de los epitopes. Incubación con anticuerpo secundario (link o puente). El anticuerpo secundario es aquel cuyo antígeno es el anticuerpo primario. Es importante conocer de qué especie fue el anticuerpo primario, ya que el anticuerpo puente será exclusivo para reconocer inmunoglobulinas de esa especie (anti-ratón, anti-conejo, etc.). Los anticuerpos secundarios se encuentran tratados con residuos de biotina lo cual le permite funcionar como enlace entre el primario y el complejo enzimático exógeno. La concentración del anticuerpo secundario siempre será menor a la del primario. En la actualidad los sistemas de detección te otorgan anticuerpos prediluidos con concentraciones establecidas. 20 Incubación con complejo enzimático: La enzima exógena más empleada es la peroxidasa de rábano (HRP-Horse Radish Peroxidase), esta enzima se encuentra unida a la avidina (comúnmente estreptavidina), lo cual constituye el complejo estreptavidina-biotina-peroxidasa. Este complejo presenta una de las interacciones no covalentes más fuertes que se conocen, ya que se puede mantener en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventes orgánicos, agentes desnaturalizantes, detergentes y peptidasas. Al igual que el anticuerpo secundario la concentración de este complejo será preestablecido por el fabricante. Colocación del sustrato para enzima (revelado) También conocido como cromógeno, son el compuesto base para el revelado de la unión del anticuerpo primario (parátope) a su antígeno (epítope). Existen diversos cromógenos tales como AEC (aminoetilcarbazol), Fast Red, Elegance Red, pero uno de los más empleados es el DAB (diaminobezidina) ya que es insoluble en alcohol y xilol. Este cromógeno es sustrato con la HRP generando un color café en el sitio donde se localiza la reacción antígeno-anticuerpo también conocida como área o zona de positividad. Contratinción nuclear (hematoxilina) La hematoxilina es un colorante básico en la histología utilizado para la visualización de los núcleos en cortes de tejido y preparaciones de células. Diferentes tipos de hematoxilina pueden ser empleados para lograr este fin (Mayer’s, Gill’s, Weigert u otra), el objetivo de la contratinción es obtener una referencia específica de en qué región celular está observándose la reacción de positividad. 21 Deshidratado y montaje: Concluido el proceso de la inmunotinción, los tejidos deben protegerse para poderlos utilizar las veces que se considere conveniente sin que se deterioren. Para alcanzar este objetivo los tejidos marcados se deshidratan y se montan empleando concentraciones de alcohol ascendentes y xilol, posteriormente se coloca el medio de montaje que puede ser una resina hidrofóbica o hidrofílica, permitiendo una unión solida del portaobjetos al cubreobjetos. Desmineralización: El procedimiento de elección para conservar la inmunoreactividad de los tejidos es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), acido utilizado como agente quelante o antagonista de metales pesados. 2.5. Análisis inmunohistoquímico asistido por softwares. La interpretación de los resultados de las técnicas inmunohistoquímicas por parte del patólogo presenta una serie de limitaciones en relación al tiempo invertido, a la subjetividad de la interpretación y reproducibilidad de resultados. El empleo de softwares comerciales o de acceso libre para el análisis digital de imágenes se ha convertido en una herramienta que favorece la reproductibilidad de la cuantificación de un área definida. Actualmente existen diferentes softwares diseñados para este fin tal como el ImageJ, este programa fue desarrollado por el NIH (National Institutes of Health) y representa uno de los programas de libre circulación. Otro programa comercial reportado en la literatura ha sido Image-Pro, el cual puede ser empleado para el análisis de imágenes y no solo para la cuantificación inmunohistoquímica. Otros reportes han divulgado el empleo de plataformas completas donde un equipo con su software específico pueden ser empleados para el análisis de inmunohistoquímicas por peroxidasa o 22 inmunofluorescencia (PM2000/AQUA y Scan Scope FL). Estos softwares y plataformas tiene ciertas limitaciones específicas resultantes de la falta de sistemas de referencia bien definidos (un área) para realizar la cuantificación cuando así corresponde, la falta de consenso respecto a la unidad susceptible de contabilización (células teñidas o áreas de tinción) o la propia variabilidad respecto a la localización celular del marcador a identificar (nuclear, citoplasmática, membrana). Lo cual nos vislumbra que estos softwares y sistemas seguirán mejorando día a día. Capítulo 3. Marcadores Biológicos. Conocidos también como marcadores tumorales o biomarcadores; corresponden a moléculas, que cambian y alteran su estructura cualitativa y cuantitativamente como resultado de una condición potencialmente cancerígena o de un cáncer, pudiendo ser detectadas a través de pruebas de laboratorio en sangre, fluidos orgánicos y tejidos. No existe un marcador ideal, es decir con una sensibilidad y especificidad del 100%. Los marcadores son usados para diagnóstico diferencial, como prueba de valor pronóstico y predictivo, como herramienta para evaluar el tratamiento administrado, y para la detección de recidivas antes de que las manifestaciones clínicas reaparezcan. Debido a los avances en Biología Molecular, actualmente se estudian los múltiples eventos involucrados como la carcinogénesis, progresión tumoral, angiogénesis, metástasis y apoptosis; así los marcadores pueden clasificarse en: 23 - Marcadores de proliferación: Estos se encuentran presentes en determinadas fases del ciclo celular. - Factores de crecimiento: Como su nombre lo indican estimulan el crecimiento tumoral. - Receptores: su sobreexpresión o su presencia alterada puede estar presente en algunos tipos de células tumorales. -Angiogénesis y factores del microambiente: favorecen la progresión de la neoplasia. -Moléculas de adhesión y expresión de proteasas: permiten la invasión y la metástasis. -Oncogenes y genes supresores: su amplificación o sobrexpresión se asocia con la desregulación del crecimiento y la apoptosis. Mucinas: su detección en la circulación se utiliza como índice de enfermedad residual. Filamentos Intermedios. Las proteínas que forman los Filamentos Intermedios reciben diferentes nombres, citoqueratinas, vimentinas, desminas, proteína ácido fibrilar glial, neurofilamentos, laminas dependiendo del tipo celular en la que se localizan. Así se han descrito cinco diferentes tipos de filamentos intermedios. (Fig.3). Tipo I y II: Constituidos por queratina ácida, y queratina básica respectivamente. Son producidos por diferentes tipos de células epiteliales (vejiga, piel, uñas, etc.) Tipo III: Se encuentran en diferentes variedades de células. Cada uno es único a cada tipo de célula y son usados para identificar el tejido que contiene aquel tipo de célula. La Vimentina se encuentra en fibroblastos, células endoteliales y leucocitos. 24 La desmina en el músculo conectando los discos Z en el sarcómero,así como comentando los desmosomas en las uniones especializadas en el músculo cardiaco. El factor acídico fibrilar glial en astrocitos y otros tipos de células gliales en el sistema nervioso central. Periferina en fibras nerviosas periféricas. El FI llamado Vicentina se encuentra en células derivadas del mesodermo: fibroblastos, células endoteliales y glóbulos rojos. Tipo IV Se incluyen en este tipo neurofilamentos de tipo L (ligeros), M, (Medianos) o H (alto) peso molecular. Los neurofilamentos están unidos por la proteína plectina que forma puentes cruzados o entrecruzamientos entre los neurofilamentos y los microtúbulos. Este entrecruzamiento añade tensión y espaciamiento entre las fibras. Otro ejemplo de esta clase de filamento intermedio es la internexina, encontrada en neuronas. Tipo V Las lamininas están localizadas en el núcleo justo debajo la envuelta nuclear formando el apoyo filamentoso de la lámina nuclear. En la evolución es probable que fuera el primer FI en aparecer. Las lamininas son vitales para la reformación de la envuelta nuclear después de la división celular. Así, sufren fosforilación al inicio de la profase durante la mitosis, lo que causa su desensamblaje y la desestructuración de la envuelta nuclear. En la telofase el grupo fosfato es retirado y la laminina se puede volver a ensamblar alrededor de los cromosomas debajo de la membrana de cada una de las membranas nucleares internas de las células hijas. (Fig.3). 25 Figura 3. Fuente IMG. Modificado de Tesis Doctoral: Estudios de marcadores y diferenciación epitelial en mucosa oral construida por ingeniería tisular; autor Ingrid Johanna Garzòn Bello, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, 2009. Tipo VI La nestina en las células madres del sistema nervioso central. En el citoplasma, uno, dos o más tipos. Capítulo 4. Marcadores de Diferenciación Epitelial. Las queratinas son proteínas que forman parte del grupo de filamentos intermedios (FI), el término citoqueratinas se usa en biología y patología para describir las queratinas que se encuentran en el citoplasma de las células epiteliales y constituyen una parte muy importante del citoesqueleto de la célula, son responsables del mantenimiento de la estructura celular y de los tejidos, confieren protección ante traumatismos y sirven como medios de comunicación con las células adyacentes. Se expresan en pares y se clasifican numéricamente del 1 al 20 según su peso molecular (PM) y su punto isoeléctrico. 26 De acuerdo al “comité de nomenclatura queratina”, las queratinas tipo I o acidas se encuentran conformadas por K9-K10, K12-28 y K31-40 y las queratinas tipo II o básicas K1-K8 y K71-K86. Las queratinas tipo I se integran por 28 genes de queratinas (17 queratinas epiteliales y 11 queratinas de pelo). Las queratinas tipo I (excepto la K18) se encuentran localizadas en el cromosoma 17q21.2 y son de bajo Peso Molecular y las del tipo II (incluye la K18) en el cromosoma 12q13.13. y son de bajo Peso Molecular (entre 44 y 66 kDa).10,11 A continuación describiremos las de mayor utilidad de acuerdo al objetivo de este manual. (Fig.4). Figura 4. Fuente IMG. Modificado de Tesis Doctoral: Estudios de marcadores y diferenciación epitelial en mucosa oral construida por ingeniería tisular; autor Ingrid Johanna Garzòn Bello, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, 2009. 27 pan-CK AE1/AE3. Son un conjunto de citoqueratinas de alto y bajo peso molecular, útiles en la identificación de neoplasias de extirpe epitelial, grado de diferenciación y en micrometástasis; pan-CK AE1/AE3 marca carcinomas, incluyendo los pobremente diferenciados. AE1 marca citoqueratinas acidas (CK10, 15,16,19) y se expresa en epitelios simples y en piel solo en la capa basal de la epidermis. La CK AE3 Reconoce citoqueratinas básicas (CK1-CK8) y es característica de epitelios de transición y en carcinomas escamosos. (Fig.5 ) Figura 5. Prueba de Inmunohistoquímica para Pan-CK AE1/AE3 Marcaje: Intracitoplasmático. Aplicación clínica: Útil para identificar tumores de origen epitelial como carcinoma de células escamosas, tumor de células de Merckel, Mesotelioma, Sarcoma Sinovial y Seminoma. Control positivo Piel y Adenocarcinomas. 28 CK8. Sinónimo Antígeno Polipéptido de Tejido (TPA), Proteína con peso molecular de 53.7kDa se expresa en el embrión, es negativo en carcinoma espinocelular, en el basocelular y en el mioepitelioma. Sin embargo, es positivo en algunas neoplasias con diferenciación écrina y apócrina. Es componente de epitelios simples como el del tracto gastrointestinal, tiroides, mama, tracto respiratorio, excepto del epitelio escamoso estratificado. Se expresa en epitelios simples y en tumores de pulmón, cérvix, mama, conductos biliares, vejiga y mesotelio. Los carcinomas de células escamosas son negativos y los epitelios escamosos no queratinizantes positivos. (Fig.6). Figura 6. Prueba de Inmunohistoquímica para CK8 Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación clínica En carcinomas no queratinizantes y enfermedad de Paget extramamaria. En neoplasias con diferenciación ecrina y apócrina. Control Positivo Carcinoma de colón. 29 CK 14. Proteínas del grupo de filamentos intermediarios (ácidos) de 50 kDa, que generalmente se combina con CK5, una citoqueratina de tipo II (básico). En las células neoplásicas, CK14 es un marcador útil en la identificación de células basales de epitelio en próstata y mioepitelio en pecho y también ha demostrado ser un marcador de carcinoma de células escamosas. (Fig.7). Figura.7 Prueba de Inmunohistoquímica para CK14 Marcaje Intracitoplasmático en células del estrato basal. Aplicación clínica Carcinoma de células escamosas y de células basales, tumores mixtos de glándulas salivales, timoma, oncocitoma y tumor de Warthin. Control Positivo Próstata. 30 CK20. Proteína de 46 kDa perteneciente al tipo acídico A (clase I). Se encuentra en las células superficiales del epitelio transicional y sobre todo en el epitelio simple de las foveolas gástricas e intestino, así como en células neuroendocrinas. Es típico el patrón de expresión de CK20 en las células de Merkel de la piel. En los adenocarcinomas colorectales se expresa en más de la mitad de las células, distribuyéndose de forma irregular. Los carcinomas de células de Merkel mantienen la expresión de CK20. (Fig. 8). Figura 8. Prueba de Inmunohistoquímica para CK20 Marcaje Intracitoplasmático Aplicación Clínica Junto con la CK7 se usa en los paneles de anticuerpos para tratar de identificar el tumor primario en las metástasis cutáneas de origen desconocido. Control Positivo Apéndice y colon. 31 Langerina (CD207). Es una lectina que presenta especificidad de unión a la manosa. Proteína de 40 kDA ubicada en el cromosoma 2p13.3 es característica de las células de Langerhans. Estas células se encuentran en el tejido no linfoide como los epitelios y su función principal es capturar el antígeno.(Fig.9). Figura.9 Prueba de Inmunohistoquímica para Langerina Marcaje Transmembranal y citoplasmática. Aplicación clínica Histiocitosis de células de Langerhans. La expresión de la proteína langerina tiene utilidad en la diferenciación de la Histiocitosis de células de Langerhans de otras proliferaciones histiocitícas . Control Positivo Piel e histiocitosis. 32 Amelogenina. Principal constituyente proteico de la matrizde esmalte en desarrollo. Esta proteína de PM de 21.6kDa está bien caracterizada. La estructura del gen de esta proteína ha sido demostrado y se confirma que hay dos genes de amelogenina en los seres humanos, uno en el cromosoma X y el otro en él Y. Se ubica el gen en el cromosoma X p22.2. Varios tipos de amelogénesis imperfecta ligada al cromosoma X son causadas por defectos estructurales en el gen de amelogenina. La importancia fisiológica de esta proteína es su participación en la formación del esmalte. ( Fig.10) Figura 10. Prueba de Inmunohistoquímica para Amelogenina Marcaje Intracitoplasmático extracelular. Aplicación clínica Identificación de proteínas de esmalte dental erupcionado, para el estudio del proteoma del esmalte dental que presenta defectos del desarrollo y en terapia periodontal. Control Positivo Amelogeninas durante la organización de la matríz. 33 Capítulo 5. Marcadores de diferenciación Mesenquimatosa Corresponden a proteínas de la familia de Filamentos Intermedios tipo III, entre ellos se encuentran la Vimentina, Desmina, la Proteína Ácido Glial Fibrilar (GFAP) y la Perfirina. Vimentina Proteína de 53 Kd.15 Su gen se encuentra codificado en el cromosoma 10p13.16 De las cinco clases de filamentos intermedios, vimentina pertenece a los de clase III, muestra un alto grado de especificidad formando filamentos intermedios del citoesqueleto de las células de origen mesenquimatoso y están presentes en casi todas las células embrionarias. Este gen es responsable del mantenimiento de la forma celular, la integridad del citoplasma, y la estabilización de las interacciones del citoesqueleto. También está implicado en la respuesta inmune, y controla el transporte de lipoproteínas de baja densidad (LDL) colesterol -derivado de un lisosoma al sitio de esterificación. . Funciona como un organizador de una serie de proteínas críticas implicadas en la unión, la migración y la señalización celular. Se encuentra transitoriamente en una variedad de tipos celulares antes de que se transformen a un fenotipo totalmente diferenciado. 17 En general, la mayoría de las células mesenquimatosas reaccionan con el anticuerpo, incluyendo los fibroblastos, células adiposas, de músculo liso, endoteliales vasculares, células de Schwann, macrófagos incluyendo células de Kupffer, así como las células mioepiteliales de las glándulas sudoríparas, salivales y mama. También son positivos, con intensidad variable y distribución, las células foliculares de la glándula tiroides y mucosa Las mutaciones dominantes en este gen causa cataratas. (Fig.11). 34 Figura 11. Prueba de Inmunohistoquímica para vimentina Marcaje Variable. Aplicación clínica Se usa en el inmunomarcaje de células mioepiteliales y es considerado como un marcador temprano en la diferenciación mioepitelial.18 Sin embargo, como otros marcadores, no es específico para células mioepiteliales neoplásicas. Control positivo Melanoma. 35 Proteína ácido glial fibrilar (GFAP). Es una proteína, de 51kDa, ubicada en el cromosoma 17q21,20 se encuentra en astrocitos y células gliales.19 y en neoplasias mesenquimatosas con diferenciación condroide.22 Su función principal es proteger la rígida organización de la estructura de los astrocitos permitiéndoles tener considerable flexibilidad y curvatura. En algunas células se encuentra estrechamente relacionada con filamentos de vimentina y desmina, los cuales están implicados en la estructura y función del citoesqueleto. (Fig.12). Figura 12.Prueba de Inmunohistoquímica Proteína ácido glial fibrilar Marcaje Intracitoplasmática y membranal. Aplicación clínica Positiva en todos los tumores de origen astrocítico , útil para diferenciar el mioepitelioma, del adenocarcinoma polimorfo de bajo grado y carcinoma adenoideo quístico de glándulas salivales. Control positivo Células Gliales y cerebro. 36 Actina. La actina es codificada por una familia multigénica que ha evolucionado a partir de un gen precursor común denominado ACTA2.28,30 se compone de 6 isoformas, que varían en su secuencia de aminoácidos, todas con el mismo peso molecular de 42kDa. Las isoformas específicas de músculo se dividen a su vez en 2 isoformas en músculo; una de músculo cardiaco y otra de estriado28 y existen dos isoformas citoplasmáticas siendo éstas últimas para filamentos de actina en células no musculares.29 Según el punto isoeléctrico existen tres clases de actina; actina alfa de músculo y las actinas beta y gamma de células no musculares. Todas las células presentan microfilamentos de actina como componente del citoesqueleto sin embargo la α-SMA tiene especificidad para células de músculo liso. Además se expresa relacionada con pericitos, células glómicas, miofibroblastos y células mioepiteliales. La α-SMA es utilizada como un marcador de diagnóstico para tumores miofibroblásticos, de músculo liso y relacionados.28 En tejidos normales el anticuerpo se expresa en células de músculo liso en los vasos sanguíneos, conductos salivales y células mioepiteliales alrededor de acinos en glándulas salivales. (Fig.13) Figura 13.Prueba Inmunohistoquímica Actina Marcaje Intracitoplasmático. 37 Aplicación Clínica Las células musculares lisas del miometrio se marcan positivamente. Además, el anticuerpo marca miofibroblastos y células mioepiteliales ubicadas alrededor de los acinos y conductos de mama, mientras que los epitelios, tejido linfático, células musculares esqueléticas y cardiacas, células endoteliales, células adiposas, células Schwann y los fibroblastos son negativos. Es una herramienta útil en la identificación de leiomiomas, leiomiosarcomas y adenomas pleomorfos. Control positivo Colon e hígado. 38 Calponina. Es una proteína de unión a actina tipo calmodulina específica de músculo liso de 34 kDa.32 participa en la organización del citoesqueleto. El contenido de calponina en células de músculo liso y células no musculares es muy alta. Calponina y caldesmón se encuentran en las fibras de actina adyacente a las membranas celulares.31 Este marcador indica diferenciación hacia músculo liso (parénquimal y vascular) aunque se ha encontrado su expresión en miofibroblastos de estroma desmoplásico, en histiocitoma fibroso maligno angiomatoide, en células mioepiteliales de neoplasias de glándulas sudoríparas y salivales, mioepitelioma y carcinoma mioepitelial de partes blandas. Se ha encontrado expresión de calponina en células proliferantes en neoplasias de estirpes variadas cómo en neurotecoma, tumores glómicos, miofibrosarcoma de hueso y focalmente en sarcoma sinovial. (Fig.14)32,33 Figura 14 Prueba de Inmunohistoquímica calponina Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación Clínica En histiocitoma fibroso maligno angiomatoide, en células mioepiteliales de neoplasias de glándulas sudoríparas y salivales, mioepitelioma y carcinoma mioepitelial de partes blandas. Se ha encontrado expresión de calponina en 39 células proliferantes en neoplasias de estirpes variadas cómo en neurotecoma, tumores glómicos, miofibrosarcoma de hueso y focalmente en sarcoma sinovial. Control Positivo Glándula mamaria normal. Desmina. Proteína de 53 Kd de peso molecular del grupo de los Filamentos intermedios que forman el citoesqueleto de las células musculares lisas, esqueléticas y cardiacas. En el músculo estriado, une lateralmente entre si las miofibrillas. En el músculo liso, los filamentos de desmina forman una red tridimensional que enlaza entre si los cuerpos densos. En los tres tiposde células musculares los filamentos de desmina proporcionan una red citoesquelética para la inserción e integración mecánica de las proteínas contráctiles. (fig.15) Figura 15. Prueba de Inmunohistoquímica Desmina Marcaje Intracitoplasmático. 40 Aplicación clínica Su papel en la identificación de los rabdomiosarcomas es muy importante, porque este tipo de tumores no siempre presentan las estriaciones típicas que sirven para caracterizarlos, y pueden confundirse con otros tumores como carcinomas y linfomas. También se usa en los leiomiosarcomas, pero no es un marcador tan homogéneo de este tipo tumoral como lo es del rabdomiosarcoma, ya que algunos leiomiosarcomas pueden ser desmina negativos, sobre todo cuando son po- bremente diferenciados. Control positivo Leiomioma, leiomiosarcoma y Rabdomiosarcoma. 41 Fascina. Es un gen de 54.5 KDa ubicado en el cromosoma 7p22.1 que codifica a un miembro de la familia Fascin de proteínas de unión a actina. Las proteínas Fascin organizan a F-actina en haces paralelos. Esta proteína desempeña un papel crítico en la interacción, motilidad, adhesión y migración celular. La expresión la sobreexpresión de este gen desempeña un papel importante en la metástasis de múltiples tipos de cáncer debido al aumento de la motilidad celular. Expresión de este gen es también un marcador para las células Reed-Sternberg en el linfoma de Hodgkin. (Fig.16) Figura 16. Prueba de Inmunohistoquímica Fascina Marcaje Intracitoplasmatico. Aplicación Clínica Es un marcador muy sensible para las células Sternberg en la esclerosis nodular, celularidad mixta, y la enfermedad de Hodgkin. Control Positivo Linfoma de Hodgkin, ganglio linfático y amígdala. 42 COL2A1 (Colágena Tipo II alfa1). El gen se localiza en el cromosoma 12 q13.11y tiene un PM de 141.8 kDa; codifica la cadena alfa 1 del colágeno tipo II, que consiste en colágeno fibrilar que se encuentra en el cartílago y el humor vítreo del ojo. (Fig.17). Figura 17. Prueba de Inmunohistoquímica Col 2 Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación clínica Las mutaciones en este gen están asociadas con Acondrogénesis, Condrodisplasia. Control positivo Células glandulares de colon. COL3A1 (Colágena Tipo III alfa1). Gen ubicado en el cromosoma 2q32.2 con PM de 138.6 kDa, este gen codifica las cadenas proalfa 1 de colágeno tipo III, este colágeno se encuentra en tejidos conectivos muy flexibles como piel, pulmón, útero, intestino y tejido vascular. (Fig.18) 43 Figura 18.Prueba de Inmunohistoquímica COL3A1 Marcaje Membranal e Intracitoplasmático. Aplicación clínica Mutaciones de este gen se asocian al Síndrome de Ehlers-Danlos. Control positivo Hígado y vejiga. COL11A1. Este gen de PM 181.1y ubicado en el cromosoma 1p21.1 codifica una de las dos cadenas alfa del colágeno tipo XI, o colágeno fibrilar menor. El Colágeno tipo XI es un heterotrímero. Las mutaciones en este gen están asociadas con el Síndrome de Stickler tipo II y con el síndrome de Marshall. El polimorfismo de este gen también se asocia con susceptibilidad a la hernia discal lumbar. Se han identificado múltiples variantes de la transcripción de este gen. (Fig.19) 44 Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación Clínica Biomarcadores de células estromales humanas de carcinoma invasivo asociado a la progresión tumoral. Control Positivo Condrocitos, osteoblastos y células madre mesenquimales. 45 Capítulo 6. Marcadores Neuroectodérmicos Sox-2. Factor de transcripción con peso molecular de 34.3 ubicado en el cromosoma 3q26.33, esencial para mantener la auto-renovación, o pluripotencialidad de las células madre embrionarias indiferenciadas. Regulan el mantenimiento de células madre del SNC SOX2 se expresa en cerebro fetal y se usa como marcador de células madre neurales multipotenciales. En los tumores, la expresión de Sox2 se observa en teratoma del sistema nervioso central, melanoma, tumor de células germinales testicular, carcinoma cervical, cáncer de pulmón, cáncer de mama con el fenotipo de células basales y el carcinoma de células escamosas del tracto gastrointestinal. SOX2 puede ser útil en la identificación de carcinoma embrionario. En el estadio I en adenocarcinomas de pulmón y parece ser un predictor independiente de mal pronóstico, útil para estratificar los pacientes en mayor riesgo de recurrencia.(Fig.20) Figura 20.Prueba de Inmunohistoquímica SOX2 Marcaje: Nuclear. Aplicación Clínica: cáncer de pulmón, de mama, carcinoma de células escamosas. Control: Cerebro, Oligodendroglioma. 46 Sox9. Es una proteína que en los humanos actúa como Factor de transcripción, participa en la diferenciación de condrocitos; se expresa durante la embriogénesis, en el cartílago, cresta neural, riñón y páncreas. SOX-9 juega un papel fundamental en el desarrollo sexual masculino, interactúa con algunos otros genes para promover el desarrollo de los órganos sexuales masculinos y su actividad es necesaria para el desarrollo, la diferenciación y el compromiso de linaje en diversos tejidos, incluyendo el epitelio intestinal. (Fig.21) Figura 21.Prueba de Inmunohistoquímica SOX9 Marcaje Nuclear. Aplicación clínica Para determinar malformaciones esqueletales. Control Colon, próstata, Piel. 47 Melanoma /HMB45. Anticuerpo monoclonal, de peso molecular 70 kDa dirigido contra la glucoproteína 100 (gp100) componente del premelanosoma. Positivo en melanocitos activos, inmaduros e intraepidérmicos y negativo en melanocitos adultos. Marcador sensible de proliferaciones melanocíticas como nevo de Spitz, azules y displásicos. HMB-45 se correlaciona con la producción de melanosomas y proliferación melanocitica. (Fig.22) Figura 22. Prueba de Inmunohistoquímica HMB45 Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación clínica Es uno de los marcadores más útiles en la confirmación de diagnóstico de melanoma en caso de tumores de histogénesis dudosa. Control positivo Epidermis y epitelio de los anexos. 48 NFGR (Receptor del factor de crecimiento nervioso). Receptor del factor de crecimiento nervioso, también denominado p75 o CD271, es una glicoproteína transmembrana 75 kDa de PM que se expresa principalmente en las células de Schwann, neuronas y en una variedad de células no neuronales. Funciona en la regulación del crecimiento neuronal, migración, diferenciación y muerte celular durante el desarrollo del SNC y periférico. Durante el desarrollo temprano, la activación de p75 NGFR por NGF induce la muerte celular por apoptosis en algunas células neuronales.(Fig.23) Figura 23.Prueba de Inmunohistoquímica NFGR Marcaje Citoplasma. Aplicación clínica Identificación de melanoma de células fusiformes, Dermatofibrosarcoma, Neuroblastoma. Control Positivo Mama. 49 Calretinina Calretinina es una proteína de unión a calcio dependiente de la vitamina D que participan en la señalización del calcio. Se expresa en el sistema nervioso central y periférico y en muchos tejidos normales y patológicos. Tiñe mesotelioma y se puede utilizar para ayudar a diferenciar los tumores de pulmón. Calretinina también se considera una herramienta de diagnóstico importante en el diagnóstico diferencial de los tumores quísticos y sólidos ameloblástico. Anti-calretinina ha demostrado ser útil en la diferenciación de mesotelioma de adenocarcinomas de pulmón y otras fuentes. Tambiénes útil en la diferenciación de los tumores suprarrenales-cortical de feocromocitomas. (Fig.24) Figura 24.Prueba de Inmunohistoquímica Calretinina Marcaje Núcleo, citoplasma Aplicación clínica Mesotelioma. Control Positivo Cerebro, colon, mesotelioma (mesotelioma maligno). 50 Capítulo 7. Marcaje de Linaje Hematopoyético o Linfoide CD1A Proteína de 43 a 49 kDa; pertenece a una familia de glicoproteínas expresadas en la superficie de diversas células presentadoras de antígeno humano normalmente presente en la membrana de células Langerhans y en timocitos corticales (inmaduros), en corteza tímica normal, hiperplasia tímica y timoma benigno.(Fig.25) Figura 25.Prueba de Inmunohistoquímica CD1A Expresión Expresión Intracitoplasmática y membranal. Aplicación Clínica Marcador específico para Histiocitosis de células de Langerhans y en la leucemia T linfoblástica aguda. Control positivo Amígdala, piel, timo. 51 CD3 El antígeno CD3 es un complejo de proteínas de tres cadenas distintas que se asocian con receptores de células T presente en las células maduras, las T inmaduras carecen de rearreglos del gen del receptor y son negativas a CD3 para generar una señal de activación de linfocitos T. (Fig.26) Figura 26.Prueba de Inmunohistoquímica CD3 Expresión Membranal e intracitoplasmática . Aplicación Clínica Es positivo en el 75-80% de los linfomas T, angioblastoma, linfoblastoma y micosis fungoide, en un pequeño porcentaje de células Reed Sternberg con un patrón paranuclear y es negativo en linfomas B. Control positivo Amígdalas. 52 CD4 Es una glicoproteína de 55kD que se expresa en la superficie de los Linfocitos T helper/inductores, monocitos, macrófagos, células de Langerhans y células dendríticas; involucrada en el reconocimiento del Complejo Mayor de Histocompatibilidad Tipo II (CMH II), cuando existe proliferación de células T maduras, excepto en el timo pueden existir poblaciones CD4, CD8. (Fig.27). Figura 27.Prueba de Inmunohistoquímica CD4 Expresión Membranal. Aplicación clínica Positiva en células T cooperadoras Negativo en células B. Para la identificación de células T auxiliares, tumores de células T, linfoma anaplásico de células grandes y micosis fungoide. Control Positivo: Amígdala y linfoma de células T. 53 CD10 Es una glicoproteína o endopeptidasa neutra de peso molecular de 100 kDa que se expresa en progenitores linfoides y células normales del centro germinal. En células mioepiteliales de mama, conductos biliares, carcinoma células renales, carcinoma de pulmón, mesotelioma y melanoma maligno. (Fig.28) Figura 28.Prueba de Inmunohistoquímica CD10 Marcaje Membranal. Aplicación Clínica 90% de casos positivos en la leucemia linfoblástica aguda de células B 94% en Linfoma de Burkitt y linfoblástico B y 60% en Linfoma folicular. Control positivo Amígdala y riñón. 54 CD20 Proteína no glicosilada de PM 32.1kDa ubicada en el cromosoma 11q12.2 que se expresa en precursores de células B y células B maduras, receptor de membrana que los linfocitos B adquieren durante su maduración esta se expresa en la superficie de las células B maduras de la médula ósea y en sangre periférica, pero no en la etapa de diferenciación a células plasmáticas. No se conoce bien su función y su ligando, pero parece participar en la diferenciación de los linfocitos B hacia células plasmáticas. (Fig.29) Figura 29.Prueba de Inmunohistoquímica CD20 Marcaje Intracitoplasmática y membranal. Aplicación clínica Se expresa en el 95% de los linfomas de células B. 90% en la enfermedad de Hodgkin con predominio linfocitario nodular. 50% en Linfoma Linfoblástico. Control positivo Amígdala y Linfoma de células T. 55 CD34 Sialomucina de superficie de células madre hematopoyéticas con peso molecular de 110kD. El gen CD34 se localiza en el cromosoma 1q 32.2 se expresa en la superficie de las células troncales hematopoyéticas, en células endoteliales, fibroblastos embrionarios y tejido nervioso fetal. El dominio citoplasmático de la proteína CD34 contiene sitios de serina, treonina y tirosina para la fosforilación por la proteína cinasa C. Participa en la adhesión de las células troncales de medula ósea a la matriz extracelular y a células estromales.(Fig.30) Figura 30.Prueba de Inmunohistoquímica CD34 Marcaje: Transmembranal y Citoplasmático. Los precursores eritrocíticos, mieloides y megacariocíticos y las células linfoides inmaduras son CD34 positivos. Aplicación clínica Para la identificación de vasos sanguíneos y linfáticos, tumores de origen vascular angiosarcoma, hemangioma, sarcoma de Kaposi. Control positivo Hígado, riñón, placenta y colon. 56 CD43 (Leu 22) Proteína de peso molecular de 140kD, reconoce una proteína de superficie presente en las células mieloides y en los linfocitos T se expresa en la membrana y citoplasma de los linfocitos T y en células de linaje mieloide Ayuda a la identificación de linfoma de bajo grado de células B, linfoma periférico de células T. (Fig.31) Figura 31.Prueba de Inmunohistoquímica CD43 Marcaje Expresión membranal. Aplicación clínica Se expresa ampliamente en la mayoría de los leucocitos, por lo que no es considerado un anticuerpo específico de linaje. Útil para el diagnóstico de Linfomas de células T y células NK. Linfoma no Hodgkin. Control positivo Amígdala y apéndice. 57 CD45 Los anticuerpos frente al Antígeno Leucocitario Común (ALC) son específicos para la mayoría de las células linfoides, excepto las células plasmáticas. La familia CD45 se compone de varios miembros, que son productos de un gen único y complejo. Existen dos isoformas de CD45; CD45RO y CD45RA. CD45RA es la isoforma de mayor peso molecular y se expresa en los linfocitos T circulantes y son reconocidos por anticuerpos monoclonales anti-CD45RA. La isoforma CD45RO es la forma de menor peso molecular, se expresa en los linfocitos T circulantes tras su activación y se asocia con la adquisición de memoria inmunológica. (Fig.32) Figura 32. Prueba de Inmunohistoquímica CD45RO Marcaje Transmembranal. Aplicación clínica CD45 se expresa en la mayoría de las proliferaciones linfoides neoplásicas, excepto en los mielomas, en algunos linfomas linfoblásticos y en las células Reed- Sternberg. No muestra reactividad con las células B, por tal motivo es un buen marcador para identificar tumores de células T. Control positivo Amígdala y ganglio linfático. 58 CD105 ( Endoglina) Glicoproteína transmembranal de 160 a 170kD, el gen ENG que codifica esta proteína se localiza en el cromosoma 9q locus 34.11. Es un componente del receptor del factor de crecimiento transformante beta que une a los péptidos beta 1 y beta 3 con alta afinidad. Mutaciones en esta proteína causan el síndrome de Osler-Rendu-Weber tipo 1 (telangiectasia hemorrágica hereditaria). (Fig.33) Figura 33.Prueba de Inmunohistoquímica CD105 Marcaje Positividad membranal y citoplasmática. Aplicación clínica Se expresa en las células endoteliales durante la angiogénesis tumoral, con expresión débil o negativa en endotelio vascular de tejidos normales. Control Positivo Hígado, riñón, bazo y colon. 59 FoxP3 Gen de 47.2KDa ubicado en el cromosoma Xp11.23. La proteína codificada por este gen es un miembro de proteínas reguladoras transcripcionales Defectos en este gen son la causa de múltiples inmunodeficiencias Es un factorregulador de la transcripción que participa directamente en la función de células reguladoras TCD4+ humanos, considerado por algunos autores como el gen maestro controlador del desarrollo y función de células, reguladoras y marcador molecular. (Fig.34) Figura 34.Prueba de Inmunohistoquímica FOX P3 Marcaje Núcleo. Aplicación Clínica Se puede expresar en células linfoides, mieloides y en algunas células no hematopoyéticas como células epiteliales. Control Positivo Amígdala, ganglio linfático, Timo. 60 Cyr61 Es un inductor angiogénico rico en cisteína. Proteína secretada de unión a heparina, con un peso de 42 a 50kD, ubicada en la matriz extracelular. El gen se localiza en el cromosoma 1p locus 22.3. Ésta proteína se une a la integrina αv/β3 estimulando la adhesión y migración de las células endoteliales. Además promueve la síntesis de DNA por lo que participa en la proliferación y diferenciación celular. La expresión de Cyr61 se incrementa durante la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la diferenciación de condrocitos. Cyr61 también se detecta en una amplia variedad de neoplasias, ya que induce el crecimiento tumoral.28 (Fig.35) Figura 35.Prueba de Inmunohistoquímica CYR61 Marcaje Membranal y citoplasmático. Aplicación clínica Sobreexpresión en carcinoma de mama invasivo y metastásico. Control positivo Hígado y tracto gastrointestinal. 61 Capítulo 8. Marcadores Tumorales La inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en identificación de diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificación de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53. La forma de evaluar un marcador de proliferación es a través del índice de proliferación que combinado con el índice de ADN permite predecir el pronóstico de una enfermedad. Cuando la célula no se encuentra involucrada en la división está en estado G0 y cuando inicia su división, entra a la fase G1, que corresponde a un período de actividad donde se sintetizan una serie de proteínas necesarias para el ingreso a la fase S.( Fig.36).En La fase S se tiene lugar la replicación del material genético, pasando la célula con una dotación cromosómica 2n (diploide) a 4n (tetraploide), por último la fase G2 corresponde a un segundo intervalo que precede a la fase M, en la cual acontece la división nuclear y citoplasmática. el objetivo evaluar la distribución de marcadores a lo largo de las distintas fases del ciclo celular y la apoptosis se caracteriza por cambios morfológicos, que incluyen, condensación del citoplasma y núcleo y la pérdida de asimetría en los fosfolípidos de la membrana plasmática. El resultado final es una compleja cascada bioquímica, por tanto, es una parte integral de la homeostasis fisiológica. Así la naturaleza del marcador tumoral va desde un ácido nucléico, una proteína, o un péptido involucrados en la apoptosis, angiogénesis y proliferación. Figura .36 Fuente .IMG. Modificado de Ciclo Celular y Cáncer, autor: Pablo Turmero, trabajo expuesto en http://www.monografias.com/trabajos105/ciclo-celular-y-cancer/ciclo-celular-y-cancer.shtml http://www.monografias.com/trabajos105/ciclo-celular-y-cancer/ciclo-celular-y-cancer.shtml 62 Ki-67 Es una proteína nuclear de 345 y 395 kDa que está estrictamente correlacionada con la proliferación. Se encuentra en todas las fases del ciclo celular excepto en G0, Durante la interfase el antígeno puede ser exclusivamente detectado en el núcleo, mientras que en la mitosis mucha proteína es relocalizada en la superficie de la célula en división.25 (Fig.37) Figura 37.Prueba de inmunohistoquímica Ki67 Marcaje Nuclear. Aplicación clínica Marcador del índice de proliferación celular medido en porcentaje, a menor índice de proliferación el tumor tendrá mejor pronóstico. Se expresa en carcinomas escamosos de piel, pulmón, cérvix, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma anexiales cutáneos y en sus metástasis.41,42 Control positivo Ganglios linfoides, colon y piel. 63 WT1 El gen WT1 se identificó como un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma11p13, participa en el desarrollo del tumor de Wilms.43,44 Se han descrito mutaciones en la línea germinal del WT1 en algunos síndromes como Denys-Drash45 y WAGR46 los cuáles predisponen al desarrollo de tumores de Wilms. Codifica una proteína de 4 dedos de zinc en la región C-terminal de unión al ADN,43,44, 47 participa en la regulación transcripcional de genes además de factores de crecimiento, marcadores de diferenciación, regulador del ciclo celular y de la apoptosis.48-51 WT1 se ha detectado inmunohistoquímicamente en diferentes neoplasias, se ha consideró un marcador fidedigno de mioepitelio neoplásico debido a que es negativo en células mioepiteliales normales.9 (Fig.38) Figura 38.Prueba de inmunohistoquímica WT1 Marcaje Expresión nuclear y citoplasmática de manera difusa y granular. Aplicación clínica Células mioepiteliales neoplásicas, carcinoma seroso de ovario y mesotelioma metastásico. Control positivo Riñón, endometrio y trompas de Falopio. 64 VEGF Factor de crecimiento endotelio vascular es una proteína de señalización importante implicada en la vasculogénesis tanto en el desarrollo del sistema circulatorio embrionario y en la angiogénesis a partir de vasculatura preexistente.. Como su nombre indica, la actividad de VEGF está restringida principalmente a células del endotelio vascular, a pesar de que tiene un efecto sobre un número ilimitado de otros tipos de células.(Fig.40) Figura 40.Prueba de Inmunohistoquímica VEGF Marcaje Intracitoplasmático. Aplicación Clínica Angiosarcoma. Control positivo Angiosarcoma, Angioma. 65 Oct-4 Gen ubicado en el cromosoma 6p21.33 con PM de 38.6 kDa. Es uno de los factores de transcripción que se requieren para mantener un estado indiferenciado (auto-renovación) y la pluripotencialidad de las células madre embrionarias humanas y de ratón, así como las células embrionarias jóvenes. Expresión aberrante de este gen en los tejidos está asociado a la carcinogénesis; por ejemplo en el Sarcoma de Ewing, donde existe translocación en el cromosoma 2125,28. (Fig.41) Marcaje Nuclear Figura 41.Prueba de Inmunohistoquímica OCT-4 Aplicación clínica Ayuda en la identificación de seminoma, y carcinoma embrionario, En el diagnóstico diferencial del disgerminoma es probable considerar el carcinoma de células claras ya que ambos pueden formar túbulos o nidos, contener células claras e infiltrado inflamatorio severo. Control Positivo Seminoma. 66 Figura 42. Fuente IMG. Modificada de Perspectivas en cáncer de mama: detección de células tumorales circulantes mediante mamaglobina A. Autor: P. Ceballos, S. Ghersevich 67 CONCLUSIONES: La inmunohistoquímica se basa en un método de reacciones inmunoenzimáticas usando anticuerpos mono o policlonales para detectar antígenos de células de tejidos es una importante herramienta en el diagnóstico, diferencial y pronóstico de muchas de las neoplasias de cabeza y cuello. También es la mejor técnica para determinar el origen de un tejido o la diferenciación de las células neoplásicas. En varios casos, la inmunohistoquímica permite un diagnóstico más preciso de los distintos procesos patológicos, el estudio de la diferenciación y el comportamiento biológico de la mayoría de las neoplasias
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