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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría en Ciencias (Neurobiología) Instituto de Neurobiología, UNAM campus Juriquilla Modulación de los ritmos respiratorios por actividad microglial. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGÍA) PRESENTA: JONATHAN JULIO ISMAEL LOREA HERNÁNDEZ TUTOR: Dr. José Fernando Peña Ortega Universidad Nacional Autónoma de México, Campus UNAM Juriquilla Instituto de Neurobiología Departamento de Neurobiología del Desarrollo y Neurofisiología MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: Dra. Ma. Teresa Morales Guzmán UNAM Juriquilla, INB, Departamento de Neurobiología Celular y Molecular Dr. Daniel Reyes Haro UNAM Juriquilla, INB, Departamento de Neurobiología Celular y Molecular MÉXICO marzo 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Universidad Nacional Autónoma de México Instituto de Neurobiología Los miembros del Comité Tutor certificamos que la tesis elaborada por Jonathan Julio Ismael Lorea Hernández cuyo título es: “Modulación de los ritmos respiratorios por actividad microglial”, se presenta como uno de los requisitos para obtener el grado de Maestro en Ciencias (Neurobiología) y cumple con los criterios de originalidad y calidad requeridos por la División de Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional Autónoma de México. Presidente Dr. Secretario (tutor) Dr. José Fernando Peña Ortega Vocal Dr. Suplente Dr. Suplente Dr. Aprobado por el Comité Académico Coordinador del Programa Firma Resumen El complejo pre-Bötzinger (preBötC) es el generador de los ritmos respiratorios. Este circuito es capaz de producir distintos patrones de actividad respiratoria en respuesta a la disponibilidad de oxígeno. En condiciones normales de oxigenación, el preBötC produce la respiración normal (eupnea), mientras que durante un episodio de hipoxia prolongada genera boqueos. Los boqueos son el último esfuerzo respiratorio en vida y son necesarios para que el organismo recupere sus funciones vitales a través de la autorresucitación. La disminución en la capacidad de generar boqueos está implicada en la patogénesis del síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL) que cursa con una falla en la autorresucitación. Dentro de los varios factores que predisponen a los bebés a sufrir el SMSL se encuentra la inflamación. La capacidad de generar boqueos y autorresucitación disminuye en condiciones pro-inflamatorias. Dado que la respuesta inflamatoria en el sistema nervioso central (SNC) involucra la activación de la microglía, existe la posibilidad de que estas células modulen la generación de los ritmos respiratorios a nivel central. El objetivo del presente trabajo fue evaluar si la activación o la inhibición de la microglía afecta la actividad del circuito generador del ritmo respiratorio in vitro e in vivo. Los resultados muestran que la activación de la microglía con lipopolisacárido (LPS), así como su inhibición con minociclina y su eliminación con L-leucina-metil-ester (LME), disminuyen la generación de los ritmos respiratorios tanto in vitro como in vivo y disminuyen la autorresucitación. Estos resultados representan una importante evidencia de la participación de la microglía en la modulación de la generación de los distintos ritmos respiratorios y permiten sugerir que las alteraciones en la actividad microglial podrían contribuir a la vulnerabilidad de la actividad respiratoria bajo condiciones pro-inflamatorias. Nuestros hallazgos podrían contribuir a un mejor entendimiento de aquellos padecimientos que cursan tanto con alteraciones inmunológicas como con alteraciones de la actividad respiratoria, como es el caso del SMSL en donde la reducción de la generación de boqueos y de la autorresucitación podría relacionarse a alteraciones de la actividad microglial. Abstract The pre-Bötzinger Complex (preBötC) is the respiratory rhythms generator. This neuronal circuit can produce different patterns of respiratory activity in response to changes in oxygen availability. In normal oxygenation conditions the preBötC generates normal breathing (called eupnea), whereas during a prolonged hypoxic period generates gasping. Gasping is the last respiratory effort and it is necessary for the recovery of the vital functions through autoresuscitation. A reduction in the ability to produce gasping and autoresuscitation has been implicated in sudden infant death syndrome (SIDS). An important risk factor for SIDS is inflammation. Accordingly, proinflammatory conditions reduce the ability to generate gasping and autoresuscitation. Considering that the inflammatory response into the central nervous system (CNS) involves microglial activation, it is possible that these cells modulate the generation of the respiratory rhythms in the CNS. Thus, we aimed to test whether the microglial activation or inhibition affect respiratory rhythm generation in vitro and in vivo. The results show that microglial activation with lipopolysaccharide (LPS) and its inhibition with minocycline or its elimination with L-leucine methyl ester (LEM) reduce respiratory rhythm generation while diminishes autoresuscitation. These results show that microglia modulates the generation of different breathing patterns in basal conditions and that its overactivation reduces gasping generation and autoresuscitation. Based on these findings, it is concluded that changes in microglial activity could contribute to breathing vulnerability during inflammation. Our findings may contribute to a better understanding of those diseases that involve immunological abnormalities as well as changes in respiratory activity, such as SIDS which is related to a reduction in gasp generation and in autorresucitación that be produced by disturbances in microglial activity. Agradecimientos y dedicatoria. Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca recibida durante mis estudios de maestría en la que se me asignó el número de becario 276264. Agradezco también a la Dirección General de Estudios de Posgrado de la UNAM. Agradezco el apoyo técnico recibido de parte de la Dra. Maria Teresa Morales Guzman, del Dr. Benito Ordaz Sánchez y de la candidata a doctora Ana Julia Rivera Angulo, así por el apoyo y tutoría recibido por parte del Dr. José Fernando Peña Ortega Agradezco también el apoyo recibido para la realización de este trabajo por parte del Bioterio del campus Juriquilla a cargo del médico veterinario zootecnista José Martín García Servín y de la Biblioteca del mismo campus a cargo del Dr. Francisco J. Valles Valenzuela Dedico afectuosamente ésta tesis a mi familia a quienes amo y agradezco su apoyo incondicional durante toda mi vida, en particular a mi madre Cristina Margarita Lorea Hernández y mis abuelos Raymundo Lorea Hernández y Teresa Hernández Reyes. Extiendo también mi dedicatoria a Tzitzi Alhelí Marín Juárez y agradezco su apoyo, su compañía y su cariño durante estos últimos 5 años. Es gracias a su apoyo, a su guía y a mi esfuerzo que he llegado hoy hasta aquí. INDICE. Introducción .................................................................................................................................................1 Antecedentes .............................................................................................................................................. 3 La respiración. ......................................................................................................................................... 3 Los centros respiratorios. ...................................................................................................................... 6 El Complejo Pre-Bötzinger. ................................................................................................................. 10 Respuesta respiratoria a la hipoxia. .................................................................................................. 11 EL Síndrome de Muerte Súbita del Lactante. .................................................................................. 12 Las células gliales. ............................................................................................................................... 14 La participación de las células gliales en el control respiratorio ................................................... 17 La participación de las células gliales en la respuesta inflamatoria dentro del SNC ................. 19 La microglía. .......................................................................................................................................... 20 Modelos de activación e inhibición de la microglía. ........................................................................ 25 Justificación ............................................................................................................................................... 30 Hipótesis. ................................................................................................................................................... 30 Objetivo General ....................................................................................................................................... 30 Objetivos particulares............................................................................................................................... 30 Materiales y métodos. .............................................................................................................................. 31 Animales. ............................................................................................................................................... 31 Registros in vivo .................................................................................................................................... 32 Registros In Vitro .................................................................................................................................. 34 Análisis de resultados. ......................................................................................................................... 37 Resultados ................................................................................................................................................. 37 Efecto de la inhibición y la activación microglial sobre los distintos patrones respiratorios de ratones neonatos. ................................................................................................................................. 37 Efecto de la inhibición y la activación microglial sobre los distintos patrones de actividad respiratoria del preBötC in vitro. ......................................................................................................... 42 Discusión. .................................................................................................................................................. 52 Conclusiónes ............................................................................................................................................. 56 1 Introducción La apnea y el síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL) son condiciones patológicas de riesgo considerable en la población neonatal (Mathew, 2010), lo que convierte a estos padecimientos en una preocupación médica de gran relevancia en la pediatría (Mathew, 2010; Herlenius, 2011). La apnea y el SMSL se exacerban con la exposición a factores ambientales como el humo de tabaco (Raza y Blackwell, 1999, Moon y Fu, 2007) o son más comunes en neonatos que presentan una regulación disminuida de la respuesta ventilatoria a la hipoxia (disminución de la presión parcial de oxigeno) y a la hipercapnia (aumento en la presión parcial de dióxido de carbono) (Raza y Blackwell, 1999; Herlenius, 2011). Diversos procesos infecciosos, particularmente en las vías respiratorias (Blackwell, 1999; Heininger, 2004; Moon y Fu, 2007; Greer, 2012; Neary et al., 2012), pueden inducir la manifestación de episodios de apnea y el SMSL (Raza y Blackwell, 1999; Hofstetter et al., 2007; Herlenius, 2011). Ante la presencia de un proceso infeccioso, el sistema inmunológico coordina, en conjunto con el sistema nervioso, respuestas adaptativas para hacer frente a la presencia de patógenos o daño tisular (Carson et al., 2006). Sin embargo, esta activación del sistema inmunológico puede también interferir con las funciones reguladas por el sistema nervioso autónomo, lo que afecta la termorregulación, la frecuencia cardíaca y/o la actividad respiratoria sobretodo en los neonatos (Guntheroth y Spiers, 2002; Stock et al., 2010; Herlenius, 2011; Neary et al., 2012). Los procesos infecciosos en otros sistemas del organismo pueden desencadenar procesos inmunológicos en el sistema nervioso central que son mediados principalmente por la microglía (Ashwell, 1991; Block et al., 2006; Graever, 2011; Balan et al, 2012; Chen et al, 2012). En condiciones fisiológicas, la microglía permanece en un “estado vigilante” que no produce citocinas o quimiocinas pro-inflamatorias (Nakamura, 1999; Wake et al., 2009; Kettenmann et al., 2011; Kim, 2012; Pocock y Kettenmann, 2007). Sin embargo, cuando un estímulo activa a la microglía, ésta comienza a producir citocinas y quimiocinas que inician un proceso inflamatorio que también puede involucrar la participación de otras células como los astrocitos o las mismas neuronas (Nakamura, 1999; Leonardo y Pennypacker, 2009; Kettenmann et al., 2011; Wake et al., 2009; Kim, 2012; Pocock y Kettenmann, 2007). La inflamación producida por la microglía puede afectar la actividad respiratoria, pues una de las principales citocinas que la microglía 2 produce cuando se activa, la interleucina 1β (IL-1β), afecta la generación de los distintos patrones respiratorios (Olsson et al., 2003; Hofstetter y Herlenius, 2005; Gresham et al., 2011). La IL-1β deprime particularmente la generación de los boqueos en roedores (Stoltenberg et al., 1994; Froen et al., 2000; Olsson et al., 2003; Hofstetter y Herlenius, 2005, Herlenius, 2011) y, por consecuencia, reduce la capacidad de autorresucitación de los animales tras un episodio de hipoxia (Stoltenberg et al., 1994; Froen et al., 2000; Olson et al., 2003; Hofstetter y Herlenius, 2005). La inhibición en la generación de los patrones respiratorios producida por la IL-1β, y quizá por otras citocinasa pro-inflamatorias, podría estar relacionada con varias condiciones patológicas pro-inflamatorias observadas en la clínica (Guntheroth y Spiers, 2002; Hofstetter et al., 2007; Moon y fu., 2007; Weber et al., 2008; Schuartz et al., 2009; Herlenius, 2011; Brigham et al., 2014). Por ejemplo, sujetos que padecen del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), muestran un incremento crónico en los niveles de varias citocinasa pro-inflamatorias, incluidas la interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral α (TNFα, por sus siglas en inglés), mismo que se asocia a la obstrucción de las vías aéreas (Brigham et al., 2014). Esta predisposición a la oclusión de las vías aéreas hace que los sujetoscon SIDA sean propensos a sufrir apnea obstructiva del sueño (AOS) (Brigham et al., 2014). La obesidad es otra condición donde se presenta inflamación crónica que se asocia con la AOS (Schuartz et al., 2009), ya que los adipocitos secretan citocinas como el TNFα, la IL-1β y la IL-6 (Schuartz et al., 2009). De manera relevante para la presente tesis, se ha reportado que las infecciones pueden preceder al SMSL (Guntheroth y Spiers, 2002; Hofstetter et al., 2007; Moon y Fu, 2007; Weber et al., 2008; Herlenius, 2011) y que una infección periférica puede desencadenar procesos inflamatorios en el SNC (Balan et al., 2012), a través de la activación de la microglía que libera varias citocinas pro-inflamatorias, incluida la IL-1β, directamente en el SNC (Balan et al., 2012). Adicionalmente, la expresión de la IL-6 y su receptor se ha correlacionado con la aparición del SMSL en sujetos que cursaron con una infección (Rognum et al., 2009). Una infección periférica puede activar a la microglía e inducir una respuesta inflamatoria que pudiera deprimir la actividad respiratoria, por lo que se consideró relevante determinar en esta tesis si la activación o la inhibición de la microglía afectan la generación de los ritmos respiratorios. 3 Antecedentes La respiración. En muchos organismos, la captación de oxígeno (O2) y la eliminación de dióxido de carbono (CO2) se lleva a cabo a través de un proceso fisiológico denominado respiración pulmonar (Pino y Río, 2010). Durante la respiración pulmonar se intercambian O2 y CO2 entre el medio externo y el medio interno del organismo mediante la renovación del aire en los alveolos pulmonares (Cruz y Moreno, 2002). La ventilación de los pulmones se realiza por la contracción y la relajación rítmica y alternada de diferentes músculos respiratorios (Richter et al., 1999; Hilaire y Pásaro, 2003), que se enlistan a continuación (Figura 1): Diafragma. Es un músculo en forma de bóveda que separa la cavidad torácica de la abdominal. La contracción de este músculo es directamente responsable de la expansión de los pulmones y de la entrada de aire a los mismos (Hilaire y Pásaro, 2003). Músculos accesorios. Incluyen a los músculos intercostales internos y externos, los músculos escalenos, los costales elevadores y los abdominales. Su acción coadyuva a la del diafragma, lo que hace más eficiente la expansión de los pulmones, sobre todo durante la espiración activa (Hilaire y Pásaro, 2003). Músculos de las vías aéreas superiores. Son los músculos de la laringe y la faringe que controlan la apertura y el cierre rítmico de estas vías (Hilaire y Pásaro, 2003). 4 Figura 1. Los músculos respiratorios. Se muestran los músculos respiratorios localizados en la caja torácica y la pared abdominal. De lado derecho se identifican a los músculos espiratorios y del lado izquierdo a los músculos inspiratorios. (Modificado de Mulroney et al., 2009) La ventilación pulmonar se lleva a cabo en tres fases, que en conjunto componen al ciclo respiratorio (Hají et al., 2000; Hilaire, 2003). Estas fases son: La inspiración. Involucra la contracción del diafragma y de otros músculos inspiratorios de la caja torácica que, como consecuencia, induce la expansión de los pulmones. La post-inspiración. Durante esta fase los músculos inspiratorios dejan de contraerse de manera progresiva mientras que los músculos espiratorios de la faringe se contraen para controlar el flujo de aire fuera de los pulmones. La espiración. Normalmente esta fase es pasiva, pero en condiciones de hiperventilación los músculos intercostales y abdominales espiratorios se contraen activamente para aumentar la eficiencia de la salida de aire de los pulmones (Haji et al., 2000; Hilaire, 2003). La respiración no se limita a ser una sucesión regular de fases inspiratorias y espiratorias (Pino y Río, 2010). Muchas de las actividades cotidianas como hablar, reír, llorar, bostezar, Diafragma 5 toser, estornudar, beber o comer modifican el patrón respiratorio y precisan de una regulación de este ritmo que facilite la realización de las mismas (Hilaire y Pásaro, 2003; Pino y Río, 2010). La generación de la respiración, así como las modificaciones que este ritmo experimenta bajo distintas circunstancias fisiológicas y conductuales, son mediadas por mecanismos complejos de generación y control, constituidos por receptores centrales y periféricos, por un entramado complejo de vías nerviosas, por centros integradores localizados en el cerebro, el tallo cerebral y la médula espinal; así como por un generador de los ritmos respiratorios (Berger et al., 1977; Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong-Riley y Liu, 2005). Este sistema de generación y regulación de la respiración se considera, de modo simplificado, como una organización formada por tres componentes que se enumeran a continuación (Figura 2): Un "controlador", constituido por circuitos neuronales que se localizan en el tallo cerebral. La actividad generada por el controlador se modula integrando señales que provienen de los “sensores” periféricos y centrales (Berger et al., 1977; Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong-Riley y Liu, 2005). Los "efectores" (pulmones, vías aéreas y músculos respiratorios), que ejecutan los comandos que emite el controlador (Berger et al., 1977; Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong-Riley y Liu, 2005). Los "sensores" (cuerpos carotideos, quimiorreceptores periféricos y centrales así como los receptores de estiramiento pulmonar) (Berger et al., 1977; Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong-Riley y Liu, 2005), que censan constantemente la eficacia de la respiración y envían señales al controlador si es requerido un ajuste en la función (Berger et al., 1977; Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong- Riley y Liu, 2005). El sistema de control de la respiración se adapta a cambios en la oxigenación y en el pH, para minimizar el desbalance en los gases sanguíneos durante el ejercicio, el sueño o ante determinadas enfermedades (Pino y Río, 2010; Feldman et al., 2013). Sin embargo, cuando la homeostasis respiratoria rebasa su límite, sobreviene alguna forma de disnea (dificultad para respirar) (Pino y Río, 2010). El controlador del sistema respiratorio está constituido por circuitos neuronales en el tallo cerebral, denominados centros respiratorios, que mantienen la homeostasis respiratoria al generar los comandos motores que dan lugar a los distintos patrones respiratorios (Richter y Spyer, 2001; Feldman et al., 2003; Wong-Riley y Liu, 2005). 6 Figura 2. El sistema de control respiratorio. El componente autónomo de la respiración se genera en circuitos zlocalizados dentro del tallo cerebral. Las señales recibidas desde los propioceptores y los quimiorreceptores en los órganos relacionados con la respiración pueden modular la actividad de estos circuitos respiratorios y generar patrones de actividad diferentes. El componente de control voluntario de la respiración es importante pues la respiración es una actividad inconsciente que, sin embargo, puede modularse de forma consciente, como cuando contenemos el aliento (tomado de Pino y Río, 2010). Los centros respiratorios. Las estructuras del SNC relacionadas con la generación y el control de la respiración son el bulbo raquídeo, el puente, la formación reticular, los “centros superiores” (p.e., la corteza cerebral) y la médula espinal (Pino y Río, 2010). Las neuronas localizadas en el tallo cerebral regulan el componente autónomo de la respiración, mientras que la corteza cerebral es la responsable de la modulación voluntaria de la respiración (Long y Duffin, 1986). Un grupo de neuronas respiratorias localizadas en el asta ventral de la médula espinal integra la información eferente enviada porlos centros respiratorios y la información aferente de los receptores periféricos para generar las señales que producen la contracción de los músculos respiratorios (Berger et al., 1977, Hilaire, 2003). ´ ´ ´ 7 El ritmo respiratorio puede ser modulado por el sistema reticular activador (SRA), constituido por las neuronas de la formación reticular que se extienden desde la médula espinal cervical superior hasta el diencéfalo en la porción medial del tallo cerebral (Berger et al., 1977; Cohen, 1981; Murray, 1986; Lorier et al., 2007). El SRA modula la actividad respiratoria dependiendo de las transiciones del ciclo sueño-vigilia (Orem et al., 1980). En el diencéfalo y el mesencéfalo también se han localizado neuronas con actividad respiratoria, que parecen coordinar la ventilación con las respuestas locomotoras y autónomas tales como la deglución (Cohen, 1981). Ya se mencionó que actividades como hablar, gritar, ingerir o reír causan cambios en la ventilación (Murray, 1986). Por ejemplo, durante la fonación disminuye la sensibilidad al CO2, por lo que se toleran concentraciones mayores de este gas en la sangre (Murray, 1986). Este tipo de control relacionado con una conducta voluntaria radica en la corteza cerebral, pues se ha podido comprobar que la estimulación de algunas zonas de la corteza inhibe los movimientos respiratorios, mientras que la estimulación de otras áreas de la corteza incrementa la frecuencia respiratoria (Aminoff y Sears, 1971). Los circuitos neuronales que generan la respiración se encuentran en el tallo cerebral distribuidos en tres áreas principalmente (Figura 3). En el puente, la mayoría de las neuronas respiratorias se localizan en la región dorsolateral rostral pontina que se denominan, en conjunto, grupo respiratorio pontino (GRP) (Wong-Riley y Liu, 2005). El GRP está constituido por el núcleo parabraquial medial y el núcleo de Kölliker-Fuse (Wong-Riley y Liu, 2005). Los núcleos respiratorios pontinos reciben información de la médula espinal y están involucrados en el control motor del diafragma, la vocalización, y el control de los músculos de las vías aéreas durante el ejercicio y el sueño (Wong-Riley y Liu, 2005). Las neuronas inspiratorias del grupo respiratorio pontino presentan un patrón de actividad similar a la de las del bulbo raquídeo (Cohen, 1981; Long y Duffin, 1986; Cherniack, 1980). La actividad de las neuronas inspiratorias del grupo respiratorio pontino se ha relacionado con la duración de las distintas fases del ciclo respiratorio y con la frecuencia del mismo (Long y Duffin, 1986). Todos los centros del puente presentan conexiones bilaterales con el grupo respiratorio ventral (GRV) y el grupo respiratorio dorsal (GRD) que constituyen las neuronas respiratorias del bulbo raquídeo (Kalia, 1981; Cohen, 1981; Long y Duffin, 1986). El GRD se constituye por una concentración bilateral de neuronas predominantemente inspiratorias, que se localizan en el límite dorsal del bulbo raquídeo y que se integran en el 8 núcleo del tracto solitario (NTS) (Cohen, 1981; Long y Duffin, 1986; St-John et al., 2009). Los nervios frénicos se componen de los axones de las motoneuronas que inervan al diafragma y qie trasmiten el comando motor que produce la contracción rítmica de este músculo y que también establecen comunicación con el NTS (Hilaire et al., 1990; Wong-Riley y Liu, 2005), para modular la contracción del diafragma en respuesta a los cambios en el medio interno que ocurren durante diferentes estados conductuales como, por ejemplo, el esfuerzo físico (Streeter y Baker-Herman, 2014). La información de retroalimentación aferente de los quimiorreceptores periféricos, como los cuerpos carotideos, ingresa al GRD a través del nervio vago y del nervio glosofaríngeo (Wong-Riley y Liu, 2005). Esta información que viaja por aferencias vagales permite modificar la actividad respiratoria en respuesta a modificaciones en los niveles de sanguíneos de O2 y CO2, a tal grado que pueden inducir un cambio en el patrón respiratorio (Wong-Riley y Liu, 2005; Streeter y Baker-Herman, 2014). Las neuronas inspiratorias del GRD se clasifican en aquellas que se excitan con la insuflación pulmonar (ingreso de aire a los pulmones) (Iß) y aquellas que se inhiben con este mismo estímulo (Iα) (Feldman et al., 1976). Una subpoblación de neuronas Iα, llamadas neuronas de descarga tardía, se relaciona con el final de la fase inspiratoria (Cohen y Feldman, 1977). Un tercer tipo de neuronas inspiratorias del GRD es el integrado por las neuronas P o de despolarización "en rampa" (Shannon, 1980), que intervienen en los reflejos de la vías aéreas y en la facilitación de la fase espiratoria (Shannon, 1980). Finalmente, sólo un 5% de las neuronas del GRD tienen un patrón de descarga espiratorio (Cohen, 1981). El grupo respiratorio ventral (GRV) corresponde a una columna longitudinal bilateral localizada en la región ventrolateral del bulbo raquídeo (Taylor et al., 1978), misma que se extiende desde el nivel de la primera raíz cervical hasta alcanzar la línea media del puente (Taylor et al., 1978). Las neuronas inspiratorias del GRV se pueden dividir en neuronas Iγ (que se corresponden con las neuronas Iα del GRD) y en neuronas Iδ, o de descarga precoz, que están relacionadas con el inicio de la inspiración (Mitchel, 1977). Funcionalmente, el GRV puede dividirse en el grupo respiratorio ventral rostral (GRVr) y el grupo respiratorio ventral caudal (GRVc) (Wong-Riley y Liu, 2005). El GRVr incluye al complejo Bötzinger (CB), al complejo pre-Bötzinger (preBötC), y al grupo respiratorio parafacial (GRpF) (Wong-Riley y Liu, 2005). El CB contiene neuronas espiratorias inhibidoras, mientras que el preBötC y el GRpF se consideran como los centros generadores de la respiración (Onimaru et al., 1988). El preBötC es el generador de los ritmos inspiratorios (Smith et al., 1991), mientras que el 9 GRpF participa de la generación de la espiración activa (Peña, 2009). El GRVc se conforma principalmente por el núcleo retroambiguo (NRA) y contiene principalmente neuronas que favorecen la espiración (Peña, 2009). Desde el núcleo ambiguo se proyectan vías que se dirigen a las motoneuronas inspiratorias y espiratorias de los músculos intercostales y abdominales (Kalia, 1981). Por su parte, los axones de las neuronas del núcleo retroambiguo se dirigen a las motoneuronas que controlan varios músculos accesorios (Murray, 1986), lo que regula el paso del aire desde las vías aéreas superiores (Murray, 1986). Otras áreas relacionadas con la regulación de la respiración incluyen al cerebelo (Harper, 2000a; Harper et al., 2000b), la neocorteza (Davenport et al., 2010; Von Leupoldt et al., 2010) y la materia gris periacueductal (Subramanian y Holstege, 2010). Como ya se mencionó, estas estructuras son importantes para la integración de varios comandos motores no- respiratorios con la respiración misma (Subramanian y Holstege, 2010). Figura 3. Los centros respiratorios. Representación esquemática de la localización de los centros respiratorios presentes en los mamíferos. La sección transversal (izquierda) muestra una vista a nivel del obex. Abreviaciones: nA, núcleo ambiguo; nVII, nucleo facial; nXII, núcleo hipogloso; nTS, núcleo del tracto solitario; DRG, grupo respiratorio dorsal; PRG Grupo respiratorio pontino; RVLM médula rostral ventral; pFRG, grupo para-facial respiratorio; VRG, grupo respiratorio ventral; CD4, segmento correspondiente de la médula espinal. (Modificado de Duffin 2004). Vista dorsal. 10 El Complejo Pre-Bötzinger. En 1991 Smith et al. publicaron un trabajo donde se delimitó una región dentro del bulbo raquídeo que mostró ser necesaria y suficiente para la generación del ritmo respiratorio y que corresponde al complejo pre-Bötzinger (preBötC; Smith et al., 1991). Se ha determinadoque el preBötC es necesario para la generación del ritmo respiratorio pues lesionarlo deprime o elimina la actividad rítmica relacionada a la respiración in vitro (Smith et al., 1991; Ramírez et al., 1998; Gray et al., 1999; Lieske et al., 2000; Smith, 2001) e in vivo (Gray et al., 2001; McKay et al., 2005; Ramírez et al., 1998; Tan et al., 2008). Por otro lado, el carácter de suficiencia del preBötC como generador de la respiración se ha determinado aislando al preBötC en una preparación in vitro, llamada “isla”, que contiene sólo a este circuito y que genera la actividad rítmica relacionada con la respiración (Johnson et al., 2001; Tryba et al., 2008; Ramírez-Jarquín et al., 2012). Dependiendo de las condiciones de oxigenación, el preBötC es capaz de generar patrones de actividad respiratoria diferentes que se corresponden con distintas modalidades de la respiración (Figura 4; Lieske et al, 2000). En condiciones basales de oxigenación (normoxia), el preBötC genera la eupnea que corresponde a la respiración normal y que se caracteriza por un ascenso y descenso lento en la descarga eléctrica poblacional que produce un patrón en la señal integrada en forma de campana (Figura 4; Lieske et al, 2000). Además de la eupnea, durante la normoxia se generan los suspiros que se caracterizan por una inspiración sostenida de mayor amplitud que la eupnea y que presentan una forma bifásica que, típicamente, esta seguida por un periodo de inactividad breve denominado apnea post- suspiro (Lieske et al, 2000; Figura 4A). En condiciones de hipoxia prolongada, el preBötC es capaz de reconfigurarse y generar un tercer ritmo respiratorio, llamado boqueo que se caracteriza por una ráfaga poblacional de inicio súbito y que es de menor duración, mayor amplitud y menor frecuencia comparada con la eupnea (Figura 4; Lieske et al, 2000). Los boqueos son esenciales para el proceso de autorresucitación pues mantienen la apertura de las vías respiratorias aún en condiciones de baja oxigenación (Fewell et al., 2000; Gozal et al., 2004). El proceso de autorresucitación es un mecanismo de supervivencia que permite la recuperación de las funciones vitales del organismo una vez que se recupera el aporte de oxígeno (Erickson y Sposato, 2009). Fallas en la generación de los boqueos y, por 11 consiguiente, en la capacidad de autorresucitación están relacionadas con el SMSL (Hunt, 1992; Poets, 1999; Harper 2000; Gozal, 2004). Figura 4. Patrones de actividad del complejo pre-Bötzinger (preBötC) A) Trazo representativo del registro electrofisiológico del preBötC en condiciones de normoxia. Se muestran una serie de ráfagas monofásicas correspondientes a la eupnea. Se observa también una ráfaga bifásica que corresponde a un suspiro. Al suspiro, le sigue un periodo silente característico denominado apnea post-suspiro. B) Detalle de los patrones de actividad correspondientes a la eupnea (izquierda) y al boqueo (derecha). En condiciones normales de oxigenación la activación paulatina de las neuronas inspiratorias determina la forma de campana de la ráfaga correspondiente a la eupnea. Durante la hipoxia la duración de la ráfaga y el tiempo de subida de la misma se reducen y el patrón de actividad cambia a boqueos. (Modificado de Lieske et al., 2000). Respuesta respiratoria a la hipoxia. Los organismos modifican su comportamiento y/o su fisiología ante condiciones adversas como un mecanismo de preservación (Rossen et al., 1943; Bachevalier y Meunier, 1996). En condiciones de hipoxia, las funciones cerebrales no esenciales para la supervivencia como la conciencia y la conducta dirigida se inhiben (Rossen et al., 1943; Bachevalier y Meunier, 1996; Peña y Ramírez 2005), mientras que aquellas funciones que sí son esenciales para la supervivencia como la respiración se mantienen (Peña y Ramírez, 2005; Ramírez et al., 2007). Esta adaptación fisiológica es el resultado de una coordinación compleja, que involucra la reorganización y bloqueo parcial de diferentes circuitos neuronales que se complementa con una reconfiguración a nivel celular (Luhman y Heinemann, 1992; Young y 12 Somjen, 1992; Peña et al., 2004; Ramírez et al., 2004). Esta reorganización funcional de los circuitos neuronales en la hipoxia se genera por la necesidad de reducir los requerimientos de O2, para prevenir el daño celular en los diferentes circuitos neuronales (Ramírez et al., 2007) y para mantener la integridad funcional del organismo (Ramírez y Peña, 2005; Ramírez et al., 2007). En los mamíferos, la respuesta respiratoria a la hipoxia consta de dos fases (Richter et al., 1991; Haddad y Jiang, 1993; Maxová y Vízek, 2001). En la primera fase de la respuesta respiratoria a la hipoxia se observa una aceleración de la respiración asociada a un incremento en la amplitud de la actividad respiratoria. En la segunda fase de la respuesta respiratoria a la hipoxia se presenta una depresión de la frecuencia del ritmo y de la amplitud de la actividad respiratoria que precede a la generación de los boqueos (Lieske et al., 2000; Peña y Ramírez, 2005; Ramírez et al., 2007; Peña et al., 2007; Peña et al., 2008; Ramírez-Jarquín et al., 2012). De prolongarse demasiado el periodo de hipoxia, los boqueos cesan y el organismo muere por apnea hipóxica (Lieske et al., 2000; Peña y Ramírez, 2005; Ramírez et al., 2007; Ramírez-Jarquín et al., 2012). Esta misma respuesta bifásica a la hipoxia se observa en rebanadas de bulbo raquídeo que contienen al preBötC (Telgkamp y Ramírez, 2000; Peña et al., 2004), lo que evidencia que la respuesta respiratoria a la hipoxia es generada directamente por este circuito (Mironov et al., 1998; Telgkamp y Ramírez, 1999; Lieske et al., 2000; Thoby-Brisson y Ramírez, 2000; Peña et al., 2004). El estudio de los mecanismos involucrados en la generación de los boqueos tiene relevancia no sólo desde el punto de vista básico, sino también en el campo clínico pues el SMLS se ha relacionado con una disminución en la generación de los boqueos y la autorresucitación (Poets et al., 1999; Hunt, 2001; Erickson y Sposato, 2009; Herlenius, 2011). EL Síndrome de Muerte Súbita del Lactante. El síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL) se define como “la muerte repentina de un infante dentro de su primer año de vida, que se mantiene sin causa aparente tras realizar la autopsia. Dicha muerte no está relacionada con ningún registro patológico en el historial médico y no puede relacionarse con factor alguno tras el análisis de la escena de la muerte” (Moon y Fu, 2007; Rognum et al., 2009; Neary et al., 2012). Este síndrome es la causa principal de muerte durante el primer año de vida en países desarrollados (Neary et al., 2012) y presenta una incidencia de 0.53 casos por cada 1000 nacimientos (Neary et al., 2012). Los 13 factores principales de riesgo asociados al SMSL incluyen condiciones que influencian el nivel de ventilación y la calidad del aire que respira el infante (Roche, 2003; Moon y Fu, 2007; Rognum et al., 2009). Estas condiciones incluyen la posición en la que se encuentra el infante mientras duerme (Moon y Fu, 2007; Rognum et al., 2009), algunos desórdenes respiratorios como la apnea obstructiva del sueño (Moon y Fu, 2007), la altitud del lugar donde la familia del infante reside (Moon y Fu, 2007), así como la exposición al humo del tabaco (Moon y Fu, 2007; Rognum et al., 2009). La conjunción de alguno o varios de estos elementos con un infante susceptible favorece la generación de apneas repetitivas y, eventualmente, el SMSL (Roche, 2003). La apnea es el periodo caracterizado por la ausencia de flujo inspiratorio que tiene una duración de al menos 10 segundos (Iber, 2005). Como se mencionó anteriormente, existen diversos factores de riesgo que pueden contribuir a la patogénesis del SMSL (Neary et al., 2012). Uno de ellos, es la posición del infante al dormir(Neary et al., 2012) pues la posición decúbito prono o la de costado comprometen la ventilación de las vías aéreas superiores del infante y aumenta la probabilidad de generar condiciones de hipoxia (Neary et al., 2012). En este mismo sentido, otros factores de riesgo para el SMSL son aquéllos relacionados con la disminución de la oxigenación del aire que respira el infante (Raza y Blackwell, 1999; Neary et al., 2012). Entre estos factores se encuentra la exposición al humo de tabaco y la altitud respecto del nivel del mar del lugar de residencia del infante (Raza y Blackwell, 1999; Neary et al., 2012). De relevancia para esta tesis, se ha documentado que los procesos infecciosos, y la inflamación asociada a los mismos, son factores de riesgo para sufrir SMSL (Herlenius, 2011). De hecho, se ha sugerido que la inflamación disminuye la resistencia de los organismos a las condiciones de hipoxia (Erickson y Sposato, 2009; Herlenius, 2011) y favorece la aparición de apneas (Fanaroff, 1998; Erickson y Sposato, 2009). Más específicamente, la inflamación asociada a una infección deprime la capacidad de generar boqueos y la autorresucitación en animales neonatos (Hofstetter y Herlenius, 2005; Hofstetter et al., 2007; Paterson et al., 2009; Herlenius, 2011). Relacionado a lo anterior, se ha documentado que la inflamación asociada a infecciones contribuye a la patogénesis del SMSL a través de la depresión de la generación de boqueos y la autorresucitación (Hofstetter y Herlenius, 2005; Hofstetter, 2007; Paterson et al., 2009; Herlenius, 2011). Es importante mencionar que los procesos infecciosos a nivel periférico generan una respuesta inflamatoria en el SNC y que esta inflamación central altera los patrones normales de respiración en roedores (Balan et al., 2012). Durante un proceso inflamatorio la microglía se torna reactiva y libera citocinas pro-inflamatorias y quimiocinas 14 (Leonardo y Pennypacker, 2009; Dantzer, 2001). Entre estas citocinasa se encuentra la IL-1β que es capaz de deprimir, por sí misma, la generación de los boqueos y la autorresucitación (Hofstetter y Herlenius, 2005; Paterson et al., 2009; Herlenius, 2011). Dado que la fuente principal de IL-1β es la microglía (Dantzer, 2001), aunque también puede ser liberada por los astrocitos (Dantzer, 2001), podemos proponer que los procesos infecciosos periféricos activan a la microglía dentro del SNC y que esta microglía activa libera citocinas pro- inflamatorias como la IL-1β que afectan la actividad respiratoria (Hofstetter y Herlenius, 2005; Paterson et al., 2009; Herlenius, 2011). Las células gliales. La glía es el grupo celular más abundante del sistema nervioso de los seres humanos (Allen y Barres, 2009). Este tipo celular fue descubierto por Rudolf Virchow en 1858 y, durante más de un siglo, se planteó que solo constituían un elemento estructural y pasivo en el que las neuronas se encontraban embebidas. A finales del siglo pasado y durante los años que han transcurrido de éste, numerosos trabajos han demostrado que la glía no solo cumple con funciones de sostén físico (Nave y Trapp, 2008) sino que tiene funciones metabólicas (Gourine y Kasparov, 2011, Mamczur et al., 2014) y que participa activamente en procesos tan importantes como el establecimiento y función de redes neuronales (Del Bigio, 2010; Young et al., 2013; Clarke y Barres, 2013), el aprendizaje y la memoria (Parkhurs et al., 2013; Blank et al., 2014, López-Hidalgo et al., 2012), el desarrollo de habilidades sociales (Morgan et al., 2010; Chen et al., 2010) e incluso la respiración (Hülsmann et al., 2000; Gourine et al., 2010; Erlichman et al, 2010; Balan et al., 2012; Rivera-Angulo y Peña-Ortega, 2014). La glía es un grupo heterogéneo de células con morfología y funciones diversas que se ubican en el SNC o en el SNP (Allen y Barres, 2009), por lo que se les puede dividir en glía central y periférica (Jessen, 2004). Los cuatro tipos gliales generales del SNC comprenden: a) Oligodendroglía, incluye a los oligodendrocitos en el SNC y a las células de Schwann en el sistema nervioso periférico. Los oligodendrocitos y las células de Schwann se encargan de producir la mielina, que recubre los axones de las neuronas en estructuras que se conocen 15 como vainas de mielina (Jessen, 2004). Las vainas de mielina permiten una conducción rápida del potencial de acción (Jessen, 2004; Young et al., 2013). b) Glía NG2, constituye aproximadamente el 5% del total de las células nerviosas presentes durante el desarrollo y en el cerebro adulto (Bergles et al., 2010). Esta glía recibe contactos sinápticos, por lo que es un elemento postsináptico adicional al neuronal (Bergles et al., 2010). Al igual que las neuronas, presenta fenómenos de plasticidad sináptica como la LTP (Ge et al., 2006). c) La astroglía, incluye la glía radial como la de Müller y la de Bergmann, los astrocitos y la glía ependimal. Los astrocitos son el componente más numeroso de la glía central (Uliasz et al., 2012) y se distribuyen homogéneamente en el cerebro y en la médula espinal (Uliasz et al., 2012). Virchow describió la función estructural de estas células, que es innegable, pero hoy también se sabe que son de gran importancia para mantener las condiciones homeostáticas del sistema nervioso (Allen y Barres, 2009; Uliasz et al., 2012), pues proporcionan el entorno fisiológico bajo el cual las neuronas funcionan (Allen y Barres, 2009; Uliasz et al., 2012). A través de sus numerosos procesos, los astrocitos forman asociaciones con los vasos sanguíneos y las neuronas y, esta asociación habilita a los astrocitos para controlar el flujo sanguíneo en función de la actividad neuronal (Haydon y Carmignoto, 2006), lo que aumenta el suministro de oxígeno y de glucosa a las regiones activas del cerebro (Haydon y Carmignoto, 2006). Los astrocitos pueden transportar la glucosa y el oxígeno desde la sangre a las neuronas (Nave y Trapp, 2008) y pueden transformar la glucosa en lactato (Nave y Trapp, 2008; Zorec et al., 2012 Parpura y Verkhratsky, 2012). Este lactato producido por los astrocitos puede ser exportado a las neuronas (Nave y Trapp, 2008; Zorec et al., 2012 Parpura y Verkhratsky, 2012), que lo convierten en piruvato que se incorpora al ciclo de Krebs y promueve la generación de ATP (Nave y Trapp, 2008; Zorec et al., 2012 Parpura y Verkhratsky, 2012). Los astrocitos también regulan la transmisión glutamatérgica, pues tienen transportadores de glutamato que capturan este neurotransmisor (Nave y Trapp, 2008). El glutamato recapturado por los astrocitos es convertido en glutamina que es exportada a las neuronas (Nave y Trapp, 2008), que a su vez la utilizan para sintetizar glutamato de nuevo (Nave y Trapp, 2008). Las células ependimales son células ciliadas que recubren la pared de los ventrículos en el SNC (Joly et al., 2007; Bystron et al., 2008), extendiéndose desde los ventrículos laterales del encéfalo y hasta el filum terminale en la médula espinal (Joly et al., 2007; Bystron et al., 16 2008). Las células del plexo coroideo filtran suero de la sangre (Joly et al., 2007) y producen un ultrafiltrado que es secretado como líquido cefalorraquídeo (LCR) al interior del sistema ventricular (Joly et al., 2007). En los ventrículos, las células ependimales movilizan el LCR a través de la agitación de sus cilios (Joly et al., 2007; Bystron et al., 2008). Se piensa también que las células ependimales protegen y dan mantenimiento a la zona subventricular adyacente durante el desarrollo embrionario (Del Bigio, 2010) y que estas células también son responsables de la preservación de las zonas neurogénicas a lo largo de la vida del organismo (Del Bigio, 2010). Las células de Müller son el componente glial principal de la retina (Goldman; 2014). Estas células regulan el transporte transcelular de iones y agua, lo que mantienela homeostasis y la integridad de la retina (Reichenbach y Bringmann, 2013). Las células de Müller pueden regular la permeabilidad de la barrera hematorretiniana (Reichenbach y Bringmann, 2013), al controlar la composición de fluido extracelular en la retina (Reichenbach y Bringmann, 2013). Además, las células de Müller proveen de soporte metabólico (Reichenbach y Bringmann, 2013) y antioxidante a los fotoreceptores y a las neuronas de la retina (Reichenbach y Bringmann, 2013). La glía de Bergmann es un tipo celular que se encuentra solo en el cerebelo, da origen a diferentes tipos celulares y provee de una guía de migración a otras células como las células granulares (Buffo y Rossi, 2013). La glía de Bergmann direcciona la elongación de los axones y dendritas de las neuronas y se piensa que participa en el establecimiento de la forma del árbol dendrítico de las células de Purkinje a través de contactos de los procesos dendríticos con las fibras de Bergmann (Buffo y Rossi, 2013). d) La microglía comprende un grupo de células de origen mesodérmico que colonizan el SNC en etapas tempranas del desarrollo embrionario (Ashwell et al., 1991) y que se establecen ahí para formar una población glial residente (Ashwell et al., 1991; Parkhurst y Gan, 2010). Clásicamente, la función de la microglía se relaciona con la inmunidad innata del SNC (Hutchins et al., 1990; Ashwell et al., 1991; Esiri et al., 1991; Geny et al., 1995; Rezaie y Male, 1999), por lo que se le ha asociado con procesos patológicos (Ashwell et al., 1991; Hutchins et al., 1990; Esiri et al., 1991; Geny et al., 1995; Rezaie y Male, 1999). Sin embargo, hoy se sabe que, al igual que los astrocitos, la microglía también se encarga de mantener la homeostasis del sistema nervioso bajo condiciones fisiológicas (Tremblay et al., 2011; Paolicelli et al, 2011; Miyamoto et al., 2013; Zhan et al., 2014; Gomez-Nicola y Perry, 2014) y 17 es responsable de procesos importantes para el desarrollo del SNC (Paolicelli et al, 2011; Miyamoto et al., 2013; Zhan et al., 2014; Gomez-Nicola y Perry, 2014). Dada la importancia de la microglía para este trabajo, se proveerá más información acerca de estas células en el apartado de “La microglia.” La participación de las células gliales en el control respiratorio Además de las neuronas que forman parte de los diferentes grupos respiratorios, se sabe que las células gliales presentes en estos circuitos pueden participar en el control de la respiración (Gourine et al., 2010; Ballanyi et al., 2010; Gourine y Kasparov, 2011; Schnell et al., 2011; Kasparov, 2011; Mulkey y Wenker, 2011; Mitterauer, 2011; Okada et al., 2012; Kasymov et al., 2013). La glía, particularmente los astrocitos, puede controlar la actividad de las redes neuronales respiratorias a través de la liberación de gliotransmisores tales como el glutamato, el ATP y d-serina (Haydon y Carmignoto, 2006; He y Sun, 2007; Huxtable, 2010). La glía es necesaria para el mantenimiento de la actividad del circuito respiratorio (Hülsmann et al., 2000). Los astrocitos de las áreas quimiorreceptoras en el tallo cerebral son altamente sensibles a los cambios químicos (Gourine et al., 2010). Dehecho, una disminución en el pH induce un incremento en la concentración intracelular de Ca2+ en los astrocitos y provoca la liberación de ATP (Gourine et al., 2010). El ATP liberado por los astrocitos despolariza la neuronas en el área ventral del tallo cerebral, donde se encuentra el grupo respiratorio ventral, lo que induce un incremento en la frecuencia respiratoria (Gourine et al., 2010). Los incrementos de calcio intracelular en los astrocitos son pulsátiles (Mitterauer; 2007; Mitterauer; 2011) y se piensa que estos pulsos de calcio y el incremento en la excitabilidad de las neuronas producido por la liberación de ATP, podrían ser esenciales para mantener la actividad de las neuronas marcapaso de la respiración (Gourine et al., 2010; Mitterauer; 2011). Se ha determinado que dentro del GRV existen neuronas respiratorias con propiedades marcapaso (Peña y Ramirez, 2004) y que estas neuronas son necesarias para la generación de los distintos ritmos respiratorios (Peña y Ramirez, 2004). Varios tipos de neuronas marcapaso son influenciadas tónicamente por el sistema serotoninérgico (Peña y Ramirez, 2004; Mitterauer; 2011), por lo que el bloqueo de esta modulación causa severas alteraciones en los ritmos generados por los circuitos en los que estas neuronas marcapaso se encuentran (Peña y Ramirez, 2004; Mitterauer; 2011). Lo anterior puede ser fatal durante 18 etapas tempranas del desarrollo posnatal, pues la actividad marcapaso es vital para el mantenimiento de la homeostasis de funciones autónomas incluida la respiración (Tryba et al., 2006; Mitterauer; 2011). Las investigaciones sobre la fisiopatología del SMSL se han enfocado en encontrar alteraciones en el funcionamiento de las neuronas respiratorias (Luhman y Heinemann, 1992; Young y Somjen, 1992; Peña et al., 2004). Sin embargo, debe expandirse esta campo de investigación al impacto de las alteraciones en el funcionamiento de la glía en la patogénesis del SMSL. En el tallo cerebral, alteraciones en los astrocitos que modulan la actividad de neuronas marcapasos pueden deteriorar la generación de los ritmos cardio-respiratorios (Mitterauer et al., 2000; Mitterauer; 2007), lo que señalaría una posible implicación de estas alteraciones en la patogénesis del SMSL (Mitterauer et al., 2000). La transmisión purinérgica, mediada por los astrocitos en los centros respiratorios, contribuye a la homeostasis de la respuesta ventilatoria (Gourine et al., 2003; Gourine et al., 2005 Lorier et al., 2008; Huxtable, 2010) y la hipoxia es capaz de inducir la liberación astrocítica de ATP en los centros respiratorios (Gourine et al., 2003; Gourine et al., 2005). Esta liberación de ATP, producida por la hipoxia, activa a receptores purinérgicos tipo II y atenúa la depresión ventilatoria durante la hipoxia (Gourine et al., 2003; Gourine et al., 2005; Huxtable, 2010). La atenuación de la depresión ventilatoria durante la hipoxia es un evento fisiológico muy relevante pues un incremento en la depresión ventilatoria puede ser letal en bebés recién nacidos y/o prematuros (Peña, 2009). La transmisión purinérgica establece una vía de comunicación por medio de la cual, neuronas, astrocitos y microglía pueden modularse mutuamente (Lauro et al., 2010; Pascual et al, 2012). La microglía puede responder a la liberación ATP y adenosina (Orr et al, 2009; Gourine et al., 2010) y, una vez activada por el ATP, la microglía puede liberar también ATP, adenosina y otras sustancias que pueden modular la actividad de las neuronas y otras células gliales como los astrocitos (Lorier et al., 2008; Huxtable, 2010; Lauro et al., 2010; Pascual et al., 2012). Adicionalmente, el ATP liberado al medio extracelular por los atrocitos produce un efecto quimiotáctico que induce la movilización de los procesos de la microglia (Davalos et al., 2005). En el GRV, la liberación de sustancias como el BDNF, la PGE2 y/o los opioides endógenos, que pueden tener origen microglial, pueden modular la actividad respiratoria (Feldman y del Negro, 2006; Ballanyi et al., 2010). Interesantemente, el BDNF liberado por la microglía puede aumentar las corrientes de calcio de las neuronas del hasta dorsal en cultivos organotípicos de médula espinal (Lu et al, 2009). Se sabe también que, en 19 rebanadas que contienen al generador de la respiración, el BDNF estimula la actividad del preBötC (Bouvier et al., 2008). De hecho, alteraciones en la liberación de BDNF por la microglía se podrían relacionar con patologías respiratorias como las observadas en sujetos con el síndrome de Rett (Bouvier et al., 2008). Otra sustancia liberada por la microglía es la prostaglandina E2, la cual se sabe estimulaal generador de la respiración (Koch et al., 2014). La participación de las células gliales en la respuesta inflamatoria dentro del SNC A nivel sistémico, la inflamación es parte de la respuesta inespecífica o innata del sistema inmune ante cualquier tipo de daño corporal o por la presencia de elementos extraños en el organismo (Abbas, 2008). La inflamación se caracteriza por el aumento del flujo sanguíneo en la zona lesionada, el aumento del metabolismo celular, la vasodilatación, la liberación de mediadores solubles de la respuesta inflamatoria, la extravasación de líquidos y la afluencia celular (Ferrero, 2007). En el SNC, la respuesta inmune está altamente regulada por diferentes células residentes (Lai y Todd, 2006). La inflamación dentro del sistema nervioso se caracteriza por la hiperactivación de las células gliales, en particular la microglía, que comienza a expresar moléculas del MHC clase I y II (Graeber et al., 2011; Liu et al., 2012), lo que deriva en la liberación de citocinas pro-inflamatorias (Graeber et al., 2011; Liu et al., 2012). Además, la inflamación en el SNC involucra la sobreexpresión de la iNOS y la COX2, así como de moléculas de adhesión (Kurkowska-Jastrzebska et al., 1999; Joniec et al., 2009). La microglía también se activa ante alguna alteración de la homeostasis del SNC (Lai y Todd, 2006; Członkowska, 2011). Tras su activación, la microglía migra hacia la zona afectada y fagocita los restos celulares si se lleva a cabo la muerte neuronal (Lai y Todd, 2006). La microglía activada puede liberar gliotransmisores que inducen la activación y la movilización a la zona afectada de los astrocitos (Lai y Todd, 2006), que sobreexpresan la proteína acida fibrilar glial y se agregan en un fenómeno conocido como astrogliosis reactiva (Leonardo et al., 2008). Las células alrededor, y dentro del foco de lesión expresan proteoglicanos que se acumulan en el espacio extracelular (Leonardo et al., 2008) y, así, se forma un agregado de astrocitos, microglía y proteoglicanos que forman una barrera de tejido llamada cicatriz glial (Leonardo et al., 2008). La formación de la cicatriz glial es un mecanismo innato de protección que aisla 20 las áreas lesionadas de las zonas viables que la rodean (Chew et al., 2006). Sin embargo, la formación de la cicatriz glial también evita la plasticidad neuronal, y puede generar más daño si la microglía y los astrocitos que forman la cicatriz glial continúan liberando citosinas y quimiocinas (Chew et al., 2006). Uno de los mediadores más importantes de la inflamación en el SNC es la interleucina (IL)- 1β que posee una actividad proinflamatoria potente (Ferrero, 2007) y que es producida principalmente por microglía en el SNC (Dantzer, 2001), así como por monocitos de la sangre durante la fase aguda de la respuesta inmune en la periferia (Herlenius, 2001; Ferrero et al, 2007). Como ya se ha mencionado, la liberación de la IL-1β en el SNC está relacionada con anormalidades respiratorias que se presentan durante la progresión de un proceso infeccioso (Hofstetter y Herlenius, 2005; Paterson et al., 2009; Herlenius, 2011) y que involucran la sobreproducción de la prostaglandina E2 (Herlenius, 2011). La producción de IL-1β y de prostaglandina E2, se lleva a cabo dentro del SNC principalmente por la microglía (Dantzer, 2001). En base a lo anterior, el presente trabajo propone que la actividad de la microglía es capaz de modular la actividad del circuito generador de los diferentes ritmos respiratorios (el preBötC) y, en consecuencia, de la respiración, de manera análoga a la capacidad de la microglía de modular la actividad neuronal en otras estructuras del cerebro como el hipocampo y el tálamo (Pascual et al., 2012; Schafer et al., 2012; Ji, 2013). La microglía. Como se mencionó anteriormente, la microglía es de origen mesodérmico (Ashwell et al., 1991), y se establece en el SNC para formar una población residente de glía, cuya principal función es inmunológica (Hutchins et al., 1990; Ashwell et al., 1991; Esiri et al., 1991; Geny et al., 1995; Rezaie y Male, 1999). Los precursores de la microglía son macrófagos que pueden ser detectados dentro del saco vitelino desde estadios muy tempranos del desarrollo embrionario y que darán origen a la microglía siguiendo una vía de diferenciación distinta a la que deriva en el linaje de los monocitos (Alliot et al., 1999). En el SNC maduro, la microglía se encuentra ampliamente distribuida dentro de todo el parénquima (Dalmau et al., 1998) aunque con mayor densidad en la materia gris (Dalmau et al., 1998). La microglía presenta principalmente dos “estados” (Dalmau et al., 1998). En condiciones fisiológicas, la microglía 21 se encuentra en un “estado de reposo” que se caracteriza por una morfología ramificada de soma reducido, con procesos celulares numerosos (Figura 5; Lorier et al., 2007). Estudios recientes indican que la microglía tiene una actividad lejana al “reposo”, que le permite monitorear de manera continua el estado de la sinapsis (Nimmerjahn et al., 2005; Hanisch y Kettenmann, 2007; Kettenmann y Verkhratsky, 2008). Por ejemplo, si las sinapsis dejan de ser funcionales, la microglía se encarga de removerlas (Nimmerjahn, 2005; Hanisch y Kettenmann, 2007; Kettenmann y Verkhratsky, 2008). La microglía en reposo también realiza funciones relacionadas con el mantenimiento y monitoreo de la proliferación celular (Streit, 2004; Wirenfeldt, 2005). En la sección siguiente se revisarán algunas de las funciones que realiza la microglía. Eventos que alteran la homeostasis del sistema nervioso como una infección (Kreutzberg, 1996), un trauma (Raivich et al., 1999; Ladeby et al., 2005), la isquemia (Morioka et al., 1991), alguna enfermedad degenerativa (Rupalla et al., 1998) o la actividad neuronal aberrante (Ponomarev et al., 2006), inducen que la microglía sufra un cambio de estado a nivel morfológico, molecular y funcional mediante un proceso denominado “activación microglial” (Kettenmann et al., 2011). En este nuevo estado, la microglía reactiva o activada se torna altamente móvil, su morfología so torna ameboidea y sus funciones se enfocan en procesos de fagocitosis y de liberación de citocinasa (Figura 5; Hanisch y Kettenmann, 2007; Kettenmann y Verkhratsky, 2008). La activación de la microglía está regulada por el complejo formado por el ligando CD200 y su receptor CD200R (Hoek et al., 2000; Wright et al., 2000), que es la misma vía de activación que siguen todas las células mieloides (Hoek et al., 2000; Wright et al., 2000). La respuesta inmunitaria mediada por la microglía activada dentro del SNC depende de la expresión de diversos receptores de reconocimiento de moléculas asociadas a patógenos, como los receptores tipo toll (TLRs, por las siglas en inglés de toll like receptors) (Fukagawa et al., 2013). Además de reconocer patógenos (Saijo et al., 2012); los TLRs reconocen moléculas generadas endógenamente a consecuencia de daño tisular o algún otro proceso patológico (Saijo et al., 2012). La activación de estos receptores en la microglía inducen que este tipo celular adquiera un fenotipo fagocítico que elimina células muertas, detritus y sustancias peligrosas del tejido nervioso (Inoue, 2002). La microglía activada por los TLRs también puede inducir apoptosis al liberar toxinas sobre las células dañadas (Inoue, 2002). Además, en estas condiciones, la microglía secreta citocinas, 22 quimiocinas y otras sustancias que están asociadas a diferentes procesos como la proliferación celular, a la quimiotaxis y a la inflamación (Figura 5). Figura 5. Características morfológicas de los diferentes estadios de la microglía. Clásicamente, se reconocen dos estados de la microglía, la microglía en reposo (vigilante) que posee una morfología altamente ramificada y la activada con una morfología ameboidea, similara lo de un macrófago clásico. Mientras que la microglía vigilante está asociada al mantenimiento de la homeostasis del sistema nervioso, la microglía activada se relaciona con el desarrollo de procesos patológicos (Modificado de Dale et al., 2014). Modulación de los circuitos neuronales por la microglía. Como se revisó al final de la sección anterior, el estudio de la microglía se ha enfocado en las acciones que ejerce dentro del SNC como defensa innata ante agentes patógenos y como mediador principal de la respuesta inflamatoria en el SNC (Saijo et al., 2013). Sin embargo, recientemente, se ha asociado a la microglía con el funcionamiento “normal” de los circuitos neuronales (Pascual et al., 2012; Schafer et al., 2012; Ji et al., 2013). Si bien la microglía expresa receptores para citocinas y quimiocinas (Saijo et al., 2013), que le permiten interactuar con células inmunológicas de la periferia (Pocock y Kettenmann, 2007), también expresa receptores para todos los neurotransmisores que clásicamente se pensaba eran exclusivos de las neuronas (Pocock y Kettenmann, 2007). La presencia de receptores para neurotransmisores en la microglía sugiere que existe una interacción mucho más activa entre las neuronas y la microglía en estado de reposo de lo que se supuso por mucho tiempo (Pascual et al., 2012). Por ejemplo, la estimulación de los receptores metabotrópicos de 23 glutamato (mGlu) del grupo II (mGlu2) en la microglía, con el agonista específico 2’, 3’- dicaboxi-ciclopropil glicina, induce la activación de la microglía en un fenotipo neurotóxico (Taylor, 2005). La estimulación del mGlu2 induce la liberación de TNFα por parte de la microglía y la activación de la caspasa 3 lo que induce la apoptosis neuronal (Taylor, 2005). La neurotoxicidad resultado de la estimulación de los receptores mGlu2 en la microglía no involucra la actividad de la iNOS (Taylor, 2005). Caso contrario, la estimulación de la microglía con el ácido (L)-2-amino, 4-fosfono-butirico (L-AP-4) o la (R, S)-fosfonofenilglicina (RSPPG), agonistas específicos de los mGlu del grupo III (mGlu3), induce la activación de la microglía sin un fenotipo neurotóxico (Taylor et al., 2003). Adicionalmente, la activación los receptores mGlu3 produce un efecto neuroprotector al bloquear la producción de toxinas microgliales activada por el lipopolisacárido (LPS) o por la proteína β amiloide (Bruno et al., 1997, 1998; Taylor et al., 2003). La interacción de estas vías glutamatérgicas modulan la actividad microglial durante un proceso patológico (Taylor et al., 2003; Taylor et al., 2005), pues el glutamato es el principal agente excitotóxico liberado tras algún daño al tejido nervioso (D’Antoni et al., 2008). A su vez, la estimulación de los mGlu3 inhibe la liberación de glutamato desde la microglía, los astrocitos y las neuronas (Conn y Pin, 1997). Además, la estimulación de los mGlu3 en los astrocitos inhibe la producción de citocinas (Besong et al., 2002). Como ya se mencionó, la microglía genera una respuesta inmune a través de su “activación” (Lorier et al., 2007; Kettenmann, 2011; Saijo, 2013). Una vez activada, la microglía es capaz de producir sustancias que afectan la actividad neuronal, como el óxido nítrico que puede modular la transmisión sináptica (Bessis et al., 2007), las citocinas que pueden aumentar o disminuir la exitabilidad de las neuronas ( Bessis et al., 2007; Hanisch y Kettenmann, 2007) y los factores tróficos que pueden inducir la supervivencia neuronal y la remielinización de los axones (Bessis et al., 2007; Hanisch y Kettenmann, 2007), así como modular la transmisión sináptica y el disparo neuronal (Pocock y Kettenmann, 2007; Pascual et al., 2012). Por ejemplo, Pascual y cols. (2012) demostraron que la que activación de la microglía con LPS produce un aumento en la frecuencia de las corrientes post-sinápticas excitatorias. Adicionalmente, este grupo determinó que dicho efecto es mediado por la liberación de ATP por parte de la microglía activada (Pascual et al., 2011). El ATP liberado por la microglía se une al receptor P2Y1R en la astroglía, que a su vez libera glutamato que se une a receptores metabotrópicos a glutamato neuronales y aumenta las corrientes excitatorias al modular la 24 actividad neuronal (Pascual et al., 2012.). Además de estos procesos, la actividad microglial puede influenciar la dinámica de un circuito neuronal mediante la fagocitosis activa de elementos post- y pre-sinápticos en un proceso denominado poda sináptica (Schafer et al., 2012). Durante el desarrollo, la eliminación de las sinapsis excedentes y el reforzamiento de conexiones maduras son indispensables para la maduración y el adecuado funcionamiento de un circuito neuronal (Wake et al., 2013). A este proceso se le denomina poda sináptica y es una de las funciones microgliales más importantes bajo condiciones no patológicas (Paolicelli et al., 2011; Ji et al, 2013). En el sistema nervioso adulto, la microglía extiende sus procesos constantemente para “censar” la actividad de las uniones sinápticas (Ji et al., 2013; Kettenmann et al., 2013). Cuando un botón sináptico deja de ser funcional es fagocitado por la microglía como un mecanismo que permite mantener la eficiencia del circuito (Ji et al., 2013; Kettenmann et al., 2013). Con el uso de microscopia de dos fotones, se descubrió que la microglía establece constantemente contactos con las sinapsis sin fagocitarlas (Wake et al., 2009). Sin embargo, la finalidad de esta interacción no es clara aún (Wake et al., 2009). En la corteza visual y en la somatosensorial de ratas adultas los contactos entre los botones sinápticos y los procesos de la microglía se establecen hasta por cinco minutos y la frecuencia con que ocurren es dependiente de la actividad sináptica (Wake et al., 2009). Por ejemplo, en la corteza visual, las interacciones entre los procesos microgliales y los botones sinápticos se deprimen con la enucleación de ambos ojos, mientras que la privación de luz reduce la movilidad de los procesos microgliales y aumentan el tiempo de contacto que establecen con las dendritas más grandes (Tremblay et al., 2010). El efecto apenas descrito es revertido con la re- exposición de los animales a la luz (Tremblay et al., 2010). La microglía también puede generar alteraciones en la neurotransmisión (Wake et al., 2013). Por ejemplo, la microglía puede liberar glutamato y, además, posee un sistema de recaptación de este amino ácido que está activo en la microglía en reposo y también cuando ésta se activa (Domercq et al., 2007). El glutamato liberado por la microglía en reposo puede ser removido rápida y eficientemente por los sistemas transportadores de glutamato en los astrocitos e incluso en los oligodendrocitos (Domercq et al., 1999). Sin embargo, la microglía reactiva interfiere con la recaptura de amino ácidos excitatorios de otras células gliales al liberar sustancias que interfieren con este proceso como son las especies reactivas de 25 oxigeno (ROS), el TNFα y la IL-1β (Domercq et al., 2007). Además, como ya se mencionó, la microglía es capaz de liberar sustancias con actividad excitatoria como el quinolato, la D- serina, el ATP y la adenosina (Wake et al., 2013). Modelos de activación e inhibición de la microglía. La estrategia experimental más ampliamente utilizada para estudiar el efecto de la inflamación sobre el SNC es la activación de la microglía con lipopolisacárido (LPS; Wang et al., 2005). El LPS es el componente principal de la pared celular de las bacterias gram- negativas y posee un gran potencial inmunogénico, pues induce el reclutamiento celular y la liberación de citocinas en la periferia (Yoon et al., 2012). Al igual que el resto de las células inmunogénicas del cuerpo, la microglía expresa el receptor tipo toll 4 (TLR4) que le permite reconocer patrones molecularesasociados a patógenos incluido el LPS (Chen et al., 2012; Zeng et al., 2012; Hines et al., 2013) (Figura 6). 26 Figura 6. Activación microglial inducida por el LPS y mediada por los receptores CD 14 y TLR. Los receptores CD14 y TLR son moléculas de reconocimiento de antígenos. Una vez unido el LPS al receptor CD14 y/o al receptor TLR se inicia la señalización a través de la vía de MAP cinasas que lleva a la expresión de los genes que inducen la activación de la microglía (Modificado de Machado et al., 2011). La activación de la microglía con LPS involucra una serie compleja de pasos que se describen a continuación. Inicialmente, el LPS se une, en el medio extracelular (Machado et al., 2011), a la proteína soluble de unión a LPS (LBP, por sus siglas en inglés; Figura 6; Machado et al., 2011). La formación del complejo LBP-LPS facilita el enlace de la LBP con el receptor CD14 (Machado et al., 2011), que está presente como proteína plasmática soluble (Machado et al., 2011), pero que también se encuentra como proteína de membrana ligada a glucofosfatidil-inositol (Machado et al., 2011). Una vez que el LPS se une al receptor CD14, se disocia de la LBP (Machado et al., 2011) y el complejo LPS-CD14 se une con el receptor TLR4 (Machado et al., 2011). Otra proteína extracelular auxiliar llamada MD2 también se une al complejo LPS-CD14 para favorecer la transducción de la señal mediada por esta 27 interacción (Machado et al., 2011). Esta vía transduccional incluye la activación de las MAP cinasas (Machado et al., 2011) y del factor de transcripción NF-κB (Machado et al., 2011), lo que da inicio a la transcripción de genes específicos que conducen a la activación microglial (Figura 6; Machado et al., 2011). Cuando el LPS es aplicado a nivel sistémico, éste puede actuar sobre el SNC por diferentes vías que se enumeran a continuación (Hines et al., 2013): El LPS se une al receptor TLR4 de la microglía presente en regiones donde la barrera hematoencefálica es permeable (Hines, 2013), como el área postrema y otros órganos circumventriculares (Hines et al., 2013). El LPS activa células perivasculares y endoteliales en los vasos sanguíneos del cerebro (Hines et al., 2013). EL LPS estimula aferente al nervio vago (Hines et al., 2013). Por infiltración a través de la barrera hematoencefálica de citocinas producidas por macrófagos periféricos activados por el LPS (Hines et al., 2013). En cultivos celulares, la estimulación con LPS induce la producción de factores neuroinflamatorios por parte de la microglía (Nakajima et al., 2001). Sin embargo, la microglía activada con LPS también sintetiza factores tróficos que tienen un efecto protector frente a ciertos eventos patológicos dentro del SNC como los accidentes cerebrovasculares (Lauro et al., 2010). En estructuras como el hipocampo, se ha demostrado que la activación microglial con LPS puede modular la transmisión sináptica a través de un efecto pre- sináptico (Ahmadi et al., 2013). Así como se ha usado al LPS como activador microglial (Wang et al., 2005), la minociclina es un fármaco utilizado como inhibidor de la activación microglial (Wang et al., 2005). La minociclina es un antibiótico de segunda generación, de la gama de las tetraciclinas, que posee un espectro amplio de actividad antimicrobiana y, además, que tiene efectos inhibitorios sobre las células del sistema inmune (Yoon et al., 2012). Este fármaco puede atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica e ingresar al parénquima del SNC (Yoon et al., 2012; Saivin y Houin, 1988). La minociclina es capaz de inhibir la activación y la proliferación de la microglía (Zink et al., 2005), de los astrocitos (Zink et al., 2005), de los macrófagos (Nikodemova et al., 2007) y de los linfocitos (Nikodemova et al., 2007). La administración de la minociclina en cultivos microgliales reduce la producción de especies reactivas de oxígeno, así como la de distintas citocinasa proinflamatorias (Wang et al., 2005). 28 Además, la minociclina detiene la progresión de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE; Nikodemova et al., 2007), que es un modelo muy utilizado de esclerosis múltiple (Nikodemova et al., 2007). La minociclina es ampliamente utilizada para bloquear la activación microglial o como antiinflamatorio (Nikodemova et al., 2007). Sin embargo, el mecanismo a través del cual la minociclina ejerce estos efectos no se conoce del todo (Fukagawa et al., 2013). A pesar de ello, en 2007 Nikodemova y colaboradores encontraron que la administración de la minociclina suprime la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHCII) en la microglía (Nikodemova et al., 2007). El MHC II es otro receptor muy importante en la regulación de la respuesta inmune en el organismo (Abbas, 2008). Además, la minociclina impide la fosforilación de la PKCα en la micrioglía y la subsecuente fosforilación y translocación del factor de transcripción IRF-1 (Nikodemova et al., 2007), lo que suprime la expresión del MHCII (Nikodemova et al., 2007; Figura 7). Además del uso de la minociclina como “inhibidor” de la activación microglial, se ha utilizado la depleción de la microglía como otra estrategia para evaluar el papel de la microglía en diversos procesos del sistema nervioso (Pascual et al., 2012). Con este propósito se ha utilizado al agente tóxico selectivo para la microglía, la L-leucina-metil-ester (LME) (Pascual et al., 2012). La exposición de los linfocitos humanos o murinos a la L- LME resulta en la eliminación selectiva de los linfocitos citotóxicos (Thiele, 1990). Esta eliminación es mediada por la aparición de metabolitos membranolíticos de la LME de estructura esterificada (Thiele, 1990), que son producidos por la actividad de la dipeptidil peptidasa, una proteasa lisosomal de tipo tiol, presente en células con potencial citolítico de origen linfoide (Thiele, 1990). Las células que presentan esta enzima son afectadas por la LME y en el caso del SNC sólo la microglía expresa la dipeptidil peptidasa (Thiele, 1990), lo que permite eliminar con la LME a este tipo celular selectivamente del tejido nervioso (Thiele, 1990). La eliminación selectiva de la microglía con LME ha permitido determinar que la activación de este tipo celular modula la actividad de otras células gliales e incluso la actividad sináptica (Pascual et al., 2012; Neher et al., 2011). 29 Figura 7. Regulación en la expresión del MHC II y su inhibición por la minociclina. Se ilustran los sitios donde se ha demostrado que la minociclina ejerce efectos inhibitorios con una flecha roma. Después de la unión con su receptor, el interferón γ (IFN γ) activa la vía de señalización JAK/STAT e induce la fosforilación de la PKC/II, lo que resulta en el aumento de la expresión de IRF-1. STAT 1 e IRF 1 son factores de transcripción que se unen al promotor de CIITA IV. CIITA es una proteína de unión a ADN y es un co-activador clave para la regulación de la expresión del MHC II. La minociclina inhibe esta vía transduccional bloqueando el efecto de la cinasa PKCa y del factor de transcripción IRF-1 (modificado de Nikodemova et al, 2007). 30 Justificación La inflamación representa un factor importante para la patogénesis del SMSL, ya que disminuye la generación de los ritmos respiratorios y la autorresucitación (Hofstetter y Herlenius, 2005; Hofstetter et al., 2007; Herlenius, 2011). Distintos procesos infecciosos periféricos inducen la liberación de citocinas pro-inflamatorias por la microglía a nivel del tallo cerebral (Dantzer 2001; Balan et al., 2012). Dado que en el tallo cerebral se ubica el generador de los ritmos respiratorios (Smith et al, 1991), se propuso determinar si la activación o la inhibición de la microglía, la principal fuente de citocinasa pro-inflamatorias en el SNC, afectan la generación de los diferentes ritmos
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