Papel-de-la-region-transmembranal-11-en-la-afinidad-por-tiazidas-del-cotransportador-renal-de-NaCl-NCC

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
 
 
 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS 
 
 LICENCIATURA EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA BÁSICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 PAPEL DE LA REGIÓN TRANSMEMBRANAL 11 
 EN LA AFINIDAD POR TIAZIDAS 
 DEL COTRANSPORTADOR RENAL DE NaCl (NCC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE LICENCIADA 
EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA BÁSICA PRESENTA: 
 
MARIA CASTAÑEDA BUENO 
 
 
DIRECTOR DE TÉSIS: DR. GERARDO GAMBA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 MÉXICO D.F. 2009
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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PAPEL DE LA REGIÓN TRANSMEMBRANAL 11 EN LA AFINIDAD POR 
TIAZIDAS DEL COTRANSPORTADOR RENAL DE NaCl (NCC) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Gerardo Gamba, en la Unidad de 
Fisiología Molecular del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM, 
localizada en el Departamento de Nefrología y Metabolismo Mineral del Instituto 
Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
Al Dr. Gerardo Gamba, por sus valiosas enseñanzas, por su asesoría, apoyo y amistad. 
 
 
A la Q.F.B. Norma Vázquez, por su ayuda invaluable para la realización de este trabajo, 
su apoyo constante y su amistad. 
 
 
A la Dra. Norma Bobadilla, por sus comentarios y sugerencias durante los seminarios y 
por sus enseñanzas. 
 
 
A todos mis compañeros del laboratorio, por su amistad, ayuda y apoyo: Diana 
Pacheco, José Ponce, Consuelo Plata, Paola de los Heros, Aída Venado, Lilia Martínez, 
Penélope Ortal, Juan Pablo Arroyo, Rocío Acuña, y ZeSergio Melo. A los vecinos, 
Joyce Trujillo, Victoria Ramírez, Juan Garzón, Rafael Valdés, Jonatan Barrera, César 
Cortés, Katy Sánchez, Rosalba Pérez y Cristino Cruz. 
Y, en especial, a los que participaron de cerca en este proyecto, Erika Moreno, Erika 
Rodríguez Lobato y Damián Hernández. 
 
 
Al jurado del Examen de Licenciatura, por el tiempo que dedicaron en la revisión de mi 
tesis, por sus comentarios y sugerencias: 
 
Presidente: Dr. Luis Alfonso Vaca Domínguez 
Secretario: Dr. Gerardo Gamba Ayala 
Vocal: Dr. León David Islas Suárez 
Suplente: Dra. Norma Bobadilla Sandoval 
Suplente: Dr. Armando Tovar Palacio 
 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 
A mis papás y hermano, por sus consejos y enseñanzas que fueron muy importantes 
para que pudiera llegar hasta aquí, pero sobre todo por su cariño y su apoyo 
incondicional. 
 
 
 
INDICE 
 
I. RESUMEN 2 
II. INTRODUCCIÓN 4 
 II.1 Cotransportadores de membrana 4 
 II.2 El riñón y el manejo de renal de NaC l6 
 II.3 Fisiología de la reabsorción en el túbulo contorneado distal 10 
 II.4 Clonación de NCC 12 
 II.5 Expresión 14 
 II.6 Familia SLC12 15 
 II.7 Estructura del NCC: Topología y formación de dímeros 17 
 II.8 Caracterización funcional de NCCr y NCCfl 20 
 II.9 Diuréticos tipo tiazida 25 
 II.10 Trabajos previos de estructura-función en NCC 31 
 II.11 Trabajos de estructura función en otros cotransportadores de la familia 37 
III. OBJETIVOS 39 
 III.1 Objetivo generál 
 III.2 Objetivos específicos 
IV. HIPÓTESIS 39 
V. METODOLOGÍA 40 
 V.1 Identificación de residuos potenciales y construcción de mutantes 40 
 V.2 Experimentos de expresión funcional 41 
 V.3 Ensayos de Western blot 43 
VI. RESULTADOS 44 
 VI.1 Alineamiento y diseño de mutantes TM 44 
 VI.2 Caracterización funcional 45 
 VI.3 Diseño y construcción de mutantes individuales 48 
 VI.4 Caracterización funcional 49 
 VI.5 Construcción y caracterización de la mutante C576S en NCCfl 50 
 VI.6 Análisis de actividad basal y expresión proteica de las mutantes 51 
VII. DISCUSIÓN 54 
VIII. CONCLUSIONES 63 
IX. BIBLIOGRAFÍA 64 
 
 2
I. RESUMEN 
 
Los diuréticos tipo tiazida son de los fármacos más prescritos a nivel mundial ya que 
constituyen el tratamiento de primera línea para el manejo de la hipertensión arterial. 
Sin embargo, se sabe poco sobre los residuos o dominios de unión del fármaco a su 
proteían blanco, el cotransportador renal de Na+:Cl- (NCC), el cual se expresa en la 
membrana apical del túbulo contorneado distal de la nefrona. Previamente se ha 
demostrado en el laboratorio que los cotransportadores NCC de lenguado (NCCfl) y 
rata (NCCr) exhiben diferentes afinidades para las tiazidas, con IC50 respectivos de 4 
uM y 0.4 uM (64), (91) y que las regiones transmembranales (TM) 8 a 12 contienen la 
información que determina esta diferencia (66). 
El objetivo de este trabajo fue identificar los aminoácidos en las regiones TM 8-12 
responsables de la diferencia en afinidad por tiazidas entre NCCr y NCCfl. El 
alineamiento entre distintos NCC de mamífero y NCCfl reveló que en las regiones TM 
8-12 existen solo 6 residuos conservados en mamífero, que son diferentes en NCCfl: 
dos en TM9, tres en TM11 y uno en TM12. Por lo tanto, se diseñaron tres mutantes de 
NCCr que contienen, cada una, un segmento transmembranal tipo NCCfl: la TM9 con 
las mutaciones A510T y A516C, la TM11 con A568S, I574C, S575C, y la TM12 con la 
mutación V601T. Estas se construyeron mediante mutagénesis puntual y todas las 
clonas obtenidas fueron secuenciadas. Se utilizaron ovocitos de Xenopus laevis como 
sistema heterólogo de expresión funcional. Éstos se inyectaron con RNAc de NCCr 
silvestre o mutante y la actividad del transportador se determinó mediante la captación 
de 22Na+ en presencia de concentraciones crecientes de tiazida, de Na+ o Cl- para 
determinar las afinidades respectivas. 
Observamos que el IC50 para las mutantes TM9 y TM12 es similar al de NCCr silvestre 
(0.2-0.4 uM), mientras que el de la mutante TM11 es similar al de NCCfl (~0.4 uM). 
Las afinidades por los sustratos de transporte, Cl- y Na+, no se vieron alteradas. 
Se construyeron entonces tres nuevas mutantes para determinar cual o cuales de los 3 
aminoácidos mutados en TM11 son necesarios para generar este cambio en la afinidad: 
una doble mutante (DM) con las mutaciones I574C y S575C, y dos mutantes sencillas, 
la I574C y la S575C. Se observó que la presencia de la mutación I574C es suficiente 
para conferir una afinidad tipo NCCfl, ya que tanto la DM como la mutante S575C 
presentan una afinidad similar a la de la mutante TM11 y a la de NCCfl. 
 3
Finalmente se observó que las mutantes TM11, DM y S575C tienen una actividad basal 
mayor a la del cotransportador silvestre, mientras que la mutante I574C presenta una 
actividad ligeramente menor. Se determinó la cantidad de proteína expresada mediante 
western blot y se observó una cantidad similar de proteína para todas las clonas 
inyectadas. 
Concluimos que sólo un aminoácido de la región TM 11, la serina 575 en NCCr, 
cisteína en NCCfl, es responsable de la diferencia de afinidad por tiazidas entre NCC de 
mamífero y de pez. Este hallazgo podría conducirnos a determinar el sitio de unión de 
las tiazidasal NCC. Además, este aminoácido también podría ser responsable, al 
menos en parte, de las diferencias en los niveles de actividad entre NCCr y NCCfl, ya 
que típicamente NCCfl presenta una mayor actividad. Esta es la primera sustitución 
encontrada en NCC que produce una ganancia de función. Dado que la actividad de 
NCC en túbulo contorneado distal se ha relacionado con la regulación de la presión 
arterial, un aumento en la función de éste debido a dicha mutación podría representar 
una causa de hipertensión. 
 
 4
II. INTRODUCCIÓN 
 
II.1 Cotransportadores de membrana 
 
Las membranas celulares son las principales barreras encargadas de la compartamentalización 
de los organismos vivos en prácticamente todos los niveles. Esta compartamentalización es 
vital para el funcionamiento adecuado de cualquier proceso fisiológico o celular, ya que estos 
procesos dependen del mantenimiento de un ambiente con características muy específicas. La 
generación de dichos ambientes se logra mediante la regulación del transporte de sustancias a 
través de estas barreras hacia espacios específicos. Debido al carácter hidrofóbico de las 
membranas, las sustancias no polares y sin carga son capaces de atravesar con diferentes 
grados de libertad estas membranas, por lo que su localización no está regulada de esta forma. 
Sin embargo, para las moléculas polares, impermeables en las membranas celulares, existen 
diferentes tipos de mecanismos de transporte cuya actividad es regulada y que además puede 
ser específica para ciertos compartimentos celulares. Los mediadores de dichos mecanismos 
de transporte generalmente son proteínas que atraviesan la membrana celular y que generan 
un paso hidrofílico a través de ésta. El movimiento de sustancias a través de las membranas, 
como cualquier otro proceso, siempre obedece a las leyes termodinámicas, por lo que para 
que se lleve a cabo es necesario que éste implique un cambio energéticamente favorable, es 
decir, que el cambio en la energía libre de Gibbs (∆G) del proceso sea negativo. En el caso del 
movimiento de moléculas entre compartimentos, un evento energéticamente favorable 
implicaría el movimiento de éstas del compartimento de mayor al de menor concentración de 
moléculas, lo cual estaría favorecido por un aumento en la entropía (o del grado de desorden) 
del sistema. El potencial químico es una medida de la fuerza disponible para el movimiento 
neto de moléculas de un compartimento a otro y esta fuerza está determinada por el gradiente 
de concentración que existe entre ellos. Además del gradiente de concentración hay otro 
factor que puede influir en el movimiento cuando se trata con moléculas cargadas: el voltaje 
transmembranal (Vm), que se opone a cualquier movimiento de moléculas que generen un 
aumento en el Vm y favorece los movimientos que disminuyan el Vm. A este factor se le 
llama potencial eléctrico, y actúa en conjunto con el potencial químico para determinar la 
dirección del movimiento neto de moléculas. Ambas fuerzas se engloban frecuentemente bajo 
el término de “potencial electroquímico” o “gradiente electroquímico.” 
Los diferentes mecanismos de transporte se clasifican de acuerdo a la fuente de energía que 
impulsa el transporte a través de ellos. Existen proteínas membranales que actúan únicamente 
permitiendo el paso de moléculas, impermeables en la bicapa lipídica, a favor de su gradiente 
 5
electroquímico (que en este caso constituye la fuente de energía para el transporte). A este 
tipo de transporte se le llama transporte pasivo o difusión facilitada e incluye a canales, poros 
y uniportadores. Los primeros generalmente medían la entrada o salida de iones de la célula y 
son proteínas que generan un poro en la membrana mediante el cual los iones pueden pasar 
libremente. Proteínas similares, pero que medían la entrada de otro tipo de sustancias que no 
son iones, por ejemplo de agua, se denominan poros. En el caso de los canales el paso puede 
estar regulado mediante la apertura o cierre de una compuerta en la entrada del poro. 
Por otro lado, también existen proteínas que son capaces de mediar el transporte de moléculas 
en contra de potencial electroquímico, sin embargo, este transporte no rompe con las leyes 
termodinámicas ya que este movimiento que consume energía (endergónico) se acopla a otro 
proceso que libera energía (exergónico). A este tipo de transporte se le llama transporte 
activo. Dicho proceso exergónico puede ser la hidrólisis de ATP, en cuyo caso se otorga el 
nombre de transporte activo primario, o el movimiento de una segunda molécula a favor de su 
gradiente electroquímico, mecanismo que recibe el nombre de transporte activo secundario. 
Se llama secundario porque el gradiente que es disipado para proveer la energía necesaria 
para el transporte de la otra molécula en contra de su gradiente, es generado en un inicio por 
un transportador activo primario. Dentro de los transportadores activos secundarios 
encontramos dos subtipos: aquellos que mueven ambos solutos en la misma dirección 
(cotransportadores) y aquellos que mueven uno en dirección opuesta al otro 
(intercambiadores). El funcionamiento de ambos sigue el mismo principio. La estructura 
terciaria de estas proteínas membranales consiste en varias α-hélices, el número generalmente 
varía entre 10 y 14, que atraviesan la membrana celular. Estas hélices están acomodadas de tal 
manera que forman una hendidura hidrofílica en donde se encuentra el sitio de unión de los 
sustratos de transporte. Esta hendidura hidrofílica no está expuesta de manera permanente al 
ambiente extracelular e intracelular, sino que cambios en la conformación de la proteína 
alternan la exposición de ésta a uno de estos dos ambientes a la vez, pero nunca al mismo 
tiempo. En los transportadores de este tipo que se han cristalizado se ha observado que los 
segmentos transmembranales de la proteína se agrupan en dos estructuras, una amino-terminal 
y otra carboxi-terminal, que, a pesar de que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, 
presentan una conformación similar, de tal forma que la estructura completa del transportador 
adquiere un carácter simétrico (2), (25), (99). Las dos estructuras interactúan y cada una 
forma una mitad de lo que finalmente constituye al transportador completo. Se ha propuesto 
que estas dos estructuras rotan alrededor de un eje para cambiar el lado de la membrana al 
que está expuesto el sitio de unión de los sustratos. El mecanismo de transporte consiste en la 
 6
unión de los sustratos desde una de las caras de la membrana al sitio de unión en el 
transportador y un cambio conformacional posterior que expone a los sustratos unidos a la 
otra cara de la membrana de tal forma que cuando se disocian éstos ha ocurrido el transporte 
(22), (2). Esto explica dos características básicas del transporte mediado por cotransportadores 
e intercambiadores. La primera es que el transporte es saturable, es decir, la velocidad de 
transporte aumenta conforme aumenta la cantidad de sustrato disponible para el transporte, 
sin embargo, alcanza un límite establecido por la capacidad de la proteína de cambiar de 
conformación. La segunda característica es la especificidad que se debe a que sólo los 
sustratos tienen la estructura química necesaria para establecer las interacciones adecuadas 
con su sitio de unión en el transportador. 
El presente trabajo está enfocado en el estudio de la proteína NCC que es un cotransportador 
de este tipo. Su estructura cristalográfica todavía no se ha determinado, por lo que sólo se 
cuenta con la evidencia estructural de otros cotransportadores para hacer inferencias al 
respecto. En capítulos posteriores se profundizará más en los datos estructurales que se 
conocen de esta proteína. 
 
 
II.2 El riñón y el manejo renal de NaCl 
 
El riñón realiza varias funciones que son vitales para el funcionamiento adecuadodel 
organismo: participa en la eliminación de toxinas y productos metabólicos; produce hormonas 
involucradas en el metabolismo de calcio, regulación de la presión arterial, y eritrogénesis; y, 
finalmente, participan en el mantenimiento de la homeostasis corporal, regulando el volumen, 
el pH y la concentración de electrolitos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-) en los fluidos corporales 
(12). 
La regulación del volumen del fluido extracelular (FEC) es esencial para el mantenimiento de 
la presión arterial dentro de límites necesarios para la adecuada perfusión y función de los 
tejidos. El organismo regula el volumen del FEC a través del monitoreo y ajuste del contenido 
corporal de cloruro de sodio (NaCl). El riñón es el único órgano a través del cual podemos 
eliminar NaCl en forma finamente regulada. 
Por otro lado, debido a que el riñón puede separar la excreción de sal de la de agua, este 
órgano juega un papel esencial en el mantenimiento de la osmolaridad del FEC mediante el 
monitoreo y el ajuste del contenido de agua. Esto es básico debido a que cambios importantes 
en la osmolaridad afectan el volumen celular y por lo tanto, las funciones celulares. 
 7
Estos dos sistemas, el de control de volumen y control de osmolaridad, se complementan, ya 
que los cambios en el contenido de NaCl corporal generan cambios en el volumen de FEC 
gracias a la acción del sistema de mantenimiento de la osmolaridad que activa el aumento en 
el contenido de agua para evitar que el NaCl genere una alteración osmótica. 
Todas estas funciones se logran gracias a la acción conjunta de tres procesos fundamentales 
que realiza el riñón: filtración, reabsorción y secreción. 
Estos se realizan a lo largo de la nefrona, que es la unidad funcional del riñón. Un riñón está 
constituido por millones de nefronas, y cada una de ellas está conformada por un glomérulo y 
un túbulo. El glomérulo es un conglomerado de capilares rodeado por una cápsula de tejido 
epitelial, la cápsula de Bowman. Esta cápsula consta de dos capas, una capa interna formada 
por células llamadas podocitos, de origen epitelial, que recubren a los capilares glomerulares, 
y una capa externa denominada capa parietal. Entre estas dos capas se genera un espacio, el 
espacio de Bowman, que es continuo con el lumen tubular. El túbulo, por su parte, está 
formado por un epitelio simple, cuyas características van cambiando de acuerdo a la función 
que se realiza en cada segmento. 
La filtración es el movimiento de plasma libre de proteínas desde el capilar glomerular hacia 
el espacio de Bowman. Ésta depende de la integridad de la pared capilar, y de la presión 
intracapilar, que a su vez está determinada por la presión de perfusión renal y de las 
resistencias de las arteriolas eferentes y aferentes. 
El espacio de Bowman, como ya se dijo, es continuo con el lumen del túbulo renal al cual 
entra el filtrado glomerular que es idéntico al plasma, con excepción de que no contiene 
macrocmoléculas como las proteínas plasmáticas. Por lo tanto, el filtrado glomerular es 
expuesto a los procesos de reabsorción y secreción a lo largo de la nefrona para convertir una 
gran cantidad de ultrafiltrado plasmático en una pequeña cantidad de orina. El filtrado 
glomerular normal es aproximadamente de 125 ml/min (180 litros en 24 hrs), mientras que la 
producción promedio de orina es de 0.8 a 1.2 ml/min (1 a 2 litros en 24 horas). 
La reabsorción y secreción pueden ser procesos pasivos, determinados únicamente por 
gradientes electroquímicos y la permeabilidad de la pared tubular, o procesos activos en los 
cuales está involucrada toda una maquinaria celular (procesos trancelulares) que provee la 
energía y el medio de transporte para que se lleven acabo. 
En términos generales, la reabsorción transcelular es posible gracias a la actividad de la 
ATPasa de Na
+
/K
+
 basolateral que saca sodio y mete potasio a la célula, y de esta forma 
genera un gradiente electroquímico que favorece la entrada apical de Na+ a través de diversas 
proteínas que permiten su difusión hacia el interior celular (canales), o que acoplan la entrada 
 8
de sodio al movimiento de otros solutos que también requieren reabsorberse (transportadores 
secundarios). Los transportadores secundarios se dividen en dos clases: aquellos que mueven 
ambos solutos transportados en la misma dirección (cotransportadores) y aquellos que 
acoplan la entrada de un soluto a la célula a la salida de otro (intercambiadores). 
La porción tubular de la nefrona se ha dividido, con fines prácticos, en segmentos de acuerdo 
a criterios funcionales y anatómicos (Figura 1). Enumerados del segmento más próximo al 
glomérulo al más distal, éstos son: 
 
• túbulo proximal, 
• asa de Henle, que se subdivide en: 
° asa descendente delgada, 
° asa ascendente delgada y 
° asa ascendente gruesa, 
• túbulo contorneado distal, 
• túbulo conector, 
• túbulo colector, subdividido en: 
° colector inicial, 
° colector cortical, 
° colector medular (externo e interno). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
En términos muy generales el papel en la reabsorción de NaCl de cada uno de estos elementos 
es el siguiente. En el túbulo proximal se recupera la mayor parte del filtrado glomerular. Se 
Figura 1. Estructura de la nefrona 
 9
reabsorbe la totalidad de los nutrientes filtrados, como glucosa y aminoácidos, acoplando el 
transporte de éstos a la entrada de sodio. El gradiente para la entrada de sodio es generado por 
la ATPasa de Na+/K+ basolateral, un mecanismo que es general para la reabsorción de Na+ a 
lo largo del epitelio. Además se reabsorbe Na+ mediante un intercambiador Na+/H+ apical, y 
un cotransportador basolateral de Na+/HCO3
-. Este mecanismo es además importante en la 
regulación ácido-base del organismo. En total se reabsorbe alrededor de un 65% de la 
cantidad total de Na+ filtrada. El Cl- se reabsorbe por vía paracelular en la parte inicial de este 
segmento, obedeciendo al gradiente eléctrico y químico transepitelial que genera la entrada de 
Na+. En la parte final el Cl- se reabsorbe por vía transcelular, acoplado a la salida de aniones 
como formato, oxalato o HCO3
-. Dado que este es un segmento permeable al agua, toda la 
reabsorción de Na+ va acompañada de reabsorción agua, y de esta forma la concentración 
luminal de Na+ se mantiene constante. 
El asa de Henle forma parte del sistema para concentrar o diluir la orina. Participa en la 
generación de un intersticio medular hipertónico a través de la reabsorción de NaCl en un 
segmento impermeable al agua. Esta hipertonicidad es explotada río abajo por los túbulos 
colectores en donde la reabsorción de agua es estimulada por la diferencia entre la 
osmolaridad luminal y la intersticial. La regulación de la permeabilidad al agua en los túbulos 
colectores es parte esencial del mecanismo biológico para regular la osmolaridad plasmática 
mediante la generación de orina diluida o concentrada. En el asa de Henle se lleva a cabo un 
25% de la reabsorción total de NaCl. Los mecanismos de transporte utilizados son un 
cotransportador electroneutro de Na+/K+/2Cl-, llamado NKCC2, que se expresa únicamente en 
el asa ascendente gruesa, y un transporte paracelular pasivo en la porción del asa ascendente 
delgada. El transportador NKCC2 es blanco de los llamados diuréticos de asa, como 
bumetanida o furosemida. 
El túbulo distal y el sistema de túbulos colectores, son los sitios que llevan a cabo el control 
fino de la excreción de sal y agua. A pesar de que a estos se encargan de reabsorber 
únicamente un ~10% del NaCl filtrado, son los principales sitios de control de la reabsorción 
de NaCl y agua, que responden a la acción de hormonas como aldosterona, angiotensina y 
hormona antidiurética (ADH), las cuales son efectoras de los mecanismos de control de 
volumen y osmolaridad del FEC. 
En los túbulos colectores, el Na+ es reabsorbido a través de un canalde sodio apical (ENaC), 
y esta reabsorción genera un voltaje transepitelial negativo en el lumen que permite la 
reabsorción paracelular de Cl-. Este voltaje también impulsa la secreción de potasio hacia el 
lúmen, vía un canal de K+ apical llamado ROMK. El Cl- es también reabsorbido a través de 
 10
un proceso transcelular que involucra un intercambiador de Cl-/HCO3
- apical, y un canal de 
Cl- basolateral (12). 
Sobre los mecanismos de reabsorción en el túbulo distal se hablará con más detalle en el 
siguiente apartado. 
 
 
II.3 Fisiología de la reabsorción en el túbulo contorneado distal 
 
Los primeros estudios hechos sobre la reabsorción en túbulo distal eran exclusivamente 
estudios de microperfusión in vivo, en los cuales se medía el flujo transepitelial a través de un 
sistema en que se controlaba la solución que perfundía al segmento tubular, y ésta era 
recuperada al final del segmento (17). La versión clásica de “túbulo distal” comprendía el 
segmento entre la mácula densa (el último segmento del asa ascendente gruesa, en donde 
entran en contacto el glomérulo y el túbulo renal), y la primera confluencia con otra nefrona. 
Muchos estudios de microperfusión distal se realizaron considerando todo este segmento, y 
así se estableció que éste es responsable de alrededor de un 10% de la reabsorción del NaCl 
filtrado (24). 
Posteriormente se observó que este segmento en realidad comprendía varios subsegmentos 
que se podían diferenciar por sus características tanto morfológicas como funcionales Estos 
subsegmentos fueron llamados: túbulo contorneado distal, túbulo conector, y túbulo colector 
inicial. 
El túbulo contorneado distal (TCD) se dividió después en dos segmentos más: el TCD 
temprano y el TCD tardío (también conocidos como TCD1 y TCD2). La región temprana está 
compuesta principalmente por células de TCD, mientras que la región tardía es una especie de 
zona de transición y, por lo tanto, contiene células de TCD, y células principales e 
intercaladas, las cuales son características de los túbulos conector y colectores. 
Las células de TCD son altas y presentan una amplificación importante de la membrana apical 
y basolateral. La amplificación basolateral es más importante que la apical y consiste en 
procesos de tipo lamelar dentro de los cuales hay una gran cantidad de mitocondrias. La 
membrana apical se caracteriza por formar numerosas microvellosidades cortas. Estas células 
son las más ricas en mitocondrias de toda la nefrona y, congruente con esto y con la gran 
amplificación basolateral, son aquellas en las que se detecta la más alta actividad de la 
ATPasa de Na+/K+ (73). 
 11
Los primeros estudios de microperfusión que se hicieron para distinguir el papel en la 
reabsorción de Na+ de cada uno de los subsegmentos del túbulo distal clásico, revelaron 
diferencias importantes en los mecanismos de reabsorción utilizados en cada segmento. En 
1975, Kunau et. al. identificaron a la nefrona distal (después de la macula densa) como el sitio 
de acción de los diuréticos tipo tiazida (53). Estudios posteriores delimitaron el sitio de 
acción de las tiazidas específicamente al TCD, en donde estos diuréticos bloquean un 
cotransporte acoplado de Na+ y Cl-, cuya actividad no altera el voltaje transepitelial. Esta vía 
es la responsable de prácticamente el total de la reabsorción de sal en este segmento. Por otro 
lado, en la zona correspondiente al túbulo conector y al colector inicial, se encontró que la 
reabsorción de Na+ se daba a través de otras vías, incluyendo una vía electrogénica sensible a 
amilorida (fármaco que bloquea a los canales de sodio denominados ENaC) (17), (24). 
Años después se logró la clonación del gen codificante del transportador responsable de la 
actividad de reabsorción en TCD. Se trataba de un cotransportador que cumplía con todas las 
características mencionadas, al cual se llamó NCC (Na+/Cl- cotransporter) (30), (29). A partir 
de entonces la caracterización de la fisiología molecular de la reabsorción de sodio en esta 
zona de la nefrona se hizo posible. 
Como muestra la figura 2, en las células de TCD, la ATPasa Na+/K+ basolateral genera el 
gradiente de Na+ necesario para la entrada apical de este catión, a la cual se acopla la entrada 
de Cl- vía NCC. El Na+ atraviesa así el epitelio, mientras que el Cl-, cuya concentración 
intracelular es elevada a niveles por encima del equilibrio electroquímico, sale a través de la 
membrana basolateral vía el canal de Cl-, CLC-K2. La continua actividad de la ATPasa 
Na+/K+ es posible gracias a la extrusión apical de K+ vía el canal de potasio llamado ROMK 
(98), y un cotransportador de K+/Cl-, KCC1 (3), (31). 
 
 
Además de modular la entrada de Na+ y Cl-, NCC también modula la reabsorción de calcio y 
magnesio. Una disminución en la función de NCC, por bloqueo con tiazidas o por otras 
Figura 2. Mecanismo de reabsorción de NaCl en TCD. 
 12
causas, aumenta la reabsorción de calcio, y un aumento en la función de NCC produce el 
efecto contrario, por mecanismos poco claros hasta el momento (34), (10), (60). 
Por último, la función de NCC también impacta el metabolismo de K+ y el balance ácido-
base. El bloqueo de la función de NCC por el uso de tiazidas puede provocar hipokalemia. La 
causa de esto es un aumento en el volumen de líquido y en la cantidad de NaCl que llega a 
túbulo colector al estar bloqueado NCC, que permite que aumente el intercambio de Na+ con 
K+ por los canales ENaC y ROMK, respectivamente. El aumento luminal de Na+ en 
colectores favorece la reabsorción a través del canal ENaC, generando un potencial eléctrico 
negativo en el lumen, que favorece la salida de K+. Así mismo, la actividad de ENaC es 
necesaria para mantener la actividad de la ATPasa de Na+/K+ la cual se requiere para la 
secreción de K+. Por último, la contracción del volumen extracelular ocasionada por el uso de 
tiazidas puede activar el eje renina-angiotensina-aldosterona, y la aldosterona circulante 
exacerbar el efecto sobre la secreción de K+ (12), (18). 
Los efectos en el balance ácido-base están ligados a los efectos en el metabolismo de K+. Se 
sabe que la hipokalemia puede causar alcalosis metabólica, así como la alcalosis puede ser 
causa de hipokalemia. Una disminución en la concentración plasmática de K+ disminuye la 
cantidad de K+ unido a proteínas, y estos sitios de unión pueden unir a cambio H+ 
disminuyendo así la concentración plasmática de H+. Además la secreción de H+ también se 
ve aumentada en colector en respuesta a un aumento en el flujo y a la cantidad de NaCl que 
llega a este sitio (12). 
Los efectos opuestos se observan cuando la función de NCC se encuentra elevada, es decir, se 
desarrolla hiperkalemia y acidosis metabólica. Esto se ha visto en personas con enfermedades 
genéticas cuya fisiopatología se explica principalmente por aumentos en la función de NCC 
(32), o en modelos animales transgénicos en que esta función está aumentada (57). 
 
 
II.4 Clonación de NCC 
 
El primer DNAc de NCC que fue clonado fue el de un pez que pertenece a la clase de los 
teleosteos, Pseudopleuronectes americanus o lenguado de invierno (30). 
Evidencias previas indicaban que los mecanismos de reabsorción de NaCl eran similares en 
TCD de mamíferos y en la vejiga urinaria de este pez. 
Se demostró que en ambos epitelios la reabsorción de Na+ y Cl- era interdependiente, y que la 
tasa de reabsorción de éstos era idéntica. El transporte era además electroneutro, ya que no 
 13
generaba cambios en el voltaje transepitelial (92), (74). También se observó que esta actividad 
era sensible exclusivamente a diuréticos tipo tiazida (86), (17), (24). De hecho, la observación 
original que demostró que las tiazidas inhiben a un transportador de NaCl fue llevada a cabo 
en la vejiga urinaria del lenguado (85) y posteriormente en TCD de mamífero (17), (24). La 
incapacidad de los diuréticos deasa, bumetanida y furosemida (inhibidores de NKCC), de 
inhibir este transporte, y la observación de que la presencia de K+ no era necesaria para este, 
indicaban que se trataba de un mecanismo diferente al observado en el asa ascendente gruesa, 
cuya estequiometría propuesta era Na+/K+/2Cl- (86), (93). También se descartó que se tratara 
de un transporte paralelo de Na+/H+ y Cl-/HCO3
-, que resultara en una entrada neta de NaCl 
electroneutra, ya que no se observó sensibilidad a amilorida (inhibidor del intercambiador 
Na+/H+), ni a estilbenos (inhibidores del intercambiados de Cl-/HCO3
-) (86), (24). Finalmente, 
en ambos epitelios se observó que la inhibición de la reabsorción de NaCl con tiazidas 
resultaba en un aumento en el transporte transepitelial de calcio (17), (103). 
Debido a que las tasas de transporte eran mayores en la vejiga de lenguado que en el TCD de 
mamífero, y a que la vejiga urinaria de lenguado representaba una oportunidad de acceder 
más fácilmente a una mayor cantidad de tejido que presentara este tipo de transporte, el 
primer gen clonado fue el de esta especie. 
Para la clonación se utilizó una técnica de expresión funcional basada en el sistema de 
expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis. (Esta técnica será explicada a detalle más 
a delante en la sección de metodología, ya que fue una herramienta esencial en el presente 
trabajo). Se fraccionó por tamaño el RNA extraído de la vejiga de lenguado, se inyectó éste 
en ovocitos de rana y después de cierto periodo de incubación se observó la capacidad de cada 
fracción de generar un transporte de 22Na+ sensible a tiazidas y dependiente de la presencia de 
Cl- en el medio. Una vez identificada la fracción capaz de producir esta actividad, se sintetizó 
DNAc, el cual se clonó en el plásmido adecuado para generar una biblioteca a partir de la cual 
se pudiera sintetizar nuevamente RNAc. La biblioteca de DNAc se dividió aleatoriamente en 
grupos a partir de los cuales se sintetizó RNAc que fue inyectado en ovocitos para lograr 
detectar la actividad del cotransportador. El grupo que presentó esta actividad fue 
progresivamente subdividido hasta que se aisló una sola clona que correspondía a un DNAc 
de 3.7 kb que por sí sola inducía la expresión de un cotransportador de NaCl sensible a 
tiazidas en los ovocitos. La clona fue secuenciada y en 1993 se publicó su estructura primaria, 
junto con un análisis del perfil de inhibición por diferentes diuréticos y distintas tiazidas, una 
predicción topológica computacional, y un análisis de la expresión del cotransportador en 
diferentes tejidos del lenguado (30). 
 14
La secuencia clonada contenía un único marco de lectura abierto de 3069 nucleótidos que 
correspondía a una proteína de 1023 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 112 
kDa. A esta proteína se le llamó inicialmente CST (cotransportador sensible a tiazidas), 
aunque posteriormente se le llamó también NCC (cotransportador de Na+/Cl-), una vez que 
se identificaron otras proteínas relacionadas filogenéticamente. 
Al inyectar RNAc de CST en ovocitos se observó que el transporte de Na+ mediado por NCC 
es insensible a bumetanida, furosemida, amilorida (inhibidor de ENaC), EIPA (inhibidor del 
intercambiador Na+/H+), estilbenos o acetazolamida (inhibidor de la anhidrasa carbónica, 
AC). Este último hallazgo tiene importancia histórica debido a que el grupo sulfonamida (-
SO2NH2) que presentan todas las tiazidas, les confiere en teoría la habilidad de actuar como 
inhibidores de la anhidrasa carbónica, por lo que se pensó por años que las tiazidas debían su 
acción diurética, al menos en parte, a este efecto. Estudios previos, habían demostrado que la 
acción natriurética de las tiazidas administradas en animales no se debían a una actividad 
como inhibidor de la AC, ya que la administración de otros inhibidores clásicos de la AC no 
producían este efecto (54). Sin embargo, la clonación y expresión del cotransportador fue la 
prueba definitiva de que la inhibición del transporte no se debía a la inhibición de la anhidrasa 
carbónica: como ya se dijo, el transporte era insensible a acetazolamida, además de que el 
perfil de potencia relativa de distintas tiazidas para inhibir a la actividad de NCC, resultó ser 
completamente distinto al perfil con que inhiben a la AC (30). 
El DNAc de NCC de lenguado se utilizó como sonda para clonar el NCC de mamífero, 
mediante técnicas basadas en la homología de secuencias. Se clonó el gen de NCC de rata, 
junto con el gen de NKCC2, ya que el grado de identidad entre ambos cotransportadores 
resultó ser del 50%, ya que estos pertenecen a la misma familia de proteínas (29). Hasta el 
momento se han identificado molecularmente el NCC de ratón, conejo y humano. El grado de 
identidad entre los NCC de mamífero es superior al 90% y de cada uno de ellos en relación 
con el lenguado es de aproximadamente 60% (95), (83), (59). 
 
 
II.5 Expresión 
 
Desde 1988 Beaumont et al. (8) realizaron estudios de unión (binding) con [3H]metolazona en 
rata e identificaron dos sitios de unión para las tiazidas. Uno de baja afinidad (Kd=289 nM), 
que observaron en varios tejidos, y otro de alta afinidad (Kd= 4.27 nM), presente únicamente 
en membranas de corteza renal, con un perfil de afinidad por distintas tiazidas similar al de su 
 15
potencia como diuréticos. Se observó mediante análisis de autoradiografía in situ que la 
[3H]metolazona se unía específicamente en los TCD (9), lo que concordaba con los resultados 
de los trabajos de localización funcional mediante microperfusión previamente mencionados 
(ver apartado II.2). 
La clonación del NCC generó herramientas más poderosas para estudiar la expresión y 
localización del cotransportador tales como sondas para análisis de Northern blot e 
hibridación in situ (29), iniciadores para análisis de RT-PCR en nefronas individuales (101) o 
anticuerpos para análisis de Western blot e immunofluorescencia (72), (6). 
En el caso del NCC de lenguado (NCCfl) se detectó, mediante Northern blot, la expresión de 
un transcrito de 3.7 kb específico de la vejiga urinaria, y un transcrito de 3 kb, producto de un 
empalme alternativo que elimina los primeros 299 aminoácidos (que comprenden la región 
amino terminal y las primeras tres regiones TM), presente en diversos tejidos incluyendo 
gónadas, intestino, ojo, cerebro, músculo esquelético y corazón (30). Sin embargo, las 
consecuencias funcionales de esta modificación en la secuencia no se conocen aún. 
Por otro lado, en la rata se observó, mediante Northern blot, la presencia exclusiva de NCC en 
riñón, y mediante estudios de hibridación in situ e inmunofluorescencia, se delimitó la 
expresión a únicamente la región correspondiente a TCD, y más específicamente a las 
microvellosidades apicales de este segmento. Se encontró que la abundancia de la proteína es 
mayor en las zonas más proximales del TCD y va disminuyendo gradualmente conforme se 
aproxima hacia el túbulo conector (29; 72). 
En años recientes se ha logrado determinar que existe expresión del NCC en otros tejidos 
fuera del riñón que incluyen el intestino (7) y el hueso (23). En este último tejido la presencia 
de NCC podría explicar el efecto benéfico que tienen las tiazidas sobre la densidad mineral 
ósea y la prevención de fracturas patológicas (50; 77). 
 
 
II.6 Familia SLC12 
 
NCC pertenece a la familia de acarreadores de solutos SLC12 según la base de datos del 
comité de nomenclatura de la organización del genoma humano, HUGO, por sus siglas en 
inglés (Human Genome Organization) (39), (1). Esta familia está conformada por 9 
miembros, incluidos en base a la homología de secuencias entre ellos, pero únicamente se 
conoce la función de 7 de éstos. En la figura 3 se puede observar el árbol filogenético de la 
familia, así como el porcentaje de identidad entre cada miembro. 
 16
Los 7 miembros cuya función se conoceson cotransportadores electroneutros de cationes 
acoplados a Cl-. Dos subfamilias son claramente identificadas. Una es la que utiliza sodio 
(con o sin potasio) como catión y cuenta con tres miembros: NCC, NKCC1 y NKCC2 y la 
otra utiliza únicamente potasio como catión y está compuesta par 4 miembros: KCC1-4. El 
grado de identidad entre ambas subfamilias es de 25%, mientras que entre los miembros de 
cada subfamilia varía entre el 50 y 70%. El grado de identidad de NCC con los otros 
transportadores de la subfamilia que utiliza sodio es de 50%. Esta similitud en la secuencia se 
refleja en una topología muy similar con 12 regiones TM y un asa extracelular entre las TM 7 
y 8. Sin embargo, NKCC1 y NKCC2 presentan una diferencia funcional importante respecto 
a NCC, ya que, además de Na+, transportan K+, con una estequiometría de 1Na+:1K+:2Cl-, de 
tal forma que se conserva la electroneutralidad. La dirección de transporte para esta 
subfamilia, en condiciones fisiológicas, es hacia el interior de la célula, ya que está dirigido 
por el gradiente de Na+. 
 
 
 
 
Por otro lado, los KCCs medían la salida de iones de la célula ya que el transporte está 
determinado por el gradiente de K+. En este caso la estequiometría es 1:1, como en el caso de 
NCC y se trata también de proteínas de 12 regiones TM, sin embargo, la topología es un poco 
diferente, ya que el asa extracelular y los sitios de glicosilación se encuentran entre las 
regiones TM 5 y 6 (31). 
 
Figura 3. Árbol filogenético de la familia SLC12 
 
 17
 
II.7 Estructura del NCC: Topología y formación de dímeros. 
 
Topología. Desde que se conoció la secuencia primaria del cotransportador se realizó un 
análisis de hidropatía, utilizando el método de Kyte-Doolittle, a partir del cual se propuso una 
estructura topológica de 12 dominios transmembranales (TM) con los extremos amino y 
carboxilo del lado citoplásmico (30). Esta predicción coincidió con las predicciones hechas 
posteriormente para los cotransportadores de la misma familia, NKCC1 y NKCC2 (98), (29). 
El único trabajo experimental que se ha llevado a cabo hasta el momento para determinar la 
validez de estas predicciones topológicas fue hecho en el 2000 por el grupo de Turner (33). 
Estos autores realizaron una comparación de predicciones topológicas para NKCC1 hechas 
con distintos métodos teóricos conocidos, y encontraron discrepancias entre ellos. Las 
principales discrepancias se concentraban en las regiones TM 9 a 12, ya que en esta zona, el 
análisis de hidropatía revelaba 2 regiones hidrofóbicas de ~36 aminoácidos que algunos 
métodos interpretaban como 4 regiones TM, 9, 10, 11 y 12, mientras que otros métodos sólo 
las interpretaban como 2 regiones, prediciendo así estructuras de únicamente 10 segmentos 
TM. 
Los autores usaron entonces un método bioquímico para analizar la capacidad de cada 
segmento TM de insertarse a la membrana. Se usó un sistema de traducción in vitro, y lo que 
se traducía era cada uno de los segmentos TM predichos, solos o por parejas, fusionados a 
secuencias de glicosilación en el extremo C-terminal. Exponiendo estos péptidos generados a 
microsomas (vesículas membranosas formadas a partir de restos de retículo endoplásmico), se 
evaluó la capacidad de inserción mediante la presencia o no de glicosilación, la cual sólo se 
podía producir si la secuencia era insertada en la membrana del microsoma y expuesta a la 
maquinaria de glicosilación presente en el interior de éste. 
Los primeros 8 segmentos, con una longitud típica de 20 aminoácidos cada uno, demostraron 
la capacidad de funcionar como secuencias de anclaje en membrana. Por otro lado, las 
regiones 9-10 y 11-12, de ~36 aminoácidos cada una, demostraron la capacidad de insertarse 
en la membrana cuando se traducían en parejas, en una conformación que cruzaba 2 veces la 
membrana, de tal forma que el extremo amino quedara del mismo lado que el carboxilo. Se 
propuso entonces que cada una de estas dos grandes zonas hidrofóbicas de 36 residuos 
podrían estar formando, en vez de una sola gran alfa hélice, un par de hélices compactadas, 
atravesando 2 veces la membrana, una conformación que recibe el nombre de “horquilla 
 18
helicoidal” (helical hairpin) (62), (63). Otra posibilidad propuesta fue que se formara una 
estructura no helicoidal o parcialmente helicoidal. 
 
Formación de dímeros. Existen varias evidencias de que los cotransportadores de la familia 
de NCC tienen la capacidad de formar dímeros (21), (84), (15), (65). Específicamente para 
NCC, el grupo de Bindels (21) utilizó distintas estrategias para demostrar esto. Se hicieron 
ensayos de Western blot de extractos totales de proteínas membranales de ovocitos inyectados 
con cRNA de NCC. Estos extractos fueron o no tratados con un agente químico (DTBP) que 
favorece la formación de enlaces covalentes entre moléculas, de tal forma que al revelar el 
Western blot de los extractos tratados con DTBP y los no tratados, se observaron diferencias 
importantes: en los extractos tratados desaparecieron las bandas de bajo peso molecular 
correspondientes a la proteína monomérica y aumentó la intensidad de las bandas 
correspondientes a conformaciones multiméricas. Un análisis cuidadoso del tamaño de las 
conformaciones multiméricas utilizando la técnica de centrifugación en gradiente de glucosa, 
reveló que estas formas migraban como un complejo molecular de 310 kDa, lo cual 
correspondía a una conformación homodimérica (NCC sin glicosilaciones pesa ~110 kDa, 
pero glicosilado pesa ~140 kDa). Se hicieron ensayos de coinmunoprecipitación a partir de 
ovocitos coinyectados tanto con NCC fusionado a un epítope HA, como con NCC fusionado 
al epítope FLAG, y se observó que en los extractos obtenidos de la inmunoprecipitación con 
HA, se podían revelar proteínas marcadas con FLAG y viceversa. Finalmente, se 
construyeron dímeros concatenados, esto es fusiones de dos moléculas completas de NCC, 
una después de la otra. Se observó que la inyección en ovocitos de una fusión de dos 
cotransportadores silvestres generaba una actividad tipo NCC similar a la que se observa 
cuando se inyecta NCC silvestre. Esto comprobó la capacidad de NCC de funcionar como 
Figura 4. Topología de NCC. 
 19
homodímero. Sin embargo, no se analizó la posibilidad de que los dímeros concatenados 
llegaran a la membrana y que, ahí, cada una de las moléculas fusionadas funcionaran como 
entidades diferentes con sus sitios de unión y poro hidrofílico propios, es decir que no se 
necesitara de ambas moléculas para formar un transportador funcional (21). En relación a 
esto, es relevante mencionar, que cuando se hicieron experimentos de dímeros concatenados, 
pero con el transportador NKCC2, en los que se fusionaron un cotransportador silvestre y uno 
mutante (con una mutación que no afectaba la llegada a la membrana, sino la actividad basal 
de este) se observó una disminución del 50% en la actividad, en relación al concatenado 
silvestre/silvestre. Si dos moléculas de NCC se necesitaran para generar la estructura 
funcional del cotransportador, tal vez se esperaría que si una de estas dos moléculas presenta 
mutaciones que impiden su función, todo el cotransporte se vea afectado, no sólo el 50% (84). 
Sin embargo, por otra parte, para KCC1, en un trabajo en el que se construyeron mutantes con 
el extremo amino terminal truncado, las cuales no eran funcionales a pesar de tener una 
expresión en membrana normal, se observó que éstas mutantes tenían un efecto dominante 
negativo cuando se coexpresaban en ovocitos junto con el cotransportador silvestre, lo cual 
parecía indicar alguna especie de interacción funcional. En apoyo a esto se logró además 
coinmunoprecipitar a las especies mutantes junto con las especies silvestres (15). La 
discrepancia entre lo observado con NKCC1 y KCC1 podría deberse a que tal vez la mutación 
hecha en NKCC1 no afecta la interacción entremonómeros, pero aquella en KCC1 si lo hace. 
Por lo tanto, queda claro que el transportador tiene la capacidad de formar dímeros y que la 
estructura dimérica es funcional. Sin embargo, aún no se sabe si esta interacción es esencial 
para la función o si la estructura monomérica también es funcional, así como si la función de 
una subunidad afecta la función de la otra. También está en duda la naturaleza de la 
interacción entre subunidades: ya sea que los aminoácidos de ambas moléculas participen en 
la generación de un sólo poro hidrofílico compartido y de un sitio de unión para los sustratos 
de transporte, o que cada subunidad del dímero funcione como una entidad de transporte 
independiente con su poro y sitios de unión propios. 
En la literatura se han reportado ya estructuras cristalográficas de varios transportadores 
membranales que forman homodímeros. En varias de estas estructuras cada unidad 
monomérica forma una unidad funcional diferente, con sus propios sitios de unión, y estas 
unidades funcionales se asocian a través de una interfase formada por ciertos segmentos 
transmembranales y, en algunos casos, por el extremo amino o carboxilo terminal (25), (61), 
(100). Algunos de estos transportadores tienen una topología similar a la de NCC, como el 
cotransportador de Na+/Leucina de Aquifex aeolicus, con 12 dominios TM (100), y el 
 20
intercambiador de Na+/Galactosa de Vibrio parahaemolyticus, con 14 regiones TM (25). Por 
lo tanto, no sería aventurado proponer que los dímeros de NCC se ensamblen de manera 
similar. Los datos experimentales sobre los concatenados de NKCC2 (84) apoyan esta 
hipótesis. 
Por otro lado, el un ejemplo en la literatura en que ambas unidades del dímero participan en la 
formación de sitios de unión comunes y un poro común, es el de un intercambiador de 
H+/multidrogas de E. coli, llamado EmrE. Sin embargo, la topología de éste es bastante 
diferente a la de NCC, ya que cada monómero contiene 4 alfa-hélices TM, y por lo tanto, el 
transportador funciona como una entidad homodimérica con únicamente ocho regiones TM 
(81). 
En cuanto a los dominios dentro de la secuencia necesarios para la formación de dímeros 
existe únicamente un trabajo realizado en NKCC1 (70). En éste se vio que el segmento 751-
998 dentro de la región C-terminal es esencial para que esto ocurra, ya que el intercambio de 
esta región entre NKCC1 y otros cotransportadores de la familia fue suficiente para cambiar 
el tipo de cotransportador con el cual se asocia la proteína (únicamente se asocia con otra 
subunidad que tenga esta región C-terminal idéntica). Por lo tanto, al parecer esta región 
determina la especificidad de la interacción, pero probablemente otras regiones de la proteína 
también puedan participar en la interfase entre subunidades. 
 
 
II.8 Caracterización funcional de NCCr y NCCfl 
 
Los primeros estudios de caracterización funcional de NCC se realizaron, ya sea midiendo el 
transporte directamente en el epitelio correspondiente, o en preparaciones membranales de 
éste. Renfro (74) y Velázquez et. al. (94) probaron la interdependencia del transporte de Na+ y 
Cl- en la vejiga urinaria de lenguado y en el túbulo distal de rata, respectivamente, y 
obtuvieron determinaciones aproximadas de las concentraciones necesarias de iones para 
alcanzar el 50% de la actividad máxima. 
Tran et. al. (90) realizaron mediciones en preparaciones membranales de corteza renal de rata 
de unión (binding) de [3H]metolazona, en presencia de diferentes concentraciones de Na+ o 
Cl-, para determinar si la inhibición se podía explicar como una competencia por el sitio de 
unión. Se observó que la unión de [3H]metolazona a las membranas se estimulaba en 
presencia de concertaciones crecientes de Na+, mientras que disminuía en presencia de 
concentraciones crecientes de Cl-. Además la inhibición de la unión de [3H]metolazona por 
 21
Cl- se exacerbaba en presencia de mayores concentaciones de Na+. Por lo tanto, se propuso 
como modelo un sistema de transporte ordenado, que se muestra en la figura 5, en el cual el 
Na+ se une primero al transportador, y favorece la unión ya sea del Cl- o de la metolazona, los 
cuales compiten por el segundo sitio de unión. 
 
 
La robusta expresión funcional lograda en el sistema de expresión hetrólogo de ovocitos de 
Xenopus laevis, posible gracias a la clonación del gen de NCC, permitió, más adelante, una 
caracterización más completa y acertada. En el 2000, Monroy et. al. (64) determinaron los 
valores de los parámetros catalíticos del transportador de rata (NCCr). A través de un ajuste 
a la ecuación de Michaelis-Menten (V= Vm*Km/(Km+S)), asumiendo equilibrio rápido, se 
obtuvieron valores de Km para Na+ y Cl- de 7.6 ± 1.6 mM y 6.3 ± 1.1 mM respectivamente 
(Figura 6, Tabla 1). Esto concuerda con los valores aproximados reportados previamente por 
Velázquez et. al. de las concentraciones de iones necesarias para alcanzar el 50% del 
transporte máximo en epitelio de túbulo distal de rata, los cuales estaban alrededor de 10 mM 
(94). La Km es una constante de equilibrio que refleja la afinidad del sustrato de transporte 
por el transportador, y de manera matemática se puede demostrar que, en estas condiciones, 
representa la concentración de sustrato necesaria para alcanzar el 50% de la velocidad 
máxima (a mayor Km, menor afinidad). Por lo tanto la comparación con los datos de 
Velázquez et. al. es válida. 
Figura 5. Modelo propuesto por Tran et. al. (90) sobre el mecanismo de transporte de NaCl mediado por NCCr. 
 22
 
 
 
 
 
 
 NCCr NCCfl NCCm 
 Monroy et. al. 
{Monroy, A, 
 2000} 
Moreno et. al. 
{Moreno, E, 
2006} 
Gamba et. al. 
{Gamba, G, 
 1993} 
Vázquez et. al. 
{Vázquez, N, 
 2002} 
Moreno et. al. 
{Moreno, E, 
 2006} 
Sabath et. al. 
{Sabath, E, 
 2004} 
Km Na+ 7.6 ± 1.6 mM 5.5 ± 1 mM 25 ± 0.4 mM 58.2 ± 7.1 mM 30 ± 6 mM 7.2 ± 0.4 mM 
Km Cl- 6.3 ± 1.1 mM 2.6 ± 0.6 mM 13.6 ± 0.2 mM 22.1 ± 4.2 mM 15 ± 2 mM 5.6 ± 0.6 mM 
IC50 
Metolazona 
5 x 10-7 M 3 x 10-7 M ND 5 x 10-6 M 4 x 10-6 M 4 x 10-7 mM 
 
 
 
 
 
 
Las determinaciones de Monroy et. al. se realizaron en presencia de concentraciones 
saturantes del contraion en el medio (es decir, del ion cuya concentración permanece fija 
cuando se realiza la cinética, midiendo la actividad de transporte en presencia de 
Figura 6. Cinética de transporte de iones y de inhibición por metolazona comparativa entre NCCfl (líneas 
punteadas) y NCCr (líneas contínuas). Se utilizó el sistema de expresión funcional de ovocitos de X. laevis. 
A) Captación de Na+ dependiente de la [Na+] extracelular. La [Cl-] utilizada fue de 96 mM. B) Captación de 
Na+ dependiente de la [Cl-] extracelular. La [Na+] utilizada fue de 96 mM (Figuras del artículo original de 
Moreno et. al., 2006) (66). 
Tabla 1. Comparación de los valores obtenidos para distintos parámetros cinéticos del NCC de distintas 
especies. Se muestran también los valores obtenidos para el transportador de una misma especie en diferentes 
trabajos. Las discrepancias observadas son producto de pequeñas variaciones en la metodología utilizada, sin 
embargo, siempre se observa una diferencia entre los transportadores de mamíferos y el transportador de 
lenguado. 
 
 23
concentraciones crecientes del ion variable, cuya Km se quiere obtener). Posteriormente se 
hicieron experimentos con la finalidad de conocer si la concentración del contraion presente 
en el medio podía afectar los valores de Km obtenidos. Se observó que, en las cinéticas de 
Na+, un aumento en la concentración de Cl- extracelular aumenta tanto la afinidad por Na+ 
(disminuye la Km), como la velocidad máxima (Vm) del transporte. Cuando el Cl- es el ion 
variable en la cinética un aumento en la concentración extracelular de Na+ tiene el mismo 
efecto. Por lo tanto, se propuso como modelo para explicar la cinética de transporte un 
sistema de unión al azar en el cualcualquiera de los dos iones puede unirse primero al 
transportador, y la unión del primer ion aumenta la afinidad con que se une el segundo. El 
valor de las constantes que describen como se altera la afinidad no fueron determinadas. Es 
importante mencionar que este modelo se contrapone a aquel propuesto por Tran et. al. (90) el 
cual proponía un sistema de unión ordenado en que el Na+ era el primer ion en unirse y 
favorecía así la unión del segundo sustrato. Aunque aún no esta claro, la discrepancia 
probablemente sea producto de las diferencias en la metodología utilizada. 
En cuanto a la afinidad por las tiazidas, se determinó la potencia de distintos tipos de éstas 
realizándose curvas de dosis-respuesta a partir de las cuales se determinaron los IC50 para 
cada una de ellas (concentración de inhibidor con la cual se alcanza el 50% de inhibición). 
Estos resultados se presentan en la figura 7. El perfil de inhibición observado fue el siguiente: 
politiazida > metolazona = bendroflumetiazida > triclorometiazida > hidroclorotiazida. 
 
 
 
 
 
A B 
Figura 7. Perfil de inhibición del NCCr (A) y NCCfl (B) por distintos tipos de tiazidas. Los compuestos usados 
con NCCr fueron: politiazida (▲), metolazona (■), bendroflumetiazida (□), triclorometiazida (○), e 
hidroclorotiazida (●). Los compuestos usados con NCCfl fueron: metolazona (□), politiazida (■), 
bendroflumetiazida (●), triclorometiazida (○) y clortalidona (▲) (64),(91). 
 
 24
Además se exploró la capacidad de las concentraciones extracelulares de Na+ y Cl- de afectar 
la afinidad (medida como el IC50) del transportador por los inhibidores, y se observó que tanto 
el Na+ como el Cl- disminuían la afinidad (figura 8). Esto último también se contrapone, hasta 
cierto punto al modelo propuesto por Tran et. al., el cual se basaba en la observación de que el 
Na+ aumentaba la afinidad por metolazona, contrario a lo observado en este caso. Por lo tanto, 
los autores propusieron a partir de este trabajo, un nuevo modelo de unión al azar de los iones 
en el que las tiazidas compiten por el sitio de unión de ambos sustratos de transporte. 
 
 
 
 
 
En un trabajo posterior, Vázquez et. al. caracterizaron al cotransportador de lenguado (NCCfl) 
y realizaron una comparación con el cotransportador de rata (NCCr) (91). Se observó que el 
NCCfl exhibe una menor afindad por ambos sustratos de transporte con valores de Km para 
Na+ y Cl- de 58.2 ± 7.1 mM y 22.1 ± 4.2 mM respectivamente (Figura 6, Tabla 1). Al igual 
que en NCCr las afinidades por ambos iones disminuyen al disminuir la concentración del 
contraion en el medio. Las diferencias en afinidad por los iones probablemente representan 
una adaptación evolutiva que permiten al transportador de mamífero una mayor actividad en 
presencia de concentraciones menores de sustratos, ya que las células de TCD se exponen a 
menores concentraciones de iones que el epitelio de la vejiga de lenguado. Esto se ve apoyado 
por los valores de Km del cotransportador de raton (NCCm) (el único transportador de otra 
especie caracterizado funcionalmente) que son similares a los de NCCr (76) (ver tabla 1). 
La afinidad por tiazidas también es al menos un orden de magnitud menor que la del NCCr, 
con un IC50 para metolazona de ~5 x 10
-6 M. El perfil de inhibición es similar, ya que todos 
Figura 8. Figura original del artículo en donde se demuestra que la concentración extracelular de Na+ y Cl- 
afecta la afinidad por metolazona en NCCr. La concentración de metolazona utilizada fue de 5 x 10-7 M 
(equivalente al IC50 para este inhibidor) (64). 
 25
los diuréticos tipo tiazida evaluados presentaban una menor afinidad pero una potencia 
relativa similar a la observada en NCCr (figura 7): metolazona > politiazida > 
bendroflumetiazida > triclorometiazida > clortalidona. 
 
 
II.9 Diuréticos tipo tiazida 
 
Importancia clínica. Los diuréticos tipo tiazida se utilizan desde 1957 para el tratamiento de 
hipertensión, y de estados edematosos como en insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia 
renal crónica, insuficiencia hepática crónica y síndrome nefrótico. La clorotiazida fue la 
primer tiazida utilizada, además de haber sido el primer agente antihipertensivo efectivo 
disponible para uso clínico (78), (96). Este tipo de compuestos se generaron de manera 
empírica sin conocimiento previo de su mecanismo de acción, y fue hasta 1993, con la 
clonación de NCC, en que se demostró, sin lugar a dudas, que este cotransportador es blanco 
de este tipo de diuréticos (30). La inhibición de la actividad de NCC afecta la reabsorción de 
NaCl a nivel de TCD, que no puede ser compensada por los segmentos más distales y se 
produce así un efecto diurético. Por lo tanto, se cree que el aumento en la excreción urinaria 
de NaCl se traduce en una disminución del volumen circulante, disminuyendo el retorno 
venoso, el gasto cardiaco y finalmente la presión arterial (PA) (43). 
 
Figura 9. Mecanismo mediante el cual las tiazidas reducen la presión arterial al disminuir la reabsorción renal de 
Na+. La disminución en el volumen circulante y en el volumen sanguíneo que llega al corazón disminuye el 
gasto cardiaco y, por lo tanto, la presión arterial. La perfusión de tejidos resultante no satisface la demanda 
metabólica, lo que desencadena un fenómeno de autorregulación mediado por vasodilatación que resulta en una 
disminución en la presión arterial acompañada de una resistencia periférica disminuida y un gasto cardiaco 
normal. Adaptado de Lifton, R., 2001 (58). 
 
 
 26
La hipertensión es el factor de riesgo cardiovascular más importante a nivel mundial, 
contribuyendo a la mitad de los casos de enfermedad coronaria y a dos tercios de los casos de 
evento vascular cerebral (19). 
Los resultados de un estudio clínico recientemente publicado, denominado “Antihypertenive 
and Lipid-Lowering Treatment to Prevent Heart Attack Trial” (ALLHAT), demostraron que 
el uso de diuréticos tipo tiazida constituye el tratamiento antihipertensivo más eficiente para 
la prevención de enfermedades cardiovasculares y complicaciones renales (14), (4). Debido a 
esto, a la falta de evidencias que demuestren un riesgo real por efectos secundarios y a la 
buena relación costo-beneficio, las tiazidas han sido recomendadas como tratamiento de 
primera línea para el manejo de la hipertensión arterial en el “Seventh Report of the Joint 
National Committee (JNC) on High Blood Pressure” realizado por institutos nacionales de 
salud (NIH) de Estados Unidos (16) y por los lineamientos del Instituto Nacional para la 
Salud y Excelencia Clínica y de la Sociedad Británica de Hipertensión en Gran Bretaña (80). 
La hipertensión es un problema de salud de alta prevalencia en la actualidad. Los sondeos más 
recientes hechos a gran escala en Estados Unidos revelaron que la prevalencia de hipertensión 
(definida como presión sistólica >140 mm Hg y/o presión diastólica >90 mm Hg y/o estar 
bajo tratamiento hipertensivo), estandarizada por edad, es de 28.9%, con un estimado de 50 
millones de personas hipertensas en este país, y revelaron también un aumento en la 
prevalencia con respecto a los resultados de sondeos anteriores (19). Esto resalta la relevancia 
de las tiazidas que son, por lo tanto, uno de los fármacos más prescritos a nivel mundial. 
Las tiazidas tienen dos usos alternativos, no relacionados con el efecto de éstas sobre el 
volumen circulante, sino con su efecto sobre la concentración plasmática y urinaria de calcio. 
Como se vio en la sección II.2, el tratamiento con tiazidas aumenta la reabsorción renal de 
Ca2+, y por lo tanto aumenta la concentración plasmática y disminuye la concentración 
urinaria de este catión. Por esta razón, las tiazidas también son utilizadas para el tratamiento 
de osteoporosis y de litiasis renal, padecimientos en los cuales un aumento en el Ca2+ 
plasmático y una disminución en la [Ca2+] tubular, respectivamente, sonfavorables. 
 
Mecanismo de acción. A pesar de que se sabe que NCC es blanco de los diuréticos tipo 
tiazida existe controversia respecto al mecanismo de acción mediante el cuál estos fármacos 
funcionan como antihipertensivos. El efecto de la administración aguda del fármaco sobre la 
presión arterial es claramente debido a la disminución en el volumen circulante de la que ya 
se habló, ya que esta disminución es observable, además de que, si se reexpande el volumen 
mediante la administración de dextrán, se reestablecen los niveles de presión arterial previos 
 27
al tratamiento. Sin embargo, las causas de la disminución en la PA como resultado de la 
administración crónica de tiazidas son más controversiales. Hay quienes piensan que este 
efecto no se debe a la disminución en la reabsorción de NaCl a través de NCC, sino a un 
efecto vascular directo en que disminuyen las resistencias periféricas totales. Esta hipótesis se 
basa en diversas evidencias experimentales. Por ejemplo, existe un bajo grado de correlación 
observado entre la potencia diurética y la potencia antihipertensiva. Además, a largo plazo, 
los efectos en la PA se mantienen a pesar de que el volumen circulante y el volumen de fluido 
extracelular regresan a los niveles pre-tratamiento (43). 
Por otro lado, la hipótesis a favor del mecanismo vía NCC, se ve apoyada por la existencia de 
enfermedades genéticas mendelianas, ocasionadas por defectos en la función de NCC. Los 
pacientes con síndrome de Gitelman, un enfermedad autosómica recesiva ocasionada por 
mutaciones inactivantes del NCC (por defectos en el procesamiento de la proteína) (76), (55), 
desarrollan hipotensión a partir de la segunda década de la vida. Además presentan 
hipokalemia, hipocalciuria, alcalósis metabólica, hipomagnesemia, poliuria, polidipsia y 
niveles plasmáticos de renina elevados. Todos estos efectos también se observan en pacientes 
en tratamiento con tiazidas. La hipotensión se desarrolla de manera tardía ya que el exceso en 
la excreción urinaria de sal es inicialmente compensado por un aumento en la ingesta y a la 
estimulación del eje renina-angiotensina-aldosterona que reestablecen el volumen circulante 
(18). Esto demuestra que la inhibición sostenida del transportador sí ejerce un efecto sobre la 
PA que no puede ser completamente compensado por otros mecanismos fisiológicos. 
Un dato importante es que el uso de tiazidas no disminuye la presión arterial en pacientes 
normotensos, en contraste con lo observado en los hipertensos. Esto podría explicarse por una 
deficiencia en algún mecanismo compensatorio en los pacientes hipertensos, que no son 
capaces de contrarrestar la deficiencia en la reabsorción al contrario de lo que ocurre en los 
normotensos. 
Los ratones knockout para NCC, que imitan la deficiencia de los pacientes con síndrome de 
Gitelman, no tienen alteraciones en la PA en condiciones normales, pero si se les administra 
una dieta baja en Na+ desarrollan hipotensión. Por lo tanto, al parecer el defecto funcional de 
NCC puede ser compensado en condiciones basales, pero no en su participación en la 
regulación de la cantidad de Na+ corporal (79), (43). 
Un estudio recientemente publicado demostró que mutaciones espontáneas en el gen de NCC, 
o sea, variantes alélicas de baja frecuencia, que tienen un efecto negativo sobre la función del 
cotransportador, previenen el desarrollo de hipertensión (49). Esto representa otra evidencia 
de que la inhibición sostenida de NCC puede afectar de forma continua la PA. 
 28
Otra enfermedad genética ilustrativa es el síndrome de Gordon, que es una imagen en espejo 
del síndrome de Gitelman, es decir, todos los elementos alterados en Gitelman están alterados 
en sentido contrario en los pacientes con Gordon. Se trata de un padecimiento autosómico 
dominante en que se encuentra mutado alguno de dos genes que codifican para cinasas 
llamadas WNK1 o WNK4 (With No Lysine). Éstas participan, entre otras cosas, en la 
regulación de la actividad de NCC y el efecto de las mutaciones, al menos parte de éste, es el 
de aumentar la actividad del cotransportador. Esto se sabe gracias a experimentos in vitro e in 
vivo que han demostrado los efectos que pueden tener estas cinasas sobre la actividad de 
NCC, y porque los pacientes con síndrome de Gordon presentan hipersensibilidad al 
tratamiento con tiazidas para corregir la PA, lo cual podría indicar que la hipertensión es 
efectivamente causada por un incremento en la actividad de NCC. Esto es otra prueba más de 
que el efecto antihipertensivo de las tiazidas se relacionan con el efecto de éstas sobre este 
cotransportador. 
 
Efectos secundarios. Como ya se dijo, la intoxicación durante el tratamiento con tiazidas 
provoca efectos similares a lo observado en pacientes con síndrome de Gitelman: 
hipokalemia, hipocalciuria, alcalósis metabólica e hipomagnesemia. De estos efectos la 
hipokalemia es la complicación más temida, sin embargo, puede ser fácilmente manejada 
mediante la utilización de suplementos de cloruro de potasio, la co-administración de 
diuréticos ahorradores de potasio como amilorida, o de inhibidores de la enzima convertidora 
de angiotensina (IECAs). Estos fármacos bloquean la secreción de K+ en túbulos colectores 
que es precisamente la vía mediante la cual se pierde este catión por la acción de las tiazidas. 
A pesar de ser recomendadas por varios lineamientos internacionales para el manejo de la 
hipertensión (16), (80), los diuréticos tipo tiazida son menos utilizados de lo esperado. Esto se 
debe, al menos en parte, a la observación hecha en algunos estudios clínicos de que las 
tiazidas pueden provocar un pequeño aumento en los niveles de glucosa sérica, lo que ha 
provocado preocupación respecto a un potencial efecto adverso a largo plazo, renal y 
cardiovascular. Sin embargo, no hay datos que claramente comprueben este efecto. Los 
estudios más extensos hechos hasta ahora, como el ALLHAT y el SHEP (Systolic 
Hypertension in the Elderly Program), no han observado una correlación entre la 
administración de diurético y un aumento en el desarrollo de diabetes espontánea, al 
compararse con el grupo placebo. Además los efectos cardiovasculares benéficos siguen 
existiendo en los pacientes diabéticos de ambos estudios. Sin embargo, algunos piensan, que 
 29
los efectos adversos no han podido ser notados en los ensayos clínicos realizados hasta el 
momento por no ser éstos lo suficientemente prolongados. 
El mecanismo mediante el cual se generan los aumentos en la glucosa sérica secundarios al 
tratamiento con tiazidas se desconocen hasta el momento. Se ha propuesto que esto podría ser 
un efecto secundario a la hipokalemia, y que por lo tanto la observación constante de los 
niveles séricos de K+ y el mantenimiento de estos prevendrían los efectos sobre la glicemia. 
Sin embargo, de ser así, cualquier manipulación que pudiera alterar la concentración sérica de 
K+, como el uso de diuréticos de asa, debería tener el mismo efecto, y este no es el caso (14). 
Es interesante notar que los pacientes con Gitelman no presentan hiperglicemia. Además el 
estudio de los niveles de glucosa sérica en personas con mutaciones en NCC que previenen el 
desarrollo de hipertensión, hecho recientemente en integrantes de la población del 
Framingham Heart Study (FHS), demostró que la actividad disminuida de NCC no se 
relaciona con alteraciones en el metabolismo de glucosa, ni con la prevalencia de diabetes 
(49). Esto sugiere que si la relación observada entre uso de tiazidas y disglicemia es real, el 
mecanismo podría ser independiente del efecto de las tiazidas sobre NCC. En relación a esto, 
existen varios datos experimentales que sugieren la existencia de un segundo sitio de unión 
para las tiazidas en el organismo. Algunos ejemplos son la detección de un sitio de unión 
inespecífico y ubicuo de baja afinidad para [3H]Metolazona (8) yla detección de un 
transporte de Na+:Cl- sensible a tiazidas en túbulo colector de rata (88), en donde no se ha 
podido detectar la presencia de NCC. Si fuera el caso de que los efectos hiperglicemiantes de 
las tiazidas se debieran a un mecanismo independiente de NCC, entonces el desarrollo de 
compuestos más específicos y más potentes, que se pudieran administrar a menores dosis, 
sería una posibilidad para evitar este tipo de efectos secundarios. 
 
Estructura química de las tiazidas. Estrictamente el término “tiazida” se usa para nombrar a 
aquellos compuestos que son derivados de benzotiadiazina. Tal es el caso de diuréticos como 
la clorotiazida, hidroclorotiazida, bendroflumetiazida, politiazida, etc. Estas fueron 
desarrolladas hace ya más de 50 años a partir de inhibidores de la anhidrasa carbónica y por lo 
tanto poseen un grupo sulfonamida que les confiere la capacidad de actuar como inhibidores 
de esta enzima, además de la actividad inhibidora específica que ejercen sobre NCC (78), 
(96). Posteriormente se desarrollaron otros compuestos que también son inhibidores 
específicos de NCC, cuya estructura base no era la benzotiazidina, y que por lo tanto no eran 
estricamente tiazidas. Por esta razón a estos compuestos se les denominó diuréticos tipo 
 30
tiazida. Algunos ejemplos son las quinazolinonas como metolazona, las benzofenonas 
sustituidas como la clortalidona y las indolinas como la indapamida. 
En la figura 10 se puede ver la estructura química de estos compuestos y también se presenta 
la estructura de la benzotiadiazina base, así como aquellas de otros compuestos útiles para una 
comparación, por ejemplo la estructura de acetazolamida (inhibidor de la AC que no tiene 
efecto sobre NCC), de una tiazida no diurética (diazóxido), y de los diuréticos de asa, 
bumetanida y furosemida. Es fácil notar que la constante presente en todos los inhibidores de 
NCC es un anillo bencénico con dos grupos químicos contiguos: una sulfonamida y un grupo 
electronegativo, cloro en la mayoría de los casos, aunque en la bezoflumetiazida encontramos 
flúor. La incapacidad del diazoxido de actuar como diurético revela la relevancia del grupo 
sulfonamida para conservar esta actividad. Por otro lado, la acetazolamida carece del grupo 
electronegativo, además de que la el grupo sulfonamida no está sobre un anillo bencénico sino 
sobre un anillo pentamérico. Finalmente, los diuréticos de asa, poseen también un grupo 
sulfonamida, pero no requieren de la presencia de un grupo electronegativo contiguo y 
además se caracterizan también por la presencia de un grupo carboxilo ausente en los 
diuréticos tipo tiazida. 
En conclusión, la presencia de un grupo sulfonamida y un grupo electronegativo contiguo 
parece ser necesaria para la interacción específica fármaco-NCC. Probablemente estos grupos 
establezcan interacciones químicas específicas con las cadenas laterales de ciertos 
aminoácidos de NCC, y por lo tanto, en cualquier estudio sobre el sitio de unión de las 
tiazidas al cotransportador se debe considerar esta información. 
 
 31
 
 
 
 
 
 
II.10 Trabajos previos de estructura-función en NCC. 
 
Debido a la dificultad que representa la cristalización de proteínas de membrana, hasta el 
momento no se conoce la estructura cristalográfica de ninguno de los miembros de la familia 
SLC12. Por lo tanto, se han realizado diversos trabajos de estructura-función con el objetivo 
de obtener información sobre esta estructura de manera indirecta. Este tipo de trabajos 
consisten en la identificación de elementos estructurales a través de modificaciones 
cuantificables en la función del transportador. 
El primer trabajo de este tipo realizado en relación a NCC consistió en la construcción de 
quimeras entre los cotransportadores apicales NCC y NKCC2. Esto se hizo con el fin de 
identificar los dominios involucrados en definir la especificidad por los distintos tipos de 
inhibidores: diuréticos tipo tiazida vs. diuréticos de asa, y el tipo de catión transportado: K+ y 
Figura 10. Estructura química de las tiazidas, de diuréticos tipo tiazida y de compuestos no 
tiazídicos que también tienen actividad diurética. En rojo se señala los elementos que son una 
constante a lo largo de todos los compuestos que tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad de 
NCC. 
 32
Na+ vs. sólo Na+. Las quimeras generadas intercambiaban el dominio amino terminal, el 
dominio carboxilo terminal, o ambos. Los resultados revelaron que el dominio central 
hidrofóbico define el tipo de actividad que tiene el transportador: si transporta o no potasio, 
así como el tipo de diurético que inhibe su actividad. Esto además probó que, de acuerdo a lo 
esperado, en esta región se localizan los sitios de unión tanto de los iones como de los 
inhibidores (89). 
En otro trabajo, Hoover et. al. estudiaron los efectos de mutaciones introducidas en los dos 
posibles sitios de glicosilación de la proteína de rata, localizados en el asa extracelular entre 
TM7 y TM8, de acuerdo a las predicciones hechas por hidropatía. Se demostró la existencia 
de glicosilación in vivo al observar una disminución en el peso de la proteína tras el 
tratamiento con N-glicosidasa F, a partir de proteínas extraídas de riñón de rata. Después se 
realizaron ensayos de captación en ovocitos de Xenopus laevis con las clonas mutantes, y se 
observó una disminución en la actividad del 50% en las clonas con un solo sólo sitio mutado, 
y del 90% con los dos sitios mutados. Se comprobó que esta disminución se debía a una 
alteración en el procesamiento de la proteína que impedía la llegada de ésta a la membrana 
celular. Finalmente, se observó que el prevenir la glicosilación aumentaba la afinidad del 
transportador tanto por Cl- como por metolazona, y se propuso que esto se debía a un 
impedimento estérico para la unión del Cl- o del diurético ejercido por los carbohidratos que 
desaparecía al prevenirse la glicosilación (42). 
Con estos antecedentes, en 2006 Moreno et. al. publicaron un trabajo del cual una parte estaba 
enfocado en conocer si este efecto de las glicosilaciones también podía ser observado en 
NCCfl, pero se observó que en el NCCfl la eliminación de los tres sitios de glicosilación de 
este transportador no tiene efecto ni en la afinidad por Cl-, ni en la afinidad por metolazona. 
Además se construyeron quimeras entre NCCfl y NCCr que intercambiaban exclusivamente 
el asa extracelular entre las regiones TM 7 y 8 (asa 7-8) y mutantes en que se eliminaron los 
sitios de glicosilación correspondientes a ese transportador y se introdujeron los de la otra 
especie. Esto se hizo con el fin de determinar si las diferencias en afinidad observada entre 
cotransportadores (ver sección II.7) podía atribuirse a elementos estructurales en esta región, 
dada la evidencia previa de la posibilidad de alterar valores cinéticos al modificar la 
glicosilación. Sin embargo, los resultados fueron negativos ya que todos los cotransportadores 
en los que se insertaron elementos de su contraparte mostraron afinidades similares a la del 
cotransportador original, demostrando que los elementos estructurales que determinan las 
diferencias en afinidad no se encuentran en esta zona (66). 
 33
En un trabajo en que se analizó el efecto de diversos polimorfismos sobre la actividad del 
cotransportador se identificó uno de ellos, el G264A, que disminuye la actividad al 50% sin 
afectar la síntesis, glicosilación o tráfico de la proteína, y que tiene una mayor afinidad por Cl- 
y metolazona. Éste trabajo, junto con el de Hoover et. al. ya mencionado, presentaron 
evidencia apoyando una antigua noción de que el Cl- y las tiazidas compiten por el mismo 
sitio de unión en el cotransportador, lo cual fue inicialmente propuesto por Tran et. al. (90) 
desde antes de la clonación de éste. 
El análisis quimérico realizado en el trabajo de Moreno et. al. de 2006 (66) no sólo se limitó