Presencia-de-CD117-ALDH1-y-celulas-madre-tumorales-de-osteosarcoma-en-la-biopsia-diagnostica-y-su-asociacion-con-la-respuesta-a-la-quimioterapia-neoadyuvante

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICAS, 
ODONTLÓGICAS Y DE LA SALUD 
 
“PRESENCIA DE CD117, ALDH1 Y CÉLULAS MADRE TUMORALES DE OSTEOSARCOMA 
EN LA BIOPSIA DIAGNÓSTICA Y SU ASOCIACIÓN CON LA RESPUESTA A LA 
QUIMIOTERAPIA NEOADYUVANTE” 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS 
MIGUEL ÁNGEL CLARA ALTAMIRANO 
 
TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: 
M. EN C. SILVIO ANTONIO ÑAMENDYS SILVA 
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
CLAUDIA HAYDEE SARAÍ CARO SÁNCHEZ 
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA 
M. EN C. ERNESTO ANDRÉS DELGADO CEDILLO 
INSTITUTO NACIONAL DE REHABILITACIÓN 
CIUDAD DE MÉXICO. ENERO 2019 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
II 
 
COLABORADORES 
 
Dr. Alejandro López Saavedra 
Q.F.B. María de Lourdes Peña Torres 
Q.F.B. Guadalupe Moncada Claudio 
Dr. Carlo César Cortés González 
Dr. José De La Luz Díaz Chávez 
Dr. Dorian Yarih García Ortega 
Dr. Mario Cuéllar Hubbe 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para Bárbara, Sofi y Mich
 
 
I 
 
INDICE 
MARCO TEORICO 1 
FACTORES PRONÓSTICOS EN OSTEOSARCOMA 2 
1. Localización del tumor 3 
2. El tamaño del tumor 3 
3. Edad del paciente 4 
4. Presencia y localización de metástasis 5 
5. Tipo de cirugía y márgenes quirúrgicos 5 
6. Niveles séricos elevados de fosfatasa alcalina y deshidrogenasa láctica 6 
7. Respuesta a la quimioterapia 7 
CÉLULAS MADRE TUMORALES DE OSTEOSARCOMA 8 
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS CÉLULAS MADRES 
TUMORALES. 9 
1. Aislamiento basado en la expresión de marcadores de superficie 10 
2. Aislamiento basado en propiedades celulares intrínsecas 11 
3. Aislamiento de la tinción y población lateral 11 
4. Actividad de la aldehido deshidrogenasa 12 
5. Caracterización funcional de las células madre de osteosarcoma 13 
6. Ensayo de dilución limitante (LDA) 13 
7. Multipotencialidad 15 
LA DIFERENCIACIÓN DEL OSTEOBLASTO Y SU DISRUPCIÓN EN 
OSTEOSARCOMA 16 
Origen celular 18 
Factores de señalización que influyen en las células madre tumorales de 
osteosarcoma 19 
CD133 22 
CD 44 23 
CD117 25 
ALDH1 26 
 
 
II 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 28 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 28 
JUSTIFICACIÓN 29 
HIPOTESIS 29 
OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN 29 
OBJETIVO GENERAL 30 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 30 
MATERIAL Y MÉTODOS 30 
CRITERIOS DE INCLUSIÓN: 31 
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN 32 
CRITERIOS DE ELIMINACIÓN: 32 
DEFINICIÓN DE LAS VARIABLES 33 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 36 
CONSIDERACIONES ETICAS 36 
RESULTADOS 37 
CONCLUSIÓN 44 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45 
ANEXO 1. CLASIFICACIÓN DE HUVOS 54 
ANEXO 2. MICROSCOPIO AXIO SCAN Z1 55 
ANEXO 3. BITÁCORA DEL EXPERIMENTO FINAL 57 
ANEXO 4. IMÁGENES DE INMUNOFLUORESCENCIA MULTIPLEX 69 
 
 
 
 
1 
MARCO TEORICO 
 
El termino osteosarcoma se aplica a un grupo heterogéneo de neoplasias malignas 
que tienen como característica común la producción de hueso inmaduro denominado 
osteoide1. Es el sarcoma óseo más frecuente, sin embargo, corresponde tan sólo al 
0.01% de todos los cánceres1 – 3. 
 
El rango de distribución por edad es bimodal, con un primer pico de incidencia 
durante la segunda década de la vida y un segundo pico de incidencia mucho menor en 
paciente mayores de 60 años. El porcentaje de incidencia es claramente específico de la 
edad, durante las primeras dos décadas de la vida y después de los 60 años el riesgo 
para el desarrollo del osteosarcoma es similar con una incidencia de 4.4 y 4.2 por millón 
respectivamente. El 60% de los pacientes se encuentran entre los 10 y 20 años. La 
población entre la tercera y sexta década de la vida tienen una incidencia de 1.7 por 
millón1 - 3. 
 
 En adolescentes es uno de los tumores más frecuentes sobrepasado solamente 
en incidencia por las leucemias y los linfomas. El osteosarcoma corresponde al 2.6% de 
todas las neoplasias pediátricas1-3. 
 
La mayoría de los osteosarcomas se originan en huesos largos, principalmente en 
el fémur distal y tibia proximal. El osteosarcoma se disemina por vía hematológica siendo 
los pulmones el principal sitio de metástasis1, 4 – 6. 
 
 
 
2 
 El síntoma más frecuente es el dolor que puede presentarse durante semanas o 
meses, este dolor sin embargo cada vez se vuelve más severo y eventualmente se 
acompaña por inflamación y aumento de volumen6. Se presenta, además, aumento de la 
temperatura local y se limita la movilidad de la articulación más cercana. Al momento del 
diagnóstico algunos pacientes presentan pérdida de peso, lo cual se suele asociar con 
enfermedad sistémica6. 
 
 La presentación radiográfica del osteosarcoma varía ampliamente, el tumor puede 
ser completamente lítico o esclerótico, pero usualmente se presenta de forma mixta, 
ocasionando una reacción perióstica que se presenta como imagen en rayos de sol o con 
la formación de un triángulo de Codman. El tumor exhibe un patrón de crecimiento 
destructivo con una transición gradual desde zonas líticas hasta zonas esclerosas 
pasando por hueso normal lo cual ocasiona que los bordes de la lesión no se encuentren 
bien definidos2 y 6. 
 
FACTORES PRONÓSTICOS EN OSTEOSARCOMA 
 
En un análisis de 1702 pacientes con osteosarcoma del esqueleto axial y las 
extremidades tratados en el COSS (Cooperative Osteosarcoma Study Group) se 
identificaron los siguientes factores pronósticos en osteosarcoma5: 
 
 
 
 
 
 
3 
1. Localización del tumor 
 
La localización característica del osteosarcoma es en las metáfisis de los huesos 
largos, sin embargo, se puede llegar a presentar en el esqueleto axial, esta localización 
corresponde a menos de 4% de los casos. La gran mayoría de estas lesiones suelen 
suceder como osteosarcomas secundarios a radioterapia o a la presencia de una 
enfermedad de Paget ósea5. 
 
 Aproximadamente el 50% de los casos están localizados en la región de la rodilla. 
La metáfisis distal del fémur se encuentra afectada 2.5 veces más frecuentemente que la 
metáfisis proximal de la tibia. El húmero proximal es el tercer sitio de frecuencia y 
corresponde al 15% de todos los casos. Menos del 10% de los osteosarcomas ocurren 
en la mandíbula y otros huesos craneofaciales5. 
 
El sacro es el sitio más frecuente de localización en el esqueleto axial. En 
pacientes mayores de 60 años el osteosarcoma de los huesos planos y la columna 
vertebral ocurren en aproximadamente el 40% de los casos5. 
 
2. El tamaño del tumor 
 
Takeuchi y colaboradores7 encontraron que la presencia de tumores menores a 5 
cm y sin metástasis a distancia es un predictor independiente de la supervivencia global 
y del período libre de enfermedad. 
 
 
 
4 
Otros autores han reportado que la presencia de metástasis al momento de la 
recurrencia local es un factor pronóstico negativo7, 8 y 9. Bacci y colaboradores10 reportaron 
que la supervivencia a cinco años posterior a la recurrencia fue de 29% para pacientes 
que solo presentaban recurrencia local mientras que fue del 0% para aquellos pacientes 
con recurrencia local y metástasis a distancia10. 
 
 Los osteosarcomas en esqueleto axial, principalmente aquellos localizados en 
pelvis y sacro suelen ser de mayortamaño que aquellos localizados en extremidades, 
debido a que suelen cursar con síntomas difusos que dificultan la posibilidad de un 
diagnóstico temprano, los osteosarcomas localizados en columna cervical o dorsal suelen 
asociarse con síntomas de compresión medular y daño neurológico5. 
 
3. Edad del paciente 
 
La mayoría de los pacientes (60%) se encuentran entre los 10 y 20 años de edad. 
Este pico de incidencia en pacientes adolescentes corresponde con el pico de 
crecimiento esquelético que se presenta durante este periodo. Las zonas metafisarias 
son las que mayor crecimiento presentan y por lo tanto son las más frecuentemente 
afectadas5. 
 
 
 
 
 
 
 
5 
4. Presencia y localización de metástasis 
 
Como se mencionó previamente el osteosarcoma se disemina por vía 
hematógena, por lo tanto, debemos tener en cuenta tres tipos de metástasis que se 
pueden presentar en los pacientes con esta enfermedad. 
 
a) La primera de ellas son las metástasis satélites las cuales se 
caracterizan por presentarse a nivel de la pseudocápsula del tumor. 
 
b) El segundo tipo son las metástasis saltatorias que consisten en 
lesiones metastásicas del osteosarcoma localizadas en una región 
más proximal del mismo hueso en donde se originó el tumor y que 
se encuentra fuera de la pseudocápsula del mismo. 
 
c) El tercer tipo son las metástasis a distancia en donde el principal sitio 
de localización son los pulmones1. 
 
5. Tipo de cirugía y márgenes quirúrgicos 
 
La cirugía (salvamento de la extremidad o amputación) permanecen como parte 
esencial en el tratamiento de los pacientes con osteosarcoma11. Estudios que han 
comparado la cirugía de salvamento de la extremidad y la amputación en pacientes con 
osteosarcoma de alto grado, no metastásico no han mostrado ninguna diferencia 
significativa en la supervivencia global y en el periodo libre de la enfermedad12 - 14. Sin 
 
 
6 
embargo la cirugía de salvamento de la extremidad se ha asociado con una mejor 
resultado funcional15. La amputación está reservada para los pacientes con 
osteosarcoma que no sean candidatos a salvamento de la extremidad con adecuados 
márgenes quirúrgicos13 y 16. 
 
6. Niveles séricos elevados de fosfatasa alcalina y deshidrogenasa láctica 
 
Han sido identificados como indicadores pronósticos en pacientes con 
osteosarcoma. En una cohorte de 1421 pacientes con osteosarcoma, Bacci y 
colaboradores9 reportaron niveles séricos más altos de deshidrogenasa lácticas en 
pacientes con osteosarcoma metastásico en comparación con pacientes con 
enfermedad localizada (36.6% vs 18.8%; P<.0001). El período libre de enfermedad a 
cinco años correlacionado con los niveles séricos de deshidrogenasa láctica (39.5% 
para pacientes con niveles elevados de DHL y 60% para pacientes con valores 
normales). En otro análisis retrospectivo de 789 pacientes con osteosarcoma Bacci y 
colaboradores8 reportó que el periodo libre de enfermedad a cinco años fue de 24% 
en aquellos pacientes con valores de más de cuatro veces el valor normal superior 
mientras que en pacientes con valores normales el período libre de enfermedad a 
cinco años es de 46%. 
 
 
 
 
 
 
 
7 
7. Respuesta a la quimioterapia 
 
Diferentes estudios han demostrado que el factor más importante para predecir la 
supervivencia de los pacientes con osteosarcoma es la respuesta a la quimioterapia 
neoadyuvante5, 7, 8 y 9. 
 
La adición de los ciclos de quimioterapia neoadyuvante y adyuvante a la cirugía 
ha mejorado la evolución de los pacientes con osteosarcoma, incrementando la 
supervivencia en aquellos pacientes con enfermedad localizada en las extremidades en 
un 70%. 5 y 8. 
 
Los primeros ensayos utilizaron esquemas de quimioterapia que incluían al menos 
tres o más de las siguientes drogas: doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, ifosfamida, 
dactinomicina y altas dosis de metotrexate17 - 20. 
 
En un ensayo aleatorizado realizado por el grupo europeo de osteosarcoma 
demostraron que la combinación de doxorrubicina y cisplatino fue mejor tolerada en 
comparación con ciclos multidroga (Cisplatino, doxorrubina y metotrexate / Cisplatino, 
doxorrubicina, metotrexate e ifosfamida) sin diferencias significativas en la sobrevida y 
un mayor periodo libre de enfermedad (65% y 55% a cinco años respectivamente) en 
pacientes con osteosarcoma resecable localmente no metastásico21, 22. 
 
El sistema utilizado para calificar el efecto de la quimioterapia preoperatoria es la 
clasificación de Huvos. 
 
Este sistema divide en cuatro grados la respuesta al tratamiento 
 
 
8 
según la necrosis observada: grado 1: necrosis menor del 50%; grado 2: necrosis mayor 
del 50% y menor del 90%; grado 3: necrosis mayor del 90% y grado 4: necrosis del 
100%22, 23. (Anexo 1). 
 
Una buena respuesta histopatológica a la quimioterapia neoadyuvante es aquella 
que consigue un porcentaje de necrosis tumoral >90% (Huvos III y IV)24 - 26. Bacci y 
colaboradores demostraron que el periodo libre de enfermedad y la sobrevida global 
tenían una correlación significativa con la respuesta histológica a la quimioterapia. El 
período libre de enfermedad fue de 67.9% en buenos respondedores mientras que en 
pobres respondedores fue del 51.3% (P<0.0001) y la sobrevida global en buenos 
respondedores fue del 78.4% y en pobres respondedores fue del 63.7% (P<0.0001). En 
la actualidad la resistencia a la quimioterapia en los pacientes con osteosarcoma con una 
pobre respuesta corresponde al 35 – 40% de los pacientes 27.
 
 
CÉLULAS MADRE TUMORALES DE OSTEOSARCOMA 
 
Se ha confirmado la presencia de células madre tumorales en osteosarcoma3, 28. 
Estas células constituyen una población heterogénea que presentan un alto rango de 
proliferación, crecimiento invasivo y son generalmente más agresivas que el resto de las 
células cancerígenas3, 29. La existencia de células madre de osteosarcoma fue 
primeramente demostrado por Gibbs y cols. Identificando una subpoblación de células 
en muestras de tejido de osteosarcoma humano y líneas celulares que fueron capaces 
de crecer como racimos30, 31. 
 
 
 
9 
Estos racimos celulares referidos como sarcoesferas u osteoesferas tienen la 
capacidad de diferenciación osteogénica. Estudios posteriores indican que la formación 
de esferas celulares en las líneas de osteosarcoma puede iniciar tumores y son 
resistentes a los agentes quimioterapéuticos32 y 33. 
 
Diferentes marcadores de células madre tumorales se han correlacionado 
recientemente con modelos de ratones con osteosarcoma. En ratones con deleción del 
gen Rb o de p53 se observa que en los linajes osteoblásticos el osteosarcoma se origina 
con un 100% de penetrancia. Las células aisladas de estos tumores murinos son 
multipotenciales y poseen una capacidad significativa para la formación de esferas con 
una alta expresión de diferentes antígenos de superficie. Además de la capacidad de 
formación de esferas, las células madre tumorales de osteosarcoma presentan como 
mínimo en su superficie los marcadores CD133 y CD4432, 33 y otras propiedades como 
son la habilidad para retener o eliminar medicamentos exhibiendo altas cantidades de 
aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1)34. 
 
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS CÉLULAS MADRES 
TUMORALES. 
 
La mayoría de las técnicas para el aislamiento de las células madre tumorales de 
osteosarcoma confían en métodos que explotan las diferencias entre las células madre 
tumorales y el resto de la población tumoral. El principal problema de estos métodos es 
asumir que tales diferencias son irreversibles y que existe sólo un tipo primario de 
 
 
10 
población de células madre tumorales35. Los diferentes métodos para el aislamiento de 
las células madre tumorales se resumen a continuación: 
 
1. Aislamiento basado en la expresión de marcadores de superficie 
 
 Esta estrategia de aislamiento confía en la expresióndiferencial de los marcadores 
de superficie en la fracción correspondiente a las células madre tumorales. 
Desafortunadamente, las células madre mesenquimales normales no tienen bien definida 
una organización jerárquica de las células como en el folículo piloso, el intestino o el 
sistema hematopoyético y no hay un claro consenso sobre los mejores marcadores de 
células tumorales que se deban utilizar36. 
 
 Múltiples marcadores de superficie de forma única o en combinación han sido 
utilizados para identificar y aislar células madre tumorales de osteosarcoma tanto en 
líneas celulares como en muestras de tejido humano. Sin embargo, estos resultados 
deben interpretarse con cautela ya que la expresión del marcador es altamente 
dependiente de la línea celular utilizada36. Además, la expresión del marcador difiere 
entre especies y es variable en función del método de aislamiento, esto queda claro en 
estudios que demuestran la presencia de diferentes fracciones de CD133 dependiendo 
de las condiciones de cultivo37. 
 
 
 
 
 
11 
2. Aislamiento basado en propiedades celulares intrínsecas 
 
 Un supuesto común es que las células madre tumorales son relativamente 
inactivas con bajas tasas de proliferación y sometidas a divisiones celulares asimétricas. 
El rango de retención de las tinciones es inversamente proporcional al rango de división 
celular. Mientras que las células que se dividen lentamente retinen las tinciones, las 
células con una división rápida diluyen el colorante en sus membranas rápidamente34. 
 
 Dado que las células madre tumorales son capaces de una división asimétrica, 
se supone que la célula en estado latente retiene la tinción en la membrana por períodos 
más largos en comparación a las células hijas más diferenciadas que se dividen 
rápidamente y forman la mayor parte de la población tumoral. Esta técnica fue utilizada 
para aislar PKH26+ en células de osteosarcoma humano. La expresión genética muestra 
que PKH26+ revela la presencia de células más inmaduras comparadas con el resto de 
las células de la población tumoral. Sin embargo, esta fracción PKH26 + es mucho más 
grande que la fracción CD133 +, nuevamente apuntando a la identificación de diferentes 
subpoblaciones de células con diferentes métodos de identificación34. 
 
3. Aislamiento de la tinción y población lateral 
 
 Muchos reportes han demostrado que las células madre tumorales son 
resistentes a los medicamentos quimioterapéuticos debido a una alta expresión de 
transportadores de medicamentos tales como el transportador multidroga de eflujo ABC. 
 
 
12 
Esta propiedad ha sido utilizada para aislar células madre tumorales de osteosarcoma en 
líneas celulares y en muestras de biopsias de osteosarcoma humano. 
 
La población lateral en los sarcomas óseos consiste en una población formadora de 
esferas que puede rápidamente iniciar tumores con una mayor frecuencia. 
Adicionalmente la población lateral es capaz de generar una división asimétrica 
generando tanto una fracción de población lateral como una fracción no población 
lateral38. 
 
4. Actividad de la aldehído deshidrogenasa 
 
 La búsqueda de un marcador universal para células madre tumorales ha llevado 
a investigar la enzima de desintoxicación de drogas, aldehído deshidrogenasa (ALDH1) 
como un posible candidato. El método de identificación (ensayo aldefluor) se basa en la 
actividad enzimática de ALDH1 para convertir un sustrato no fluorescente en uno 
fluorescente, lo que permite el aislamiento de ALDH1. Las células de osteosarcoma 
ALDH1+ fueron encontradas en las fracciones formadoras de esferas y se han asociado 
con una población más agresiva39. 
 
 Una advertencia a todos estos ensayos es que ellos dependen en dos principales 
conceptos, el primero es que las células madre tumorales proliferan más lentamente que 
el resto de la población y el segundo es que las células madre tumorales retienen o 
excluyen tinciones de forma diferente al resto de la población celular39. 
 
 
 
13 
5. Caracterización funcional de las células madre de osteosarcoma 
 
La caracterización funcional de las células madre tumorales es por ensayos rigurosos 
que utilizan dos aspectos principales de estas células: 
 
a) La capacidad de dar origen a un tumor similar al tumor de origen en un huésped 
inmunocomprometido. 
 
b) La capacidad de generar células de diferentes linajes que componen el tejido de 
origen. Esta caracterización funcional es usualmente una secuela de técnicas de 
aislamiento y es un requisito absoluto para establecer la identidad de las células 
madre tumorales39. 
 
La habilidad de formar sarcoesferas/osteoesferas ha sido demostrada y bien 
correlacionada con la habilidad de formar tumores39. 
 
6. Ensayo de dilución limitante (LDA) 
 
 Este es el estándar de oro para establecer la identidad de una célula tumoral 
como una célula madre tumoral. Este ensayo es dependiente de la habilidad de las 
células madre tumorales de formar tumores de una manera dosis – dependiente y que 
exhibe una relación linear. En otras palabras, una célula tumoral es designada como una 
célula madre tumoral si esta es capaz de iniciar tumores con una mayor frecuencia y en 
un número menor de células comparada con el resto del tumor. La validez de un ensayo 
 
 
14 
de dilución limitante es altamente dependiente de la linealidad de la relación entre el 
número de células y la formación del tumor en el modelo murino. La carencia de 
respuesta inmune que es un importante regulador del crecimiento tumoral in vivo, así 
como la presencia de señales específicas de la especie y deben interpretarse con 
precaución. Además, dada la íntima asociación del tumor con su microambiente el sitio 
de la inyección también contribuye a la eficacia de la iniciación del tumor. Los modelos 
ortotópicos en los que las células tumorales son depositadas en nichos óseos son un sitio 
preferido para evaluar células madre tumorales de osteosarcoma40. 
 
 El LDA puede ser aplicado para evaluar la formación de esferas in vitro, aunque 
el mecanismo por el cual las células madre preferencialmente forman esferas clonales es 
desconocido. El ensayo está basado en evaluar la capacidad de auto-renovación de las 
poblaciones de células tumorales que son capaces de crecer bajo condiciones libres de 
suero. Sin embargo, los ensayos que se basan en la formación de esferas se encuentran 
bajo crítica por las siguientes razones: 
 
a) Incapacidad para determinar la presencia de mayores densidades celulares 
 
b) Incapacidad para detectar células madre en estado latente 
 
 Por lo tanto, el establecer la presencia de clonalidad puede resultar difícil, 
especialmente si existe una mayor densidad celular en donde el agrupamiento es 
observado. Sin embargo, esto puede ser advertido incorporando un abordaje LDA para 
establecer que una simple célula madre tumoral pueda dar origen a esferas39, 40. 
 
 
15 
 
7. Multipotencialidad 
 
 A diferencia de la mayoría de las células tumorales las células madre tumorales 
presentan divisiones simétricas y asimétricas que se diferencian en diferentes tipos 
celulares que pueden ser encontrados en el tejido original y son por lo tanto consideradas 
multipotenciales. Aunque la definición de una célula madre tumoral no incluye la 
multipotencialidad esta es una característica esencial de las células madre. Al igual que 
las células madre mesenquimales, las células madre tumorales de osteosarcoma también 
pueden diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo el estímulo 
apropiado39, 41. 
 
 Las células madre tumorales de osteosarcoma son fáciles de caracterizar por 
ensayos de multipotencialidad debido a la simplicidad de los protocolos de diferenciación 
y a la facilidad de identificación de los diferentes tipos celulares. Estos ensayos in vitro 
son generalmente conducidos después de hacer una separaciónbasada en marcadores 
para caracterizar la fracción de células madre de la que no39, 41. 
 
 Los ensayos de multipotencialidad asociados en combinación con los análisis de 
LDA proveen la mejor evaluación disponible para la obtención de células madre 
tumorales39. 
 
 
 
 
16 
LA DIFERENCIACIÓN DEL OSTEOBLASTO Y SU DISRUPCIÓN EN 
OSTEOSARCOMA 
 
 Las células madre tumorales de osteosarcoma comparten algunas propiedades 
con sus contrapartes normales y la formación del tumor ha sido asociada con una 
organogénesis anómala. La naturaleza heterogénea del tejido de osteosarcoma indica la 
presencia de células arrestadas en diferentes estadios de diferenciación y su desarrollo 
coincide con periodos en los que el hueso sufre rápido crecimiento o remodelación39. 
 
 Las células madre mesenquimales son células madre somáticas que pueden 
diferenciarse en muchos linajes incluidos adipocitos, osteoblastos o condrocitos los 
cuales pueden seguir proliferando llegar a una diferenciación terminal o irse a apoptosis. 
Durante la formación ósea células inmaduras del linaje de los osteoblastos se diferencian 
en osteoblastos maduros que son los responsables de la síntesis, deposición y 
mineralización de la matriz para formar hueso42. 
 
 Las células osteoprogenitoras primitivas se originan de las células madre 
mesenquimales que originan el linaje de los osteoblastos diferenciándose en pre-
osteoblastos y osteoblastos maduros. Algunos marcadores son conocidos que pueden 
utilizarse para distinguir los estadios de diferenciación a lo largo de este linaje, el que 
actúa de forma más temprana y es un regulador clave en la diferenciación del osteoblasto 
es el factor de transcripción RUNX2/CBFA1, mientras que osterix (OSX)/SP7, otro 
regulador clave de la osteoblastogénesis funciona rio debajo de RUNX2. Como 
expresiones preosteblasto RUNX2 y OSX promueven la diferenciación a lo largo del linaje 
 
 
17 
osteoblástico y gradualmente detienen la proliferación mientras sintetizan y depositan 
proteínas de matriz principalmente colágeno tipo 1. La diferenciación procede a 
osteoblastos maduros con la expresión de osteocalcina. (OCN). Finalmente, la matriz 
está mineralizada para generar hueso39, 42. 
 
 Aunque los osteosarcomas son tumores heterogéneos entremezclados con 
osteoide y hueso, la enfermedad se caracteriza por un incremento en la proliferación y 
una diferenciación defectuosa. La perdida de la diferenciación es un hallazgo pronóstico 
que se encuentra en los osteosarcomas de alto grado. Mientras que en la enfermedad de 
bajo grado se encuentra asociada con una morfología bien diferenciada39. 
 
 Los dos supresores tumorales Rb y p53 se encuentran comúnmente inactivados 
en el osteosarcoma y son también requeridos para la inactivación de los osteoblastos. La 
proteína Rb interactúa con un incremento en la actividad transcripcional de RUNX2 
incrementando la diferenciación de los osteoblastos. Estos hallazgos han sido 
corroborados con hueso de ratones con Rb noqueado que exhiben un desarrollo 
esquelético con numerosos defectos en los osteoprogenitores que son incapaces de 
someterse a un fin del ciclo celular. De hecho, un déficit en el Rb condiciona un 
incremento en la capacidad de formar esferas multipotenciales hallazgos similares se 
reportan en ratones con hueso específico con p53 noqueado mostrando un defecto en la 
diferenciación ósea con una alta propensión para el desarrollo de osteosarcoma39,44. 
 
 
 
18 
 Es altamente probable que la mutación de Rb o de p53 alteren la programación 
de la diferenciación ósea seleccionando así progenitores inmaduros con ADN defectuoso, 
checkponits dañados y una propensión a acumular otras mutaciones39, 44. 
 
 Los osteosarcomas preservan un mecanismo de deubiquitinación de la misma 
forma que lo hacen las células madre mesenquimales. Ellos encontraron que las 
proteinas ID (inhibidoras de unión de DNA) que antagonizan a la vía del Rb se encuentran 
perpetuadas por la enzima deubiquitinizante USP1. Altos niveles de proteínas ID 
promueven el hallazgo de células madre y bloquean la diferenciación osteoblástica. El 
bloqueo de la proteína USP1 en osteosarcoma permite la desestabilización de ID 
permitiendo un arresto celular y diferenciación. Por lo tanto, aunque las células madre de 
osteosarcoma puedan tener cierta capacidad para una división asimétrica y dar origen a 
células hijas bien diferenciadas el osteosarcoma se caracteriza por una diferenciación 
defectuosa39. 
 
Origen celular 
 
 Aunque la mayoría de los investigadores asumen que el osteosarcoma se origina 
de células madre mesenquimales el estado de la célula de origen permanece dificil de 
establecer. En modelos de ratones con osteosarcoma espontáneo en los cuales Rb y p53 
se encuentran inactivados en el linaje de osteoblastos, el rastreo del origen es de una 
célula osteoprogenitora. Alternativamente, la pérdida de Rb y p53 en una célula madre 
tumoral puede conferir la capacidad de desdiferenciar a un estadio más primitivo. Esto 
es, porque las células madre tumorales de osteosarcoma mantienen la capacidad de 
 
 
19 
formar múltiples linajes, esto representa una des-desdiferenciación de osteoprogenitores 
que adquieren propiedades similares a las células madre mesenquimales manteniendo 
la multipotencialidad debido a esta características44. 
 
Factores de señalización que influyen en las células madre tumorales de 
osteosarcoma 
 
 Un componente importante de la diferenciación osteoblástica es el nicho de 
células madre de la médula ósea. La médula ósea es una fuente de células madre 
hematopoyéticas y mesenquimales y estas dos poblaciones se pueden diferenciar 
basados en ensayos fenotípicos y funcionales. Las células madre mesenquimales 
pueden mantener a las células de osteosarcoma en un estado desdiferenciado a través 
de la secreción de citocinas tales como la interleucina – 6. En un reciente trabajo 
publicado por Brune y colaboradores sugieren que las células madre mesenquimales 
aisladas desde muestras de osteosarcoma humano son genéticamente distintas de las 
células tumorales, sugiriendo que el mantenimiento de un nicho separado de células 
madre mesenquimales puede ser crucial en el mantenimiento de las células de 
osteosarcoma en un estado desdiferenciado45. 
 
 Aparte de las células madre mesenquimales, la médula ósea es una rica fuente 
de factores que influyen en la diferenciación ósea. Muchas vías de señalización tales 
como Hedgehog, Notch y MAP cinasa juegan un rol en el mantenimiento de las células 
madre en el linaje del osteoblasto y pueden jugar un rol en el mantenimiento de las células 
madre tumorales de osteosarcoma. Mientras que BMP tiene normalmente una función 
 
 
20 
pro-diferenciación está ha sido reportada que disminuye en osteosarcoma. El factor de 
crecimiento de fibroblastos (FGF) ha sido implicado en el mantenimiento del nicho de 
células madre tumorales y sirve como un mecanismo potencial de enlace para el 
desarrollo de células madre de osteosarcoma. La función del FGF es uniéndose a su 
factor receptor de crecimiento de fibroblastos (FGFRs). El hallazgo en la activación en la 
mutación del FGFRs causa diferente desordenes autosómicos dominantes en el 
esqueleto humano lo que provee una clara evidencia de la importancia de la señalización 
de FGF en el desarrollo óseo. FGF estimula la proliferación y el bloqueo de la 
diferenciación en osteoblastos maduros e induce la expresión de SOX2. La señalización 
de FGF también induce la proliferación de células madre tumorales mesenquimales. 
Existe evidencia emergente de que la señalización FGF puede jugar un rol en el 
mantenimiento de las células de osteosarcoma45. 
 
 La estimulación de FGF incrementa la proliferación de células de osteosarcoma 
humano y el FGFRs ha sido reportado por ser sobreexpresado en muestras de 
osteosarcoma humano. El tratamiento con inhibidoresde la señalización de la 
señalización de FGF permite la disminución de la expresión de SOX2 y disminuye la 
proliferación en células de osteosarcoma en ratones. Un reporte reciente señala a un rol 
de FGF derivado del estroma en el mantenimiento del estado inmaduro y la agresividad 
del osteosarcoma en un modelo de ratón45. 
 
 La vía WNT juega un importante rol en el desarrollo óseo y múltiples estudios 
han establecido que WNT promueve la diferenciación de los osteoblastos y la formación 
de hueso. En la vía canónica de WNT la transcripción de los genes diana de WNT son 
 
 
21 
regulados por la acumulación de Beta-catenina nuclear. La unión de los WNT´s a sus 
receptores bloquea la fosforilación y degradación de la Beta-catenina la cual es 
translocada al núcleo para regular los genes blanco WNT. Mientras que la activación de 
WNT ha sido asociada al desarrollo de cáncer en células de origen epitelial, tales como 
el cáncer de colon su rol en tumores de origen mesenquimal es como supresor tumoral46. 
 
 Los reportes de la señalización de WNT han generado algunas controversias en 
la literatura sobre su activación y represión en osteosarcoma. Aunque la inactivación de 
un inhibidor de WNT, WIF-1, ha sido asociada con osteosarcoma inducido por radiación. 
Implicando una desregularización en la señalización de WNT, otros grupos han 
demostrado que la señalización de WNT se encuentra regulada a la baja en 
osteosarcoma39, 46. 
 
 Se sugiere que las señalizaciones de FGF y Wnt tienen funciones opuestas en 
el osteosarcoma. FGF incrementa la formación de esferas de osteosarcoma junto con la 
expresión de Sox2 y FGFR2. Así FGF puede incrementar la población de células madre 
mientras que la señalización de WNT está asociada con la diferenciación y el 
mantenimiento controlado de las células madre. En relación con estas observaciones se 
ha encontrado que la señalización de WNT a través de la inhibición de la glucógeno 
sintetasa cinasa (GSK3B) en epitelio humano (cáncer de colon HCT116) y en 
osteosarcoma humano (NYU1) proveen resultados contrastantes: mientras que la 
activación de la señalización de WNT significa un incremento en el número de esferas 
formadas por células de cáncer de colon, las células de osteosarcoma muestran una 
 
 
22 
dramática disminución en el número de esferas formadas cuando WNT se encuentra 
activo39, 47. 
 
CD133 
 
El Clúster de diferenciación 133 (CD 133) es una glicoproteína de membrana 
producto del cromosoma 4 (4p15.23). Es reconocido como un marcador tanto de células 
madre normales y tumorales. La presencia de CD133 solo o en combinación con otros 
marcadores se ha utilizado para aislar células madre de numerosos tejidos Tiene una 
estructura única, consistiendo en un dominio extracelular amino terminal, 5 dominios 
transmembrana, dos grandes azas extracelulares y una cola citoplasmática. Tiene 8 sitios 
iniciales de N-glicosilación: 5 en el primer aza y tres en la segunda3, 32. Ha sido implicada 
en el movimiento celular lo cual es crucial para los procesos de quimiotaxis, desarrollo 
embrionario, crecimiento invasivo y metástasis. 28, 48, 49. 
 
La molécula CD133 se sobre expresa en células madre de cáncer en varios tipos 
de tumores malignos, como lo son: glioblastoma, pulmón, riñón, melanoma, ovario, 
hígado, colon, retinoblastoma, leucemia mielocítica aguda y leucemia linfocítica aguda. 
Siendo identificadas en todos los casos como CD133+. Además de relacionarse con la 
proliferación y angiogénesis en estos tipos de tumores48, 49. 
 
Las células madre de tumorales CD133+ son capaces de activar una serie de 
mecanismos responsables del crecimiento del tumor y recurrencia tales como activación 
de puntos de control en el ciclo celular para la detección de algún daño al DNA, activación 
 
 
23 
de sistemas de reparación de DNA, alta expresión de proteínas inhibidoras de apoptosis 
y supresoras de apoptosis, expresión de elevados niveles de CXCR4 (receptor de 
quimiocinas de superficie celular) relacionada a alto potencial invasivo, además de que 
se a correlacionado con la sobreexpresión de una proteína denominada “Nestin” 
indicando que las células tumorales están en un estadio diferenciado, con una motilidad 
celular elevada la cual se correlaciona con invasividad y malignidad48, 49. 
 
Se ha observado que las células CD133+ son caracterizadas por una resistencia 
intrínseca a agentes quimioterapéuticos tales como temozolomida, carboplatino, 
paclitaxel y etopósido lo que complica el pronóstico de supervivencia de los pacientes48, 
49. 
 
CD 44 
 
El clúster de diferenciación 44 (CD44) es una glicoproteína que anteriormente se 
pensaba que era una molécula de adhesión transmembrana, pero en la actualidad se 
sabe que cuenta con tres diferentes fases físicas que son un receptor de superficie celular 
transmembrana, un componente integral de la matriz y una fase líquida. Cada una con el 
potencial de ser significativa50. 
 
En patofisiología la expresión aberrante de CD44 ha sido asociada causalmente 
con la diseminación de diversas células malignas y puede permitir la distinción entre 
tumores metastásico y no metastásico. Esta función está asociada con la citosina ligando 
osteopontina50. 
 
 
24 
 
Aunque no se sabe que tan frecuente se expresa o que rol juega en el tejido óseo 
normal. Se ha observado a CD44 en los osteoclastos y osteocitos por medio de 
inmunohistoquímica sin embargo se desconoce su función en estas células. Como CD44 
reacciona con la matriz extracelular muchos reportes lo asocian con un potencial 
metastásico, pronóstico y propiedades biológicas de tumores malignos humanos. Las 
investigaciones de CD44 en los últimos 20 años han establecido funciones adicionales 
como son su capacidad para mediar el crecimiento celular, migración y metástasis50, 51. 
 
La expresión de este receptor en las células tumorales puede apoyar el 
crecimiento del tumor, posiblemente después de la adhesión a hialuronato, osteopontina, 
colágeno, anquirina, fibronectina y metaloproteinasas. Contribuyendo en procesos de 
adhesión, migración y proliferación de células madre en osteosarcoma50, 51. 
 
La isoforma variante de CD44 (CD44V) se ha reportado asociada con un 
incremento en la invasión, metástasis y pobre pronóstico. También se ha reportado que 
CD44V6 puede regular la matriz extracelular, promover la movilidad celular y suprimir la 
apoptosis tumoral. De hecho, CD44V6 se ha implicado como promotor de la progresión 
tumoral. Las proteínas CD44 se han estudiado con relación a la malignidad tumoral y al 
potencial metastásico50, 51. 
 
El valor pronóstico de CD44 para los pacientes con cáncer ha sido reportado en 
varios tumores sólidos como son colon, pulmón y cáncer de mama. Con respecto a 
osteosarcoma, la relación entre la expresión de CD44 y el pronóstico aún permanece 
 
 
25 
controversial. Sin embargo, la expresión de CD44 en osteosarcoma también se asocia 
con la presencia de metástasis y un mayor crecimiento tumoral con respecto a aquellas 
células de osteosarcoma que no presentan CD44 y también se asocia con la inducción 
de oncogenes tales como ras. Esto abre la posibilidad de que la deleción del gen que 
codifica para CD44 pueda influir en la progresión de la enfermedad. Las contribuciones 
de estas diversas funciones de CD44 a la carcinogénesis no se encuentran 
completamente dilucidados50, 51. 
 
Estudios recientes han demostrado que los microRNA pueden influir en la 
quimioresistencia del osteosarcoma con la inclusión de diferentes vías como es la de 
CD44. Esta resistencia a los agentes quimioterapéuticos sigue siendo una de las 
principales razones de falla del tratamiento del osteosarcoma y no excluye el rol de CD44 
en ella. CD44 contiene el sitio de unión de microRNA´s 3´UTR el cual se encuentra 
regulado por los microRNA’s miR-34ª, miR-140 y miR-215. El resultado de estos estudios 
muestraque el nivel de CD44 es inversamente correlacionado con el nivel de microRNA50, 
51. 
 
CD117 
 
El clúster de diferenciación 117 (CD117) es una glicoproteína transmembrana. 
Está codificada por el gen c-kit que está situado en el cromosoma 4 humano (4q12).15, 16 
Se encuentra en condiciones normales en numerosos tipos de células del organismo, 
entre ellas la células pluripotenciales de la médula ósea, los melanocitos de la piel y las 
https://es.wikipedia.org/wiki/Glicoprote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=C-kit&action=edit&redlink=1
https://es.wikipedia.org/wiki/Cromosoma_4
https://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9dula_%C3%B3sea
https://es.wikipedia.org/wiki/Melanocitos
 
 
26 
células del epitelio mamario. El CD117 se sobreexpresa en ciertos tipos de cáncer, 
particularmente en el tumor del estroma gastrointestinal52 - 53. 
 
El CD117 forma parte del receptor KIT. Este receptor transmembrana tiene como 
ligando al factor SCF (iniciales de Stem Cell Factor). La activación del receptor KIT 
cuando se le une el factor SCF provoca una serie de cambios estructurales en el receptor 
que activan la enzima tirosina quinasa. La tirosin quinasa es una enzima que cataliza la 
fosforilación de la tirosina, causando fosforilación de numerosas proteínas, generando 
diferentes señales que actúan sobre importantes procesos celulares, incluyendo 
proliferación celular, apoptosis y diferenciación54. 
 
Adhiraki y colaboradores39. Examinaron en el 2010 la expresión de CD117, 
descubriendo que las células de osteosarcoma positivas para esta glicoproteína en 
humanos formaban colonias esféricas, exhibiendo e incrementando la resistencia a la 
doxorrubicina. Además, las células que expresan esta molécula se asocian con un mayor 
grado de invasión tisular, multipotencialidad y potencial metastásico, Múltiples estudios 
han confirmado estos hallazgos demostrando la importancia de CD117 como marcador 
molecular para identificar y aislar células madre tumorales en osteosarcoma54 - 56. 
 
ALDH1 
 
Diecinueve diferentes genes funcionales de ALDH y múltiples variantes han sido 
reportadas hasta la fecha. Las enzimas aldehído deshidrogenasas 1 y 2 (ALDH1 y 
ALDH2) son importantes para la oxidación de los aldehídos ambas son proteínas 
https://es.wikipedia.org/wiki/Tumor_del_estroma_gastrointestinal
 
 
27 
tetraméricas de 54 KDa estas enzimas se encuentran de forma natural en muchos tejidos 
del cuerpo, pero principalmente se localizan en el hígado57. 
 
ALDH1 es un marcador de células madre de osteosarcoma. Es una proteína 
citosólica, tetramérica que oxida aldehídos a ácidos carboxílicos habilitando a la célula a 
resistir el estrés oxidativo. Las células con altos niveles de ALDH han demostrado un 
incremento en su agresividad en múltiples tipos de cáncer. En estudios clínicos de cáncer 
de mama y cáncer de ovario se ha encontrado que una alta actividad de ALDH predice 
una pobre supervivencia. Se ha observado que en altas concentraciones en muestras de 
osteosarcoma murino estas presentan una mayor resistencia al estrés oxidativo con 
mayor potencial para dar metástasis 57. 
 
Además de esta función de desintoxicación celular y marcador clave de células 
madre tumorales su papel en la iniciación y progresión tumoral se ha convertido en un 
tópico de considerable interés. Mientras que el papel de ALDH1 en la formación del tumor 
primario, resistencia al tratamiento y comportamiento maligno in vitro ha sido 
extensamente descrito en la literatura el rol de ALDH in vivo y en las metástasis ha sido 
menos evidente57. 
 
 
 
 
 
 
 
28 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
El porcentaje de necrosis tumoral posterior a la quimioterapia neoadyuvante sigue 
siendo el factor predictivo más importante para determinar el período libre de enfermedad 
y la supervivencia global de los pacientes con osteosarcoma. Sin embargo, el porcentaje 
de necrosis tumoral alcanzado tras la quimioterapia neoadyuvante suele ser bajo y no 
existe en la actualidad ningún factor que nos ayude a predecir dicha respuesta. 
 
A pesar de que se ha comprobado en múltiples estudios la existencia de células 
madre tumorales en osteosarcoma, no existen en la literatura estudios en los cuales se 
haya buscado intencionalmente en la biopsia diagnóstica CD117, ALDH1, CD133 y 
CD44. 
 
Encontrar la presencia de CD117, ALDH1, CD133 y CD44 en las biopsias 
diagnósticas puede ayudar a entender los grados tan bajos de necrosis tumoral que se 
presentan posterior a la quimioterapia neoadyuvante. 
 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Existe alguna relación entre la presencia de CD117, ALDH1, CD133 y CD44 en 
la biopsia diagnóstica de osteosarcoma con una mala respuesta a la quimioterapia 
neoadyuvante? 
 
 
 
29 
JUSTIFICACIÓN 
 
En todos los pacientes con diagnóstico de osteosarcoma que reciben 
quimioterapia neoadyuvante se ha observado una variabilidad en la respuesta a dicha 
quimioterapia a pesar de recibir los mismos esquemas de tratamiento. 
 
Esta respuesta se observa en el estudio histopatológico posterior a la resección 
quirúrgica y se reporta a través del grado de necrosis tumoral de acuerdo con lo descrito 
en la clasificación de Huvos. 
 
En la actualidad no existen reportes en la literatura en los cuales se establezca 
una relación existente entre la expresión de CD117, ALDH1, CD133, CD44 y células 
madre tumorales comparada con la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante 
expresada mediante el porcentaje de necrosis tumoral. 
 
HIPOTESIS 
 
Existe diferencia entre la presencia de CD117, ALDH1, CD133, CD44 y células madre 
tumorales en la biopsia diagnóstica de osteosarcoma y una mala respuesta a la 
quimioterapia neoadyuvante. 
 
 
 
 
 
 
 
30 
Objetivo General 
 
Describir la presencia o ausencia de CD117, CD44, CD133 Y ALDH1 en la biopsia 
diagnóstica de los pacientes con osteosarcoma 
 
 
Objetivos Específicos 
 
• Describir las características clínicas de osteosarcoma osteoblástico 
• Cuantificar el porcentaje de necrosis tumoral posterior a la quimioterapia 
neoadyuvante 
• Comparar la mortalidad de los pacientes según la presencia de los CD117, 
ALDH1, CD133 y CD44 
• Describir la supervivencia global de los pacientes con osteosarcoma osteoblástico 
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
Se realizó un estudio descriptivo, retrospectivo y analítico. En donde se revisaron 
los expedientes de pacientes con diagnóstico de osteosarcoma de alto grado, atendidos 
en el Instituto Nacional de Cancerología de México en el período comprendido 1 de marzo 
del 2013 al 28 de febrero del 2018. Todos los datos serán obtenidos de la base de datos 
de Osteosarcoma del Departamento de Piel y Partes Blandas del Instituto Nacional de 
Cancerología y del expediente electrónico INCANET. 
 
Las laminillas fueron evaluadas a fin de seleccionar aquellas que no fueron 
descalcificadas y que contaban con material suficiente (celularidad >60%). De cada 
Margarita
Texto escrito a máquina
OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN 
 
 
31 
bloque se obtuvieron cortes histológicos en laminillas electrocargadas con los cuales se 
realizaron estudios de inmunofluorescencia para identificación de CD117, ALDH1, CD133 
y CD44 con el microscopio Axio Scan Z1 (Anexo 2). 
 
Criterios de inclusión: 
 
A. Pacientes con diagnóstico de osteosarcoma que reciban el tratamiento completo 
(Quimioterapia neoadyuvante, Cirugía y quimioterapia adyuvante) en el Instituto 
Nacional de Cancerología. Durante el período comprendido del 1 de marzo del 
2013 al 28 de Febrero del 2018. 
 
B. Se incluirán todos los pacientes con osteosarcoma cuyas biopsias no hayan sido 
descalcificadas, sin importar el estadio clínico. 
 
C. Las pacientes cuentan con estudios histopatológicos completos: 1. Biopsia inicial 
del tumor (incluye material de revisión en caso de que cuente con bloque de 
parafina), 2. Estudio histopatológico del espécimen quirúrgico de la resecciónal 
término de la neoadyuvancia. 
 
D. Pacientes con bloques histológicos disponibles para estudio en el archivo del 
servicio de patología de Instituto Nacional de Cancerología. 
 
E. Tejidos de biopsia inicial con adecuada conservación y al menos 1 foco 
microscópico de 6 mm en una misma biopsia o dos focos microscópicos 
 
 
32 
separados, de al menos 3 mm y/o al menos 60 células neoplásicas en la biopsia 
inicial en el mismo bloque de parafina o en bloques separados. 
 
 
F. Tejidos de resección post quimioterapia adyuvante con adecuada conservación y 
cuyo tumor residual sea medible o evaluable (HUVOS). 
 
Criterios de exclusión 
 
• Pacientes con osteosarcoma de bajo grado (ya que estos pacientes no requieren 
quimioterapia neoadyuvante) 
 
• Pacientes con Osteosarcoma condroblástico, ya que esta variante histológica es 
resistente a quimioterapia neoadyuvante, debido a la escasa o nula vascularidad 
intratumoral. 
 
• Pacientes que por cualquier razón no reciban tratamiento neoadyuvante estándar 
con quimioterapia. 
 
• Pacientes con biopsias insuficientes o en malas condiciones por mal 
procesamiento (material de revisión) para realización de estudios de inmunohistoquímica. 
 
Criterios de eliminación: 
 
A. Pacientes que decidieron no continuar con el tratamiento. 
 
 
 
33 
B. Pacientes que decidieron tratarse en otra institución. 
 
C. Pacientes cuyo tejido de biopsia inicial o de resección haya sido utilizado para un 
protocolo de investigación previo o no se encuentre disponible en archivo del 
servicio de patología del Instituto Nacional de Cancerología. 
 
DEFINICIÓN DE LAS VARIABLES 
 
Variable Según Influencia Variable 
Aleatoria 
Definición 
CD133 + Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
Glicoproteína de membrana. 
Ha sido implicada en el 
movimiento celular lo cual es 
crucial para los procesos de 
quimiotaxis, desarrollo 
embrionario, crecimiento 
invasivo y metástasis. 
CD44 + Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
Molécula de adhesión. 
Contribuye en procesos de 
adhesión, migración y 
proliferación de las células 
madre de osteosarcoma. 
 
 
34 
ALDH 1+ Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
Proteína tetramérica que 
oxida aldehídos a ácidos 
carboxílicos habilitando a la 
célula a resistir el estrés 
oxidativo, su expresión se 
ha visto asociada a 
resistencia a medicamentos 
y mayor capacidad de 
metástasis. 
CD117 + Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
CD117 es una glicoproteína 
transmembrana. Está 
codificada por el gen c-kit 
que está situado en el 
cromosoma 4 humano 
(4q12). Se ha relacionado 
con resistencia a la 
Doxorrubicina. 
Células Madre 
Tumorales 
Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
Grupo de células madre 
positivas para CD133 y 
CD44 con o sin algún otro 
anticuerpo positivo. 
Nichos 
Celulares 
Independiente Cualitativa 
Dicotómica 
Agregado de células madre 
tumorales dentro del tejido. 
https://es.wikipedia.org/wiki/Glicoprote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=C-kit&action=edit&redlink=1
https://es.wikipedia.org/wiki/Cromosoma_4
 
 
35 
Porcentaje de 
Necrosis 
Dependiente Cuantitativa 
continua 
Patrón morfológico de la 
muerte de células tumorales 
provocada por un agente 
nocivo que causa una lesión 
tan grave que no se puede 
reparar o curar. 
Supervivencia 
global (SG) 
Independiente Cuantitativa 
continua. 
La supervivencia global se 
valorará en meses a partir 
de la fecha de diagnóstico y 
hasta la fecha de defunción 
de los pacientes. 
Periodo libre 
de 
enfermedad 
(PLE) 
Independiente Cuantitativa 
continua 
El período libre de 
enfermedad se valorará en 
meses a partir de finalizado 
el tratamiento con 
quimioterapia adyuvante y 
hasta la aparición de 
actividad tumoral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 
El valor de P considerado significativo que se utilizará para demostrar asociación 
entre variables será p<0.05. Se realizará un análisis de las variables demográficas 
obtenidas en la base de datos de osteosarcoma y se analizará cada una de ellas para 
observar si presentan distribución paramétrica. 
 
Los variables CD117, ALDH1, CD133 y CD44 se analizarán como dicotómicas en 
donde se determinará la presencia o ausencia del anticuerpo en el tejido observado. Se 
construirán y analizarán tablas de contingencia 2x2 y se realizará un análisis mediante la 
prueba de Fisher. 
 
CONSIDERACIONES ETICAS 
 
 El presente trabajo reúne información de los reportes diagnósticos de los servicios 
de Patología y de Piel y Partes Blandas del Instituto Nacional de Cancerología INCAN, 
los cuales se organizarán y analizarán según los fines de la investigación; esta 
información será obtenida en forma individual a partir de los resultados histopatológicos 
registrados de cada estudio realizado y conforme a las características requeridas para 
este estudio, según los criterios de inclusión. Sin embargo, la ficha de afiliación y el 
nombre de los pacientes no se utilizaron, estos datos fueron reemplazados por un número 
consecutivo secuencial de acuerdo a como se incluyeron en la investigación y el número 
de patología del estudio, de tal forma que se obtuvo una base de datos compuesta de 
casos organizados en orden ascendente. Por tales motivos, en este estudio, no se 
requirió de consentimiento ético informado para su realización. 
 
 
37 
 
 La base de datos que se utilizó en la presente investigación es resguardada por el 
investigador principal y los tutores, durante el desarrollo de la misma, y ellos fueron los 
únicos autorizados para realizar estudios metodológicos y análisis de datos con base a 
ella; al final, la base de datos será entregada a la jefatura de los servicios de Patología y 
de Piel y Partes Blandas, la información será resguardada bajo el título “Presencia de 
CD117, ALDH1 y células madre tumorales de osteosarcoma como factor pronóstico de 
resistencia a la quimioterapia neoadyuvante”. En caso de publicar lo obtenido en esta 
investigación, nunca se revelarán datos personales de los casos incluidos, únicamente 
se publicará la información en resultados por promedio, modas, especificidad y 
sensibilidad de los criterios estudiados. 
 
RESULTADOS 
 
 
De los 50 paciente con osteosarcoma osteoblástico con los que contábamos en nuestra 
base de datos tan solo 21 pacientes contaban con el tratamiento completo y posterior al 
análisis de las laminillas tan sólo 14 pacientes presentaron biopsias no descalcificadas. 
En la tabla 1 se presentan los valores demográficos más importantes de nuestra muestra 
de pacientes. 
 
 
 
 
 
 
 
38 
Tabla 1. Variables Demográficas 
Variable Valor (N=14) 
Edad 24.1 (± 6.9) Años 
Género 
Femenino 
Masculino 
 
5 (35.7%) 
9 (64.3%) 
Localización 
Fémur distal 
Tibia proximal 
Diáfisis de fémur 
Diáfisis de tibia 
Húmero proximal 
Fémur proximal 
 
5 (35.7%) 
4 (28.6%) 
2 (14.3%) 
1 (7.1%) 
1 (7.1%) 
1 (7.1%) 
Etapa Clínica (AJCC, 7ª. Edición 2010) 
II B 
IV A 
 
8 (57.1%) 
6 (42.9%) 
Tipo de biopsia 
Cerrada 
Abierta 
 
8 (57.1%) 
6 (42.9%) 
Recurrencia 4 (28.57%) 
Mortalidad 6 (42.9%) 
Necrosis tumoral (HUVOS) 
I 
 
3 (21.4%) 
 
 
39 
II 
III 
IV 
6 (42.9%) 
4 (28.6%) 
1 (7.1%) 
 
Se analizan las variables cuantitativas por medio de la prueba de Shapiro-Wilk 
obteniendo que solamente edad y supervivencia global presentaron distribución 
paramétrica. Se utilizaron los anticuerpos CD117, CD44, CD133 y ALDH1 para 
determinar la presencia de células madre tumorales por medio de inmunofluorescencia 
mediante la técnica multiplex, se reportaron como variables dicotómicas ante la presencia 
o ausencia de estos en las laminillas (Anexos 3 y 4). También se reportaron la presencia 
o ausencia de nichos celulares y células madre tumorales. Los resultados se observan 
en la Tabla2. 
 
Tabla 2. Presencia de marcadores de células madre en la biopsia 
Variable Valor N=14, N(%) 
CD44 7 (50%) 
CD133 8 (57.1%) 
ALDH1 10 (71.4%) 
Células madre tumorales 5 (35.7%) 
Nichos Celulares 9 (64.3%) 
 
 
 
40 
Ninguna de las laminillas fue positiva para CD117. Se realizó un análisis mediante la 
prueba de Fisher de dos colas entre la presencia de los marcadores de células madre y 
la mortalidad del grupo de pacientes (Tabla 3). 
 
Tabla 3. Mortalidad según la presencia de marcadores de células madres en la biopsia 
diagnóstica de osteosarcoma 
Marcador Vivo 
N =8, N (%) 
Muerto 
N=6, N (%) 
P 
CD44 4 (57.1) 3 (42.9) 0.439 
CD133 4 (50) 4 (50) 0.533 
ALDH1 5 (50) 5 (50) 0.393 
Células madre 
tumorales 
2 (40) 3 (60) 0.334 
Nichos Celulares 5 (55.55) 6 (44.44) 0.872 
 
No se encontró significancia estadística entre CD44, ALDH1, CD133, Células madre 
tumorales y los nichos celulares con el grado de necrosis tumoral de acuerdo con Huvos 
por medio de la prueba exacta de Fisher. 
 
Se analizó la supervivencia global en el grupo de pacientes en donde observamos que la 
media fue de 50 meses con un IC del 95% (36.7 – 63.3). (Figura 1). 
 
 
 
 
41 
Figura 1. Curva de supervivencia global. 
 
DISCUSIÓN 
 El osteosarcoma es el tumor óseo maligno más frecuente, su principal factor 
pronóstico es la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante asociada a la resección 
quirúrgica completa, sin embargo, no existe un método para identificar al grupo de 
pacientes que responda adecuadamente a la quimioterapia neoadyuvante. 
 
 
 
42 
Intentamos identificar células madre tumorales mediante la utilización de los 
anticuerpos CD117, CD44, CD133 y ALDH1 con inmunofluorescencia multiplex para 
poder detectar los cuatro en la misma laminilla con el uso del microscopio Axio Scan Z1. 
 
La fluorescencia es causada por un grupo de electrones acertadamente 
conjugados en una molécula orgánica. La autofluorescencia puede ser debido a un rastro 
de impurezas generada por la oxidación que se va produciendo durante el procesamiento 
y almacenamiento de los tejidos. Además, la adsorción de moléculas orgánicas del medio 
ambiente durante el proceso de almacenamiento puede resultar también en una 
autofluorescencia significativa. Por lo tanto, existen múltiples causas de 
autofluorescencia, ninguna de las cuales han sido bien estudiadas o evitadas, por lo que 
la mejor manera de bloquear este problema ha sido la destrucción de fluoróforos 
indeseables utilizando medios químicos58. 
 
Davis y colaboradores mencionan que la autofluorescencia se deriva de dos 
causas principales que son la presencia de señales no específicas y fluorescencia que 
se encuentra intrínsecamente asociada con el tejido “autofluorescencia. Mientras que las 
señales no específicas pueden ser reducidas incrementando el número de lavados, la 
autofluorescencia puede ser mucho más difícil de manejar. Esto se convirtió en la 
principal limitación durante el proceso de estandarización59. 
 
La sensibilidad de la detección de fluorescencia se encuentra típicamente limitada 
por la cantidad de señal de fondo que es emitida por un tejido58 y 59. Por tal motivo se 
implementaron diferentes técnicas como fueron el uso de radiación lumínica y el 
 
 
43 
tetrahidroborato de sodio que permitieron durante el proceso de estandarización disminuir 
la cantidad de imagen de fondo, pero incrementaron el tiempo de realización del 
experimento. 
 
No se identificó CD117 en ninguno de los casos analizados. CD44, CD133 y 
ALDH1 no presentaron una relación estadísticamente significativa con la respuesta a la 
quimioterapia neoadyuvante. A pesar de que los resultados no confirman nuestra 
hipótesis esto puede deberse a las mismas limitantes del estudio como es que sea un 
estudio retrospectivo con una cantidad de pacientes limitada. 
 
No fue posible realizar un análisis cuantitativo de los anticuerpos, las células madre 
tumorales ni de los nichos celulares ya que la contratinción POPRO utilizada durante el 
proceso de multiplex no logró marcar los núcleos celulares lo que limitó la capacidad para 
determinar la presencia cuantitativa de las células. 
 
CD133 junto con CD44 son los marcadores más importante de células madre 
tumorales y además, su presencia tiene una relación con la formación de nichos celulares 
por lo que, aunque no pudimos establecer una relación estadísticamente significativa 
entre la presencia a través de la inmunofluorescencia de las células madre tumorales con 
la respuesta a la quimioterapia ni con la mortalidad, el haberlas identificado en el 36% de 
las muestras abre la posibilidad a realizar estudios prospectivos con mayor cantidad de 
pacientes enfocados a determinar el valor de la presencia de estas. 
 
 
 
44 
Observamos en tres pacientes la presencia de subpoblaciones específicas para 
CD133, ALDH1 y CD44, estas subpoblaciones podrían determinar un mayor 
comportamiento agresivo, sin embargo, no fue posible encontrar una relación causal 
entre estas subpoblaciones y la mortalidad de los pacientes. 
 
A diferencia de otros sarcomas óseos como el Sarcoma de Ewing, el 
osteosarcoma no cuenta con una mutación específica. Sin embargo, el conocimiento del 
comportamiento molecular de esta enfermedad sigue en constante crecimiento siendo un 
área de oportunidad para la investigación en la búsqueda de alguna alteración molecular 
recurrente que pueda tener un valor pronóstico. 
 
En este trabajo se buscó la presencia de cuatro anticuerpos específicos en la 
biopsia diagnóstica de osteosarcoma y poder encontrar diferencias entre la presencia de 
estos con el resultado clínico predictor más importante que es la respuesta a la 
quimioterapia neoadyuvante evaluada con la clasificación de Huvos, sin embargo, no se 
encontraron diferencias estadísticamente significativas. 
 
CONCLUSIÓN 
 
Las células madre tumorales en osteosarcoma se han convertido en un campo 
importante de la investigación científica y un área de oportunidad que se ha explorado en 
los últimos años. 
No encontramos diferencia entre la presencia de CD117, ALDH1, CD133 y CD44 
con la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante, sin embargo llama la atención una alta 
 
 
45 
prevalencia de células madre en el tejido tumoral analizado, lo que abre la posibilidad de 
realizar estudios a futuro. 
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54 
 
 
 
ANEXO 1. CLASIFICACIÓN DE HUVOS 
Clasificación de Huvos 
GRADO % NECROSIS Características 
I 0 – 49% Sin o escasa necrosis 
II 50 – 89% Áreas de tejido osteoide 
acelular y/o tejido fibrótico 
atribuible al efecto de la 
quimioterapia combinado 
con áreas viables de 
tumor. 
III 90 – 99% Predominio de áreas de 
tejido osteoide acelular 
y/o tejido fibrótico 
atribuible al efecto de la 
quimioterapia con zonas 
dispersas de células 
tumorales viables. 
IV 100% Sin evidencia patológica 
de tumor viable. 
Tabla 1. Clasificación de Huvos. Tabla tomada de Huvos A. (1991) Bone tumors: 
 
 
55 
diagnosis, treatment, prognosis, 2nd ed, WB Saunders, Philadelphia22. 
 
 
ANEXO 2. MICROSCOPIO AXIO SCAN Z1 
 
Axio Scan es un escáner de laminillas automatizado para microscopía de campo 
claro y fluorescencia. Se pueden cargar y escanear hasta 100 diapositivas con objetivos 
10x / 0.45, 20x / 0.8 o 40x / 0.95.Crea laminillas de alta calidad que pueden ser 
navegadas, editadas y compartidas. 
 
Especificaciones técnicas 
Imagen Escáner de diapositivas 
Escáner de campo claro 
Fluorescencia 
Detectores Campo claro CCD Hitachi HV-F202CLS 
Fluorescencia: AxioCam MRm 
Fuentes de luz Campo claro: VIS LED 
Fluorescencia: Colibri.2 
Stand Axio Scan.Z1 
Capacidad Más de 100 laminillas 
Software Zeiss Zen Slidescan 2012 
Soporte para laminillas 25 contenedores para 4 laminillas 
26x76mm 
 
 
56 
1 contenedor para 2 laminillas de 
52x76mm 
Objetivos 10X 
20X 
40X 
Fuentes de luz 365nm (Azul) 
470nm (Verde) 
555nm (Rojo) 
625nm (Rojo lejano) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
57 
 
 
 
ANEXO 3. BITÁCORA DEL EXPERIMENTO FINAL 
 
En el experimento se utilizaron: 
 14 laminillas de osteosarcoma como laminillas problema 
 14 laminillas de osteosarcoma como control negativo 
 4 laminillas de osteosarcoma para control de cada anticuerpo (CD117, ALDH1A1, 
CD44, CD133) 
 Líneas celulares de cáncer gástrico enriquecidas con células troncales un vitro 
para control positivo. 
La concentración de los anticuerpos fueron las siguientes: 
 CD117: 1:400  Alexa Fluor 488 
 CD44: 1:100  Alexa Fluor 594 
 CD133: 1:200  Alexa Fluor 555 
 ALDH1A1: 1:200  Alexa Fluor 647 
 
14 DE NOVIEMBRE DEL 2018 
 Se colocaron las laminillas en irradiación lumínica a las 8:30 am por 48 horas. 
 
16 DE NOVIEMBRE DEL 2018 
 8:30 am: Se colocaron las laminillas en horno a 60 grados centígrados durante 12 
horas. 
 
 
58 
 
 8:30 pm: Se colocaron las laminillas en xilol al 100% y se vuelven a introducir al 
horno a 60 grados durante 12 horas. 
 
17 DE NOVIEMBRE DEL 2018 
Tren de alcoholes 
 
 Las laminillas se introdujeron a Xilol a temperatura ambiente (TA) x 30 minutos y 
posteriormente: 
 
o Xilol/Etanol (alcohol) al 96% a TA x 30min 
 
o Etanol (alcohol) al 96% a TA x 10min 
 
o Etanol (alcohol) al 70% a TA x 10min 
 
o Etanol (alcohol) al 50% a TA x 10min 
 
o Agua a TA x 5min 
 
Recuperación antigénica 
 
 
 
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 Se colocaron las laminillas en un coupling con buffer de citrato con PBS a 
temperatura ambiente, hasta su procesamiento. 
 Se calentaron a máxima potencia en microondas por 5 min aproximadamente. 
 Se retiraron los coupling del horno de microondas y se dejaron enfriar hasta que 
el buffer de citratos se vuelva a ver transparente. 
 Se colocaron las laminillas en tres coupling y se agregan 30 ml PBS hasta que se 
cubran