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• Brasil. j. infectar. 26 (01) • 2022 •
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Análisis del genoma completo de cepas invasoras
de haemophilus influenzae aisladas del hospital
universitario estatal de Campinas. Una
aproximación epidemiológica 2012 - 2019 y cepas
ancestro
Artículo Original 
COPIAR

Rafaella Fabiana Carneiro Pereira
Juan Pablo de Oliveira Guarnieri
Carlos Fernando Macedo da Silva
Bruno Gaya Bernardes
marcelo lancellotti
Resumen
Trece cepas invasivas de Haemophylus influenzae aisladas de pacientes en el Hospital Clínico
de la Universidad Estatal de Campinas, desde mayo de 2013 hasta agosto de 2019, se
enviaron a la plataforma HiSeq de secuenciación del genoma de Illumina. Además , el análisis
in silico de serogrupos y Multi Locus Sequence Typing (MLST) de la secuenciación de ADN
completo demostró la distribución clonal real en la región metropolitana de Campinas. Así, los
resultados mostraron la existencia de un nuevo ST Haemophilus influenzae encontrado en el
territorio brasileño y un aumento de cepas pertenecientes al serogrupo a (tres cepas también
pertenecientes al ST23). En conclusión, observamos un aumento de H. influenzae no
tipificable(NTHi) y una cepa involucrada en enfermedades invasivas en la región de Campinas –
São Paulo después de la detección frecuente de esos serotipos y genotipos en otras regiones
brasileñas.
Palabras clave 
Genoma completo; Haemophilus influenzae ; secuenciación; enfermedad invasiva
Introducción
Brasil
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Haemophilus influenzae es un patógeno importante involucrado en varias enfermedades
invasivas que pueden progresar a meningitis, septicemia y muerte. Asimismo, Haemophilus
influenzae es conocido como cocobacilo Gram negativo pleomórfico clasificado en seis cepas
inmunológicas encapsuladas (af) y H. influenzae no tipificable – NTHi. La H. influenzae tipo b
(Hib) es el tipo más invasivo asociado comúnmente con meningitis y otras infecciones del tracto
respiratorio superior en niños y adultos. , Las cepas NTHi están asociadas con
enfermedades moderadas del tracto respiratorio superior y otitis media en niños y neumonía en
adultos con fibrosis quística. , Junto con la introducción de la vacuna conjugada Hib, la
epidemiología de H. influenzae ha cambiado en los últimos años. NTHi y otros serotipos de H.
influenzae se han vuelto más prevalentes que Hib en todo el mundo. Los brotes en el Hospital
Clínico de la Universidad de Campinas, Estado de São Paulo – Brasil, han mostrado un
aumento de cepas invasivas después de la vacunación. El uso de la plataforma Illumina para la
construcción del genoma bacteriano completo establecida por nuestro grupo para la
caracterización de las cepas de Haemophilus de la fiebre pupúrica brasileña (Pereira et al. 2019
) fue utilizado para este propósito. Este trabajo tuvo como objetivo utilizar el método de
secuenciación Illumina para borrador del genoma para caracterizar la estructura del genoma y
los factores de virulencia in silico de 13 cepas invasivas aisladas de sangre y líquido
cefalorraquídeo. Además, en este trabajo se explorará una aproximación a los mecanismos de
virulencia y escape vacunal.
material y métodos
Cepas bacterianas
Trece cepas de H. influenzae fueron aisladas entre mayo de 2013 y agosto de 2019 de
pacientes del Hospital Clínico de la Universidad Estadual de Campinas (HC-UNICAMP). Todas
las cepas se aislaron de hemocultivos excepto una Hi2015-6 aislada de líquido cefalorraquídeo.
Las cepas Hi38 y Hi45 habían sido caracterizadas por Lancellotti et al. 2008 y también
aislamientos del mismo hospital en 1998. Las cepas bacterianas se cultivaron en placas de
agar chocolate o BHI suplementadas con NAD (4 µg/mL) y hemina (10 µg/mL) (Kilian, 1976
) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO .
Secuenciación, ensamblaje y anotación del genoma completo
El ADN genómico se extrajo según lo descrito y adaptado por Cury et al. 2014. El análisis y
la cuantificación de la calidad del ADN se realizaron con NanoDrop (NanoDrop® 2000 - Thermo
Scientific®). Las bibliotecas se prepararon con el kit de preparación de bibliotecas de ADN
Nextera XT (Illumina, CA, EE. UU.) y se secuenciaron con la plataforma Illumina HiSeq 2500
(lecturas de un solo extremo de 100 pb) en la sección de Genómica del Centro de Ciencias de
la Vida (LaCTAD, Campinas, Estados Unidos). São Paulo, Brasil). Todas las bibliotecas se
multiplexaron en una ejecución de secuenciación. La calidad de los archivos de lectura se
evaluó con FastQC v.0.11.7 (Babraham Bioinformatics, Cambridge, Reino Unido). Las lecturas
de secuenciación se recortaron, ensamblaron y anotaron a través de PATRIC pipeline v.3.5.43 (
https://patricbrc.org/ ). Las lecturas se recortaron por calidad (puntuación Phred de calidad >
20) y tamaño (> 20 pb) y las secuencias de los adaptadores de Illumina se eliminaron con la
herramienta FastqUtils con Trim Galore v. 0.6.1 y Cutadapt v. 2.2. El ensamblaje y la anotación
se realizaron con la herramienta Genome Comprehensive Analysis with SPAdes v. 3.10.0
con parámetros predeterminados y kit de herramientas RAST (RASTtk), respectivamente.
Análisis de operón capsular y determinación de MLST
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Los genes capsulares se identificaron mediante una búsqueda BLASTn con el software Hicap
, y Geneious Prime® 2020.1.1 ( https://www.geneious.com ). Para la determinación de
Multi Locus Sequence Typing (MLST), las secuencias de genes para los genes de
mantenimiento adk, atpG, adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi y recA se analizaron en el sitio web
de Haemophilus influenzae MLST ( https://pubmlst.org /hinfluenzae/ ) ubicado en la Universidad
de Oxford para la asignación de alelos y tipos de secuencia (ST).
Genes de virulencia y genotipos de resistencia antimicrobiana
Los factores de virulencia y los genes de resistencia adquiridos se evaluaron utilizando la base
de datos de factores de virulencia (VFDB) y ResFinder versión 2.1, respectivamente.
Resultados
La secuenciación de cepas con la plataforma HiSeq2500 generó un total de 214 376 882
lecturas para un total de 19 muestras.La Tabla 1 resume los datos sin procesar de la
secuenciación de 14 muestras analizadas. Se observa que el número de lecturas generadas
por muestra osciló entre 16.131.465 y 45.305 (muestras Hi5 y Hi4 respectivamente), con un
porcentaje medio superior al 90% de bases con puntuación phred = 20. Todos los análisis
realizados se adjuntan a este informe con todas las Contigs y notaciones genómicas.
Aún analizando las propiedades y datos de los genomas secuenciados,el MLST (
Los análisis de la Tabla 2 ) se realizaron para obtener un análisis clonal de las cepas aisladas
en este estudio. Además, las cepas aisladas entre 1997-1998 denominadas cepa ancestral
(Hi38), las cepas aisladas ya en los años 2010 y las cepas aisladas en 2019 (AS's y Hi's) se
analizaron con un borrador de genoma completo. En cuanto al análisis MLST de todas las
cepas, se encontraron nuevos alelos en nuestras cepas aisladas en 2019 ( frdB alelo 232 y
recA alelo 191 de HiP1 y HiX, respectivamente). Además, también se determinaron nuevos
tipos de secuencias para H. influenzae encontrados en las cepas Hi11, HiP1 y HiX
(comisariadas en el sitio web de MLST).
Tras ensamblar los borradores genómicos, se observó la presencia de NTHi y cepas
pertenecientes al serotipo a H. influenzae (cepas AS6, Hi5 y Hi6) y al mismo ST23. En el
Fig. 1 , las flechas rojas muestran las alteraciones en el operón capsular en esas cepas. La
correlación del linaje considerado anciano - Hi38 se encontró que no tiene el mismo origen
clonal (figura 1 ).
Discusión
La determinación del genoma para el estudio de cepas de H. influenzae asociadas a
enfermedades invasivas había sido realizada por nuestro grupo cuando Pereira et al. determinó
el genoma completo de Haemophilus influenzae que causó la fiebre purpúrica brasileña en
2019. La experiencia de las plataformas de bioinformática genómica hizo posible el análisis
de H. influenzae invasoras aisladas en el Hospital Clínico de la Universidad Estadual de
Campinas en este estudio. Los servicios de salud de este hospital cubren toda el área
metropolitana de Campinas con cerca de 3,2 millones de habitantes y 20 municipios. ,
Por lo tanto, este análisis de las poblaciones bacterianas es representativo de las regiones del
suroeste de Brasil y el descubrimiento de nuevas variantes de H. influenzae identificadas en
este estudio es una información importante para la salud pública considerando el nuevo perfil
de ST identificado y la presencia del serotipo a H. influenzae en enfermedades invasivas. Los
datos presentados en el material complementario muestran varios genes de virulencia
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detectados en las cepas analizadas en este estudio. Dichos factores de virulencia habían sido
probados previamente por nuestro grupo como reportaron Pereira et al. 2021 como
expresión de genes relacionados con autotransportadores de H. influenzae biotipo aegyptius.
Sin embargo, el análisis complementario sobre otros genes implicados en la virulencia de
Haemophilus podría ser objeto de próximas investigaciones.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al personal del Centro Básico de Ciencias de la Vida (LaCTAD,
UNICAMP) por la secuenciación de los genomas de Hae y a los biólogos del Servicio de
Patología Clínica del Hospital Universitario (HU) de la Universidad de Campinas (UNICAMP)
por el aislamiento de las cepas bacterianas y en la asistencia técnica en todas las pruebas.
Esta publicación hizo uso del sitio web de Haemophilus influenzae MLST (
https://pubmlst.org/hinfluenzae/ ) ubicado en la Universidad de Oxford (Jolley et al. Wellcome
Open Res 2018, 3:124 [versión 1; árbitros: 2 aprobados] ). El desarrollo de este sitio ha sido
financiado por Wellcome Trust. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones números
2018/09874-7, Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP). ML son becas de
concesión número 310146/2013-5, CNPq.
Materiales complementarios
El material complementario asociado con este artículo se puede encontrar en la versión en
línea en doi: 10.1016/j.bjid.2021.101667 .
Referencias
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Fechas de publicación
Historia
» Publicación en esta colección 
01 Abr 2022
» Fecha de emisión 
2022
» Recibido el 
29 de agosto de 2021
» Aceptado 
el 23 de noviembre de 2021
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Pereira RFC, Theizen TH, Machado D, et al. Análisis de genes de potencial virulencia y
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Fiebre Purpúrica Brasileña. Genet Mol Biol. nd; 44. https://doi.org/10.1590/1678-4685-GMB-
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