Identificacion-de-receptores-para-glucocorticoides-en-ovocitos-de-bovino

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA 
SALUD ANIMAL 
 
 
IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORES PARA 
GLUCOCORTICOIDES EN OVOCITOS DE BOVINO 
 
 
T E S I S 
 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
 
PRESENTA 
 
 
ITZAYANA MEJÍA FLORES 
 
TUTOR: MARÍA DE LOURDES JUÁREZ MOSQUEDA 
 
 
COMITÉ TUTORAL: MARIA JUANA ANTONIETA COTE VÉLEZ 
 SALVADOR URIBE CARVAJAL 
 
 
 
 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2011 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
II 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA 
PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
 
“IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORES PARA GLUCOCORTICOIDES 
EN OVOCITOS DE BOVINO” 
 
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE 
 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
PRESENTA 
ITZAYANA MEJÍA FLORES 
 
TUTOR 
Dra. MARÍA DE LOURDES JUÁREZ MOSQUEDA 
 
 
COMITÉ TUTORAL 
DRA. MARÍA JUANA ANTONIETA COTE VÉLEZ 
Dr. SALVADOR URIBE CARVAJAL 
 
 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
 
III 
 
DECLARACIÓN 
 
 
 
El autor da su consentimiento a la División de Estudios de Posgrado e 
Investigación de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad 
Nacional Autónoma de México para que esta tesis esté disponible para cualquier 
tipo de reproducción e intercambio bibliotecario. 
 
 
 
 
____________________________________ 
MVZ. ITZAYANA MEJÍA FLORES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV 
 
DEDICATORIA 
 
A Dios por guiarme, cuidarme y permitir que cumpla una más de mis metas. 
 
A mis padres: Rocío y Víctor, por ser un ejemplo de vida e inculcarme el amor, la 
perseverancia pero sobre todo la gratitud y humildad. Los amo profundamente 
 
A mi hermana Tzoali porque siempre tienes una frase exacta para ayudarme, 
porque eres la mejor hermana del mundo. Te amo 
 
A mi tía Blanca por su apoyo, ayuda y confianza incondicional durante toda mi 
vida. Por ser una pieza importante para realizar y culminar este proyecto. La amo 
 
A mi compañero incondicional, por ser y estar, por ser mi cómplice literalmente. 
Gracias por tu ayuda pero sobre todo por el amor que me das. Te amo Marco 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
V 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi alma mater la Universidad Nacional Autónoma de México 
 
Al CONACYT por la beca otorgada durante mis estudios 
 
A la Dra. Lourdes Juárez por su apoyo y consejos brindados durante el posgrado 
 
A mi comité tutoral: Dra. Antonieta Coté por su ayuda y apoyo brindado en todo 
momento para el desarrollo de este trabajo, pero sobre todo por su calidad humana. 
Dr. Salvador Uribe por ser una gran persona, por el tiempo brindado para escuchar, 
aconsejar y ayudar. Por la confianza brindada pero sobre todo por mostrarme el lado 
amigable de la ciencia. 
 
A los miembros del jurado: Dr. Javier Valencia, Dr. Alfredo Medrano, Dra. Icela Palma 
y Dr. Oscar Gutiérrez por sus consejos y observaciones, por su apoyo gracias. 
 
A todos mis compañeros y amigos de morfología: Mayeli, Germán, Sandra, Ángel y 
Oscar con quienes compartí horas de trabajo y diversión, por los ánimos y ayuda 
brindados durante la maestría, gracias. 
 
A todos los miembros del laboratorio a cargo del Dr. Salvador en el Instituto de 
Fisiología Celular especialmente a la Dra. Naty, el Dr. Armando y Daniela por 
enseñarme, por compartir sus conocimientos, por su sencillez y por su apoyo durante 
la realización del presente trabajo 
 
A mi maestro, mi jefe, mi compañero de trabajo y amigo Javier Hernández no me 
cansare de agradecerte siempre por todo cuanto me has ayudado. Te quiero mucho 
 
A mis amigos: Pao y familia, Adolfo, Moni y familia, Edgar, Noé y Claudia, Tere y Toto, 
Angélica y Luisa, porque siempre confiaron en mí y por sus palabras de aliento 
durante todo este tiempo. Los quiero mucho 
 
A todos los integrantes de la Familia Mejía que la verdad son bastantitos no los 
menciono para no hacer sentir mal a alguien, por dejarme ser parte de ella y 
enseñarme el significado de familia. Los amo 
 
A todos los miembros de la familia Padierna, por su ayuda y apoyo, por cuidarme y 
estar al pendiente de mí. Pero sobre todo por hacerme sentir parte de ella. Los quiero 
mucho 
 
VI 
 
RESUMEN 
MEJIA FLORES ITZAYANA. IDENTIFICACION DE RECEPTORES PARA 
GLUCOCORTICOIDES EN OVOCITOS DE BOVINO (Tutora principal Dra. María 
de Lourdes Juárez Mosqueda, COMITÉ TUTORAL Dra. María Juana Antonieta 
Cote Vélez y Dr. Salvador Uribe Carvajal). 
 
Los glucocorticoides (GC) juegan un papel esencial en el control de diversos 
procesos fisiológicos como la homeostasis, inmunidad celular y la respuesta al 
estrés. Se considera que el receptor a glucocorticoides (GR) está presente en las 
células de todos los tejidos. Al igual que en otras especies, el estrés calórico 
afecta la calidad de los ovocitos y el desarrollo embrionario temprano en la 
especie bovina. Si bien el GR ha sido identificado en los órganos reproductivos de 
la vaca, existe escasa información que indique si hay la expresión de GR en los 
ovocitos desnudos. En el presente trabajo se pretende identificar receptores para 
glucocorticoides en ovocitos de bovinos. La primera parte del estudio consistió en 
la estandarización de la técnica de maduración de ovocitos bovinos in vitro (IVM). 
Se utilizaron ovocitos (tipo I y II) obtenidos mediante aspiración de ovarios de 
hembras sacrificadas en rastro y cultivados en el medio TCM-199, adicionado con 
suero fetal bovino (SFB), FSH o eCG y hCG, gentamicina y con o sin piruvato de 
sodio, bajo condiciones de 5% de CO2, 38.5 ºC y 100% de humedad relativa. Los 
resultados mostraron que el medio adicionado con 0.1 UI de hCG, 0.5 µg de FSH, 
10% de SFB es el que permite obtener mayor porcentaje de ovocitos maduros 
(88%). Lo anterior fue validado por medio de la tinción de Hoechst y la 
observación del primer cuerpo polar. La segunda parte del estudio radicó en la 
identificación del GR en los ovocitos desnudos de bovinos para lo cual se 
utilizaron 157 ovocitos tanto inmaduros como madurados in vitro. Se realizó una 
lisis citoplasmática de los ovocitos y se identificó la presencia del GR por medio de 
Western Blot. Los resultados proporcionan evidencia de la presencia del GR en 
ambos tipos de ovocitos de bovinos, pero aparentemente en mayor cantidad en 
los ovocitos inmaduros. Se sugiere que esta proteína puede ser responsable de 
los efectos directos de los glucocorticoides en el ovocito de bovino. 
 
Palabras claves: ovocito, GR, glucocorticoides, maduración, identificación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VII 
 
ABSTRACT 
MEJIA FLORES ITZAYANA. IDENTIFICATION OF RECEPTORS FOR 
GLUCOCORTICOIDS IN BOVINE OOCYTES (Main Tutor Dra. María de Lourdes 
Juárez Mosqueda, SUPERVISORY COMMITTEE Dra. María Juana Antonieta 
Cote Vélez and Dr. Salvador Uribe Carvajal). 
 
Glucocorticoids (GC) have an essential role in controlling various physiological 
processes such as homeostasis, cellular immunity and the stress response. It is 
considered that the glucocorticoid receptor (GR) is present in the cells of all 
tissues. As in other species, heatstress affects the quality of oocytes and early 
embryonic development in the cattle. Although GR has been identified in the 
reproductive organs of the cow, there is little information on whether there is 
expression of GR in denuded oocytes. The aim of the present work was to identify 
the GR in the bovine oocytes. The first part of the study was the standardization of 
the technique of bovine oocyte maturation in vitro (IVM). Oocytes (type I and II) 
were obtained by aspiration from the ovaries of females sacrificed at a 
slaughterhouse and cultured in TCM-199 medium, supplemented with fetal bovine 
serum (FBS), eCG or FSH, hCG, gentamicin and with or without 0.2 mM / ml 
sodium pyruvate, under 5% CO2, 38.5 º C and 100% relative humidity. The results 
showed that the media added with 0.1 UI hCG, 0.5 µg FSH and 10% FBS allowed 
to obtain the higher percentage of mature oocytes (88%). This was validated by 
Hoechst staining and observation of the first polar body. The second part of the 
study was the GR identification in the bovine denuded oocytes for which immature 
and matured in vitro oocytes were used; cytoplasmic oocytes analysis was 
performed and the presence of GR was detected by Western Blot. The results 
provide evidence for the presence of GR in bovine oocytes and suggest that this 
protein may be responsible for the direct effects of glucocorticoids on the bovine 
oocyte. 
 
Keywords: oocyte, GR, glucocorticoids, maturation, identification. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VIII 
 
ABREVIATURAS 
 
GC 
VPA 
CRH 
ACTH 
PKA 
StAR 
P450sCC 
AMPc 
CGB 
GR 
MR 
AND 
ARNm 
hGR 
DBD 
HBD 
AF 
NLS 
hsp 
HRE 
GRE 
GnRH 
LH 
FSH 
PEIV 
MIV 
FIV 
CIV 
Glucocorticoides 
Hormona Vasopresina Arginina 
Hormona liberadora de la hormona Corticotrópica 
Hormona adrenocorticotrópica 
Proteina cinasa A 
Steroidogenic Acute Regulatory 
citocromo P450 que corta la cadena lateral del colesterol 
Adenosina 3´5´monofosfato ciclica 
Globulina ligadora de Corticosteroides 
Receptor para Glucocorticoides 
Receptor para Mineralocarticoides 
Ácido desoxirribonucleico 
Ácido ribonucleico mensajero 
Receptor para glucocorticoides humano 
Del inglés DNA binding domain 
Del inglés Hormone binding domain 
Función de activación 
Señal de localización nuclear 
Proteína de choque térmico 
Elementos de Respuesta Hormonal 
Elementos de Respuesta a Glucocorticoides 
Hormona liberadora de Gonadotropinas 
Hormona Luteinizante 
Hormona Folículo Estimulante 
Producción de Embriones in vitro 
Maduración in vitro 
Fertilización in vitro 
Cultivo in vitro 
 
IX 
 
CCO 
RVG 
MII 
GMPc 
PKC 
EGF-like factor 
MAPK 
ERK 
PDE3A 
Cdc25B 
MPF 
CDK1 
TGF 
SFB 
SVE 
ABS 
HHG 
11βHSD 
RT-PCR 
 
PR 
ER 
hCG 
eCG 
FSH-p 
EGF 
DPBS 
PBS 
NP-40 
HCl 
Complejo Cumulus Ovocito 
Rompimiento de Vesícula Germinal 
Metafase II 
Guanosina 3´5´-monofosfato cíclica 
Proteína cinasa C 
Factores de Crecimiento semejantes al Epidermal 
Proteína Cinasa Activada por Mitógeno 
Cinasas Reguladas Extracelularmente 
Fosfodiesterasa 3A 
Ciclo de división celular 25B 
Factor Promotor de la Maduración 
Cinasa Dependiente de Ciclina 1 
Factores de Crecimiento Transformante 
Suero Fetal Bovino 
Suero de Vaca en Estro 
Albumina Sérica Bovina 
Hipotálamo-Hiposífis-Gonada 
11βHidroxiesteroide Deshidrogenasa 
Transcriptasa revesar de Reacción en Cadena de la 
Polimerasa 
Receptor de Progesterona 
Receptor de Estrógenos 
Gonadotropina Corionica humana 
Gonadotropina Corionica equina 
Hormona Folículo Estimulante porcina 
Factor de Crecimiento Epidermal 
Solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco 
Solución amortiguadora de fosfatos 
Nonil fenoxipolietoxiletanol-40 
Ácido clorhídrico 
 
X 
 
NaCl 
EDTA 
NA3VO4 
NaF 
H3PO4 
CDTA 
DTT 
WB 
SDS-PAGE 
PVDF 
TBS 
Cc 
v/v 
Cloruro de sodio 
Ácido etilendiaminotetraacético 
Orto-vanadato de sodio 
Fluoruro de sodio 
Ácido fosfórico 
Ácido 1,2- ciclohexilenedinitrilotetracetico 
Ditiotreitol 
Western Blot 
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
Polifluoruro de vinilideno 
Solución salina tamponada con Tris 
Condición corporal 
Volumen a volumen 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
XI 
 
CONTENIDO 
Página 
RESUMEN ............................................................................................................. VI 
ABSTRACT ........................................................................................................... VII 
CONTENIDO ......................................................................................................... XI 
1  INTRODUCCION .............................................................................................. 1 
1.1  GLUCOCORTICOIDES ................................................................................. 1 
1.2  ESTRES ...................................................................................................... 11 
1.3  MADURACIÓN in vitro DE OVOCITOS BOVINOS ..................................... 15 
1.4  ANTECEDENTES DE ESTUDIOS REALIZADOS SOBRE EL GR ............. 23 
2  HIPOTESIS ..................................................................................................... 26 
3  OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 27 
4  OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................... 27 
5  MATERIAL Y METODOS ............................................................................... 28 
5.1  FASES DEL ESTUDIO EXPERIMENTAL ................................................... 28 
5.2  MATERIAL BIOLOGICO ............................................................................. 28 
5.3  MADURACION in vitro DE OVOCITOS BOVINOS ..................................... 28 
5.4  IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR PARA GLUCOCORTICOIDES EN 
OVOCITOS DE BOVINO POR MEDIO DE WESTERN BLOT .................... 34 
6  RESULTADOS ............................................................................................... 38 
6.1  MADURACION in vitro ................................................................................ 38 
6.2  IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORES PARA GLUCOCORTICOIDES EN 
OVOCITOS DE BOVINOS .......................................................................... 41 
7  DISCUSION .................................................................................................... 42 
7.1  MADURACION in vitro DE LOS OVOCITOS DE BOVINO ......................... 42 
7.2  IDENTIFICACIÓN DE RECEPTOR PARA GLUCOCORTICOIDES EN 
OVOCITOS BOVINOS ................................................................................ 45 
8  CONCLUSIONES ........................................................................................... 49 
9  PERSPECTIVAS ............................................................................................ 50 
LITERATURA CITADA .......................................................................................... 51 
 
XII 
 
 
LISTA DE CUADROS 
 
Página 
 
Cuadro 1 Constitución del medio de maduración in vitro de cada 
protocolo realizado. ................................................................................. 33 
Cuadro 2 Resultados de la Cuantificación de proteínas por el método de 
Bradford en los lisados de ovocitos bovinos desnudos 
inmaduros y maduros. ............................................................................. 36 
Cuadro 3 Realización de la curva estándar para la cuantificación de 
proteínas por el método de Bradford. ...................................................... 37 
Cuadro 4. Expansión de las células del cumulus con los protocolos de 
maduración empleados para la estandarización de la 
maduración in vitro de los ovocitos bovino. ............................................. 39 
Cuadro 5. Porcentaje de ovocitosde bovino madurados in vitro tomando 
como parámetros la expansión de las células del cumulus, la 
presencia del primer cuerpo polar y la tinción de Hoechst al 
emplear el protocolo 5. ............................................................................ 40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
XIII 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Página 
 
Fig. 1 Ruta de la esteroidogenesis en la corteza adrenal. ...................................... 5 
Fig. 2 Esquema del gen GR de humano. ................................................................ 8 
Fig. 3 Estructura del GR. ........................................................................................ 9 
Fig. 4 Cascada de señalización de los glucocorticoides. ...................................... 11 
Fig. 5 Descripción esquemática del posible mecanismo del estrés 
calórico en la reproducción. ......................................................................... 13 
Fig. 6 Ovocito bovino desnudo en donde la flecha señala el 
primercuerpo polar. ..................................................................................... 18 
Fig. 7 Modelo propuesto de la reasunción de la meiosis en el ovocito 
folicular inducida por la LH. ......................................................................... 20 
Fig. 8 Categorías de CCO bovino de acuerdo a la apariencia 
morfológica del citoplasma y células del cumulus ....................................... 22 
Fig. 9 Ovocitos de bovino después de 24 hrs de maduración in vitro 
donde se puede observar que presentan pobre expansión de las 
células del cumulus. .................................................................................... 38 
Fig. 10 a) Ovocitos de bovino madurados in vitro con el protocolo 5 
donde se muestra la expansión de las células del cumulus. b) 
Mayor aumento de los ovocitos (200X). ...................................................... 40 
Fig. 11 Ovocito de bovino teñidos con Hoechst 33342. ........................................ 41 
Fig. 12 Western blot mostrando la inmunodetección de GR. ................................ 41 
 
 
 
 
 
1 
 
1 INTRODUCCION 
1.1 GLUCOCORTICOIDES 
Originalmente los glucocorticoides fueron llamados así debido a su 
importancia en el metabolismo de la glucosa, actualmente son definidos como 
esteroides que ejercen sus efectos por unión a un receptor citosólico específico el 
cual media la acción de estas hormonas (Aron et al.,2004a). 
 
1.1.1 Regulación 
Existen estudios que indican que los glucocorticoides (GC) juegan un papel 
esencial en el control de numerosos procesos fisiológicos y del desarrollo. En el 
desarrollo fetal, los glucocorticoides modulan ordenadamente la secuencia de 
diferenciación en los tejidos, mientras que en el adulto se involucran de manera 
esencial en la homeostasis, la inmunidad celular y la respuesta al estrés (Ballard, 
1986). Con respecto al estrés, el sistema portal hipofisiario, mediante la 
interpretación de estímulos físicos y psicológicos, es el responsable de responder 
a un estímulo especifico de estrés; ocasionando primeramente el incremento 
inmediato y constante en la concentración de la hormona vasopresina arginina 
(VPA) y de la hormona liberadora de la hormona corticotrópica (CRH) y más tarde 
el de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la cual responde después de un 
lapso mayor de tiempo, cuando las concentraciones de cortisol son altas (Dobson 
y Smith, 2000). El incremento en las concentraciones de ACTH estimula la síntesis 
y liberación de glucocorticoides. 
Los GC junto con los mineralocorticoides, estrógenos, progestágenos y 
andrógenos son hormonas esteroides derivadas del colesterol y son sintetizadas 
por las células endocrinas localizadas la glándula adrenal, el ovario y testículos, 
respectivamente (Tsai y O´Malley,1994; Aron et al.,2004a). 
Los GC se sintetizan en la corteza de la glándula adrenal, mientras que la 
parte central, la médula, sintetiza catecolaminas, principalmente epinefrina. Cabe 
 
2 
 
mencionar que la corteza adrenal se divide en tres capas: la zona glomerular, 
compuesta de grupos de células esféricas, localizadas justo debajo de la cápsula 
adrenal; la zona fascicular contiene células arregladas en columnas, es la lámina 
media y; la zona reticular contiene células en un patrón parecido a un enrejado, 
siendo la capa más profunda. El mayor producto de la zona fascicular y reticular 
son los GC (cortisol en humanos y corticosterona en roedores), los 
mineralocorticoides y los andrógenos (Aron et al., 2004a). 
Aunque la ACTH es la hormona trófica de la zona fascicular y reticular de la 
glándula adrenal y por ende el regulador principal de la producción de cortisol y 
andrógenos adrenales, existen otros factores producidos dentro de la adrenal 
como neurotransmisores, neuropéptidos y óxido nítrico que también participan en 
la regulación de estos compuestos. La CRH estimula la secreción pulsátil de la 
ACTH (Aron et al., 2004a). 
 La secreción y regulación de CRH y de ACTH depende de tres factores: 1) la 
secreción episódica y de ritmo circadiano de la ACTH, 2) la sensibilidad al estrés 
del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal y, 3) la retroalimentación negativa del 
cortisol sobre la secreción de CRH y ACTH. 
1) Ritmo circadiano. Este proceso es el resultado de eventos del 
sistema nervioso central para regular el número y magnitud de los 
episodios de secreción de CRH y ACTH. Así, la secreción del cortisol 
es baja por la noche y continua disminuyendo hasta las primeras 
horas de sueño en las cuales sus niveles en plasma no son 
detectables. Durante la tercera y quinta hora de sueño existe un 
incremento en la secreción del cortisol, pero los episodios de 
secreción mayor inician en la sexta y octava hora de sueño y 
empieza a disminuir nuevamente al despertar; casi la mitad del 
cortisol diario total es secretado durante este último periodo. 
Después, la secreción del cortisol disminuye gradualmente durante el 
día, con episodios de secreción de baja magnitud; sin embargo, hay 
un aumento en la secreción de cortisol en respuesta al ejercicio y la 
 
3 
 
alimentación. Aunque este patrón de secreción es constante existen 
factores que pueden modificarlo como cambios en el patrón de 
sueño, exposición a días obscuros, hora de alimentación, el estrés 
físico y psicológico. 
2) Respuesta al estrés. El incremento en plasma de ACTH y cortisol 
son característicos de una respuesta al estrés físico. ACTH y cortisol 
son secretados en minutos después de iniciado un estrés, y esta 
respuesta puede inhibir el ritmo circadiano si el estrés es prolongado. 
La respuesta al estrés se origina en él sistema nervioso central e 
incrementando la secreción de CRH por el hipotálamo y de ACTH 
por la hipófisis. 
3) Retroalimentación negativa. Se piensa que la principal acción 
negativa de los glucocorticoides en la secreción de ACTH ocurre 
tanto en hipotálamo como en glándula hipófisis anterior, por medio 
de dos mecanismos: "Inhibición rápida de la retroalimentación” e 
“Inhibición lenta de la retroalimentación”. El primer mecanismo es 
dosis-dependiente, - por ejemplo depende de la tasa de aumento de 
la dosis de glucocorticoides-, pero no de la dosis de administración. 
Esta fase es rápida (dentro de unos minutos) y pasajera (menos de 
10 minutos), por lo que sugiere la mediación de un mecanismo no 
nuclear ya que el fenómeno ocurre demasiado rápido para ser 
explicado por la influencia de los corticosteroides en la transcripción 
nuclear del RNAm específico para ACTH. La "retroalimentación 
lenta," es tiempo y dosis-dependiente; la administración continua de 
glucocorticoides ocasiona que los niveles de la ACTH también 
disminuyan de manera continua y que no respondan a la 
estimulación hasta culminar con la supresión de la CRH, la liberación 
de ACTH y atrofia de las zonas fascicular y reticular. Bajo estas 
condiciones,el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal se suprime y no 
responde al estrés o la estimulación. Este tipo de retroalimentación 
 
4 
 
parece actuar a través del mecanismo clásico de receptor de 
glucocorticoides. Además de la retroalimentación negativa de 
corticoides, la ACTH también inhibe su propia secreción 
(retroalimentación de asa corta). (Aron et al.,2004a,b). 
 
1.1.2 Síntesis 
Al igual que la síntesis de todas las hormonas esteroideas, la síntesis de los 
GC por la zona fascicular y reticular en la glándula adrenal inicia con el colesterol. 
Es decir cuando la glándula adrenal es estimulada por la ACTH se produce una 
rápida y aguda respuesta en la biosíntesis de hormonas esteroides, resultado de 
la movilización del colesterol a partir de lípidos almacenados en la membrana 
interna de la mitocondria. Esta rápida respuesta al estímulo de la esteroidogénesis 
es mediada por la proteína StAR (steroidogenic acute regulatory); esta proteína 
mitocondrial aumenta el transporte del colesterol de afuera de la mitocondria hacia 
la membrana interna de este organelo, la cuál es rica de la enzima P450scc o 
CYP11A1. Esta última proteína convierte el colesterol en ∆5-pregnenolona, 
iniciando así la esteroidogenesis (Waterman y Larry, 1997; Aron et al., 2004a) 
(Fig. 1). La cascada de señalización inicia cuando la ACTH se une con alta 
afinidad a los receptores de membrana de la corteza adrenal, activando a la adenil 
ciclasa y en consecuencia aumentando los niveles de AMPc (Adenosina 3´5´-
monofostato cíclico), que por su parte activan a la proteína cinasa A intracelular 
(PKA) y a la proteína reguladora esteroidogénica aguda (StAR). La PKA por su 
parte induce la activación de la colesterolesterasa y la inhibición de la colesterol-
ester sintetasa lo que induce el incremento en la formación de colesterol libre. 
Otro de los efectos de la ACTH, en la glándula adrenal, es aumentar la captación 
de las lipoproteínas. Como resultado la ACTH conduce a la síntesis rápida y 
secreción de esteroides por lo que los niveles en plasma de estas hormonas se 
elevan en minutos. (Aron et al., 2004a). 
 
 
5 
 
 
P450sCC (citocromo 
P450 que corta la cadena lateral del colesterol); P450C17 (17αhidroxilasa/citocromo 
P450 17,20-liasa); 3β-HSD (3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa); P450c21 
(citocromo P450 C21-hidroxilasa) y P450c11 (citocromo P450 11β-hidroxilasa). 
Tomado de: Waterman y Bischof, (1997). 
 
1.1.3 Circulación 
La mayor parte de la actividad glucocorticoide está relacionada con la 
molécula de cortisol, el cual es secretado en un estado libre; sin embargo, esta 
hormona se une a proteínas plasmáticas para entrar en la circulación. La vida 
media del cortisol en plasma (60-90 minutos) es determinada por el grado de 
unión a las proteínas en plasma y por la tasa de inactivación metabólica. El cortisol 
se une principalmente a la globulina unidora de corticosteroides (CBG o 
Fig. 1Ruta de la esteroidogenesis en la corteza adrenal. 
 
6 
 
transcortina) y en menor grado a la albúmina. Cabe mencionar que los esteroides 
ligados son biológicamente inactivos mientras que los no-ligados o libres forman la 
fracción activa (Aron et al., 2004a). 
En condiciones basales, aproximadamente el 10 % del cortisol circulante se 
encuentra libre, aproximadamente el 75 % está ligado a CBG, y el resto está 
ligado a la albúmina; esta ultima proteína aunque tiene una capacidad mucho 
mayor para unir cortisol lo hace con menor afinidad debido a que se une de 
manera inespecífica, normalmente une 15% del cortisol circulante, porcentaje que 
aumenta cuando la concentración de cortisol total excede la capacidad de unión 
de CBG. Normalmente, el nivel de cortisol libre en plasma es aproximadamente 1 
μg/dL, y es este cortisol activo el cual es regulado por ACTH (Aron et al., 2004a). 
 
1.2.1 Receptor: estructura y activación 
La respuesta biológica de las células a los glucocorticoides es mediada por 
una proteína receptora específica, el receptor a glucocorticoides (GR), el cual se 
encuentra presente de manera ubicua en todos los tejidos (Beato, 1989; Franklyn, 
2004). El GR puede presentarse en 2 isoformas moleculares diferentes, el GRα y 
el GRβ, con 777 y 742 aminoácidos, respectivamente. Ambas isoformas se han 
encontrado juntas en casi todos los tejidos del humano (Holm et al., 1999). 
Los receptores a esteroides son una superfamilia de factores de trascripción 
ligando-inducible, que controlan una variedad de funciones fisiológicas, como el 
metabolismo, el desarrollo y la reproducción, a través del control en la trascripción 
de genes blanco específicos (Heitzer et. al., 2007). 
Los receptores a las hormonas esteroides, como los de los glucocorticoides y 
de otros receptores relacionados con ligandos no esteroides (como por ejemplo la 
hormona tiroidea, el ácido retinoico o la vitamina D3) se sitúan en el interior de la 
célula actuando directamente sobre la expresión genética al unir a su ligando. De 
hecho existen diferencias con respecto a la localización subcelular entre los 
receptores de esteroides. El GR, posiblemente el receptor de aldosterona y el 
 
7 
 
receptor de mineralocorticoides (MR), se encuentra en el citoplasma mientras que 
por el contrario, los receptores relacionados con ligandos no esteroides podrían 
hallarse en el núcleo, probablemente asociados con el ADN, aunque no 
necesariamente a la región del promotor. Otros, como el receptor de hormonas 
tiroideas puede tener localización nuclear, citosólica o hallarse en la membrana de 
la mitocondria (Adcock e Ito, 2000). 
En los mamíferos, el gen de los receptores esteroideos se ha conservado 
evolutivamente por lo que deriva de un ancestro común originado hace 400 
millones de años. El gen del GR humano (hGR) es el más estudiado, este gen se 
localiza en el brazo largo del cromosoma 5 y está compuesto de 9 exones (Fig. 
2a). En el ARN mensajero maduro (ARNm), el exón 1 representa la región no 
traducida 5´, mientras que los exones 2-9 codifican para la proteína y la región no 
traducida 3´. Además, el exón 1 esta compuesto de varias variantes 
independientes llamadas 1A-1J, cada una de ellas contiene su propio sitio de inicio 
de la transcripción y promotores únicos. Las variedades de promotores, los sitios 
de unión a los factores de transcripción y los sitio de inicio de la transcripción se 
piensa sean responsables de las diferencias en la expresión génica del hGR en 
las diferentes partes del cuerpo (Fig. 2b) Comparablemente al exón 1 el exón 9 
puede ser madurado alternativamente para producir las 2 isoformas más 
ampliamente conocidas GRα y GRβ (Revollo y Cidlowski, 2007) (Fig. 2c). El GRα 
es la isoforma predominante y la única que tiene capacidad para unirse a la 
hormona y, por lo tanto, para realizar funciones de activación o represión. El GRβ 
se forma como consecuencia de un mecanismo alternativo de maduración (corte y 
empalme) del ARNm del GR, y difiere de la isoforma α tan sólo en los últimos 
aminoácidos del extremo C-terminal. Esta diferencia podría ser lo que incapacita al 
GRβ para unir a la hormona (Barnes, 1996). 
 
 
8 
 
a) Estructura del gen de GR 
compuesto por 9 exones. b) Sitios de iniciación alternativos del GR. c) Mecanismo 
alternativo de maduración del ARNm.Tomado de: Revollo y Cidlowski, (2009). 
 
Por otra parte, el receptor cuenta con el dominio N-terminal, el dominio 
central de unión al DNA (DBD, del inglés DNA binding domain) y el dominio C- 
terminal de unión a la hormona (HBD del inglés Hormone binding domain). 
Respecto al dominio N-terminal este contiene el dominio de activación AF-1 (o 
independiente de la hormona) relacionado con la actividad transcripcional y la 
unión con proteínas coactivadoras y factores de transcripción (Cosío et al., 2005). 
Pos su parte el DBD cuenta con 2 dedos de zinc que le permiten la unión al DNA, 
mientras que el dominio C-terminal contienea la región AF-2, responsable de la 
unión a la hormona, y la señal de localización nuclear (NLS) (Revollo y Cidlowski, 
2007) (Fig. 3). 
Fig. 2 Esquema del gen GR de humano.
 
9 
 
El GR en su estado inactivo se encuentra en el citoplasma y unido a través 
del extremo C-terminal a un complejo hetero-oligomérico, que consiste del GR 
(100 KDa), dos proteínas de 90 KDa, que pertenecen a la familia de proteínas 
activadas por calor (heat shock proteins o hsp) o también llamadas chaperonas, 
además de otras proteínas (Barnes et al., 1998; Adcock e Ito, 2000). 
Por otra parte existen secuencias en el DNA a las cuales se unen estos 
receptores, llamadas elementos de respuesta a hormonas (HRE, hormone 
response elements), en el caso para los GC reciben el nombre de GRE. Estos 
elementos pueden estar situados cerca de la región del promotor de los genes 
regulados o muy lejos de él y, en algunos casos, formando parte del primer intrón 
y son responsables de potencializar la tasa de transcripción del gen en el que se 
localizan (Adcock e Ito, 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las hormonas esteroides por ser de naturaleza lipídica pueden entrar a las 
células blanco por difusión simple y subsecuentemente unirse a su receptor afín 
(Tsai y O´Malley, 1994). 
Cuando la hormona se une al GR se induce un cambio en la conformación 
del receptor provocando su disociación de las hsp, exponiéndose además la 
Fig. 3 Estructura del GR. Tomado de: Revollo y Cidlowski, (2009). 
 
10 
 
secuencia de translocación nuclear dentro del DBD y una vez dentro del núcleo 
se une al ADN a través de los 2 dedos de zinc que contiene este dominio; la 
región amino terminal de este dominio contiene los aminoácidos que reconocen el 
GRE, llamada caja P, por lo que ha sido implicada en la especificidad de unión del 
receptor a esta región. Por otra parte, debido a la secuencia palindrómica de 15 
pares de bases de GRE (GGT ACA NNN TGT TCT) el GR se une en forma de 
homodímero para activar así la transcripción génica. Aunque la especificidad de la 
unión del receptor a la secuencia del GRE del ADN esta determinada por los tres 
aminoácidos adyacentes al primer dedo de zinc, la región carboxilo terminal del 
segundo dedo de zinc en también necesaria para la unión al ADN, ya que 
mutaciones en esta región generan un receptor inactivo (Beato, 1989; Adcock e 
Ito, 2000) (Fig. 4) 
De manera general el complejo hormona-receptor (receptor activado) al 
unirse a la secuencia HRE del ADN facilita, en el sitio promotor, el ensamblaje y 
estabilización del complejo de preiniciación transcripcional para estimular la 
transcripción de los genes sensibles a esteroides. Los productos de los genes 
sensibles a esteroides primeramente son responsables de la regulación de 
funciones biológicas como la reproducción, desarrollo, homeostasis y conducta, ya 
sea directamente o a través del control transcripcional de otros genes (Tsai y 
O´Malley, 1994). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GR: receptor de 
glucocorticoides; GRE: elemento de respuesta a glucocorticoides. Tomado de: 
Revollo y Cidlowski, (2009). 
 
1.2 ESTRES 
Un mecanismo que altera las funciones biológicas reguladas por el complejo 
GC-GR es el estrés. Bajo condiciones de producción animal el estrés puede ser 
definido como la inhabilidad de un animal para responder a las condiciones de su 
entorno; fenómeno que se manifiesta cuando el animal no logra su potencial 
genético, por ejemplo la tasa de crecimiento, producción de leche, resistencia a 
enfermedades o fertilidad (Dobson y Smith, 2000) 
Fig. 4 Cascada de señalización de los glucocorticoides. 
 
12 
 
Los bovinos, como otros animales homeotérmicos, responden a condiciones 
de estrés estableciendo prioridades fisiológicas para mantener funciones críticas y 
como resultado, otras funciones fisiológicas se ven comprometidas; por ejemplo, 
un mecanismo homeocinético para prevenir la hipertermia en los animales 
expuestos a un estrés calórico es la disminución en el consumo de alimento; así 
resulta también una reducción en la motilidad del rumen y una tasa de crecimiento 
precaria. Además, la falla o la habilidad insuficiente para regular la temperatura 
corporal pueden tener consecuencias negativas en el aspecto reproductivo, debido 
a que las temperaturas elevadas causan alteraciones en el espermatozoide, los 
ovocitos y en la implantación de los embriones. (Aréchiga, 2005). 
 
1.2.2 Efecto del estrés calórico sobre el eje hipotálamo-hipófisis-
ovario 
Los principales factores que regulan la actividad del ovario son la hormona 
GnRH (Hormona liberadora de Gonadotropinas) producida por el hipotálamo y las 
gonadotropinas LH (Hormona Luteinizante) y FSH (Hormona Folículo Estimulante) 
secretadas por la hipófisis. 
En los mamíferos, el efecto del estrés calórico sobre las concentraciones de 
LH en sangre es inconsistente puesto que mientras algunos autores no 
encuentran cambios en la concentración de esta hormona, otros indican una 
disminución de la misma. Adicionalmente, en bovinos sometidos a estrés calórico, 
en lo que respecta a los patrones de secreción de LH, se ha encontrado que en 
novillas aunque la amplitud de los pulsos disminuye no se producen cambios en 
la frecuencia de secreción de la hormona mientras que en las vacas si; aunque la 
razón de esta diferencia no es clara, se ha sugerido que esto puede estar 
relacionado con el nivel preovulatorio de estradiol, ya que en las vacas la amplitud 
de los pulsos preovulatorios de LH y GnRH en plasma se encuentran disminuidos 
cuando existe baja concentración plasmática de estradiol pero no al contrario. De 
manera notable se ha encontrado que las concentraciones plasmáticas de 
 
13 
 
estradiol se reducen en vacas por el estrés calórico, este efecto es consistente con 
la disminución de las concentraciones de LH y la baja dominancia del folículo 
seleccionado, lo que resulta en una pobre expresión del estro y por lo tanto 
fertilidad reducida (De Rensis y Scaramuzzi, 2003). 
Sin embargo, los mecanismos por los cuales el estrés calórico altera las 
concentraciones circulantes de las hormonas reproductivas no son claros. Se ha 
sugerido que el incremento en la secreción de corticosteroides puede inhibir la 
secreción de GnRH y LH o que el estrés calórico puede actuar directamente en el 
ovario disminuyendo su sensibilidad a las gonadotropinas (Fig. 5) (De Rensis y 
Scaramuzzi, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.2.3 Efecto del estrés calórico en el ovocito y embrión. 
Estudios realizados en diferentes épocas del año han mostrado que la 
proporción de ovocitos clasificados morfológicamente normales es menor durante 
Fig. 5 Descripción esquemática del posible mecanismo del estrés calórico
en la reproducción. Tomado de: De Rensis y Scaramuzzi, (2003). 
 
14 
 
el verano que en el invierno. También, en los meses de verano se ha encontrado 
que una menor proporción de ovocitos, fertilizados in vitro, se desarrollaron hasta 
la etapa de blastocitos. Además el efecto del estrés calórico puede verse reflejado 
tiempo después de que las vacas fueron expuestas al mismo, es decir la 
exposición de los folículos en desarrollo a altas temperaturas durante el verano, 
tiene un efecto en la calidad de los ovocitos en el otoño; lo cual es consistente con 
la baja fertilidad observada durante el otoño, aun cuando las temperaturas 
ambientales son menores (Hernández, 2005). Lo anterior posiblemente sea 
debido a que esta exposición durante el verano reduce el grado de dominancia del 
folículo dominante y la supervivencia de los folículos subordinados de tamaño 
medio; e incrementa la duración de la dominancia del folículo preovulatorio por lo 
que más de un folículo dominante puede desarrollarse y esto podría explicar 
también el incremento en nacimientos gemelares observados en el verano(De 
Rensis y Scaramuzzi, 2003). 
Por otra parte, además de que el estrés térmico afecta la calidad de los 
ovocitos también afecta el desarrollo embrionario temprano (Hernández, 2005); en 
las vacas durante el estrés térmico el ambiente intrauterino se ve comprometido 
debido a que se produce disminución en el flujo sanguíneo del útero y un 
incremento en la temperatura uterina. Estos cambios inhiben el desarrollo 
embrionario, incrementan la pérdida del embrión temprano y la proporción de 
inseminaciones poco exitosas (De Rensis y Scaramuzzi, 2003). Así, los ovocitos 
pueden afectarse ya sea por un efecto directo de la temperatura o a través del 
efecto que tiene el estrés térmico en el desarrollo folicular (Hernández, 2005). 
Adicionalmente, bajo condiciones in vitro, la exposición de los embriones a 
temperaturas equivalentes a la temperatura rectal de las vacas bajo estrés térmico 
(41° C), provoca disminución en la proporción de embriones que llega a la etapa 
de blastocito. La susceptibilidad de los embriones al estrés térmico disminuye 
conforme los embriones avanzan en su desarrollo; los embriones de dos células 
son más susceptibles que los embriones en la etapa de mórula. Sin embargo, 
independientemente de la etapa del desarrollo embrionario en que los embriones 
 
15 
 
sean susceptibles al estrés térmico, el resultado final es un aumento en la muerte 
embrionaria (Hernández, 2005). 
Para evaluar el efecto del estrés calórico sobre la calidad del ovocito y del 
embrión, se han desarrollado técnicas de cultivo in vitro de estos, para elucidar el 
mecanismo por el cual el calor ejerce un daño o cambios en el potencial del 
desarrollo (Ju et al.,2005). 
1.3 MADURACIÓN in vitro DE OVOCITOS BOVINOS 
Como es conocido la selección genética y los esquemas de cruzamiento 
pueden ser optimizados con la producción de embriones in vitro (PEIV). Esta 
técnica se encuentra integrada por tres etapas: 1) la maduración in vitro de 
ovocitos (MIV), 2) la fertilización in vitro (FIV) y 3) el cultivo in vitro (CIV) de los 
embriones. Actualmente los resultados logrados con la PEIV son alrededor del 30 
a 40 % de blastocistos. Estos resultados tan bajos han sido atribuidos entre otras 
cosas a la población heterogénea de ovocitos obtenidos de los folículos presentes 
en los ovarios utilizados (Van Blerkom et al., 1990). 
Para obtener los ovocitos a gran escala, los ovarios utilizados se pueden 
adquirir después del sacrificio de las hembras o por ovariectomía. La forma más 
común y económica para la obtención de los ovocitos con fines experimentales, es 
el aprovechamiento de los ovarios de vacas sacrificadas en los rastros (Gordon, 
2003). 
El desarrollo in vitro de los ovocitos está íntimamente relacionado con el 
grado de desarrollo estructural que adquiere durante la etapa folicular previa. El 
folículo es una estructura ovárica con dos funciones, producción de hormonas y de 
ovocitos aptos para ser fecundados (Gordon, 2003). Los ovocitos que residen 
dentro de los folículos ováricos están recubiertos por células de la granulosa 
(células del cumulus) formando el complejo cumulus-ovocito (CCO), manteniendo 
una comunicación con estas células a través de uniones comunicantes. (Tripathi et 
al., 2010). De manera particular, la división meiótica del ovocito se detiene durante 
el crecimiento folicular y son los folículos antrales los que tienen la particularidad 
 
16 
 
de mantener el arresto meiótico, el cual se reinicia después de la liberación 
(ovulación) y termina después de la fecundación de óvulo. In vitro la división 
meiótica puede continuar en forma espontánea después de que el ovocito es 
retirado del folículo (Pincus y Enzmann, 1935). 
Durante cada ciclo estral el número de folículos en desarrollo difiere según la 
especie y depende también en forma directa del peso de los animales, donde el 
tamaño del ovocito está correlacionado con la capacidad de desarrollo del folículo. 
Generalmente los ovocitos competentes para madurar deben medir como mínimo 
110μm de diámetro, por lo que cuanto mayor sea el tamaño folicular mayor será la 
capacidad del ovocito de lograr el estado de ruptura de la vesícula germinal 
(RVG), la fecundación y posterior desarrollo (Gordon, 2003). 
 
1.3.1 Mecanismo celular de la maduración de ovocitos de 
mamíferos 
El ciclo celular meiótico en los ovocitos inicia durante la etapa fetal y al 
momento del nacimiento permanece arrestado en la etapa de diploteno de la 
primera profase meiótica; dependiendo de la especie mamífera permanecerá en 
esta etapa por meses o años dentro de un microambiente folicular particular. Sólo 
después de la pubertad los ovocitos plenamente desarrollados comenzaran a 
reanudar la meiosis que es estimulada por el aumento de gonadotropinas (Sun et 
al., 2009; Tripathi et al., 2010). 
 La maduración del ovocito es definida como el reinicio y terminación de la 
primera división meiótica y la subsecuente progresión a metafase II (MII); durante 
esta, los procesos de maduración nuclear y citoplasmático son esenciales para la 
fertilización y el desarrollo embrionario temprano (Gordon, 2003). Dentro de los 
procesos nucleares se encuentran la RVG para que los cromosomas homólogos 
se separen, expulsándose el primer cuerpo polar (Fig. 6), quedando la cromatina 
materna arrestada en metafase II. Los cambios que ocurren en el ovoplasma, 
llamados maduración citoplasmática, incluyen modificaciones en el citoesqueleto, 
 
17 
 
la redistribución de los organelos, reducción de los niveles de RNAm y cambios en 
los patrones de síntesis proteica (Sun et al.,2009). 
Dentro de la redistribución de organelos está la de las mitocondrias del 
centro de ovocito hacia la periferia; su movimiento hacia las áreas de mayor 
consumo de energía es crucial para el ovocito ya que estas juegan un papel 
esencial de la maquinaria metabólica, al ser responsables de proporcionar la 
energía que se consume durante el proceso de maduración (Ferreira et al., 2009). 
Otras estructuras que también son redistribuidas son los gránulos corticales 
(exclusivos sólo de los ovocitos y producidos por el aparato de Golgi); 
originalmente estos se localizan en el centro del ovocito pero conforme este 
progresa por la metafase son translocados hacia la periferia del ovocito. Esta 
translocación constituye uno de los signos ultraestructurales más obvios de la 
maduración citoplasmática. La exocitosis de los gránulos corticales (reacción 
cortical) es uno de los mecanismos usados por el ovocito para prevenir la 
poliespermia, pues cambia las propiedades físicas y químicas de la zona pelúcida 
ya que dentro de su composición se incluyen enzimas (además de una población 
diversa de proteínas, moléculas estructurales y glicosaminoglicanos) (Ferreira et 
al., 2009). 
 Por otra parte, además de los reguladores del ciclo celular, otras moléculas 
son importantes para la progresión de la maduración y el desarrollo la 
embriogénesis temprana; la síntesis y acumulación de estas moléculas en el 
ovocito es considerada como un marcador de la maduración citoplasmática. Así, el 
glutatión es un marcador biológico de la maduración citoplasmática; su 
concentración intracelular se incrementa conforme el ovocito progresa de vesícula 
germinal a la etapa de metafase II. Varios estudios han mostrado que esta enzima 
juega un papel fundamental en la protección celular contra el daño oxidativo de la 
eliminación de las especies reactivas del oxígeno (ROS), pero después de la 
fertilización, su actividad se relaciona con la descondensación de la cromatina del 
espermatozoide, la subsecuente activación del ovocito y la formación del 
 
18 
 
pronúcleo masculino, además de promover el desarrollo embrionario (Ferreira et 
al., 2009 y Curnow et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La 
flecha señala el primer cuerpo polar. 
 
Está bien establecido que el arresto meiótico es reguladopor los niveles de 
AMPc en el ovocito (Mehlmann, 2005); una de las hipótesis mantenida desde hace 
mucho tiempo señala que el AMPc es transferido de las células de la granulosa al 
ovocito a través de la uniones comunicantes. Sin embargo, recientemente se ha 
mostrado, por lo menos en el ratón, que los niveles intracitoplasmicos de AMPc 
en el ovocito son esenciales para el mantenimiento del arresto meiótico, además 
de que el GMPc (Guanisina 3´5´-monofosfato cíclica) también actúa como una 
señal inhibitoria y mantiene él arresto meiótico en los mamíferos. El GMPc pasa 
de las células de la granulosa al ovocito a través de las uniones comunicantes e 
inhibe en este la hidrólisis del AMPc por la fosfodiesterasa 3A (PDE3A) (Tripathi 
et al., 2010). 
El reinicio de la meiosis en el ovocito se da como respuesta al pico 
preovulatorio de LH producida por la hipófisis durante el estro, poco antes de la 
ovulación. Los receptores a LH están localizados en las células de la granulosa 
por lo que el mecanismo(s) por el cual esta hormona estimula la maduración del 
ovocito es indirecto; la acción de LH sobre las células de la granulosa se traduce 
Fig. 6 Ovocito bovino desnudo en donde la flecha señala el primer cuerpo
 
19 
 
en cambios en las moléculas de señalización (AMPc y GMPc) en el ovocito para 
reiniciar la meiosis (Mehlmann, 2005). 
Se ha establecido que como respuesta al pico de LH en las células de la 
granulosa se produce incremento en los niveles de AMPc, lo cual provoca la 
activación de PKA y de la proteína cinasa C (PKC) las que a su vez inducen la 
expresión de factores de crecimiento semejantes al epidermal (EGF-like factors), 
como la amfiregulina y la epiregulina. Estos EGF-like factors vía receptores en las 
células de la granulosa inducen la activación de la proteína cinasa activada por 
mitógeno (MAPK), específicamente MAPK3/1 (también conocidas como ERK1/2 o 
cinasas reguladas extracelularmente). La activación de la MAPK bloquea la 
comunicación entre el ovocito y las células que lo rodean a través de la 
fosforilación de las proteínas de las uniones comunicantes. El cierre de las 
uniones además de producir una disminución en los niveles de AMPc dentro del 
ovocito también produce la reducción en la transferencia de GMPc de las células 
del cumulus hacia el ovocito. La reducción en los niveles de GMPc permite la 
activación de PDE3A (Fosfodiesterasa 3A) lo que ocasiona que los niveles de 
AMPc en el ovocito disminuyan rápidamente (Tripathi et al., 2010). 
Por otra parte, la reducción del AMPc en el ovocito ocasiona la inactivación 
de la PKA; en ausencia de PKA, la fosfatasa Cdc25B (ciclo de división celular 
25B) ya no es fosforilada por lo que se mantiene es su estado activo. Cdc25B 
participa en la activación del complejo MPF (Factor promotor de la maduración), 
dicho complejo es inactivado por la fosforilación de las cinasas Wee1/Myt, por lo 
tanto lo que hace Cdc25B es desfosforilar a CDK1 (Cinasa dependiente de ciclina 
1) del complejo MPF, reiniciandose la meiosis del arresto de diploteno (Tripathi et 
al., 2010) (Fig. 7). 
 
 
 
 
20 
 
 
 
1.3.2 Criterios de selección del CCO 
La clasificación que se realiza para seleccionar a los ovocitos que serán 
utilizados para la MIV (maduración in vitro) es sumamente importante y se basa en 
una evaluación visual de las características morfológicas. Al igual que con la 
selección por el tamaño del ovocito, la morfología de los CCO´s se estableció 
como criterio para seleccionar a los más adecuados para ser cultivados (Madison 
et al., 1992; Blondin y Sirard, 1995; Hazeleger et al., 1995; Hosoe y Shioya, 1997). 
Fig. 7 Modelo propuesto de la reanudación de la meiosis en el ovocito 
folicular inducida por la LH. AC (adenil ciclasa), MAPK (Proteina cinasa activada por
Mitógeno), GPR3 (Receptor acoplado a proteína G), Gs (Proteína G estimulante),
PDE3A (Fosfodiesterasa 3A), PKA (Proteína cinasa A), cdc25b (fosfatasa del ciclo de
división celular 25B), RVG (Rompimiento de la vesícula germinal), Wee1/Myt1
(cinasas para la progresión del ciclo celular), MPF (Factor promotor de la 
maduración), CDK1 (cinasa dependiente de ciclina 1) y CyB (ciclina B). Tomado de:
Tripathi et al., (2010). 
 
21 
 
Según el autor las categorías de clasificación varían en numero, para fines 
prácticos se deberán cultivar sólo los CCOs que posean un cumulus 
 denso, con un mínimo de 5 capas y que cubran la totalidad de la superficie 
del ovocito; además su citoplasma debe de ser de color gris oscuro uniforme y no 
contener manchas (Gordon, 2003). 
La primera clasificación del CCO fue propuesta por Leibfried y First (1979), a 
partir de esas fechas muchas clasificaciones han sido propuestas considerándose 
la cantidad de las capas de las células del cumulus y la densidad de estas células 
foliculares que rodean al ovocito. La clasificación más empleada actualmente es la 
de De Loos (1989) que distingue 4 categorías del CCO; esta evalúa la 
compactación y transparencia de las células del cumulus que revisten al ovocito y 
la homogeneidad y transparencia del ovoplasma (Fig. 8). 
Clasificación según De Loos: 
Categoría 1: CCO cubierta de multicapas compactas de células, ovaplasma 
homogéneo, CCO ligeramente transparente. 
Categoría 2: CCO cubierta de multicapas compactas de células, ovoplasma 
homogéneo pero con la presencia de una zona obscura en la periferia del 
ovocitos, CCO ligeramente obscuro y menos transparente. 
Categoría 3: CCO cubierta celular poco compacta, ovoplasma irregular con 
zonas obscuras, CCO obscuro e irregular. 
Categoría 4: Células del cumulus expandidas formando puntos obscuros en 
una matriz gelatinosa, CCO obscuro e irregular. 
 
 
 
 
22 
 
Fig. 8 Categorías de CCO bovino de acuerdo a la apariencia morfológica del
citoplasma y células del cumulus. 
 
 
 (Imagen tomada de Stojkovic, 2001). a: 
categoría 1; b: categoría 2; c: categoría 3 y d: categoría 4. 
 
In Vitro los mejores resultados de maduración se obtienen con los CCO de la 
categoría 1 y 2 (Fukui y Sakuma, 1980; De Loss, 1989; Chian y Niwa, 1994; Hawk 
y Wall, 1994,). 
Para proporcionar al ovocito, de elementos similares a los disponibles in vivo, 
los medios de cultivo de maduración pueden contener hormonas gonadotrópicas 
(FSH y LH, estradiol, suero, células somáticas para co-cultivo por ejemplo: células 
del cumulus, de la granulosa, de la teca interna, oviducto, útero, células de hígado 
de rata, búfalo), aminoácidos y factores de crecimiento transformante (TGF-α, 
TGF-β). El objetivo es obtener el mayor porcentaje de ovocitos que logren un 
desarrollo hasta la etapa de blastocisto en los sistemas de cultivo in vitro. Uno de 
los medios de cultivo de ovocitos bovinos empleado con mayor frecuencia en los 
laboratorios de fertilización in vitro (FIV) es el medio de cultivo de tejidos 199 
(TCM-199). Generalmente los medios para la MIV emplean fuentes proteínicas de 
diferente origen, las más utilizadas son: el suero fetal bovino (SFB), suero de vaca 
en estro (SVE) y la albúmina sérica bovina (ASB). El suero está constituido por 
aminoácidos, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas y otras substancias 
que el ovocito requiere para su maduración (Gordon, 2003). 
El desarrollo de la MIV ha abierto la posibilidad de estudiar el efecto del 
estrés calórico y de los GC durante el desarrollo del ovocito. 
 
 
 
23 
 
1.4 ANTECEDENTES DE ESTUDIOS REALIZADOS SOBRE EL GR 
 
Estudios recientes, en la rata, han identificado receptores a glucocorticoides 
en células del ovario y testículos donde tienen acción directa en la 
esteroidogénesis gonadal, tanto in vivo como in vitro. El mecanismo por el cual el 
eje Hipotálamo Hipófisis Gonadal (HHG) puede influir en la función reproductiva es 
por un efecto directo de los glucocorticoides en las gónadas (testículos y ovarios). 
Estos compuestospueden intervenir en los tres niveles del eje hipotálamo-
hipófisis-gonadal: 1) a nivel del hipotálamo disminuyendo la síntesis y la liberación 
a GnRH; 2) en la glándula hipófisis anterior inhibiendo la síntesis o liberación de 
gonadotropinas y 3) a nivel de las gónadas modulando directamente la 
esteroidogénesis y/o gametogénesis. Esta propuesta está sustentada en 
numerosos estudios que indican que la administración de glucocorticoides 
sintéticos puede disminuir significativamente la liberación de GnRH por el 
hipotálamo e inhibir indirectamente la liberación de LH y FSH en la hipófisis 
(Yang et al., 1990). 
En el caso de Xenopus laevis se ha encontrado que las condiciones de 
estrés térmico repercuten en las etapas tempranas de la ovogénesis y esto se ve 
reflejado en la calidad del ovocito y en la fertilidad de los mismos (Gordon, 2003). 
En esta especie, usando Northern blot, se encontró que el GR se expresa en el 
ovocito y que puede funcionar como un modulador en el desarrollo embrionario 
temprano (Gao et al., 1994). 
Otro estudio realizado en ratas, por medio de la técnica de transcriptasa 
reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), mostró que la 
expresión de GR en las células de la granulosa se lleva a cabo de manera 
constitutiva durante las diferentes etapas del desarrollo folicular y la luteinización. 
Sin embargo los autores encontraron que existe la expresión diferencial de las 2 
isoformas de la enzima 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11βHSD): la 
11βHSD1 reductasa y de la11βHSD2 deshidrogenasa, por lo que sugieren que 
 
24 
 
esto pude actuar como un mecanismo clave para controlar la acción de los 
glucocorticoides durante el desarrollo folicular (Tetsuka et al., 1999). 
En el caso de bovinos, Schäubli et al., (2008) encontraron que durante la 
gestación tardía y alrededor del término, la pared uterina intercaruncular expresa 
receptores para progesterona (PR), estrógenos (ER) y glucocorticoides, 
distribuidos en un patrón de localización y tipo celular especifico; además 
encontraron que los cambios hormonales durante este periodo influyeron sólo 
ligeramente en la expresión de GR, mientras PR y ERα no mostraron cambios. 
También encontraron que existió una influencia de la progesterona, los estrógenos 
y los glucocorticoides en la expresión de sus propios receptores y en las funciones 
uterinas, como la contractibilidad y producción de prostaglandina y oxitocina. 
Otro estudio realizado en bovinos, en donde evaluaron la maduración nuclear 
(progresión a metafase II) y citoplasmática (translocación de gránulos corticales a 
la ovolema) de lo ovocitos bajo estrés-calórico (41ºC), después de 24 horas de 
maduración, mostró que este no tuvo efecto sobre los parámetros evaluados, sin 
embargo, hubo una reducción en el tiempo necesario para llegar a la maduración 
(de 4 a 6 horas) (Edwards et al., 2005). 
En cuanto al efecto de los GC sobre la maduración de los ovocitos y de su 
capacidad de fertilización, in vitro, empleando ovocitos de cerda, la adición de 
diferentes concentraciones de dexametasona al medio de maduración y la 
maduración de los mismos durante diferentes tiempos, mostraron que en el caso 
de CCO la concentraciones de 5 μg/ml y 10 μg/ml permitió la maduración de los 
ovocitos en un 52% y 48%, respectivamente, mientras que en el caso de ovocitos 
desnudos los porcentajes fueron menores, 43% y 35% respectivamente. El estudio 
menciona que el efecto de la dexametasona fue mayor a las 48 h de cultivo y que 
aparentemente la inhibición de la maduración del ovocito es mediada por las 
células de cumulus oophorus (Yang et al,, 1990). 
De lo antes señalado tal parece que los ovocitos de diferentes especies son 
capaces de responder al estrés, en el caso de los bovinos existe escasa 
información que señale la presencia del GR en dichas células y la relación que 
 
25 
 
pudiera tener la presencia de este receptor con la respuesta al estrés. Debido a 
ello se propuso en el presente trabajo buscar la presencia del receptor para 
glucocorticoides en los ovocitos bovinos cultivados in vitro. Esto como un primer 
paso para estudiar la respuesta del ovocito de esta especie a las condiciones de 
estrés calórico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
2 HIPOTESIS 
 
 
Si el receptor a glucocorticoides es constitutivo en las células de los 
mamíferos este debe estar presente en el ovocito de bovino inmaduro y/o en el 
maduro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
3 OBJETIVO GENERAL 
Identificar o no, al receptor para glucocorticoides en los ovocitos bovinos 
inmaduros y en los maduros bajo condiciones in vitro. 
 
 
4 OBJETIVOS ESPECIFICOS 
Determinar la presencia del GR en los ovocitos de bovinos y si su presencia 
se relaciona con el estado de maduración del mismo, por medio de: 
1. Maduración de ovocitos de bovino in vitro (IVM). 
2. Inmunodetección de receptores a glucocorticoides en ovocitos 
inmaduros y maduros. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
5 MATERIAL Y METODOS 
5.1 FASES DEL ESTUDIO EXPERIMENTAL 
La fase experimental del estudio constó de dos fases: 
1.- Maduración in vitro de los ovocitos bovinos: la cual se realizó en 
Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia 
de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
2.- Identificación de GR por medio de Western blot: realizada en colaboración 
con el laboratorio a cargo del Dr. Salvador Uribe Carvajal, en el Instituto de 
Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
5.2 MATERIAL BIOLOGICO 
Se utilizaron ovarios de vacas sacrificadas en el rastro municipal ubicado en la 
localidad de Temamatla, Estado de México. 
5.2.1 Colección y transporte del material biológico 
El transporte de los ovarios del rastro al laboratorio se realizó bajo condiciones 
de temperatura ambiente (25-27°C) en medio de transporte el cual estaba 
constituido de cloruro de sodio al 9% y 1% de gentamicina (100mg/ml), en un 
frasco de plástico con capacidad de 1.5 litros y transportados en un termo para 
mantener la temperatura. 
 
5.3 MADURACION in vitro DE OVOCITOS BOVINOS 
 
5.3.1 OBTENCIÓN DE LOS OVOCITOS BOVINOS 
Una vez en el laboratorio los ovarios se colocaron en un vaso de precipitado, 
que contenía 50 ml de medio de transporte a 25º C. Los ovarios fueron lavados de 
2-5 veces con dicho medio hasta retirar los detritus celulares y restos de sangre. 
 
29 
 
Para la colección o recuperación de ovocitos, a partir de ovarios obtenidos de 
animales sacrificados, se emplean diferentes técnicas, esto con la finalidad de 
obtener el mayor número de ovocitos posibles sin causar daño a la integridad 
morfológica y estructural de los mismos. La recolección de ovocitos bovinos por la 
técnica de aspiración de los folículos es el método más comúnmente empleado 
(Katska, 1984; Sirad et al., 1985; Epigg y Schroeder, 1986; Savio et al., 1988; 
Gordon y Lu, 1990; Carolan et al., 1992; Revel et al, 1995;). La ventaja de la 
técnica de aspiración folicular en la recuperación de ovocitos a gran escala es que 
es más rápida en comparación a la disección (Katska, 1984; Gordon y Lu, 1990; 
Gordon, 2003). Mientras que la técnica de disección, permite obtener el complejo 
cumulus ovocito con una mejor calidad que la aspiración, pero también se obtiene 
una mayor cantidad de detritus celulares, lo que aumenta el tiempo de selección 
del complejo cumulus-ovocito. (Katska, 1984; Gordon, 2003). 
El promedio de ovocitos recuperados por la técnica de aspiración es de 10-16 
ovocitos por ovario, de los cuales entre el 45-78% de estos presenta una calidad 
del Complejo Cumulus – Ovocito (CCO) aceptable. Por disección se han obtenido 
de 16-21 ovocitos por ovario y de éstos un 72-83% presentan buena calidad del 
CCO (Carolan, 1992). Tales datossugieren que la buena calidad de los ovocitos 
puede ser más difícil de conseguir cuando se hace aspiración. Sin embargo, 
algunos investigadores han trabajado con ambas técnicas, para ello después de 
realizar la aspiración folicular realizan la disección, obteniendo de esta manera 
una mayor cantidad de ovocitos por ovario (Gordon, 2003). 
En este estudio se decidió utilizar la combinación de ambas técnicas, esto 
tomando en consideración que los ovarios obtenidos de las vacas sacrificadas en 
los rastros presentaban escasos folículos visibles en la superficie del ovario con el 
diámetro requerido para ser puncionados; por lo que se realizó primero la 
aspiración de los folículos que contaban con un diámetro de 2-8 mm. La disección, 
únicamente se realizó en aquellos ovarios que presentaban a la vista una mayor 
cantidad de folículos. Esto nos permitió tomar primero aquellos ovocitos que 
tenían el mayor potencial de desarrollo y la obtención de la mayor cantidad de 
 
30 
 
ovocitos presentes en el ovario, reduciendo así el tiempo de selección de los 
ovocitos morfológicamente normales. 
Para la aspiración del complejo cumulus-ovocito (CCO) se utilizó una jeringa 
hipodérmica de 5 ml con una aguja de 18G X 38mm conteniendo 1-2 ml de medio 
de manipulación (TCM-199 - 25mM de HEPES). 
Después se llevó a cabo la disección de los ovarios, utilizando una hoja de 
bisturí se realizaron cortes transversales y longitudinales en la superficie de los 
ovarios; las incisiones fueron lavadas con medio de manipulación a 23-25 ºC, 
empleando una jeringa hipodérmica de 10 ml y una aguja del número 16. 
El líquido colectado del lavado, así como el obtenido de la aspiración se 
colocó en cajas de Petri, identificadas cada una de acuerdo a la técnica de 
colección empleada. Los ovocitos se localizaron con la ayuda de un microscopio 
estereoscópico y al mismo tiempo se realizó la clasificación y cuantificación de los 
mismos. La clasificación de los ovocitos fue de acuerdo a: el número de capas de 
células de la granulosa, coloración uniforme del citoplasma, integridad de la zona 
pelúcida, siguiendo la clasificación de De Loss (1989). 
Los ovocitos fueron separados y depositados en una caja de Petri conteniendo 
medio de manipulación a 25º C. Los ovocitos seleccionados fueron lavados 5 
veces por goteo con medio de manipulación, para con ello eliminar el detritus 
celular. 
Como ovocitos inmaduros fueron tomados aquellos clasificados con calidad 1 
y 2 pero que no contaban con un número mayor a 10 capas de las células del 
cumulus. Para retirarles las células del cumulus, los ovocitos fueron colocados en 
TCM-199, 0.1% (v/v) de hialuronidasa (Sigma) y suplementados con 4 mg/ml de 
ASB (fracción V) y sometidos al vortex por 4 min (Stojkovic et al., 2001). Una vez 
desnudos (sin células del cumulus) fueron congelados a -20º C en amortiguador 
de lisis isotónico (1% (v/v) NP-40, 20mM Tris-HCl pH 7.5, 137 mM NaCl, 1mM 
EDTA, 2mM Na3VO4, coctel inhibidor de proteasas 1x/ml Complete®-Roche 
Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany y 10 mM NaF) hasta su utilización 
para obtener el extracto citoplasmático. 
 
31 
 
 
5.3.2 ESTANDARIZACIÓN DE LA MADURACIÓN in vitro DE 
LOS OVOCITOS 
Previo a ser empleado el medio para la maduración de los ovocitos, el medio 
TCM-199 (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), fue estabilizado 24 horas a 38.5º 
C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa, previamente adicionado con 10% 
(v/v) de suero fetal bovino (SFB Invitrogen, Carlsbad, CA). 
Para la maduración se utilizaron aquellos ovocitos que fueron clasificados 
como tipo I y II, y se incubaron a razón de 50 a 100 ovocitos/500µl de medio TCM-
199 estandarizado. Una vez depositados los ovocitos en las gotas estas fueron 
cubiertas completamente con aceite mineral (Sigma). 
Para la estandarización del protocolo para la MIV de los ovocitos de bovinos 
se ensayaron cuatro protocolos y dependiendo del resultado obtenido en ellos 
fueron las repeticiones realizadas. La decisión anterior se tomó considerando que 
los ovarios recolectados provenían en su mayoría de hembras sacrificadas con 
una condición corporal (cc) baja de 1 a 2, según escala de cc de 1 a 5 propuesta 
por Lowman et al., (1976) y Van Niekerk y Louw (1980), por lo que la generalidad 
de los ovarios obtenidos presentaba escasa actividad folicular. 
El primer protocolo fue con modificaciones del empleado por Hernández 
(1997) quien utilizó: TCM-199, 20% (v/v) de SFB, 50µl de LH, 50µl de FSH y 0.1% 
de penicilina-estreptomicina adicionándole células de la granulosa como co-
cultivo. En este estudio se sustituyeron las gonadotropinas FSH y LH por eCG 
(Folligon®, Intervet, Holanda) y hCG (Chorulon®, Intervet, Holanda), 
respectivamente, y en lugar de penicilina-estreptomicina se utilizó gentamicina. De 
acuerdo a estos cambios el medio de cultivo fue el siguiente: TCM-199, 20% (v/v) 
SFB, hCG 5 UI/ml, eCG 5UI/ml y gentamicina 10mg/ml (Cuadro 1). 
El segundo protocolo consistió en la combinación de varios protocolos 
reportados en la literatura, llevando a cabo ajustes en las concentraciones de 
gonadotropinas, gentamicina y SFB utilizado, además de que ya se contaba en el 
 
32 
 
laboratorio con FSH (Sigma). Por lo que el medio de cultivo que constituido de la 
siguiente manera: TCM-199, 10% (v/v) SFB, hCG 1 UI/ml, FSH 10 µg/ml y 
gentamicina 50 µg/ml (Cuadro 1). 
En el tercer protocolo se optó por cambiar la concentración de 1 UI/ml de hCG 
por hCG 0.1 UI/ml (Stojkovic et al., 2001; Thomas et al., 2004) además el medio 
fue adicionado con 0.2mM de piruvato de sodio de acuerdo a lo reportado por 
Dominko et al., (1999). El medio de cultivo quedo constituido por: TCM-199, 10% 
(v/v) SFB, hCG 0.1 UI/ml, FSH 10 µg/ml, piruvato de sodio 0.2 mM y gentamicina 
50 µg/ml (Cuadro 1). 
En el cuarto protocolo se realizó la combinación de hCG con eCG o FSH; la 
concentración de eCG fue de 0.1 UI/ml y de 0.5 µg/ml para la FSH (Khurana, 
2000; Sagirkaya et al., 2007; Pires et al., 2009; Quetglas et al., 2010) quedando 
constituidos de la siguiente manera: medio a) TCM-199, 10% (v/v) SFB, hCG 0.1 
UI/ml, eCG 0.1UI/ml, piruvato de sodio 0.2 mM y gentamicina 50 µg/ml. medio b) 
TCM-199, 10% (v/v) SFB, hCG 0.1 UI/ml, FSH 0.5 µg/ml, piruvato de sodio 0.2 mM 
y gentamicina 50 µg/ml (Cuadro 1). 
El protocolo 5 estaba constituido por el medio b) del protocolo 4, a partir de 
este se realizaron las repeticiones. El medio contenía TCM-199, 10% (v/v), 0.1 
UI/ml de hCG, 0.5 μg/ml de FSH, 0.2 mM de piruvato de sodio y 50 μg/ml de 
gentamicina (Cuadro 1). 
En todos, los ovocitos fueron incubados durante 24 hrs a una temperatura de 
38.5º C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. 
Después de las 24 hrs de maduración se seleccionaron aquellos ovocitos que 
presentaran expansión de las células del cumulus o la presencia del primer cuerpo 
polar. Si bien el grado de expansión de las células del cumulus puede ser usado 
como un indicador morfológico de la maduración del ovocito, es discutible si esto 
está directamente relacionada con la capacidad de desarrollo y maduración del 
ovocito (Ali y Sirard, 2002 y Luciano et al., 2002), razón por la cual en este trabajo 
se decidió corroborar el estado de maduración de algunos ovocitos mediante la 
 
33 
 
tinción de Hoechst 33342, para observar los cromosomas en metafase II y la 
presencia del primer cuerpo polar. 
Para observar el primer cuerpo polar se retiraron las células del cumulus, del 
mismo modo que con los ovocitos inmaduros 
 
 
Cuadro 1 Constitución del medio de maduración in vitro de cada 
protocolo realizado. 
 
 
 
34 
 
5.3.3 TINCIÓN DE HOECHST 
Para la realización de esta tinción los ovocitos se lavaron 3 veces con DPBS-
ASB. Posteriormente se fijaron con 4% formaldehído en DPBS por 15 min a 
temperatura ambiente, se lavaron los ovocitos 3 veces con DPBS-ASB por 5 min. 
El paso siguiente fue permeabilizara los ovocitos con 0.2% Triton X-100 y 0.1% 
Tween-20 en DPBS por 40 min a temperatura ambiente, se lavaron nuevamente 3 
veces con Tween-20 al 0.05% en DPBS. Los ovocitos fueron teñidos con 0.5 μg/ml 
de Hoechst 33342 (Edwards et al., 2005) por 10 min en obscuridad a temperatura 
ambiente, se lavaron 3 veces con Tween-20 al 0.05% en DPBS y por último se 
montaron en laminillas con glicerol-PBS (a una relación 9:1) se colocó un cubre 
objetos y fueron selladas con esmalte de uñas, las laminillas fueron refrigeradas 
en una caja negra, para su posterior observación en microscopio de fluorescencia. 
 
5.4 IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR PARA 
GLUCOCORTICOIDES EN OVOCITOS DE BOVINO POR MEDIO 
DE WESTERN BLOT 
 
Una vez estandarizada la maduración, a los ovocitos maduros seleccionados 
se les retiró las células del cumulus (ver ovocitos inmaduros), ya desnudos se 
procedió a congelarlos a -20° C en amortiguador de lisis isotónico, hasta la 
extracción citoplasmática. 
Para llevar a cabo la extracción citoplasmática, los ovocitos tanto maduros 
como inmaduros, fueron decantados por separado en un solo tubo. Los ovocitos 
fueron centrifugados a 300 rpm, después la pastilla fue resuspendida en 100 μl de 
buffer de lisis (25 mM Tris-H3PO4 ph 7.8, 10 mM de CDTA, 2 mM de DTT, 10% 
glicerol y 1% Triton X-100) y se incubaron por 20 minutos en agitación suave a 
4°C. 
 
35 
 
Posteriormente los ovocitos fueron sonicados en baño maría en ciclos de 2 
minutos y de 1 minuto en hielo, esto se realizó 3 veces. Después de sonicados los 
ovocitos fueron centrifugados a 12,000 rpm por 5 minutos. 
El sobrenadante fue recuperado y una alícuota de 5 µl fue tomada para 
realizar la cuantificación de proteínas totales por el método de Bradford, el resto 
del sobrenadante fue hervido con amortiguador de muestra durante 5 minutos en 
agua en ebullición lenta. 
Para la identificación del receptor de GC por WB se realizaron 3 repeticiones, 
para cada repetición se utilizó el extracto citoplasmático de 158 ovocitos 
inmaduros y 156 maduros. 
Los extractos citoplasmáticos fueron sometidos a SDS-PAGE al 10%. Como 
control positivo se utilizó el lisado total de neuronas hipotalámicas de rata 
estimuladas con dexametasona (Cote et al., 2005 y 2011) y como control negativo 
el suero fetal bovino. 
Las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF (Polyvinylidene 
Fluoride) durante 2 hrs a 250 mAmp. La membrana se bloqueó por 1 hora a 
temperatura ambiente con leche descremada al 5% en TBS-Tween 20 al 0.1% y 
0.5% de ASB. 
Posteriormente la membrana fue incubada toda la noche a 4 °C con el primer 
anticuerpo anti GR (Santa Cruz Biotechnology, la Joya, Cal. sc-8992) a una 
dilución de 1:500 en TBS suplementado con 0.1% Tween 20. La membrana fue 
lavada 3 veces en solución TBS-Tween 0.1% por 7 minutos y 2 veces más por 5 
min sólo con TBS. Posteriormente fue incubada por 1 hora con el segundo 
anticuerpo (Sigma, cabra anti conejo, peroxidado) a una dilución de 1:8000 en 
TBS-Tween 0.1% esto a temperatura ambiente y en una superficie plana en 
movimiento suave. Se lavaron nuevamente 5 veces en TBS-Tween 0.1% por 7 
minutos y 3 veces más solo con TBS por 5 minutos. La señal fue detectada por 
quimioluminiscencia. 
 
 
36 
 
5.4.1 Procedimiento para realizar la cuantificación de proteína 
por él método de Bradford 
Este procedimiento se realizó con el fin de conocer la cantidad de proteína del 
extracto citoplasmático obtenido, correspondiente a los 156 y 158 ovocitos 
inmaduros y maduros respectivamente, por lo que únicamente se realizó una vez. 
Esto con la finalidad de colocar igual cantidad de proteína por muestra en la SDS-
PAGE, como referencia para observar si existe una diferencia en el patrón de 
banda de las proteínas y que esta no se relacione con la cantidad de proteína de 
la muestra. Los resultados que se obtuvieron de la cuantificación de proteínas 
totales fueron para los ovocitos inmaduros fue de 61.30 µg/95 µl y para los 
ovocitos maduros de 66.83 µg/95 µl (Cuadro 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para realizar el método de Bradford se necesitan los siguientes reactivos: 
Solución de ASB en agua bidestilada con una concentración de 0.2 mg/ml, 
reactivo de Bradford y agua bidestilada. 
El procedimiento para realizarlo es el siguiente: 
Primero se realizó una curva estándar, para lo cual se obtuvieron 10 lecturas 
(por duplicado) de la ASB con las siguientes concentraciones: 0 (Blanco), 1, 2, 4, 
6, 8 10, 12 y 14 (µg) de proteína. Para obtener dichas concentraciones a tubos 
Cuadro 2 Resultados de la Cuantificación de proteínas por el método
de Bradford en los lisados de ovocitos bovinos desnudos inmaduros y
maduros. 
 
37 
 
Eppendorf identificados se les agregó diferente volumen de agua de acuerdo a lo 
indicado en el Cuadro 3. Posteriormente se les adicionó diferentes volúmenes de 
la solución de ASB (2mg/ml) para tener en cada tubo un volumen final de 800 µl 
(Cuadro 3) y finalmente se añadieron 200 µl del reactivo de Bradford a cada tubo, 
teniendo un volumen final en cada tubo de 1000 µl. Se mezclaron con vortex, y se 
dejaron reaccionando 5 minutos antes de leerlo en el espectrofotómetro a una 
longitud de onda de 595 nm, las muestras deben leerse antes de los 30 minutos, 
después de mezclar, para evitar la formación de precipitados. 
Para la cuantificación de proteínas de las muestras, 5 µl del lisado ovocitos 
inmaduros y maduros, se diluyeron en 45 µl de agua, se mezclaron con vortex, 22 
µl fueron tomados, colocados en los tubos Eppendorf identificados, adicionados 
con 780 µl de agua bidestilada y 200 µl el reactivo de Bradford (Cuadro 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuadro 3 Realización de la curva estándar para la cuantificación de
proteínas por el método de Bradford. 
 
38 
 
6 RESULTADOS 
6.1 MADURACION in vitro 
 
Para la primera parte del estudio que consistió en la estandarización de la 
técnica de maduración in vitro (MIV) de ovocitos bovinos, en el primer protocolo 
encontramos que la expansión de las células del cumulus fue del 20-30% (Cuadro 
4) (Fig. 9). 
 
 
 
Fig. 9 Ovocitos de bovino después de 24 hrs de maduración in vitro donde 
se puede observar que presentan pobre expansión de las células del cumulus. 
 
 
Los resultados del segundo protocolo, que consistió en la sustitución de LH (1 
UI/ml) del protocolo de Vozzi et al., (2001) por hCG 1 UI/ml, FSH 10 µg/ml (Marei 
et al., 2010), 50 µg/ml de gentamicina (Krischek y Meinecke, 2002; Roth y Hansen, 
2004) y 10% de SFB (Park et al., 2005; Bettegowda et al.,2008), mostraron que la 
expansión de las células del cumulus fue del 30% (Cuadro 4). 
 
39 
 
En el tercer protocolo los resultados mostraron sólo 28.57% de expansión de 
las células del cumulus. (Cuadro 4) 
En el cuarto protocolo donde se realizó la combinación de hCG con eCG o 
FSH, los resultados mostraron una mayor expansión de las células del cumulus 
(60-70%) en aquellos ovocitos a los cuales se le adicionó 0.5µg/ml de FSH, 
mientras que los ovocitos con 0.1 UI/ml de eCG presentaron el 40% de expansión 
(Cuadro 4). 
La utilización del medio de maduración constituido por TCM-199, 10% (v/v) 
SFB, hCG 0.1 UI/ml, FSH 0.5 μg/ml, piruvato de sodio 0.2 mM y gentamicina 50 
μg/ml, fueron los resultados que mostraron el mayor porcentaje de expansión de 
las células del cumulus (88%) (Cuadro 5) (fig. 10); de los ovocitos que 
expandieron (139) la tinción de Hoechst 33342 confirmo la maduración de 107 
(72.7%) donde se pudo observar las células en metafase II (fig. 11). 
 
 
 
 
 
Cuadro 4. Expansión de las células del cumulus con los protocolos de
maduración empleados para la estandarización de la maduración in vitro de
los ovocitos bovino. 
 
40 
 
Fig. 10 a) Ovocitos de bovino madurados in vitro con el protocolo 5 donde se
muestra la expansión de las células del cumulus. b) Mayor aumento de los ovocitos
(200X).