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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN “SALVADOR ZUBIRÁN” PTP1B COMO FACTOR PREDICTIVO DE RESPUESTA A PACLITAXEL Y DOCETAXEL EN CULTIVOS PRIMARIOS DE CÁNCER DE MAMA TESIS DE POSGRADO PARA OBTENER EL TÍTULO DE ESPECIALISTA EN ONCOLOGÍA MÉDICA PRESENTA: DR. JULIO CÉSAR GARIBAY DÍAZ TUTOR: DRA. MARÍA DE JESÚS IBARRA SÁNCHEZ CO-TUTORES DE TESIS: DR. JOSÉ ESPARZA LÓPEZ DR. EUCARIO LEÓN RODRÍGUEZ México, D.F. Septiembre 2014 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Escudo-UNAM-escalable.svg UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 AUTORIZACiÓN DE TESIS ~ DRA. MARíA DE JESÚS IBARRASÁNCHEZ Investigadora en Ciencias Medicas Tutora de TesIs _ .... . ~;I' , J ". . , , J - . . . lNCMNSZ W.'1ITUT'O ~J"G10NAl ot úlNCI~S MEDICAS VIllJlRIClÓU - OH. ·SAlVf..DOF, ZU8\~AW ".oerrlóN DE ENSENP-NZA ;..'10,_,-",-' "'.' nt= Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrrclón "Salvador Zubirán" cJJ~~/// OR. EUGARIO LEÓN R~RíGUEZ Profesor Titular del Curso de Especialización en Oncologia Médica Ca-Tutor de TesIs Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zublrán" ---~~ OR. JOSÉ ESPARZA LÓPEZ Investigador en Ciencias Medicas Ca-Tutor de Tesis Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zublrán" DR. SERGIO PO CE DE LEÓN ROSALES Director de Enseñanza Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán" 3 DEDICATORIA. A mis padres, por su paciente y sabio ejemplo que guió mi sed de aprender y me enseñó que el conocimiento es responsabilidad y compromiso. Porque al compartirme con la medicina antepusieron mis sueños a los propios. Para Ana Miriam y Óscar Rodrigo, hermanos que son mi orgullo y mis amigos incondicionales. Anita, mi sobrina consentida, por recordarme el gusto de vivir, crecer y anhelar. A Zulma, por apoyarme y compartir mi aventura más grande, la Oncología. Por tus amorosos consejos y tiernos alientos para concretar este proyecto. A mis maestros, por forjar mis herramientas para construir mis sueños. Al Dr. Eucario León, por desarrollar mi lado crítico para la ciencia y la vida. A la Dra. María de Jesús Ibarra y al Dr. José Esparza, por mostrarme la investigación como una memorable experiencia, por recordarme el valor de la docencia, y el gusto por la ciencia. 4 AGRADECIMIENTOS. Gracias a Dios por mostrarme el camino en el que puedo servir a mis hermanos y por sostenerme en mis momentos de flaqueza. Gracias a Martika y Donato, por ser mi ejemplo de vida y enseñarme a creer en mí. Gracias a Ana Miriam, Óscar y Ana Changuito, por ser mi apoyo y mi alegría por vivir. Gracias a Zulmita, por ser mi incansable compañera y dulce inspiración. Gracias amigos, Raúl y Citlali, por adoptarme en su familia; Fausto y Osvaldo, por enseñarme el modo en que la amistad verdadera puede ser tan fuerte como los genes, porque su guía en la Medicina y la Oncología hizo la diferencia. A Mary y Pepe, grandes y honestos maestros, entrañables amigos, por la confianza que depositaron en mí, por tolerar mis desvaríos y encausar mis ideas durante el desarrollo de este proyecto. A la Universidad de Guadalajara, UNAM y el INCMNSZ, las instituciones educativas a quienes debo y agradezco la formación brindada durante este camino. Gracias a Roberto De la Peña y a Elizabeth Escobar, por la calidez y calidad en la enseñanza de la Oncología. A mis pacientes, por ser mis mejores maestros, el motor cotidiano para ser médico, por ser ejemplo de vida, paciencia y perseverancia. Y finalmente, gracias a quienes desconfiaron y aseveraron que era imposible, por darme un motivo más para crecer. 5 Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica de Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”. Se contó con el apoyo económico del proyecto del CONACYT 102825. 6 ÍNDICE 1.- INTRODUCCIÓN Pág. 7 1.1 Epidemiología Pág. 7 1.2 Factores pronósticos del cáncer de mama Pág. 7 1.3 Microtúbulos y Taxanos Pág. 8 1.4 Fosforilación de Residuos de Tirosina Pág. 12 1.5 PTP1B Pág. 13 2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Pág. 16 3.- JUSTIFICACIÓN Pág. 16 4.- HIPÓTESIS Pág. 17 5.- OBJETIVOS Pág. 17 5.1 Objetivo General Pág. 17 5.2 Objetivos específicos Pág. 17 6.- MATERIAL Y MÉTODOS Pág. 18 6.1 Cultivo de células de cáncer de glándula mamaria Pág. 18 6.2 Ensayos de citotoxicidad Pág. 18 6.3 Ensayo de Western Blot Pág. 19 7.- RESULTADOS Pág. 21 7.1 Expresión de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama Pág. 21 7.2 La expresión endógena de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama induce resistencia a paclitaxel Pág. 21 7.3 Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la resistencia a paclitaxel Pág. 23 7.4 La expresión endógena de PTP1B induce mayor susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama Pág. 24 7.5 Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama Pág. 25 8.- DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Pág. 27 9.- BIBLIOGRAFÍA Pág. 33 7 1.- INTRODUCCIÓN. 1.1 Epidemiología El cáncer constituye un problema de salud pública a nivel mundial, la OMS en 2008 estimó una incidencia de más de 12 millones, y 7.5 millones de muertes por esta causa. A nivel mundial, el cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en mujeres con 22.9 % de casos nuevos (13.8 millones), y también la primera causa de muerte por cáncer en población femenina con 13.7 % de los decesos (458,000) [1]. Durante el 2009 en EUA el 29 % de los casos de cáncer correspondió a cáncer de mama y se ubicó como el segundo con mayor mortalidad (14 %), superado sólo por el cáncer de pulmón. La tasa de incidencia de los cuatro principales tipos de cáncer se encuentra en decremento, excepto para cáncer de mama que se muestra estable desde 2005 [2]. En mujeres mexicanas es el primer lugar en incidencia (21 % de los casos) y mortalidad por cáncer (10 %) [1]. El cáncer de mama en México tiene una distribución geográfica, su incidencia predomina en las regiones con mayor desarrollo económico y social [3]. 1.2 Factores Pronósticos del Cáncer de Mama. El tamaño tumoral y la existencia de metástasis axilares ganglionares son considerados los principales factores con valor pronóstico. El análisis de un extenso número de casos ha determinado que la sola presencia de ganglios axilares positivos disminuye la supervivencia global en 40 % a cinco años (de 94 hasta 54 %). El estudio histopatológico del tumor aporta parámetros pronósticos como son el grado de diferenciación y su clasificación morfológica; de acuerdo a la clasificación histopatológica del cáncer de mama el subtipo clínico más agresivo es el ductalinfiltrante y se diferencia de otros menos agresivos como el medular, mucinoso y papilar 8 [4]. La expresión de receptores de estrógeno y progesterona son marcadores con un valor pronóstico, su presencia incrementa la supervivencia libre de enfermedad en 8 a 10 % de valor absoluto, y también tienen un valor predictivo porque en base a su expresión resulta factible escoger terapias hormonales como tratamientos únicos o concomitantes [5]. Otro marcador relevante es la expresión del receptor Her2, que es considerado un factor de mal pronóstico [6]. La identificación de este receptor permite seleccionar a las pacientes que se benefician de tratamiento con terapia blanco, por ejemplo, trastuzumab, pertuzumab o lapatinib [7-10]. Se han descrito otros marcadores pronósticos, como p53 y la densidad microvascular tumoral; sin embargo, su validación y uso clínico han sido limitados por costos, practicidad y poca reproducibilidad [11, 12]. 1.3 Microtúbulos y Taxanos. Los fármacos antineoplásicos son diversos en su origen y mecanismo de acción, existen agentes alquilantes como la ciclofosfamida y los derivados del platino, los antimetabolitos como 5-fluorouracilo, pemetrexed y gemcitabina, y los que tienen como blanco componentes del citoesqueleto, como son los taxanos, que son fármacos que actúan sobre los microtúbulos. Los microtúbulos son proteínas que participan en procesos biológicos como la proliferación, la adhesión y la motilidad celular, así como el transporte interno de organelos, vesículas y proteínas, todo esto mediante eventos de polimerización y despolimerización de las subunidades de tubulina [13, 14]; estos eventos son conocidos como inestabilidad dinámica. Los microtúbulos son estabilizados mediante su asociación con las proteínas asociadas a microtúbulos (MAP, del inglés microtubule-associated proteins) en su estado desfosforilado [15]. Existen fármacos que actúan sobre la dinámica de los microtúbulos como colchicina, utilizada para tratar 9 pacientes con gota [16]. Otros fármacos que interfieren con la dinámica de los microtúbulos son los alcaloides de la vinca, que se han usado para el tratamiento de diversas neoplasias, en particular el cáncer de mama, su acción sobre los microtúbulos es inhibir la polimerización de la tubulina confiriéndoles actividad antimitótica. Por otra parte, los taxanos se unen a la tubulina polimerizada y la mantienen estabilizada, evitando la despolimerización de sus subunidades, provocando arresto celular en la fase G2/M (Figura 1) [13]. Otro mecanismo por el cual estos fármacos inducen muerte celular es mediante la sobreexpresión de Bcl-2, la cual en presencia de paclitaxel se asoció a un incremento en la expresión de la proteína proapoptótica Bim y a una mayor apotosis por la vía mitocondrial [17]. El paclitaxel es el prototipo de los taxanos, se une a la subunidad de la tubulina en los aminoácidos 1-31, 217-233 y Arg-282 [15, 18-21]. Mientras que el docetaxel es un taxano semisintético de segunda generación y comparte con el paclitaxel los sitios de unión a la -tubulina. El docetaxel, a diferencia del paclitaxel, tiene mayor afinidad por los aminoácidos 217-233 que por los aminoácidos 1-31. Ambos, paclitaxel y docetaxel, están formados por un anillo taxano unido a un éster en la posición C-13; las fracciones en las posiciones C-2′ y C-3′ sobre la cadena lateral en C-13 son esenciales para su actividad antimicrotúbulo. En C-10 y en C-2′ se observan las principales diferencias estructurales entre paclitaxel y docetaxel (Figura 2). La afinidad del docetaxel por el sitio de unión a la tubulina es 1.9 veces mayor que la del paclitaxel; además, induce polímerización a una concentración de tubulina 2.1 veces menor que la requerida por el paclitaxel y tiene mayor efecto citotóxico [15]. También han sido descritas diferencias farmacocinéticas y farmacogenómicas entre paclitaxel y docetaxel (Figura 3) [22, 23]. El mecanismo de 10 resistencia a los agentes de quimioterapia más estudiado es la expresión de la bomba de expulsión multidrogas Pgp, codificada por el gen mdr1, pero su papel en la resistencia a taxanos parece ser secundario. Por otra parte, la expresión de y tubulinas con una capacidad disminuida para polimerizarse ha sido identificada como un mecanismo de resistencia a los agentes que estabilizan microtúbulos [15]. Otros mecanismos menos estudiados involucran formas mutantes de tubulina, proteínas asociadas a microtúbulos y expresiones alteradas de p53, Bcl-2 y Bcl-x [13, 14, 16]. En las últimas décadas, los taxanos son ampliamente utilizados en el tratamiento del cáncer de mama localizado y avanzado, incrementando la supervivencia global y supervivencia libre de recurrencia en aproximadamente 5 % de beneficio absoluto [14, 24]. El efecto clínico de ambos taxanos en cáncer de mama es similar, con una tasa de respuesta cercana al 60 % [13, 14, 16]. Figura 1.- Representación esquemática del mecanismo de acción de los taxanos. Los taxanos (T) se unen a la -tubulina polimerizada () y estabilizan sus subunidades ( yademás promueven la polimerización y elongación del microtúbulo. Esta elongación de microtúbulos conduce al bloqueo celular en G2/M y finalmente a la apoptosis. 11 Figura 2.- En A se muestra la estructura molecular de paclitaxel y circuladas se señalan las diferencias con docetaxel; la cadena lateral unida a la posición C-13 del anillo taxano es esencial para la actividad estabilizadora de microtúbulos, es en ésta cadena lateral en la que se observa una de las diferencias más importantes con docetaxel. En B se muestra la estructura molecular de docetaxel y sus diferencias con paclitaxel como en A. Tomado de Rowinsky, Annu. Rev. Med. 1997. 48:353–74 [15]. Figura 3.- Representación esquemática de las diferencias farmacogenómicas entre paclitaxel y docetaxel. Se observa la participación del citocromo CYP2C8 en el metabolismo del paclitaxel, mientras que en el metabolismo de docetaxel se encuentra la isoforma CYP3A4. Esquema tomado de Oshiro Connie, et. al.."Taxane Pathway" Pharmacogenetics and genomics (2009)[22]. 12 1.4 Fosforilación de Residuos de Tirosina. En el tratamiento farmacológico del cáncer de mama además de los fármacos citotóxicos se han propuesto medicamentos que tienen como blanco algunas vías de señalización dependientes de la fosforilación en residuos de tirosina [6]. La fosforilación de proteínas en residuos de tirosina es una de las modificaciones postraduccionales más usada por las células para regular respuestas biológicas como proliferación, diferenciación, migración y muerte celular. El nivel de fosforilación en residuos de tirosina en una célula depende de la acción equilibrada de dos tipos de enzimas, las proteínas tirosinas cinasas (PTK, del inglés protein tyrosine kinase) y las proteínas fosfatasas de tirosina (PTP, del inglés protein tyrosine phosphatase) (Figura 4). Las primeras se encargan de agregar grupos fosfato a residuos de tirosina específicos en la proteína sustrato, promoviendo cambios conformacionales que modifican la interacción con otras proteínas [25]. Las PTPs son una familia estructuralmente diversa, altamente regulada y que puede tener tanto efectos estimulatorios como inhibitorios [26]. En el genoma humano se han identificado un total de 107 PTPs las cuales están divididas en cuatro clases: clase I integrada por fosfatasas clásicas y duales, la clase II que son fosfatasas de bajo peso molecular, clase III CDC25 y la clase IV Eya 1-4; las fosfatasas clásicas se dividen en intracelulares y transmembranales, PTP1B pertenece a las fosfatasas intracelulares [27, 28]. El dominio catalítico de las PTPs tiene 280 aminoácidos, que contiene una secuencia consenso conservada (VHCSAGXGR[T/S]G), que incluye el residuo de cisteína conservado necesario para la actividad catalítica[28]. Las PTPs remueven los residuos fosfato mediante un mecanismo de 2 pasos: primero, la formación de un enlace covalente de fosfato-PTP; y segundo, la hidrólisis de la unión 13 fosfato - proteína sustrato [26]. Inicialmente, se pensó que las PTPs tenían un papel como supresores tumorales ligado a la regulación negativa de la actividad oncogénica de las PTKs. La alteración en el balance de estas enzimas provoca niveles de fosforilación aberrantes asociados a diferentes enfermedades, entre ellas cáncer [26]. Figura 4.- Fosforilación de proteínas en residuos de tirosina. Representación esquemática de la acción de las Proteínas Cinasas de Tirosina (PTKs) y las Proteínas Fosfatasas de Tirosina (PTPs). Mientras las PTKs agregan grupos fosfato (P) a los residuos de tirosina, las PTPs remueven los grupos fosfato. Estas acciones de PTPs y PTKs promueven cambios conformacionales en la proteína sustrato. 1.5 PTP1B PTP1B (PTPN1) y TC-PTP (PTPN2) fueron las primeras PTPs en ser identificadas [29]. PTP1B pesa 50kD y está formada por un dominio catalítico de 37kD hacia su extremo N-terminal flanqueado por dominios ricos en prolina, y un dominio C-terminal con una secuencia de localización al retículo endoplásmico (RE) (Figura 5) [30]. La especificidad de PTP1B se encuentra regulada estrechamente por su acceso a los sustratos, lo cual está en relación a la localización [31]. Existen otros cuatro mecanismos que regulan la actividad de PTP1B, oxidación, fosforilación, sumoilación y proteólisis [32]. Estudios previos han demostrado que PTP1B juega un papel importante en la señalización de vías metabólicas ya que participa en la regulación negativa de la señalización de los 14 receptores de insulina y leptina, lo que sugiere se encuentra involucrado en patologías como diabetes mellitus y obesidad. Actualmente, se le considera como un potencial blanco terapéutico de estas enfermedades [33-35]. PTP1B también puede inhibir la señalización de receptores con actividad de tirosina cinasa (RTK) como los receptores del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) y del Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) [36]. Su sobreexpresión en fibroblastos inhibe la transformación por oncogenes en los que se incluyen Her2, Src, Bcr-Acl, Crk y Ras [37, 38]. PTP1B también es requerida para la activación de las GTPasas de Rac y Ras (enzimas asociadas con incremento de proliferación y motilidad celular) [38], también puede activar a Src mediante desfosforilación de la tirosina 527 (Y527) [39]. El gen que codifica a PTP1B se encuentra localizado en el cromosoma 20 en la región q13.1-q13.2 [40]; se ha demostrado que la ganancia o amplificación de esta región se asocia a un pobre pronóstico en cáncer de mama [41]. Estudios realizados en modelos murinos que sobreexpresan Her2 demostraron que la deleción de PTP1B retrasa el desarrollo de tumores mamarios y disminuye la posibilidad de desarrollar metástasis pulmonares [42, 43]. Recientemente, se analizó la expresión de PTP1B en 1,402 muestras de pacientes con cáncer de mama, y se encontró que el 49 % de las muestras estudiadas fueron positivas para PTP1B. Se reportó una asociación positiva de la expresión de PTP1B y la expresión de Receptores de Estrógeno (RE) (50.7 % vs 43.1 %); así como, la asociación con los subtipos moleculares: Luminal B con expresión Her2 (53.9 %) y basaloide (37.9 %). El análisis no encontró asociación estadísticamente significativa con la expresión de Her2. Interesantemente, la expresión de PTP1B se asoció a una mejor supervivencia global de las pacientes de manera independiente (HR 0.779) [44]. Por otra parte, en estudios previos de nuestro laboratorio se encontró que la sobreexpresión 15 de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama induce un incremento en la expresión de Her2 de manera independiente de la transcripción del gen her2/neu [45]. También se demostró que la sobreexpresión de la fosfatasa induce un fenotipo celular más agresivo con incremento en proliferación y migración celular [45]. Todos estos antecedentes sugieren que PTP1B participa en la oncogénesis del cáncer de mama. Sin embargo, desconocemos si la expresión de PTP1B afecta la sensibilidad a fármacos de quimioterapia en células de cáncer de mama. Figura 5.- PTP1B tiene un dominio catalítico flanqueado por dominios ricos en prolina, también tiene un dominio C-terminal con una secuencia de localización al retículo endoplásmico (RE); ésta localización en el RE regula su acceso a los sustratos. PTP1B es regulado por procesos como fosforilación, oxidación, sumoilación y proteólisis [30]. 16 2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. PTP1B se encuentra expresado en el 49 % de las muestras de cáncer de mama, lo que sugiere un papel importante de esta fosfatasa en esta patología. Estudios recientes en nuestro laboratorio han establecido una regulación positiva de PTP1B sobre los niveles de expresión de Her2 en cultivos primarios de cáncer de mama, lo que les confiere un fenotipo más agresivo. Sin embargo, se desconoce si PTP1B puede modular la respuesta de las células de cáncer de mama a fármacos de quimioterapia, como los taxanos paclitaxel y docetaxel. Esto permitiría definir si PTP1B puede ser considerado un factor pronóstico y predictivo de respuesta a los taxanos en las pacientes con cáncer de mama. 3.- JUSTIFICACIÓN El cáncer de mama es la neoplasia maligna más frecuente en el sexo femenino, y el primer lugar de mortalidad por cáncer en este género. Los taxanos paclitaxel y docetaxel son utilizados ampliamente en el tratamiento farmacológico del cáncer de mama, pero hasta el momento, no se conoce algún factor predictivo de la respuesta a estos fármacos. Los taxanos ejercen su mecanismo de acción sobre los microtúbulos en el citoplasma de la célula y PTP1B se encuentra anclada al retículo endoplásmico, en el mismo entorno celular que los taxanos. En reportes previos se ha demostrado una regulación positiva de PTP1B sobre Her2 en cultivos primarios de cáncer de mama, lo cual les confiere un fenotipo tumoral con mayor capacidad de proliferación y migración. Sin embargo, no se conoce si la modulación en la expresión de PTP1B tiene un efecto en la susceptibilidad a fármacos como el paclitaxel y el docetaxel. 17 4.- HIPÓTESIS. Si la expresión de PTP1B confiere un fenotipo más agresivo a las células de cáncer de mama; entonces la sobreexpresión o silenciamiento de PTP1B afectará la susceptibilidad a paclitaxel o docetaxel. 5.- OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Evaluar el efecto de la expresión de PTP1B sobre la susceptibilidad a paclitaxel y docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. 5.2 Objetivos específicos A) Evaluar el efecto de la expresión endógena de PTP1B sobre la susceptibilidad a paclitaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. B) Evaluar el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B sobre la susceptibilidad a paclitaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. C) Evaluar el efecto de la expresión endógena de PTP1B sobre la susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. D) Evaluar el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B sobre la susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. 18 6.- MATERIAL Y MÉTODOS. 6.1 Cultivo de células de cáncer de glándula mamaria. Los cultivos celulares MBCD3, MBCD5, MBCD5-B3, positivos para PTP1B, y MBCD17, MBCDF y MBCD25, negativos para PTP1B, fueron generados previamente en el laboratorio a partir de explantes obtenidos de tejidos de pacientes tratados con mastectomía radical (Protocolo aprobado por el comité de ética del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, referencia 159). Las células MBCD3-sh control y MBCD3-sh1B fueron establecidas previamente mediante la transfección de losplásmidos pGFP-V-RS control o pGFP-V-RS conteniendo 4 diferentes secuencias de shRNAs para PTP1B, estos cultivos fueron mantenidos en presencia de puromicina [5 g/ml] (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Las células MBCDF-EV y MBCDF-1B WT también ya habían sido establecidas en el laboratorio mediante la transfección de los plásmidos de pcDNA4 y pcDNA4 myc-PTP1B WT, los cutivos se mantuvieron en presencia de zeocina [50 g/ml] (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA). Los cultivos son mantenidos en RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) (HyClone, Thermo, Utah, USA) al 10 % e incubadas a 37oC con atmósfera de 5 % CO2. 6.2 Ensayos de Citotoxicidad. Las células fueron sembradas a una densidad de 10,000 células/cm2 en placas de 48 pozos (Corning, NY, USA), en medio de cultivo RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) suplementado con SFB al 10 % (HyClone, Thermo, Utah, USA), se dejaron adherir a la placa. Se aplicaron concentraciones 19 crecientes de los fármacos paclitaxel (Intas Pharmaceuticals Limited, Gujarat, India), o docetaxel (Sanofi Aventis, París, Francia) y se incubaron durante 48 hrs más. Se fijaron las células con glutaraldehido al 1.1 % en PBS, durante 20 minutos en agitación. Se retiró el glutaraldehido y se tiñó con cristal violeta (0.1 %) en agitación por 20 min. Se lavaron las placas en agua y se dejaron secar. El cristal violeta se solubilizó en 400l/ pozo de ácido acético al 10 % en agitación por 20 min. Se leyó la absorbancia de la solución a 595 nm en un espectrofotómetro de microplaca (Opsys MR, Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA). Los valores están expresados como el porcentaje de viabilidad con respecto al control no tratado. Los datos representan al menos tres experimentos independientes sembrados por triplicado. 6.3 Ensayo de Western Blot. Las células se lisaron en un buffer que contiene 50 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % Nonidato P-40, 10 mM NaF, 50 mM -glicerofosfato de sodio, 1 mM vanadato de sodio y mezcla de inhibidores de proteasa (Complete, EDTA free, Roche). La cuantificación de proteína se realizó mediante técnica de Bradford, la densidad óptica se midió a 595 nm en especofotómetro (DU-65, Beckman Coulter, Pasadena, California, USA). Se corrieron 20g de proteína en gel de policramida desnaturalizante al 9 %. Posteriormente, se transfirió a una membrana Inmobilon-P PVDF (Millipore Corp Bedford, MA). La membrana se bloqueó durante 1 hora con leche al 5 % en PBS tween. Después se colocó en anticuerpo primario anti-myc, anti-Her2 y anti-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) durante la noche a 4oC en agitación continua. Se lavó con PBS tween y después se incubó con el anticuerpo secundario marcado con HRP. 20 La señal fue visualizada mediante reacción de quimioluminiscencia con Super Signal (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) y captada por autoradiografía (Kodak, Rochester, NY, USA). 21 7.- RESULTADOS 7.1 Expresión de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama. Mediante Western blot se caracterizó la expresión de PTP1B en seis cultivos primarios de cáncer de mama: MBCD5-B3, MBCD3, MBCD5, MBCD17, MBCD25 y MBCDF, utilizamos como control positivo la línea celular MCF-7. Los cultivos MBCD3 y MBCD5 tienen mayor expresión de PTP1B, mientras que MBCD5-B3 y MCF-7 expresan menor cantidad de PTP1B. En tanto que MBCD17, MBCD25 y MBCDF no presentaron niveles detectables de PTP1B por esta técnica (Figura 6). En estos cultivos se analizó su susceptibilidad a taxanos. 7.2 La expresión endógena de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama induce resistencia a paclitaxel. Para estudiar el papel de PTP1B en la susceptibilidad a paclitaxel se realizaron ensayos de citotoxicidad con los cultivos positivos (MBCD5-B3, MBCD3, MBCD5) y negativos para PTP1B (MBCD17, MBCD25, MBCDF). Las células fueron incubadas por 48 h en presencia de dosis crecientes de paclitaxel. Los resultados mostraron que los cultivos positivos para PTP1B presentan una mayor resistencia a paclitaxel en el rango de 0.1- 10 g/ml. En contraste, los cultivos negativos para PTP1B muestran una mayor susceptibilidad a este fármaco (Figura 7). Estos resultados sugieren que la expresión endógena de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama induce resistencia a paclitaxel. 22 Figura 6.- Expresión de PTP1B en cultivos primarios de cáncer de mama. Western blot anti-PTP1B de los cultivos primarios de cáncer de mama. Se corrieron 20 g de proteína total en un gel de policramida al 9 %. Se detectó la presencia de PTP1B mediante un anticuerpo policlonal anti-PTP1B. Figura 7.- Susceptibilidad a paclitaxel respecto a la expresión endógena de PTP1B. El paclitaxel fue adicionado a 0.05, 0.1, 1, 5 y 10 g/ml. Se evaluó a viabilidad por la técnica de cristal violeta 48 h después de adicionado el fármaco. Los resultados son expresados como el porcentaje del promedio de la OD570 de las células no tratadas contra las células tratadas. Los datos representan el promedio de al menos tres experimentos independientes sembrados por triplicado. 23 7.3 Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la resistencia a paclitaxel. El resultado anterior sugiere que PTP1B juega un papel importante en la resistencia a paclitaxel. Para corroborar este papel de PTP1B, primero se silenció la expresión de PTP1B en las células MBCD3 (MBCD3-sh1B) mediante shRNAs y como segunda aproximación se sobreexpresó PTP1B transfectando el cDNA de la forma silvestre de la fosfatasa en células MBCDF (MBCDF 1B WT) (Figura 8A). En estos cultivos se adicionaron concentraciones crecientes de paclitaxel, evaluando la viabilidad 48 h después. Los resultados muestran una menor viabilidad en las células MBCD3-sh1B comparada con el cultivo transfectado con shRNA control (MBCD3 sh control) en el rango de concentraciones de 0.1-10 g/ml de paclitaxel (Figura 8A). Estos resultados sugieren que el silenciamiento de PTP1B incrementa la susceptibilidad a paclitaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. Una vez que se demostró que el silenciamiento de PTP1B revierte la resistencia a paclitaxel, realizamos ensayos de citotoxicidad comparando células transfectadas con el vector vacío MBCDF-EV y células que sobreexpresan el cDNA silvestre de PTP1B MBCDF-1B WT. La viabilidad se evaluó 48 h después de la adición de concentraciones crecientes de paclitaxel. Los resultados mostraron que la viabilidad celular fue mayor para el cultivo MBCDF-1B WT comparado con el cultivo MBCDF-EV desde la concentración más baja (0.05 g/ml) hasta 5 g/ml de paclitaxel (Figura 8B). Este resultado sugiere que la sobreexpresión de PTP1B incrementa la resistencia a paclitaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. 24 Figura 8.- Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la resistencia a paclitaxel. Las células se sembraron a una densidad de 10,000 cel/cm 2 , se adicionaron concentraciones crecientes de paclitaxel (0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 y 10 g/ml). La viabilidad se evaluó a las 48 h después de la adición del fármaco por la técnica de cristal violeta. Los datos están representados en porcentaje del promedio de OD570 de las células no tratadas. Cada valor es resultado de por lo menos tres experimentos independientes sembrados por triplicado. A) Los cultivos MBCD3 sh control y MBCD3 sh1B, silenciados para la expresión de PTP1B. B) Las células MBCDF-EV y MBCDF-1B WT, donde se sobreexpresa el cDNA de PTP1B wt. 7.4 La expresión endógena de PTP1B induce mayor susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. Otro de los taxanos con mayor relevancia clínica en el tratamiento de cáncer de mama además de paclitaxel, es el docetaxel. Conla finalidad de analizar el papel de PTP1B en la susceptibilidad a otros taxanos realizamos ensayos de citotoxicidad similares a los descritos anteriormente adicionando concentraciones crecientes de docetaxel. Nuevamente, utilizamos los cultivos primarios con expresión endógena de PTP1B (MBCD5, MBCD3 y MBCD5-B3) comparados con cultivos deficientes de ella (MBCDF, 25 MBCD25 y MBCD17). Los cultivos primarios con expresión endógena de PTP1B resultaron ser más susceptibles a docetaxel que los cultivos negativos para esta fosfatasa (Figura 9). Nuestros resultados sugieren que las células de cáncer de mama positivas para PTP1B presentan una mayor susceptibilidad a docetaxel. Figura 9.- Susceptibilidad a docetaxel respecto a la expresión endógena de PTP1B. Los cultivos MBCD5, MBCD3 y MBCD5-B3, positivos para PTP1B y los cultivos MBCDF, MBCD25 y MBCD17, negativos para la fosfatasa, se sembraron a 10,000 cel/cm 2 . Se adicionaron 0.1, 0.5, 1, 5, 10 y 50 ng/ml de docetaxel y se evaluó la viabilidad a las 48 h por la técnica de cristal violeta. Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes sembrados por triplicado. 7.5 Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la susceptibilidad a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. Los resultados anteriores demuestran que los cultivos primarios que expresan PTP1B son más susceptibles a docetaxel. Para corroborar el papel de PTP1B en la susceptibilidad a docetaxel, se realizaron ensayos de citotoxicidad en las células donde 26 se silenció (MBCD3-sh1B) y en las células donde se sobreexpresó PTP1B (MBCDF 1B WT). Las células MBCD3-sh1B fueron más resistentes al efecto citotóxico del docetaxel comparado con el cultivo MBCD3 sh control (Figura 10A). Estos datos sugieren que el silenciamiento de PTP1B incrementa la resistencia a docetaxel en cultivos primarios de cáncer de mama. Posteriormente, investigamos si la sobreexpresión de PTP1B induce susceptibilidad al mismo fármaco. Los resultados obtenidos mostraron que el docetaxel induce una mayor citotoxicidad en las células MBCDF-1B WT comparada con las células MBCDF-EV (Figura 10B). Estos datos confirman que la sobreexpresión de PTP1B confiere mayor susceptibilidad a docetaxel. Figura 10.- Efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B en la susceptibilidad a docetaxel. Las células se sembraron a una densidad de 10,000 cel/cm 2 , se adicionaron concentraciones crecientes de docetaxel (0.1, 0.5, 1, 5, 10 y 50 ng/ml) y la viabilidad se evaluó 48 h después por la técnica de cristal violeta. Los datos están representados como el porcentaje del promedio de OD570 de las células no tratadas. Cada valor es resultado de por lo menos tres experimentos independientes sembrados por triplicado. A) Los cultivos MBCD3 sh control y MBCD3 sh1B, silenciado para la expresión de PTP1B. B) Las células MBCDF-EV y MBCDF-1B WT, donde se sobreexpresó el cDNA de PTP1B wt. 27 8.- DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. En los últimos años se ha reportado que PTP1B juega un papel importante en el cáncer de mama. Estudios en modelos murinos que sobreexpresan Her2 demostraron que la deleción de PTP1B retrasó la aparición de tumores y metástasis pulmonares [42, 43]. Por otra parte, se ha sugerido que la expresión de PTP1B es necesaria para la implantación y pogresión de los tumores mamarios [46]. Previamente en nuestro laboratorio, se encontró que PTP1B juega un papel importante en la regulación de Her2 y esto se asocia a un fenotipo más agresivo, con mayor capacidad de proliferación y migración celular [45]. En el presente trabajo estudiamos el efecto de PTP1B sobre la sensibilidad a los taxanos paclitaxel y docetaxel. Nuestros resultados muestran que la expresión de esta fosfatasa correlaciona con sensibilidad opuesta a los dos taxanos utilizados, es decir, células positivas para PTP1B presentan resistencia a paclitaxel; mientras que son sensibles al docetaxel. Estos resultados fueron confirmados mediante el silenciamiento y la sobreexpresión de PTP1B. Las células silenciadas para PTP1B fueron más sensibles al tratamiento con paclitaxel y las células que eran negativas para PTP1B y se sobreexpresó la fosfatasa fueron resistentes a paclitaxel. Para el caso del docetaxel sucedió lo opuesto, las células que fueron silenciadas a PTP1B presentaron resistencia a docetaxel, y por el contrario, las células que sobrexpresaron PTP1B fueron más sensibles al efecto citotóxico de este taxano. Estos resultados sugieren que la presencia de PTP1B condiciona a una respuesta antagónica a estos taxanos. Es interesante hacer notar que aunque en la actualidad se usan de manera indistinta en el tratamiento del cáncer de mama, estos resultados sugieren que la presencia de PTP1B puede ser un factor predictivo de respuesta a estos dos fármacos y su determinación al 28 inicio del tratamiento podría ser crucial para elegir el tipo de taxano a asignar a las pacientes con cáncer de mama. Aunque paclitaxel y docetaxel ejercen su acción mediante la estabilización de los microtúbulos (Figura 1) [47], desconocemos cuál es el mecanismo molecular por el que las células primarias de cáncer de mama positivas para PTP1B responden de manera opuesta al efecto citotóxico de estos dos taxanos. Se han reportado diferencias entre ambos taxanos que pueden explicar este fenómeno: ambos fármacos están formados por un complejo anillo taxano con una cadena lateral en la posición C-13 que es determinante para su actividad sobre los microtúbulos [15]; es en esta cadena lateral donde se observa una de las principales diferencias estructurales entre paclitaxel y docetaxel (Figura 2). Docetaxel ha mostrado mayor afinidad por los microtúbulos y mayor inducción de la fosforilación de Bcl-2 comparado con paclitaxel. Se sabe que docetaxel y paclitaxel son hidrolizados por distintas formas de citocromo P-450 a nivel hepático; y se han observado mejores respuestas in vivo con docetaxel que con paclitaxel sobre células de cáncer de pulmón y próstata, no así en cáncer de mama [48, 49]. Por otra parte, en estudios fase II, pacientes con cáncer de mama y cáncer de ovario resistentes a paclitaxel se muestran sensibles a docetaxel con una tasa de respuesta de 18 - 23 % [23, 50]. Estas diferencias pueden ser condicionantes que expliquen en parte los resultados antagónicos entre docetaxel y paclitaxel obtenidos en este trabajo. Además de las diferencias moleculares entre paclitaxel y docetaxel, existen vías de señalización que podrían influir en la distinta susceptibilidad a estos taxanos. 29 Recientemente, se demostró que paclitaxel y vinorelbine disminuyen la fosforilación de STAT3, en particular paclitaxel bloquea la asociación entre STAT3 y tubulina. Se sabe que STAT3 juega un papel importante en procesos de migración y que se encuentra fosforilado de manera constitutiva en cáncer de mama [51, 52]. Se sabe que PTP1B y TC-PTP desfosforilan a los miembros de la familia JAK/STATs y aunque no está reportado que PTP1B desfosforile a STAT3, podría ser un posible blanco en células de cáncer de mama y afectar la respuesta a paclitaxel y docetaxel [53-55]. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de acción de los taxanos que involucra la vía intrínseca de la apoptosis mediante la expresión de Bcl-2. Bcl-2 es una familia de proteínas con funciones proapoptóticas y antiapoptóticas, ejercen su acción mediante la regulación de la permeabilidad mitocondrial [17]. La expresión de Bcl-2 en algunos tumores ha sido asociada con un peor pronóstico para los pacientes, pero a una mejor respuesta a la quimioterapia. Por otra parte, líneas celulares de cáncer de próstata, pulmón y mama con niveles altos de Bcl-2 presentan una mayor susceptibilidad a docetaxel [48]. La sobreexpresión in vitro de Bcl-2 induce una mayor permeabilidad mitocondrial en célulastratadas con paclitaxel mediada por un incremento en los niveles de Bim, el cual se encuentra unido a los microtúbulos y puede ser liberado por los taxanos [17]. La expresión de PTP1B se ha relacionado a una mayor susceptibilidad a la apoptosis por privación de suero, mediada por un incremento en los niveles de Bim y de caspasa 3 [56]. En nuestro estudio, las células positivas para PTP1B mostraron una mayor susceptibilidad a docetaxel que las negativas, este resultado podría explicarse en relación a la vía mitocondrial de la apoptosis. Es 30 probable que los efectos citotóxicos de paclitaxel y docetaxel dependan en distinta medida de vías como JAK/STAT y Bcl-2/Bim. La inestabilidad dinámica de los microtúbulos es necesaria para que cumplan con sus funciones celulares y está regulada por las proteínas asociadas a microtúbulos (MAP), que en su estado desfosforilado se unen a los microtúbulos para estabilizarlos [57-61]; y fungen como sitio de acoplamiento para algunas cinasas y fosfatasas [61-63]. Una de las cinasas que regulan el estado de fosforilación de las MAP es MARK (del inglés MAP/microtubule affinity regulating kinase) [61, 64], cuya actividad es regulada por la acción de dos fosfatasas: la PP2A (del inglés phosphatase 2A), con blanco en residuos de serina y treonina [58]; y PTP1B que desfosforila residuos de tirosina [57]. La desfosforilación de MARK disminuye su actividad sobre las MAP, esto contribuye a la inestabilidad de los microtúbulos. Se ha observado que los efectos de la sobreexpresión de MARK son contrarrestados por la acción estabilizadora de docetaxel sobre los microtúbulos [57]. Uno de los mecanismos de resistencia a taxanos es el incremento en la inestabilidad de los microtúbulos, la acción estabilizadora de los taxanos en células con este fenotipo regresa la inestabilidad incrementada a una dinámica apenas "normal". Es probable que el incremento en los niveles de PTP1B condicione una mayor inestabilidad dinámica por la desfosforilación de MARK y a su vez, una mayor resistencia a paclitaxel; estos datos en su conjunto podrían explicar los resultados obtenidos con células positivas para PTP1B y su mayor resistencia a paclitaxel. [47] [48]. 31 Estudios sobre la localización intracelular de las fosfatasas indican que PRL-1, y probablemente PTP1B, se encuentran en distinta localización durante las fases del ciclo celular; en la fase G0 se localizan cerca del RE, mientras que durante la mitosis se encuentran asociadas con el huso mitótico y sus tubulinas [65]. Esta localización podría promover la interacción directa de PTP1B y las moléculas de taxanos [49]. Así mismo, es muy probable que docetaxel y paclitaxel muestren una distinta afinidad por las distintas isoformas de tubulinas, mismas que podrían verse afectadas por la expresión de PTP1B. Para dilucidar estos mecanismos se requieren más estudios que evalúen la interacción entre fostatasas y microtubulos. Recientemente, se publicó que el 49% de las pacientes con cáncer mama expresan PTP1B, esta expresión se asoció a un mejor pronóstico [66]. La expresión frecuente de PTP1B en células de cáncer de mama y su asociación a un fenotipo celular más agresivo sugieren que esta fosfatasa juega un papel importante en esta patología y que son necesarios más estudios que aborden el papel de PTP1B en diferentes aspectos del cáncer de mama, como es el efecto que puede tener sobre la sensibilidad a fármacos de quimioterapia [45]. Por ejemplo, los taxanos se encuentran dentro de las mejores opciones disponibles para el tratamiento adyuvante, neoadyuvante e incluso paliativo de las pacientes con cáncer de mama. Los resultados de este trabajo demuestran que la presencia de PTP1B en tumores mamarios confiere diferente sensibilidad a paclitaxel y docetaxel in vitro, lo cual nos permite proponer a PTP1B como un marcador predictivo de respuesta a taxanos. Es importante corroborar los resultados de nuestro estudio con ensayos clínicos donde se correlacione la respuesta a estos fármacos con la expresión de PTP1B, lo que permitiría seleccionar a un grupo 32 de pacientes que se beneficie de una mejor elección de tratamiento de acuerdo a la presencia o no de PTP1B. 33 9.- BIBLIOGRAFÍA. 1. Ferlay, J., et al., Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer, 2008. 127(12): p. 2893-917. 2. Siegel, R., D. Naishadham, and A. Jemal, Cancer statistics 2013. CA Cancer J Clin, 2013. 63(1): p. 11-30. 3. 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