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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO “EVALUACION DE ELEMENTOS MINERALES Y VITAMINAS HIDROSOLUBLES EN PELO, HECES, SUERO SANGUÍNEO Y ALIMENTO DEL CONEJO DE LOS VOLCANES (Romerolagus diazi), EN CAUTIVERIO”. TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS PRESENTA: M.V.Z. JOSE LUIS FLORES GUTIERREZ TUTOR: MVZ. MPA Dr. C. Carlos Gutiérrez Olvera COMITÉ TUTORAL: D.V.M. Ph. D. Rosalía Pastor Nieto Dra. Dulce María Brousset Hernández Jáuregui MÉXICO, D. F. 2012 MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO “EVALUACION DE ELEMENTOS MINERALES Y VITAMINAS HIDROSOLUBLES EN PELO, HECES, SUERO SANGUÍNEO Y ALIMENTO DEL CONEJO DE LOS VOLCANES (Romerolagus diazi), EN CAUTIVERIO”. TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS PRESENTA: M.V.Z. JOSE LUIS FLORES GUTIERREZ TUTOR: MVZ. MPA Dr. C. Carlos Gutiérrez Olvera COMITÉ TUTORAL: D.V.M. Ph. D. Rosalía Pastor Nieto Dra. Dulce María Brousset Hernández Jáuregui MÉXICO, D. F. 2012 MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL RESUMEN El conocimiento de la nutrición de la fauna silvestre es fundamental para la sobrevivencia y productividad de las poblaciones ya sea en libertad o mantenidas en cautiverio. Generalmente, las investigaciones sobre hábitos alimenticios en vida libre son netamente descriptivas, y pocas veces determinan la razón fisiológica o la importancia de la variedad de alimentos ingeridos. En este estudio se determinó el aporte de elementos minerales y vitaminas hidrosolubles por medio de técnicas cromatográficas y espectrofotorimetricas respectivamente, digestibilidad aparente y consumo de la dieta aportada a los conejos de los volcanes (Romerolagus diazi) del zoológico de Chapultepec Alfonso L. Herrera, correlacionándose los resultados obtenidos de elementos encontrados en pelo y suero sanguíneo de estos animales como reflejo del estado nutricional y de salud de los estos animales, encontrándose que se puede explicar el contenido de cobre y magnesio en suero sanguíneo [0.4 (p < 0.06) y 0.6 (p<0.05) respectivamente], afirmando que por cada µg/g de contenido de cobre y magnesio en el pelo, el contenido promedio en suero sanguíneo aumenta 0.45 y 0.57 µg/ml correspondientemente. Debido a las condiciones alimenticias que a repercutido su cautiverio por largos años, su comportamiento alimenticio y necesidades de nutrientes parecidas al conejo doméstico, indican que los datos obtenidos en este trabajo no puedan ser extrapolados a los animales en vida libre por lo que es necesario llevar a cabo estudios similares a este en animales que no se encuentra en cautiverio. Palabras Claves: Conejo de los volcanes, minerales, vitaminas hidrosolubles, pelo, suero sanguíneo, heces, cromatografía de líquidos, espectrofotometría. ABSTRACT The wildlife knowledge of nutrition is the most important thing for the survival of the populations productivity and the groth olso in wildlife as kept in captivity. Generally, many of the research on feeding behavior about this species in wildlife is mostly descriptive, and only few documents describe the value of the deferments ingredients intake in the mineral nutrition on this animals. In this work, was determinated measurements of mineral elemets and water soluble vitamins using the spectrophotometer and chromatography techniques, apparent digestibility and the uptake diet provided to the volcano rabbits (Romerolagus diazi) of the Chapultepec Zoo “Alfonso L. Herrera, relating the results obtained from elements founds in coat and blood serum of these animals like a way of status nutritional and health of these animals can be found to explain the content of cooper and magnesium in blood serum [0.4 (p<0.06) and 0.6 (p<0.05) respectively] . Stating that for each mg/g of cooper and magnesium content in coat, the average content in blood serum increases 0.45 and 0.57 mg/ml respectively. Due to feeding in captivity for many years, the feeding behavior and the nutrients requirements as domestic rabbits indicate that this work can not be transpolar with wildlife. Therefore, is necessary to make more studies like this in animals in wildlife. Key words: Volcano rabbit, Mineral elements, Water soluble vitamins, Coat, Blood serum, Feces, High Performance Liquid Chromatography, Spectrophotometer. DEDICATORIA A mis padres A mis hermanos A mi pareja Mariana A Pity Por ser más que mi esencia, mi camino y mi espíritu, dándome la Fortaleza en concluir con las metas del camino de la vida. Joaquín † que siempre ha estado a mi lado en estos logros de mi vida. Claudia quien a confiando en mi persona mostrándome su fe en mí, así como yo siempre he tenido fe en ella. Siendo el impulso incondicionalmente fortaleciéndome para crear las metas propuestas en esta vida, confiando en mi mente, mis ideas y mi vida, siendo ella parte esencial de la mía. Por ser una gran matriarca, maestra y madre, dando momentos inolvidables para quienes estuvieron a su alrededor. AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT), y al proyecto PAPIIT IN216309 “EVALUACIÓN NUTRICIONAL (AMINOÁCIDOS PROTÉICOS, VITAMINAS HIDROSOLUBLES, VITAMINA K, ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES Y AMONIACO) EN COCOTROFOS Y CONTENIDO CECAL DE CONEJOS CANULADOS A NIVEL DEL CIEGO Y PRODUCCIÓN DE INÓCULOS MICROBIANOS, quienes permitieron la realización del presente trabajo de investigación. Al Dr. Carlos Gutiérrez Olvera. Por sus conocimientos, paciencia, guía, consejos y apoyo para realizar esta tesis. Al Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica, así mismo al Dr. Rene Rosiles, como al equipo de trabajo del Laboratorio de Toxicología FMVZ, por su apoyo, regaños paciencia para transmitirme sus conocimientos y ayuda. A la Dra. Dinorah Vargas Estrada por confiar en mí, apoyarme en la elaboración de la tesis y en la asesoría técnica. Al Departamento de Fisiología y Farmacología de la FMVZ de la UNAM, como a su jefa de departamento la Dra. Sara Caballero Chacón, mediante el apoyo del Laboratorio de Farmacología y su colaboración en este trabajo. A la Dra. Rosalía Pastor Nieto y la Dra. Dulce Ma. Brousset, por sus apoyos y consejos. A la DGZVS del Distrito Federal y a los médicos que participaron en el apoyo de obtención de muestras de esta tesis, así un agradecimiento especial al MVZ. Javier Ojeda Chávez, al M en C. José Antonio Sandoval y a la MVZ Erika Servín por su paciencia. A la Laboratorista Fermina Palma por su apoyo, regaños y ayuda en la realización de esta investigación, también estoy agradecido completamente con el equipo de trabajo, quienes considero como una Familia, todos y a cada uno que lo conforman ya que he crecido con grandes personas a lo largo de estos 3 años, y que en lo personal, está de más describir a cada uno, ya que sime olvidara de alguien, lo lamentaría eternamente. A la Familia Herrán Aguirre por su apoyo, confianza y motivación. A la Familia Gutiérrez Torres por su gran amistad y apoyo. Un paréntesis especial a esa gente de quien recibía apoyo siempre aun distante, Marilu Guillen, Ángel Gómez E. Ernesto Gramajo, Adriana Raquel Aguilar, MVZ. Pedro N. Aguilar, Dr. Mariano Martinez Vazquez y MVZ. Alfredo Castellanos C. CONTENIDO Página I.- INTRODUCCION ............................................................................................................... 1 1.1 Sinonimias y clasificación taxonómica del conejo de los volcanes ................................. 1 1.2.- Características Biológicas del conejo de los volcanes .................................................. 1 1.3.- Características digestivas .............................................................................................. 3 1.4.- Necesidades nutricionales en conejos .......................................................................... 4 1.5.- Importancia de los nutrimentos ...................................................................................... 7 1.5.1.- Vitaminas ......................................................................................................... 7 1.5.2.- Elementos minerales ..................................................................................... 16 1.6.- Aspectos fisiológicos y anatómicos del pelaje ............................................................ 20 1.6.1 Factores alimenticios que afectan el crecimiento del pelo y de calidad......... 21 II.- ANTECEDENTES ........................................................................................................... 22 2.1.- Estado de conservación e investigación del conejo de los volcanes ......................... 22 2.2.- Desarrollo de métodos no invasivos y rápidos para el análisis de evaluación de componentes nutricionales y tóxicos en animales ....................................... 24 2.2.1 Análisis de vitaminas en la aplicación médica ............................................................ 26 2.2.2 Pruebas de medición de minerales ............................................................................. 29 III.- JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 30 IV.- OBJETIVOS .................................................................................................................. 30 4.1.- Objetivo general ........................................................................................................... 30 4.2.- Objetivos específicos ................................................................................................... 30 V.- MATERIAL Y METODOS .............................................................................................. 31 5.1.- Población de estudio. ................................................................................................... 31 5.2.- Alojamiento ................................................................................................................... 32 5.3.- Dieta ............................................................................................................................. 32 5.4.- Toma de muestras ...................................................................................................... 33 5.4.1.- Muestreo de sangre y pelo............................................................................ 33 5.4.2.- Muestreo de heces. ....................................................................................... 34 5.4.3.- Muestreo de alimento. ................................................................................... 34 5.5.- Procesamiento de las muestras. ................................................................................. 35 5.5.1.- Procesamiento de los elementos minerales: ............................................... 35 5.5.2.- Metodología para el procesamiento de las muestras e identificación del contenido de Vitaminas: ....................................................................................................... 36 5.5.3.- Análisis de vitaminas hidrosolubles .............................................................. 37 5.6.- Determinación de concentraciones minerales............................................................. 39 5.6.1.- Determinación de Zinc en agua de bebederos en las baterías de los conejos de los volcanes. ...................................................................................................... 39 5.7.- Análisis estadístico de resultados. ............................................................................... 39 5.7.1.- Análisis estadístico para minerales............................................................... 39 5.7.2.- Análisis estadístico para vitaminas ............................................................... 39 VI.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 40 6.1.- Elementos minerales. ................................................................................................... 40 6.1.1.- Concentración de elementos minerales en el alimento................................ 40 6.1.2.- Consumo de alimento. ................................................................................. 41 6.1.3.- Consumo de elementos minerales. .............................................................. 43 6.1.4.- Elementos minerales excretados ................................................................. 44 6.1.5.- Digestibilidad de los elementos minerales. .................................................. 46 6.1.6.- Elementos minerales en el suero sanguíneo. .............................................. 49 i CONTENIDO Página 6.1.7.- Elementos minerales en el pelo. ................................................................... 51 6.1.8.- Regresión de valores de los elementos minerales en pelo como factor indicador de elementos minerales en suero sanguíneo. ..................................................... 53 6.2.- Vitaminas hidrosolubles. .............................................................................................. 54 6.2.1.- Vitaminas hidrosolubles en el alimento. ....................................................... 54 6.2.2.- Vitaminas hidrosolubles excretadas. ............................................................ 55 6.2.3.- Vitaminas hidrosolubles en muestras de pelo y suero sanguíneo. .............. 57 6.2.3.- Digestibilidad de las vitaminas hidrosolubles detectadas. ........................... 57 VII.- CONCLUCION .............................................................................................................. 59 VIII.- LITERATURA CITADA ................................................................................................ 61 IX.- ANEXOS ....................................................................................................................... 69 ii ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1 Necesidades nutritivas de los conejos alimentados ad libitum ............................. 5 Cuadro 2 Necesidades nutritivas de los conejos recomendadas por Lebas (1980)............. 6 Cuadro 3 Requerimientos de vitaminas A, D y E en conejos. ............................................... 9 Cuadro 4 Requerimientos de vitaminas del complejo B y vitamina K en conejos. .............. 9 Cuadro 5 Composición mineral de los cuerpos de los animales adultos (contenidos en 1 kg de tejido sin grasa cruda) ................................................................................................ 19 Cuadro 6 Composición mineral de los cuerpos de los animales recién nacidos (contenidos en 1 kg de tejido sin grasa cruda) ........................................................................................19 Cuadro 7 Valores de minerales descritos por Trillanes en varios órganos en el conejo de los volcanes. ......................................................................................................................... 23 Cuadro 8 Resumen de recolección de muestras................................................................. 33 Cuadro 9 Concentración de elementos minerales en los ingredientes de la dieta para conejos de los volcanes expresado en % en base seca ..................................................... 40 Cuadro 10 Consumo promedio por ingrediente de la dieta de conejos de los volcanes (g), entre sexos a través del tiempo ............................................................................................ 4| Cuadro 11 Promedio de elementos minerales consumidos (μg) entre sexos a través del tiempo. ................................................................................................................................. 43 Cuadro 12 Cantidades promedio de elementos minerales (µg) excretados al día, en relación al sexo a través del tiempo ..................................................................................... 45 Cuadro 13 Promedio de la digestibilidad de los elementos minerales en relación al tiempo y al sexo (%).. ....................................................................................................................... 47 Cuadro 14 Cantidades de elementos minerales consumidos y excretados diariamente. .. 48 Cuadro 15 Concentración promedio de los elementos minerales en suero sanguíneo entre sexos a lo largo del tiempo (µg/ml). ..................................................................................... 49 Cuadro 16 Concentración de elementos minerales en pelo entre sexos a lo largo del tiempo (µg/g)......................................................................................................................... 51 Cuadro 17 Concentración promedio de vitaminas hidrosolubles en la dieta del conejo de los volcanes .......................................................................................................................... 52 iii ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 18 Cantidades promedio de vitaminas hidrosolubles consumidas entre sexos a lo largo del tiempo. ................................................................................................................... 55 Cuadro 19 Cantidades promedio total de vitaminas hidrosolubles excretadas diariamente en el conejo de los volcanes en base húmeda, entre sexos a través del tiempo. .............. 56 Cuadro 20 Digestibilidad de las vitaminas hidrosolubles detectadas en los conejos de los volcanes (%) ......................................................................................................................... 58 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Distribución de Romerolagus diazi ......................................................................... 2 iv INTRODUCCIÓN 1.1.- Sinonimias y clasificación taxonómica del conejo de los volcanes El conejo de los volcanes (Romerolagus diazi), también conocido como zacatuche, teporingo o tepolito, es un mamífero del orden lagomorpha, el cual consta en la actualidad de la familia leporidae (conejos y liebres) y la Ochotonidae (picas) con 13 géneros y 69 especies 1, 2, 3 . Los lagomorfos se caracterizan por presentar labio leporino o hendido, son herbívoros y coprófagos (producen dos tipos de excretas: las heces redondas y duras; y las blandas, que son ingeridas para aprovechar los nutrientes producidos en la fermentación cecal); presentan tres pares de incisivos superiores (uno involuciona al nacer y los dos restantes crecen durante toda su vida, uno tiene forma de pivote y se alinea detrás del otro par) 4 . La familia leporidae da lugar a dos subfamilias, la primera es leporinae la cual incluye seis géneros: Nesolagus, Brachylagus, Oryctolagus, Caprolagus, Sylvilagus y Lepus. La segunda subfamilia es Paleolaginae y da origen a Pentalagus, Pronolagus y Romerolagus; en la cual se encuentra clasificada taxonómicamente al conejo de los volcanes 4,5,6 . 1.2.- Características Biológicas del conejo de los volcanes. El conejo de los volcanes es el segundo conejo más pequeño del mundo, y el primero en México. Los adultos promedian un peso de 450 a 600 g y una longitud corporal de 270 a 330 mm, siendo las hembras de mayor talla que los machos. Como la mayoría de los conejos silvestres, su color es pardo oscuro, pero se distingue por sus orejas (40 a 50 mm), patas y cola cortas (esta difícilmente distinguible), además, en la nuca posee 1 una zona triangular de pelo amarillento, probablemente relacionada con mecanismos de comunicación visual. Otra peculiaridad de la especie es su capacidad para emitir vocalizaciones, de hecho, junto con los picas y el conejo rojo, posiblemente, son los únicos lagomorfos que cuentan con un repertorio diverso de vocalizaciones. Considerados como una especie primitiva por su característica esquelética, es una especie endémica del territorio mexicano que se localiza en una pequeña área restringida en las montañas centrales del Eje Neovolcánico Transversal (figura 1), particularmente entre los 3, 000 y 4, 000 m.s.n.m. 1, 3, 6, 7, 8, 9. Los conejos de los volcanes se alimentan fundamentalmente de gramíneas amacolladas denominadas localmente zacatones (Festuca amplissima, Muhlenbergia macroura y Stipa ichu) y que al parecer el conejo de los volcanes las consume todo el año, por lo que también se les da el nombre de conejos zacatuches (Anexo 1.1.1). Además de los pastos, consumen hierbas como Alchemilla sp. y Donnnellsmithia juncea y las hojas jóvenes de las hierbas espinosas (Eryngium columnare y Cirsium jorullense) 7, 9 Figura 1. Distribución de Romerolagus diazi (Tomada de Velázquez A. et. al. 1996) 2 1.3.- Características digestivas. Debido a la característica anatómica y alimenticia del conejo de los volcanes se especula que su comportamiento digestivo y sus requerimientos nutricionales son similares al del conejo doméstico (Oryctolagus cuniculi), poseyendo un aparato digestivo desarrollado y adaptado al consumo de cantidades de fibra altas, caracterizandondose por la importancia relativa del ciego y el colon cuando es comparado con otras especies. La fórmula dentaria del conejo de los volcanes (I 2/1, C 0/0, P 3/2, M 3/3), es igual al del conejo doméstico7. El estómago tiene una capa muscular muy débil y siempre está parcialmente lleno. Después de la cecotrofia la región fúndica del estómago actúa como una cavidad para almacenamiento de cecotrofos. El rango del pH estomacal es de 1 a 5 dependiendo de la determinación del sitio (fúndica contra la región cardiaca pilórica), la presencia o ausencia de heces suaves, el tiempo de ingesta de alimento y la edad del conejo 10. Las cifras más bajas (de 1 a 2.5) son determinadas en la región cardiaca. El estómago está unido con el ciego por un intestino delgado de aproximadamente 3 m de largo, donde la secreción de bilis, enzimas digestivas y los buffers se vierten. El pH del intestino delgado es de alrededor de 7 10, 11. El ciego tiene una capa muscular débil y en él se lleva a cabo la fermentación bacteriana permitiendo la degradación de fibra, dando como resultado al cecotrofo (heces blandas) (Anexo 1.1.2) que es un material parcialmente degradado y muy rico en vitaminas, proteínas, aminoácidos y agua. El pH del contenido cecal es ligeramente ácido (5.6 – 6.2) 10. La actividad microbiana del ciego es de gran importancia para los procesos de digestión y utilización de nutrimentos y el comportamiento de ingestión de las heces suaves de origen cecal (cecotrofos) hace que la digestión microbiana en el ciego sea más importante para la utilización de nutrimentospor el conejo 1, 5, 10, 12. En la región del ano se realiza la cecotrofia de toma directa, que consiste en la ingestión de las heces 3 blandas 13, 14, 15. Sin embargo, en el caso del conejo de los volcanes, los estudios en cuanto a la fisiología digestiva son prácticamente inexistentes, como lo han descrito Sanchez y Nuñez en el 2009 y 2010 respectivamente 16, 17, 18. El aprovechamiento de los nutrimentos aportados por la dieta y los cecotrofos contribuyen al estado de salud de los conejos de los volcanes. Al comparar el consumo de materia seca entre el conejo de los volcanes y el conejo doméstico se ha notado que existe cierta similitud en relación al PV; debiéndose a que ambos poseen un tamaño corporal pequeño, por lo que su rango metabólico es muy alto e inversamente proporcional al peso, asumiéndose que el conejo de los volcanes, al ser más pequeño muestra una mayor tasa metabólica basal y por consiguiente un mayor consumo de materia seca que el conejo doméstico. Los reportes enfocados a su conducta alimenticia, mencionan que esta especie herbívora, tiene predilección por ingerir plantas jóvenes y partes suculentas de estas, que contienen mayor densidad de nutrientes, principalmente proteínas y carbohidratos solubles, y que son fácilmente digeridas por el aparato digestivo del conejo, concretando la similitud del comportamiento selectivo de Romerolagus diazi a la del Oryctolagus cuniculus17, 18. El consumo promedio reportado en los volcanes del zoológico de Chapultepec, por animal, en base húmeda y en materia seca (CMS) es de 128.60 g y 36.93 g respectivamente, este último representa un 6,36% de materia seca (MS) en relación al peso vivo (PV) que varía de 538.25 a 580.64g 18, 19 1.4.- Necesidades nutricionales en conejos. La fuente normal de información sobre las necesidades nutritivas del ganado son las publicaciones del National Research Council (NRC) en 1977, de la serie “Necesidades Nutritivas De Los Animales Domésticos”. Las necesidades del conejo se exponen en el Cuadro 1 en la que se observa inmediatamente que faltan datos cuantitativos sobre las 4 necesidades, especialmente para las funciones distintas al crecimiento. Es importante recalcar que en ciertas ocasiones se han empleado ingredientes purificados o semipurificados de apetecibilidad muy baja, lo que dio lugar a bajos ritmos de crecimiento, incluso para los animales testigos20, 21. Cuadro 1 Necesidades nutritivas de los conejos alimentados ad libitum 20, 21 Nutrientes Crecimiento Mantenimiento Gestación Lactación Energía y Proteína Energía digestible (Kcal) 2.500 2.100 2.500 2.500 TDN (%) 65 55 58 70 Fibra bruta (%) 10-12 14 10-12 10-12 Grasa (%) 2 2 2 2 Fibra indigestible 16 12 15 17 Nutrientes inorgánicos Calcio (%) 0.4 - 0.45 0.75 Fósforo (%) 0.22 - 0.37 0.5 Magnesio (%) 300-400 300-400 300-400 300-400 Potasio (%) 0.6 0.6 0.6 0.6 Sodio (%) 0.2 0.2 0.2 0.2 Cloro (%) 0.3 0.3 0.3 0.3 Cobre (mg) 3 3 3 3 Yodo (mg) 0.2 0.2 0.2 0.2 Hierro - - - - Manganeso (mg) 8.5 2.5 2.5 2.5 Zinc - - - - Vitaminas Vitamina A (UI) 580 - > 1.160 - Vitamina A, como caroteno (mg) 0.83 - 0.83 - Vitamina D - - - - Vitamina E (mg) 40 - 40 40 Vitamina K (mg) - 0.2 - Niacina (mg) 180 - - - Piridoxina (mg) 39 - - - Colina (g) 1.2 - - - 5 Cuadro 1 Necesidades nutritivas de los conejos alimentados ad libitum 20, 21 El nutriólogo francés especialista en conejos, Francois Lebas, ha establecido una serie de requerimientos que están más estrechamente orientados a las necesidades de la producción comercial actual de conejos explicada en el Cuadro 2 20 21. Cuadro 10 Necesidades nutritivas de los conejos recomendadas por Lebas (1980) 20, 21 . Nutriente Crecimiento 4-12 semanas Lactación Gestación Mantenimiento Conejas y su camada con la misma ración Proteína bruta (%) 15 18 18 13 17 Aminoácidos (%) Aminoácidos azufrados 0.5 0.6 - - 0.55 Lisina 0.6 0.75 - - 0.7 Arginina 0.9 0.8 - - 0.9 Treonina 0.55 0.7 - - 0.6 Triptófano 0.18 0.22 - - 0.2 Histidina 0.35 0.43 - - 0.4 Isoleucina 0.6 0.7 - - 0.65 Valina 0.7 0.85 - - 0.8 Leucina 1.05 1.25 - - 1.2 Fenilalanina 1.2 1.4 - - 1.25 Fibra bruta (%) 14 12 14 15-16 14 Fibra indigestible (%) 12 10 12 13 12 E. Digestible (kcal/kg) 2.500 2.700 2.500 2.200 2.500 E.Metabolizable (kcal/kg) 2.400 2.600 2.400 2.120 2.410 Grasa (%) 3 5 3 3 3 Minerales Calcio (%) 0.5 1.1 0.8 0.6 1.1 Fósforo (%) 0.3 0.8 0.5 0.4 0.8 Potasio (%) 0.8 0.9 0.9 - 0.9 Sodio (%) 0.4 0.4 0.4 - 0.4 Cloro (%) 0.4 0.4 0.4 - 0.4 Magnesio (%) 0.03 0.04 0.04 - 0.04 Azufre (%) 0.04 - - - 0.04 Cobalto (ppm) 1 1 - - 1 Cobre (ppm) 5 5 - - 5 Nutriente Nutrientes Crecimiento Mantenimiento Gestación Lactación Aminoácidos (%) Lisina Metionina+Cisteina 0.65 0.6 - - - - - - Arginina Histidina 0.6 0.3 - - - - - - Leucina 1.1 - - - Isoleucina 0.6 - - - Fenilalanina + tirosina 1.1 - - - Treonina 0.6 - - - Triptófano 0.2 - - - Valina 0.7 - - - Glicina - - - - 6 Cuadro 11 Necesidades nutritivas de los conejos recomendadas por Lebas (1980) 20, 21 . Nutriente Crecimiento 4-12 semanas Lactación Gestación Mantenimiento Conejas y su camada con la misma ración Minerales Zinc Hierro (ppm) Manganeso (ppm) 50 50 8.5 70 50 2.5 70 50 2.5 - 50 2.5 70 50 8.5 Yodo (ppm) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Vitaminas Vitamina A (UI/kg) 6.000 12.000 12.000 - 10.000 Caroteno (ppm) 0.83 0.83 0.83 - 0.83 Vitamina D (UI/kg) 900 900 900 - 900 Vitamina E (ppm) 50 50 50 50 50 Vitamina K (ppm) 0 2 2 0 2 Vitamina C (ppm) 0 0 0 0 0 Tiamina (ppm) 2 - 0 0 2 Riboflavina (ppm) 6 - 0 0 4 Piridoxina (ppm) 40 - 0 0 2 Vitamina B12 (ppm) 0.01 0 0 0 - Acido Folico (ppm) 1 - 0 0 - Acido pantoténico (ppm) 20 - 0 0 - Los nutrientes que tienen especial importancia en las raciones de los conejos son la proteína bruta, energía digestible (ED) y la fibra indigestible. Según se ha indicado anteriormente, no existen necesidades específicas de energía en kilocalorías por unidad de ración, ya que sobre un amplio intervalo de niveles energéticos, los animales ajustan la ingestión voluntaria para cubrir sus necesidades energéticas. Como norma general, la ED debe situarse entre 2.500 y 3.000 kcal/kg para los conejos 21, 22, 23. 1.5.- Importancia de los nutrimentos. 1.5.1 .- Vitaminas La tiamina o vitamina B1, fue la primera sustancia aislada que contiene una función amina y es esencial para la vida, de ahí el término “Vitamina” propuesto por Funk en 1911. En los conejos, el complejo vitamínico B y la vitamina K (naftoquinona) son sintetizados por las bacterias del ciego y la vitamina C (ácido ascórbico) en los tejidos, 7 por lo tanto, las vitaminas A (retinol), D (colecalciferol) y en algunos casos la vitamina E (tocoferol) podrían estar carentes por su disposición, requiriendo concentraciones diarias expresadas en el Cuadro 3. Todavía la cantidad de información que concierne con la concentración de vitaminas en los conejos es muy limitada 24 25 26, 27. Cuadro 12 Requerimientos de vitaminas A, D y E en conejos 25 . 1.5.1.1 Vitaminas del complejo B El complejo B está compuesto por tiamina (B1), riboflavina (B2), niacina (B3), ácido pantoténico (B5), piridoxina (B6), biotina (B8), ácido fólico (B9) y la cobalamina (B12). Estas vitaminas son sintetizadas por las bacterias del ciego desde los primeros días de edad en adelante, aumentando conforme el desarrollo cecal 6, 8. Las vitaminas del complejo B son proporcionadas por las bacteriascecales y por lo tanto no es necesario que se incluyan dentro de la dieta a menos que el conejo no ingiera los cecotrofos, en tal motivo los requerimientos que se han encontrado en los conejos están descritas en la Cuadro 4 25 26. Cuadro 13 Requerimientos de vitaminas del complejo B y vitamina K en conejos. 8 http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml En el proceso de la absorción, las vitaminas hidrosolubles atraviesan la mucosa intestinal por difusión simple y mediante transportadores dependientes del sodio. Algunas vitaminas del complejo B como la tiamina, riboflavina, niacina y ácido pantotenico actúan y son requeridos como cofactores del complejo multienzimatico piruvato deshidrogenasa en la descarboxilacion oxidativa del acido pirúvico. La deficiencia de tiamina no sólo bloquea la conversión del ácido pirúvico a acetil-CoA, sino que afecta la descarboxilación del ácido alfacetoglutárico y la transformación de hexosas en pentosas, catalizadas por la transcetolasa. El exceso de glucosa incrementa la concentración de los ácidos pirúvico y láctico, de modo que se altera el funcionamiento celular en su conjunto y compromete el metabolismo energético 26, 28. 1.5.1.1.1 Vitamina B1 (Tiamina) Está compuesto por dos heterociclos: un núcleo de pirimidina sustituido (amino-4 metil- 2 pirimidina) y un núcleo de tiazol sustituido {(2-hidroxietil) -5 tiazol -4}, unidos por un puente de metileno que es la parte débil de la molécula y explica su termolabilidad. La tiamina es estable en una solución acuosa a un pH de 2.4, pero es menos estable o inestable, en un pH neutro o alcalino, en el que ocurre una oxidación convirtiéndose en tiocromo. Sólo los esteres di y trifosfato de tiamina tienen una función metabólica conocida. El difosfato de tiamina (TDP) actúa como coenzima en muchos sistemas enzimáticos y el trifosfato de tiamina (TTP) tiene la función de neuromediador 29. Actúa como cofactor para ciertas enzimas implicadas en el metabolismo de los carbohidratos y grasas para la producción de energía, una deficiencia de tiamina en conejos causa pérdida del apetito, parálisis muscular y acumulación de ácido pirúvico en la sangre, causa deficiencias en la síntesis de proteínas y carbohidratos, además, de causar un daño irreversible a los nervios periféricos, ya que permite realizar adecuadamente las funciones nerviosas, digestivas y contribuyendo con el crecimiento y el mantenimiento 9 de la piel 21, 25. La vitamina B1 está presente en forma de tiamina libre en las plantas y de forma fosforilada unida en proteínas de los productos de origen animal 27. Metabolismo La tiamina se absorbe en el duodeno y el intestino delgado a través de un proceso de transporte activo saturable por ATP dependiente de sodio. En el momento de la absorción en las células intestinales sufren reacciones de fosforilación y desfosforilación, junto con la absorción 27. La tiamina es captada rápidamente por las células donde es transformada en su forma activa, TDP, este último a su vez puede ser fosforilado a TTP, que en algunos tejidos representa el 10% de la vitamina B1. Se considera que el contenido total de tiamina en el cuerpo humano es de alrededor de 25 a 30 mg y no menos del 25% está como tiamina libre mientras que el resto se halla predominantemente en forma de pirofosfato., no hay lugar de almacenamiento. La mayor concentración se encuentra en hígado, riñón y corazón, que supera en 2 a 3 veces la del encéfalo. En una dieta deficiente, el cerebro es el último tejido de perder sus reservas. La tiamina se elimina por vía renal en forma libre o degradada. En las heces se encuentra también tiamina sintetizada por la flora bacteriana arrastradas del sitio de absorción 27, 28. 1.5.1.1.2 Vitamina B2 (Riboflavina) La riboflavina (7,8-dimetil-10-ribityl-isoalloxazine), o vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble presente en una amplia variedad de alimentos. Es relativamente estable al calor, pero se degrada rápidamente en la luz. Participa en la liberación y utilización de energía de los carbohidratos, grasas y proteínas y en defensas antioxidantes siendo cofactor para la actividad del glutatión reductasa. Su función biológica más importante es participar en las reacciones redox e interviene en la transformación de la vitamina B6 10 y del ácido fólico en sus formas activas respectivas, y en la conversión de triptófano en niacina (vitamina B3). La riboflavina es necesaria para la respiración celular teniendo una importante participación en el mecanismo oxidativo en las células ya que trabaja conjuntamente con otras enzimas en la utilización del oxigeno celular siendo esta necesaria para la reparación de los tejidos; para la producción de glóbulos rojos21. La cantidad excretada depende de la ingerida y de las necesidades relativas de los tejidos y puede estar acompañada de pérdida de proteínas. En el hígado y los riñones del conejo se encuentran pequeñas cantidades de riboflavina pero no se almacena en el cuerpo y por eso debe ser regularmente incorporada a la dieta, una deficiencia de riboflavina causa retraso en el crecimiento y disminución del apetito en el conejo 21, 26 Metabolismo Un requisito previo para la absorción de la riboflavina es la hidrólisis de la FAD y FMN en riboflavina catalizada por las fosfatasas en el borde de cepillo de los enterocitos ya que cuando los vitameros están unidos de manera covalentemente, no están disponibles para la absorción30. La absorción se lleva a cabo principalmente en el intestino delgado proximal, gracias a un proceso de transporte activo saturable. La riboflavina libre es absorbida por los enterocitos y se somete a la fosforilación catalizada por una flavoquinasa citosólica para producir FMN. En el plasma, la riboflavina es transportada por la albúmina y algunas inmunoglobulinas, que también pueden estar unidas en otra parte por las coenzimas flavinicas. En los tejidos, la riboflavina está casi completamente ligada a enzimas, las formas no unidas son rápidamente hidrolizadas a riboflavina libre que se difunde a partir de las células y posteriormente es excretada. La fosforilación intracelular de la riboflavina es por lo tanto, una forma de mantener la homeostasis metabólica de la riboflavina. La ingesta de riboflavina en exceso conduce a la excreción urinaria en forma de metabolitos o 11 riboflavina. Algunos de estos metabolitos en la orina son también un reflejo de la actividad bacteriana en el tracto gastrointestinal 25 27, 30. 1.5.1.1.3 Vitamina B6 (Piridoxina) La piridoxina se trata de una coenzima que actúa, junto con otras enzimas, en numerosos procesos químicos del organismo su fórmula empírica es C8H11O3N. La vitamina B6 se degrada fácilmente por la luz y es fácilmente soluble en agua (excepto ácido 4-piridóxico), es incolora, con excepción de la solución de fosfato de piridoxal (PLP) la cual es amarillenta e inestable en un medio neutro o alcalino 21, 25. La piridoxina es necesaria para que el organismo transforme los hidratos de carbono y grasas en energía, ayuda en el sistema inmunitario, el sistema y desempeña un papel vital en el metabolismo y la absorción de las proteínas también ayuda en la creación de hemoglobina. La deficiencia de piridoxina en conejos produce dermatitis, convulsiones y parálisis. Las tres formas de vitamina B6 pueden ser la fosforilada en la posición 5, formando al fosfato de piridoxina (PNP), fosfato de piridoxal (PLP) y fosfato de piridoxamina (PMP). Se reconoce en el fosfato de piridoxal funciones metabólicas importantes relacionados con su actividad como coenzima, el PMP es más bien una forma de almacenamiento 21, 25, 26. Metabolismo La vitamina B6 está presente en los alimentos en sus tres formas (alcohol, aldehído o aminas) fosforilados o no fosforilados, en gran medida unido a las proteínas y aglúcidos. La vitamina B6 es liberada de la proteína y las formas fosforiladas son hidrolizadas por una fosfatasa intestinal antes de ser absorbidas en el yeyuno proximal. La forma glucósida es absorbida directamente o después de la hidrólisis parcial por una glucosidasa intestinal entrando en el enterocito por un mecanismo de difusión 12 pasiva no saturable o se someten a reacciones de fosforilación seguidas de reacciones de desfosforilación antes de salir de la célula intestinal para ganar la circulación portal al hígado. Estas formas de vitamina al entrar en la célula hepática por difusión pasiva se convierten en fosfato de piridoxal (PLP), la coenzima activa. Esta transformación se lleva a cabo sobre la acción de la cinasa de piridoxal, lo que permite la fosforilación en todos los tejidos, y también bajo la acción de la oxidasa de piridoxina, que cataliza la transformación de fosfato de piridoxina y del fosfato de piridoxamina en fosfato de piridoxal. La enzima anterior es dependiente de la coenzima flavin mononucleotido (FMN) y está presente principalmente en el hígado, explicando el papel central del hígado en el metabolismo de la vitamina B6 25, 27. En la sangre, la vitamina B6 se encuentra en forma de fosfato de piridoxal en el plasma (54%) a la albúmina y el nivel de los eritrocitos unido a la hemoglobina. La vitamina B6, es eliminada por vía urinaria después de la transformación en acido 4-piridoxico en el hígado y los riñones, también se encuentra en la orina en forma de piridoxal en cantidades muy pequeñas27. 1.5.1.1.4 Vitamina B12 (Cianocobalamina) La vitamina B12 pertenece a la familia de la cobalamina (cianocobalamina, hidroxocobalamina, metilcobalamina adenosilcobalamina). Las cobalaminas tienen una estructura química similar del grupo hemo, pero aquí el átomo central de hierro se sustituye por un átomo de cobalto, de ahí el nombre de la cobalamina 27. En el cuerpo su función está en forma de dos coenzimas, la coenzima B12 y la coenzima metil-B12. Es necesaria para la formación del material genético, ayuda a producir glóbulos rojos y a mantener un buen funcionamiento del sistema nervioso, interviene en el metabolismo de los ácidos grasos y favorece la síntesis de creatina que es una proteína necesaria para un buen nivel de masa muscular y de reserva energética. Es sintetizada en el 13 intestino del conejo si el cobalto está presente y disponible 21, 26. La cianocobalamina es un polvo rojo violeta, soluble en agua, estable al calor, pero sensible a la luz. Existe una fotoconversión de hidroxocobalamina en aquocobalamine, o una conversión de la coenzima B12 a cianocobalamina en presencia de cianuro de potasio 27. Metabolismo Bajo condiciones fisiológicas hay 3 tipos de proteínas que se unen a la vitamina B12 para su absorción: la haptocorrina, el factor intrínseco y la transcobalamina. La cobalamina casi nunca se encuentra libre sino conjugada con alguna de estas proteínas26. La vitamina es liberada de los alimentos por la acción de los ácidos y la pepsina del estómago, aquí se une con la haptocorrina secretada en la saliva con una afinidad que persiste al pH ácido del jugo gástrico. En el duodeno la haptocorrina se hidroliza por las enzimas pancreáticas y la cobalamina se une al factor intrínseco secretado del estómago, que presumiblemente la envuelve protegiéndola de las enzimas proteolíticas. Este complejo es absorbido por un receptor específico en el ileum. La unión al receptor capacita al complejo factor intrínseco B12 a entrar en las células entéricas; dentro de la célula el factor intrínseco se degrada y la cobalamina es liberada, uniéndose a la transcobalamina II la cual la transporta a la circulación portal. La transcobalamina I parece actuar como almacén de la vitamina con una larga vida media de 7 a 10 días y no parece estar envuelta en la toma tisular o transporte intertisular de vitamina. La transcobalamina III es eliminada rapidamente por el hígado con una vida media de 5 min, y parece proveer un mecanismo para regresar vitamina B12 y sus metabolitos de los tejidos periféricos al hígado, que es el órgano fundamental de almacenamiento. Hay una circulación enterohepática y almacenamiento en el hígado que permiten al cuerpo acumular reservas durante 3 años. De hecho, el hígado es el órgano más rico en vitamina B12. Contiene más del 60% de vitamina B12 total en el 14 cuerpo. La vitamina B12 se excreta en la bilis, la orina y las heces. La vida media de vitamina B12 en el cuerpo es de un año. 27, 31 1.5.1.1.5 Vitamina C (ácido ascórbico) El ácido ascórbico o vitamina c es un compuesto con seis átomos de carbonos estrechamente relacionado con la glucosa. Su papel biológico principal es el de agente reductor en la hidroxilación de lisina y prolina en el protocolageno32. La vitamina C corresponde al grupo de las vitaminas hidrosolubles, y no se almacena en el cuerpo por un largo período de tiempo y se elimina en pequeñas cantidades a través de la orina27. Por este motivo, es importante su administración diaria, ya que es más fácil que se agoten sus reservas que las de otras vitaminas. Es una sustancia de color blanca, estable en su forma seca, pero en solución se oxida con facilidad, más aún si se expone al calor., el cobre y el hierro, también aceleran su oxidación. Es importante su función reductora del Fe+3 a Fe+2 lo que asegura una mayor absorción a nivel del intestino. Facilita a la vez la liberación del hierro de la transferrina (proteína que transporta el hierro en sangre) y también de la ferritina (una de las principales formas de almacenamiento del hierro). Es importante su participación en la formación del colágeno y mucopolisacáridos, ya que es necesaria junto con el O2 y el Fe +2 para formar hidroxiprolina e hidroxilisina (componentes del colágeno). El colágeno es una sustancia de la cual depende la integridad de todos los tejidos fibrosos, como son la piel, el tejido conjuntivo, la dentina, matriz ósea, cartílago y los tendones; en la formación de esta proteína radica su importancia como cicatrizante de heridas y fracturas. Participa también en la formación de ciertos neurotransmisores como la serotonina, en la conversión de dopamina a noradrenalina, y en otras reacciones de hidroxilación que incluyen a los aminoácidos aromáticos y a los corticoides. Su concentración disminuye bajo situaciones de stress cuando hay mucha actividad de las hormonas de la corteza suprarrenal 27, 32 15 Metabolismo Se absorbe fácilmente en el intestino delgado, más precisamente en el duodeno. Pasa a la sangre por transporte activo y tal vez, también por difusión. Parece ser que el mecanismo de absorción es saturable, debido a que cuando se ingieren cantidades muy grandes de la vitamina, el porcentaje que se absorbe es mucho menor. La concentración de vitamina C en los leucocitos está en relación con la concentración de la vitamina en los tejidos, por lo que midiendo la concentración de la vitamina C en los leucocitos, sabemos el nivel real de la vitamina en los tejidos. Cuando el margen de concentración de vitamina c en condiciones normales se satura, la vitamina C se elimina en un alto porcentaje por orina, bajo la forma de ácido oxálico (catabolito) o si se ingiere en dosis muy elevadas, como ácido ascórbico. Si hay deficiencias, la absorción es muy alta y no hay eliminación por orina. El ácido ascórbico se encuentra en altas concentraciones en varios tejidos, como por ejemplo, el tejido suprarrenal, hígado, bazo y riñones. La vida media del ácido ascórbico en el organismo humano es de aproximadamente 16 días. Es por este motivo que los síntomas del escorbuto tardan meses en aparecer en sujetos con una dieta deficiente en vitamina C27. 1.5.2.- Elementos minerales. Los minerales son elementos inorgánicos, que se necesitan para formar estructuras, pararealizar las reacciones químicas celulares y para regular los líquidos corporales. Algunos minerales se llegan a encontrar en gran concentración en las plantas por lo tanto no hay un riesgo grande que los conejos alimentados por una dieta variada incluyendo muchas verduras desarrollen carencias24 25. La absorción de los elementos minerales puede realizarse por difusión simple o mediante transportadores, siendo muy diferente para cada mineral. La absorción de calcio está regulada por el 1, 25- dehidroxicolecalciferol, es favorecido por un pH bajo y es disminuido por la presencia 16 de oxalatos y fitatos, en una hipocalemia ocurre una respuesta por la hormona paratiroidea la cual actúa regulando los niveles de calcio en sangre, esto en conejos se ha comprobado que no hay respuesta a ello y la hipocalemia es notable. En los animales la absorción de hierro es independiente de la fuente de esta, encontrándose dificultades para excretar el hierro del organismo y, por consiguiente disponen de un método de regulación de la absorción, para evitar que ingrese en el organismo cantidades excesivas, la absorción del hierro se ve alterada con el aumento de la edad en las especies, pero durante las hemorragias graves y la gestación las necesidades de hierro aumentan de modo que la absorción también lo hace. La absorción del Zinc en el intestino delgado es por un proceso realizado por un transportador, siendo el limitante del ritmo la captación por el borde en cepillo de la membrana, se tiene en consideración que el calcio inhibe la absorción de Zinc 20, 21, 34. La alfalfa es una buena fuente de macrominerales (calcio, fósforo, magnesio, potasio, cloro), y microminerales (zinc, cobre, hierro) pero debe darse con precaución porque, es alta en proteínas 20, 21, 24. El zinc interviene en la producción de linfocitos, formación de insulina, funcionando como un componente del sistema enzimático y está implicado en la transferencia de dióxido de carbono en las células rojas sanguíneas, en la calcificación de los huesos y en la síntesis de proteínas y ácidos nucleícos. Los requerimientos de zinc en conejos no han sido determinados pero la necesidad de zinc en la dieta se ha estabilizado. La deficiencia de zinc implica disminución de consumo alimenticio, pérdida de peso, dermatitis, hematocrito bajo y problemas reproductivos. El hierro y el cobre están implicados en la producción de hemoglobina, por lo tanto si hay deficiencia de cada uno de estos elementos se presentara anemia. El hierro está relacionado con la correcta utilización de las vitaminas del complejo B. Se sabe que la vitamina C mejora 17 la absorción del hierro. Para las concentraciones de cobre propuestas por la National Research Council (NRC) ha establecido que los requerimientos en la dieta estén en 3 ppm en cambio los requerimientos de hierro no se han establecido aun. Una deficiencia de hierro es muy poco probable, pero una deficiencia de cobre también provoca disminución del pigmento del pelo ya que interviene en la síntesis de melanina. En una carencia de magnesio en la dieta se aprecia un pobre crecimiento, hábitos de ingesta de pelo e hiperirritabilidad. El magnesio interactúa con muchos minerales y es importante para la correcta asimilación del calcio y de la vitamina C. Equilibra el sistema nervioso central (ligera acción sedante), es importante para la correcta transmisión de los impulsos nerviosos y aumenta la secreción de bilis (favorece una buena digestión de las grasas y la eliminación de residuos tóxicos). En los conejos el exceso de magnesio en forma de sulfato de magnesio provoca diarrea severa. El calcio es muy importante en la dieta del conejo. Forma parte de los huesos, del tejido conjuntivo y de los músculos (está implicado en la contracción de músculo), en la transmisión de impulsos nerviosos, la coagulación y es esencial para una buena circulación de la sangre. Pero tanto el déficit como el exceso pueden resultar peligrosos para su salud. Una deficiencia de calcio puede conducir a la pérdida de hueso, raquitismo. En conejos con una dieta baja en calcio puede ser una buena idea de supervisar la densidad de hueso. Excepto en conejos enfermos o con algún déficit no se recomienda dar suplementos minerales 20, 21, 24, 33, 35. 1.5.2.1 Composición mineral de tejidos corporales de animales El contenido de minerales biogénicos en animales y los tejidos animales es bastante constante, en condiciones normales, y los valores medios de estos parámetros (en consideración de la especie, edad y el estado fisiológico de los animales) pueden servir 18 como material inicial para la determinación de los recursos minerales y la adecuada o no suplementación mineral (Cuadro 5)36. Cuadro 14 Composición mineral de los cuerpos de los animales adultos (contenidos en 1 kg de tejido sin grasa cruda) 36 . Elemento Ganado Cerdos Perros Conejos Pollos Sodio (mEq) 69 65 69 58 51 Potasio (mEq) 49 72 65 72 69 Cloro (mEq) 31 40 43 32 44 Calcio (g) 18 12 15 13 13 Fosforo (g) 10 7.0 8.2 7.0 7.1 Magnesio (g) 0.41 0.45 0.4 0.5 0.5 Hierro (mg) 170 60 69 60 60 Zinc (mg) 40 25 35 50 30 Cobre (mg) 2.0 2.5 2.5 1.5 1.5 Yodo (mg) 0.15 0.3 0.7 0.5 0.4 La edad es el principal factor que influye en la composición química de los animales. Las concentraciones de Ca, K, P Mg, Zn y Mn están elevadas en animales adultos y recién nacidos. Mientras que para Na, Cl, Fe (en algunas especies), Cu, I y Mo disminuyen. Hay poco cambio en las concentraciones de cobalto (Cuadro 6)36. Cuadro 15 Composición mineral de los cuerpos de los animales recién nacidos (contenidos en 1 kg de tejido sin grasa cruda) 35 . Elemento Ganado Cerdos Perros Conejos Pollos Sodio (mEq) 80 93 81 78 83 Potasio (mEq) 49 50 58 53 56 Cloro (mEq) 52 52 60 56 60 Calcio (g) 12 10 4.9 4.8 4 Fosforo (g) 7 5.8 3.9 3.6 3.3 Magnesio (g) 0.31 0.32 0.17 0.23 0.3 Hierro (mg) 100 29 40 135 38 Zinc (mg) 30 10.1 20 22.5 12 Cobre (mg) 3.5 3.2 3.3 4 2.8 Yodo (mg) 0.25 0.4 0.7 0.6 0.5 Existe un número muy grande de interacciones entre minerales. En general estas interacciones pueden ser antagonicas o sinérgicas. Muchas interacciones minerales 19 son antagonicas y pueden ocurrir numerosos mecanismos que incluyen interacciones en el procesamiento de alimentación, en el tracto digestivo donde hay competencia por su captación a nivel intracelular, a nivel tisular interviniendo actividad enzimática, en el tiempo de transporte y en el recorrido de excreción 24. 1.6.- Aspectos fisiológicos y anatómicos del pelaje. El pelo es un carácter diagnóstico de los mamíferos, tiene varias funciones entre las que destacan el aislante térmico e hídrico, camuflaje y protección contra depredadores. El pelo comienza su desarrollo en el estrato germinativo de la epidermis, proyectándose hacia la dermis. Se forman dos papilas, una superior que dará origen a la glándula sebácea y una inferior que da origen al folículo piloso. Esta segunda proyección de la epidermis hacia la dermis (mesodermo) es invadida por células mesenquimatosas que forman los vasos sanguíneos, que nutrirán el pelo permitiendo su crecimiento y desarrollo. También se incluyen melanocitos, que serán los encargados de proporcionar la coloración del pelo (melanina). Alrededor del pelo la capa germinativa de la dermis se transforma en una vaina epidérmica y justo debajo de esta se coloca una vaina dérmica de células mesenquimatosas. A un lado las células de la vaina dérmica forman una proyección que se diferencia en fibras musculares y se convierte en el músculo erector del pelo. El desarrollo del pelo es similar al de la epidermis teniendo células germinativas que dan origen a células que producen queratina y aceptan melanina de los melanocitos (células del mesodermo que producen melanina). Conforme se alejan de la capa germinativa,por aparición de nuevas capas de células debajo de ellas, se van aplanando para posteriormente morir dejando una estructura en forma de lámina compuesta por queratina y coloreada por gránulos de melanina, todo fuertemente adherido entre una lámina y otra, formando un tejido córneo muy resistente. En la estructura de un pelo típico se encuentra un tallo 20 externo y la raíz, que está situada dentro de una depresión de la dermis llamada folículo piloso. La raíz está compuesta por una porción proximal e intermedia y el tallo se divide en espátula y punta. El tallo transversalmente incluye tres capas: 1) la médula, ubicada en la parte central del pelo, la cual consiste de células queratinizadas unidas y está presente solo en pelos gruesos y puede tener espacios de aire; 2) la corteza, que es el componente principal del tallo y rodea a la médula. Las células de la corteza están compactadas, queratinizadas y fuertemente adheridas entre sí, en esta capa se concentra la mayoría de los gránulos de pigmento y, 3) la superficie o cutícula, donde se puede encontrar un grupo de células adheridas o separadas, dispuestas en escamas, a las que se les denomina escamas cuticulares. Los pelos del cuerpo que se ubican en la parte externa se encuentran clasificados en tres grupos: pelos de guardia, pelos de bajo manto o bajo piel y las vibrisas37. 1.6.1 Factores alimenticios que afectan el crecimiento del pelo y de calidad Los folículos pilosos son los tejidos metabólicamente activos que requieren de nutrientes para apoyar actividades tanto estructurales como funcionales. Como tal, la nutrición tiene un efecto importante en su calidad y cantidad. La mala nutrición puede reflejarse en la coloración del cabello, cabello quebradizo, o delgado, también se puede presentar trastorno pigmentario. Los factores nutricionales que influyen en el crecimiento del pelo son muy complejos y pueden estar correlacionados con las deficiencias de proteínas, fósforo, yodo, zinc, y vitaminas A y E, así como excesos en la dieta de selenio, yodo y vitamina A. Otros desequilibrios nutricionales que pueden afectar el crecimiento del cabello incluyen vitamina B y vitamina C, el cobre y las deficiencias de cobalto, molibdeno y toxicosis37. 21 II.- ANTECEDENTES 2.1.- Estado de conservación e investigación del conejo de los volcanes. Los conejos de los volcanes se encuentran actualmente amenazados y enlistados en el Apéndice I de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES por sus siglas en inglés), así como en la Lista Roja de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN por sus siglas en inglés) y protegido por la Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL- 2001 como especie en peligro de extinción. Por sus peculiaridades, el conejo de los volcanes es una especie que ha despertado gran interés entre los investigadores que buscan conservarla y estudiarla 9 38. Se han realizado diversos intentos para establecer colonias en cautiverio en el extranjero, manteniéndose en México en la Facultad de Ciencias de la UNAM (1979-80); en la Estación Ecológica de San Cayetano (1989) y en el zoológico de Zacango (1982, 2001), ambos en el estado de México; y en el zoológico de Chapultepec (1984) y zoológico Los Coyotes (2003), siendo los últimos dos que hasta la fecha han mantenido sus colonias viables a largo plazo (anexo 1.1.3) 1,9. La Dirección General de Zoológicos y Vida Silvestre del Gobierno del Distrito federal (DGZVS), junto con otras instituciones, ha impulsado la conservación y estudio del conejo de los volcanes, por medio de proyectos conjuntos, tanto en cautiverio como en campo, demostrando que su alimentación es basada principalmente de especies de pastos identificadas como Festuca amplissima, E rosei, Muhlenbergia macroura y Stipa ichu, mientras que otras evidencias de campo sugieren que también consumen las semillas de la enredadera anual (Sicyos parvijlorus) y que se alimentan de campos de cultivo, consumiendo las plantas jóvenes de maíz (Zea mayz), avena (Avena sativa), papa (Solanum tuberosum), chícharo (Pisum sativum) y haba (Vicia faba), sin 22 embargo, el consumo de estas especies varía de un lugar a otro 3, 5, 11,14,16, 18. En relación a estos estudios y la semejanza con el conejo doméstico, el conejo de los volcanes se ha adaptado a diferentes alimentos existentes en su hábitat; manteniéndose a base de zanahoria, alfalfa, lechuga, espinaca, manzana y pera16. Se tienen datos que existen colonias mantenidas con una alimentación constituida en zanahoria (Daucus carota L.), alfalfa fresca (Medicago sativa) y alimento peletizado comercial para conejo, además de la administración periódica de calcio y vitamina D 39, 40, 41.. A partir de estas dietas de mantenimiento en cautiverio se ha realizado la evaluación de concentración de los nutrimentos aportados en ella, evaluándose los minerales contenidos no solo en los ingredientes si no también se han evaluado en hígado, hueso, riñón y pelo recolectados en cadáveres de la colección del zoológico de Chapultepec, siendo uno de los primeros registros de minerales en estos animales, valores mostrados en el Cuadro 7 42. Cuadro 16 Valores de minerales descritos por Trillanes en varios órganos en el conejo de los volcanes, en base seca. 23 2.2.- Desarrollo de métodos no invasivos y rápidos para el análisis de evaluación de componentes nutricionales y tóxicos en animales. El control de la valoración clínica y nutricional en animales se ha realizado analizando muestras obtenidas de manera directa (orina, sangre, leche) en unidades de producción y clínicas cuando se refiere a animales domésticos, o en tal motivo al muestreo directo mediante la contención física o química al hablar de animales silvestres, lo que en su mayoría implica no solo un estado de estrés animal si no un riesgo de la integridad del mismo. Para términos muy parecidos estas prácticas se han realizado a nivel de toxicología en órganos, secreciones y contenido digestivo de muestras de animales en necropsias. Las técnicas de biomonitoreo para el control biológico, como suelen ser llamadas, son métodos de análisis para cualquier carácter 24 de ser vivo determinado para permitir la carga de las fracciones biodisponibles de los elementos ya sea en forma de contaminantes o componentes bioacumulables43. Los biomonitoreos incluyen técnicas invasivas (sangre y tejidos u órganos internos) y no invasivas (vías de excreción, orina y queratina; pelo y las uñas) 43, 44. El pelo ha sido utilizado preferentemente debido a que los elementos permanentemente se depositan en el cabello a medida que crece y se suministran por la sangre44, 45. Para ello, los bioacumulables contenidos en el pelo son el reflejo de la exposición prolongada a la sustancia tóxica o nutricional ya sea su caso respectivo. Por el análisis de sangre u orina, es posible evaluar los niveles específicos actuales 43, 45 46. Se han reportado concentraciones de vitaminas hidrosolubles analizadas en el pelo influenciado por la dieta, en los cuales se han reportado mediciones de niacina, ácido pantoténico y riboflavina en pelo de ratones y humanos47. Una nueva aproximación para la detección y control de estas prácticas puede ser el análisis de pelo o bien el HTMA por sus siglas en ingles Análisis Mineral en Tejido y Pelo. Esta matriz presenta ciertas ventajas frente a las matrices convencionales, ya que además de ofrecer una fácil manipulación, almacenaje y transporte, proporciona un periodo útil de detección más amplio. Este análisis se ha utilizado en medicina forense, toxicología y en medicina del deporte para controlar el consumo de drogas de abuso y de agentes dopantes. En pelo humano se han detectado más de un centenar de compuestos, fundamentalmentedrogas de abuso, agentes anabolizantes y psicofármacos así como en el de algunos animales de producción y de carreras48. En los últimos años, se han realizado trabajos tanto en medicina humana y en medicina veterinaria observando la relación de los nutrientes aportados en el alimento con la interacción que tienen en el organismo y la concentración de estos en pelo en algunas especies, como es el caso de monos saraguatos y en sangre y pelo en caballos 49. 25 2.2.1 Análisis de vitaminas en la aplicación médica. La Association of Official Analytical Chemist ha recomendado la determinación de vitaminas del complejo B mediante métodos microbiológicos, espectrofotométricos y fluorométricos. La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) ha sido la principal vía de análisis de las mezclas de vitaminas y más recientemente, la electroforesis capilar ha sido empleada para llevar a cabo la separación de mezclas de vitaminas. Los detectores flluorométricos y espectrofotométricos acoplados a CLAR han sido empleados para el análisis de las vitaminas B1, B2, B6,B12. La técnica de CLAR provee un fácil, rápido y preciso método cuantitativo de determinación de diversos componentes, como lo son en su caso las vitaminas hidrosolubles, el método de CLAR provee la ventaja de la medición de diversos componentes de manera simultánea en una sola prueba 50 51. 2.2.1.1 Análisis de vitaminas por cromatografía. La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es distribuida entre dos fases inmiscibles (sólida, líquida o gas), una estacionaria y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. La separación se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un sólido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria líquida. También se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un sólido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografía se basan en los mismos principios 26 fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografía en columna, en papel y de capa fina 52 53. La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. Para las técnicas cromatografías en la evaluación de vitaminas se requiere la precipitación de la muestra, que permita separar o extraer los componentes a evaluar empleando la centrifugación de las muestras y la dilución con ciertas soluciones. La evaluación en CLAR requiere la exposición fluorimétrica 52 53. Técnicas cromatográficas para la vitamina B1 La concentración de tiamina puede ser evaluada en dos enfoques complementarios: (1) la determinación de la tiamina y de sus ésteres fosfóricos en los eritrocitos o en la sangre total u otros tejidos por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y (2) la determinación de la actividad de transcetolasa eritrocitaria. La separación de la tiamina no fosforilada y sus ésteres fosfato es mediante el uso de CLAR de manera isocrática, empleando la detección fluorimétrica. Estas técnicas permiten evaluar de una manera sensible y específica el estado de la tiamina, sino también para determinar una fosforilación anormal de tiamina27. Técnicas cromatográficas para la vitamina B2 Los métodos empleados son la fluorimétrica directa, técnicas microbiológicas y determinación por métodos cromatográficos. En los cuales se realiza la valoración de vitamina B2 o de sus vitameros (los cuales son vitaminas que se encuentran enmas de 27 una estructura química, asi tal como la riboflavina o flaviadenina dinucleotido) pero también de la medición de la actividad de la glutatión reductasa de los hematíes27. Pueden ser empleadas muchas de las técnicas cromatográficas (por intercambio iónico, de afinidad, exclusión), pero la cromatografía líquida de alta resolución se recomienda en la actualidad 54. Técnicas cromatográficas para la vitamina B6 El empleo de técnicas de CLAR ha permitido la identificación con éxito de la vitamina B6 y de los diferentes vitameros en la sangre, el plasma y el suero. La detección fluorimetrica es exclusivamente utilizado en el CLAR debido a su selectividad y su sensibilidad. En el 2004, Pfeiffer describe una técnica de derivación utilizando una post-columna para la determinación de la vitamina B6 en el suero por CLAR en fase reversa con detección fluorimétrica 27. Técnicas cromatográficas para la vitamina B12 Existen tres tipos de medición de la vitamina B12, los métodos microbiológicos, la medición por competencia con un ligando marcado, la dosis específica de vitameros con separación cromatográfica de capa fina o por CLAR 27. Técnica cromatográficas para la vitamina C Muchos métodos analíticos incluyendo sensores y biosensores han sido aplicados a la detección de ácido ascórbico en variedades de muestras. La cromatografía de líquidos ha sido aplicada con detectores fluorimetricos y con el empleo de acetonitrilo como solvente en la fase móvil 27. 2.2.2 Pruebas de medición de minerales. El análisis de minerales por diversos espectroscopios y diversos métodos es un procedimiento de evaluación estandarizado usado en laboratorios y universidades 28 alrededor del mundo. Se tienen consideradas 3 clasificaciones de los elementos minerales a evaluar en los laboratorios 45 46 48 55: Macrominerales como el calcio, magnesio, sodio, potasio y fosforo. Minerales traza como el hierro, zinc cubre, manganeso, selenio, cromo, boro y otros. Minerales tóxicos, incluyendo plomo, mercurio, cadmio, arsénico, aluminio níquel y quizás otros elementos como uranio y berilio. 2.2.2.1 Evaluación del pelo como indicador de elementos minerales. El análisis de minerales en pelo facilita una medición de los elementos químicos depositados entre las células y las células del pelo. Esto provee una lectura del depósito de los minerales en el pelo durante 3 a 4 meses durante el cual el pelo crece. Unos 20 elementos pueden ser medidos dependiendo el laboratorio. La significancia de muchos otros minerales en el pelo y en la fisiología humana no es muy bien entendible. La evaluación mineral del pelo en poblaciones de humanos y animales ha sido retomada por 50 años 55. 2.2.2.2 Análisis de minerales por espectroscopia. Los métodos de análisis incluyen la espectroscopia de absorción atómica (AA), el plasma de acoplamiento inductivo (ICP), la espectroscopia de masas y el horno de grafito. La mayoría de los laboratorios utilizan un ICP o el instrumento de espectroscopia de masas más reciente. Esencialmente, la muestra disuelta se quema a una temperatura alta. Cada mineral emite un espectro característico o frecuencias de la luz, que es recogido por los detectores sensibles en el instrumento de medición. Calibración y control preciso de la temperatura de la llama son esenciales para obtener lecturas precisas. 29 III.- JUSTIFICACIÓN El análisis de la evaluación nutricional de la fauna silvestre constituye una herramienta de gran valor en las poblaciones, ya sea en libertado mantenidas en cautiverio, este análisis permite conocer el estado de salud, asegurar la supervivencia y mejorar la calidad de vida. Por tal motivo, es necesario, buscar métodos no invasivos que permitan determinar las concentraciones de nutrimentos depositados en varios componentes del organismo, con la finalidad de considerar el estado de salud de los conejos de los volcanes en cautiverio. IV.- OBJETIVOS 4.1.- Objetivo General Conocer las concentraciones de los nutrimentos y metabolitos en las diferentes muestras (alimento, pelo, heces y sangre), mediante su medición en el conejo de los volcanes (Romerolagus diazi), en cautiverio. 4.2.- Objetivo Específicos En los conejos de los volcanes alojados por la Dirección General de Zoológicos y Vida Silvestre (DGZVS), en las instalaciones del Zoológico de Chapultepec: 1.- Determinar el contenido nutricional de la dieta proporcionada, así como la digestibilidad aparente y el consumo de la misma. 2.- Determinar vitaminas hidrosolubles y minerales en pelo y el suero sanguíneo. 3.- Interpretar la concentración de los nutrimentos y metabolitos determinados en pelo, a partir de las concentraciones encontradas en suero sanguíneo, con ayuda de una regresión. 4.- Determinar los componentes nutricionales de las heces. 30 HIPOTESIS La concentración de los nutrimentos encontrados en diferentes componentes del individuo, están correlacionados con la concentración de nutrimentos consumidos a partir de la dieta. El estado nutricional de los conejos de los volcanes puede ser interpretado mediante la medición de la concentración de los nutrimentos en pelo y en suero sanguíneo, mediante un análisis de regresión, esperando que exista una semejante a las concentraciones encontradas en los conejos domésticos (Oryctolagus cuniculi). V.- MATERIAL Y MÉTODOS Este trabajo de Investigación se llevó a cabo en el Zoológico de Chapultepec de la Ciudad de México “Alfonso L. Herrera”, perteneciente a la Dirección General de Zoológicos de la Ciudad de México, Gobierno del Distrito Federal, presentándose en este sitio, la fase de recolección de muestras que llevó un plazo de 21 días. Su localización esta a 19°24’ N latitud, 99° 11’ O longitud y a 2250 m sobre el nivel del mar. El tipo de clima predominante es C(w) templado sub-húmedo con lluvias en verano, la temperatura media es de 15.4°C, y la precipitación promedio anual es de 769.2 mm 17, 21. Se midió la temperatura ambiental del cuarto durante esta etapa. La fase de análisis de componentes nutricionales, se llevó a cabo en los laboratorios de Bromatología y Toxicología del Departamento de Nutrición Animal y Bioquímica el laboratorio de Farmacología, ambos de la FMVZ, UNAM. 5.1.- Población de estudio. Se empleó una población muestral de 11 machos y 11 hembras, adultos (6 meses) con un peso de 450 a 860 g, clínicamente sanos, pertenecientes a la colonia de conejos de los volcanes de la DGZVS. El manejo de la población de estudio se realizó de la forma 31 en la que se lleva a cabo normalmente en la misma colonia, siguiendo las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio (NOM -062-ZOO-1999, anexo 1.1.4). Se excluyeron a los individuos con signos o conductas no deseadas que pudieron alterar los resultados de la investigación retirándolos durante la fase experimental. Para catalogarlos como clínicamente sanos se realizó un examen físico general en el cual se revisó su aspecto realizando una palpación externa y se evaluaron sus constantes físicas, considerándose sanos. 5.2.- Alojamiento. Los conejos de los volcanes que se utilizaron se encontraban alojados en jaulas individuales, tipo batería, de alambre galvanizado de aproximadamente 40 cm. de ancho por 35 cm. de alto y 57 cm. de largo dentro de las instalaciones de la colonia del Zoológico de Chapultepec “Alfonso L Herrera” con aprovisionamiento de comedero y bebedero. Todas las baterías se localizan dentro de un cuarto techado y con piso de concreto. Este cuarto fue diseñado dentro del albergue del conejo de los volcanes del zoológico, que cuenta además, con un exhibidor y tres encierros al aire libre. Para la realización del trabajo se le incorporaron unos marcos con malla de 1 milimetro de diámetro en los pisos de cada jaula esto con el objetivo de permitir la colecta total de heces y alimento y evitar contaminaciones con orina. 5.3.- Dieta. Los animales fueron alimentados con la dieta aprobada por la DGZVS, la cual consiste en alfalfa fresca verde en manojo (100 g), zanahoria (60 g) y alimento comercial balanceado (40 g). Este alimento se proporcionó de forma ad libitum, pesando cada uno de los ingredientes al ofrecer, realizando este proceso todos los días por las mañanas. A todos los animales se les proporcionó agua limpia y fresca de manera ad libitum (anexo 1.1.5). 32 5.4.- Toma de muestras. Se consideraron las siguientes actividades contempladas a lo largo de los 21 dias del trabajo de campo, expuestas en el Cuadro 8. Cuadro 8 Resumen de recolección de muestras. PERIODO DÍAS DE ESTUDIO MUESTRAS OBTENIDAS FORMA DE OBTENCIÓN ELEMENTOS DETERMINADOS 1 del día 1 al 7 ALIMENTO Se obtuvieron diariamente, cantidades de 100 g de alfalfa fresca, 60 g de Zanahoria y 40 g de alimento balanceado del alimento ofrecido ELEMENTOS MINERALES VITAMINAS HIDROSOLUBLES 2 del día 8 al 14 ALIMENTO Obtención de muestras y pesaje del alimento ofrecido diariamente. ELEMENTOS MINERALES Pesaje del alimento rechazado al día VITAMINAS HIDROSOLUBLES SUERO SANGUÍNEO El día 8 se recolecto de 1.5 a 3 mL de sangre completa, por la vena safena. ELEMENTOS MINERALES VITAMINAS HIDROSOLUBLES HECES Pesaje y recolección de las heces producidas diariamente ELEMENTOS MINERALES VITAMINAS HIDROSOLUBLES 3 del día 14 al 21 ALIMENTO Obtención de muestras y pesaje del alimento ofrecido diariamente. ELEMENTOS MINERALES Pesaje del alimento rechazado al día VITAMINAS HIDROSOLUBLES SUERO SANGUÍNEO El día 8 se recolecto de 1.5 a 3 mL de sangre completa, por la vena safena. ELEMENTOS MINERALES VITAMINAS HIDROSOLUBLES HECES Pesaje y recolección de las heces producidas diariamente ELEMENTOS MINERALES VITAMINAS HIDROSOLUBLES 5.4.1.- Muestreo de sangre y pelo. Se realizaron los muestreos de sangre completa y pelo de cada individuo, el día 8 y el día 21 con el objetivo de evitar la tensión de los conejos de los volcanes. La toma de muestras sanguíneas y de pelo se realizó mediante la colaboración del médico 33 responsable, con la metodología de manejo y recolección de muestras que se lleva a cabo por la DGZVS, realizando una contención química por anestesia inhalada con isoflurano al 5 % para inducción y 2.5 % de mantenimiento. La recolección de pelo fue de manera directa mediante la extracción obtenida en la región del dorso en dirección craneal a caudal, obteniendo preferentemente 1 g de pelo del animal por muestreo, tomando en cuenta el contenido de pelo muerto posible en la muestra. Para esto se contempló el proceso de cambio de pelo, el cual consiste en la despigmentación melaninica de la piel y facilita la obtención de pelo y folículo piloso de manera directa en la extracción, reportado por Romero en 1994 9 (anexo 1.1.6). La recolección de sangre fue realizada a partir de la punción de la vena safena extrayendo 3 mL de sangre por animal con la ayuda de una jeringa de 5 mL (anexo 1.1.7). Para esto se realizaron varias pruebas piloto para asegurar el manejo del animal y la obtención adecuada de la muestra, además de realizar disecciones de la vena con cadáveres del área de patología, debido a nulos reportes de obtención de estas cantidades de sangre para dicha especie (anexos 1.1.8 y 1.1.9). La sangre fue almacenada en tubos vacutainers de 3 mL sin anticoagulante conservandola
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