Oxidacion-de-dibenzotiofeno-por-cloroperoxidasa-de-Caldariomyces-fumago-en-un-reactor-de-membrana

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
OXIDACION DE DIBENZOTIOFENO POR CLOROPEROXIDASA DE 
CALDARIOMYCES FUMAGO EN UN REACTOR DE MEMBRANA 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
INGENIERO QUÍMICO 
 
PRESENTA 
 
CARLOS ENRIQUE MONTERO MONDRAGÓN 
 
 
 
 
 
 
 
MEXICO, D.F. 2008 
Neevia docConverter 5.1
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
Jurado asignado: 
 
Presidente Prof. Luis Cedeño Caero 
Vocal Prof. Tatiana Eugenievna Klimova Berestneva 
Secretario Prof. Jorge Arturo Aburto Anell 
1er suplente Prof. María de los Ángeles Vargas Hernández 
2º suplente Prof. Juvenal Flores de la Rosa 
 
 
Sitio donde se desarrolló el tema: Instituto Mexicano del Petróleo 
 
 
 
 
Sustentante: Carlos Enrique Montero Mondragón. 
 
 
 
Director de la tesis: Jorge Arturo Aburto Anell 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 
 
Justo al terminar este trabajo de investigación, me he dado cuenta que no es el final de 
mi preparación profesional, ahora viene mi verdadero reto, ser un ingeniero productivo para 
la sociedad. En este momento de incertidumbre política y económica, es imprescindible que 
todos los profesionistas saquemos al país adelante, nos toca luchar contra la vida misma, 
combatir con nuestras mentes y talentos para procurar una vida mejor a los que vienen 
después de nosotros. Y no podría ser de otra manera, pues al ser parte de esta, nuestra 
máxima casa de estudios, soy parte también de un país y una sociedad, que colaboran con la 
formación de todos y cada uno de los profesionistas que de esta universidad egresan. 
En este grandioso país me tocó vivir, con gente que siempre me apoyó, que creyeron en 
mi. Ahora que he completado una etapa, puedo voltear a mi alrededor y agradecerle a todos 
aquellos que tuvieron una influencia directa o indirecta sobre mi formación, a todos los que se 
cruzaron en mi camino y me hicieron ser la persona en que me he convertido, ahora puedo 
comprometerme a regresar, en buena medida, algo de lo que se me ha otorgado, 
comprometerme, también, con mi familia, para sacarla adelante y procurarle un buen nivel de 
vida y, así, aportar mi granito de arena para que este país y este mundo sean mejores cada 
día. 
 
Por mi raza hablará el espíritu. 
 
I. Q. Carlos Enrique Montero Mondragón. 
 
 
Neevia docConverter 5.1
Dedicatorias 
A mi padre, José, el mejor legado que alguien puede dejarle a su hijo, la educación y no 
solo la académica; gracias porque tú has sabido ser ese modelo y apoyo que necesité, siempre 
que hacia algo bueno o malo, tú estabas allí para notarlo, para decir la palabra justa, para 
enderezar mi camino. Tus enseñanzas, consejos y atenciones, siempre estarán presentes en mi 
mente. 
A mi madre, María del Carmen, por tu amor y apoyo incondicional, porque lo mejor de 
mi, mis principios y valores, te los debo a ti, por tu sencillez y calidad humana, por tus 
regaños, que tantas veces me hicieron recapacitar, por las desmañanadas juntos y por siempre 
tener una palabra de aliento cuando era necesaria. Tú eres mi fortaleza. 
A mis hermanos Alfredo y Rodrigo. Alfredo, cuando volteo a recordar mi infancia, 
siempre te encuentro a ti, nuestros juegos y nuestras peleas, tantos buenos y malos recuerdos 
que, sin duda, definieron mi amor a mi familia, gracias por enseñarme, por retarme y por 
ponerme parámetros tan altos, sin tu ejemplo no se en donde estaría. Rodrigo, además de mi 
hermano, siempre fuiste mi cómplice y mi amigo, crecer a tu lado y compartirte mis 
aprendizajes me enseñaron mucho de la vida, gracias por el apoyo y el cariño a los dos. 
A Angelita, justo al comenzar esta aventura, la vida te puso en mi camino, ahora no 
solo eres mi compañera y mi confidente, eres quien me da la motivación extra, la alegría, la 
luz, los enojos y las tristezas; sin ti nada de esto hubiera sido igual. Gracias por todos los 
momentos junto a mí, por recordarme a cada momento que esto no termina aquí, por hacerme 
parte de tus planes y tu historia. Por enseñarme tantas y tantas cosas, has sido mi mejor 
maestra de la vida. Te amo! 
 
Este logro es, en gran parte, de todos ustedes!!! 
 
Neevia docConverter 5.1
Agradecimientos. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, por hacerme parte de su 
grandeza y majestuosidad, estudiar, o más bien, vivir en su campus ha sido la más 
grande experiencia. 
A la facultad de química, si tus muros y espacios hablaran… En tus aulas dejo 
gran parte de mí y, a cambio, me llevo mucho más de ti. 
A mi asesor, el Dr. Jorge Aburto, por el tiempo, la paciencia y amabilidad para 
guiar mi trabajo; en ciertos momentos hizo mas de lo que le tocaba, gracias por 
compartirme sus conocimientos y experiencia. 
Al Instituto Mexicano del Petróleo, por el apoyo logístico que este trabajo 
implicó. 
A Tatiana Klimova y a Luis Cedeño por sus oportunas correcciones, anotaciones 
y comentarios acerca de este trabajo. 
A todos mis amigos durante mi estancia en la FQ; Mina, los verdaderos amigos 
te escuchan y te entienden; Montse, apoyo y ánimo hasta en los momentos difíciles; 
Valeria, tu amistad y ejemplo me ayudaron mucho, Paulina, siempre un comentario 
agudo y además gracioso; Paty, amistad y perseverancia, a pesar de todo. A los y las 
inges futboleros y reventados, que no quiero nombrar a alguno para que no se me escape 
alguien, qué hubiera hecho sin ustedes?. Al equipo de experimenta-ciencia, Ana, 
Guillermo y Glinda, aprendí mucho de ustedes; Elena, Moy, Inés, excelentes 
compañeros y mejores amigos; Rosita, gracias por el apoyo, eres increíble; Angeles, 
bueno, tú mereces mención aparte. Y a todos los viejos amigos, que por diferentes 
circunstancias, nos distanciamos pero no nos olvidamos. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO I 
 
Contenido 
Índice de Figuras y gráficas III 
Índice de Símbolos y Abreviaturas V 
Resumen 1 
Introducción 3 
I. Antecedentes 5 
I.1 Combustibles limpios en México y calidad del aire 6 
I.2 Compuestos azufrados 11 
I.3 Hidrotratamiento 14 
I.4 Catalizadores para HDT 17 
I.5 Enzimas 18 
I.5.1 Nomenclatura y clasificación 19 
I.5.2 Cocatalizadores. 21 
I.5.3 Activadores 23 
I.5.4 Inhibidores 23 
I.6 Cinética de las Reacciones Enzimáticas 24 
I.6.1 Centro activo de una enzima 28 
I.6.2 Actividad enzimática 28 
I.6.3 Factores que influyen en la velocidad de las reacciones 
enzimáticas 29 
I.6.4 Inhibición Enzimática 30 
I.6.5 Mecanismo de acción enzimática. 31 
I.7 Peroxidasas 34 
I.8 Cloroperoxidasas 36 
Objetivos 39 
Hipótesis 39 
II. Metodologías y desarrollo 40 
II.1 Materiales 41 
II.2 Determinación de la oxidación de DBT por CPO en medio monofásico 
en reactor intermitente 42 
II.3 Determinación de la oxidación de DBT por CPO en medio monofásico 
en CSTR de membrana 44 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO II 
 
II.4 Aplicación de la técnica a una muestra real de diesel 46 
III. Resultados y discusión 48 
III.1 Oxidaciónde DBT por CPO en medio monofásico en reactor 
intermitente 49 
III.2 Oxidación de DBT por CPO en medio monofásico en CSTR de 
membrana 56 
III.3 Aplicación de la técnica a una muestra de diesel 61 
Comparación de los parámetros cinéticos 67 
Conclusiones 69 
IV. Apéndices 71 
A1.1 Curvas de calibración 72 
A1.2 Resultados de curvas de calibración 72 
A2.1 Actividad específica 74 
A2.2 Resultados de actividad especifica 74 
A3.1 Método HPLC 77 
A3.2 Método del CG con detector de Nitrógeno 79 
A3.3 Método del CG con detector de Azufre 80 
V. Referencias 81 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO III 
 
Índice de Figuras y gráficas 
 
Figuras: 
Ilustración 1. Tendencias mundiales de contenido de azufre en combustibles ..... 8 
Ilustración 2. Compuestos azufrados presentes en el diesel y su resistencia al 
hidrotratamiento ........................................................................................12 
Ilustración 3. Diagrama de flujo de un proceso HDT tradicional .......................15 
Ilustración 4. Esquema Ultradeep HDT con adsorción .....................................16 
Ilustración 5. Desarrollo en la actividad de los catalizadores ............................18 
Ilustración 6. Velocidad de reacción catalizada enzimáticamente ......................25 
Ilustración 7. Energía de activación de una reacción enzimática ......................33 
Ilustración 8. Grupo hemo de la CPO. (Wang et al. 2003) ...............................34 
Ilustración 9. Cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago (figura generada con 
MacPyMOL, W.L. DeLano) ...........................................................................36 
Ilustración 10. Esquema de montaje del reactor y reactor ...............................44 
Ilustración 11. HPLC utilizado ......................................................................78 
Graficas: 
Gráfica 1. Avance de la reacción. Lote 1 .......................................................49 
Gráfica 2. Avance de la reacción. Lote 2 .......................................................50 
Gráfica 3. Avance de la reacción. Lote 3 .......................................................51 
Gráfica 4. Avance de la reacción: Lote 4 .......................................................52 
Gráfica 5. Comparación de avance de la reacción por lotes .............................53 
Gráfica 6. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 2 ..........................................................54 
Gráfica 7. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 3 ..........................................................54 
Gráfica 8. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 4 ..........................................................54 
Gráfica 9. Avance de la reacción. Continuo 1 .................................................56 
Gráfica 10. Avance de la reacción. Continuo 2 ...............................................58 
Gráfica 11. Tiempo vs ln (at/a0) CSTR 1. τ= 43 min.......................................59 
Gráfica 12.Tiempo vs ln (at/a0) CSTR 2. τ= 2 min .........................................59 
Gráfica 13. Cromatogramas para nitrogenados a diferentes tiempos de 
operación. ................................................................................................62 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO IV 
 
Gráfica 14. Comparación de zonas de retención. ............................................64 
Gráfica 15. Cromatogramas de azufre a diferentes tiempos de reacción. ...........65 
Gráfica 16. Concentración de azufre y nitrógeno en diesel ..............................65 
Gráfica 17. Tiempo vs ln (at/a0) Diesel ..........................................................66 
Gráfica 18. Curva de calibración DBT ............................................................73 
Gráfica 19. Curva de calibración DBTS ..........................................................73 
Gráfica 20. Actividad específica de la CPO con respecto al DBTS ......................76 
Gráfica 21. Actividad específica DBT .............................................................77 
 
Tablas: 
Tabla I. Especificaciones de las gasolinas en México ........................................ 7 
Tabla II. Especificaciones del diesel en México ................................................ 8 
Tabla III. Composición típica del petróleo .....................................................11 
Tabla IV. Velocidades de reacción de los diferentes compuestos azufrados 
presentes en el petroleo .............................................................................12 
Tabla V. Condiciones de operación para diferentes procesos de eliminación de 
azufre ......................................................................................................13 
Tabla VI. Reacciones comunes en el Hidrotratamiento ....................................14 
Tabla VII. pH óptimo de diferentes enzimas ..................................................30 
Tabla VIII. Comparación entre las energías de activación de una reacción 
catalizada enzimáticamente. .......................................................................32 
Tabla IX. Peroxidasas hemo y su función biológica .........................................35 
Tabla X. Actividad en la CPO de Caldariomyces fumago ..................................38 
Tabla XI. Constante de inactivación y tiempo de vida media por lotes ..............55 
Tabla XII. Constante de inactivación y tiempo de vida media del CSTR a dos τ. .60 
Tabla XIII. Parámetros cinéticos para la reacción con diesel ............................67 
Tabla XIV. Comparación de las constantes cinéticas .......................................68 
 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO V 
 
Índice de Símbolos y Abreviaturas 
a0 Actividad enzimática inicial (tiempo 0) 
at Actividad enzimática en cualquier tiempo 
Bw Ancho de banda (Bandwidth) 
CG Cromatografía de gases 
CoMo Cobalto - Molibdeno 
CPO Cloroperoxidasa 
CSTR Reactor continuo de tanque agitado (continuos stirred tank reactor) 
Da Dalton 
DBT Dibenzotiofeno 
DBTS Dibenzotiofeno sulfona 
HDT Hidrotratamiento 
HPLC Cromatografía de líquidos de alto desempeño 
ki Constante de inactivación 
km Constante de Michaelis 
NiMo Níquel - Molibdeno 
NPD Detector de fosforo y nitrógeno (Nitrogen Phosporus Detector) 
t ½ Tiempo de vida media de la enzima 
Vmax Velocidad máxima de reacción 
τ Tiempo de residencia 
Prefijos 
m Mili 
n Nano 
μ Micro 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 1 
 
El petróleo y sus productos contienen una gran cantidad de compuestos no 
deseados de azufre y de nitrógeno, que generan gases altamente 
contaminantes durante su combustión. Estos compuestos se eliminan 
durante el procesamiento del petróleo a través del Hidrotratamiento, 
proceso en el que se saturan las moléculas de hidrocarburos, para que el 
azufre y los demás componentes no deseados se eliminen de las corrientes 
de proceso. Este tratamiento no resulta ser del todo efectivo, pues los 
combustibles que se usan comúnmente contienen aun compuestos de 
azufre que causan una gran contaminación al ser quemados y expulsados 
a la atmósfera. Uno de estos compuestos es el DBT, que es un compuesto 
recalcitrante al HDT. 
En las últimas fechas se ha producido una tendencia mundial a ser más 
estrictos en cuanto a las especificaciones del diesel. La meta en estos 
cambios es reducir la cantidad de partículas suspendidas, los compuestos 
de nitrógeno y de azufre producto de las emisiones de los vehículos que 
utilizan este combustible. 
Resumen 
Con el fin de obtener este subproducto del petróleo, con las 
especificaciones requeridas, se ha llevado a cabo un esfuerzo mundial para 
el desarrollo de mejoras y de nuevas tecnologías para el hidrotratamiento. 
Gran parte de estos desarrollos se espera que se den en el campo de los 
catalizadores,esta línea de investigación ha demostrado, históricamente, 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 2 
 
ser fundamental para el desarrollo, no solo del HDT sino de toda la 
industria de la refinación y en general de los procesos industriales. 
Tradicionalmente, para el HDT, se han usado catalizadores metálicos 
soportados en materiales muy diversos, estos catalizadores han 
demostrado ser eficientes, sin embargo requieren de condiciones de 
operación complicadas para lograr su mejor desempeño. 
Es bien sabido de la alta efectividad de las enzimas para catalizar 
reacciones cinéticamente lentas y además hacerlo a condiciones 
“normales”, es decir cercanas o iguales a la ambiente. Una de estas 
enzimas, la cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago, consigue oxidar 
efectivamente algunos compuestos azufrados y nitrogenados presentes en 
el diesel (Montiel, 2008). 
Mediante el presente trabajo de investigación se pretende, como primer 
paso, determinar algunos parámetros cinéticos de la reacción de oxidación 
que se llevara a cabo, con compuestos modelo, en presencia de CPO, con 
el fin de oxidar el DBT a la sulfona respectiva, en un reactor continuo de 
tanque agitado de membrana. 
También se probará la actividad de la enzima para tratar una muestra real 
de Diesel, cuyas condiciones de reacción se determinaran con base en los 
resultados obtenidos en la primera etapa de la investigación. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 3 
 
Introducción 
El problema del cambio climático ha cobrado gran importancia de algunos 
años a la fecha y desde entonces se ha hecho énfasis en la importancia de 
proponer alternativas a las actividades humanas que dañan al ambiente. 
Uno de los principales cambios que se ha desarrollado, es el uso eficiente, 
responsable y ecológico de la energía, para lo cual se han propuesto desde 
mejoras en los medios que se usan actualmente, hasta nuevas fuentes que 
impacten en menor medida al equilibrio ambiental. 
Es por todos bien sabido que los combustibles fósiles, al ser quemados, 
emiten una gran cantidad de contaminantes a la atmósfera. Debido a su 
origen orgánico, el petróleo contiene una gran cantidad de compuestos de 
nitrógeno, oxigeno, azufre y metales pesados, este tipo de compuestos, 
además de los mismos hidrocarburos presentes en él, son altamente 
nocivos para los seres vivos y el ecosistema en general. Durante el 
proceso de transformación del petróleo, es imprescindible una etapa en 
donde se retiren, en lo mayormente posible, estos contaminantes, puesto 
que dichas impurezas, no solo impactan directamente en la polución del 
medio, sino que además son un veneno para los catalizadores utilizados en 
cada uno de los procesos de transformación del crudo. 
Uno de los procesos mas ampliamente usado para tal fin es el 
Hidrotratamiento, HDT, que consta de una hidroconversión y una 
hidropurificación. En el primero, ocurre una reformación de hidrocarburos 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 4 
 
para dar moléculas mas pequeñas y con relaciones de Hidrogeno/Carbono 
mas altas. El segundo proceso consiste en liberar los contaminantes, como 
nitrógeno, oxigeno y azufre, mediante la inserción de un átomo de 
hidrogeno, que rompe el enlace entre estos contaminantes y los 
hidrocarburos, (Gates, 1979) todo esto se hace de forma catalítica. 
A pesar de las nuevas generaciones de catalizadores para el HDT, como el 
Nébula® y el Centinel Gold®, existe todavía un contenido de azufre 
considerable, en los combustibles terminados que se distribuyen alrededor 
del mundo. 
Existe una tendencia global en la que el petróleo extraído es cada vez más 
pesado, con mayor contenido de compuestos no deseados; las 
regulaciones exigen combustibles más limpios, por lo tanto las empresas 
de refinación se ven obligadas a someter sus procesos de HDT a 
condiciones de operación más severas. 
Existen algunas alternativas tecnológicas a este proceso de HDT, como la 
oxidación química, la adsorción selectiva o la biodesulfuración. 
En estas dos ultimas se utiliza un catalizador común, las enzimas, 
utilizadas por los seres vivos para llevar a cabo reacciones químicas de las 
que depende su supervivencia. Una de estas enzimas, la cloroperoxidasa 
de Caldariomyces Fumago muestra un buen comportamiento en la 
reacción de oxidación de DBT a su respectiva sulfona (Zuñiga, 2002; 
Sanchez, 2003). 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 5 
 
 
 
 
 
 
 
 
II.. AAnntteecceeddeenntteess 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 6 
 
I.1 Combustibles limpios en México y calidad del aire 
Es un hecho que la calidad del aire es uno de los factores mas importantes 
en cuanto a calidad de vida se refiere, el daño a los seres vivos, y al 
ecosistema en general, que provoca un aire contaminado es inmensurable, 
tanto en términos de salud como económicos. 
Intentar mejorar la calidad del aire, ya sea controlando las emisiones de 
compuestos nocivos o simplemente limpiando las que ya se encuentran en 
él, resulta casi imposible sin antes eliminar los compuestos de azufre que 
se queman diariamente como combustibles. 
Casi todas las tecnologías tradicionales o avanzadas requieren que el 
azufre en los combustibles sea extremadamente bajo y si es nulo, mejor, 
desde los convertidores catalíticos en los automóviles de modelos 
anteriores, hasta los nuevos diseños con motores de alta eficiencia. Para 
ello se preparan gasolinas con diferentes características que cumplan con 
los requerimientos para cada tipo de motor, que van desde el numero de 
octanos, hasta el contenido total de compuestos azufrados presentes en 
ellas. Existen clasificaciones para los combustibles, de acuerdo a su nivel 
de azufre: 
• Combustibles pobres en azufre, que tienen un contenido que 
ronda las 150 ppm. 
• Combustibles bajos en azufre, cuyo contenido de azufre es 
cercano a las 50 ppm. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 7 
 
• Combustibles de ultra bajo azufre, aquellos cuya concentración de 
azufre es menor a 10 ppm. 
Todos estos combustibles ayudan a reducir las emisiones vehiculares, ya 
sea por su composición misma o permitiendo que los catalizadores de 
oxidación funcionen con mayor eficiencia, ayudando así a un mejor diseño 
de los nuevos automotores. 
Este contenido de compuestos azufrados influye directamente en la 
posibilidad y capacidad de instalar equipo de absorción de contaminantes, 
así como catalizadores de oxidación. 
En México el contenido de azufre en combustibles esta establecido por la 
norma NOM-086-SEMARNAT-SENER-SCFI-2005 “Especificaciones de los 
combustibles fósiles para la protección ambiental” en la tabla I y II 
podemos observar estas especificaciones. 
 Tabla I. Especificaciones de las gasolinas en México 
NOMBRE DEL PRODUCTO: PEMEX 
Premium 
PEMEX 
Magna Propiedad Unidad 
Azufre Mercaptánico ppm peso 
Negativa 
20 máximo 
Negativa 
20 máximo 
Azufre ppm peso promedio / 80 máximo 
ZM 
30 prom / 80 máx. 
RP 
Enero 2009: 30 prom/ 80 
máx. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 8 
 
Tabla II. Especificaciones del diesel en México 
Nombre del producto: PEMEX Diesel Diesel(1) 
Propiedad Unidad 
Azufre total ppm peso 
15 máx. 
ZM Enero 2009: 15 máx. 
RP Septiembre 2009: 15 máx. 
5000 máximo 
(1) Producto para motores a diesel para servicio agrícola y marino. No debe utilizarse en motores a diesel para 
uso automotriz. 
ZM: Zona metropolitana de México, Guadalajara y Monterrey. 
RP: Resto del país. 
ZF: Zona Fronteriza. 
En la unión europea se ha establecido la normatividad para que en 2010 
se produzca y utilice gasolina y diesel con un contenido de 10 ppm de 
azufre. En Estados Unidos la tendencia esperada contempla gasolinas con80 ppm y diesel con 15 ppm para el mismo periodo de años. Estas 
tendencias las podemos ver en la ilustración 1. 
 
Ilustración 1. Tendencias mundiales de contenido de azufre en combustibles 
(Fuente: BP) 
 
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
1990 1995 2000 2005 2010
P
P
M
 m
a
x
 d
e
 a
zu
fr
e
Año
USA CARB*
USA
Union Europea
Japon
* California Air 
resources 
board
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 9 
 
Como podemos observar, las tendencias mundiales apuntan a una 
disminución en el contenido de azufre como indicador principal en la 
calidad de los combustibles. Para cumplir con la estricta normatividad que 
existe y que se avecina, los constructores de autos e industria de 
refinación han tendido que desarrollar tecnología basada en la 
investigación de estos compuestos azufrados. 
La regulación en esta materia es de suma importancia para poder 
introducir nuevas tecnologías que permitan controlar estas emisiones en 
cada uno de los pasos en que se encuentran presentes, desde la 
preparación de los combustibles, hasta su consumo final por parte de los 
vehículos. 
Blumberg et al. (2003) han señalado 5 puntos de relevancia en el diseño 
de nuevas políticas en materia de regulación ambiental. 
1) Los costos y beneficios varían de región a región, pero se ha 
demostrado que los costos en disminución de azufre son viables y 
minimizados por sus beneficios. 
2) La regulación y estímulos fiscales han probado ser efectivos para 
encaminar a la industria de la refinación hacia productos bajos en 
azufre. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 10 
 
3) Una correcta planificación en la modernización de refinerías para 
producción de combustibles de mayor calidad, puede reducir 
significativamente los costos. 
4) Resulta efectivo y ventajoso realizar en un solo paso el cambio a 
diesel de ultra bajo azufre. Los beneficios en la reducción de emisiones 
totales crecen rápidamente cuando el nivel de azufre en el diesel 
disminuye de bajo a ultra bajo, tanto en términos de la mitigación de 
emisiones de los vehículos existentes, como para el control de emisiones 
de los nuevos vehículos. Dado este aumento de los beneficios y el 
incremento constante de los costos, tiene sentido optar directamente 
por el diesel de ultra bajo azufre. 
5) Debe de tenerse cuidado en no derivar el azufre extraído de una 
corriente de combustibles hacia otra en la que no exista una regulación. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 11 
 
I.2 Compuestos azufrados. 
Entre los compuestos no deseados más abundantes en el petróleo se 
encuentran los azufrados. Su presencia varía desde solo unas cuantas 
centesimas porcentuales hasta un 8% del total del peso de una muestra 
de petróleo, dependiendo del tipo de crudo. En crudos pesados, la 
presencia de azufre es mayor, sus compuestos son más complejos y por lo 
tanto requieren de condiciones más extremas para su eliminación. En la 
tabla III podemos ver los rangos más comunes en la composición del 
petróleo. 
Tabla III. Composición típica del petróleo 
Elemento porciento p/p 
Carbono 83.0-87.0 
Hidrógeno 10.0-14.0 
Nitrógeno 0.1-2.0 
Oxígeno 0.05-1.5 
Azufre 0.05- 8.0 
Metales (V y Ni) <1000 ppm 
 
En el proceso de Hidrodesulfuración se trata de eliminar todo el azufre, sin 
embargo la existencia de un gran número de compuestos que lo contienen 
y las diferencias entre la reactividad de cada uno de ellos, hace que este 
proceso sea complicado, por lo que hay compuestos que se consideran, de 
acuerdo a su reactividad, recalcitrantes al Hidrotratamiento. 
La figura 2 muestra, esquemáticamente, el orden en que se remueven los 
compuestos azufrados que se encuentran en el diesel. En la tabla IV 
vemos las velocidades de reacción de dichos compuestos (Chunshan Song, 
2003). 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 12 
 
 
 
Ilustración 2. Compuestos azufrados presentes en el diesel y su resistencia al 
hidrotratamiento 
Tabla IV. Velocidades de reacción de los diferentes compuestos azufrados presentes en el 
petroleo 
Compuesto de 
azufre Estructura 
Pseudo primer 
orden 
(m3 / kg 
catalizador) 
Constante de 
velocidad de 
reacción relativa 
Tiofeno 
 
1,38 x 10-3 280 
Benzotiofeno 8,11 x 10-4 165 
Dibenzotiofeno 7,38 x 10-3 15 
2,8–dimetil–
Dibenzotiofeno 
6,72 x 10-5 14 
3,7–dimetil–
Dibenzotiofeno 
3,53 x 10-5 7 
4–metil–
Dibenzotiofeno 
6,64 x 10-6 1,3 
4,6–dimetil–
Dibenzotiofeno 
4,92 x 10-5 1 
(Villalobos 2006) 
La resistencia a la remoción con hidrógeno se incrementa de izquierda a derecha 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 13 
 
En los cortes ligeros del petróleo, el azufre esta presente como tioles, 
sulfuros, disulfuros y tiofenos, mientras que los alquilbenzotiofenos y 
alquildibenzotiofenos están presentes en la fracción más pesada de 
gasóleos. Su concentración se incrementa con el punto de ebullición de la 
fracción de donde provienen. 
La eliminación de estos compuestos, como ya se dijo antes, requiere de 
condiciones muy distintas de acuerdo al tipo de proceso que se emplea, en 
una comparativa podemos observar estas diferencias, que en términos 
económicos resultan de suma importancia al convertirlos a costos fijos y 
de operación (Tabla V). 
Tabla V. Condiciones de operación para diferentes procesos de eliminación de azufre 
Proceso Temperatura (0C) Presión (psi) 
Bioprocesos 25 - 80 14.61 
Oxidación química 170 14.61 
Adsorción 400 300 
Hidrotratamiento 350 - 450 500 - 1500 
 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 14 
 
I.3 Hidrotratamiento 
El Hidrotratamiento es un proceso utilizado en la refinación del petróleo, 
generalmente posterior a la destilación primaria y de vacio, y tiene el fin 
de saturar las moléculas de hidrocarburos con hidrógeno para liberar los 
elementos no deseados en los productos derivados del mismo, estos 
elementos no deseados, son principalmente azufre, nitrógeno, oxigeno y 
metales, que se liberan como H2S, NH3 y H2O. Además esta saturación, 
también busca una desintegración y/o reformación en las moléculas 
presentes en los diferentes cortes, tales como la transformación de 
aromáticos a cicloalcanos y olefinas a parafinas. Estas reacciones se 
muestran en la tabla VI: 
Tabla VI. Reacciones comunes en el Hidrotratamiento 
Reacción Forma 
Hidrodesulfuración R-S + H2 → R-H + H2S 
Hidrodesnitrogenación R-N + H2 → R-H + NH3 
Hidrodesoxigenación R-O + H2 → R-H + H2O 
Hidrocracking R-R + H2 → R-H + R-H 
Saturación de olefinas Olefina + H2 → Parafina 
Hidrogenación de aromáticos 
Poliaromático + H2 → Aromático 
Aromático + H2 → Nafteno 
 
El proceso de HDT, en general, consiste en llevar a cabo una reacción 
entre el corte de petróleo e hidrógeno en exceso, hasta 1000% del 
hidrógeno estequiométrico requerido, en presencia de un catalizador 
metálico soportado en alúmina, el catalizador suele ser de Níquel - 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 15 
 
Molibdeno o Cobalto - Molibdeno, soportados en Alúmina (Al2O3). Estas 
reacciones (Tabla VI) se llevan a cabo en condiciones de temperatura y 
presión en los rangos de 350 – 450 ºC y 500 - 1500 psi (Tabla V). La 
ilustración 3 muestra un diagrama general del proceso del HDT. 
Calentador de carga
Reactor
Agotador
Separador
Tanque de reflujo
Alimentacion
Hidrogeno de 
reposición
Agua de lavado
H2S
Agua amarga
 
Ilustración 3. Diagrama de flujo de un proceso HDT tradicional 
El hidrógeno se combina con el aceite ya sea antes o después de ser 
calentados a la temperatura de la reacción. La alimentación entra en la 
parte alta de un reactor de cama fija donde fluye a través de una cama de 
catalizador de oxido metálico. 
El hidrógeno reacciona con los hidrocarburos paraproducir sulfuro de 
hidrógeno, amoniaco, hidrocarburos saturados y metales libres. Los 
metales permanecen en el catalizador y los demás productos salen en una 
corriente de vapor y gases. El hidrógeno se separa de los hidrocarburos en 
un agotador. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 16 
 
El sulfuro de hidrógeno y los productos ligeros son eliminados del producto 
desulfurizado, se envía a un proceso de adulzamiento de gas, el agua se 
trata antes de ser reutilizada o simplemente desechada. 
Para el hidrotratamiento de fracciones de diesel se han desarrollado 
procesos como el “Ultra Deep HDS”, en donde se utiliza un tipo de 
catalizador (Cobalto - Molibdeno) para compuestos de fácil remoción y otro 
diferente (Níquel - Molibdeno) para los de mas difícil tratamiento 
(Alquildibenzotiofenos), cada uno en una etapa separada dentro del 
reactor, lo que permite optimizar las condiciones de reacción para cada 
proceso (Koide et al. 2003) 
Algunos otros diseños incluyen una adsorción previa al proceso de HDT, lo 
cual reduce el consumo de hidrógeno y aumenta la eficiencia del 
catalizador. (Xiaoliang, et al. 2001), este se muestra en la ilustración 4. 
 
Ilustración 4. Esquema Ultradeep HDT con adsorción 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 17 
 
En otros procesos se ha desarrollado una etapa de reacción con sodio, lo 
cual elimina el azufre y produce sulfuro de sodio, este proceso conocido 
como Transfining®, reduce al mínimo el consumo de hidrógeno, que sólo 
es requerido para estabilizar los hidrocarburos resultantes (Schuker, 2004) 
I.4 Catalizadores para HDT 
Una de las variables de operación más importantes son los catalizadores, 
pues la actividad de estos permite hacer cambios tanto en los diseños de 
los sistemas, como en las condiciones de operación. Existen dos tipos 
principales de catalizadores que se utilizan comercialmente, uno basado en 
Cobalto–Molibdeno (CoMo), y el otro de Níquel-Molibdeno (NiMo), además 
de estos, se ha estudiado el comportamiento de otros metales como Ir, Pt, 
Ru y Pd, para tratar el dibenzotiofeno (Navarro et al, 1996. Y Pawelec et 
al. 2003.). El Hidrotratamiento no es un proceso simple pues existen 
diferentes rutas químicas de reacción. Para hacer esto aun más complejo, 
estos caminos interaccionan uno con el otro. Todos los catalizadores 
promueven las reacciones, pero en diferentes grados, además los 
diferentes tipos de catalizador responden diferente a la alimentación y las 
condiciones de operación. 
Durante décadas no hubo gran desarrollo en el desempeño de los 
catalizadores, fue hasta mediados de la década de los 90 que su actividad 
creció de manera exponencial, en solo algunos años la actividad de los 
catalizadores CoMo creció al doble. En el año 2000 una nueva generación 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 18 
 
de catalizadores apareció, el Nebula®, desarrollado por Akzo Nobel. La 
actividad de los catalizadores volvió a duplicarse. 
 
Ilustración 5. Desarrollo en la actividad de los catalizadores 
Fuente: Akzo Nobel 
Una de las ventajas de Nebula®, es que remueve el azufre remanente de 
los compuestos recalcitrantes a los procesos convencionales, los 
Dibenzotiofenos. Los DBT fueron, durante mucho tiempo una barrera en la 
remoción de azufre (50 ppm). 
I.5 Enzimas 
Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en 
ausencia de un catalizador, debido a que muchas de estas reacciones son 
sumamente complejas y requieren ser llevadas a cabo en condiciones 
“naturales” que no dañen al organismo vivo. Estos catalizadores se 
denominan enzimas y son en su totalidad moléculas de naturaleza 
proteica. 
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010
A
ct
iv
id
a
d
 r
e
la
ti
va
 d
e
l 
ca
ta
li
za
d
o
r
Año
Co Mo Alumina
Stars
Nebula
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 19 
 
Además de incrementar la velocidad en las reacciones, las enzimas 
presentan una elevada especificidad y en algunos casos pueden ser 
reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y/o disminuyendo su 
actividad de acuerdo a las necesidades del momento. 
Las enzimas, por su naturaleza proteica tienen ciertas diferencias con los 
catalizadores inorgánicos, algunas de ellas se enuncian a continuación. 
a) Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del 
medio. 
b) El reconocimiento de la enzima con el sustrato es altamente 
específico. 
c) Transforman un gran número de moléculas de sustrato por unidad 
de tiempo. 
d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos 
y alostéricos. 
I.5.1 Nomenclatura y clasificación 
La forma mas común de nombrar a las enzimas es añadiendo el sufijo 
"asa" al nombre del sustrato. Así, la ureasa es la enzima que cataliza la 
hidrólisis de la urea formando amoníaco y dióxido de carbono. 
 
Sin embargo, con el descubrimiento de nuevas enzimas esta nomenclatura 
resulta a veces confusa. Actualmente se han adoptado ciertas 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 20 
 
recomendaciones de la International Enzyme Commission, que pretende 
sistematizar la nomenclatura y clasificación de las diferentes enzimas 
conocidas. Este sistema divide a las enzimas en seis clases que a su vez 
pueden tener diferentes subclases. 
• 
Catalizan reacciones de óxido-reducción. Precisan la colaboración de las 
Oxidorreductasas 
coenzimas de oxido-reducción (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden 
los electrones correspondientes; tras la acción catalítica, estas coenzimas 
quedan modificados en su estado de oxidación por lo que deben ser 
regeneradas antes de volver a efectuar la reacción catalítica. 
• 
Transfieren 
Transferasas 
grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas) a 
otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversión 
de monosacáridos, aminoácidos, etc. 
• 
Llevan a cabo reacciones de 
Hidrolasas 
hidrólisis con la consecuente obtención de 
monómeros a partir de polímeros. Actúan en la digestión de los alimentos, 
previamente a otras fases de su degradación. 
• 
Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus 
Isomerasas 
isómeros de 
función o de posición. 
Neevia docConverter 5.1
http://es.wikipedia.org/wiki/Coenzima�
http://es.wikipedia.org/wiki/Electrones�
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_funcional�
http://es.wikipedia.org/wiki/Monosac%C3%A1rido�
http://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido�
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3lisis�
http://es.wikipedia.org/wiki/Mon%C3%B3mero�
http://es.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero�
http://es.wikipedia.org/wiki/Is%C3%B3mero�
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 21 
 
• 
Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos (H2O, CO2 y NH3) para 
formar un doble enlace o añadirse a un doble enlace, capaces de catalizar 
la reducción en un sustrato. 
Liasas 
• 
Realizan la degradación o síntesis de los enlaces denominados "fuertes" 
mediante al acoplamiento a sustancias de alto valor energético, como el 
Ligasas 
ATP. 
I.5.2 Cocatalizadores. 
Algunas enzimas dependen, para su actividad catalítica, además de la 
estructura proteica, de otras moléculas de naturaleza no proteica. Estas 
estructuras reciben el nombre de cofactores o coenzimas. 
El complejo enzima – cofactor recibe el nombre de holoenzima. A la 
fracción proteica aislada del cofactor, que es inactiva, se la denomina 
apoenzima. Los cofactores pueden ser simplemente iones metálicos o en 
algunos casos moléculas orgánicas complejas. Estas últimas reciben el 
nombre de coenzimas. Entonces la configuración de una enzima es: 
Holoenzima = Apoenzima + Coenzima 
Los coenzimas son cofactores orgánicos no proteicos, termoestables, que 
unidos a una apoenzima constituyen la holoenzima oforma catalíticamente 
activa de la enzima. Tienen en general baja masa molecular, al menos 
Neevia docConverter 5.1
http://es.wikipedia.org/wiki/Liasa�
http://es.wikipedia.org/wiki/Adenos%C3%ADn_trifosfato�
http://es.wikipedia.org/wiki/Cofactor�
http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna�
http://es.wikipedia.org/wiki/Termoestable�
http://es.wikipedia.org/wiki/Apoenzima�
http://es.wikipedia.org/wiki/Holoenzima�
http://es.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisis�
http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima�
http://es.wikipedia.org/wiki/Masa_molecular�
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 22 
 
comparada con la apoenzima, y son claves en el mecanismo de catálisis, 
por ejemplo, aceptando o donando electrones o grupos funcionales. 
El mecanismo de acción básico de las coenzimas es el siguiente: 
1. La coenzima se une a una enzima, 
2. La enzima capta su substrato específico, 
3. La enzima ataca a dicho substrato, arrancándole algunos de sus 
átomos, 
4. La enzima cede a la coenzima dichos átomos provenientes del 
substrato, 
5. La coenzima acepta dichos átomos y se desprende de la enzima. La 
coenzima no es el aceptor final de esos átomos, sino que debe 
liberarlos tarde o temprano, 
6. La coenzima transporta dichos átomos y acaba cediéndolos, 
recuperando así su capacidad para aceptar nuevos átomos. 
Este último paso es esencial para no mermar la concentración de 
coenzimas de una célula, ya que la enzima no pueden realizar la reacción 
química sin la presencia de su coenzima. 
Algunas coenzimas están fuerte y permanentemente unidas a su enzima, 
constituyendo, en la práctica, un grupo prostético; tal es el caso del FMN 
(Flavín mononucleótido) a la enzima NADH deshidrogenasa (Hatefi, 1985), 
o el FAD (flavín-adenín dinucleótido) a la succinato deshidrogenasa. 
Neevia docConverter 5.1
http://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3n�
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_funcional�
http://es.wikipedia.org/wiki/Grupo_prost%C3%A9tico�
http://es.wikipedia.org/wiki/FMN�
http://es.wikipedia.org/wiki/FAD�
http://es.wikipedia.org/wiki/Succinato_deshidrogenasa�
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 23 
 
Cada coenzima está especializada en aceptar y transportar un tipo de 
átomos determinado; unos aceptan hidrógenos, otros grupos acetilo, 
amino, etc. No obstante, las coenzimas no son nada específicas respecto a 
las enzimas a las que se unen, de modo que una misma coenzima puede 
unirse a un gran número de enzimas distintas, es por ello que el número 
de coenzimas diferentes es relativamente bajo. Las moléculas de coenzima 
son a menudo vitaminas o se hacen a partir de vitaminas. 
I.5.3 Activadores 
Algunas enzimas necesitan, para su actividad, iones inorgánicos 
específicos que reciben el nombre de activadores. Los activadores que se 
necesitan con más frecuencia son los iones de hierro, cobre, manganeso, 
magnesio, cobalto y zinc. Normalmente, sólo un ion funciona con una 
determinada enzima, pero en ciertos casos se pueden substituir ciertos 
iones por otros, persistiendo la actividad enzimática. 
I.5.4 Inhibidores 
Las moléculas que regulan la actividad enzimática, inhibiendo su actividad, 
pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las irreversibles se unen 
covalentemente a la enzima y son útiles en farmacología (penicilina, 
aspirina). 
Las reversibles pueden clasificarse, a su vez, en competitivas y no 
competitivas. Las competitivas modifican la km de la enzima, ya que se 
unen al centro activo de éste e impiden la unión con el sustrato. Las no 
Neevia docConverter 5.1
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno�
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Acetilo&action=edit&redlink=1�
http://es.wikipedia.org/wiki/Amino�
http://www.muydelgada.com/wiki/Vitamina�
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 24 
 
competitivas se unen a otro lugar de la enzima, modificando la Vmax, ya 
que al unirse, la enzima queda inactivada. 
I.6 Cinética de las Reacciones Enzimáticas 
En principio, las consideraciones generales de la cinética química pueden 
aplicarse a las reacciones catalizadas enzimáticamente, aunque estas 
últimas tienen la particularidad de mostrar el fenómeno de saturación por 
el sustrato, por lo que existen modificaciones sobre los parámetros 
cinéticos que caracterizan a una reacción biocatalítica. 
Observando el gráfico de la velocidad de la reacción catalizada 
enzimáticamente en función de la concentración del sustrato, ilustración 6, 
es evidente que a bajas concentraciones del mismo, la velocidad de 
formación de producto es proporcional a la concentración del sustrato. A 
medida que se aumenta la concentración del sustrato se aprecia una 
pérdida de la proporcionalidad, en esta zona la reacción es de orden mixto 
y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reacción es 
independiente de esta. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 25 
 
 
Ilustración 6. Velocidad de reacción catalizada enzimáticamente 
El fenómeno de saturación, junto con otras evidencias, llevaron a postular 
la existencia de un complejo enzima – sustrato (E – S) como etapa previa 
a la formación de productos. 
En 1913 Leonor Michaelis dedujo la relación entre la velocidad máxima 
(Vmax) de una reacción catalizada enzimáticamente, en términos de la 
formación del complejo E–S. En base a estas consideraciones es lógico 
suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de 
la enzima están ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un máximo. 
El modelo propuesto sirve de base para explicar las propiedades de la 
mayoría de las enzimas y como se dijo antes, asume la existencia de un 
complejo E–S como intermediario en la catálisis. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 26 
 
Una enzima E se combina con un sustrato S, para formar el complejo E–S, 
con una constante de velocidad k1. Este complejo E–S puede seguir dos 
caminos: 
a) Proceder para formar el producto con una constante de velocidad k3 
b) el camino alternativo es disociándose, generando nuevamente E y S con 
una constante de velocidad k2 
En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente 
será: 
𝒗𝒗 = 𝒌𝒌𝟑𝟑 �𝑬𝑬–𝑺𝑺� (1) 
El valor [E–S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una 
expresión equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo 
matemático la ecuación 1 se transforma en la ecuación (2): 
 (2) 
La ecuación 2 es conocida como la expresión de Michaelis – Menten. 
Entonces, si se mantiene la concentración de la enzima constante y 
variamos la concentración de sustrato, se obtiene una curva hiperbólica, 
como la de la ilustración 6. Al principio un aumento de la concentración de 
sustrato, produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si 
se sigue aumentando la concentración de sustrato, la velocidad de 
reacción comienza a disminuir; vemos que a muy altas concentraciones de 
sustrato, se observa que no cambia la velocidad de reacción, se dice que 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 27 
 
los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de 
reacción que se obtiene a esa alta concentración de sustrato se define 
como la velocidad máxima (vmax) de la reacción enzimática, bajo las 
condiciones especificadas. La concentración de sustrato [S], a la 
semivelocidad máxima de reacción (v½) se puede determinar de la gráfica 
y representa la constante de Michaelis o km, la cual es una característica 
para cada enzima. La inversa de km, o 1/km, mide aproximadamente la 
afinidad de la enzima por el sustrato. Mientras más pequeño sea el valor 
de km, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. Si varias 
enzimas compitenen el metabolismo por el mismo sustrato, éste será 
transformado, preferentemente, por la enzima con mayor afinidad. 
Así tendremos: 
[ ]
[ ] mkS
Svv
+
= maxmax
2 
 (3) 
(Simplificando 3) 
[ ]
[ ] mkS
S
+
=
2
1
 
 (4) 
Si reordenamos la ecuación 4 tendremos que: 
[ ] [ ]SkS m 2=+ (5) 
Despejamos 5 [ ]Skm = (6) 
Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la 
mitad de la velocidad es el valor de km de la enzima. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 28 
 
I.6.1 Centro activo de una enzima 
Ya se había mencionado que la porción de la molécula en la enzima, que 
se una al o a los sustratos es una zona relativamente pequeña de la 
misma. Esta zona, responsable de la actividad catalítica, que favorece la 
orientación de los grupos que reaccionan para dar los productos de la 
reacción, recibe el nombre de centro activo. 
Los grupos responsables de la actividad catalítica propiamente dicho se los 
denomina sitios activos 
I.6.2 Actividad enzimática 
La cantidad de enzimas presentes en un fluido biológico es muy difícil de 
determinar en valores absolutos, mg. o moles, una forma de resolver este 
problema es midiendo la velocidad de reacción catalizada por la misma, 
empleando un sustrato específico. La velocidad de reacción puede 
expresarse como la cantidad de reactivo que se transforman en producto 
por unidad de tiempo. De allí que la unidad internacional (UI) de cualquier 
enzima se define como la cantidad de la misma que cataliza la 
transformación de un mol de sustrato por minuto, bajo condiciones 
definidas: pH, temperatura, concentración de sustratos, etc. 
En base a lo que se acaba de explicar es posible expresar la cantidad de 
una enzima en un fluido biológico en UI/cm3 o en UI/mg de proteína total. 
Esta última expresión denominada actividad específica es la cantidad de 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 29 
 
moles de sustrato transformados por minuto y por mg de enzima, 
debiéndose indicar las condiciones como la temperatura y el pH. 
La actividad específica de una enzima es una medida indirecta de la 
fracción de la proteína total en una preparación que contienen a la enzima. 
I.6.3 Factores que influyen en la velocidad de las reacciones 
enzimáticas 
Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la 
velocidad de reacción hasta cierta temperatura óptima, ya que a 
temperaturas altas (45 °C) se comienza a producir la desnaturalización 
térmica. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una temperatura 
óptima de 37 °C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse 
y se destruyen. Sin embargo existen especies de bacterias y algas que 
habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas 
bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a 0 C. 
pH: El pH no afecta la actividad enzimática directamente, sino que 
modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar la 
estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar también en la 
reacción como sustrato o producto. Cualquier cambio brusco de pH, 
sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de 
los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las 
propiedades catalíticas de una enzima. A pHs altos o bajos se puede 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 30 
 
producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su 
inactivación, la tabla VII muestra pHs óptimos de algunas enzimas. 
Tabla VII. pH óptimo de diferentes enzimas 
Enzimas pH óptimo 
Pepsina 1,5 
Tripsina 7,7 
Catalasa 7,6 
Arginasa 9,7 
Fumarasa 7,8 
Ribonucleasa 7,8 
I.6.4 Inhibición Enzimática 
La actividad enzimática puede ser disminuida, o eliminada, por la acción 
de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de 
inhibidores enzimáticos. 
Las distintas formas de interacción se traducen en varios tipos de 
inhibición perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos más 
comunes son la competitiva y la no competitiva. La primera es cuando el 
inhibidor compite con el sustrato por la unión con el centro activo de la 
enzima. En la segunda el inhibidor se enlaza con la enzima en un lugar 
diferente del sitio activo, lo que provoca la disminución de la velocidad 
máxima de reacción. 
Ciertos metales como el plomo, mercurio y arsénico inhiben enzimas que 
tienen en su centro activo grupos – SH libres. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 31 
 
El proceso de inhibición enzimática es útil para comprender los 
mecanismos de acción tóxica y farmacológica de algunos compuestos. 
I.6.5 Mecanismo de acción enzimática. 
Una enzima, por sí misma, no puede llevar a cabo una reacción, su función 
es modificar la velocidad de la reacción. Tal variación se debe a la 
disminución de la energía de activación Ea; la energía de activación es la 
cantidad de energía necesaria para que todas las moléculas de un mol, a 
una temperatura dada alcancen el estado reactivo. Mientras que, el estado 
de transición es el estado rico en energía de las moléculas que 
interaccionan en la cima de la barrera de activación. La velocidad de una 
reacción química es proporcional a la concentración del complejo en el 
estado de transición. 
Una reacción química se puede acelerar de la siguiente forma: 
 1) Al aumentar la temperatura se incrementa la energía cinética, por lo 
que es mayor el número de moléculas que alcanzan el estado de 
transición. 
2) Añadiendo un catalizador, que proporciona un camino de menor energía 
de activación y aumenta la velocidad de reacción. 
La enzima (E), se combina con el sustrato (S) formando el complejo de 
transición, enzima-sustrato (E-S), mediante una reacción reversible, cuya 
energía de activación es menor que la de la reacción no catalizada. Cuando 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 32 
 
se forma el producto de la reacción (P), se regenera de nuevo la enzima 
(E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molécula 
de sustrato (S). 
 
Una enzima reduce más eficientemente la energía de activación (Ea) de 
una reacción que un catalizador inorgánico, lo que permite que una 
reacción se realice a menor temperatura. En la tabla VIII podemos 
comparar energías de activación de una reacción catalizada por diferentes 
sistemas. 
Tabla VIII. Comparación entre las energías de activación de una reacción catalizada 
enzimáticamente. 
Reacción 
Energía de activación 
(Kcal*mol-1) 
a) El peróxido de hidrógeno se descompone en: 
H2O2 H2O + O2 18 
b) Catalizador: Hierro catalítico (Fe) 
H2O2 H2O + O2 13 
c) Catalizador: Platino catalítico (Pt) 
H2O2 H2O + O2 12 
d) Catalizador: Catalasa 
H2O2 H2O + O2 5 
Una enzima no modifica la energía libre, ni la constante de equilibrio, sino 
que disminuye la energía de activación de la reacción, como se ve en la 
ilustración 7 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 33 
 
 
Ilustración 7. Energía de activación de una reacción enzimática 
 La diferencia en el nivel de energía entre el estado inicial y la necesaria 
para iniciar la reacción (picos de las curvas) es la energía de activación. 
El complejo Enzima-sustrato posee menor energía de activación que las 
especies en estado de transición que la correspondiente reacción no 
catalizada. 
¿Cómo realiza esta acción una enzima? 
• Orienta a los sustratos: parte de la energía de activación se 
utiliza para que los sustratos roten y se encuentren con los átomos 
correctos para formar los enlaces. 
• Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R), de los 
aminoácidosde las enzimas, pueden participar directamente haciendo 
a los sustratos químicamente más reactivos. 
• Inducen la deformación en el sustrato: cuando una sustancia se 
une al sitio activo, la enzima puede causar que los enlaces se “estiren”, 
poniéndolo en un estado de transición inestable. 
• Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo 
de llave-cerradura de Fisher fue actualizado cuando se descubrió que 
las enzimas son flexibles y sus sitios activos pueden cambiar para 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 34 
 
acomodarse a sus sustratos. Este cambio de forma, causado por la 
unión al sustrato, se denomina ajuste inducido. El ajuste inducido 
alinea las cadenas laterales reactivas, del sitio activo de la enzima, con 
los sustratos. 
I.7 Peroxidasas 
Dentro de la clasificación de las oxido-reductasas se encuentra una 
subclase, denominada peroxidasas. Las peroxidasas son enzimas que 
utilizan peróxido para llevara a cabo la oxidación de un sustrato, la 
mayoría de las peroxidasas contienen un complejo hierro-porfirina, 
llamado grupo hemo, el cual podemos ver en la ilustración 8. 
 
Ilustración 8. Grupo hemo de la CPO. (Wang et al. 2003) 
El grupo hemo de la cloroperoxidasa tiene la característica de presentar 5 
ligandos axiales, que fueron identificados por Blanke y Hager (1988), lo 
cual convierte a este complejo en algo singular. 
 Las peroxidasas se pueden clasificar, con base en su origen, en dos 
superfamilias: peroxidasas de mamíferos y peroxidasas de plantas (van de 
Velde, 2001). La primera superfamilia incluye enzimas como la 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 35 
 
lactoperoxidasa, la mieloperoxidasa y la prostaglandina H sintasa. La 
segunda familia se encuentra dividida en tres clases: 
I. Peroxidasas intracelulares, como citocromo C y peroxidasa de 
levadura. 
II. Peroxidasas de plantas, como la peroxidasa de rábano blanco. 
III. Peroxidasas extracelulares de hongos, como la cloroperoxidasa de 
Caldariomyces fumago. 
En la tabla IX vemos ejemplos de hemo peroxidasas. 
Tabla IX. Peroxidasas hemo y su función biológica 
Peroxidasa Origen Función 
Cloroperoxidasa Caldariomyces fumago Biosíntesis de 
caldariomicina 
Citocromo c peroxidasa Saccaromyces cerevisiae Reducción de H2O2 y 
oxidación de citocromo c 
Peroxidasa de rábano Armocrasia rusticana Biosíntesis de hormonas 
de plantas 
Lactoperoxidasa Leche bovina Antimicrobiana 
Lignino peroxidasa 
Phanerochaete 
chrysosporium 
Degradación de lignina 
Mieloperoxidasa Leucocitos humanos Actividad antimicrobiana 
 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 36 
 
I.8 Cloroperoxidasas. 
Existe un tipo de peroxidasas llamadas haloperoxidasas. En la naturaleza 
estas enzimas catalizan la oxidación de haluros, utilizando peróxido de 
hidrógeno, lo que resulta en la halogenación de compuestos orgánicos. 
La cloroperoxidasa (CPO, E.C. 1.11.1.10) de Caldariomyces fumago 
(ilustración 9) es una haloperoxidasa con un grupo hemo que presenta un 
plegamiento único y es estructuralmente diferente a cualquier otra 
hemoperoxidasa conocida (Sundaramoorthy et al. 1998). Es decir que la 
CPO no parece estar relacionada evolutivamente con las demás 
hemoperoxidasas. Su estructura tridimensional fue descrita por 
Sundaramoorthy et al. en 1995. 
 
Ilustración 9. Cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago (figura generada con 
MacPyMOL, W.L. DeLano) 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 37 
 
CPO es una proteína extracelular con un peso molecular de 42 000 Da y un 
grado de glicosilación de 25-35%. Es una proteína monomérica con un 
grupo prostético hemo (Montiel 2008). Los sitios de glicosilación son 
principalmente treoninas y serinas, aunque también se han detectado 
modificaciones en algunas asparaginas (Pickard, 1981). 
CPO puede producirse en concentraciones entre 280 y 600 mg/L en 
bioreactores de tipo batch con flujo de aire ascendente (airlift) y 
semicontinuo, respectivamente (Charmichael y Pickard, 1989; Pickard y 
Charmichael, 1991). Esencialmente, es la única proteína extracelular 
producida, por lo que su purificación se lleva a cabo de manera 
relativamente sencilla, alcanzándose buenos rendimientos y alta pureza, 
una vez producido el hongo, el micelio se filtra y el medio gastado se 
concentra y se congela para obtener un gel del cual se purifica la enzima, 
por medio de una cromatografía de intercambio iónico. La enzima pura es 
estable por semanas a temperatura ambiente y bajo control de pH 
(Pickard et al., 1991). 
CPO suele participar en reacciones como las mostradas en la tabla XI 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 38 
 
Tabla X. Actividad en la CPO de Caldariomyces fumago 
Tipo de reacción Reacción catalizada Sustratos 
Halogenación RH+H202+Cl-+H+ → RCl+2H2O 
Dicetonas cíclicas, fenoles, 
esteres fenólicos 
Deshidrogenación 2RH+H2O2 → R-R+2H2O 
Metoxifenoles, anilinas, 
indol. 
Descomposición de 
peróxido 
2ROOH → O2+2ROH 
Peróxido de hidrógeno, 
peróxidos orgánicos 
Inserción de oxigeno R+H2O2 → R-OH+H2O 
Tioanisoles, alquenos, 
bencilos. 
 
Todas estas reacciones han sido ampliamente estudiadas por Dunford et 
al. (1987), Hernández et al. (1998), Doerge (1986) y Colonna (1993) entre 
otros investigadores. 
CPO, ha mostrado ser mas activa, oxidativamente, que algunas otras 
enzimas, como citocromo C, citocromo p450, lignino peroxidasa y 
hemoglobina (Torres et al., 2003). 
Además, cataliza la oxidación de varios compuestos azufrados, incluyendo 
sulfuros alquilados y sulfuros aromáticos (Colonna, 1992; Pasta, 1994; 
Hager, 1998; van de Velde, 2000; Hu, 2002; Dembitsky, 2003; Spreti, 
2004). Estos estudios se realizaron en el contexto de transformaciones 
enantioselectivas y asimétricas, en medios orgánicos como iso-octano, 
hexano y tolueno (van de Velde, 2000). 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 39 
 
 Monitorear la evolución de la reacción de oxidación de DBT 
catalizada por CPO de Caldariomyces Fumago en un reactor 
intermitente de tanque agitado (Batch) y en un reactor continuo de 
tanque agitado (CSTR) de membrana. 
Objetivos. 
 Evaluar algunos parámetros cinéticos que caracterizan esta 
reacción, para su utilización en desulfuración de destilados 
intermedios, tales parámetros son: 
o Eficiencia de oxidación. 
o Tiempo de vida media (t½) de la enzima. 
o Constante de inactivación de la enzima (ki) 
La cloroperoxidasa de Caldariomyces Fumago es una enzima que cataliza 
la reacción de oxidación de Dibenzotiofeno con peróxido de hidrógeno. 
Utilizando una membrana que retenga a la enzima dentro del reactor se 
podrá operar el reactor en continuo y establecer un régimen permanente 
de conversión de DBT. 
Al encontrarse la enzima en la misma fase, se favorece el contacto con el 
sustrato y se obtendrá un aumento en el rendimiento de la reacción. 
Hipótesis. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 40 
 
 
 
 
 
 
IIII.. MMeettooddoollooggííaass 
yy ddeessaarrrroolllloo 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 41 
 
II.1 Materiales. 
La Cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago (CPO, 42 kDa,) fue donada 
por el Dr. Michael A. Pickard de la Universidad de Alberta, Canadá. Los 
reactivos dibenzotiofeno (DBT) al 98 % de pureza y dibenzotiofensulfona 
(DBTS) con pureza del 97 % fueron adquiridos en Aldrich Chemical 
Company Inc.; el acetato de sodio y el cloruro de potasio, ambos reactivos 
ACS, se obtuvieron de Spectrum Chemical; el Acido acético glacial,, fue de 
J. T. Baker; el diclorometano grado HPLC fue de Burdick & Jackson; el 
Alcohol isopropílico y el peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30 % fueron 
marca Fermont; y el Acetonitrilo grado HPLC provino de Tecsiquim. 
El reactor yla membrana de celulosa regenerada son del fabricante 
Millipore®, las bombas peristálticas utilizadas para la alimentación del 
reactor, así como los tubos, fueron Easy Load® II Masterflex® de Cole-
Parmer, modelo 7521-40. 
El cromatógrafo de líquidos de alto desempeño fue marca Hewlet-Packard 
modelo HP 1100. 
Se utilizó un cromatógrafo de gases con detector NPD acoplado marca 
Thermoquest y otro con un detector de quimioluminiscencia marca Sievers 
para la determinación del perfil de compuestos nitrogenados y azufrados, 
respectivamente. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 42 
 
II.2 Determinación de la oxidación de DBT por CPO en medio 
monofásico en reactor intermitente. 
Para hacer las pruebas del reactor por lotes, que fueron cuatro en total, 
se utilizó, para la primera corrida, una carga de 50 ml con composición 80 
% acuosa y 20 % orgánica. 
Dentro de la fracción acuosa se añadió peróxido de hidrógeno (H2O2) a una 
concentración de 1 mM la enzima se encontraba a 14,26 nM y el resto se 
completo con buffer de acetatos de pH 3. La concentración del peróxido se 
limita a 1mM, pues el exceso de este ocasiona una pérdida de actividad de 
la enzima (Valderrama et al., 2002) 
La fracción orgánica se componía de una disolución de DBT en acetonitrilo 
y la concentración al interior del reactor fue de 20 μM. 
En la segunda determinación se hizo la adición de un activador, que no se 
encontraba en la primera, cloruro de potasio (KCl) con una concentración 
de 20 mM. Todas las demás especies y concentraciones fueron idénticas. 
La tercera prueba se hizo con una disminución en la concentración de la 
enzima a la mitad que en las anteriores 2 cargas; de tal manera que la 
CPO se añadió para lograr una concentración de 7,13 nM. Las demás 
condiciones se mantuvieron constantes con respecto al experimento 
numero dos. 
En el cuarto, y ultimo, lote se disminuyó la concentración del activador 
cloruro de potasio (KCl) a la mitad, para que quedara en la misma 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 43 
 
proporción que la enzima pero en una cantidad igual a la mitad, cada uno, 
con respecto a la segunda carga. Así, las concentraciones de enzima y 
activador fueron 7,13 nM y 10 mM respectivamente. Cabe mencionar que 
las concentraciones de dibenzotiofeno y peróxido de hidrógeno no 
sufrieron cambios para ninguno de los cuatro casos tratados. En el caso 
del amortiguador de acetatos, debido a que los volúmenes de la fase 
acuosa cambiaban, el volumen agregado de este fue variable, puesto que 
se utilizaba para completar la carga de 50 ml al reactor. 
Las muestras, para todos los casos, se realizaron de la forma que sigue: 
Debido al poco volumen que se tenia en el reactor y las muchas muestras 
que se pretendía obtener, 22 en total, se determinó tomar alícuotas de 50 
μl cada vez; en total se retiraron del reactor 1,1 ml, cantidad que no 
impactaba de manera considerable al volumen total y por lo tanto evitaba 
problemas de dilución en el interior de la reacción, antes de las pruebas se 
dispuso que el total de volumen extraído del reactor no debería de 
sobrepasar los 5 ml. 
A estos 50 μl de alícuota se añadían 50 μl de acetonitrilo , para detener la 
reacción y completar los 100 μl que se inyectarían al HPLC. 
La toma de muestra se realizó en los siguientes tiempos: cada minuto 
desde 0 hasta 10 min, después, cada 10 minutos hasta completar 120 
min. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 44 
 
II.3 Determinación de la oxidación de DBT por CPO en medio 
monofásico en CSTR de membrana. 
Para la operación del reactor de mezcla completa se utilizó una membrana 
de celulosa regenerada marca Millipore, la cual presenta un tamaño de 
poro de 200 Daltons, suficiente para actuar como barrera para la enzima. 
El reactor utilizado y su montaje son los mostrados en la ilustración 10. 
 
Ilustración 1. Esquema de montaje del reactor y reactor 
1ª Prueba 
La carga al reactor se compuso de la siguiente manera: 20 % solución de 
dibenzotiofeno en acetonitrilo con una concentración de 20 μM; 80 % fase 
acuosa, compuesta por peróxido de hidrógeno de concentración 1 mM y el 
resto buffer de acetatos de pH 3. Todas estas concentraciones son en la 
carga final que se alimentó al reactor. 
Esta carga se alimentó al reactor por medio de dos bombas peristálticas 
conectadas en serie. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 45 
 
Las bombas fueron previamente probadas para determinar la operación 
durante la corrida. Se determinó el gasto de alimentación, descarga y, por 
consiguiente, el tiempo de residencia en el reactor. El tiempo de residencia 
que se tuvo en esta ocasión fue de 43 minutos aproximadamente, que era 
el tiempo mas alto que nos permitía la configuración del sistema, pues era 
también el flujo mas bajo otorgado por las bombas, aproximadamente 1,2 
ml/min. 
En el reactor, con volumen de 50 ml, se colocó la enzima con una 
concentración de 14,26 nM. La enzima se encontraba libre y la adición de 
esta correspondió al minuto cero de la operación. En este momento se 
tomó la primera muestra y posteriormente se tomaban del reactor cada 10 
minutos durante 2 horas y posteriormente cada 30 minutos hasta un total 
de 5 horas. El volumen de las tomas fue de 0,5 ml, los cuales se colocaban 
en un vial para insertar al HPLC, en el que previamente se habían colocado 
otros 0,5 ml de acetonitrilo. 
2ª prueba. 
En una segunda prueba se disminuyó el tiempo de residencia del sustrato 
quedando este en aproximadamente 22,2 minutos. 
Se añadió, además, el activador cloruro de potasio, que se había omitido 
en la prueba anterior, con una concentración de 20 µM. Las demás 
concentraciones y condiciones se mantuvieron con respecto a la corrida 
anterior. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 46 
 
II.4 Aplicación de la técnica a una muestra real de diesel. 
Para realizar esta prueba se utilizo diesel final procedente de la unidad U-
700 “Hidros II” de la refinería Ing. Antonio Dovali Jaime de Pemex 
Refinación en Salina Cruz, Oaxaca, con un contenido de azufre de 924 
ppm y de nitrógeno de 225 ppm. 
Se realizan dos pruebas, la primera de ellas con la siguiente composición: 
Fase acuosa: 45%; KCl: 20 mM; H2O2: 1mM; Buffer de acetatos: a 
completar el 45 %. Fase orgánica: 55% (isopropanol-diesel) 5 % de diesel 
en la carga; el alcohol isopropílico se agrega hasta completar el 55 %. 
Al reactor de 50 ml se agrega la enzima con una concentración de 14,26 
nM, lo cual corresponde al minuto 0 de la operación. 
Se colecta la salida y cada 5 ml se reserva, se le añaden 5 ml de 
diclorometano, para extracción del diesel e inactivación de la enzima. Se 
deja reposar la muestra y posteriormente se elimina la fase acuosa 
flotante y la orgánica se seca con sulfato de sodio anhidro para eliminar 
toda la humedad. Esta fase recuperada se coloca en un concentrador para 
eliminar el diclorometano y obtener el diesel que será inyectado al 
cromatógrafo de gases con detector de azufre y de nitrógeno. El diesel 
resultante se coloca en un vial con inserto con capacidad de 20 µL. 
La segunda prueba se lleva a cabo con una composición igual a la anterior 
con el único cambio en la concentración de la enzima, la cual se aumento 
de 14,26 nM a 1 µM. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 47 
 
El tiempo de residencia en esta prueba fue de aproximadamente 25 
minutos. De igual manera se reservó cada 15 mililitros de la descarga y se 
trató tal como en la prueba anterior. 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 48 
 
 
 
 
 
 
 
IIIIII.. RReessuullttaaddooss yy 
ddiissccuussiióónn 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 49 
 
Después de determinar lascondiciones a las cuales se llevaría a cabo la 
reacción en el reactor, a partir de los experimentos de actividad 
enzimática, se llevaron a cabo 4 corridas en reactor batch: 
1ª prueba: 
La reacción no se llevó a cabo, pues a pesar de que la concentración del 
DBT sufre variaciones con respecto del tiempo, gráfica 1, los 
cromatogramas no muestran señal en el sitio que debería de aparecer la 
sulfona, en ellos solamente se observa un pico y es el que corresponde al 
DBT. 
III.1 Oxidación de DBT por CPO en medio monofásico en 
reactor intermitente. 
 
Gráfica 1. Avance de la reacción. Lote 1 
Se cree que esto se debió a la omisión del activador Cloruro de potasio, ya 
que no se agregó este al recipiente de reacción. No es posible determinar 
la velocidad de reacción, pues no ocurre una. 
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100 120
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 (
µ
M
)
Tiempo (min)
DBT
DBTS
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 50 
 
2ª prueba: 
En este segundo intento se agregó el activador de la enzima (KCl) y el 
resultado es que para el minuto 3 se había consumido en su totalidad el 
sustrato, la concentración de la sulfona ronda en el valor de 20 µM, gráfica 
2, que es la concentración esperada, tomando en cuanta que es la misma 
concentración de dibenzotiofeno que se coloca en un principio y la reacción 
es 1:1 estequiométricamente. Por lo tanto se considera que la reacción se 
llevó a cabo totalmente, en un tiempo de 2 minutos. 
 
Gráfica 2. Avance de la reacción. Lote 2 
La consideración de la estequiometría 1:1 nos lleva a esperar que la 
concentración máxima de la sulfona sea igual a la concentración inicial del 
DBT, la gráfica nos muestra, en algunos puntos, que esto no ocurre. Esto 
puede deberse a distintas circunstancias como errores en la toma de 
muestra o evaporación del disolvente utilizado, inclusive también a una 
acumulación por mala agitación. 
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70 80
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 (
µ
M
)
tiempo (min)
Sulfona
DBT
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 51 
 
3ª prueba: 
Se redujo la cantidad de enzima para intentar ampliar el tiempo de 
reacción y observar si existía una desactivación del catalizador en tiempos 
más largos. El resultado es que la reacción se lleva a cabo totalmente en 
un tiempo más corto, 1 minuto, que la anterior. La concentración de la 
sulfona es mayor que la esperada, 20 µM, y este comportamiento se 
mantiene constante, gráfica 3. 
 
Gráfica 3. Avance de la reacción. Lote 3 
El aumento en la velocidad de la reacción, de 8 a 11 µM/min, se puede 
deber a que el activador cloruro de potasio se encuentra en exceso con 
respecto a la enzima, esto hace que los sitios activos se saturen mas 
rápido y por lo tanto que haya una mayor conversión del sustrato. En el 
caso de la concentración de sulfona, que es mayor a la esperada, 
seguimos teniendo alguna acumulación, ya sea en el reactor, la pipeta o 
los viales con los que tiene contacto la muestra. 
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 (
µ
M
)
Tiempo (min)
DBTS
DBT
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 52 
 
4ª prueba: 
Se disminuye la cantidad de activador, para observar si la mayor actividad 
del biocatalizador, observada en el caso anterior, se debía a un exceso de 
este con respecto a la concentración de la enzima. 
El resultado es que el tiempo que tarda para que la reacción alcance su 
máximo es mayor, 4 minutos. Después de este máximo la concentración 
de la sulfona se mantiene oscilando alrededor de 23 µM (grafica 4) 
 
Gráfica 4. Avance de la reacción: Lote 4 
La velocidad de la reacción se reduce a solo 3 µM/min, de sulfona 
producida. Al haber la misma proporción de enzima y de activador, pero 
con una menor cantidad de enzima con respecto del sustrato, la reacción 
se lleva a cabo más lentamente pues el catalizador, al ser menos, necesita 
de mayor tiempo para oxidar la misma cantidad de reactivo. 
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 (
µ
M
)
Tiempo (min)
DBTS
DBT
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 53 
 
 
Gráfica 5. Comparación de avance de la reacción por lotes 
En la gráfica 5 se puede observar la diferencia en la velocidad de reacción 
para los 3 lotes, también podemos notar que la cantidad máxima de 
sulfona producida va aumentando según aumenta el numero progresivo 
del lote, esto nos puede dar una pista sobre la acumulación que se planteó 
anteriormente. 
En lo que respecta a la constante de inactivación, el cálculo de ésta se 
realizó en 3 zonas, pues la inactivación de la enzima no fue de forma lineal 
(Gráficas 6, 7 y 8). En la gráfica de tiempo, contra el logaritmo natural del 
cociente de la actividad a cualquier tiempo, entre la actividad inicial de la 
enzima, la pendiente del ajuste se utiliza para el cálculo de la constante de 
inactivación de cada zona. Se obtiene ki de la pendiente de las gráficas de 
ln (at/a0) contra tiempo. Como podemos ver, la inactivación se llevó a 
cabo más rápido en el batch 3, gráfica 7 y disminuyó su velocidad en los 
batches 2 y 4, gráfica 6 y 8. 
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70 80
C
o
n
ce
n
tr
a
ci
ó
n
 D
B
T
S
 (
µ
M
)
Tiempo (min)
Batch 2 STD
Batch 3 (-E)
Batch 4 (-KCl)
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 54 
 
 
Gráfica 6. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 2 
 
Gráfica 7. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 3 
 
Gráfica 8. Tiempo vs ln (at/a0). Lote 4 
De estas gráficas se obtienen los valores de la constante de inactivación 
(Tabla XI). El tiempo medio de inactivación (t½) se calculó de acuerdo a la 
ecuación 7: 
y = -0,2416x + 0,1816
y = -0,0752x - 0,8782
y = -0,0169x - 2,4356
-4,5
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0 20 40 60 80 100 120
ln
 (
a
t/
a
0
)
tiempo (minutos)
y = -0,4021x + 0,427
y = -0,1543x - 0,4486
y = -0,0387x - 1,8193
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
ln
 (
a
t/
a
0
)
tiempo (minutos)
y = -0,2964x + 0,2497
y = -0,1155x - 0,2048
y = -0,0275x - 1,6576
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0 10 20 30 40 50 60 70
ln
 (
a
t/
a
0
)
Tiempo (minutos)
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 55 
 
𝑡𝑡1
2�
= 𝑙𝑙𝑙𝑙 0,5
𝑘𝑘𝑖𝑖
 (7) 
Tabla I. Constante de inactivación y tiempo de vida media por lotes 
Lote 
[E]/[KCl] 
(nM/µM) 
ki (1/min) t ½ (min) 
A B C A B C 
2 14,26/20 0,242 
(1-6 min) 
0,075 
(7-25 min) 
0,017 
(30+ min) 
2,9 9,2 41 
3 7,13/20 0,402 
(1-3 min) 
0,154 
(4-10 min) 
0,039 
(15+ min) 
1,7 4,5 17,9 
4 7,13/10 0,296 
(1-5 min) 
0,115 
(7-15 min) 
0,028 
(20+ min) 
2,3 6 25,2 
Podemos observar, en la tabla anterior, que la enzima se desactiva con 
mayor rapidez en el tercer lote y para la primera zona de tiempo de 
reacción. Si recordamos, la velocidad de reacción para este lote fue la más 
alta, eso quiere decir que la enzima lleva a cabo la reacción con mayor 
velocidad pero también se inactiva más rápidamente. 
Si comparamos las constantes en los otros 2 lotes, vemos que existe una 
diferencia de un minuto en el tiempo medio de desactivación. Recordemos 
que la cantidad de enzima en la corrida 2 es el doble que aquella en el lote 
4, a pesar de esto la rapidez de reacción fue casi del triple en la segunda y 
su inactivación un poco más lenta. 
 
Neevia docConverter 5.1
OXIDACIÓN DE DIBENZOTIOFENO 
 
MONTERO 56 
 
1ª prueba reactor CSTR. 
En la primera operación del reactor, la reacción se lleva acabo y los datos 
del cromatógrafo arrojan valores de concentración máxima, de la sulfona 
producida, de 8 µM, valor que se alcanza al minuto 20 de operación, 
posteriormente la concentración cae a un valor