Identificação de mudanças conformacionais em receptores de hormônios esteroides

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Facultad de Medicina
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS CAMBIOS 
CONFORMACIONALES EN LOS RECEPTORES DE HORMONAS
ESTEROIDES Y EL RECLUTAMIENTO DE COACTIVADORES 
POR EL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS ALFA, INDUCIDO POR 
ESTEROIDES NATURALES Y SINTÉTICOS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL)
P R E S E N T A
BIOL. ELIZABETH BORJA CACHO
DIRECTORA DE TESIS: M. EN C. ROCÍO ÁNGELES GARCÍA BECERRA
MÉXICO, D.F. ENERO, 2006 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Facultad de Medicina
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS CAMBIOS 
CONFORMACIONALES EN LOS RECEPTORES DE HORMONAS
ESTEROIDES Y EL RECLUTAMIENTO DE COACTIVADORES 
POR EL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS ALFA, INDUCIDO POR 
ESTEROIDES NATURALES Y SINTÉTICOS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL)
P R E S E N T A
BIOL. ELIZABETH BORJA CACHO
DIRECTORA DE TESIS: M. EN C. ROCÍO ÁNGELES GARCÍA BECERRA
MÉXICO, D.F. ENERO, 2006 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada durante el 
período de septiembre del 2003 al junio del 2005, para la realizar los estudios de 
Maestría en la Facultad de Medicina de la UNAM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Rocío García, por los cinco años que trabajamos juntas, por la confianza que depositó 
en mí durante todos estos años y por que gran parte de mi formación profesional dentro 
de la investigación básica la aprendí de ella. 
 
 
 
Al Dr. Fernando Larrea, por haberme permitido trabajar en el Departamento de Biología 
de la Reproducción y por el apoyo brindado durante cinco años. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
A mis padres: 
 
Por que nunca han dejado de apoyarme y por que 
esta es una de las maneras de devolverles todo lo 
que me han dado. 
 
 
A mi hermano: 
 
Por los veintiséis años de convivencia en los que 
siempre nos hemos ayudado. 
 
 
A Rodrigo: 
 
Por todo el apoyo que me brindó durante 
estos dos años de la maestría y por todo su 
cariño. 
 
 
A mis amigos del Departamento de Biología de la Reproducción: 
 
Por todos los momentos buenos y malos que pasamos juntos, 
por sus consejos, por el apoyo pero más que nada por su 
amistad 
 
 
ÍNDICE 
 
 
ABREVIATURAS______________________________________________________ 3 
RESUMEN____________________________________________________________ 4 
 
ABSTRACT____________________________________________________________6 
INTRODUCCIÓN _____________________________________________________ 8 
Los Receptores Nucleares. _______________________________________________ 8 
Mecanismo de acción de los receptores a hormonas esteroides.________________ 10 
El receptor de progesterona. ____________________________________________ 12 
Isoformas A y B del receptor de progesterona.______________________________ 13 
El receptor de andrógenos.______________________________________________ 16 
El receptor de estrógenos. ______________________________________________ 18 
Los subtipos α y β del receptor de estrógenos.______________________________ 19 
Ligandos selectivos para los subtipos del receptor de estrógenos. ______________ 21 
La interacción de los coactivadores con el receptor de estrógenos. _____________ 24 
Estructura de la familia p160/SRC. ______________________________________ 25 
Base estructural para las proteínas p160/SRC y su interacción con AF-2._________ 29 
El amino terminal AF-1 y su interacción con los coactivadores. ________________ 29 
Estructura de la familia CBP/ p300. ______________________________________ 30 
Mecanismo de acción de las proteínas correguladoras. ______________________ 32 
ANTECEDENTES ____________________________________________________ 36 
HIPÓTESIS__________________________________________________________ 40 
OBJETIVOS _________________________________________________________ 41 
Objetivos particulares ___________________________________________________ 41 
 
 1
MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________ 42 
Reactivos. ____________________________________________________________ 42 
Plásmidos. ___________________________________________________________ 42 
Construcción de los vectores para el sistema de los dos híbridos. ______________ 45 
Preparación de bacterias competentes.____________________________________ 46 
Transformación de bacterias competentes. ________________________________ 46 
Purificación y verificación de los plásmidos. _______________________________ 47 
Maxi preparación._____________________________________________________ 48 
Cultivo Celular._______________________________________________________ 49 
Transcripción y traducción acopladas in vitro y la digestión parcial por proteasas. 49 
Sistema de los dos híbridos en células de mamífero. _________________________ 50 
Transfecciones y análisis del reportero del sistema de los dos híbridos. _________ 54 
 
RESULTADOS _______________________________________________________ 56 
1. Efectos de los derivados sintéticos de la 19-nortestosterona sobre la 
conformación de los RPB y RA. __________________________________________ 55 
2. Efectos de los derivados sintéticos de la 19-nortestosterona sobre la 
conformación de los REα y REβ. ________________________________________ 64 
3. Reclutamiento de proteínas coactivadoras por el REα. __________________ 72 
DISCUSIÓN _________________________________________________________ 77 
CONCLUSIONES_____________________________________________________ 84 
APÉNDICE __________________________________________________________ 85 
REFERENCIAS ______________________________________________________ 88 
 2
ABREVIATURAS 
 
 
 
AF función de activación 
AMPc adenosín monofosfato cíclico 
CBP proteína de unión a CREB 
CREB proteína asociada a elementos de respuesta a AMPc 
DBD dominio de unión al DNA 
E2 estradiol 
GSD gestodeno 
hsp proteínas de choque térmico 
LBD domonio de unión al ligando 
LNG levonorgestrel 
LUC enzima luciferasa 
NET norestisterona 
NR receptor nuclear 
P4 progesterona 
RA receptor de andrógenos 
RE receptor de estrógenos 
REα receptor de estrógenos α 
REβ receptor de estrógenos β 
RP receptor de progesterona 
RPA receptor de progesterona A 
RPB receptor de progesterona B 
SRC-1 coactivador de receptores esteroides-1 
 
 
 3
RESUMEN 
 
 
 
 
La norestisterona (NET), el levonorgestrel (LNG) y el gestodeno (GSD) son progestinas 
sintéticas derivadas de la 19-nortestosterona las cuales son metabolizadas a compuestos 
dihidro y tetrahidroreducidos. Para investigar los mecanismos moleculares mediante los 
cuales las 19-nor progestinas así como sus correspondientes derivados reducidos en el 
anillo A, presentan diferentes efectos hormonales, se evaluaron los cambios 
conformacionales inducidos en los diferentes receptores de hormonas esteroides como: el 
receptor de progesterona-B (RPB),el receptor de andrógenos (RA) y a los receptores de 
estrógenos α (REα) y β (REβ), a través de un sistema basado en digestiones parciales del 
receptor. Además, se evaluó la habilidad de estos ligandos para promover el 
reclutamiento de proteínas coactivadoras como las p160/SRC o CBP/p300 por el REα 
utilizando el sistema de los dos híbridos en células de mamífero. Los resultados obtenidos 
demuestran que el patrón de fragmentación proteolítico inducido por los ligandos de tipo 
agonista, difiere de aquel obtenido de la digestión del receptor en presencia de 
compuestos antagonistas y que este análisis al igual que el del reclutamiento de 
coactivadores, son herramientas útiles para indicar y determinar la naturaleza 
agonista/antagonista de diversos ligandos. Para el RPB y el RA se observó que las 
moléculas sin reducir y sus derivados 5α-reducidos tenían la capacidad de inducir 
patrones de fragmentación proteolítcos en sus receptores similares a los obtenidos por la 
P4 y DHT respectivamente, estos resultados confirman la actividad progestacional y 
androgénica de los derivados sintéticos de la serie 19 nor. De manera interesante, se 
observó que únicamente los derivados tetrahidro reducidos de la NET, el LNG y el GSD 
inducían un cambio conformacional en el REα similar al inducido por el E2, sin efecto 
alguno a través del REβ, confirmando estudios previos realizados en nuestro laboratorio 
en donde se demostró que los derivados tetrahidro reducidos son selectivos para activar la 
transcripción de genes responsivos a estrógenos únicamente a través del REα. Por otra 
parte, estos compuestos presentaron la habilidad de inducir el reclutamiento de los 
coactivadores SRC-1 y CBP por el REα, de manera similar a como lo hace el E2 natural. 
La caracterización de los cambios conformacionales inducidos en ambos subtipos del RE, 
 4
así como en el RP y RA por éstos ligandos nos permiten entender el mecanismo 
molecular del receptor ya sea en presencia de un compuesto agonista o de uno 
antagonista y por lo tanto su capacidad de activar la trancripción. Los ligandos que tienen 
la capacidad de unirse al receptor de estrógenos (RE) y activar selectivamente al subtipo 
α o al subtipo β, serán de gran utilidad para determinar la biología de ambos receptores y 
para el desarrollo de nuevas terapias basadas en las acciones hormonales. 
 5
ABSTRACT 
 
 
 
Norethisterone (NET), levonorgestrel (LNG) and gestodene (GSD) are 19-
nortestosterone progestins that can be biotransformed to dyhydro and tetrahydro-reduced 
compounds. In order to investigate the molecular mechanisms in which 19 nor progestins 
and their corresponding A ring reduced derivatives, show different hormonal effects, we 
investigated the structural conformation induced in the progesterone receptor-B (PRB), 
the androgen receptor (AR) and both estrogen receptor alpha (ERα) and estrogen receptor 
beta (ERβ) using a limited trypsinization assay. We also evaluated the ability of these 
compounds to induce recruitment of steroid receptor coactivator-1 (SRC-1) and CBP 
(CREB binding protein) coactivator to ERα with mammalian two hybrid system. The 
results demonstrated that trypsin digestion pattern induced by agonist ligands are 
different from that generated by antihormone ligands. These assays have proven to be a 
reliable method to analyze the ligand-induced conformation of both ER subtypes and 
their agonist vs antagonist bond conformations. For PRB and AR, we found that the 
original molecule as well as their 5α-reduced derivatives induced a similar ligand-
receptor trypsin digestion pattern to that of P4 and DHT respectively. These results 
confirm the progestational and androgenic activites of 19-nor progestins. Interestingly, 
incubations in the presence of 3β,5α-NET, -LNG or -GSD produced a proteolytic 
fragment pattern virtually identical to that obtained with E2, without effects upon ERβ, 
confirming data from previous studies perfomed in our laboratory where we showed that 
non-phenolic tetrahydro reduced metabolites behave as full selective ERα agonists by 
activating ER-dependent gene transcription. On the other hand, the same compounds 
showed the ability to recruit SRC-1 and CBP to the ERα with an efficiency close to E2, 
suggesting that these 19-nortestosterone synthetic derivatives were able to induce similar 
agonist conformational changes in ERα structure than natural E2. The application of these 
methods to characterize different conformations induced in both ER subtypes, as well as 
in PR and AR by these compounds, will be useful to get understanding on how steroid 
receptors behave in presence of agonist/antagonist ligands and so their ability for gene 
transcription activation induction. The selectivity of these compounds for an ER subtype 
 6
may provide additional structural basis for the development of new therapeutic and/or 
contraceptive formulations with disease-prevention benefits. 
 
 
 7
INTRODUCCIÓN 
 
 
Los Receptores Nucleares 
 
Los receptores nucleares pertenecen a la familia de factores de transcripción, que son 
activados por moléculas o ligandos pequeños y específicos como son; las hormonas 
esteroides, las hormonas tiroideas, los ácidos retinóicos, la vitamina D, los ácidos grasos 
y eicosanoides los cuales, juegan un papel importante en la expresión génica [1]. Los 
genes regulados por los receptores nucleares están involucrados en una gran variedad de 
procesos celulares como el metabolismo, el desarrollo, el crecimiento, la diferenciación y 
señalización endócrina entre otros [1, 2] . 
 
Los receptores nucleares tienen tres dominios funcionales importantes: un dominio amino 
terminal variable (N-terminal) conteniendo funciones de activación, un dominio de unión 
al DNA altamente conservado (DBD) y hacia el extremo carboxilo terminal (C-terminal) 
se encuentra el dominio de unión al ligando (LBD) [3-5]. 
 
El dominio de unión al DNA contiene dos dedos de zinc asimétricos cada uno de los 
cuales está coordinado por 4 residuos de cisteína conservados [6]. El dominio de unión al 
ligando presenta una estructura conservada consistiendo de 10 a 12 hélices que se pliegan 
formando 3 capas. La hélice alfa localizada más hacia el extremo carboxilo terminal 
(H12), se extiende afuera del centro del LBD en ausencia del ligando, la cual toma otra 
posición en respuesta a la unión de la hormona plegandose hacia el centro del dominio. 
Esta posición sella el sitio de entrada de la cavidad de unión y crea una superficie 
hidrofóbica en el LBD que es reconocida por los coactivadores [7]. 
 
El LBD contiene sitios para la unión a proteínas de choque térmico (hsps) e 
inmunofilinas [8], para la dimerización del receptor, sitios de localización nuclear (SLN) 
y un dominio de activación transcripcional dependiente del ligando, denominado función 
de activación-2 (AF-2) [9, 10]. El DBD contiene un segundo dominio de dimerización 
que depende de la unión al DNA. La dimerización del receptor juega un papel doble al 
 8
estabilizar al complejo receptor-DNA y actuar como una molécula que orienta de manera 
apropiada al receptor dimerizado con respecto a los elementos de respuesta en el DNA 
[11-13]. El extremo amino terminal es el más variable en cuanto a longitud y secuencia 
de aminoácidos. Algunos receptores nucleares, en particular los de hormonas esteroides, 
tienen un extremo N-terminal que contiene un segundo dominio de activación 
transcripcional denominada AF-1 (Fig. 1) [14, 15]. 
 
 
 
DBD LBD/AF-2H COOH-N+H3
• Dominio de unión al ligando
• SLN
• Dimerización
• Unión al DNA
• SLN
• Dimerización
AF-1 DBD LBD/AF-2H COOH-N+H3
• Dominio de unión al ligando
• SLN
• Dimerización
• Unión al DNA
• SLN
• Dimerización
AF-1
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Dominios funcionales de los receptores nucleares. Los receptores nucleares cuentan 
con un extremo amino terminal variable el cual contiene la función de activacióntranscripcional-1 (AF-1), un dominio de unión al DNA altamente conservado (DBD), la región 
bisagra (H) y hacia el extremo carboxilo terminal el dominio de unión al ligando (LBD), el cual 
contiene la función de activación-2 (AF-2). Los sitios de localización nuclear (SLN) y los 
dominios de dimerización también son mostrados en la figura [1]. 
 9
Mecanismo de acción de los receptores a hormonas esteroides 
 
El mecanismo de acción general de los receptores para hormonas esteroides es similar al 
de otros miembros de la famila de los receptores nucleares [16]. En ausencia del ligando, 
el receptor es transcripcionalmente inactivo y se localiza en el núcleo de las células 
blanco, unido a un complejo de proteínas de choque térmico (hsps: hsp-90, hsp-70, y 
p59) [17-21]. Una vez que el ligando se une al receptor, este sufre cambios en su 
conformación que resultan en la disociación del receptor monomérico del complejo de 
proteínas de choque térmico y posteriormente el receptor se fosforila [16, 22]. La 
activación de los receptores de estrógenos (RE), de progesterona (RP), andrógenos (RA) 
y otros receptores se acompaña de un incremento en la fosforilación del receptor y se 
asocia con un incremento en la actividad transcripcional del mismo [23-25]. El 
mecanismo de acción molecular a través del cual los cambios en la fosforilación del 
receptor alteran la expresión de genes aún no se conocen. Por ejemplo, el receptor de 
estrógenos alfa (REα) es fosforilado en respuesta al tratamiento con estrógenos en células 
en cultivo así como a la estimulación con factores de crecimiento, esta fosforilación se 
asocia con un incremento en la actividad transcripcional [23, 26]. Finalmente, los 
receptores unidos al ligando se dimerizan e interaccionan con los elementos de respuesta 
hormonal en el DNA dentro de la región reguladora de genes blanco (Fig. 2) [17]. 
 
Cuando el complejo hormona-receptor se une al DNA puede tener un efecto positivo o 
negativo sobre la transcripción del gen blanco, según el contexto celular o del promotor. 
La transducción de señal mediada por los receptores de hormonas esteroides tiene al 
menos dos mecanismos por los cuales se induce la transcripción de genes. En el primer 
mecanismo, el receptor activado por el ligando se une a secuencias específicas en el DNA 
de forma directa. En el segundo caso, el receptor activado se une a los componentes de la 
maquinaria general de transcripción (MGT) a través de proteínas correguladoras [27-31]. 
Estas dos vías de activación transcripcional son utilizadas diferencialmente por los 
receptores nucleares en distintas células. 
 10
 
 
Adaptador
MGT
TATA
P P
R
P P
R
Adaptador
MGT
TATATATA
P P
R
P P
R
Adaptador
ERH
P P
R
P P
R
ERH
P P
R
P P
R
HH
hsp
90
hsp
90
hsp
70
p59
R
hsp
90
hsp
90
hsp
70
p59
R
hsp
90
HH
hsp
90
hsp
90
hsp
70
p59
R
hsp
90
hsp
90
hsp
70
p59
R
hsp
90
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Mecanismo de acción de los receptores de hormonas esteroides. Después de la 
unión del ligando, el receptor sufre un cambio conformacional debido a la liberación de proteínas 
de choque térmico seguido de la fosforilación y dimerización del receptor. Una vez en el núcleo, 
el receptor dimerizado se une a su respectivo elemento de respuesta en el DNA, donde se 
aumenta el grado de fosforilación. El dímero del receptor unido al DNA recluta las proteínas 
correguladoras que unen a la maquinaria general de transcripción (MGT). La interacción con la 
MGT modula la actividad de la RNA polimerasa II generando un receptor transcripcionalmente 
activo [32]. 
 11
El receptor de progesterona. 
 
La progesterona (P4) es una hormona esteroide, encargada de la regulación del desarrollo 
y mantenimiento del sistema reproductivo [33]. El uso adecuado de antiprogestinas como 
son el RU486 en el tratamiento de enfermedades tales como meningiomas cerebrales, 
endometriosis, y fibrosis uterinas han implicado a la P4 como una hormona reguladora de 
un amplio rango de procesos biológicos adicionales [34]. Es por esta razón que existe un 
gran interés en definir el mecanismo de acción molecular del RP, así como del desarrollo 
de nuevos fármacos que puedan presentar una actividad ya sea progestacional o 
antiprogestacional. 
 
Como se menionó anteriormente, el RP es un factor de transcripción dependiente del 
ligando que comparte la estructura con el resto de la familia de los receptores nucleares 
(Fig. 3) [5]. 
 
AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD COOH-
Dominio de unión al ligando
SLN
Unión HSP
Dimerización
Funciones de transactivación
N+H3 AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBDAF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD COOH
-
Dominio de unión al ligando
SLN
Unión HSP
Dimerización
Funciones de transactivación
N+H3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Receptor de progesterona. El receptor de progesterona está compuesto por un 
dominio de unión al DNA altamente conservado (DBD), un dominio de unión al ligando 
(LBD), una región de bisagra localizada entre el DBD y el LBD, un dominio carboxilo 
terminal y otro amino terminal. Dentro del LBD hay regiones responsables de la 
dimerización del receptor, interacción con las proteínas de choque térmico (hsps), 
localización nuclear (SLN), y activación dependiente del ligando (AF-2) y dos funciones 
de activación adicional (AF-1 y AF-3) localizados dentro de la región amino terminal. 
[32].
 12
Isoformas A y B del receptor de progesterona 
 
El receptor de progesterona humano existe en dos isoformas: el hRPA (94 kDa) y el hRPB 
(114 kDa) (Fig. 4) [35]. El hRPA es una forma truncada del hRPB debido a que carece de 
los primeros 164 aminoácidos del extremo N-terminal. Ambas isoformas han sido 
identificadas en la mayoría de las especies, con excepción del conejo, donde solo se 
identificó el hRPB [36]. En los humanos existe una sola copia del gen para el RP y ambas 
isoformas son transcritas por iniciación alternativa a partir de dos promotores diferentes 
estrógeno-inducibles [37]. Se han observado diferencias en el nivel relativo de expresión 
de ambas isoformas del RP [35]. Específicamente en el útero, las cantidades de 
hRPA:hRPB son desde 50:1 a 2:1 durante el ciclo menstrual, debido principalmente al 
incremento en el nivel de expresión del hRPB [38], mientras que niveles bajos del hRPB 
han sido detectados sobre todo en tumores primarios de mama y de endometrio [39, 40]. 
Se ha observado que cuando el RP se dimeriza pueden formarse 3 combinaciones 
distintas debido a la presencia de 2 isoformas por ejemplo; homodímeros A:A y B:B y 
heterodímeros A:B [41, 42]. Las isoformas A y B del hRP no son funcionalmente iguales 
y es posible que las tres formas diméricas del receptor activado no sean funcionalmente 
idénticas, de tal manera que las diferencias en la expresión de los receptores podrían 
influir en la respuesta celular por progestinas y antiprogestinas. 
 
 
 13
 
 
 
AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD
AF-1 DBD AF-2 LBD
Pm1I
Pm1I
Región variable
hRPB
hRPA
AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBDAF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD
AF-1 DBD AF-2 LBD
Pm1I
Pm1I
Región variable
hRPB
hRPA
5’ 3’
5’ 3’
AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD
AF-1 DBD AF-2 LBD
Pm1I
Pm1I
Región variable
hRPB
hRPA
AF-3 AF-1 DBD AF-2 LBDAF-3 AF-1 DBD AF-2 LBD
AF-1 DBD AF-2 LBD
Pm1I
Pm1I
Región variable
hRPB
hRPA
5’ 3’
5’ 3’
 
 
Figura 4. Estructura de las isoformas del RP. Las regiones de menor homología entre los RPs 
están localizadas hacia la región 5’ del sitio único de restricción Pm1I presente en ambos 
receptores (55% de similitud, 30% de identidad). Las regiones de alta homología se encuentran 
hacia la región 3’ del sitio de restricción Pm1I (90% similitud, >72% identidad) hRPB.- receptor 
de progesterona humano-B; hRPA.-receptor de progesteona humano-A; LBD.- dominio de unión 
al ligando; AF-2.- función de activación-2; DBD.- dominio de unión al DNA; AF-1.- función de 
activación –1; AF-3.- función de activación –3 [32].14
Ambas isoformas del RP humano tienen capacidad de unirse al ligando y al DNA [43]. 
Sin embargo, en estudios utilizando células de mamífero y sistemas de transcripción 
dependientes de progesterona, se demostró que el hRPA y hRPB tienen afinidad por 
promotores diferentes [44]. Además, las actividades transcripcionales de estas isoformas 
varian dependiendo del tipo de célula y del promotor [16, 44-47]. Los estudios realizados 
con ambas isoformas del RP, demostraron que el hRPB funcionó como un activador de la 
transcripción de construcciones conteniendo los clásicos elementos de respuesta a 
progesterona (ERP), mientras que el hRPA no, concluyendo que este receptor podría 
funcionar como un transrepresor dominante dependiente del ligando [44]. 
 
Una de las características más importantes de la familia de los receptores esteroides, es 
que cada uno es responsable de una vía reguladora y responde a hormonas 
estructuralmente distintas, y que existen varios puntos de convergencia o 
intercomunicación entre las vías de señalización. Por ejemplo, el hRPA además de 
modular la actividad transcripcional del hRPB funciona como un transrepresor dominante 
de la actividad transcripcional de otros receptores de esteroides tales como el receptor de 
glucocorticoides (RG), el RA, el receptor de mineralocorticoides (RM) y el RE. Esta 
característica no se ha identificado en otros miembros de la familia de los receptores 
nucleares [45, 47, 48]. 
 15
El receptor de andrógenos 
 
El RA es miembro de la familia de los receptores nucleares [5, 49] y regula la respuesta a 
hormonas masculinas como la testosterona (T) y la 5α dihidrotestosterona (DHT) en los 
tejidos. La proteína del RA está formada aproximadamente de 917 aminoácidos de 
longitud que conforman al dominio de unión al DNA, el dominio de unión al ligando y la 
región amino terminal [50-53]. 
 
En estudios realizados con pacientes que presentaban el síndrome de feminización 
testicular completo, se identificó una forma más pequeña del RA humano [54]. 
Observaciones subsecuentes, revelaron que esta isoforma del receptor de andrógenos, 
denominada RAA debido a su similitud con la estructura del RPA, difería de la estructura 
determinada para la forma B del RA ya que carecía completamente del extremo 
N- terminal, pero tanto el dominio de unión al DNA como el dominio de unión al ligando 
se encontraban intactos. Algunos análisis demostraron que esta isoforma del RA se 
expresa en una gran variedad de tejidos aunque con bajos niveles, es decir el RA está 
presente en varias células de dos formas [55]. Mientras la isoforma B migra con un 
aparente peso molecular de 110 kDa y constituye más del 80% del receptor 
inmunoreactivo en la mayoría de las células, la forma A migra con un peso aproximado 
de 87 kDa, el cual parece derivar de una iniciación de la traducción alterna y que 
constituye 20% o menos del RA inmunreactivo (Fig. 5) [55]. 
 
Como en el caso del RP, la expresión de diferentes isoformas del RA se ha detectado en 
diversos tejidos. A diferencia del RPA, el RAA, se ha detectado en concentraciones 
relativamente bajas y no se han identificado hasta la fecha tejidos donde únicamente se 
exprese el RAA como forma predominante [56, 57]. A pesar de esto, la similitud entre las 
estructuras de las isoformas A y B para el RA y el RP sugieren que la isoforma A del 
receptor de andrógenos puede jugar distintos papeles en la regulación de los genes que 
responden a andrógenos. 
 
 
 
 16
 
 
 
AF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RAB
AF-1 DBD LBD/AF-2 RAA
AF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RABAF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RAB
AF-1 DBD LBD/AF-2 RAAAF-1 DBD LBD/AF-2 RAA
5’ 3’
5’ 3’
AF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RAB
AF-1 DBD LBD/AF-2 RAA
AF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RABAF-3 AF-1 DBD LBD/AF-2 RAB
AF-1 DBD LBD/AF-2 RAAAF-1 DBD LBD/AF-2 RAA
5’ 3’
5’ 3’
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Receptor de andrógenos humano. Las regiones de menor homología entre los RAs 
están localizadas hacia la región 5’ y las regiones de alta homología se encuentran hacia la región 
3’ del receptor. RAB.- receptor de andrógenos -B; RAA..-receptor de andrógenos-A; LBD.- 
dominio de unión al ligando; AF-2.- función de activación-2; DBD.- dominio de unión al DNA; 
AF-1.- función de activación –1; AF-3.- función de activación –3 [55]. 
 
 
 
 
 
 
 
 17
El receptor de estrógenos. 
 
 
Los estrógenos juegan un papel importante en el crecimiento, desarrollo y mantenimiento 
de una gran variedad de tejidos. Estos ejercen sus efectos fisiológicos a través del RE, 
que funciona como un regulador transcripcional ligando activado [3]. 
 
El receptor de estrógenos es miembro de la superfamilia de los receptores nucleares, es 
un factor de transcripción con secuencias específicas que al igual que algunos otros 
factores de transcripción ha conservado los dominios de unión al DNA y de 
transactivación [3, 58, 59]. En ausencia del ligando, el RE presenta poca actividad 
transcripcional pero, la unión de un ligando agonista resulta en un aumento de la 
actividad transcripcional [60-62]. 
 
En un principio se creía que los efectos de los estrógenos eran mediados únicamente a 
través de un RE, pero posteriormente se descubrió una segunda forma del mismo al cual 
se le denominó REβ [63, 64]. Ambos subtipos del receptor de estrógenos (REα y REβ) 
exhiben la organización característica de los dominios de los receptores nucleares que 
incluyen un dominio variable de transactivación N-terminal (AF-1), una región para la 
unión al DNA altamente conservada con dedos de zinc y un dominio de unión a la 
hormona C-terminal. El LBD es multifuncional y además tiene un sitio de 
reconocimiento al ligando conteniendo las regiones para la dimerización del receptor y 
transactivación dependiente del ligando (AF-2). A pesar de que el mecanismo preciso por 
el cual el RE modula la actividad de la RNA polimerasa no se sabe con exactitud, 
recientemente se ha demostrado que el receptor unido a ligandos agonistas tiene la 
capacidad del reclutar a algunos adaptadores transcripcionales o proteínas que permiten 
al receptor transmitir su información reguladora al aparato celular transcripcional [65, 
66]. 
 18
Los subtipos α y β del receptor de estrógenos 
 
El primer RE fue clonado hace más de diez años (REα) del cual, se creía era el único y a 
través del cual los estrógenos mediaban sus efectos [67, 68]. El segundo RE, denominado 
REβ, fue identificado y clonado a partir de próstata de rata [63]. Este hallazgo fue 
seguido por la clonación de diferentes formas de REβ del testículo humano [69, 70] y del 
ovario de ratón [64, 71]. La presencia de dos REs indicó que el mecanismo de acción 
biológico de los estrógenos así como de algunas drogas sintéticas y naturales 
relacionadas, era más complejo de lo que se había pensado. Más complejo fue: 1) la 
identificación de varias isoformas para el REβ, algunos con un N-terminal prolongado 
[64] y otros con una inserción de 18 aminoácidos en el LBD [72, 73] y 2) que el REα y el 
REβ pueden formar heterodímeros [64, 74]. 
 
El REβ es codificado por un gen diferente del que codifica al REα [63, 69]. Ambos 
receptores comparten únicamente el 47% en su secuencia de aminoácidos, con un 18% de 
homología en el extremo N-terminal A/B hacia donde se localiza la AF-1 y el 56% de 
homología en su secuencia de aminoácidos en el LBD incluyendo a la AF-2. El DBD se 
encuentra altamente conservado (Fig. 6). Como se mencionó anteriormente, los subtipos 
α y β del RE muestran diferencias entre los dominios AF-1 sugierendo que la activación 
transcripcional de genes responsivos a estrogenos deben mostrar patrones diferentes, de 
tal forma que las diferencias en la activación del gen además de estar influenciadas por 
factores promotor y célula específicos [60, 75-77] también se deben a la interacción 
sinergística entre los dominios de activación N-terminal y C-terminal del receptor [48].19
 
 
A/B C D E F
191 461 1990
AF-1 DBD H LBD AF-2 COOH-N+H3
RNAm
REα
RNAm
REβ
12 1456
AF-1 DBD H LBD AF-2 COOH-N+H3
Proteína
Proteína
A/B C D E F
191 461 1990
AF-1 DBD H LBD AF-2 COOH-N+H3
RNAm
REα
RNAm
REβ
12 1456
AF-1 DBD H LBD AF-2 COOH-N+H3
Proteína
Proteína
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Esquema de los RNAm y las proteínas que codifican para el REα y REβ. Se 
muestran las estructuras de los receptores de estrógenos α y β de ratón, así como las 
localizaciones aproximadas de aquellos dominios modulares específicos del receptor. Se indican 
los dominios estructurales de estos receptores (A/B, C, D, E y F), así como los dominios de unión 
a la hormona, unión al DNA y funciones de transactivación (AF-1 y AF-2) [78]. 
 
 
 
 20
Ligandos selectivos para los subtipos del receptor de estrógenos. 
 
Debido a que el REα y el REβ tienen secuencias primarias significativamente diferentes 
en sus LBDs, es razonable que estos subtipos del RE se unan a algunos ligandos con 
diferente afinidad y que estos ligandos tengan también diferentes caracteres de agonismo 
o antagonismo mediado por los dos receptores. Además, ambos receptores presentan 
coincidencias pero también difieren en su distribución tisular [63, 69, 79], lo cual se 
traduce en diferencias importantes en sus acciones biológicas a nivel del tejido. 
 
Para identificar compuestos con actividad selectiva por los subtipos del RE, se 
examinaron algunos ligandos para los REs, de los que se identificaron varios ligandos no 
esteroidales que muestran diferencias pronunciadas subtipo-selectiva en la unión al 
ligando y en la potencia transcripcional o eficacia del REα y el REβ. A este respecto, el 
compuesto pirazol activó la transcripción de genes reporteros a través de su interacción 
con el REα, mostró ser 120 veces más potente en estimular al REα comparado con el 
REβ [80, 81]. Posteriormente, se sintetizaron una serie de análogos con sustituciones de 
varios grupos a la molécula original del pirazol [82, 83]. Los análogos evaluados fueron 
agonistas del REα, pero los compuestos BSC-pirazol (adición de una cadena básica 
lateral al corazón del pirazol) [84] y MPP metil-piperidino-pirazol [82], resultaron 
antagonistas selectivos para el REα (Tabla 1). 
 
Por otra parte, otros compuestos no esteroidales, el tetrahidrocriseno (THC) [85] y el 
THC, rac-2b [82] son compuestos agonistas para el REα y antagonistas selectivos para el 
REβ [80]. Investigaciones al respecto han revelado que el carácter antagonista en los 
ligandos THC para el REβ depende del tamaño y disposición geométrica de los grupos 
que se adicionan a la molécula original [85]. Además, los antagonistas que son 
selectivamente efectivos en el REβ pueden tener estructuras que son muy diferentes de 
los antiestrógenos típicos (tamoxifeno, raloxifeno, ICI 182, 780). Se han identificado 
otros compuestos que son potencialmente más selectivos por el REα que el pirazol, 
mientras otros son agonistas selectivos para el REβ (Tabla 1). Algunos fitoestrógenos 
 21
como la genisteína, la daidzeína y el equol, así como algunos androstanedioles, activan a 
ambos REs α y β pero muestran selectividad hacia el REβ. 
 
En nuestro laboratorio se han descrito otros ligandos esteroidales con actividad agonista 
selectiva para el REα en la unión al ligando y potencia transcripcional [86, 87]: la 
noretisterona (NET), el levonorgestrel (LNG) y el gestodeno (GSD) las cuales son 
progestinas sintéticas derivadas de la 19-nortestosterona, ampliamente utilizadas en 
formulaciones anticonceptivas. Las progestinas no se unen al RE, pero muestran efectos 
estrogénicos en condiciones in vivo e in vitro [88, 89]. Los efectos estrogénicos son 
atribuídos a sus metabolitos no fenólicos resultado de la doble reducción en el anillo A de 
la molécula; generando así compuestos 5α-dihidro y 3β,5α-tetrahidro reducidos [90, 91]. 
La capacidad de los metabolitos reducidos para activar la transcripción vía un mecanismo 
de acción estrogénico, incluyendo las diferencias selectivas entre los subtipos del RE α y 
β fue atribuída solamente para los compuestos 3β,5α-tetrahidro reducidos de NET, el 
LNG y el GSD. 
 
La identificación de compuestos selectivos para los subtipos del RE será de valiosa ayuda 
para el desarrollo de nuevos acercamientos terapéuticos basados en las acciones 
hormonales y proveé una herramienta importante para examinar las funciones 
moleculares y celulares específicas dependientes del REα y del REβ. 
 
 22
 
Tabla 1. Interacción de diferentes compuestos esteroidales y no esteroidales con los subtipos del 
receptor de estrógenos. 
 
 
 
Compuesto 
 
 
Actividad 
 
 
Receptor
 
 
Referencia 
 
 
 Pirazol (miembro de la familia Diazol) 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[81] 
 
 PPT, propilpirazoltriol 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[80, 82] 
 
 FPPT, fluoropropilpirazoltriol 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[83] 
 
 BSC-pirazol, cadena básica lateral 
 
Antagonista selectivo 
 
REα 
 
[84] 
 
 MPP, metilpiperidinopirazol 
 
Antagonista selectivo 
 
REα 
 
[82] 
 
 Pirazolopirimidina 
 
Antagonista selectivo 
 
 
REβ 
 
[92] 
 
 DPN, diarilpropionitrilo Agonista selctivo REβ [82] 
 R,R-THC, R,R-tetrahidrocriseno (cromóforo 
 estilbeno) 
Agonista 
Antagonista selectivo 
 REα 
REβ 
 
[80, 82] 
 
 THC, rac-2b 
 
Agonista 
Antagonista selectivo 
 
REα 
REβ 
 
[85] 
 
 SKF-82958 (agonista del receptor de dopamina 
 D1) 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[93] 
 
 Benzoxatinas 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[94] 
 
 Fitoestrógenos: genisteína, daidzeína y S-equol 
 
Agonistas 
 
REβ 
 
[95, 96] 
 
 Benzofurano 
 
Agonista selectivo 
 
REα 
 
[97] 
 
 Progestinas sintéticas 19-nortestosterona: 
 3β,5α-NET, 
 3β,5α-LNG 
 3β,5α-GSD 
 
 
Agonistas selectivos 
 
 
REα 
 
[86, 87] 
 
 
 23
La interacción de los coactivadores con el receptor de estrógenos. 
 
A pesar de que todos los ligandos del RE se unen exclusivamente al LBD, la unión de un 
agonista causa actividad en la AF-2, pero la unión de un antagonista no. Análisis 
realizados sobre la estructura del RE unido al estradiol (E2) o al raloxifeno/tamoxifeno 
mostraron que cada clase de ligando induce una conformación diferente en el LBD y que 
este arreglo estructural es crítico para la regulación transcripcional inducida por el 
ligando, debido a que expone la superficie del receptor que recluta a los coactivadores y 
otras proteínas correguladoras [65]. 
 
La familia p160, llamada coactivador de receptores esteroides (SRC) p160/SRC, está 
constituída por tres miembros: 1) SRC-1 o NCoA-1, fue la primera molécula 
coactivadora p160 identificada como una proteína que interacciona con la AF-2 del RP o 
el RE y se demostró que su interacción era promovida por agonistas e inhibida por 
antagonistas [65], 2) SRC-2 o factor intermediario transcripcional 2 (TIF2)/NCoA-2 
proteína 1 relacionada a GR (GRIP-1) y 3) SRC-3 o ACTR/pCIP/coactivador asociado al 
receptor (RAC3)/TRAM-1/ amplificada en cáncer de mama 1 (AIB1) [30, 98-104]. Una 
región importante de estos coactivadores es el dominio de interacción con el receptor 
nuclear que consiste de tres secuencias de leucina separadas entre sí por cualquier otro 
aminoácido (aa) LXXLL (L= leucina, XX= a cualquier aa) denominada caja NR. Todos 
los p160 tienen un dominio de interacción nuclear que a su vez contiene tres de estas 
cajas arregladas en tandem. Una cuarta y única caja NR se localiza hacia el extremo 
C-terminal en una variante del SRC-1 y al cual se le ha denominado SRC-1a [31]. Estas 
secuencias representan los sitios de ensamble al dominio AF-2 del receptor nuclear [103, 
105]. Las cajas NR también han sido identificadas en otro tipo de moléculas 
coactivadoras que incluyen a los p300/CBP o proteínas de unión a elementos de respuesta 
a AMPc (CREB), TRAP 220/DRIP 205/PBP, PGC-1 y TRBP/ASC-2/RAP250 [106-
108].Los coactivadores no son capaces de unirse al DNA por sí solos si no que son reclutados 
por los promotores de algunos genes responsivos a esteroides a través de la interacción 
proteína-proteína con los receptores nucleares. Estos se unen directamente con los 
 24
receptores de hormonas esteroides principalmente en el dominio AF-2 del receptor de 
manera hormono-dependiente y básicamente por hormonas de tipo agonistas. Cuando se 
realizaron experimentos en los que la AF-2 era mutada, se observó una disminución en la 
unión de las proteínas p160 lo cual correlacionaba con la disminución en la actividad de 
la AF-2. Por otro lado, se observó que cuando los REs y RPs eran incubados en presencia 
de esteroides de tipo antagónico, estos inactivaban a la AF-2 y en consecuencia no era 
posible la unión de los p160, indicando que estos coactivadores eran necesarios para el 
funcionamiento adecuado de la AF-2. 
 
Estructura de la familia p160/SRC 
 
A pesar de que los diferentes miembros de la familia de los SRC comparten únicamente 
el 40% de homología en su secuencia, son proteínas moduladoras con regiones o 
secuencias conservadas que funcionan como dominios funcionales distintos. La región 
más conservada se localiza hacia el extremo N-terminal en donde se encuentra un 
dominio de interacción que a su vez contiene el motivo básico hélice-asa-hélice (bHLH) 
y un dominio de asociación denominado PAS. El bHLH es un motivo de unión al DNA 
presente de varias familias de factores de transcripción eucarióticos y PAS funciona 
como un dominio de interacción con otras proteínas similares. El dominio N-terminal 
bHLH/PAS es indispensable para la unión de las proteínas p160/SRC con los receptores 
nucleares y para la función de coactivación, lo cual sugiere que esta región juega un papel 
muy importante que aún no se conoce del todo [109-111]. 
 
Un dominio de interacción nuclear (DIN) se encuentra en la región central de las tres 
diferentes clases de coactivadores SRC. Este dominio contiene a su vez tres regiones o 
motivos LXXLL altamente conservados denominados cajas NR como ya se mencionó 
anteriormente, y que son responsables de reconocer a la AF-2 [105, 112-114]. Estos 
motivos forman una α-hélice anfipática con el aminoácido leucina alineados hacia un 
extremo de la hélice H12 del LBD del receptor [115]. Una interacción eficiente del 
coactivador depende tanto de los motivos LXXLL como de las secuencias que se 
encuentran hacia los extremos de las proteínas p160/SRC. Estas secuencias no son 
 25
capaces de unirse a la AF-2 por sí solas si no que requieren ser estabilizadas mediante la 
interacción con las cajas NR [114, 115]. 
 
En el caso del RE, se han identificado una gran variedad de ligandos que inducen una 
serie de cambios conformacionales en su LBD [116-119], de igual manera se observó la 
habilidad que tenía el RE para reconocer específicamente una o más cajas NR una vez 
unido a estos ligandos, necesitando de al menos dos de ellas para una unión eficiente con 
el LBD. 
 
Utilizando al REα y al REβ, se evaluó la selectividad de ambos en términos de su 
habilidad para unirse a las cajas NR de la familia p160/SRC, los resultados mostraron que 
los dos receptores exhibían diferencias significativas en la selectividad por las cajas. Para 
las cajas NR del SRC-1, el REα mostró una clara preferencia por la caja NR II con poco 
reclutamiento por la caja NR IV. No se observó reclutamiento a través de la caja NR I y 
III del SRC-1 a través del REα. El REβ tuvo un patrón de selectividad diferente, en 
donde el reclutamiento fue a través de la caja NR IV del SRC-1, seguido de la caja II con 
un reclutamiento mínimo a través de la I y III del SRC-1. La selectividad de ambos 
subtipos del receptor de estrógenos por la caja IV del SRC-1 puede ser significativa ya 
que la cuarta caja es expresada unicamente en una variante alternativa del SRC-1 
denominada SRC-1a. También se observaron diferencias en la selectividad de las cajas 
NR del SRC-2 entre el receptor de estrógenos α y β, el REα mostró una clara preferencia 
por la caja II seguida de la I sin unión alguna por la III. En cuanto al REβ, éste reclutó a 
las tres cajas NR del SRC-2 con la misma eficacia. Finalmente para el SRC-3 el 
reclutamiento fue idéntico para ambos receptores (NR I>II> III) con la única diferencia 
de que el REβ tiene mayor uníon a través de la caja III mientras que el REα no [71, 120]. 
 
Cada uno de los tres miembros de la familia p160/SRC contiene al menos dos dominos 
de activación transcripcional autónomos (AD1 y AD2) (Fig.7). El DIN y los dos 
dominios de activación transcripcional son modulos funcionales distintos. El DIN puede 
unirse al receptor nuclear de manera eficiente pero no es capáz de mediar la activación 
transcripcional, mientras que el AD1 y AD2 no se unen a los receptores nucleares pero sí 
son capaces de mediar la activación de la transcripción. Los dos dominios de activación 
 26
transcripcional median la respuesta a través de su interacción con diferentes proteínas 
blanco y vías de señalización. El AD1 coincide con el sitio de unión para otro coactivador 
transcripcional denominado CBP y las proteínas relacionadas p300 [114, 121]. La 
observación de que la actividad funcional del AD1 correlaciona con la unión al 
CBP/p300 sugiere que este es un blanco localizado hacia la región 3’ del coactivador 
p160/SRC que regula la actividad del AD1. En contraste, el AD2, no es un sitio de unión 
para p300/CBP. Una proteína determinada CARM1 (coactivador asociado a arginina 
metiltransferasa) es la responsable de la interacción con el AD1 de los tres miembros de 
la familia SRC [122]. 
 
El SRC-1 y el SRC-3 poseen actividad de histona aceltil transferasa (HAT), la cual no ha 
sido detectada para el SRC-2. En el SRC-1a, el dominio catalítico HAT se ha encontrado 
entre los aa 1029-1292 [101, 123]. 
 
 
 27
 
 
SRC-1a
SRC-2
SRC-3
1 300
634 780
1441
DIN DINAF-1
AD1 AD2I II III IV
624 775
14641
AD1 AD2I II III
621 821
14121
AD1 AD2I II III
Dominio
interacción
LXXLL CBP CARM1
L: Leucina
X: cualquier aa
SRC-1a
SRC-2
SRC-3
1 300
634 780
1441
DIN DINAF-1
AD1 AD2I II III IV
624 775
14641
AD1 AD2I II III
621 821
14121
AD1 AD2I II III
Dominio
interacción
LXXLL CBP CARM1
L: Leucina
X: cualquier aa
1 300
634 780
1441
DIN DINAF-1
AD1 AD2I II III IV
1 300
634 780
1441
DIN DINAF-1
AD1 AD2I II III IV
624 775
14641
AD1 AD2I II III
624 775
14641
AD1 AD2I II III
621 821
14121
AD1 AD2I II III
621 821
14121
AD1 AD2I II III
Dominio
interacción
LXXLL CBP CARM1
L: Leucina
X: cualquier aa
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Familia p160/SRC de los coactivadores para los receptores de hormonas 
esteroides. Los tres miembros de la familia p160/SRC son: SRC-1a, SRC-2 y SRC-3. En el 
dominio de interacción se encuentran los dominios hélice-asa-hélice básica y de interacción PAS. 
En el centro se encuentra localizado el dominio de interacción nuclear (DIN). El DIN contiene 
tres motivos LXXLL o cajas NR que reconocen a la región AF-2 a través de un sitio hidrofóbico 
en la superficie del LBD del receptor. Una variante del SRC-1 (SRC1a) contiene una cuarta caja 
NR en el extremo C-terminal. El dominio AD1 funciona como sitio de unión para los 
coactivadores generales p300/CBP y en el dominio AD2 se encuentra la proteína metilasa 
denominada coactivador asociado a arginina metiltransferasa-1 (CARM1). Tanto p300/CBP 
como CARM1, sirven como coactivadores secundarios que median las respuestas de señalización 
transcripcional de AD1 y AD2 respectivamente. Un segundo dominio de interacción nuclear 
(DIN/AF-1) representa el sitio al cual se une la AF-1 del extremo N-terminal del receptor 
esteroide localizado entre AD1 y AD2. La actividad de histona acetil transferasa se localiza en el 
segmento C-terminal del SRC-1a y SRC-3 [1]. 
 28
Base estructural para las proteínas p160/SRC y su interaccióncon AF-2. 
 
Los estudios realizados con los receptores de hormonas esteroides, particularmente con el 
dominio de unión al ligando, demostraron que a pesar de que la hélice α 12 anfipática 
(H12) del extremo C-terminal del LBD se une con las p160/SRC, esta interacción no era 
suficiente para la unión de estas proteínas o para la función de la AF-2. Un mapa 
detallado de la superficie del LBD mediante mutagénesis, reveló que los residuos en las 
regiones del LBD localizadas por fuera de la H12 están también involucrados y que 
forman una superficie hidrofóbica que a su vez está compuesta por algunos residuos de 
las hélices 3 y 5 así como de una porción movible de la hélice 12 que se reposiciona 
contra sitios estacionarios en respuesta a la unión de la hormona [124, 125]. 
 
En estudios de cristalografía, se demostró que el LBD del RT (receptor de hormona 
tiroidea) y del RE forman complejos con la caja NR IV del SRC-1 y se confirmó que la 
superficie hidrofóbica interacciona con una hélice α complementaria formada por el 
motivo LXXLL de las proteínas p160/SRC. Estos análisis revelaron que dos motivos 
LXXLL del mismo péptido p160/SRC hacen contactos idénticos con cada subunidad del 
receptor dimérico. En resumen, el mecanismo general por el cual los coactivadores 
p160/SRC reconocen el LBD de los receptores nucleares es el mismo. El LBD actúa 
como una región dependiente del ligando que prende al receptor completo como 
resultado del reposicionamiento del la hélice 12 para crear un sitio de unión a los 
p160/SRC en la superficie del dominio de unión al ligando. 
 
El amino terminal AF-1 y su interacción con los coactivadores. 
 
La AF-1 es una estructura importante del receptor que regula las respuestas de tipo 
celular, promotor y tejido específico [14, 15, 114, 126]. La región AF-1 puede funcionar 
independientemente de la AF-2 o bien sinergizar con ella para generar una actividad 
transcripcional completa de los receptores a esteroides. A pesar de que los coactivadores 
p160/SRC fueron identificados originalmente como proteínas que se unen a la AF-2, hay 
evidencias que muestran que también interaccionan y aumentan la actividad de la AF-1 
de los receptores [127-130]. La interacción de los coactivadores p160/SRC con la AF-1 
 29
del RE y del RP es considerablemente más débil que su unión con la AF-2. Sin embargo, 
con el RA difiere en que la actividad de la AF-2 es más débil ya que la afinidad de éste 
por los coactivadores de tipo p160/SRC-1 es baja, mientras que la activación 
transcripcional por la AF-1 es predominante. Se ha determinado que la interacción de la 
AF-1 con p160/SRC se lleva a cabo en el segmento C-terminal entre AD1 y AD2. Este 
sitio ha sido llamado dominio de interacción nuclear AF-1 (DINAF-1) [127, 129]. 
Mutaciones por deleción en las cajas NR permitieron la interacción y aumento de la 
actividad de la AF-1 pero falló para aumentar la actividad de la AF-2. En contraste 
mutaciones en el DINAF-1 no mostraron aumento en la actividad de la AF-1 pero 
mantuvieron su habilidad para aumentar la actividad de la AF-2. Estos resultados 
indicaron que la AF-1 y la AF-2 interaccionan simultáneamente con al menos dos 
determinantes separados en el mismo coactivador SRC, sugiriendo que un simple 
polipéptido p160/SRC se puede unir cooperativamente a los receptores nucleares. 
 
Estructura de la familia CBP/ p300 
 
Las proteínas CBP/p300 fueron originalmente identificadas asociadas a la proteína de 
unión a los elementos de respuesta a AMPc (CREB). Algunos estudios, demostraron que 
CBP/p300 interacciona con una gran variedad de factores de transcripción como son: Jun, 
Fos, NF-kB, Pit-1 y STATs que potencían la actividad transcripcional de CBP/p300. La 
interacción de CBP con los receptores se da en el extremo N-terminal del coactivador. 
Las proteínas CBP/p300 tienen en su estructura los siguientes dominios funcionales: el 
sitio de interacción con las proteínas CREB, tres dedos de zinc (H1, H2 y H3) en los 
cuales se pueden unir otros factores de transcripción y la acetilasa pCAF que se asocia en 
el dedo de zinc H3. 
 
Los coactivadores CBP/p300 además de unirse directamente a los receptores nucleares, 
también se asocian a otros coactivadores como los de la famila p160/SRC en el extremo 
C-terminal. Esta interacción ha sido identificada en estudios tanto in vivo como in vitro 
permitiendo a los receptores nucleares unirse a las proteínas CBP/p300 de dos diferentes 
maneras; una de ellas mediante su interacción con el extremo N-terminal y otro a través 
de su interacción con las proteínas p160/SRC (Fig.8) [131]. 
 30
 
 
 
 
DIN
I
H1 H2 H3
Sitio de interacción 
con CREB
HAT
pCAF
SRC-1
Caja NR
NH2 COOH
DIN
I
H1 H2 H3
Sitio de interacción 
con CREB
HAT
pCAF
SRC-1
Caja NR
NH2 COOH
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8. Estructura de las proteínas coactivadoras CBP/p300. El dominio de interacción nuclear 
(DIN), localizado hacia el extremo N-terminal, tiene una única caja NR a diferencia de las 
proteínas coactivadoas p160/SRC. Los coactivadores CBP/p300 contienen un dominio de 
interacción con las proteínas CREB y tres dedos de zinc denominados H1, H2 y H3 
respectivamente, los cuales sirven para la interacción con otros factores de transcripción de la 
maquinaria general de transcripción, en el caso del H3 se une la acetilasa pCAF. En el extremo C-
terminal se localiza la región con la cual los coactivadores CBP interaccionan con las proteínas 
corregularas SRC [131]. 
 
 
 
 
 
 
 31
Mecanismo de acción de las proteínas correguladoras 
 
La cromatina tiene un efecto represivo en la transcripción debido a que limita la 
accesibilidad de la maquinaria general de transcripción (RNA polimerasa y factores 
generales asociados a la transcripción) al DNA. El remodelamiento de la estructura de la 
cromatina se puede dar por dos vías: a) la acetilación de las histonas centrales y b) el 
remodelamiento dependiente de ATP por medio del complejo de proteínas de la levadura 
SWI-SNF. Muchos coactivadores transcripcionales en los vertebrados poseen actividad 
de histona acetil transferasa (HAT). Esta actividad HAT provee un mecanismo potencial 
en las células para dirigir a algunas enzimas hacia promotores específicos vía interacción 
proteína-proteína con activadores transcripcionales dentro de secuencias específicas en el 
DNA [132]. 
 
Los receptores nucleares son capaces de reclutar por lo menos tres clases diferentes de 
coactivadores que poseen actividad HAT como los p160 (SRC-1 y SRC-2), el CBP/ p300 
y el factor asociado pCAF [101]. Tanto el CBP como el pCAF son coactivadores 
generales que se asocian con una gran variedad de activadores transcripcionales, mientras 
que las proteínas p160/SRC son relativamente específicas para los receptores nucleares. 
A pesar de que el CBP y el pCAF pueden unirse independientemente a los receptores 
nucleares y aumentan la transactivación, el principal modo de interacción con los 
receptores nucleares parece ser indirectamente a través de la asociación con p160/SRC. 
La unión directa del CBP y del pCAF a receptores nucleares no es dependiente de la 
hormona a través de la AF-2 [133, 134]. El CBP es un coactivador secundario que require 
la presencia de p160 para efectos de coactivación en receptores nucleares 
presumiblemente interaccionando con el AD1 de los coactivadores p160/SRC [112-114]. 
Los coactivadores de tipo SRC-2 de la familia p160/SRC no presentan actividad HAT, 
mientras que algunas formas truncadas de SRC-1 y SRC-3 que carecen del dominio para 
la acetilación de las histonas, no pueden funcionar como coactivadores. La función 
principal de p160/SRC es servir como un componente directo de unión al receptor 
nuclear que a su vez se le unen otras proteínas coactivadoras con actividad HAT como el 
CBP y el pCAF que facilitan el reclutamiento del complejo de iniciación de la 
transcripción al promotor. Se ha encontradoque p300/CBP se une directamente a la RNA 
 32
polimerasa II [135]. Por otro lado se observado que el pCAF existe como un complejo 
multiprotéico con componentes en común y factores asociados a TBP (TAFs) sugiriendo 
que el contacto con la RNA polimerasa tambien es parte importante del mecanismo por el 
cual el pCAF funciona como coactivador de receptores nucleares [136]. En resumen, los 
coactivadores actúan en dos pasos: el primero es promover el remodelamiento local de la 
estructura de la cromatina facilitando el acceso de los factores de transcripción generales 
al DNA. El segundo es el reclutamiento y estabilización de la maquinaria basal de 
transcripción por medio de una interacción proteína-proteína directa o indirecta con 
factores de transcripción asociados con la RNA polimerasa II (Fig. 9). 
 33
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3 SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
E
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
TRAP/
DRIP
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
E6-AP
Ub
Ub
Ub
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
SWI/SNF
BRG-1/
BAF57
ATP ADP
Pi
T
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
A) B) C)
D) E) F)
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3 SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
E
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
SRC
CBP/
p300
CARM-1
PCAF
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
TRAP/
DRIP
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
LBD
(AF-2)
E
TRAP/
DRIP
TRAP/
DRIP
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
LBD
(AF-2)
E
E6-AP
Ub
Ub
Ub
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
SWI/SNF
BRG-1/
BAF57
ATP ADP
Pi
AF-1
DBD
LBD
(AF-2)
E
LBD
(AF-2)
E
SWI/SNF
BRG-1/
BAF57
ATP ADP
Pi
SWI/SNF
BRG-1/
BAF57
ATP ADP
Pi
T
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
A)
T
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
AF-1
LBD
(AF-2)
DBD
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
SMRT/
NCoR
HDAC
Sin3
A) B) C)
D) E) F)
 
 
 
Figura 9. Mecanismo de acción de las proteínas correguladoras. La figura representa un 
esquema del intercambio de correguladores implicados en la activación del gen por el REα. En 
términos generales, los coactivadores y corepresores se encuentran en un complejo de proteínas 
dentro de las células. A) En presencia de un antiestrógeno, como el tamoxifeno (T), el receptor 
interacciona con un complejo de proteínas corepresoras incluyendo SMRT y/o NCoR, que 
mantiene al receptor en estado inactivo. B) En el estado no ligado, el REα puede unir a un 
complejo corepresor o coactivador. C, D y E) Cuando el estrógeno activa al receptor, una serie de 
coactivadores se unen e intercambian en una secuencia programada para llevar a cabo las 
funciones necesarias para activar el gen. Esto implica la acetilación de las histonas (actividad 
HAT) mediante la unión de las acetilasas p300/CBP y SRCs, posteriormente se une el complejo 
SWI/SNF, BRG-1/BAF57, el cual desenrrolla al DNA y remodela a la cromatina, seguido por un 
complejo involucrado en la iniciación de la transcripción. Este complejo puede incluir al SRC-1 o 
alguno de los miembros de la familia p160/SRC. El mantenimiento y reinicio de la transcripción 
se realiza por TRAP220 y el complejo de proteínas TRAP/DRIP, que sucesivamente unen a la 
 34
RNA polimerasa e inician la transcripción. Finalmente el complejo de proteínas con ubiquitinas, 
como: E6-AP y MDM2, ubiquitinan a las proteínas para la degradación del receptor por el 
proteosoma 26S. La transferencia del receptor permite la regulación de los niveles de 
receptor/coactivador, pero esta regulación también es requerida para continuar eficientemente la 
transcripción del gen. Tamoxifeno (T), Estradiol (E2), proteínas corepresoras, SMRT y NCoR, 
histonas acetilasas (p300/CBP y SRCs), proteínas que desenrrollan al DNA BRG-1/BAF57; 
metiltransferasas CARM1 y PRMT-1/2, histona diacetilasa HDAC, Ub, ubiquitina [137]. 
 
 35
ANTECEDENTES 
 
 
 
 
Los estudios realizados en nuestro laboratorio, han demostrado que las progestinas 
sintéticas derivadas de la 19-nortestosterona, son metabolizadas tanto in vivo como in 
vitro a compuestos dihidro y tetrahidro reducidos que presentan una gran variedad de 
efetos hormonales. La reducción en el anillo A de las progestinas sintéticas de la serie 19-
nor como son; la noretisterona (NET), el levonorgestrel (LNG) y el gestodeno (GSD), a 
sus correspondientes metabolitos 5α-dihidro y 3β,5α-tetrahidro reducidos resulta en la 
pérdida de su actividad progestacional. A pesar de que los derivados dihidro reducidos 
unen principalmente a los receptores de progesterona y andrógenos, los derivados 
tetrahidro reducidos pierden actividad progestacional y adquieren efectos de tipo 
estrogénico que son mediados por el receptor de estrógenos [88, 138, 139]. Utilizando un 
sistema de transactivación in vitro, mediante la transfección de células HeLa con genes 
progesterona y estrógeno dependientes, nuestro grupo demostró que, los derivados 
tetrahidro reducidos de NET, LNG y GSD perdían la capacidad de activar la 
transcripción a través de ambas isoformas del RP cuando se comparaba con P4 y la 
molécula original. En contraste, la actividad de los derivados 3β,5α-tetrahidro reducidos 
de las 19 nor progestinas, resultó en una activación de la transcripción significativa de los 
genes dependientes de estrógenos. Estos efectos fueron selectivos por el REα ya que no 
se observó actividad alguna a través de REβ [86, 87]. Estos resultados proveen 
evidencias que ayudan a entender la actividad estrógenica de los derivados sintéticos de 
la 19-nortestosterona así como los requerimientos de un ligando para ser reconocidos por 
el REα. Recientemente, nuestro grupo demostró que los derivados 5α-reducidos de NET, 
LNG y GSD así como las moléculas originales, tenían la capacidad de activar la 
transcripción de genes andrógeno dependientes cuando se comparaba con DHT [140], 
confirmando evidencias previas en las que se observó que estos compuestos presentaban 
efectos de tipo androgénico al lograr restablecer la conducta sexual masculina en ratas 
castradas [89]. 
Las hormonas esteroides como el estradiol y la progesterona activan a sus receptores a 
través de una serie de pasos secuenciales en donde, seguido de la unión del ligando, los 
receptores se disocian de un complejo heteromérico que contiene una gran variedad de 
 36
proteínas de choque térmico. La disociación es seguida de la dimerización de los 
receptores, evento que se lleva a cabo antes de su unión a los elementos de respuesta en el 
DNA [20]. Los primeros estudios acerca del cambio conformacional de los receptores se 
realizaron con el receptor de progesterona utilizando un sistema de transcripción y 
traducción in vitro dependiente del ligando, los resultados demostraron que con la simple 
remoción de las chaperonas hsp no se controlaba el proceso de activación del receptor y 
por lo tanto no había iniciación de la trancripción [20, 141]. Esto se detectó mediante el 
análisis de proteólisis parcial de los receptores transcritos in vitro en donde algunas 
progestinas indujeron un cambio conformacional drástico en el dominio de unión al 
ligando. Por otro lado, también se encontró que el RU486, un compuesto 
antiprogestacional, inducía cambios en la conformación del receptor que de igual manera 
afectaron la estructura del LBD sin embargo, el cambio fue claramente distinto al 
inducido por el compuesto agonista en el extremo C-terminal [22, 142]. Con estos 
resultados se confirmó que el cambio conformacional en el LBD, ya sea por la hormona o 
antihormona, era necesario al menos para inducir la disociación de las hsps y la unión del 
receptor al DNA, en el caso del complejo antihormona-receptor se provoca una 
inhibición de la activación de la transcripción debido a un cambio distinto e inapropiado 
en la estructura del LBD,principalmente en la región C-terminal. Con estos resultados se 
concluyó que, dependiendo de la naturaleza del ligando al cual se encuentre unido el 
receptor, se obtienían fragmentos polipeptídicos de diferentes tamaños cuando los 
complejos hormona-receptor o antihormona-receptor eran expuestos a la digestión 
limitada con enzimas como quimotripsina o tripsina, indicando que el cambio 
conformacional en el LBD del receptor es distinto para agonistas y antagonistas [119, 
143, 144]. 
 
Estudios posteriores acerca de los cambios conformacionales en el RP mediante la 
digestion parcial del receptor con diferentes proteasas como la tripsina, quimotripsina y 
subtilisina, demostraron que los productos de la digestión analizados a través de geles 
desnaturalizantes se caracterizaban por la formación de dos fragmentos de distintos 
tamaños dependiendo del ligando. Para los tres tipos de proteasas se obtuvieron dos 
fragmentos. Un fragmento de 30 kDa que resultó ser más resistente a la digestión cuando 
el RP fue incubado en presencia de progesterona, mientras que un fragmento adicional de 
 37
27 kDa fue más resistente cuando el receptor fue tratado con RU486. Debido a que la 
digestión es progresiva, parece ser que el fragmento de 27 kDa se deriva del de 30 kDa, 
indicando esto, que los cambios en la estructura inducidos por los dos ligandos 
involucran la misma región [145]. Posteriormente, digestiones parciales del receptor de 
andrógenos transcrito in vitro, fueron realizadas con la finalidad de demostrar las 
diferentes conformaciones del receptor inducidas por algunos andrógenos y 
antiandrógenos. Los resultados mostraron cinco conformaciones distintas del receptor 
detectadas por la formación de diversos fragmentos resistentes a la acción de las 
proteasas; el primero de ellos una conformación inicial del receptor sin ocupar que no fue 
capáz de resistir a la proteólisis, el segundo, la formación de un fragmento resistente con 
un peso característico de 35 kDa que correspondía al dominio de unión al ligando y una 
parte de la región bisagra obtenida con la mayoría de los antagonistas; el tercero, la 
presencia de un fragmento de 29 kDa correspondiente al dominio de unión al ligando 
obtenido en presencia de un agonista después del proceso de activación, la cuarta y quinta 
conformación los fragmentos de 30 y 25 kDa derivados de los mencionados en segundo y 
tercer lugar, pero que les falta parte del carboxilo terminal obtenido con RU486, el cual 
tiene propiedades antiandrogénicas además de algunos efectos antiprogestacionales y 
antiglucocorticoides [146]. 
 
Los ensayos de sensibilidad a las proteasas para los receptores de hormonas esteroides, 
son un método confiable para caracterizar también los cambios conformacionales 
inducidos en la estructura del LBD del REα una vez que se ha unido a su ligando [119, 
145, 147]. Kraichely y col. evaluáron la sensibilidad de ambos subtipos del receptor de 
estrógenos con algunos ligandos selectivos y se encontró que el REα completo con un 
peso de 66 kDa, incubado en presencia de E2, era rápidamente digerido por la tripsina 
dando lugar a la formación de un fragmento de 28 kDa. Cortes subsecuentes hasta 
fragmentos de 25 kDa ocurrieron cuando el REα está formando complejos con 
compuestos antagonistas. Los ligandos utilizados durante este estudio, el R,R- y S,S-THC 
y PPT, los cuales son ligandos agonistas selectivos para el REα, resultaron ser tan 
efectivos como el E2 para estabilizar la banda de 28 kDa, indicando que estos compuestos 
son capaces de inducir una conformación de tipo agonista. Lo más importante del estudio 
fue que, tanto el compuesto R,R-THC como el PPT, que son agonistas para el receptor de 
 38
estrógenos α pero antagónicos para el β, indujeron conformaciones agonistas para REα y 
conformaciones antagónicas para el REβ. Las actividades transcripcionales del REα y del 
REβ están influenciadas no sólo por el tipo de ligando si no por proteínas correguladoras 
con las cuales estos se asocian [60, 109, 111]. El reclutamiento de proteínas 
coactivadoras por el receptor de estrógenos y otros receptores de hormonas esteroides con 
sus respectivos ligandos parece ser un buen indicador de su actividad transcripcional y se 
cree refleja la conformación inducida en estos receptores por sus ligandos. 
 
Posteriormente, se realizaron estudios con la estructura cristalizada de los LBDs de varios 
receptores nucleares, incluyendo el REα y el REβ en complejo con ligandos agonistas o 
antagonistas [116-118]. Los resultados demostraron que ambos tenían una estructura 
similar a pesar de que la conformación de algunas porciones de este dominio cambia 
dependiendo de la naturaleza del ligando. Cuando el REα se une al agonista E2 o 
dietilestilbestrol, adopta una conformación que reposiciona a la hélice H12, formando 
una superficie hidrofóbica que resulta importante para la unión de la caja NR o motivo 
LXXLL de las proteínas coactivadoras p160 [114-116]. En contraste, cuando el REα se 
encuentra formando un complejo con compuestos antagonistas como el raloxifeno o bien 
el tamoxifeno, la hélice H12 se encuentra desplazada de su posición y ocupa la superficie 
hidrofóbica que necesita ocupar el coactivador. En el caso del REβ tiene conformaciones 
similares [117]. De esta forma, el reposicionamiento de la hélice H12 por medio de 
ligandos de tipo agonistas parece ser un indicador de la habilidad que tienen los 
receptores nucleares para unirse a proteínas coactivadoras además de ser un determinante 
importante de la magnitud de la actividad de transcripción del receptor. 
 
 
Estos hallazgos junto con el uso de fagos que expresan en su superficie péptidos 
correspondientes a regiones especificas de alguna proteína de interés, sugieren que varios 
ligandos para el RE inducen cambios conformacionales distintos en ambos subtipos del 
receptor de estrógenos que correlacionan con la habilidad de este receptor para unirse a la 
caja NR de las proteínas coactivadoras [148]. 
 
 
 
 39
 
 
 
HIPÓTESIS 
 
 
 
Las progestinas sintéticas de la serie 19 nor, al metabolizarse a compuestos dihidro y 
tetrahidro reducidos, inducirán cambios en la estructura del receptor de progesterona, 
andrógenos y los subtipos α y β del receptor de estrógenos, generando una conformación 
activa del receptor que lo protegerá contra la digestión parcial por proteasas. El cambio 
en la conformación adecuada del REα inducida por lo derivados 3β,5α-tetrahidro 
reducidos de las 19 nor progestinas, resultará en la habilidad del mismo para reclutar 
proteínas coactivadoras y así activar la transcripción de algunos genes reporteros. 
 
 
 
 
 40
OBJETIVOS 
 
 
 
Caracterizar los cambios conformacionales inducidos por las progestinas sintéticas 
derivadas de la 19-nortestosterona y sus metabolitos en los diferentes receptores de 
hormonas esteroides, así como el reclutamiento de proteínas coactivadoras a través del 
REα. 
 
 
Objetivos particulares 
 
 
• Analizar los cambios conformacionales en el receptor de progesterona y receptor de 
andrógenos inducidos por las progestinas sintéticas derivadas de la 19-nortestosterona 
y sus correspondientes metabolitos dihidro y tetrahidro reducidos a través de la 
digestión parcial por proteasas. 
 
 
• Establecer las propiedades agonistas de los compuestos 3β,5α-NET, 3β,5α-LNG y 
3β,5α-GSD a través de estudiar los cambios conformacionales del RE. 
 
• Establecer las diferencias transcripcionales de los derivados sintéticos de la 19-
nortestosterona y el estradiol natural, así como su habilidad para reclutar proteínas 
coactivadoras como el SRC-1 o CBP por el REα. 
 
 41
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
 
 
Reactivos 
 
El estradiol no radiactivo: 1, 3, 5 (10)- estratien-3, 17β-diol fue obtenido de Sigma 
Chemical Co. (St. Louis, Mo). [2, 4, 6, 7- 3H] Estradiol. ([3H] E2; actividad específica 72 
Ci/mmol), y el 3[H]Cloranfenicol(actividad específica 38.9 C1/mmol) se compró de 
DuPont NEN Research products (Boston, M.A). La radiactividad se determinó en un 
espectrofotómetro de centelleo líquido Beckman LS6500 (Beckman Instruments, CA). El 
medio de cultivo celular DMEM se compró de Life Technologies (Gibco). El suero 
bovino fetal (FBS) de Hyclone Laboratories, Gibco. (Logan, UT). Todos los solventes y 
reactivos utilizados fueron de grado analítico. La NET (17α-etinil-17β-hidroxi-4-estren-
3-ona) y el GSD (13β-etil-17α-etinil-17β-hidroxi-4,15-gonadien-3-ona), el LNG (13β-
etinil-17α-etinil-17β-hidroxi-4-gonen-3-ona) y derivados reducidos fueron donados por 
Schering Mexicana, S.A. (México) y Schering AG (Berlin, Alemania) respectivamente. 
La síntesis de los correspondientes 5α-dihidro (5α-NET, 5α-LNG y 5α-GSD) y los 
tetrahidro reducidos (3α,5α-NET, 3α,5α-LNG y 3α,5α-GSD), y (3β,5α-NET, 3β,5α-
LNG y 3β,5α-GSD), incluyendo la descripción de sus correspondientes constantes físicas 
o químicas fueron descritas previamente [138, 139]. 
 
 
Plásmidos 
 
Los vectores de expresión pCR3.1-hREα, pCR3.1-hREβ y el pCR3.1-hRPB utilizados en 
el sistema de transcripción y traducción in vitro, fueron generados en el plásmido 
pCR3.1®, usando el estuche comercial de clonación TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, 
CA, USA). La característica principal del vector pCR3.1 es que cuenta en su secuencia 
con una región que codifica para el promotor T7 entre las bases 638-657 el cual es 
indispensable para los sistemas de transcripción y traducción simultánea (Fig.10). 
 
 42
El vector pCR3.1-hREα fue generado de la siguiente manera: el DNA que codifica para 
el REα completo fue amplificado por PCR a partir del plásmido pCMV5hERα, el 
fragmento resultante fue subclonado en los sitios de restricción NheI y XmaI del vector 
pCR3.1 usando el estuche comercial TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Para 
generar el plásmido pCR3.1-hREβ, el DNA que codifica para el REβ fue amplificado por 
PCR obtenido a partir del plásmido pCMV5-hERβ y el fragmento resultante fue insertado 
en los sitios de restricción NheI y KpnI del vector pCR3.1 [149]. 
 
Para la construcción del pCR3.1RPB, el DNA que codifica para el RPB fue amplificado 
por PCR a partir del plásmido pLEN-hPRB, el fragmento resultante de la reacción fue 
subclonado en el vector pCR3.1. 
 
Para la expresión del RA, el producto de PCR correspondiente, fue subclonado en el 
vector pcDNAHis, en los sitos de restricción KpnI/SacII obteniendo el vector 
pcDNAHisARomcs. 
 
Los plásmidos arriba mencionados y utilizados para el sistema de transcripción y 
traducción in vitro, fueron proporcionados por los doctores Austin J. Cooney, Carolyn 
Smith y Nancy Weigel del Departamento de Biología Celular y Molecular del Colegio de 
Medicina de Baylor en Houston, Texas. 
 
 
 
 43
 
 
Promotor T7Promotor T7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Plásmido pCR3.1 utilizado para el sistema de transcripción y traducción in vitro. 
Este vector esta formado por 5066 nucleótidos. El promotor T7 requerido para la expresión de 
proteínas in vitro se encuentra localizado de las bases 638 a 657. En este vector fueron clonados 
los DNAs que codifican para el hREα, hREβ y RPB, amplificados por PCR respectivamente. 
 
 
 44
Construcción de los vectores para el sistema de los dos híbridos 
 
Los siguientes plásmidos fueron donados por la Doctora Carolyn Smith del 
Departamento de Biología Celular y Molecular del Colegio de Medicina de Baylor en 
Houston Texas, los cuales fueron construídos de la siguiente manera: 
 
El vector pBIND que codifica para el dominio de unión al DNA de GAL4 (aminoácidos 
1-147) y el plásmido pACT el cual dirige la expresión del dominio de activación del virus 
del herpes simple VP16 (aminoácidos 411-456) fueron obtenidos de Promega 
Corporation (Madison, WI), así como el gen reportero pG5luc el cual contiene 5 
dominios de unión para el DBD del GAL4 y un promotor TATA localizado hacia la 
región 3’ del gen de la enzima luciferasa. 
 
El vector de expresión GAL-SRC-1 fue construído substituyendo el fragmento BstZ17I-
XbaI del pBIND-hSRC-1a [150] con el nucletótido 270 BstZ17I-SpeI fragmento del 
DNAc del SRC-1e el cual fue generado por la transcriptasa reversa SuperScript II ( Life 
Technologies, Grand Island, NY, USA), del RNA aislado de las células HeLa seguida de 
una amplificación por PCR usando los primers 5’-TGT GTT CAG TCA AGC TGT CC-
3’ y 5’-GAG CAT TCC ACT AGT CTG TAG-3’. 
 
El vector de expresión quimérico VP16-ERαLBD fue generado en el plásmido pACT de 
la siguiente manera: 882 pb del DNA que codifica para el LBD del REα que corresponde 
a los aminoácidos 302-595 fueron amplificados por PCR a partir del plásmido 
pCMV5hERα [151] utilizando los primers 5’-GGG ATC CGTA AGAA GAA CAG CTG 
GCC TTG TTC C-3’ y 5’-TCT AGA GAC TGT GGC AGG GAA ACC CTC TGCC-3’. 
Los fragmentos resultantes del PCR fueron subclonados en el vector pCR3.1 usando el 
estuche comercial de clonación TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), y 
posteriormente se volvió a aislar como un fragmento BamHI-XbaI y subclonado en el 
vector pACT en los sitios correspondientes para generar el VP16-ERα-LBD. 
 
 45
Preparación de bacterias competentes 
 
La preparación de las bacterias competentes se llevó a cabo con la finalidad de tener 
bacterias viables a las cuales se les puedan introducir fácilmente fragmentos del DNA de 
interés. Para este proceso se inoculó una colonia de bacterias de E. coli de la cepa DH5α 
en 10 ml de medio LB. El cultivo se dejó crecer toda la noche a 37°C a 200 revoluciones 
por minuto (rpm). Al día siguiente se inoculó 1 ml de este cultivo en 100 ml de LB. Se 
incubó a 37°C en agitación y cuando las células alcanzaron una densidad óptica a 590 nm 
(D.O590nm ) de 0.375, se tomaron 50 ml del cultivo en un tubo estéril frío y se dejó en 
hielo de 5 a 10 min. Posteriormente las células se centrifugaron a 3000 rpm por 7 min a 
4°C, el precipitado se resuspendió suavemente en 10 ml de CaCl2 frío para lograr 
permeabilizar la pared celular de las bacterias DH5α. Las bacterias se centrifugaron 5 
min a 2500 rpm a 4°C. El precipitado se resuspendió en 10 ml de CaCl2 frío y se dejó en 
hielo durante una hora. Las bacterias se alicuotaron y se congelaron a –70°C. 
 
Transformación de bacterias competentes 
 
La incorporación de DNA a bacterias competentes para su transformación, consistió en la 
adición de 10 ng del DNA de interés a 100 µl de bacterias DH5α, se mezcló suavemente 
y dejó en hielo durante 30 min. Posteriormente las bacterias se incubaron a 42°C por 45 
seg e inmediatamente se pasaron a hielo por 5 min. Se adicionó 1 ml de medio LB y se 
agitó 1 h a 37°C. 
 
Para selecionar las bacterias transformadas se sembraron 20 µl del cultivo en cajas de 
LB-agar conteniendo antibiótico (50 µl/ml de ampicilina) y se incubaron 16 h a 37°C. Se 
picó una sola colonia del plato que contenía el DNA de interés y se creció en 5 ml de 
medio LB con antibiótico a 37°C por 8 h a 3000 rpm. Se adicionó glicerol al 15% 
utilizado como crioprotector. Se fraccionó el cultivo bacteriano en alicuotas de 1 ml y se 
congelaron a –70°C. 
 
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Purificación y verificación de los plásmidos 
 
La purificación de los DNAs de las bacterias de interés se realizó usando QIAprep 
Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo al protocolo establecido por el 
fabricante. Para la purificación de los plásmidos se realizaron cultivos manteniendo una 
relación 1:1000 en medio LB (50 µg/ml ampicilina), y se crecieron a 37°C durante 17 h. 
Posteriormente el cultivo se centrifugó a 13,000 rpm y el precipitado bacteriano se 
resuspendió en 250 µl de la solución P1, seguido de la adición de 250 µl de la solución 
P2, se mezcló por inversión del tubo de 4 a 6 veces. Se adicionaron 350 µl de la solución 
N3 y se mezcló. Se centrifugó a 13,000 rpm por 10 min. El sobrenadante se adicionó