Acido-lipoteicoico--estructura-mecanismos-de-transduccion-y-actividad-biologica

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE ODONTOLOGíA
; !' -. :.
ÁCIDO L1POTEICOICO: ESTRUCTURA,"MECANISMOS DE
« 't""
TRANSDUCCIÓN y ACTIVIDAD BIOLÓGICA .¡~ " ..
TESINA
Que para obtener el título de:
CIRUJANA DENTISTA
P r e s e n t a :
YADIRA TAPIA DíAZ
DIRECTORA: DRA~A GUTIERREZ VENEGAS
MÉXICO, O.F. 2005
Neevia docConverter 5.1
Dedico esta tesina a mi papá José Tapia
por todo el apoyo que me ha brindado durante
toda la carrera, a mi mamá Eva Díaz por toda
la confianza, el apoyo y la guía que me ha dado
durante toda mi vida, a mis hermanos: Dianeth,
Rosario y José porque me han ayudado en
momentos difíciles.
Neevia docConverter 5.1
Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México por abrirme sus puertas y
darme la oportunidad de desenvolverme en la sociedad por un camino recto. A la Dra.
Gloria Gutiérrez Venegas porque sin su ayuda no habría podido realizar este trabajo , a
todos los integrantes del laboratorio de Bioquimica : Silvia, Martita, Armando, Paty, Pilar,
Perla, Karía, Miguel y Cinthya por darme la confianza de trabajar con ustedes, a los
Ores. Mauricio Zaldivar y Rolando Buneder de la Clínica Periférica de Xochimilco junto
con todos los doctores de la misma por su apoyo durante mi estancia en ese lugar y a
todas las personas que me han ayudado de las cuales no terminaría de escribir.
"Gracias a todos"
Atentamente: Yadira Tapia Oíaz.
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íNDICE
1. INTRODUCCIÓN 5
1.1. Descripción de las bacterias Gram-positivas 7
1.2. Sintesis y estructura de la pared celular de las
bacteñasGram-positivas 8
1.3. Estructurasasociadasa la pared de
bacteriasGram-positivas 12
1.4. Ácidos teicocicos 12
1.5. Ácidos lipoteicoicos 14
2. ESTRUCTURA 15
2.1. Ácidos lipoteicoicosde poli-glicerofosfato 15
2.2. L1pido de anclaje 16
2.3. Estructurade la cadena 20
2.4. Ácidos Iipoteicoicos de polkjigalactosil,
galactosilglicerofosfato 23
2.5. Upoglicanosque contienen glicerofosfato 23
2.6. Upomanosuccinilado 25
2.7. Ácido lipoteicoicode Streptococcus pneumoniae 26
2.8. Aspectos cuantitativos 26
3. METABOLISMO 27
3.1. Bioslntesisde ácidos lipoteicoicospoIi-glicerofosfato 27
3.2. Biosintesisde microamfifilos relacionados 35
3.3. Influenciade la bioslntesis del ácido lipoteicoico
en el recambiomembranal 38
3.4. Adición de sustituyentes a la cadena 41
· 3.4.1. Glicosilación 41
3.4.2. Adición de residuos D-alanil 42
3.5. Recambiode residuoséster D-alanina
en ácido lipoteicoicoy la transferencia
de ácido teicoico en la pared 44
3.6. Condicionesque afectanel contenido
celular y la sintesis de ácido lipoteicoico 46
3.7. Estadode crecimientoy tasa de
crecimiento 48
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3.8. Efecto del pH y la fuente de carbohidratos
3.9. Limitación de fosfato
3.10. Deprivación de la energía
3.11. Esporulación
3.12. Condiciones que afectan la sustitución
de la cadena
4. LOCALIZACiÓN CELULAR
5. ACTIVIDADES BIOLÓGICAS
5.1. Ácido lipoteicoico portador
5.2. Interacción con la pared celular
5.3. Interacción con cationes divalentes
6. MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN
6.1. Receptores
6.2. Mecanismos de transducci6n
6.3. Efecto del LTA en la sepsis y daño a órganos
7. CONCLUSIONES
BIBILlOGRAFIA
ANEXO
Artículo. Ácido Lipoteicoico: Receptores y
Mecanismos de Transducci6n
48
49
51
51
51
56
58
58
65
72
75
77
79
81
83
85
102
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1. INTRODUCCiÓN.
Los ácidos teicoicos (del griego: teichos: pared) se detectaron en el año de
1958 por Baddiley y colaboradores (1. 2) mientras investigaban el papel del
CDP-glicerol y CDP-ribitol, moléculas que están presentes en las bacterias
Gram-positivas. Las primeras moléculas que se aislaron de la pared celular
mostraron ser polímeros del ribitol fosfato o del glicerol fosfato que usualmente
.contienen residuos glucosil o ésteres de alanina o ambos. Por la diversidad
estructural el término de ácidos teicoicos se redefinió para incluir a la pared, la
membrana o polímeros capsulares que contienen también residuos de glicero-
fosfato o ribitol fosfato (3).
El grupo de ácidos teicoicos de poli-glicerofosfato se diferenció y se denominó
ácidos teicoicos intracelulares porque se extraían de las células completas, al
contrario de los ácidos teicoicos previamente estudiados, y que están ausentes
en las paredes celulares (4,5). Posteriormente, los ácidos teicoicos
intracelulares se localizaron en la membrana citoplasmática y se renombraron
como "ácidos teicoicos membranales" (6). Un tercer cambio de nombre a
ácidos lipoteicoicos, fue finalmente sugerido cuando ocho años después se
detectaron "complejos lipídicos de ácidos teicoicos" (7) y de forma subsecuente
se identificaron como moléculas amfifílicas, de poli-glicel"ofosfato que están
covalentemente unidas a la membrana glicolipídica por enlace fosfodiéster (8).
Actualmente se sabe que los ácidos lipoteicoicos son moléculas amfifílicas,
ancladas a la capa interna de la membrana citoplasmática por interacción
hidrofóbica. mientras que los ácidos teicoicos están covalentemente unidos por
unión al peptidoglicano de la pared celular (9-11). Muchas bacterias Gram-
positivas contienen ambos polímeros, pero los ácidos lipoteicoicos son más
abundantes y su síntesis se considera que es menos dependiente de las
condiciones de crecimiento (12 ,13).
Los ácidos teicoicos y Iipoteicoicos no están relacionados estructural o
metabólicamente, por ejemplo Staphylococcus aureus contiene ácidos teicoicos
formados por poli-D-alanil-a,p-N-acetil-D-glucosaminil -ribitol fosfato y los
5
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ácidos Iipoteicoicos por poli-D-alanil-glicerolfosfato. Aún si ambos pollmeros,
como en Bacil/us subtilis Marburg, poseen cadenas de poli-glicerofosfato, las
rutas para la bioslntesis de estas moléculas es diferente. Los residuos de
glicerofosfato de los ácidos Iipoteicoicos se derivan del fosfatidilglicerol y los
ácidos teicoicos del CDP-glicerol, los residuos de glicerofosfato de estos
pollmeros poseen configuraciones estereoqulmicas y enantioméricas
especificas (Fig. 1).
(e)
~ H CHJOH
I
H C OH
I
CH}
R
O ¿_ O
CH} O
I
O é H
H} ¿
CH}OH ( H,OH PiI I
H C OH o HO C H o H CI ti
H) t 1IH} C o P OH o P OH
1- r,
o O
(o) n»
Fig. 1. Configuración estereoquimica de glicerolfosfatos. Sn-Glicero -1-fosfato (a) está presente
en ácidos lipoteicoicos y glicerofosfoglicollpidos (Fischer, 1981), sn-glicero-3-tosfato (b) en
COP-glicerol, ácidos teicoicos de la pared, sus unidades de enlace (Ward, 1981) y
fosfatidilglicollpidos (Wilkinson y Bell, 1971; Fischer y col. 1973b). El Fosfatidilglicerol (e)
contiene ambos enantiomeros, el sn-3-isomero acilado como un donador de cualquier residuo
fosfatidil o sn-glieero-1-fosfato.
Recientemente se ha descrito que los ácidos Iipoteicoicos poseen poli-
hexosilglicerofosfato y estructuras de Iipoglicanos que contienen glicerofosfato.
Sin embargo, debido a su varianza estructural, estas moléculas amfifllicas
están relacionadas con los ácidos Iipoteicoicosque contienen poli-glicerofosfato
y comparten el mismo origen biosintético y configuración estereoqulmica de
sus residuos de glicerofosfato.
La pared celular de las bacterias Gram-positivas alberga una gran variedad de
moléculas y tiene un gran número de funciones la mayoría de las cuales son
cruciales en la viabilidad de los microorganismos.
6Neevia docConverter 5.1
La función primaria de la pared celular es proveer de un rígido exoesqueleto
que funciona en la protección contra lisis osmótica y mecánica (14, 15). La
pared celular de las bacterias Gram-positivas participa en el reconocimiento
entre las diferentes proteínas que interactúan con la pared. En las últimas
décadas se ha determinado que las bacterias Gram-positivas presentan
mecanismos únicos que permiten inmovilizar proteínas en sus superficies.
Entre los mecanismos se encuentran la adherencia de proteínas al
peptidoglicano o la asociación no covalente de las proteínas al peptidoglicano o
polímeros secundarios de la pared como los ácidos teicoicos.
1.1. Descripción delas bacterias Gram positivas.
Las bacterias Gram-positivas son células sencillas. En base al aspecto
morfológico se distinguen tres compartimentos celulares: el citosol, la
membrana citoplasmática y rodeando a esta estructura se encuentra la pared
celular. (16). Algunas bacterias Gram-positivas sintetizan una larga cápsula
polisacárida, mientras que otras elaboran una superficie cristalina de proteinas.
(17); ambas estructuras envuelven a la célula entera. Las bacterias Gram-
positivas formadoras de esporas como Bacillus subti/is, generan células hijas
morfológicamente distintas mediante un programa de división celular asimétrico
(18). La pared celular de bacterias formadoras de esporas se diferencian del
progenitor porque contienen un juego específico de proteinas (19,20). Algunas
bacterias Gram positivas se dividen separando su pared celular y continúan
creciendo como cadenas de células (streptococci) o como racimos
(staphylococci). En la Figura 2 se muestra una microscopia electrónica de
transmisión de Actinomyces naes/undii, que revela la estructura característ ica
de la morfología de los compartimentos de las bacterias Gram-positivas.
7
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1.2. Sintesis y estructura de la pared celular de las bacterias Gram-
positivas.
La pared celular de las bacterias Gram-positivas es una macromolécula de
peptiglucanos a la que están unidas moléculas accesorias como ácidos
teicoicos, ácido teicur6nico, polifosfatos o carbohidratos. (14, 22). Las hebras
de glicanos de la pared celular consisten en estructuras repetidas de ácido N-
acetilmurámico (j31-4)-N-acetilglucosamina (MurNAc-GlcNAc) (23, 24). Las
hélices de glicano varian en longitud y se estima que contienen de 5 a 30
subuniddes dependiendo de las especie bacteriana (25-27).
En la mayoria de los casos la adherencia D-Iactil al MurNAc se realiza por
enlace amida unido a un péptido corto que es componente del peptidoglucano
(28-30). Los péptidos de la pared están entrecruzados con otros péptidos que
están unidos a las hebras vecinas de glicanos (31-33), de esta forma generan
una red molecular tridimensional que rodea a la bacteria y provee de esta
forma la funci6n de exoesqueleto (34, 35). Fig. 3.
Cadena de Glk .lOO
[·GIcNac-MurNac·Jn
L·Ala
O-iGlu
m-Dpm (~~~-::~~~)
('¡;¡~:;~~I~;~~) O-Ala
(-GkNAc-MurNAc.}
L-Ala
D-iGlu
m-Dpm
O-Ala
O-Ala
Fig.3. Péptidos entrecruzados con otros péptidos y unidos por hebras de glicanos generando
una red molecular tridimensional que rodea a las bacterias y que provee la función de
exoesqueleto.
La sintesis de la pared celular de las bacterias Gram-positivas se divide en tres
estadios separados que ocurren en distintos compartimentos celulares, el
citoplasma, la membrana y finalmente la pared celular (36, 37) Fig. 4.
8Neevia docConverter 5.1
L-Ala
D·iGlu L-Ala
Nlh-[Gly]> L-Ly s O·IGlu
O-Ala Gly· Gly·Gly-Gly-Gly L·Ly,
( IU(<!'d o: r" ,oe'fll<!'
1PC'nl<l<,lIKIn.1) O-Ala
O-Ala
' .11" 1'10 1 nI, 11' , P YI )ll "I I( " ,
(.n.J ~ (,lrcoNlO
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W('nMI~plldo}
(-GkHA<-M,I'NAc-¡'
L·Ala
D·IGlu
Nlb·(Ala)1 L-LV'
D·AI. D-Ala 1 .-A~,·l-AIa
(¡ U«('dePU~<!'
1lll.'llotlllrUl
L-AI.
().~IU P••N~~td..
l ·l.ys l~tll"P44"'ol
O-Al.
O-Ala
Fig. 4. EstadIos de la slntesis de la pared celular de bacterias Gram-posit ivas.
La biosfntesis de la pared celular de Staphylococos aureus, que es idéntica en
todas las bacterias Gram-positivas, se inicia mediante la generación de UDP-
MurNAc a partir de UDP-GlcNAc y fosfoenolpiruvato (38, 39). Cinco
aminoácidos se unen al UDP-MurNAc mediante cuatro pasos consecutivos
inicialmente se unen L-Ala, D-isoGlu, L-Lys y finalmente el dipéptido D-Ala-D-
Ala (40-42).
La slntesis de D-Ala-D-Ala requiere de dos enzimas. La primera es la D-Ala
racemasa, que convierte L-Ala en D-Ala, mientras que la segunda D-Ala,
ligasa, crea una unión peptrdica entre las dos D-Ala (43-45). La srntesis de
cada enlace peptrdico consume enerqla mediante la hidrólisis del adenosrn
trifosfato (ATP). (46).
El pentapéptido UDP-MurNAc está unido por enlace fosfodiéster a la molécula
Undecaprenil-pirofosfato que funciona como acarreadora y requiere de
UDP(C55-PP, MurNAc-L-Ala-D-isoGlu-L-Lys-D-Ala-D-Ala, o Hpido 1), (47,48).
UDP-Glc-NAc se une a muramil para generar el precursor disacárido Upido 11
(C55-PP, MurNAc-L-Ala-D-isoGlu(Gly5)-D-Ala-D-Ala-[31-4GlcNAc). (47, 48).
9Neevia docConverter 5.1
La biosíntesis de la pared celular de Staphylococos aureus, que es idéntica en
todas las bacterias Gram-positivas, se inicia mediante la generación de UOP-
MurNAc a partir de UOP-GlcNAc y fosfoenolpiruvato- (38, 39). Cinco
aminoácidos se unen al UOP-MurNAc mediante cuatro pasos consecutivos
inicialmente se unen L-Ala, O-isoGlu, L-Lys y finalmente el dipéptido O-Ala-D-
Ala (40-42).
La síntesis de O-A1a-O-Ala requiere de dos enzimas. La primera es la O-Ala
racemasa, que convierte L-Ala en O-Ala, mientras que la segunda O-Ala,
Iigasa, crea una unión peptídica entre las dos O-Ala (43-45). La síntesis de
cada enlace peptídico consume energía mediante la hidrólisis del adenosín
trifosfato (AlP). (46).
El pentapéptido UOP-MurNAc está unido por enlace fosfodiéster a la molécula
Undecaprenil-pirofosfato que funciona como acarreadora y requiere de
UOP(C55-PP, MurNAc-L-Ala-O-isoGlu-L-Lys-O-Ala-O-Ala, o Iípido 1), (47,48).
UOP-Glc-NAc se une a muramil para generar el precursor disacárido Lípido 11
(C55-PP, MurNAc-L-A1a-O-isoGlu(Gly5)-O-Ala-O-Ala-131-4GlcNAc). (47, 48).
Ellípido 11 es modificado por la adición de aminoácidos a e-amíno de Lisina (49,
50). Las reacciones de la biosíntesis de los peptidoglucanos de S. aureus,
contienen cinco residuos de glicina unidos a L-Lys. Para la biosíntesis se
requieren de 3 Glicil-tRNA (51-54). Finalmente el precursor Iípido 11 es
translocado a la membrana citoplasmática y sirve como sustrato para el
ensamblaje del peptidoglucano
El ensamblaje de la pared celular es catalizado por proteínas de unión a
penicilina (55). Estas proteínas de alto peso molecular tiene propiedades
bifuncionales y se han caracterizado dos isoformas. Clase A promueve la
polimerización de glicanos desde el precursor disacárido . La adición sucesiva
de MurNAc(-L-Ala-O-isoGlu-L-Lys-O-Ala-O-Ala)-GlcNAc a C55-PP-MurNAc(-L-
Ala-O-isoGlu-L-Lys-O-Ala-O-Ala)GlcNAc y la transpetidación de los péptidos de
pared (56). La reacción final provoca la remoción proteolítica de O-Ala del
carboxilo terminal del pentapéptido y la formación de un nuevo enlace amida
10
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entre el grupo amino de la cadena de cruce con el grupo carboxilo de la O-Ala
en posición 4 (33). La reacción de transpeptidación del peptidoglucano se
muestra en la Figura 4. Esta reacción es el blanco de penicilina y de otros [3-
lactamos que mimetizan la estructura del dipéptido O-Ala-O-Ala (33). Poco se
conoce de la clase B pero se sugiere que participa en la morfogénesis de las
redes de la pared celular (57).
No todos los péptidos de las paredes celulares están entrecruzados con las
hebras de peptidoglucano vecinas. Los péptidos no sustituidos pueden ser
preservados como accesorio de la O-Alanina terminal del pentapéptido (58),
está reacción es catalizada otras proteinas de unión a penicilina de bajo peso
molecular que funcionan como carboxipeptidasas (59, 60)
Las reacciones de transpeptidasas y carboxipeptidasas son similares. Las
transpeptidasas usan el grupo amino como nucleófilo para la formación de un
intermediario acil-enzima entre el grupo hidroxilo de la serina presente en el
sitio activo y el carbonilo de O-Ala, mientras que las carboxipeptidasas usan
agua como nucleófilo (55). Consecuentemente existen similitudes de secuencia
y estructurales entre estas dos enzimas (55). La relación entre transpeptidación
y carboxipeptidación es importante para la generación de la estructura
tridimensional de la pared celular (61). Por ejemplo diferentes grados de
entrecruzamiento permiten la sintesis de pared con diferentesángulos y
generan curvas en forma de células cilindricas . Sin embargo, esta aseveración
no ha sido nunca probada para las bacterias Gram-positivas que presentan
diferente morfologia . Peptidoglucanos con bajo entrecruzamiento son mucho
más.sensibles a la degradación de la pared por hidrolasas (35). El grado de
entrecruzamiento juega un papel importante en determinar los sitios que son
susceptibles a degradación o sintesis.
Mientras que el disacárido repetido (MurNAc-([31-4)-GlcNAc) se encuentra en
todos los peptidoglucanos bacterianos, los péptidos difieren en composición
entre las especies bacterianas (62). Otros adicionan aminoácidos a la cadena
lateral s-arnlno de L-Lys para sintetizar y extender los puentes de
11
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entrecruzamiento de los peptidoglicanos. La Figura 3 muestra un ejemplo de
las estructuras de peptidoglucanos de diferentes bacterias Gram-positivas.
Los péptidos de la pared pueden estar entrecruzados con otra hebra de
glucano en la que el e-amino de Lys u otro aminoácido añadido en esta
posrcron pueda unirse mediante enlace amida a la O-Ala en el péptido de la
pared o puede ser arreglado para generar un tetrapéptido no entrecruzado (62).
Lapared celular de muchas bacterias Gram-positivas es modificada por 0-
acetilación del MurNAc en el carbono 6 (63). Aunque el mecanismo enzimático
de esta modificación se desconoce hasta el momento, se sabe que le confiere
resistencia a la degradación de la pared por Iisozimas animales (64). Otras
modifiéaciones quimicas incluyen la adición de ácido teicoicos, fosforilación y
glicosilación. Avances recientes en la estructura de la pared se han analizado
estudiando los fragmentos de pared por cromatografia liquida de alta presión
combinado con análisis espectrofométricos (65-68). Estas técnicas permiten la
caracterización de los diferentes grados de entrecruzamiento asi como la
identificación de nuevas reacciones de entrecruzamiento en la pared celular
(69).
1.3. Estructuras asociadas a la pared de bacterias Gram-positivas.
Las bacterias Gram-positivas sintetizan diversos compuestos que decoran el
exoesqueleto de peptidoglucano (14). Se encuentran presentes ácidos
teicoicos, ácidos teicurónicos, ácidos Iipoteicoicos, lipoglicanos y glicosilación
(14). En los últimos 30 años estructuras completas de algunos de estos
compuestos asi como los genes requeridos para su síntesis han sido
caracterizados.
1.4. Ácidos teicoicos.
Se cree que todas las bacterias Gram-positivas sintetizan pólimeros aniónicos
que están covalentemente unidos al peptidoglucano o unidos a un Iipido. (70,
71). Tipicamente estos polímeros consisten de poliglicerofosfato (Gro-P),
12
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poliribitol fosfato (Rit-P) o poli-glucosil fosfato (Glc-P) que están glicosilados o
esterificados con aminoácidos (72, 73). La Figura 5 compara la estructura de
los ácidos teicoicos de Staphylococcus con otras bacterias. Un polímero de 30
a 50 subunidades de Rit-P está unido por enlace fosfodiéster a 2 o 3 residuos
de Gro-P que están unidos al disacárido ManNac(131-4)GlcNAc (74-78). La
unión GlcNAc es (1-6) mediante enlace fosfodiéster al MurNAc y con el
disacárido repetido (MurNAc-GluNac) (79-81).
El {Gro-P)n-ManNac-GlcNAc unido los ácidos teicoicos de la pared y
peptidoglucano se denominan como la unidad de unión (82) . Aunque muchas
bacterias Gram-positivas sintetizan unidades de unión idénticas, algunas
especies modifican su estructura con carbohidratos mientras que otros usan
diferentes compuestos para unir los ácidos teicoicos de la pared (82).
Modificaciones a las subunidades repetidas difieren entre las bacterias (83).
Ambas unidades repetidas de Gro-P y Rit-P pueden ser decoradas con una
variedad de diferentes azúcares y pueden también ser esterificadas con O-Ala
(84-86). La síntesis de la estructura ocurre en el citoplasma (73, 84). La síntesis
inicia con la fusión de UOP-GlcNAc a fosfato de prenol (87, 88) (Fig. 5). El
GlcNAc-PP-prenol es manosilado con UOP-ManNac para producir ManNac-
glcNAc-PP-prenol (89).
El Iípido sirve para la adición de dos o tres unidades de Gro-P y es extendida
por Rib-P, que es adicionado a partir de sustratos de COP-ribitol (90-93). El
producto final es translocado a través de la membrana citoplasmática por el
sistema de transporte acoplado al ATP. La unión del ácido teicoico al MurNac
procede durante el ensamblaje de la pared celular, sin embargo, no ha sido
caracterizada la maquinaria enzimática que participa en este procedimiento.
La esterificación de Gro-P o Rib-P con O-Ala ocurre en la superficie la
membrana citoplasmática después de que los ácidos teicoicos han sido
translocados a través de la membrana (94). Se requieren los productos de
cuatro genes porque al inicio la O-Ala se une a la proteína acarreadora de diacil
y después se une al acarreador de undacaprenol-fosfato (94-99). Ellípido unido
13
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a O-Ala es translocado a través de la membrana citoplasmática y sirve como
sustrato de esterificación. Esta modificación es presumiblemente para la
modificación éster de O-Ala de los ácidos teicoicos y Iipoteicoicos de la.pared
(100). Los ácidos teicoicos de la pared están uniformemente distribuidos en la
pared de peptidoglucano (101). En algunos casos la esterificación de O-Ala con
los ácidos teicoicos es inestable por lo que deben ser reesterificados. La
estructura de los ácidos teicoicos es ampliamente conocida y las proteínas que
intervienen en la síntesis parecen estar involucradas en el crecimiento
bacteriano.
Por otra parte, es posible que la carga negativa los ácidos teicoicos funcione en
la' captura de cationes o sirva como una barrera biofísica para prevenir la
difusión de sustancias (72. 102). Sin embargo, deben realizarse experimentos
que confirmen esta función. Los ácidos teicoicos participan en la unión de
enzimas que hidrolizan la pared de peptidoglucano como por ejemplo murein-
hidrolasas (103,104).
1.5. Ácidos Iipoteicoicos.
Los ácidos lipoteicoicos son polimeros polianiónicos ubicados en la parte
externa de la membrana citoplasmática mediante unión a Iipidos (72).
Los ácidos lipoteicoicos están formados de Poli-Gro-P que puede estar
modificado en el hidroxilo del carbono 2" y 4' con GlcNac y O-Ala. (78)
14
Neevia docConverter 5.1
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Fig_5. Bioslntesis de los ácidos teicoicos de Staphylococcus con otras bacterias.
2. ESTRUCTURA.
2.1. Ácidos Iipoteicoicos de poli-glicerofosfato.
El tipo predominante de ácidos Iipoteicoicos contiene una cadena de 1,3 poli-
glicerofosfato unida por enlace fosfodiéster a un glicoHpido o fosfatidilglicoHpido
el cual en forma libre ocurre como un Hpido de membrana caracteristico de las
bacterias Gram-positivas (105,106). Igualmente una caracteristica de las
bacterias Gram-positivas es la presencia de glicerofosfolipidos que son
homólogos de los ácidos Iipoteicoicos de cadena corta que contienen un
residuo sn-qllcerol-t fosfato en el glicoHpido en lugar de cadenas de poli-
15Neevia docConverter 5.1
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Fig. 5. 8ios lntesis de los ácidos teicoicos de Staphy/ococcus con otras bacterias .
2. ESTRUCTURA.
2.1. Ácidos Iipotelcolcos de poll-glicerofosfato.
El tipo predominante de ácidos Iipoteicoicos contiene una cadena de 1,3 poli-
glicerofosfato unida por enlace fosfodiéster a un glicollpido o fosfatidilglicollpido
el cual en forma libre ocurre como un Iipido de membrana caracteristico de las
bacterias Gram-positivas (105,106). Igualmente una caracteristica de las
bacterias Gram-positivas es la presencia de glicerofosfolipidos que son
homólogos de los ácidos lipoteicoicos de cadena corta que contienen un
residuo sn-glicerol-1 fosfato en el glicolipido en lugar de cadenas de poli-
15Neevia docConverter 5.1
glicerolfosfato. Estas moléculas son componentes minoritarios de las
membranas y se consideran precursores en la bioslntesis del ácido
lipoteicoico.
La relación estructural entre los glucoHpidos, glicerofosfoHpidos y ácidos
Iipoteicoicos se muestra en la Figura 6. Un estudio para analizar la distribución
de ácidos Iipoteicoicos con poli-glicerofosfato entre las bacterias Gram-
positivas lo realizó Mc Carty 1959 (4) en una investigación serológica para la
detección del antlgeno extralble de poli-glicerolfosfato.
Estos estudios mostraron que pneumococci, clostridia, corynebacteria,
streptococci grupo-O y bacterias Gram-negativas carecen del antlgeno. Entre el
grupo de bacterias no-hemoHticas, streptococci viridans, cepas positivas y
negativas si lo presentaron.
(a)
(b)
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Fig. 6. Relación estructural entre glicolfpidos (a), glicerofosfoglicolfpido (b) y ácido Iipoteicoico
(c) en Staphylococcus aureus (X, 70 % ester D-alanina, 30 % H; n= 25-29). Los mismos
compuestos ha sido encontrados en Bacillus Iicheniformis y Bacillus subtilis.
2.2. Llpido de anclaje.
La mitad del Hpido rinde moléculas amfifllicas de ácidos Iipoteicoicos que sirven
de ancla con la membrana citoplasmática mediante interacciones hidrofóbicas.
16Neevia docConverter 5.1
Los glicolípidos difieren en estructura entre las bacterias Gram-positivas y de
manera específica por el género (107, 108).
Las estructuras y composición son listadas en la Tabla 1. Como se observa, los
dihexosildiacilgliceroles son los más frecuentes, los trihexosildiacilgliceroles
ocurren ocasionalmente, mientras que los monohexosildiacilgliceroles no han
sido detectados como componentes de los ácidos lipoteicoicos, aunque están
consistentemente presentes en las membranas como precursores biosintéticos
del dihexosildiacilgliceroles. Se han encontrado un gran número de ácidos
Iipoteicoicos además de los glicolípidos y derivados de estos (Tabla 1) que
contienen un tercer éster de ácido graso (lb, IIIb, IVb) o un residuo de sn-2-
fosfatidil-. Los residuos del tercer ácido graso y del fosfatidil están
generalmente unidos al carbono 6 del residuo hexosil unido al diacilglicerol
como se ilustra en la Fig 7, de la cual la mitad de la molécula es hidrofóbica.
Tabla 1. Lipido de anclaje de ácidos lipoteicoicos
IVa+Nb GIc(J1-8)GtI(d.2)Ok:(*"1~~ ~ce.r~
Glc(21-8)o.I(t:1-2)Gk(d...s)Kl,Gro ~.~~
• ...
17
Neevia docConverter 5.1
Referencias : ' Flscher y col. (1980 a); b Flscher y col. (1981) ;' Koch y Flscher (1978) ; · SChlelfer y col. (1985) ; ' Toon
y col. (1972) ; , Ganfield y Pierlnger (1975), • Fischer y col. (1983) ; • Bullon y Hemmlngs (1976 a); 1 Iwasak i y cot.,
(1988); • W. Flscher (Observaciones no publicadas); I Duckworth Y col. (1975); m W . Flscher y T. F1elschmann-5perber
(trabajo no publicado); " Helher y Jackson (1983) ; • Ruhland y Fledler (1987) ; • Uchikawa y col. (1986); q Nakano y
Flsche r (1978);' Flschery col . (1980b), ' Bull on y Hemmlngs (1976b) .
Especies moleculares con 3 o 4 residuos de acil graso constituyen menos del
50% del ácido Iipoteicoico total. El tercero y cuarto residuo de acil-graso puede
anclarse más firmemente a la membrana debido a la concentración micelar
critica de los Hpidos amfifflicos que decrece conforme se incrementa el número
de átomos de carbono alifáticos (109, 110).
Fig. 7. Modelo de espacio-lleno de GroP-6Glc(p1 -6)Gal(a1-2), acil-6Glc(a1-3)aciI2Gro de
Lactobacif/us casei mostrando una mitad glicollpida con tres cadenas acil-graso.
El residuo de diacilglicerol no glicosilado como Ifpido de anclaje fue encontrado
por primera ocasión en el ácido Iipoteicoico de una cepa mutante de Bacillus
Iicheniformis, que al carecer de fosfoglucomutasa, es incapaz de sintetizar
UDP-glucosa y por tanto glucoHpidos (111). Recientemente un residuo de
diacilglicerol como Hpido de anclaje del ácido Iipoteicoico se detectó en cepas
silvestres de Bacillus coagulans y Bacillus megaterium (112). Es interesante
señalar que B. mageterium no contiene naturalmente glicoHpidos en la
membrana, mientras los Hpidos de membrana de B. coagulans no han sido
caracterizados. La presencia de residuos de acil-graso en residuos de glicerol
de la cadena de poli-glicerofosfato no ha sido aún confinnada (113).
18Neevia docConverter 5.1
Como se muestra en la Tabla 2, la composición de ácidos grasos del ácido
Iipoteicoico es muy similar a la de los ácidos grasos presentes en la célula, lo
que refleja que el origen de estas moléculas es a partir de los Iípidos de la
membrana. Si el ácido Iipoteicoico presenta residuos de ácido cis, 11-12
metilenoctodecanoico, el contenido de esta molécula es por lo general más alto
en la membrana lipídica que en el ácido Iipoteicoico utilizando como precursor
biosintético al ácido cís-e-t t-octadecanolco (114, 115). Se ha demostrado que
la ciclopropanización de ácidos grasos no saturados ocurre después de la
síntesis de Iípidos y por delante de la fase logaritmica de crecimiento
bacteriano (116-120). Estos resultados sugieren que el ácido Iipoteicoico es
menos accesible a la enzima ciclopropano sintetasa, posiblemente por que la
molécula se localiza en la capa externa de la membrana.
Tabla 2. Composición del porcentaje acil-graso de ácidos Iipoteicoicos y lipidos de la
membrana en varias bacterias Gram-posilivas
'e lU C14:1 efe :o "efe:' e'&il c •• :, e.e.-
12.. 3).S 3-S
7.7 0.'" 21.7 3.9
26.e t .6 15.7 '2.5
2:5.a 1.1 7. t 22.'"
1.1
2.S
U .1 f 11..
24,01 «la
Referencias: "Toon y col. (1972) ; "IN. Fischer (Trabajo no publicado); 'Schleifer y col.(1985); 'Fischet (1987 a).
'Cis-11, 12-ácido-metileno-octadecanoi<:o,
19
Neevia docConverter 5.1
'Predominantemente cis-611-ácidoocladecanoico.
'Acido octadecanoicocon locacióninusualy no identificadade un doble enlace.
·Predominantementecis-69-ácidooctadecanoico.
2.3. Estructura de la cadena.
Los ácidos lipoteicoicoicos poli-glicerofosfato contienen una cadena sencilla
unida por un enlace fosfodiéster al glucolípido, aunque estos detalles
estructurales se encuentran solamente en pocas estructuras. Sin embargo,
estudios estructurales de glicerofosfolípidos, muestran la presencia de un
enlacefosfodiéster lo que sugiere que la cadena de poliglicerol-fosfato se une
consistentemente al carbono en posición 6 en la hexosa no reductora terminal
distal al diacilglicerol (115, 121-123). El fosfatidilgliceroles el precursor
biosintético de sn-glicerol-1-fosfato, de glicerofosfolipidos (122, 123) Y del
residuo de glicerolfosfato del glicolípido terminal (105).
La variación en la estructura de los glucolípidos por especie y género depende
de la cadena de poli-glicerofosfato y la naturaleza de la sustitución en el
carbono 2 del glicerol como se muestra en la Tabla 3. Con una cadena sencilla
sin ramificaciones en el glucolípido, la longitud de la cadena varía de entre 16 a
40 unidades de glicerofosfato. De acuerdo a la sustitución en la cadena los
ácidos Iipoteicoicos se han clasificado en cuatro grupos:
Grupo 1: Carecen de sustituyentes.
Grupo 2 y 3: Contienen ésteres de de O-alanina o glicosiJ.
Grupo 4: Contienen ambos sustituyentes.
El único aminoácido presente es la O-alanina y entre los sustituyentes
glicosilados están presentes un rango estrecho de monosacáridos comunes. La
mayoría de los ácidos Iipoteicoicos contienen sustituyentes monohexosil.
Los residuos mono-,di -,tri- y tetrahexosil se encuentran presentes en el ácido
Iipoteicocoico de Enterococcus faecalis . Como se observa en la Tabla 3, entre
las diferentes cepas existen diferencias notables en el grado de glicosilación de
la cadena de poli-glicerofosfato asi como en el número de residuos glucosil de
20
Neevia docConverter 5.1
cada sustituyente. En pocas bacterias los sustituyentes glucosil son antígenos
de grupo (124).
La presencia de residuos de glicerol no sustituidos en la mayoría los ácidos
lipoteicoicos (Tabla 3 y 4) lleva a preguntarse si los ácidos Iipoteicoicos son
mezclas de cadenas sustituidas o no sustituidas o si todas las cadenas están
parcialmente sustituidas. La extracción por cromatografía de intercambio
aniónico o por columnas de DEAE-Sephacel permite la separación de especies
químicas de ácido Iipoteicoico con un incremento en la carga negativa con el
propósito de disminuir el contenido de ésteres de alanina (125). Usando este
procedimiento. se ha mostrado que especies no sustituidas están ausentes en
el ácido Iipoteicoico de Staphylococcus aureus y que todas las especies
moleculares presentan bajos contenidos de alanina (125). La cromatografía de
afinidad de lectina específica para residuos de a-D-galactopiranosil igualmente
muestra la ausencia de especies no galactosiladas en el ácido Iipoteicioco de
Lactococcus lactis (13). Cuando se estudiaba la distribución de residuos de
alanina a lo largo de la cadena, se llegó al descubrimiento de la
fosfomoesterasa, que degrada D-alanil ácido Iipoteicoico de la porción terminal
distal (126). Usando este procedimiento con el ácido Iipoteicioico de
Staphylococcus aureus, se ha mostrado que cada tercer cadena posee el
mismo radio de D-alanina-fosfato. Esto revela la distribución homogénea de
sustituyentes de D-alanina- fosfato a lo largo de la cadena lo que sugiere tanto
el arreglo regular como el azaroso. Mediante estudios de espectroscopia NMR
se ha obtenido información sobre los distribución azarosa de ésteres de alanina
en el ácido lipoteicoico de Lactobacillus ferrnentum (127). Los residuos glicosil
del ácido lipoteicoico de Enterococcus faecalis también están distribuidos de
forma azarosa.
Dos o tres susütuyentes diferentes del ácido Iipoteicoico (Tabla 3) pueden estar
unidos como se muestra en la Tabla 4, para separar residuos de glicerol o
residuos de éster de alanina, y pueden en parte unirse a sustituyentes glucosil.
El alto grado de glicosilación del ácido Iipoteicoico de Enterococcus faecalis
cepa NCIB 8191 y NCIB 39 sugiere que la mayoría de los ésteres de alanina
21
Neevia docConverter 5.1
están unidos a sustituyentes glucosil (Tabla 3). Los sustituyentes hexosil y
alanina están unidos en la misma cadena en el ácido lipoteicoico del L. factis.
Tabla 3. Sustitución y longitud de cadena de ácidos lipoteicoicos poli(gl icerolfosfato)
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2
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2
'Residuos glicosi, pertenecen a las series O y son en forma de píranosa.
'Ausencia de Slaphytococcus aureus H gor'<l>R ('N. Fischer. trabajo no publicado). un mulante carente de los
suslituyentes N-acetilglucosaminil en la pared del ácido teico ico (Heckels y cot., 1975)
'Estruduras: a-Glc (1-; aGIc(1-2)a-G1c(1; a-GIc(1-2)a-Glc( 1-2)a-G1c(1 ; a-GIc(1-2)a-GIc(1-2)a-GIc(1-2)a-GIc(k
'no presente en todas las cepas. mientras la forma anomérica es cepa-especlfica.
Referencias: 1, Foscher y col. (1981); 2. lwasaki y col. (1986); 3. Kelemen y Baddiley (1961) ; 4, Nakano y Fischer
(1978); 5. W. Fischer (Trabajo no publicado); 6, Fischer y col. (1980);7, Fischer y col . (19809a); ; 8. Mc Carty (1964); 9,
SchleWer y col. (1985); lO, Rajbhandari y Baddiley (1963) ; 11, Foscher y ROsel (1980); 12, Cabacungan y Pieringer
(1965); 13, Wicken y Baddiley, (1963); 14, Ruhland y Fledler (1987); 15, Uchikawa y col. (1986) , 16. Fischer y Koch
(1981).
22
Neevia docConverter 5.1
Tabla 4. Composición de la cadena de ácidos lipoteicoicos" poli(glicerolfosfato) sustituidos. De
Fischer y Koch (1981)
"Medición después de la hidrólisis con 40 % (pfp) con fluoruro de hidrógeno (Fischer y col. 198011, 1981); los valores
cotizados están en proporción molar al Fósforo.
"Glicerol no-sustituldo.
2.4. Acldos Iipoteicoicos poli-digalactosil, galactosil gllcerofosfato.
Este tipo de ácidos lipoteicoicos están presentes en Lactococcus garvieae (Fig.
8). En donde los residuos de digalactosil están intercalados entre los residuos
de glicerofosfato, mientras los residuos de glicerofosfato están
consistentemente sustituidos en el C-2 con residuos de monogalactosil (107,
128). En otras especies de Lactococcus el Iipido de anclaje es Glc(a1-
2)Glc(a1-3)acil2Gro y derivados del 6-0-acetilado. La estructura de la cadena
es una reminiscencia de polihexosil glicerofosfato presentes en en la pared de
ácidos teicoicos (129) pero difiere porque contiene residuos de sn-glicerol-1-
fosfato (128).
2.5. Lipoglicanos que contienen glicerofosfato.
El ácido lipoteicoico de Bifidobacterium bifidum consiste de dos unidades de
1,2 poliglicerofosfato, una de las unidades contiene glucano y la otra
glucofurano en el glicerol terminal de la cadena distal de poliglicerofosfato en la
mitad dellipido (130).
En esta estructura, la cadena amfifilica es Iipoglucogalactofurano y los residuos
de glicerofosfato no están intercalados en la cadena pero están unidos como
23
Neevia docConverter 5.1
brazos monoméricos a residuos de galactofuranosil. Con ácidos Iipoteicoicos
poliglicerofosfato. los residuos de glicerofosfato tienen configuración sn-1 y
están en parte sustituidos con ésteres de alanina. Sin embargo, presentan
configuración L en contraste con los residuos de O-alanina del ácido
lipoteicocoico de poliglicerofosfato.
El Hpido ancla fue tentativamente identificado como [3-0-Gal(1-3) acil2Gro y
pueden por consiguiente ser derivados de galactoHpidos de membrana (131).
En contraste a los ácidos Iipoteicoicos de poJiglicerofosfato, los residuos de
glicerofosfato presentan distancia de la membrana por unión al glucano.
Actinomycetes y Streptococcus sanguis biotipo B carecen de ácido Iipoteicoico
poliglicerolfosfato según detección serológica. (131, 133). En lugar de esta
estructura contienen heteropolisacáridos (134, 135). Están presentes también
pequeñas cantidades de residuos monoméricos de glicerofosfato.
45·74 %
26-55 ~b11
CO-R'
OU OIl
Q
~tt>l
Il C
01> o ~ O'
? ~It> o co R'
( H2 / 0,
)-O, O\L.I': o ClU
~, I IIC o CO R'
I It>C O CO R'
Fig. 8. Estructura del ácidolipotcicoico del Lactococcus garvieae (formalmente conocido como
Streptoco ccus lactis Kiel 42172).
24Neevia docConverter 5.1
R
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o ~H2 I I O ~Hl I O ~Hl ~
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H2C O ¿_~ f H2
H- O ~
Fig. 9. Estructura de un Iipoglicano de Bifidobacterium bifidum DSM 20239 orientando cadenas
sn-glicero-1 -fosfato parcialmente sustituidas con éster L-alanil. n, 7-10, m, 8-15.
2.6. Lipomanano succinilado.
Micrococcus luteus, Microccus f1avus y Micrococcus sodenensis carecen
serológicamente de ácidos Iipoteicoicos detectables, pero poseen Iipomanano
succinilado (136-139) (Fig 10). La unión hidroflfica contiene de 50 a 70 residuos
de (1-2)-, (1-3)-, Y (1-6) a-D-manopiranosil y dos puntos de ramificación en
posición 2 y 4.
Entre el 10 Y 25% de los residuos de manosil están sustituidos con succinato
unido mediante enlace éster. Un lipomanano neutro que carece de residuos
succinil ha sido aislado de Micrococcus agilis (140). El lipomanano de M.
luteus, presenta como Iipido de unión diacilglicerol (139, 141). El lipoglicano
que contiene glicerofosfato de Bifidobacterium bifidum se considera como el
vinculo entre los Iipomananos y los ácidos lipoteicoicos.
Mannosd (Mannosil) "-
50 "- CHlOH
I I I Y-o,
/ ~ O )N-VI O
(
pll
CHl
I
. / C,
. o/ eX <ro
~
lOH
- ?~
1 V i o CHl
I
H( o CO R
I
Hle o CO R
Fig. 10. Estructura del Lipomano succinilado de Micrococcus /uteus
25Neevia docConverter 5.1
2.7. Ácido Iipoteicolco de Streptococcus pneumoniae.
Estas bacterias poseen en lugar del ácido Iipoteicoico de poliglicerofosfato al
antlgeno Forssman de pneumococos por lo que se denomina también como
ácido lipoteicoico pneumococal. Aunque conocido subsecuentemente como
Iipocarbohidrato desde 1943 (142) Y durante la última década ha sido
intensamente estudiado por sus actividades biológicas. Hasta el momento la
estructura de este polfmero no ha sido desentrañada. Se ha demostrado que
contiene residuos de ácido graso de ribitol fosfato, galactosamina, glucosa y
fosfato de colina (143-146). La composición de ácidos grasos es similar a la de
los ácidos teicoicos de los pneumococos como se muestra en la Figura 11. A
pesar de la similitud en la composición, los ácidos Iipoteicoicos no son
precursores de los ácidos teicoicos (147).
1"
Fig. 11. Estructura de la unidad repetida del ácido teicoico de la pared de Streptococcus
pneumoniae (Jennings y col. 1980). El antlgeno pneumococcico de Forssman ("ácido
Iipotelcoico" pneumococclco) tiene una composición similar pero, además. contiene esteres
acil-graso sobre una mitad IIpida no identificada.
2.8. Aspectos Cuantitativos.
Estimaciones tempranas del contenido celular de ácidos Iipoteicoicos señalan
que se encuentran en bajas concentraciones, debido a la dificultad en la
extracción cuantitativa (145,149, 150). Se ha reportado que representan del 1
26Neevia docConverter 5.1
al 3% de peso seco y del 2 al 3% para el estimado de 120 urnol de ácido
Iipoteicoico o glicerol por gramo de peso seco (134, 145). Para algunas
bacterias el contenido varía en función de las condiciones de crecimiento. En
Staphylococcus aureus, el crecimiento en medio líquido cultivo muestra que
los ácidos Iipoteicoicos, teicoicos y ácidos nucleicos representan el 13, 29 Y
58% respectivamente al total del polímero de fósforo (145). Tomando en cuenta
la diferencia en la longitud la cadena de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos el
radio es de 1.5.
3. METABOLISMO.
3.1. Biosíntesis de ácidos Iipoteicoicos poliglicerolfosfato
En el año de 1974, Glaser y Lindsay y Emdur y Chiu, realizaron experimentos
in vivo y mediante ensayos de pulsa-caza mostraron evidencias de que en
Staph. aureus y Strep. sanguis, el glicerolfosfato requerido para la biosíntesis
de ácido Iipoteicoico deriva del fosfatidilglicerol. La función del fosfatidilglicerol
se estableció con certeza por experimentos in vitro usando preparaciones
membranales de Strep. faecalis (146) y Lactobacillus casei tratadas con
tolueno (19). El COP-glicerol que contiene sn-glicerol-3-fosfato no puede
sustituir al fosfatidilglicerol, como se muestra en la preparación enzimática de
Ent. faecalis (137). En experimentos con B.subtilis, la inhibición en la síntesis
de fosfatidilglicerol con 3,4-dihidroxi-butil-1-fosfonato, un análogo del sn-glicero-
3-fosfato, provoca el bloqueo en la síntesis del ácido Iipoteicoico (151). En
experimentos pulsa-caza de células en crecimiento como Staph. aureus (66) y
B. subtilis (152) se marcaron con eH] glicerol y posteriormente se extrajeron
como fosfatidilglicerol, el cual se hidrolizó con ácido acético o fosfolipasa C, con
el propósito de estudiar el patrón del marcaje del diacilglicerol y del
glicerolfosfato (Fig. 12). Se encontró que se producía un rápido recambio de
glicerol no acetilado en ácido lipoteicoico cuando el grupo fosfato se
encontraba marcado (152).
27
Neevia docConverter 5.1
al 3% de peso seco y del 2 al 3% para el estimado de 120 urnol de ácido
Iipoteicoico o glicerol por gramo de peso seco (134, 145). Para algunas
bacterias el contenido varía en función de las condiciones de crecimiento. En
Staphylococcus aureus, el crecimiento en medio líquido cultivo muestra que
los ácidos lipoteicoicos, teicoicos y ácidos nucleicos representan el 13, 29 Y
58% respectivamente al total del polímero de fósforo (145). Tomando en cuenta
la diferencia en la longitud la cadena de los ácidos teicoicos y Iipoteicoicos el
radio es de 1.5.
3. METABOLISMO.
3.1. Biosíntesis de ácidos lipoteicoicos poliglicerolfosfato
En el año de 1974, Glaser y Lindsay y Emdur y Chiu, realizaron experimentos
in vivo y mediante ensayos de pulsa-caza mostraron evidencias de que en
Staph. aureus y Strep. sanguis, el glicerolfosfato requerido para la biosintesis
de ácido lipoteicoico deriva del fosfatidilglicerol. La función del fosfatidilglicerol
se estableció con certeza por experimentos in vitro usando preparaciones
membranales de Strep. faecafis (146) y Lactobaciflus case; tratadas con
tolueno (19). El CDP-glicerol que contiene sn-glicerol-3-fosfato no puede
sustituir al fosfatidilglicerol, como se muestra en la preparación enzimática de
Ent. .'aecafis (137). En experimentos con B.subtifis , la inhibición en la síntesis
de fosfatidilglicerol con 3,4-dihidroxi-butil-1-fosfonato, un análogo del sn-glicero-
3-fosfato, provoca el bloqueo en la síntesis del ácido Iipoteicoico (151). En
experimentos pulsa-caza de células en crecimiento como Staph. aureus (66) y
B. subtifis (152) se marcaron con [3H] glicerol y posteriormente se extrajeron
como fosfatidilglicerol, el cual se hidrolizó con ácido acético o fosfolipasa C, con
el propósito de estudiar el patrón del marcaje del diacilglicerol y del
glicerolfosfato (Fig. 12). Se encontró que se producía un rápido recambio de
glicerol no acetilado en ácido lipoteicoico cuando el grupo fosfato se
encontraba marcado (152).
27Neevia docConverter 5.1
12 -
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O O
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Fig. 12. Recambio de la mitad gllcerolfosfato no-acetilado de fosfatldilglicerol dentro del ácido
Iipoteicoico en crecimiento como Staphylo coccus eureus en un experimento pulsa-caza usando
[2-3H]glicerol; la flecha Indica el inicio de la caza. 51mbolos: e, ácido Iipoteicoico; Á , mitad
glicerolfosfato y I 1, mitad diacilglicerol de fosfatidilgllcerol liberado por tratamiento con
fosfolipasa e y separado por fase de división (Koch y col. 1984).
Un sistema promisorio para estudiar la slntesis del ácido Iipoteicoico se obtuvo
al generar veslculas membranales que se liberaban de Lb. casei por el
tratamiento con penicilina (130). Estas vesículas catalizan la incorporación del
[14C] glicero-3-fosfato y UDP_[14C] glucosa al poliglicerofosfato y glucollpidos .
La elongación de la cadena se dilucidó por técnicas de marcaje diferencial. En
En!. faecalis, elácido Iipoteicoico se premarcó in vivo con [14C] glicerol y
subsecuente el elongado se analizó in vitro usando preparaciones enzimáticas
de [1(3)-glicerol-¡3H] ácido Iípoteicoico, formado en la bacteria en crecimiento y
fue analizado en células tratadas con tolueno usando C4c] glicerol 3-fosfato
como segundo marcaje (12). El ácido Iipoteicoico fue aislado y degradado del
glicerol terminal al IIpido por la acción de fosfodiesterasas y
fosfomonoesterasas de Aspergillus nfger. En ambos polimeros el radio de los
dos isótopos en el glicerol liberado indica el crecimiento de la cadena distal al
IIpido de anclaje (Fig. 13).
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Fig. 13. Datos que muestran el modo de la extensión de la cadena de ácido lipoteicoico en
Lactobacillus casei. El ácido lipoteicoico en bacteria estaba marcado en sucesión con [2-
3Hlglicerol y C4c]glicerol, aislado, y el termino gradual del glicerol degradado por la acción
conjunta de fosfodiesterasa y fosfomonoesterasa de Aspergillus N/ger. A intervalos de tiempo
el glícerollíberado fue analizado por radioactividad 14C_ y 3H.
De este modo el crecimiento de la cadena es idéntico con el de la pared de los
ácidos teicoicos (153, 154) Y difiere de la extensión de la cadena de
peptidoglucanos que es alargada por la transferencia de la cadena en
crecimiento a la siguiente unidad de repetición del acarreador lipidico (7). El
crecimiento distal del IIpido acarreador, como en la sintesis de ácido
Iipoteicoico, permite que toda la cadena sintetizada esté unida al IIpido.
Requiere por otra parte, que durante la sintesis de la cadena o del crecimiento
terminal de la cadena permanezcaen contacto con la membrana.
La sintesis de glucollpidos ha sido estudiada en preparaciones de extractos
crudos de varias bacterias Gram-positivas. Generalmente el 1,2-di-O-acil-sn-
glicerol es el sustrato lípldlco inicial a través del cual los residuos
monosacáridosson subsecuentemente transferidos de sustratos hexosil unidos
29Neevia docConverter 5.1
a nucleótidos (140, 155-157). Se ha sugerido que el residuo de diacilglicerol
origina ácido fosfatídico a través de la acción de la fosfatasa de ácido
fosfatídico (115) pero antes de que se haga evidente la cantidad de
diacilglicerol, que se requiere para la síntesis de glucolípidos. resulta la sintesís
del ácido Iipoteicoico.
En lactococci (108, 158), enterococci (159,160) y lactobacilli (160-162) el .
fosfatidil y el acil diglicosildiacilglicerol que participan en la unión Iipídica de los
ácidos Iipoteicoicos están frecuentemente presentes en estado libre entre los
Iipídos de membrana. Los derivados glucolípidos pueden ser usados como
sustratos aceptores para la síntesis de ácido lipoteicoico y están también
presentes en estado libre en la membrana Iipídica. Un hallazgo adicional del
sn-glicerol-1-fosfato que llevan derivados de acil y fosfatidilglicosil-
diacilglicerolipidos conduce a la idea de que en Ent. faecalís se lleva a cabo la
biosíntesis a como se ilustra en fa Figura 14. La biosínstesis de
fosfatidilglucosíldiacilglicerol ha sido demostrada en preparaciones enzimáticas
de Ent. faecalís que catalizan la transferencia de fosfatidil a partir del
bifosfatídilglicerol y fosfatidilglicerol al glucolípido. Estas preparaciones
membranales también catalizan la conversión de fosfatidilglicerol al
bisfosfatidilglicerol y son más activas en la síntesis de fosfoglucolípidos (163).
30
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Fig. 14, Estructural y posible relación biosintética entre el glicolfpido, fosfoglicolfpidos y las dos
especies moleculares de ácido lipoteicoico en Enterococcus faecalis . Para las estructuras de
fosfoglicolfpidos (Fischer y col, 1973 a.b: Fischer y Langraf, 1975) y ácido Iipoteicoico (Toon y
col ., 1972; Ganlield y Pieringer , 1975; Fischer y col., 1981) ver las referencias dadas ; Para los
sustitutos de cadena de ácidos Iipoteicoicos completos (X) ver tabla 3.
Con preparaciones particuladas de membrana de la misma bacteria, puede
demostrarse que el fosfadildiglucosildiacilglicerol marcado es utilizado como
sustrato en la biosintesis del ácido Iipoteicoico que procede al fosfatidilglicerol
endógeno (146). El marcaje aparece en un producto soluble en agua que
parece incrementar su longitud en periodos de incubación largos porque se
incrementa su insolubilidad en c1oroformo-metanol-agua (Fig. 15). Homólogos
de cadena corta del ácido Iipoteicoico se extraen con tolueno en células de Lb.
casei (8 y 164).
31Neevia docConverter 5.1
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Fig. 15. Curso de tiempo de incorporación de [glucosa-14Cjfosfatidildiglucosildiacilglicerol (nmol
(protelna mq)") dentro de un polfmero extra ido en solución salina de cloroformo-metanol-agua
(1:1:0.125, por vol.) . sobrenadante • y una prote ína insoluble que contiene la pastilla O por
preparaciones de membrana de Streptococcus teeceñs.
En experimentos pulsa-caza los ácidos grasos de Staph. aureus en crecimiento
se marcaron con ¡1"C)-acetato, el [1"C) aparece en Glc([31 -3)acil2Gro, Glc([31 -
6)Glc(j31 -3)acibGro y ácido lipoteicoico (Fig.16). El glicerofosfoglucoHpido ha
sido aislado y caracterizado y se sabe que participa como intermediario en la
bioslntesis de ácido lipoteicoico como se mostró en experimentos con [3H]
glicerol (Fig.17) (165).
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Fig. 16. Cinéticos pulsa -caza de amfifilos Ifpidos en crecimiento de Staphylococcus aureus
sobre el marcaje de ácidos grasos con [14Cjacetato . La flecha indica la entrada de la caza .
51mbolos: Á , fosfatldilgllcerol; I !, diacllglicerol; . , ácido Iipoteicotco; <..\ dlglucosildiacilglicerol;
(), glucosildiacilglicerol;A, ácido fosfatidico.
32Neevia docConverter 5.1
Como se muestra en la Figura 17, la unión del glicerofosfato del
glicerofosfaglucolipido gana y pierde radiactividad muy rápidamente, porque la
poza de glicerofosfoglucolipido es muy pequeña y se recambia a la gran poza
de ácido Iipoteicoico (ver Tabla 5). Por otra parte, el marcaje del residuo de
glicerol en el glucolfpido se incrementa continuamente durante todo el periodo
de caza (Fig. 17), ganando radiactividad a través de la slntesis desde el
duradero marcaje en la poza del diacilglicerol (Fig. 16).
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Fig. 17. Cinéticos pulsa-caza de las dos mitades glicerol de GroP~6GIc(131 -6)Glc(131­
3)acil2Gro, el glicerofosfoglicollpido de Staphylococcus aureus, sobre el marcaje de células de
crecimiento con [2-3H) glicerol. 51mbolos: • • mitad diglucosildiacilglicerol ; Á , mitad
gllcerolfosfato; 1\ , gllcerolfosfato-glicollpidoel cual evitó la conversión del ácido lipoteicoico.
Existen dos uniones qulmicamente diferentes en la slntesis del ácido
Iipoteicoico. La primera es la unión del glicerofosfato al glucolfpido, la segunda
es la unión de unidades de glicerolfosfato entre sI. El descubrimientode
glicerofosfoglicolipidos en un amplio rango de bacterias Gram-positivas, junto
con la usual ausencia de homólogos grandes, (160) sugiere que dos
transferasas de glicerofosfato están involucradas. Una podrla reconocer al
glucolipido como sustrato, formando un intermediariode glicerofosfoglucolipido,
y la segunda podría polimerizar la cadena. La transferasa inicial parece ser
altamente especifica, en algunas bacterias, como Lb. casei , cietros glucolfpidos
son estrictamente selectivos (Fig. 18), Y en todos los casos los residuos de
33Neevia docConverter 5.1
glicerofosfoHpidos estudiados están exclusivamente unidos al e-6 del hexosil
terminal del glucoHpido. El diacilglicerol no glicosilado encontrado en el ácido
lipoteicoico de ciertas bacterias (Tabla 1) sugiere que el diacilglicerol o
fosfatidilglicerol sirven como sustrato.
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Fig. 18. Estructuras de glicollpidos, glicerofosfoglicollpidos y ácido Iipoteicoico de Luctobacillus
casei. Para detalles, ver Fischer y col., (1978c) y Nakano y Fischer (1977,1978), para
sustitución de ácido Iipoteicoico (X) ver Tabla 3.
34Neevia docConverter 5.1
3.2. Biosíntesis de microamfifilos relacionados.
Aunque la biosíntesis de ácido lipoteicoico poli(glicosilglicerofosfato) de
Lactococcus garvieae no ha sido estudiada, la configuración sn-1 de residuos
de glicerolfosfato proveen una fuerte evidencia para el fosfatidilglicerol como un
donador de glicerofosfato. Un juego de sn-glicerol-1-fosfoglucolípidos
galactosados ha sido detectado en estos organismos (166) y puede ser
incorporado con la secuencia biosintética conduciendo a la formación de un
compuesto que contiene una unidad completa de Gal (a1-6)Gal(a1-3), Gal(a1-
2)Gro-1-fosfato, en el ácido Iipoteicoico (Fig. 19). Por consiguiente uno podria
pensar que la unión de unidades repetidoras en la cadena en crecimiento por la .
transferencia sucesiva de glicerofosfato y residuos individuales de galactosil.
Las cadenas de sn-glicero-1-fosfato dellipoglicano de Bifidobacterium bifidum
(Fig. 9) ha mostrado que es un derivado del fosfatidilglicerol. Preparaciones de
membrana catalizan la transferencia del radiactividad del fosfatidil-[14c]glicerol
pero no del CDP-C4c]glicerol al producto que tiene las propiedades de
microamfifilo (136). En estos experimentos la incorporación de radiactividad en
el polímero a partir de UDP-[14c]glucosa y UDp[14c]galactosa no ha sido
observado, el glicerofosfato es aparentemente transferido al lipoglicano
preformado. Los residuos de galactofuranosil y glicerofosfato pueden ser
transferidos separadamente al Iipoglucano, esto se infirió por el hallazgo de
especies moleculares en el amfifilo nativo que tienen un pequeño número de
residuos de galactofuranosil incompletamente sustituido con glicerolfosfato
(167). Si la síntesis del glucogalactofurano requiere de derivados hexosil del
undecaprenol fosforilado como donadores del glucosil.
En ..Micrococcus luteus , el a-D-manopiranosil-1-fosforil-undecaprenol es
sustrato para la síntesis dellipomanano (107 y 168). Por otra parte el GDP-a-
D-manosa, es directamente usado para la síntesis del mono- y
dimanosildiacilglicerol en este organismo (140). Si la síntesis de lipomanano
comienza del diamanosildiacilglicerol, ambos donadores activados se
requerirán para la sintesis total.
35Neevia docConverter 5.1
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Fig. 19. Secuencia biosintética entre glicerofosfoglicollpidos y ácido Iipoteicoico en Lactococcus
garvieae (formalmente Streptococcus lactis KieI42172).
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Fig. 19. Secuenc ia biosintética entre glicerofosfoglicollpidos y ácido Iipoteicoico en Lactococcus
garvieae (formalmente Streptococcus lactis KieI42172).
37Neevia docConverter 5.1
3.3. Influencia de la biosíntesis del ácido Iipoteicoico en el recambio
membrana!.
En bacterias Gram-positivas el rápido recambio de Iípidos de membrana,
particularmente del fosfatidilglicerol, se identificó hace 15 años (110,169), pero
no ha sido hasta en fechas recientes que se ha desentrañado la biosíntesis del
ácido lipoteicoico (152,165).
La dinámica involucrada por Staph. aureus puede ser deducida de los datos
que se presentan en la Tabla 5. El ácido Iipoteicoico representa no más de 6
moles y contiene aproximadamente el 50% del glicerol amfifilo total y tres
veces la cantidad del glicerol no acilado en el fosfatidilglicerol. El total de
fosfatidilglicerol en membrana se recambia 3 veces para la biosintesis del ácido
lipoteicoico cuando la bacteria está en replicación. El diacilglicerol formado
concomitantemente es seis veces la cantidad presente en la poza de
diacilglicerol. Si, en la caza después del marcaje con [2_3H] glicerol, la
radiactividad en el diacilglicerol de todos los Iípidos amfifílicos es balanceada,
se vuelve evidente que el diacilglicerol se completamente preservado (Tabla 6).
Tabla 5. Composición de amfifilos Iipidos en crecimiento logarítmico en Staphylococcua aureus.
De Koch et al (1984).
Sin embargo, solamente una fracción minoritaria es requerida para la síntesis
de glucolípidos y la unión del glucolípido al ácido lipoteicoico (Tabla 5), la
38
Neevia docConverter 5.1
principal parte debe ser reciclada a través de ácido fosfatídico al
fosfatidilglicerol (Fig. 20). La evidencia de este reciclaje fue evidente por la
diferencia en la cinética de marcaje de las uniones del glicerol del
fosfatidilglicerol en experimentos pulsa-caza (Fig. 12).
Tabla 6. Balance de radioactividad en las mitades de diacilglicerol de amfifilos lipidos en
crecimiento de Staphylococcus aureus durante la caza después de etiquetarlo con [2-
3HjGlicerol. De Koch y col. (1984).
Fosfallcfdgllcerol 301 260 204 194 172 162 168
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Durante el pulso. el diacilglicerol es marcado más lentamente que el glicerol no
acetilado sugiriendo que es derivado de un precursor que se ha marcado muy
lentamente en lugar de ser formado por la síntesis de novo del glicerofosfato.
Después de la caza, la unión del diacilglicerol pierde la marca más lentamente
que el glicerol no acetilado. Mayor soporte para el esquema de reciclaje
proviene del comportamiento sincrónico, después del pulso, la radiactividad se
encuentra en los residuos del ácido graso del diacilglicerol en el
fosfatidilglicerol, en diacilglicerol libre y en ácido fosfatídico (Fig. 16). Es
particularmente notable la persistencia de la radiactividad en la ácido
fosfatídico, debido a la pequeña poza en la síntesis y posición clave en la
síntesis de llpldos, se podria rápidamente perder el marcaje después del pulso
si fuera formado solamente por síntesis de novo vía glicerofosfato a partir de
glicerol no marcado (Fig. 20).
39
Neevia docConverter 5.1
Glicl'lot
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Fig. 20. Interrelación propuesta entre la slntesis de ácido Iipoteicoico y el metabolismo de la
membrana IIpida en Staphylococcus aureus. Esquemas similares metabólicos han sido
disenados para Enterococcus faecalis (Carson y col., 1981) y Lactobacillus casei (Taron y col.,
1983, Ntamere y col., 1987).
La misma diferencia en el recambio en las dos uniones del glicerol en el
fosfatidilglicerol ha sido también observada en otras bacterias Gram-positivas
que sintetizan ácido Iipoteicoico (152, 170,171) mientras, que en cepas de
Bacillus que carecen de ácido lipoteicoico ambas uniones del glicerol son
recambiadas sincrónicamente (115). Un prerrequisito para el reciclaje del
diacilglicerol es la existencia de la diacilglicerol cinasa. Esta enzima ha sido
identificada en L.casei yen Staph. aureus (8).
En Bacillus megaterium, dos diferentes pozas de fosfatidilglicerol, han sido
observadas (171). La poza principal y rápidamente metabolizable es precursor
del diacilglicerol y por consiguiente, está involucrada en la sfntesis del ácido
Iipoteicoico.
40Neevia docConverter 5.1
3.4. Adición de sustituyentes a la cadena.
3.4.1 Glicosilación.
El ácido lipoteicoico de Ent. faecalis está altamente sustituida en el C-2 del
glicerol con mono, di-, tri- Y eventualmente, residuos de tetraglucosil (113, 131,
172), la síntesis in vitro de la cadena del poliglicerofosfato en preparados
enzimáticos procede en ausencia de UDP-glucosa no sustituido del ácido
lipoteicoico recién formado (146). Recíprocamente la glicosilación es
independiente de la síntesis de poliglicerofosfato. La radiactividad se incorpora
al ácido Iipoteicoico preformado cuando las preparaciones enzimáticas se
incuban en presencia de UDP-eH] glucosa. Después de la hidrólisis con 40%
(p/p) de f1uoruro de hidrógeno la radiactividad se detecta con residuos mono-,
di-, tri- Y tetraglucosil , con los que la elongación de sustituyentes diglucosil
parece ser prevalente (172). En células vivas, la glicosilación puede ocurrir en
ácidos Iipoteicoicos en crecimiento por la existencia de di (glicerofosfo)
glucolipidos galactosados los cuales son extraídos .con los Iípidos de
membrana de cepas de Lb. lactis y acarreadores del ácido Iipoteicoico como a-
D-galactopiranosil en uno de los glicerofosfato (173).
La enzima particulada de Strep.sanguis ATCC 0556 incorpora glucosa del
UDP-[14c]glucosa en poliglicerofosfato que ha sido caracterizado en el ácido
Iipoteicoico (4). La incorporación en este polímero es precedida de la formación
del glucosil-Iípido marcado que es soluble en c1oroformo-metanol y
caracterizada como glucosil-1-fosfo-undecaprenol. La glicosilaci6n por
consiguiente ha sido formulada como una reacción de dos pasos (109):
UDP-Glc + Undecaprenilfosfato ~ Glc-1-fosforilundecaprenol + UDP
Glc-1-fosforilundecaprenol + LTA ~ Glc-LTA + undecaprenilfosfato
La existencia de la segunda reacción está basada en evidencia indirecta, por el
requerimiento de hexosil-1-fosfo-undecaprenol como sustrato y puede ser
notable por la glucosilación del ácido lipoteicoico, que ocurre en una reacción
41
Neevia docConverter 5.1
similar y asociada a membrana, y que procede directamente del hexosil-1-
difosforil nucleótido. (174).
3.4.2. Adición de residuos D-alanil.
La alanilación del ácido lipoteicoico fue establecida por Neuhaus y sus
colaboradores usando membranas tratadas con tolueno en extractos de Lb.
casei (126 y 175). La reacdón requiere de fracciones de preparaciones
membranales y de sobrenadantes. La fracción del sobrenadante presenta una
alta actividad de la enzima activadora de O-alanina (176).
Enzima + O-alanina+ ATP B O-alanil-AMP-enzima + Ppi
Posteriormente con cromatografia de filtración de la fracción del sobrenadante
se detectó otro componente que es requerido para la adición de O-alanina en
las membranas que se detectó en presencia de la enzima activadora O-alanina
ligasa, y se piensa que está involucrada en la transferencia de O-alanina del
intermediarioactivado de la membrana.
Enzima O-alanil-AMP + aceptor membranal~ aceptor membranal de O-alanil +
AMP
El último aceptor membranal fue identificado como ácido lipoteicoico
poli(glicerofosfato) presente en las preparaciones membranales (126). No se
sabe como actúa la Iigasa como O-alanil transferasa o previo a la incorporación
de alanil, requerida para la asociación del complejo de la enzima O-alanil-AMP
a la membrana.
Componentes adicionales de la membrana parecen ser necesarios, ya que el
descubrimiento de cepas mutantes de Lb. casei, cuyo ácido lipoteicoico carece
del éster de O-alanina (119). A pesar de la presencia del contenido normal o
incrementado del ácido Iipoteicoico, los fragmentos membranales de estos
mutantes son incapaces de incoroporar D- alanina cuando son incubados con
42
Neevia docConverter 5.1
proteínas del sobrenadante de cepas parentales, mientras que la combinación
reversa muestra actividad.
Cuando las células son tratadas con tolueno o las membranas junto con las
proteínas del sobrenadante de Lb. casei se incuban en presencia de D_[14C]
alanina, se detectan compuestos Iipofílicos (164). En contraste al ácido
lipoteicoico, los extraen con una mezcla de cloroformo-metanol-agua y después
de la partición de fase los recuperan en la capa orgánica. Estos compuestos
contienen D-[14c]-alanina en unión éster, que muestra propiedades
cromatográficas similares a los glicerofosfoglucolípidos de Lb.casei y por tanto
son-considerados homólogos de cadena corta del ácido Iipoteicoico alanilados.
Homólogos de cadena corta de D-alanina se aislaron de B./icheniformis y su
estructura fue identificada como 3"(2")-O-D-alanil-sn-glicerol-1 "-fosfo-6Glucosa
(131-6)-Glc (13 1-3)aciI2 Gro (177). La incorporación de D-alanina parece ser
independiente de la longitud de la cadena y puede ocurrir in vivo
concomitantemente con la síntesis de poliglicerolfosfato. De acuerdo con las
células tratadas con tolueno de Lb. casei, se ha obtenido evidencia para la
elongación de compuestos Iipofílicos alanilados. (8,164).
En un esfuerzo por establecer el papel del ácido Iipoteicoico en al cual D-
alanina es incorporada. Se obutieron muestras de ácido lipoteicoico de células
de Lb. casei tratadas con tolueno marcadas en secuencia con D-[3H]alanina y
D-[14c]alaina (178).
La hidrólisis enzimática de la cadena doblemente marcada revela un radio
constante de 3H y 14C. Existen dos explicaciones para esta observación. La
primera es que D-alanina está azarosamente esterificada a cualquier residuo
de glicerofosfato disponible en la cadena y la otra que D-alanina sea
adicionada en un sitio particular cerca de la unión al Iípido y sea redistribuido a
lo largo de la cadena . (179). Exiten reportes que señalan que para la
transferencia no enzimática de residuos de éster alanina del [14C] alanina del
ácido lipoteicoico a la cadena hidrofílica del ácido Iipoteico ico (178) .
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Neevia docConverter 5.1
Sin embargo, se deben realizar más experimentos para evaluar la eficiencia de
la trans-esterificación no enzimática entre grupos hidroxilo no adyacentes. Por
otra parte, la incorporación azarosa de residuos éster alanina a lo largo de la
cadena requieren de orientación paralela o doblado hacia atrás del ácido
lipoteicoico en la membrana donde un podría esperar que la esterificación
tuviera lugar.
3.5. Recambio de residuos éster O-alanina en ácido Iipoteicoico y . la
transferencia de ácido teicolco en la pared.
Residuos de éster O-alanina del ácido Iipoteicoico, como los ácidos teicoicos de
pared son susceptibles a la hidrólisis espontánea a pH 7 (126,180,181 Y182),
sugiriendo que la continua pérdida de unión éster de O-alanina ocurre in vivo.
Por otra parte, la relación molar de O-alanil/glicerol es tan alta como 0.7 y son
normalmente encontrados en el ácido Iipoteicoico de S. aureus (125).
En experimentos pulsa-caza con [14C] O-alanina, usando S . aureus en
crecimiento con ácido Iipoteicoico queha sido marcado previamente con [3H]
glicerol, la marca de 14C decrece rápidamente después del pulso, mientras que
la marca de 3H permanece constante (132). En vista de la estabilidad de la
cadena del 3H poliglicerofosfato , el decremento del 14C marcado indica la
pérdida de residuos éster de O-alanina del ácido lipoteicoico. Adicionalmente a
la hidrólisis básica, una enzima, parece estar involucrada debido a que la
velocidad de recambio del residuo de alanina es 20 veces más rápida que la
catalizada por hidrólisis básica al mismo pH.
Correlacionada con la pérdida de O-C4C]alanina del ácido Iipoteicoico hay una
ganancia de la radiactividad en el éster de O-alanina unido a la pared, lo que
sugiere que se produce la transferencia de residuos de O-alanina del ácido
Iipoteicoico al ácido teicoico. Un fuerte apoyo para esta transferencia se obtuvo
de estudios de cinéticos de pulso con O_[14c] alanil-glicerol y O_[14C] alanil-
ribitol por el tratamiento de la célula completa con 40% (p/p) de f1uoruro de
hidrógeno acuoso, se liberan del ácido lipoteico ico y ácido teicoico
respectivamente, y se separan por el analizador de aminoácidos.
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Neevia docConverter 5.1
Como se muestra en la Figura 21, la pérdida de radiactividad del D-
alanilglicerol esta acompañada por un incremento de la marca de las formas
glucosiladas y el ribitol del ácido teicoico. Mientras esta transferencia es la
única vla para la incorporación de D-alanina al ácido teicoico deber ser todavía
estudiada con mayor detenimiento.
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Fig. 21. Recambio de residuos D-C4c]alanil de ácido Iipoteiocico a la pared del ácido teicoico
en células de crecimiento como Sfaphy/ococcus aureus. Simbo los: \ ), ácido Iipoteicoico alanil;
0 , alanilglicerol de ácido Iipoteicolco; A , rlbitol total ligado a residuos alanina y 1\ , N-acetil
alanil ribitol glucosamil de la pared de ácido teicoico.
La rápida y casi completa pérdida después del pulso con residuos éster- D-
[14c]alanina del ácido Iipoteicoico. Se produce rápidamente una sustancial
cantidad de D-alanina libre del ácido lipoteicioco y las posiciones vacantes son
re-esterificadas. Se realizaron estudios de re-esterificación usando células de
S. aureus tratadas con tolueno, en condiciones apropiadas, no sintetizan ácido
Iipoteicoico pero retienen la capacidad de incorporar D-alanina en el ácido
lipoteicoico y ácido teicoico (183). Como se observa en la Figura 22 la ácido
Iipoteicoico de células de S. aureus tratadas con tolueno, pierden residuos de
D-alanina y la tasa de la pérdida se incrementa al incrementar el valor de pH.
La incubación en presencia de D-[14c]alanina, ATP y Mg2+ , la pérdida
moderada de residuos de éster de D-alanina es compensada por la
45Neevia docConverter 5.1
incorporación de nuevos D-[14C]alanina y por tanto el radio molar de 0-
alanina/glicerol del ácido lipoteicoico permanece constante. la acelerada
pérdida de residuos de éster-alanina a pH 7.5 aparentemente induce una
rápida re-esterificación por los que el radio D-alanina/glicerol disminuye menos
del 10% a pesar de la pérdida de residuos de éster D-alanina sobre el mismo
periodo sumando el 60%. Todavía una más acelerada incorporación, conduce
a un transitorio incremento en radio alanina/glicerol se observó cuando el
experimento se realiza a pH 6 en S. aureus que debido al crecimiento y al alto
contenido de sales contienen bajo ácido Iipoteicoico alanilado (183). Como los
residuos de éster de D-alanina incorporados en el ácido lipoteicoico en
experimentos de doble marcaje, los residuos de D-alanina incorporados en el
ácido Iipoteicoico por re-esterificación fueron homogéneamente distribuidos a lo
largo de la cadena.
Con células de S . aureus, tratadas con tolueno la relación con un producto
precursor sugiere que la D-alanina se transfiere del ácido Iipoteicoico al ácido
teicoico. En contraste con S. aureus en crecimiento, el aceptor del ácido
teicoico en células tratadas con tolueno el polímero no podría sintetizarse en la
membrana porque no se podría sintetizar el ácido teicoico. La transferencia por
tanto debe ocurrir al completar al ácido teicoico unido a la pared. La re-
alanilación del ácido teicoico completo puede también jugar un papel en S.
aureus como se sugiere de la observación que después del calentamiento
subletal una pérdida del 55% del éster de D-alanina de las células sometidas
se repara durante la recuperación. (106).
3.6. Condiciones que afectan el contenido celular y la síntesis de ácido
Ilpoteicoico.
Para un amplio rango de bacterias se ha demostrado que las condiciones de
crecimiento afectan la cantidad de ácido Iipoteicoico. Algunos de estos
resultados requieren una mayor confirmación porque, se ha observado que la
extracción del ácido Iipoteicoico de bacterias no desintegradas puede ser
incompleta, una variabilidad en la extractabilidad del ácido Iipoteicoico de la
bacteria sometida a diferentes condiciones de crecimiento puede a priori no ser
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Neevia docConverter 5.1
evitado (145, 150 y182). Se han reportado también resultados en relación a la
concentración de ácido lipoteicoico en función de la masa celular. Esto no
necesariamente refleja cambios en el contenido celular de ácido lipoteicoico
porque los cambios en la talla celular pueden ocurrir análogamente como por
ejemplo el observado si la tasa de crecimiento varia (184, 185).
(b) IpH65 1
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TIEMPODEINCU8ACION (h )
Fig. 22. Perdida de residuos éster D-alanina de ácido Iipoteicoico (a) y re-esterificaci6n de las
posiciones libres con D-alanina nueva (b,c) en células tratadas con tolueno de Staphy/ococcus
aureus . En (a) el ácido Iipoteicoico fue premarcado con D-C4C)alanina y cazada en los valores
de pH indicados en la presencia de D-alanina no-marcada, ATP e iones de Mg2+. En (b) y (c)
las células no marcadas fueron encubadas bajo condiciones idénticas en la presencia de 0 -
C4C)alanina a los valores de pH indicados.
47Neevia docConverter 5.1
3.7. Estado de Crecimiento y Tasa de Crecimiento.
Durante el crecimiento logarítmico de E. teeceus (128) y de B. meqetenum
(186) en un medio que contiene [3H] glicerol, la radiactividad incorporada en el
ácido Iipoteicoico es aproximadamente paralela a la curva de crecimiento y
permanece en E. faecalis una fracción constante del total del glicerol
incorporado. Un contenido constante de ácido Iipoteicoico se encontró en base
al peso durante todos los estadías de crecimiento para E. faecalis y S. aureus
(150). En ciertas bacterias, la cantidad celular de ácido Iipoteicoico disminuye
en la fase estacionaria debido a la pérdida del polímero en el medio de cultivo.
La variabilidad en la cantidad de ácido Iipoteicoico celular puede ser
demostrada mediante la modificación en la tasa de crecimiento. En E. faecalis,
un incremento en la replícación de 30 a 200 minutos resulta en 10 veces el
incremento en el contenido total de glicerol, y la distribución de residuos de
glicerol entre el ácido Iipoteicoico y Iípidos permanece esencialmente sin
cambio (187) . Cepas de S. mutans Ingbritt y BHT muestran relativamente una
cantidad de ácido Iipoteicoico constante por generación entre la primera y diez
horas de crecimiento en un medio que contiene glucosa ya pH 6. (188, 189).
Un incremento de cuatro veces en tiempos de generación más cortos fue
observado para S. mutans Ingbritt cuando la glucosa en el medio de
crecimiento es remplazada por sacarosa (188). Células de Lb. case; y Lb.
fermentum