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4/10/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO

INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN
SALVADOR ZUBIRÁN

ASOCIACIÓN ENTRE LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS METAFASES CON
LA ACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTICROMATINA EN PACIENTES
CON ENFERMEDADES AUTOINMUNES

TESINA QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE LA

ESPECIALIZACIÓN EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

P R E S E N T A :

Q.F.B. VIRGINIA MARTÍNEZ BEZIES

ASESOR: Dr. JAVIER CABIEDES CONTRERAS
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA Y REUMATOLOGÍA

MÉXICO, D.F. Agosto 2007.

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

DEDICATORIA

A mi Universidad,

A mis Profesores,

A mis Hermanas,

A mi Esposo,

A mis Amigos,

A mis Compañeros de la Especialidad,

Y, especialmente, a las personas que han contribuido a mi formación tanto
profesional como personal.

- I -

AGRADECIMIENTOS

AL DR. JAVIER CABIEDES CONTRERAS:
Por su asesoramiento, por compartir sus
conocimientos y su basta experiencia para
la realización de este trabajo y por su gran
paciencia.

A LOS QUÍMICOS DEL LAB. DE INMUNOLOGÍA
Y REUMATOLOGÍA DEL INCMNSZ:
Ma. Teresa, Araceli, Carlos, Diego y José Luis,
Por sus enseñanzas, infinita paciencia y apoyo
para el buen desarrollo de este trabajo.

A MIS PROFESORES:
Porque gracias a su guía he podido lograr una mejor
integración de la enseñanza teórica con lo plasmado
en el campo laboral.

A MIS COMPAÑEROS DE LA ESPECIALIDAD:
Por compartir gratos momentos conmigo,
especialmente a Idaly y Marisol por su ánimo
y amistad.

A MIS HERMANAS
Irma, Alicia A. y Gabriela porque han sido
el motivo de mis deseos de superación.

A MI ESPOSO:
Por su respaldo durante el desarrollo
de esta Especialidad y por creer en mí.

FINALMENTE:
A todas las personas que deuna
u otra forma apoyaron la
realización de este trabajo.

- II -
INDICE

1
DEDICATORIA I

AGRADECIMIENTOS II

ÍNDICE 1

ABREVIATURAS 3

1. RESUMEN 4

2. INTRODUCCIÓN
2.1 Anticuerpos Anti-nucleares Asociados con Enfermedades
Autoinmunes Específicas

2.2 Interferencias

2.3 Patrones de Inmunofluorescencia Indirecta observados en Células
HEp-2

2.3.1 Descripción de los Patrones de IFI más Comunes

2.3.2 Clasificación del tipo de Metafase

2.3.3 Uso de algoritmos y su Interpretación en Reumatología
7

3. JUSTIFICACIÓN 17

4. HIPÓTESIS 19

5. OBJETIVOS 21

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Pacientes y Criterios de Inclusión

6.2 Estrategias de Estudio

6.3 Muestras

6.4 Reactivos y Materiales
6.4.1 Inmunofluorescencia Indirecta
23

24
24
INDICE

6.4.2 Determinación de Anticuerpos Anti-cromatina por ELISA

6.5 Fundamento
6.5.1 Inmunofluorescencia Indirecta

6.5.2 Determinación de Anticuerpos Anti-cromatina por ELISA

25
25

7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

8. RESULTADOS 30

9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39

10. CONCLUSIONES

48
11. BIBLIOGRAFÍA 51

ABREVIATURAS
- 3 -

AAN Anticuerpos anti-nucleares.
AAC Anticuerpos anti-cromatina.
AR Artritis reumatoide.
DNAcd Ácido desoxirribonucleico de doble cadena.
DNAcs Ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla.
EAI Enfermedades autoinmunes.
EMTC Enfermedad mixta del tejido conectivo.
ES Esclerosis Generalizada.
FITC Isotiocianato de fluoresceína.
IFI Inmunofluorescencia indirecta.
LEG Lupus eritematoso generalizado.
MC Metafase compacta.
MD Metafase delineada.
MDif Metafase difusa.
MF Patrón de inmunofluorescencia moteado fino.
MG Patrón de inmunofluorescencia moteado grueso.
SSj Síndrome de Sjögren.
T1 Título 1:40-1:160.
T2 Título 1:320-1:640.
T3 Título 1:1280-1:5120.

1. RESUMEN

- 5 -

Por la información que proporciona la detección de anticuerpos antinucleares
(AAN) mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) se ha sugerido como la primera prueba
que apoya el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. La presencia de un patrón
nuclear o citoplásmico determina la prueba subsecuente, que representa la búsqueda de
autoanticuerpos dirigidos contra uno o más antígenos específicos. Generalmente se
buscan los AAN mediante ELISA para identificar el epítope o epítopes específicos cuando
los AAN de escrutinio son positivos.

Acorde a lo anterior, un patrón de tinción en células HEp-2 es una guía importante
del o los antígenos que reconocen los AAN. Específicamente, los anticuerpos anti-
cromatina (DNAcd, DNAcs, Histonas, Nucleosomas) pueden dar diferentes patrones de
tinción en las células HEp-2 en división, dependiendo del antígeno reconocido.

Objetivo. Caracterizar los patrones de IFI con metafases positivas usando células HEp-2
como sustrato e identificar si correlacionan con anticuerpos anti-cromatina (AAC) para,
posteriormente, desarrollar algoritmos que permitan asociar por medio de las
características de las metafases el o los anticuerpos específicos dirigidos contra los
componentes de la cromatina y que ayuden al diagnóstico de los pacientes con
enfermedades autoinmunes.

Materiales y Métodos. Se recabaron 129 muestras de pacientes que acudieron al Servicio
de Inmunología y Reumatología del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán en el periodo comprendido entre el 18 de agosto y el 05 de octubre de
2006 que en la IFI resultaron positivos con tinción positiva en la metafase. La detección de
anticuerpos AAN se realizó sobre laminillas con células HEp-2 fijadas con alcohol y, a
continuación, se les determinó la reactividad contra componentes de la cromatina (anti-
DNAcd, anti-DNAcs, anti-Histonas y anti-Nucleosomas) por ELISA para confirmar e
identificar su especificidad.

Resultados. De 129 sueros de pacientes estudiados 103 (79.8%) correspondieron al sexo
femenino y 26 (20.2%) al masculino. La edad promedio fue de 38.6 + 17 años. Los
diagnósticos de estos pacientes fueron clasificados en 4 grupos para su análisis y se vió
que el 74.4% fueron pacientes con diversas enfermedades de tipo autoinmune.

Al realizar la clasificación de los patrones de IFI se encontraron 70 casos (54.3%)
clasificados como patrón Homogéneo (H), 42 (32.5 %) Moteado Fino (MF), 16 (12.4 %)
Moteado Grueso (MG) y 1 (0.8%) Nucleolar.

Del análisis de las metafases observadas se encontraron 46 (35.6%) casos con MC,
54 (41.9%) con MD y 29 (22.5%) con MDif, donde se observó que los casos con MC
correspondieron al patrón homogéneo (46/100%); la MD se encontró principalmente en
moteado fino (33/61.1%), seguido del homogéneo(10/18.5%) y moteado grueso
1. RESUMEN

- 6 -

(11/20.4%). La MDif se presentó en los patrones homogéneo (14/48.3%), moteado fino
(9/31%), grueso (5/17.2%) y nucleolar (1/3.4%).

El estudio de la distribución de los AAC mostró que el 63.6% (82) fueron positivos y
que el mayor porcentaje de éstos correspondió a DNAcd (28.7%/37), seguido de DNAcd +
Nucleosomas (10.1%/13). Se observó que los AAC registraron mayor positividad en las
muestras clasificadas con MC (en patrón homogéneo) y MD (en el moteado fino) con
31/67.4% y 23/42.6%, respectivamente.

Del análisis estadístico de correlación entre las características de las metafases y
AAC positivos, se encontró que para la MD hay asociación significativa (r=0.401, p= 0.03)
con nivel de significancia de 0.05; en la MC se vió que también existe asociación
significativa (r=0.352, p=0.017) con nivel de significancia de 0.01. En la MDif no se
observó correlación de AAC positivos ni con el título en el que esta metafase se presentó.
Análisis de Resultados. Se encontró mayor proporción de mujeres que de hombres
relación 4:1, lo cual coincide con lo descrito en la literatura [23, 24, 25].

Se esperaba tener alta concordancia con AAC positivos, sin embargo, solo el 63.6%
de los sueros tuvieron AAC positivos, esto pudo ser debido, por un lado, a la especificidad
en de los AAN por IFI, donde la literatura indica que es 91-93% [15,16]; por otra parte, en
las laminillas con el sustrato (células HEp-2) se encuentran los epítopes íntegros.

El título en el que los AAC fueron positivos fue en 1:40-1:80(T1) y mayores a
1:1280 (T3) donde hay mayor asociación con las características de las metafases, ya que la
tinción periférica se observa con mayor claridad y en el centro de la metafase se observa
la fluorescencia con menor intensidad.

En base a los resultados obtenidos, se realizó la propuesta de algoritmos en los
cuales se toman en consideración las características morfológicas de los AAN por IFI y la
probabilidad de tener AAC positivos en la misma muestra analizada.

Conclusiones. Dado a que la determinación de AAN por IFI la prueba de tamizado inicial,
es importante definir de manera específica las características de los patrones observados.

El uso de algoritmos basado en los patrones de IFI puede beneficiar al médico en la
elección de estudios subsecuentes en dirección de confirmar o descartar la sospecha de
un proceso de tipo autoinmune, aunque es necesario plantear la posibilidad de realizar
estudios posteriores en los que se clasifique a los pacientes en base a un padecimiento
específico para observar si existe asociación más clara entre las características
morfológicas de los AAN por IFI con la actividad de los AAC y, de ser así, incluir en los
algoritmos la asociación existente con las manifestaciones clínicas.

2. INTRODUCCIÓN
- 8 -

En sus orígenes, los anticuerpos se han definido como una aberración
esencialmente fisiológica en el proceso de inmunidad, caracterizada por la reacción de
inmunoglobulinas contra moléculas propias. Por lo tanto, los anticuerpos antinucleares
(AAN) son inmunoglobulinas que reconocen y reaccionan contra componentes del
núcleo de las células incluyendo DNAcd, RNA y diversas proteínas nucleares y
citoplásmicas.

La detección de los AAN patogénicos, tanto naturales como infecciosos no
asociados a manifestaciones clínicas de enfermedades autoinmunes, se basa en
métodos de tamiz que permiten la unión de los autoanticuerpos a estructuras de la
célula, en sustratos que proporcionan los antígenos específicos (vg, tejidos, líneas
celulares, antígenos purificados, etc.) seguido del uso sustancias que hagan evidente la
reacción antígeno-anticuerpo (fluorógenos como el isotiocianato de fluoresceína [FITC]
o isotiocianato de tetrametilo-rodamina).

Los resultados pueden ser utilizados como ayuda para el diagnóstico,
pronóstico, seguimiento y tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunes.
Se ha observado que existe correlación entre los AAN positivos
(específicamente en el patrón homogéneo) con la actividad de lupus eritematoso
generalizado (LEG) y AAN negativos con inactividad o remisión de la enfermedad [3,5].

En algunos pacientes afectados por ciertas enfermedades reumáticas (síndrome
de Sjögren y dermatopolimiositis), los AAN detectados por IFI pueden ser negativos,
sin embargo, en pacientes con manifestaciones clínicas de enfermedades
autoinmunes, los AAN específicos pueden ser solicitados sin antes haber hecho la
prueba de escrutinio y éstos pueden ser negativos [3]. Lo anterior se considera una
práctica inadecuada por las siguientes razones: 1) el costo de los AAN específicos
detectados por ELISA es mucho más alto comparado con la determinación de AAN
detectados mediante IFI, lo que conduce a un gasto excesivo para el paciente; 2) el
uso de algoritmos puede orientar al médico en el diagnóstico y tratamiento así como
para evaluar el curso de la enfermedad, lo cual redunda en beneficio del paciente.

Los anticuerpos anti-DNA (aDNA) fueron descritos en 1957 y han sido
considerados desde entonces como "marcadores" de enfermedad, específicos de
pacientes con LEG, aunque también pueden presentarse en otras enfermedades
autoinmunes [1]. Constituyen un subgrupo de autoanticuerpos antinucleares que
reconocen antígenos de la cromatina (figura 2.1) tales como DNA de una cadena
(DNAcs), DNA de doble cadena (DNAcd), Histonas y Nucleosomas ya sea en conjunto o
de manera independiente; los isotipos más frecuentes son IgM o IgG.

2. INTRODUCCIÓN
- 9 -

Figura 2.1 Estructura de la cromatina [27].

Algunos AAN, como los anticuerpos anti-DNAcd en pacientes con LEG,
contribuyen a la fisiopatología de la enfermedad por su capacidad de formar complejos
inmunes o por tener reacción cruzada con otros antígenos, uniéndose a ellos en las
células, produciendo su modificación y activación de los procesos inflamatorios.

Algunos AAN no poseen propiedades patogénicas por sí mismos pero
participan en los procesos inflamatorios con lo que producen daño de manera
indirecta. Su principal papel, para el clínico, es como marcadores en ciertas etapas de
las enfermedades autoinmunes.

2.1 Anticuerpos Anti-nucleares Asociados con Enfermedades Específicas
Diferentes autores han propuesto que los anticuerpos antinucleares son
marcadores específicos de enfermedades autoinmunes, sin embargo, el paradigma
actual es que no hay anticuerpos antinucleares específicos de enfermedad ni de
manifestación clínica, lo que existe son grupos de autoanticuerpos que caracterizan
enfermedades autoinmunes. Las evidencias muestran que probablemente existen
autoanticuerpos relacionados con manifestaciones clínicas [6, 7, 8], por lo que los
algoritmos de asociación no se basan en causa efecto, sino son más complejos. Con
estudios sistemáticos y los conocimientos generados se espera poder entender la
relación autoanticuerpo-antígeno con daño-manifestación clínica.

Algunos autoanticuerpos pueden estar presentes predominantemente en una
enfermedad autoinmune determinada, por ejemplo: los anticuerpos anti-DNAcd se
consideran marcadores de actividad en pacientes con LEG, pero depende del ensayo
utilizado y del punto de corte establecido a partir de controles [5], por lo tanto, hasta
el momento se considera que los anticuerpos detectados son también técnica-
dependiente. Los anticuerpos anti-Sm y anti-P ribosomal son considerados
marcadores específicos de LEG, pero no de actividad de la enfermedad. Actualmente
se debate si los anticuerpos contra nucleosoma son marcadores de LEG. En los últimos
consensos de autoanticuerpos se llegó a la conclusión de que los únicos anticuerpos
Relacionados con los anticuerpos anti-nucleosomas son los dirigidos contra
topoisomerasas [6].2. INTRODUCCIÓN
- 10 -

En los laboratorios en donde se detectan AAN, la técnica más empleada como
tamizado inicial es la inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el sustrato más empleado es
la línea celular de epitelio humano provenientes de tumor (células HEp-2), y un
conjugado anti-IgG específico para revelar la presencia del complejo antígeno-
anticuerpo.

El patrón de tinción detectado por IFI de una muestra positiva puede ser
utilizado para inferir la especificidad del antígeno usando el conocimiento existente
acerca de qué autoantígenos son reconocidos o se encuentran en una estructura de la
célula en particular. Así una técnica como la IFI en la que se usan células HEp-2 como
sustrato (la cual tienen una especificidad entre 91-93 % y una sensibilidad que
depende del microscopio empleado [15,16]) es utilizada para inferir posibles antígenos
específicos, los cuales posteriormente pueden ser confirmados por ensayos más
sensibles y específicos (vg. ensayos inmunoenzimáticos, radioinmunoensayos,
electroinmunotranferencia, etc. [10, 11, 12]).

La determinación de AAN por IFI permite la identificación de una serie de
patrones de tinción en los que, de acuerdo a las características que presentan, se
pueden inferir autoantígenos específicos del núcleo, del citoplasma y de las
membranas nucleares y citoplásmicas.

De acuerdo a lo anterior, estos patrones de tinción pueden tener las siguientes
características:

♦ Patrón Nuclear: Tinción de los componentes del núcleo.
♦ Patrón Citoplasmático: La tinción se localiza en el citoplasma.

Los patrones de fluorescencia se reportan tomando en cuenta las características
de tinción observadas y la máxima dilución hasta la cual fueron positivos. La tabla 2.1
muestra los puntos de corte establecidos en población mexicana por el Laboratorio de
Inmunología y Reumatología del INCMN SZ [13].

Tabla 2.1 Reporte de los AAN detectados mediante IFI

Patrón Valores normales Positivo Dilución
Nuclear:
Moteado fino < 1:160 > 1:160
Moteado grueso < 1:160 > 1:160
Nucleolar
Homogéneo
< 1:160
< 1:80
> 1:160
> 1:80
Cualquier otro < 1:20 > 1:20
Citoplásmico:
Mitocondrial < 1:80 > 1:80
Otro < 1:20 > 1:20
2. INTRODUCCIÓN
- 11 -

Los AAN se reportan a partir de la dilución 1:40 (tamizado inicial) hasta la
dilución 1:5120. Si hay positividad mayor a la dilución 1:5120, pueden ser
cuantificados con diluciones más altas y se reportan considerando el factor de dilución
usado.

2.2 Interferencias

Los factores que pueden ser causa de interferencia en la lectura afectan
principalmente a la sensibilidad y estos son: el lote de anticuerpos anti-IgG humana
conjugados con FITC; la fuente de luz, filtros y ópticas de diferentes microscopios de
epifluorescencia así como la experiencia del analista.

2.3 Patrones de Inmunofluorescencia Indirecta observados en Células HEp-2
Los patrones de tinción que se observan por la presencia de AAN reportados en
la literatura, detectados mediante inmunofluorescencia indirecta usando como sustrato
células HEp-2, se dividen en:
a) Nucleares:
♦ Homogéneo
♦ Periférico
♦ Centromérico
♦ Moteado grueso
♦ Granular
♦ Nucleolar
♦ PCNA
♦ Na
♦ Lámina nuclear
♦ Anti-complejo de los poros nucleares
♦ Anti-antígenos del ciclo celular
♦ Anti-aparato mitótico

b) CCitoplásmicos:

♦ Mitocondrial
♦ Ribosoma
♦ Jo-1
♦ Lisosomal
♦ Golgi
♦ Actina
♦ Citoqueratina
♦ Vimentina
2. INTRODUCCIÓN
- 12 -

2.3.1 Descripción de los Patrones de IFI más Comunes
♦ Homogéneo

Patrón en el que se observa una tinción homogénea del núcleo, que puede ser
muy intensa o tenue dependiendo de la concentración en la que se encuentren los
autoanticuerpos.

Características:
Núcleo completamente teñido
La tinción de los nucleolos puede ser positiva o negativa
Metafase positiva
Antígenos reconocidos:

Histonas (H1, H2A, H2B, H3 y H4)
DNA nativo
Dímeros de [H2A-H2B]-DNA
Nucleosomas

Enfermedades asociadas: LEG, lupus inducido por
drogas, AR y esclerosis generalizada progresiva.

♦ Moteado Fino

Patrón en el que se observa el núcleo teñido con gránulos finos o gruesos, la
tinción depende del título de los autoanticuerpos. Este patrón difiere del moteado
grueso porque la tinción en los nucleolos es negativa.

Características:
Núcleo teñido con gránulos finos o gruesos.
Nucleolos negativos.
Metafase negativa.
Antígenos reconocidos:
U1RNP (68, 34 y 23 kD)
Sm (proteínas U1, U2, U4/U6 y U5)
♦
(16kD), E (12 kD), F (11 kD) y G
(10kD)
U2RNP, U1U2RNP
hnRNP
SS-A/Ro
Enfermedades asociadas: EMTC, LEG,
síndrome de sobreposición, ES, SSj y AR.

Figura 2.2 Patrón Homogéneo [27].
Figura 2.3 Patrón Moteado Fino [27]
2. INTRODUCCIÓN
- 13 -

♦ Moteado Grueso
Patrón en el que se observa el núcleo teñido con gránulos finos o gruesos, la
tinción depende del título de los autoanticuerpos. Este patrón difiere del moteado fino
porque la tinción en los nucleolos es positiva.

Características:
Núcleo teñido con gránulos finos o gruesos.
Nucleolos positivos.
Metafase negativa.

La tabla 2.2 muestra los diferentes patrones de tinción, su localización a nivel
celular, los probables antígenos reconocidos y las enfermedades asociadas a la
presencia de los autoanticuerpos:

Tabla 2.2 Localización celular de los AAN, antígenos reconocidos y enfermedades
relacionadas.

AAN LLocalización AAntígenos reconocidos EEnfermedades relacionadas

Anti-DNAcs

Cromatina
DNAcs LEG
Anti-DNAcd DNAcd LEG
Anti-poliADP-ribosa Poli ADP ribosa LEG
Anti-Scl-70 DNA Topoisomerasa I CREST
Anti-centrómero Centrómeros Lupus Inducido por Fármacos
Anti-histonas Histonas EG, LEG
Anti-U1 RNP

Núcleo
U1 RNP EMTC
Anti-Sm U1, U2, U4-U6, U5 RNP LEG
Anti-U2 RNP U2 RNP Síndromes de sobreposición
Anti-SSA/Ro hY1~hY5 RNP SSj

Anti-SSB/La
RNA polimerasa III: Factor de
terminación de transcripción
LEG
Anti-PCNA DNA polimerasa factor auxiliar LEG
Anti-Ku Proteíncinasa DNA dependiente Síndromes de sobreposición
Anti-U3RNP U3RNP (Fibrilarina) Esclerosis generalizada
Anti-7-2 (Th) RNP RNasa P, RNasa MRP Esclerosis generalizada
Anti-RNA polimerasa I Nucleolo RNA polimerasa I Esclerosis generalizada
Anti-PM-Scl Complejo de 11 proteínas (20-110
KD)
Síndromes de sobreposición
Anti-NOR-90 Esclerosis generalizada
Figura 2.4 Patrón Moteado Grueso [27]
2. INTRODUCCIÓN
- 14 -

La determinación en suero de los AAN que reconocen componentes nucleares y
citoplásmicos es importante en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes
inflamatorias crónicas. Además, los pacientes con otras enfermedades del tejido
conectivo tales como artritis reumatoide, esclerodermia y dermatomiositis también
pueden presentar AAN a títulos altos.

En la fase inicial del diagnóstico de las enfermedades autoinmunes, los
pacientes con síntomas clínicos de padecimientos autoinmunes tienen una alta
probabilidad de tener títulos altos de AAN, por lo que la primera prueba de detección
de éstos debe ser la IFI usando como sustrato células HEp-2. Siguiendo los algoritmos
de detección de los AAN, las características del patrón observado nuclear o
citoplásmico, se sabe qué pruebas deben realizarse posteriormente para identificar el
o los epítopes reconocidos por los autoanticuerpos presentes en el suero del paciente.

Los autoanticuerpos dirigidos contra componentes celulares son de gran ayuda
en el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades del tejido conectivo (ETC). Aún con
la tecnología de los hibridomas, que permiten inmovilizar células precursoras capaces
producir autoanticuerpos monoespecíficos tanto de sujetos sanos como de individuos
con enfermedades autoinmunes, no ha sido posible demostrar que los anticuerpos
son los causantes de la enfermedad, aunquede acuerdo a los postulados de
sferir anticuerpos
patogénicos o células T auto-reactivas se inducen las manifestaciones clínicas de
enfermedades autoinmunes en modelos experimentales [14].

indicar la naturaleza de la enfermedad así como su localización en ciertos órganos
involucrados, es decir sirven como guías para el diagnóstico y monitoreo de los
pacientes con enfermedades autoinmunes [3].

De acuerdo a lo anterior, un patrón de tinción observado en células HEp-2 es
una guía importante del o los antígenos que reconoce los AAN. Específicamente, los
anticuerpos anti-cromatina (AAC) pueden dar diferentes patrones de tinción en las
células HEp-2 en división, dependiendo del antígeno que reconocen (vg. nucleosomas,
DNA de cadena doble, DNA de cadena simple o histonas).

En el presente trabajo, de acuerdo a la experiencia en la determinación de los
AAN, a la observación de sus patrones de IFI y a que aún no se ha descrito en la
literatura, se clasificó la morfología de la tinción positiva de las células en división en
3 tipos los cuales se describen continuación.

2. INTRODUCCIÓN
- 15 -

2.3.2 Clasificación del tipo de Metafase

Metafase Compacta (MC). Patrón en el que
se observa tinción nuclear homogénea en
células en interfase y en células en
división, se tiñe el material genético de
forma compacta y bien delimitada.

Metafase Delineada (MD). Patrón en el que
se observa tinción nuclear homogénea en
células en interfase y en células en
división, se tiñe el borde del material
genético de manera más intensa que el
centro.

Metafase Difusa (MDif). Patrón en el que se
observa tinción nuclear homogénea en
células en interfase y en células en
división, se tiñen de forma no definida ni
intensa por lo que la tinción no se ve
compacta, es más bien difusa.

2.3.3 Uso de Algoritmos y su Interpretación en Reumatología

En Dinamarca, en el Departament of Autoimmunology at Statens Serum Institut
of Copenhagen, la experiencia en el uso de algoritmos o guías prácticas para la
solicitud de AAN ha dado buenos resultados no sólo por los beneficios económicos
obtenidos sino porque se ha observado la retroalimentación entre reumatólogos y
médicos con poca experiencia en el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes.

El principio general que rige la solicitud de determinación de AAN es el uso de
una guía práctica en la que se indican los pasos a seguir tras un resultado positivo, así
Figura 2.6 Patrón Homogéneo con
metafase delineada (MD).
Figura 2.7 Patrón Homogéneo con
metafase difusa (MDif).
Figura 2.5 Patrón Homogéneo con
metafase compacta (MC).
2. INTRODUCCIÓN
- 16 -

como la batería de estudios disponibles para realizar, posteriormente, el análisis de
AAN específicos y estudios adicionales si se requieren.

El uso de algoritmos ha ayudado a hacer solicitudes de estudios que den
soporte a diagnósticos probables y a la estimación del pronóstico en el curso del
padecimiento autoinmune [3,12].

En este trabajo se realizó una caracterización del tipo de tinción por IFI que
presentan las células en división (metafase) y se estudió la asociación con títulos altos
de anticuerpos anti-DNAcd, DNAcs, Histonas y/o nucleosomas, se desarrollaron
además, algoritmos que permiten inferir cuál es el antígeno o antígenos reconocidos
por los AAN.

3. JUSTIFICACIÓN
- 18 -

La determinación en suero de los AAN dirigidos contra componentes nucleares
y citoplásmicos de la célula es importante en el diagnóstico de enfermedades
autoinmunes inflamatorias crónicas. Los pacientes con otras enfermedades del tejido
conectivo como artritis reumatoide, esclerodermia y dermatomiositis también
presentan AAN positivos. En la fase inicial del diagnóstico de las Enfermedades
Autoinmunes, en los pacientes con síntomas clínicos, se incrementa la posibilidad de
que estén presentes, por lo que la primera prueba debe ser la detección de los AAN
mediante IFI.

La presencia de un patrón fluorescente nuclear o citoplásmico determina la
prueba posterior, lo que representa la búsqueda de autoanticuerpos dirigidos contra
uno o más autoantígenos específicos. Los autoanticuerpos dirigidos contra
componentes celulares pueden ser de gran ayuda en el diagnóstico y pronóstico de
enfermedades del tejido conectivo. Algunos de los anticuerpos contribuyen a la
patogénesis de las enfermedades en las que son encontrados. Los AAN pueden ser
considerados como huellas digitales al indicar la naturaleza de la enfermedad así como
su localización en ciertos órganos involucrados y ser guía para el diagnóstico y
monitoreo.

El presente estudio, en base a la experiencia en la determinación de los AAN y
su observación por IFI, propone encontrar la asociación entre las características de las
metafases positivas con la presencia de anticuerpos anti-cromatina (anti-DNAcd, anti-
DNAcs, anti-Histonas y anti-Nucleosomas).

4. HIPÓTESIS

- 20 -

H1. El análisis de los anticuerpos antinucleares detectados mediante
inmunofluorescencia indirecta y las características de las metafases se pueden
asociar a la presencia de anticuerpos anti-cromatina (DNAcd, DNAcs, Histonas y/o
nucleosomas).

H0. El análisis de los anticuerpos antinucleares detectados mediante
inmunofluorescencia indirecta y las características de las metafases no se asocian
con la presencia de anticuerpos anti-cromatina.

5. OBJETIVOS

- 22 -

OBJETIVO GENERAL:

Caracterizar los patrones de inmunofluorescencia indirecta con metafases
positivas usando células HEp-2 como sustrato e identificar si correlacionan con
anticuerpos anti-cromatina (nucleosomas, DNAcs, DNAcd e histonas).

OBJETIVOS PARTICULARES:

1. Desarrollar algoritmos que permitan asociar por medio de las características de
tinción de las metafases el o los anticuerpos específicos dirigidos contra los
componentes de la cromatina.

Desarrollar algoritmos que permitan inferir el o los antígenos de la cromatina
reconocidos por los AAN, asociados con las metafases, y que ayuden al diagnóstico de
los pacientes con enfermedades autoinmunes.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

- 24 -

6.1 Pacientes y Criterios de Inclusión

Pacientes que acudieron al Servicio de Inmunología y Reumatología del Instituto
Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán en el periodo comprendido
entre el 18 de agosto y el 05 de octubre de 2006, a los cuales se les solicitaron
determinación de anticuerpos antinucleares por el método de Inmunofluorescencia
Indirecta y que resultaron positivos con tinción nuclear positiva.

6.2 Estrategia de estudio

Detección de anticuerpos anti-nucleares por el método de inmunofluorescencia
indirecta con laminillas que tienen adheridas células HEp-2 fijadas con alcohol, en sueros
de pacientes a los que se les diagnosticó algún tipo de padecimiento autoinmune. Una vez
que se caracterizó el patrón de tinción nuclear, a las muestras a las que les detectamos
reactividad contra componentes de la cromatina de acuerdo a lo observado en la IFI, les
determinamos por ELISA los anticuerpos anti-DNAcd, anti-DNAcs, anti-Histonas y anti-
Nucleosomas para identificar su especificidad.

6.3 Muestras

Se obtuvo suero a partir de muestras de sangre total de los pacientes que
acudieron al Servicio de Inmunología y Reumatología para la detección de AAN por IFI en
el periodo antes mencionado.

6.4 Reactivos y Materiales

6.4.1 Inmunofluorescencia Indirecta

Equipo de la marca The Binding Site o Rhigene los cuales contienen: Instructivo
 Laminillas con células HEp-2 fijadas con alcohol
 Calibrador
 Suero control (+) y control (-)
 Anticuerpo prediluido, listo para usarse anti-IgG humano, purificado por
afinidad, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
 Azul de Evans
 Amortiguador de fosfatos
 Medio de montaje
 Cubreobjetos
Material no suministrado con el equipo:
 Microscopio de epifluorescencia

6. MATERIALES Y MÉTODOS

- 25 -

6.4.2 Determinación de Anticuerpos Anti-cromatina por ELISA

Equipos de las marcas Orgentec Diagnostika GmbH y The Binding Site que contienen:

 Instructivo
 Certificado de Control de Calidad.
 Marco para 12 columnas x 8 filas de pozos sensibilizados con nucleosomas,
DNAcd, DNAcs e histonas dentro de una bolsa metálica.
 1 frasco con 20 mL de diluyente solución 5X
 1 frasco con 20 mL de solución de lavado 50X.
 6 frascos de calibradores con 1.5 mL de suero humano diluido, cuyos títulos
son:
CA = 0 U/mL
CB = 12.5 U/mL
CC = 25.0 U/mL
CD = 50.0 U/mL
CE = 100.0 U/mL
CF = 200.0 U/mL

 1 frasco con 1.5 mL de control positivo anti-DNAcs, anti-DNAcd, anti-Histonas
y anti-Nucleosomas de isotipo IgG.
 1 frasco con 1.5 mL de control negativo.
 1 frasco con 15 mL de anti-IgG conjugada con peroxidasa.
 1 frasco con 15 mL de sustrato 3,3’,5,5’– tetrametilbenzidina (TMB).
 1 frasco con 15 mL de solución de ácido fosfórico para detener la reacción.

Material necesario no suministrado en el equipo:
 Agua destilada.
 Micropipetas de: 10, 100 y 1000 L.
 Equipo Automatizado DSX.

6.5 Fundamento

6.5.1 Inmunofluorescencia Indirecta

Las laminillas con células HEp-2 fijadas con alcohol (metanol o etanol) son el
sustrato que se utiliza para la detección de los AAN por el método de inmunofluorescencia
indirecta. Las muestras de pacientes, calibradores, controles positivo y negativo, se
incuban con el sustrato. Los anticuerpos que no reaccionaron contra los antígenos de los
componentes del núcleo y/o citoplasma son eliminados mediante lavados con solución
amortiguadora de fosfatos (PBS). Los anticuerpos unidos a los antígenos se identifican con
un segundo anticuerpo anti-IgG humana conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC). El conjugado no unido se elimina con un segundo ciclo de lavados con PBS. La
6. MATERIALES Y MÉTODOS

- 26 -

Dilución de los
sueros 1:40 Incubación de 20’ a TA
en cámara
húmeda
Dos lavados
de 5´ c/u con
PBS
Adición del
conjugado de
IgG
Incubación de 20’ a
TA en cámara
húmeda
Dos lavados
de 5´ con PBS
Lectura en microscopio de
epifluorescencia
unión de los anticuerpos de conejo, conjugados con FITC, a la región Fc de los anticuerpos
humanos que reconocieron antígenos en las células HEp-2 muestra patrones de tinción
que se observan en el microscopio de epifluorescencia. La figura 6.1 muestra los pasos
que se siguen para realizar la inmunofluorescencia indirecta:

Figura 6.1 Inmunofluorescencia indirecta

6.5.2 Determinación de Anticuerpos Anti-cromatina Detectados por ELISA

Las placas de microELISA están sensibilizadas con los antígenos específicos. Los
calibradores, los controles y las muestras de pacientes se agregan a los pozos de las
placas para que se lleve a cabo el reconocimiento y unión de los autoanticuerpos al
antígeno durante la primera incubación del ensayo a temperatura ambiente. Después de
lavar los pozos para eliminar las proteínas inespecíficas y los anticuerpos que no se
unieron, se agregan anticuerpos producidos en conejo anti-IgG humana (específico contra
cadena ) los cuales están conjugados con peroxidasa. El conjugado se une a los
autoanticuerpos humanos y el exceso del conjugado que no reaccionó se elimina por un
paso posterior de lavados. La unión del conjugado se visualiza con el substrato 3,3’,5,5’–
tetrametilbenzidina (TMB) el cual da una coloración azul debido al producto de la reacción
enzimática. La intensidad es proporcional a la concentración de autoanticuerpos presentes
en las muestras. Para detener la reacción se agrega ácido fosfórico, el cual produce una
coloración amarilla que se lee a 450 nm.

La tabla 6.1 muestra la distribución de los calibradores, controles y muestras en la
placa del ELISA. En las figuras 6.2 y 6.3 se observa el equipo utilizado para la realización
de los ELISAs y la placa en la que se realizó la determinación anticuerpos anti-histonas.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

- 27 -

Tabla 6.1 Distribución de las muestras de los pacientes en las placas de ELISA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CA Pac 1 Pac 9 Pac 17 Pac 25 Pac 33 Pac 41 Pac 49 Pac 57 Pac 65 Pac 73 Pac 81
B CB Pac 2 Pac 10 Pac 18 Pac 26 Pac 34 Pac 42 Pac 50 Pac 58 Pac 66 Pac 74 Pac 82
C CC Pac 3 Pac 11 Pac 19 Pac 27 Pac 35 Pac 43 Pac 51 Pac 59 Pac 67 Pac 75 Pac 83
D CD Pac 4 Pac 12 Pac 20 Pac 28 Pac 36 Pac 44 Pac 52 Pac 60 Pac 68 Pac 76 Pac 84
E CE Pac 5 Pac 13 Pac 21 Pac 29 Pac 37 Pac 45 Pac 53 Pac 61 Pac 69 Pac 77 Pac 85
F CF Pac 6 Pac 14 Pac 22 Pac 30 Pac 38 Pac 46 Pac 54 Pac 62 Pac 70 Pac 78 Pac 86
G C+ Pac 7 Pac 15 Pac 23 Pac 31 Pac 39 Pac 47 Pac 55 Pac 63 Pac 71 Pac 79 Pac 87
H C- Pac 8 Pac 16 Pac 24 Pac 32 Pac 40 Pac 48 Pac 56 Pac 64 Pac 72 Pac 80 Pac 88
Figura 6.2 Equipo DSX automatizado para
determinación de anticuerpos por ELISA.

Figura 6.3 Placa de ELISA con muestras para
la determinación anticuerpos anti-histonas

7. ANÁLISIS ESTADÍSCO

- 29 -

En el análisis de frecuencias para determinar la correlación entre las
características de las metafases, el título que presentaron por IFI los AAN y la
reactividad contra antígenos de la cromatina se usó la prueba de Pearson con el
programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) versión 12.0 en español.

Posteriormente, se efectuó un segundo análisis para verificar si había
correlación entre tipo de metafase con la actividad de los AAC, considerando también
la positividad de los nucleolos al momento de hacer la clasificación de las metafases.

La magnitud de la relación en la prueba de Pearson está dada por el valor del
coeficiente y su interpretación es la siguiente:

 De 0 a 0.299 No hay asociación lineal entre las variables
 De 0.3 a 0.499 Asociación baja
 De 0.5 a 0.799 Asociación moderada
 De 0.8 a 1.0 Asociación alta entre variables

8. RESULTADOS

- 31 -

De 129 sueros de pacientes estudiados 103 (79.8%) correspondieron al sexo
femenino y 26 (20.2%) al masculino. La edad promedio fue de 38.6 ± 17 años. Los datos
de edad mínima y máxima por género se presentan en la gráfica 8.1(a). Los diagnósticos
de los pacientes fueron clasificados para su análisis en 4 grupos. Como se puede ver el
74.4% fueron pacientes con diversas enfermedades autoinmunes. En la figura 8.1 (b) se
muestra la clasificación y porcentaje de los diagnósticos.

La distribución de los patrones de fluorescencia fue: 70 casos (54.3%)
presentaron un patrón Homogéneo; 42 Moteado Fino (32.5 %), 16 Moteado Grueso (12.4
%) y 1 Nucleolar (0.8%).

Las metafases fueron clasificadas en: compacta (MC), delineada (MD) y difusa
(MDif). Las frecuencias observadas fueron: MC 46 (35.6%), MD 54 (41.9%) y MDif 29
(22.5%). En la gráfica 8.2 se muestra la distribución de los patrones de IFI y las
características de las metafases observadas.

Fig. 8.1 (b) Frecuencia por diagnóstico
Diagnósticos
(b)
74,4%
EAI
AR

LEG

Otras Enf. Autoinmunes

Enf. Infecciosas

Otros
Fig. 8.1 (a) Distribución de edades por género de los
pacientes estudiados.(a)
P
o
rc
e
n
ta
je

Fig. 8.2 Frecuencia de patrones de IFI y características de las metafases. a) Patrones de inmunofluorescencia
indirecta (IFI). b) característica de las metafases. MG = Moteado Grueso; MF = Moteado Fino; MC = Metafase
Compacta; MD = Metafase Delineada; MDif = Metafase Difusa.
a)
b)
129
Características de las
Metafases
8. RESULTADOS

- 32 -

Todas las metafases compactas (MC) se observaron en muestras que dieron patrón
homogéneo por IFI. Las metafases delineadas (MD) se observaron principalmente (61.1 %)
en muestras que dieron un patrón moteado fino (33/54); 18.5 % en muestras que dieron
patrón homogéneo (10/54) y 20.4 % en muestras que dieron patrón moteado grueso
(11/54). Las metafases difusas (MDif) se observaron en el 48.3 % de las muestras que
dieron patrón homogéneo (14/29); en el 31 % con patrón moteado fino (9/29); en el 17.2
% de las muestras que dieron patrón moteado grueso (5/29) y en el 3.4 % de las muestras
que dieron patrón nucleolar (1/29). En la figura 8.3 se presenta la distribución del tipo de
metafase por patrón observado.

La prevalencia de anticuerpos anti-cromatina positivos en las muestras estudiadas
fue de 63.6% (82/129). El mayor porcentaje de los anti-cromatina reconocieron sólo
DNAcd 45.1% (37/82), seguido de los que reconocieron DNAcd y nucleosomas 15.8%
(13/82). La distribución se muestra en la figura 8.4.

Posteriormente, analizamos la relación de los anticuerpos anti-cromatina con las
características de la metafase por patrón de IFI observado. Como esperábamos, el mayor
porcentaje de muestras 67.4% (31/46) con actividad anti-cromatina se concentraron en el
Fig. 8.3 Distribución y frecuencia de las metafases en los diferentes patrones observados por IFI.

Fig. 8.4 Prevalencia de anticuerpos anti-cromatina
P
o
rc
e
n
ta
je

Anticuerpos anti-cromatina

8. RESULTADOS

- 33 -

patrón homogéneo con metafase compacta (MC), seguido de aquellas que dieron patrón
moteado fino con metafase delineada (MD) 42.6 % (23/54) y el 17.2% (5/29) con
metafase difusa (MDif). La distribución observada por tipo de metafase y patrón observado
se muestra en la figura 8.5.

El análisis del título de los autoanticuerpos detectados por IFI, la morfología de las
metafases y la reactividad contra componentes de la cromatina mostró que la mayor
frecuencia de anticuerpos anti-cromatina positivos (35.2 %; 19/54) se presentó a títulos
entre 1:1280 y 1:1520 (T3) en las muestras con metafases delineadas (MD), en el 36.9 %
de las muestras con títulos de AAN detectados por IFI entre 1:160 y 1:640 (T2) con
metafases compactas (MC) y en el 34.5 % de las muestras con títulos de anticuerpos anti-
cromatina detectados mediante IFI entre 1:160 y 1:640 con metafases difusas (MDif).

Los porcentajes de anticuerpos anti-cromatina negativos analizado por título y
morfología de las metafases mostró que a títulos entre 1:160 y 1:640 las muestras que
dieron metafase compactas (MC) fueron de 26.1 %, de 22.2 % para las muestras que dieron
metafase delineada (MD) y de 41.4% para las muestras que dieron metafase difusa (MDif).
La figura 8.6 muestra la distribución de los porcentajes.

Fig. 8.5 Distribución de los anti-cromatina por tipo de metafases de acuerdo al patrón observado.

Tipo de Patrón y Metafase

Metafase y Anticuerpos Anti-Cromatina

Fig. 8.6 Análisis de los Anticuerpos anti-cromatina en función de las
características de la metafase por título de Anticuerpos antinucleares.

8. RESULTADOS

- 34 -

En la figura 8.6 se puede ver que a títulos entre 1:40 y 1:80 (T1), en el caso de las
muestras que dieron metafases compactas (MC) no se detectaron anticuerpos anti-
cromatina positivos, en tanto que, a esos mismos títulos en muestras que dieron
metafases delineadas (MD) y difusas (MDif) sí se detectaron anticuerpos anti-cromatina
11.1 % y 3.4 % respectivamente, aunque en menor proporción que a títulos entre 1:160 y
1:640 (T2) y 1:1280 y 1:5120 (T3).

El análisis de las muestras con títulos de AAN entre 1:160 y 1:640 mostró que en
aquellas que dan un patrón homogéneo mediante IFI con metafases compactas (MC) o
metafases difusas (MDif) la proporción anticuerpos anti-cromatina positivos y negativos
es similar: MC=31.5% y 36.8% respectivamente, y MDif = 15.8% tanto para AAC positivos
como negativos, en tanto que, las muestras que dieron patrón homogéneo con metafase
delineada acompañado de un patrón citoplásmico tuvieron anticuerpos anti-cromatina
positivos (2/10). La frecuencia de anticuerpos anti-cromatina positivos y negativos en
muestras que dieron un patrón homogéneo, sólo o acompañado de patrones
citoplasmáticos se muestra en la gráfica 8.7.

En el caso de las muestras que dieron patrón moteado fino, si éste se encuentra
solo o con el patrón de filamentos intermedios, los anticuerpos anti-cromatina fueron en
su mayoría negativos (66.7% y 100% de los casos respectivamente); cuando el patrón
nuclear se acompañó de un patrón citoplásmico o mitocondrial, los anticuerpos anti-
cromatina fueron en su mayoría positivos, 75 % para ambas combinaciones de patrones.

Por último, las muestras que dieron patrón moteado grueso, cuando está sólo o
con filamentos intermedios, los anticuerpos anti-cromatina son negativos pero si está
presente el patrón citoplásmico los anticuerpos anti-cromatina fueron positivos en 40 %
de los casos (Fig. 8.8).
Fig. 8.7. Patrón Homogéneo (H) a títulos entre 1:160 y 1:640. Patrón: H= homogéneo;
C = citoplásmico; Mit = Mitocondrial, FI = Filamentos intermedios, Cent= Centromérico.

8. RESULTADOS

- 35 -

En la tabla 8.1 se muestra la distribución de frecuencias de los anticuerpos
anti-cromatina por título del patrón nuclear principal detectado mediante IFI, tomando en
cuenta el tipo de metafase observada.

Metafase Patrón de tinción Título

AAC (+)
%
Compacta Homogéneo T3
T2
T1
(14/16) 87.5
(17/29) 58.6
0/0
Delineada Homogéneo

T3
T2
T1
6/100
2/100
0/0
Moteado Fino

T3
T2
T1
10/92.3
7/43.7
4 /100
Moteado Grueso

T3
T2
T1
1/100
1/25
2 /33.4
Difusa Homogéneo

T3
T2
T1
3/100
5/45.5
0/0
Moteado Fino

T3
T2
T1
1/100
3/50
1/50
Moteado Grueso

T3
T2
T1
0/0
1/25
1/100
Nucleolar

T2 1/100

Tabla 8.1 Frecuencia de anticuerpos anti-cromatina positivos. T1 = diluciones 1: 40 a 1:80;
T2 = diluciones 1:160 a 1:640; T3 = diluciones 1:1280 a > 1:5120.
N
o
.
C
a
s
o
s

N
o
.
C
a
s
o
s

Fig. 8.8 (a) Muestras que dieron patrón moteado Fino. (b) Muestras que dieron patrón moteado grueso
(a) (b)
Tipo de Metafase y Anticuerpos Anti-cromatina
8. RESULTADOS

- 36 -

El análisis de los anticuerpos anti-cromatina, considerando la tinción nuclear, el
tipo de metafase y los títulos mostró lo siguiente:

Tinción Nuclear Homogénea (Patrón Homogéneo), con títulos entre 1:40 y 1:80 (T1) en
ninguno de los tres tipos de metafases se observó positividad contra componentes de la
cromatina. En el mismo patrón, pero a títulos entre 1:160 y 1:640 el porcentaje de
positividad fue de 45.5-58.6% para cualquier tipo metafase siendo la reactividad contra
DNAcd el principal componente de la cromatina reconocido (44.8%). A títulos entre 1:1280
y mayor a 1:5120, el porcentaje de muestras con actividad anti-cromatina es de 87.5-100
% observándose que 31.5 % de las muestras tuvieron reactividad contra DNAcd, DNAcs y
nucleosomas, 12.5 % de las muestras reconocieron los cuatro componentes de la
cromatina (nucleosomas, DNAcd, DNAcse histonas). La gráfica 8.9 muestra la
distribución de los anticuerpos anti-cromatina por título, tomando en cuenta las
características de las metafases.

Tinción Nuclear Granular sin Tinción de los Nucleolos (Patrón Moteado Fino; MF). Todas
las muestras con éste patrón a títulos entre 1:40 y 1:80 (T1) y metafase delineada (MD)
tuvieron anticuerpos anti-cromatina positivos (75 % anti-DNAcd y 25 %, anti-histonas).
Las muestras con títulos entre 1:160 y 1:640 (T2) 46.75% tuvieron anticuerpos anti-
cromatina positivos (25 % anti-DNAcd y 18.75% anti-DNAcd y anti-histonas) y a títulos
entre 1:1280 y mayores a 1:5120 (T3) el 92.3 % de las muestras tuvieron anticuerpos anti-
cromatina positivos (23.3 % anti-DNAcd y 23.3 % anti-DNAcd y anti-nucleosomas ambos
positivos, anti-nucleosomas 15.4 %, anti-DNAcd con anti-DNAcs y nucleosomas 15.4%).
La actividad contra DNAcs y nucleosomas, así como contra los 4 componentes de la
cromatina estuvo presente en el 7.7 % de las muestras.

Cuando se observó el patrón moteado fino con metafase difusa (MDif) a títulos
entre 1:40 y 1:80 (T1), la actividad anti-cromatina estuvo presente en el 50% de las
muestras y de éstas la mitad (50 %) fue contra DNAcd. A títulos entre 1:160 y 1:640 (T2),
50 % tuvieron actividad contra componentes de la cromatina (16.6% anti-DNAcd y 16.7
Fig. 8.9 MC = metafase compacta; MD = metafase delineada;
MDif = metafase difusa; T1 = Títulos entre1:40 y 1:80;
T2 = Títulos entre 1:160 y 1:640; T3 = Títulos entre 1:1280
y > 1:5120.
Anticuerpos Anti-cromatina en muestras con patrón
Homogéneo
P
o
rc
e
n
ta
je

Tipo de Metafase

8. RESULTADOS

- 37 -

contra DNAcd y nucleosomas o contra DNAcd, DNAcs y nucleosomas). A títulos entre
1:1280 y mayores a 1:5120, todas las muestras tuvieron actividad anti-DNAcd y anti-
nucleosomas, simultáneamente. En la gráfica 8.10 se muestra la distribución.

Tinción Nuclear Granular con Nucleolos Positivos (Patrón Moteado Grueso; MG). De las
muestras que dieron éste patrón con metafase delineada (MD) y a títulos entre 1:40 y 1:80
(T1), el 33.4 % tuvo actividad sólo contra DNAcd y 16.7 % tuvo actividad contra DNAcd y
DNAcs. Éste mismo patrón con metafase delineada (MD) pero a títulos entre 1:160 y 1:640
(T2) el 25 % de las muestras presentó actividad anti-DNAcd, a títulos entre 1:1280 y
mayores a 1:5120 (T3), todas las muestras tuvieron actividad anti-DNAcd.

De las muestras que dieron patrón moteado grueso con metafase difusa (MDif),
aquellas con títulos entre 1:40 y 1:80 (T1) y entre 1:160 y 1:640 (T2) todas tuvieron
actividad anti-DNAcd. En la figura 8.11 se muestra la distribución.

El análisis de correlaciones entre las características de las metafases y la actividad
anti-cromatina mostró que existe baja asociación pero significativa entre las metafases
delineadas (MD) y la actividad contra componentes de la cromatina (r=0.401, p= 0.03) con
nivel de significancia de 0.05. Las metafases compactas (MC) se asociaron también con la
presencia de anticuerpos anti-cromatina (r=0.352, p=0.017) con nivel de significancia de
Tipo de Metafase
Fig. 8.10 MD = metafase delineada; MDif = metafase
difusa; T1 = títulos 1:40 a 1:80; T2 = Títulos 1:160 a
1:640; T3 = Títulos 1:1280 a > 1:5120.
Anticuerpos Anti-cromatina que dan Patrón
Moteado Fino
P
o
rc
e
n
ta
je

Tipo de Metafase
Fig.8.11 MD = metafase delineada; MDif = metafase difusa;
T1 = títulos 1:40 a 1:80; T2 = Títulos 1:160 a 1:640; T3 =
Títulos 1:1280 a > 1:5120.

Anticuerpos Anti-cromatina en muestras que dan
Patrón Moteado Grueso
P
o
rc
e
n
ta
je

8. RESULTADOS

- 38 -

0.01. En el caso de las metafases difusas (MDif) no se observó correlación con actividad
anti-cromatina ni con título de anticuerpos detectados mediante inmunofluorescencia
indirecta.
Al analizar el tipo de metafase, la presencia de anticuerpos que reconocen
componentes del nucleolo, reactividad contra componentes de la cromatina y títulos
detectados mediante inmunofluorescencia indirecta se observó correlación baja entre
metafases compactas (MC), nucleolos positivos y títulos entre 1:40 y 1:5120 (r=0.354,
p=0.016) con nivel de significación 0.05.

Cuando el tipo de metafase fue delineada (MD) se observó una baja asociación
proporcional al título de los anticuerpos detectados mediante inmunofluorescencia
indirecta y a la reactividad contra componentes de la cromatina con nivel de significancia
de 0.001 (r=0.360, p=0.007) e inversamente proporcional al 0.05 (r=0.342, p=0.012) con
los nucleolos positivos, lo cual es de esperarse ya que las metafase delineadas fueron las
que se observaron con mayor frecuencia en el patrón moteado fino (33/54= 61.1%) y el
mayor porcentaje de anticuerpos anti-cromatina con metafase delineada (MD) se observó
en el patrón moteado fino (MF; 42.6%).

En las muestras que dieron metafase difusa (MDif) no se observó correlación con la
actividad anti-cromatina, con el título de los anticuerpos detectados mediante
inmunofluorescencia indirecta ni con la presencia o ausencia de anticuerpos contra
componentes de los nucleolos.

Finalmente, el análisis de los diagnósticos de los pacientes con la presencia de
anticuerpos anti-cromatina mostró que existe mayor porcentaje de pacientes con
anticuerpos anti-cromatina en los pacientes que fueron diagnosticados con algún tipo de
padecimiento autoinmune (vg lupus eritematoso generalizado, 88.9%) que en aquellos
casos con enfermedades de etiología infecciosa (VHC, VHB 41,7%, etc.), resultados que
confirman lo reportado en la literatura. La gráfica 8.12 muestra la distribución de
anticuerpos anti-cromatina por diagnóstico. .

Fig. 8.12 LEG = lupus eritematoso generalizado;
AR = artritis reumatoide; N = negativos;
P = positivos.
P
o
rc
e
n
ta
je

Frecuencia de Anticuerpos Anti-cromatina
por Diagnóstico

Padecimiento

9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

- 40 -

Los resultados muestran que las enfermedades autoinmunes afectan
principalmente a las mujeres en una proporción de 4:1. La edad promedio en mujeres
fue de 39.5 años y 37.5 en hombres. Éstos resultados confirman lo reportado en la
literatura para otros grupos étnicos [23, 24, 25], donde se afirma que las mujeres son
afectadas con mayor frecuencia a partir de la tercera década de la vida, lo cual sugiere
que los factores hormonales (estrógenos) juegan un papel importante en el desarrollo
de autoinmunidad. Es importante recalcar que los datos presentados en la literatura
son de pacientes caucásicos y solo existe un estudio referente a pacientes con artritis
reumatoide en población mexicana, donde los autores reportan que la incidencia,
respecto a la edad y el sexo, es muy semejante a lo observado en caucásicos [23]. Un
estudio realizado en Inglaterra [26] muestra que, en pacientes con LEG, la prevalencia
varía de acuerdo a la edad, sexo y las características étnicas de la población afectada.

Las muestras que estudiamos eran de pacientes en los que se sospechaba
padecimiento autoinmune y cumplieron los criterios de inclusión al estudio -
anticuerpos anti-nucleares positivos con metafases compactas (MC), delineadas (MD),
o difusas (MDif)- por ello y de acuerdo a la especificidad de los anticuerpos anti-
nucleares detectados mediante inmunofluorescencia indirecta, reportada en la
literatura [15, 16], esperábamos una alta frecuencia de anticuerpos anti-cromatina
positivos, sin embargo, ésta fue del 63.6%. Una explicación de la baja frecuencia de
anticuerpos anti-cromatina es que en las células HEp-2 se encuentran los antígenos
nativos y hay reconocimiento simultáneo de varios antígenos a la vez, en tanto queal
detectar la reactividad por ELISA se hace con antígenos purificados y por ello puede no
haber concordancia entre ambas determinaciones.

Los patrones de algunas muestras detectados mediante inmunofluorescencia
en células HEp-2 se pueden deber al reconocimiento simultáneo de diferentes
antígenos, los cuales no están incluidos en el espectro de antígenos estudiados por
nosotros ni por otros autores, debido a que clínicamente no se les ha encontrado
significado clínico [13].

En cuanto al título en que fueron positivos los anticuerpos anti-nucleares
detectados mediante inmunofluorescencia indirecta y que fueron positivos los
anticuerpos anti-cromatina, se observó que, a títulos entre 1:80 y 1:160 (T1) y 1:1280
y mayores a 1:5120 (T3), hay mayor asociación con las características de las
metafases, principalmente con la metafase delineada (MD), ya que a diluciones entre
1:80 y 1:160 (T1) la tinción en la periferia de la metafase se observa con mayor
claridad y el centro de ésta se ve menos teñida. Este efecto también se observa a
diluciones entre 1:1280 y mayores a 1:5120 (T3), aunque la periferia de la metafases
se tiñe con mayor intensidad, ésta es menor que la florescencia en el centro de la
metafase.

A diluciones entre 1:160 y 1:640 (T2), se observó que la proporción de sueros
con actividad anti-cromatina positivos y negativos es similar para los 3 tipos de
9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

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metafases, sin embargo, cuando el patrón nuclear se encuentra asociado a patrones
citoplásmicos, excepto con filamentos intermedios, el porcentaje de muestras con
actividad anti-cromatina aumenta principalmente si se trata del patrón citoplásmico
mitocondrial o del citoplásmico propiamente dicho.

El análisis de la presencia de actividad anti-cromatina de los sueros estudiados
con el diagnóstico de los pacientes confirmó lo reportado en la literatura. Los
pacientes que tuvieron títulos altos de anticuerpos contra componentes de la
cromatina (nucleosomas, DNAcd, DNAcs y/o histonas) tienen diagnóstico de
enfermedades autoinmunes, principalmente lupus eritematoso generalizado.

Con los resultados obtenidos proponemos los siguientes algoritmos para
ayudar: 1) al diagnóstico de las enfermedades autoinmunes; 2) para identificar el
antígeno o antígenos reconocidos por los anticuerpos detectados en los sueros de los
pacientes con enfermedades autoinmunes y 3) para iniciar estudios de correlación de
presencia de anticuerpos, antígenos reconocidos, títulos observados y manifestaciones
clínicas de las enfermedades autoinmunes.