Biologia-molecular-y-bioquimica-de-metaloproteasas-de-matriz-extracelular-y-sus-inhibidores-en-higado-de-rata-normal-y-cirrotico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS 
BIOLOGIA MOLECULAR Y BIOQUIMICA DE METALOPROTEASAS DE 
MATRIZ EXTRACELULAR y SUS INHIBIDORES EN HíGADO DE RATA 
NORMAL Y CIRRÓTICO 
T E S I S 
PARA OBTENER EL GRADO DE 
DOCTORA EN CIENCIAS 
PRESENTA 
M. en C. MARIA DEL CARMEN GARCíA DE LEÓN MÉNDEZ 
MÉXICO D.F. 2005 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta que la ciencia 
logra abrir 
Albert Einstein 
COMITÉ TUTORAL 
TUTORA 
DRA. IRMGARD MONTFORT HAPPEL 
COTUTORES 
DRA. ANNIE PARDO SEMO 
DR. MOISÉS SELMAN LAMA 
DEDICATORIA 
A la DRA. IRMGARD MONTFORT HAPPEL 
Quien me invitó a participar en su proyecto y depositó en mi sus 
conocimientos, confianza y apoyo, permitiéndome crecer 
académicamente a su lado. 
Para mí ha sido un privilegio trabajar con un ser humano de su 
estatura. 
A Georgina 
mi madre, a quien debo en buena parte lo que soy 
A Francisco, Luis, 
Georgina. Alberto y Patricia 
mis hermanos 
Quienes en las buenas y en las malas, han estado cerca con una 
palabra de aliento 
Doy mi más sincero agradecimiento 
A los Ores, Annie Pardo Semo y Moisés Selman Lama, quienes, 
contribuyeron con su tiempo y reflexiones al enriquecimiento de este 
trabajo. 
A los miembros del jurado, cuyas observaciones y comentarios 
ayudaron a mejorar la comprensión de esta tesis. 
A la Dra. Cecilia Jiménez García, por su constante ayuda, y sabios 
consejos, que me dieron impulso en todo momento. 
Al Dr. Rubén Darío Martínez, quien siempre tuvo una respuesta a mis 
preguntas y una enorme disposición para ayudarme. 
Al Dr. José Luis Lepe Zúñiga, por su valiosa colaboración en la 
estructuración y redacción del artículo que avala este trabajo. 
Agradezco al CONACyT y a la DGAPA , el apoyo financianciero 
que respaldó el desarrollo del presente trabajo. 
RESUMEN 
La cirrosis hepática es una de las principales causas de muerte en sujetos entre 
los 25 y 50 años de edad en México. Una vez establecida la enfermedad, es muy 
poco lo que la medicina actual puede ofrecer al paciente, además de un 
tratamiento sintomático. Una de las principales razones de la insuficiencia 
terapéutica es el desconocimiento de los mecanismos moleculares que producen 
el trastorno hepático y lo hacen irreversible. Entre una serie de cambios 
anatómicos sobresale la presencia de un exceso de tejido fibroso, que adopta 
distintas morfologías dependiendo de la etiología y la etapa de la enfermedad. A la 
fecha se acepta que las células estelares y los miofibroblastos hepáticos, son los 
principales responsables del proceso fibrótico mientras que las células del 
parénquima hepático, a pesar de ser las más numerosas, y las más afectadas, 
habitualmente son excluidas como participantes del mismo. Este trabajo retoma la 
hipótesis de que el hepatocito participa en los mecanismos de regulación de la 
matriz extracelular hepática, para ello se analizó si estas células son capaces de 
producir las metaloproteasas de matriz extracelular y sus correspondientes 
inhibidores tisulares específicos, necesarios para este proceso. Empleando un 
modelo de cirrosis hepática experimental inducida con tetracloruro de carbono en 
ratas, fue posible localizar por hibridación in situ los RNA-mensajeros específicos 
de 4 metaloproteasas de matriz extracelular (MMP-2, -3, -10 Y -13) Y 2 inhibidores 
tisulares específicos de metaloproteasas (TIMP-1 y -2), en cortes de tejido hepá-
tico y cultivos primarios de hepatocitos, y demostrar su actividad enzimática en los 
1 
medios de cultivo, así como confirmar la expresión de los productos de traducción 
de los RNAm por medio de una técnica inmunohistoquímica indirecta, utilizando, 
anticuerpos monoclonales específicos. En ambas pruebas (hibridación in situ e 
inmunohistoquímica), los hepatocitos en cultivo se identificaron con anticuerpo anti 
albúmina de rata. Además, utilizando la técnica de Transcripción reversa- Reac-
ción en cadena de la polimerasa, se generaron los cDNAs correspondientes a las 
4 metaloproteasas y sus 2 inhibidores a partir de RNA total, extraído de hepato-
citos recién aislados de ratas normales; éstos coincidieron en secuencia y tamaño 
con los ya reportados. En conclusión, el hepatocito expresa las principales molé-
culas requeridas para participar en la regulación de los componentes de la matriz 
extracelular hepática. 
2 
INTRODUCCiÓN 
La Matriz Extracelular 
La matriz extracelular (MEe) es un componente esencial del tejido conjuntivo de 
los organismos multicelulares que proporciona integridad estructural y sostén, 
además de actuar como un modulador dinámico del comportamiento celular 
(Buchner y cols., 1990, Iredale &, Arthur, 1994). Representa una combinación 
compleja de diversas familias de proteínas que definen distintas funciones 
fisiológicas del tejido, cuya composición y estructura varia considerablemente 
entre los diferentes órganos. Esta red molecular determina la organización 
específica del tejido conjuntivo, facilitando a las células un soporte y las señales 
que dirigen la polarización, la proliferación, la migración, la diferenciación y la 
supervivencia. La función primaria de la MEe, es dotar a los tejidos de sus 
características mecánicas y bioquímicas específicas. Las células residentes son 
responsables de su síntesis y mantenimiento, pero la matriz, a su vez tiene 
también un impacto en las funciones celulares. 
Las interacciones célula-matriz, mediadas por los receptores específicos de la 
célula y los sitios de enlace presentes en muchas moléculas de la matriz desem-
peñan no solamente un papel dominante en la adhesión y la migración celular, 
sino también regulan y promueven su diferenciación y expresión génica. 
La matriz pericelular proporciona un microambiente fisiológico especial para las 
células, protegiéndolas frente a influencias mecánicas perjudiciales e influyendo 
también en la transmisión de las señales inducidas en forma mecánica. Una 
4 
atribución adicional de la MEC en la morfogénesis y el metabolismo celular, es el 
almacenaje y la liberación de factores de crecimiento que se encuentran enlaza-
dos a componentes específicos que forman parte de ésta (Gelse y cols., 2003). 
En la mayoría de los órganos los principales componentes proteicos de la MEC 
son las colágenas y los proteoglicanos, además de diversas familias de glicopro-
teínas no colágenicas, como las lamininas. 
Las Colágenas 
Las colágenas son proteínas producidas y secretadas por una variedad de células 
estromales, predominantemente fibroblastos, los cuales proporcionan gran parte 
del esqueleto necesario para la organización de las células que constituyen el 
tejido (Stamienkovic, 2003). Son proteínas ubicuas responsables de la integridad 
estructural de vertebrados y muchos otros organismos. Se han identificado más de 
20 colágenas genéticamente distintas en los tejidos que tienen que resistir cortes, 
y fuerzas de compresión o extensión, tales como los tendones, los huesos, los 
cartílagos, y la piel. Estas proteínas pueden ser agrupadas en dos clases molecu-
lares principales: la primera clase corresponde a las colágenas tipo 1, 11, 111, V, Y XI, 
que consisten de unsolo dominio colagenoso, que tiene un arreglo fibrilar, con una 
periodicidad axial característica de 67nm, formado por una triple hélice de 300 nm 
de longitud y 1.5 nm de diámetro, el cual les proporciona la fuerza extensible 
(Stamenkovic & Bosman, 2003), y la segunda clase, corresponde a un grupo 
heterogéneo llamado en general colágenas no fibrilares, que contienen, además 
de dominios colagenosos, uno o varios dominios no fibrilares. 
5 
Esta segunda clase puede subdividirse, en: a) colágenas formadoras de mallas o 
redes, como las colágenas tipo VIII y X Y la colágena tipo IV que forma parte de la 
membrana basal; b) la colágena tipo VII, formadora de filamentos de anclaje; c) la 
colágena tipo VI, que forma filamentos en forma de gota; d) el grupo de las 
colágenas asociadas a fibrillas con triple hélice interrumpida (FACITs), que 
engloba a las colágenas tipo IX, XII, XIV, XVI, XIX, Y XX, Y e) las multiplexinas 
(con múltiples dominios colagenosos con múltiples interrupciones), representadas 
por las colágenas tipo XIII, XV Y XVIII, (Schuppan y cols, 2001). 
Las Lamininas 
Las lamininas son una familia de glicoproteinas no colagénicas de alto peso 
molecular (200 a 400 kDa), formadas por tres cadenas polipeptídicas (a¡f3IYI) 
organizadas en forma de una cruz asimétrica unidas a través de puentes disulfuro. 
Actúan como mediadoras de adhesión entre diferentes células. La laminina tiene 
una función reguladora para una gran variedad de fenómenos biológicos tales 
como, crecimiento, morfogénesis y migración celular. Ciertos tipos de células 
normales y neoplásicas contienen receptores de alta afinidad para esta molécula, 
es uno de los principales constituyentes de la membrana basal junto con la 
colágena tipo IV, el nidogen-entactina, y el perlecano. 
La membrana basal es una estructura laminar delgada situada inmediatamente 
por debajo de los epitelios, los cuales por medio de esta se unen al tejido 
conjuntivo subyacente. Las moléculas que forman la membrana basal se 
ensamblan espontáneamente entre sí mediante enlaces covalentes. La unión de la 
6 
colágena tipo IV y la laminina es equimolecular y está estabilizada por el nidogen-
entactina, la procolágena tipo VII y polímeros de proteoglicanos de heparán 
sulfato; dichas uniones se producen en zonas específicas de cada molécula, que 
sirven como receptores para los otros componentes de la membrana basal. Estas 
moléculas poseen además receptores para factores de crecimiento, hormonas, 
etc., lo que posibilita que la membrana responda a los estímulos provenientes de 
tejidos vecinos. 
Algunos componentes de la MEC pueden transmitir señales a las células vía 
receptores transmembranales, tales censores de la matriz son principalmente las 
integrinas, además de los proteoglicanos transmembranales ó algunas moléculas 
asociadas con los receptores de la matriz. 
Las Integrinas 
Las integrinas funcionan como receptores de la MEC proporcionan continuidad 
entre el exterior y el interior de la célula. Estas interacciones controlan actividades 
celulares tales como, adhesión, migración, diferenciación, proliferación, y apop-
tosis (Schuppan y cols, 2001). Estas moléculas tienen la estructura heterodi-
mérica básica aJ). Reconocen secuencias peptídicas pequeñas, la naturaleza de 
sus ligandos varia significativamente según la estructura de sus cadenas. Los 
miembros de la subfamilia J)2 reconocen contra-receptores pertenecientes a la 
superfamilia de las inmunoglobulinas, teniendo un papel importante en la 
circulación de los linfocitos durante la inflamación. Las integrinas de la subfamilia 
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J31 por su parte reconocen proteínas de MEC como fibronectina, colágena y lami-
nina. 
Los Proteoglicanos 
Los proteoglicanos se pueden agrupar en varias familias. Todos tienen un núcleo 
proteico el cual es rico en glicosaminglicanos. La primera familia está constituida 
por los lecticanos en los cuales el núcleo proteico tiene un dominio globular N-
terminal que interactúa con el ácido hialurónico y un dominio del tipo de selectina 
en el C-terminal. Las cadenas laterales consisten sobre todo de condroitin sulfato, 
aunque el queratan sulfato también puede estar presente. Los miembros de este 
grupo son el agrecano, versicano, neurocano, y brevicano. Hasta hace poco tiem-
po se asumió que su función era estructural, al proporcionar al tejido la rigidez 
necesaria para resistir fuerzas compresivas. Está claro ahora, que el versicano, 
uno de los miembros de este grupo, estimula la proliferación de fibroblastos y de 
condrocitos, a través de la presencia en su molécula de secuencias semejantes al 
factor de crecimiento epidérmico (EGF). 
La segunda familia de proteoglicanos, es caracterizada por un núcleo proteico que 
se compone de repeticiones ricas en leucina. Éstas le proporcionan una estructura 
parecida a una herradura, que favorece las interacciones de la proteína. Sus 
cadenas laterales compuestas de glicosaminglicanos son sobre todo condroitin-
Idermatan sulfato, o keratan sulfato. La decorina, el biglicano, la fibromodulina, y el 
keratocano están entre los miembros de esta familia. Estos proteoglicanos hasta 
hace poco tiempo eran considerados organizadores de las redes de colágena. Se 
8 
La familia de los proteoglicanos del sulfato del heparan, moléculas cuya estruc-
tura, se encuentra directamente asociada a la membrana celular. El perlecano es 
un representante de esta familia y se encuentra predominantemente en membra-
nas basales. Los sindecanos y los glipicanos también pertenecen a este grupo. Se 
ha demostrado que estas moléculas tienen interacciones de alta afinidad, con una 
gran variedad de factores del crecimiento, formando estructuras ternarias con di-
chos factores y sus receptores, modulando así, la respuesta a la señal inducida 
por el factor de crecimiento en las células portadoras del receptor. A través de este 
mecanismo, los proteoglicanos de este tipo ejercen efectos sobre la adherencia, la 
migración de la célula y sobre su proliferación y diferenciación. La amplia expre-
sión de los proteoglicanos de sulfato del heparan y su participación en diversos 
procesos fisiológicos de la célula, sugiere que también estén relacionados en una 
amplia variedad de procesos patológicos, como, la cicatrización de heridas y en el 
crecimiento de tumores (Stamenkovic & 80sman, 2003). 
Las Metaloproteasas de Matriz Extracelular 
La remodelación de la MEC es el resultado de los procesos concurrentes múltiples 
que varían según el estímulo inicial. Así, los cambios estructurales y funcionales 
que ocurren dentro de la MEC de un órgano dado durante una respuesta inflama-
toria aguda, se diferencian, de los que acompañan el desarrollo de un miembro, o 
la invasión tumoral. Sin embargo, diferentes características mecánicas de la remo-
delación del tejido, son comunes a la mayoría de las etiologías. 
10 
El remodelar requiere como mínimo de dos acontecimientos: síntesis y depósito 
de los componentes de la MEC por un lado,' y su degradación por el otro. 
Numerosas proteasas han estado implicadas en la degradación de la MEC, entre 
ellas, está la familia del metaloproteasas de la matriz (MMP). 
Las MMPs forman una subfamilia de la superfamilia de las metzincinas, proteasas, 
que constituyen una de varias familias de las metaloendopeptidasas. Las metzin-
cinas comparten una topología estructural conservada, una secuencia motivo den-
tro del dominio catalítico que contiene tres histidinas que proporcionan un sitio de 
enlace al zinc, y una secuencia conservada "Met-turn" que reside debajo del sitio 
activo del ión zinc. 
Con base en su semejanza estructural, las metzincinas se subdividen en cuatro 
subfamilias: las serralisinas, las adamalisinas, las astacinas, y las matrixinas 
(MMPs). 
Se sabe que las más de 20 MMPs humanas y sus homólogas de otras especies 
podrían degradar prácticamente todos los componentes proteicos dela MEC. De 
acuerdo con su especificidad las MMPs se ha dividido en colagenasas, gelati-
nasas, estromelisinas, matrilisinas y metaloelastasas. Sin embargo, el alto grado 
del superposición entre especificidades del substrato de las MMPs y la noción de 
que pueden romper un mayor número de sustratos que no son parte de la MEC, 
hace esta nomenclatura imprecisa en el mejor de los casos (Stamienkovic, 2003). 
A cada MMP se le asigna un número que corresponde a la cronología de su 
identificación. Se han identificado varias subclases de MMPs, algunas de las 
cuales se secretan mientras que otras son proteínas unidas a la membrana. 
11 
Todas las MMPs son producidas como zimógenos los cuales contienen una se-
cuencia señal secretora y un propéptido, cuya ruptura es necesaria para que las 
enzimas se activen. 
El propéptido es seguido por el dominio catalítico que contiene el sitio consenso, 
que une al zinc HEBXHXBGBXHZ donde la X corresponde a un residuo variable y 
la 8 es un residuo hidrofóbico. La Z es un aminoácido específico de familia, esto 
es, en las serralisinas, la Z corresponde a prolina; en las adamalisinas, la Z es un 
ácido aspártico; las astacinas por su parte contienen ácido glutámico en esa 
posición; y en las MMPs corresponde a una serina. La estructura de las diferentes 
subgrupos de las MMPs se presenta en el siguiente cuadro. 
Estructura de las MMPs 
Dominio mínimo: MMP-7; MMP-26 
Dominio de hemopexina: MMP-1 ;MMP-3; MMP-8 
MMP-10; MMP-12; MMP-13; MMP-19; MMP-20: 
MMP-27 
Con secuencias de repetición tipo fibronectina 11: 
MMP-2; MMP-9 
Dominio de hemopexina simple activado por furina 
MMP-11; MMP-28 
~ Secuencia señal 
pro-dominio 
región de la bisagra 
dominio de enlace al zinc 
Secuencia de reconoci - .==------
MMPs transmembranales: MMP-14; MMP-15; 
MMP-16; MMP-17 
MMPs secuencias de anclaje: MMP-17: MMP-25 
Dominio transmembranal 
miento de furina Dominio catalítico s , Dominio citoplásmico 
secuencia de anclaje Secuencias de repetición tipo fibronectina II Dominio semejante 
a hemopexina 
Stamenkovic, 2003 
12 
Por lo menos dos MMPs (MMP-7 y MMP-26) se componen solamente del péptido 
señal, del propéptido y del dominio catalítico, y son conocidas como MMPs de 
dominio mínimo. La mayoría del MMPs restantes contiene en el carboxilo terminal 
un dominio de hemopexina, del cual se piensa, que confiere un cierto grado de 
especificidad por el sustrato. Otras tienen adicionalmente, secuencias de repeti-
ción semejantes a fibronectina en el dominio catalítico, un sitio de reconocimiento 
para la furina en el dominio del propéptido, los cuales participan en el proceso de 
activación de la molécula, y que son sitios de reconocimiento de proteasas de 
serina. Se piensa que estas estructuras le confieren funciones de adhesividad a 
estas moléculas, aunque el espectro total de sus funciones está por ser 
determinado. Finalmente, una subclase de MMPs que contiene un dominio 
transmembranal y un dominio intracelular es referidas a menudo como MT-MMPs 
(Stamienkovic, 2003). 
La actividad de MMP es controlada en varios niveles, incluyendo la transcripción, 
activación proteolítica, localización, e interacción con los inhibidores. La activación 
de MMPs ocurre típicamente por la ruptura proteolítica del propéptido, el cual es 
generalmente, el resultado de la actividad de otras proteasas, aunque también 
ocurre la activación auto-catalítica. Reciente se ha publicado que las MMPs antes 
de ser secretadas se localizan, al menos en forma transitoria, en la superficie de la 
célula, interactuando con receptores de adhesión y proteoglicanos. Tal localización 
parece ser importante en la degradación de la MEe mediada por la célula, y en la 
activación de factores de crecimiento latentes. También se piensa que la superficie 
de la célula puede proteger a las MMPs de sus inhibidores naturales, particular-
13 
mente los inhibidores tisulares específicos de las metaloproteasas (TIMPs), que 
son potentes bloqueadores de la actividad de estas enzimas, secretados por una 
amplia gama de la células y depositados en la MEe (Stamenkovic & Bosman, 
2003). 
Las MMPs promueven la invasión de la MEe de células normales y malignas, por 
medio de la interrupción física de las barreras naturales que la matriz presenta a la 
migración celular. Aunque la ayuda de las MMPs crea una trayectoria innegable de 
la migración para las células invasoras, las observaciones recientes proporcionan 
evidencia que obliga a pensar que la función de estas enzimas va más allá de la 
capacidad de cortar simplemente las proteínas estructurales de la matriz. Así, 
además de aumentar la biodisponibilidad de los factores de crecimiento 
secuestrados dentro de la MEe, la actividad proteolítica de las MMPs puede 
activar factores de crecimiento latentes secretados [(MMP-2 y 9 pueden activar 
TGF-~, y varias MMPs pueden liberar factor de crecimiento semejante a insulina 
(IGF) de sus receptores o proteínas enlazantes de IGF (IGFBPs)] y los precur-
sores de los factores de crecimiento presentes en la membrana celular, incluyendo 
al factor de crecimiento transformante-a (TGF-a) y al EGF unido a heparina (HB-
EGF), entre otros. Si bien durante mucho tiempo se consideró que la función 
primordial de las MMPs residía en proporcionar un mecanismo para degradar las 
proteínas del MEe y regular la resistencia mecánica a la migración de la célula, 
ahora se están considerando como reguladoras importantes de las interacciones 
normales de la fisiología celular. 
14 
La Estructura Microscópica del Hígado 
El hígado desempeña un papel único como centro metabólico del cuerpo. Se com-
pone de cinco tipos distintos de las células que ocupan cerca del 80% de su volu-
meno El 200/0 restante es ocupado por los espacios extracelulares y los componen-
tes de la matriz extracelular. (Rojkind &, Greenwel, 1994). 
El tejido hepático se organiza a nivel microscópico, en lóbulos que consisten en un 
Fig. 1 Estructura microscópica del lóbulo hepático. Canalículo Biliar (CB), 
Espacio de Disse (ED), Células endoteliales sinusoidales (SEC), Hepato-
citos (H), Células estelares hepáticas (HSC), Células de Kupffer (K), 
Células Pit (P), Sinusoide (S). (Kcmiec 2001). 
muro hecho de placas 
constituidas por células 
que se extienden desde la 
zona porta en forma lineal 
a la vena central, y los 
espacios que atraviesan 
los tabiques contienen los 
sinusoides hepáticos se-
parados de los hepatocitos 
por el espacio perisinusoidal de Disse (Fig. 1). Los sinusoides hepáticos, con un 
diámetro medio de 5 a 7 J.!m, conducen la sangre mezclada de las ramificaciones 
terminales de la arteria hepática y de la vena porta a la ramificación terminal de la 
vena hepática, e.g. vena central. Los sinusoides representan la única forma de 
tubo capilar en el hígado, su aspecto externo, se caracteriza, por, a) el 
revestimiento endotelial continuo, pero fenestrado, b) la presencia de células de 
15 
Kupffer dentro del lúmen, o como parte del sinusoide, c) la carencia de una 
membrana basal, y d) la presencia del espacio perisinusoidal (espacio de Disse). 
La única comunicación entre los sinusoides y el espacio de Disse son las ventanas 
o fenestras de las células endoteliales sinusoidales (SEC). La ausencia de mem-
brana basal facilita el intercambio rápido de componentes de la sangre con los 
hepatocitos. Los sinusoides hepáticos conectan los espacios porta con las ramas 
terminales de la vena hepática (venas centrales). Las células endoteliales de la 
arteria hepática son alargadas y arregladas longitudinalmente, mientras que las de 
las venas porta y central son poligonales y aplanadas, y poseen microvellosi-
dades. 
El espacio perisinusoidal contiene células estelares hepáticas (HSCs), abundan-
dantes microvellocidades de hepatocitos, terminaciones nerviosas, y una MEC 
compleja no densa a los electrones (Kmiec, 2001 
Los canalículos biliares, compuestosde invaginaciones longitudinales de la mem-
brana plasmática de dos hepatocitos adyacentes, continúan a la periferia del lóbu-
lo hasta que alcanzan los ensamblajes canalicular-ductular, conocidos previamen-
te como canales de Hering. Las paredes de estos canalículos terminales están for-
madas por hepatocitos y por un número pequeño de células epiteliales planas que 
se asocian estrechamente con los hepatocitos circundantes. (Kmiec, 2001) 
La MEC hepática es un compartimiento muy pequeño dentro del órgano, abarca 
menos el de 3% del área relativa en una sección normal del mismo. Además de la 
cápsula de Glisson, la MEC esta confinada, en el hígado normal, a las zonas por-
ta, paredes sinusoidales y venas centrales. En cualquier sitio, ésta es parte de la 
16 
frontera entre el flujo sanguíneo y el parénquima; una situación tan estratégica, 
explica lo inmediato de las múltiples consecuencias deletéreas, de cualquier modi-
ficación, en la distribución y composición de la matriz ya sea cualitativa o cuantita-
tiva. 
La Matriz Extracelular Hepática 
La MEC hepática se compone por lo menos de cinco tipos genéticos distintos de 
colágena, siete clases de proteínas no colagénicas, y de un número indeterminado 
de proteoglicanos y glicosaminoglicanos (Tabla 1). Entre las proteínas 
encontradas con mayor frecuencia en la MEC hepática se cuentan las colágenas, 
de tipo 1, 111, IV, Y V, aunque también están presentes otras isoformas incluyendo la 
tipo XVIII, precursora de la endostatina, descrita reciente-mente. 
Tabla 1. Composición de la matriz extracelular hepática. 
Colágenas 
Proteoglicanos 
Tipo I 
Tipo 111 
Tipo IV 
Tipo V 
Tipo VI 
Sindecano 
asociado a 
membrana 
Trombomodulina 
Betaglicano 
(Rojkind y, Greenwel, 1994) 
Fibronectina 
Laminina 
GI
" "N Entactina/nidogen 
Icoprotelnas 0- " 
colagénicas Tenasclna 
Asociadas con 
la matriz 
extracelular 
Trombospondina 
SPARC 
Undulina 
Versicano 
Biglicano 
Decorita 
Fibromodulina 
Perlecano 
17 
Cada isotipo difiere en su localización y función física dentro del hígado. Mientras 
que los tipos 1, 111, Y V, los componentes principales de la colágena fibrilar, se con-
finan principalmente a la zona porta y en la pared de la vena central, la colágena 
tipo IV, en asociación con la laminina y la nidogen-entactina, participa en la forma-
ción de un material de baja densidad, semejante a una membrana basal, a lo largo 
de la pared sinusoidal. En esta posición, generalmente está ausente una membra-
na basal densa a los electrones aunque se pueden detectar la mayoría de sus 
componentes individualmente. La baja densidad de esta estructura que semeja 
una membrana basal es crítica para permitir la difusión, entre la sangre y las célu-
las del hígado y para mantener la función diferenciada de células tales como hepa-
tocitos y células sinusoidales. 
Otros componentes importantes de la MEC del hígado son las glicoproteínas, 
como laminina, fibronectina, tenascina, nidogen, y SPARC, los proteoglicanos en-
tre los que se incluye el heparan, dermatan, y condroitin sulfato, el ácido hialuró-
nico, el biglicano y el perlecano, y la decorina (Rojkind &, Greenwel, 1994; 
Bedossa & Paradis, 2003). 
La función principal del MEC sigue siendo la coherencia y la resistencia mecánicas 
del hígado, pero también tiene un objetivo en varias funciones biológicas importan-
tes tales como proliferación de la célula, migración, diferenciación, y expresión 
genética. 
Cada célula del hígado tiene la capacidad de producir más de un tipo de proteínas 
de la MEC. Esta información se resume en la tabla 2. 
18 
La tabla 3 recopila las características principales de algunas de éstas moléculas. 
La matriz extracelular está altamente estructurada, su distribución y organización 
en el hígado es única, El diámetro de las fibrillas depende de varios factores, 
incluyendo el procesamiento de los extremos carboxilo o amino-terminales del 
propéptido y la asociación con otros componentes de la MEC, incluyendo las 
colágenas. A lo largo del acino hepático, el fenotipo del hepatocito (y quizá tam-
bién el de los otros tipos de células que forman el órgano), es variable, debido a la 
migración y maduración de células originales desde el área portal a la vena termi-
nal. 
Por lo tanto, la cantidad y la naturaleza de los componentes de la matriz que se 
producirán a lo largo de la trayectoria de la migración de los hepatocitos serán 
diferentes. Dentro del espacio de Disse se pueden visualizar por microscopia 
electrónica, solamente pequeños ensanchamientos de una estructura semejante a 
una membrana basal interrumpida. Estas características son importantes al consi-
derar la fisiología normal del hígado y las anormalidades que ocurren durante el 
desarrollo de la cirrosis hepática. 
La concentración de los componentes de la matriz varía considerablemente con la 
especie animal. Mientras que en la rata la colágena está a razón de 1 mg/g de pe-
so húmedo del hígado, en el ser humano representa 5 mg/g del tejido. 
Como ya se mencionó, la mayoría de los componentes del tejido conjuntivo se 
localizan en los espacios vasculares, tales como tríadas porta, áreas perive-
nulares, y en la cápsula de Glisson. No obstante, una cantidad pequeña pero sig-
19 
nificativa está presente en el espacio sinusoidal y más concretamente en el espa-
cio de Disse. 
Los espacios libres del hígado (vasos y conductos biliares) ocupan un volumen 
relativamente más grande que el de la MEC, y desempeñan un papel importante 
en la fisiología del hígado, puesto que representan los sistemas usados por las 
células para obtener sus nutrientes y para descargar sus productos metabólicos, 
incluyendo los necesarios para la comunicación con otras células o con otros teji-
dos. Cuando cualquiera de los espacios señalados se estrecha o desaparecen, 
como ocurre con el incremento del tamaño de los hepatocitos o la capilarización 
del espacio de Disse, respectivamente, la llegada y la salida de sustancias se 
modifican, lo mismo que su volumen de distribución, así como la presión porta. 
Tabla 2. Componentes de la MEC sintetizados por las células normales del hígado 
Colágena tipos I y III 
Hepatocitos Fibronectina (plasmática y celular) 
Laminina (RNAm de la cadena J32) 
Células 
estelares 
Colágenas tipos I (solamente miofibroblastos), 111, 
y IV 
Laminina (RNAm de cadenas J31-J32) 
Tenascina ( solamente miofibroblastos) 
Fibronectina ( solamente miofibroblastos) 
Entactina 
Undulina 
Células Colágena tipo IV 
Endoteliales Entactina 
Trombospondina 
(Rojkind & Greenwel, 1994) 
20 
Tabla 3. Localización de colágenas y proteínas no colagénicas y sus respectivos RNAm 
en hígado normal 
Tipo de 
Colágena 
111 
IV 
v 
VI 
Se localiza predominantemente en los espacios vasculares (en las áreas del 
tracto portal y vena central) y en la cápsula de Glisson. Algunas fibras están 
presentes dentro del espacio de Disse, en contacto con el plasmalema de los 
hepatocitos y células endoteliales. 
RNAm: los transcritos de procolágena I están presentes en las células del 
estroma del tracto portal, en algunas células del tracto portal, en algunas 
células de las venas centrales y en las células sinusoidales distribuidas en el 
lóbulo 
Está presente en los espacios vasculares y cápsula de Glisson. En el espacio 
de Disse está fuertemente asociada con los procesos de las células estelares 
hepáticas (HSCs) 
RNAm: Los transcritos de procolágena 111 están localizados en las células del 
estroma de los tractos portales y en las células de las venas centrales. Lo 
mismo que en las células sinusoidales distribuidas en el lóbulo. 
Localizada en las estructuras vasculares, linfáticas, y canaliculares que tienen 
membranas basales. En los sinusoides, se encuentran depósitos discontinuos 
pequeños entre el revestimiento endotelial y las capas de células hepáticas. 
RNAm: No ha sido detectado excepto en algunas células del estromade los 
tractos portales. 
Esta presente en el tejido conectivo intersticial periportal, particularmente 
alrededor de la lámina basal de los conductos biliares. Ocasionalmente se 
presentan fibras muy finas en el espacio perisinusoidal. 
RNAm: no ha sido determinado 
Es el componente de menor importancia localizado en los espacios 
periportales y en el espacio de Disse. 
RNAm: No ha sido determinado 
(Rojkind &, Greenwel, 1994) 
21 
Las Células del Hígado 
Entre las células del hígado, los hepatocitos son los de mayor tamaño. Ocupan 
cerca del 50 al 60% del volumen del órgano y comprenden dos tercios del total de 
las células hepáticas. Realizan funciones importantes, como ayudar a desintoxicar 
la sangre, y sintetizar las proteínas séricas del transporte (Iipoproteína, albúmina y 
transferrina). Es la principal célula epitelial del órgano, su estructura es poliédrica, 
con 8 o más superficies, y su tamaño varía entre 25-30 Jlm de largo, y con 20 a 25 
Jlm de ancho. Los cultivos primarios y secundarios de hepatocitos son útiles para 
estudiar los mecanismos de regeneración y de diferenciación del hígado. 
Históricamente, los hepatocitos en cultivo primario han exhibido una expectativa 
de vida limitada. Además, cuando son estimulados para dividirse en cultivo, 
generalmente pierden algunas funciones, como la capacidad sintetizar y secretar 
albúmina y transferrina. 
Debido a la estructura del hígado, la membrana del hepatocito presenta tres 
flancos diferentes, lo mismo ocurre con las funciones que realiza a través de cada 
uno de ellos, lo que significa que la superficie del hepatocito es asimétrica. 
La membrana plasmática basal, o frente sinusoidal, que se extiende con la presen-
cia de muchas microvellosidades cortas, se especializa en el intercambio de meta-
bolitas con la sangre, esto incluye: a) el transporte de moléculas pequeñas a tra-
vés de la membrana (e.g., aminoácidos, glucosa, ácidos biliares), b) la secreción 
de las proteínas del plasma vía la fusión de vesículas secretoras, y c) la 
23 
internalización de macromoléculas que circulan vía vesículas y poros revestidos 
de clatrinas. 
La superficie lateral comparte la mayoría de las funciones del frente sinusoidal y 
se especializa además en la comunicación célula-célula. 
Las funciones especializadas de la membrana apical o de los canalículos biliares 
incluyen: a) el transporte de los ácidos biliares y de los productos de desintoxi-
cación a través de la bicapa de la membrana a la bilis; b) el transporte y liberación 
de lípidos en el frente canalicular; y c) el suministro de la IgA secretora a la bilis 
vía la fusión de las vesículas de transporte con la membrana apical. En general 
estas células participan en casi todas las funciones atribuidas al hígado además 
de estar equipados para la defensa contra el estrés oxidativo. 
Existen algunas diferencias en su ultraestructura que se relacionan con la localiza-
ción de la célula en el lóbulo hepático. Por ejemplo los que forman parte de la zo-
na periportal tienen mayor número de mitocondrias de mayor tamaño, en compa-
ración con aquellos que se localizan en la zona perivenular, lo que indica que su 
actividad metabólica es preponderante ( Hubbard, 1994). 
En el hígado normal, las células del parénquima se dividen raramente, sin embar-
go, después de una hepatectomía parcial, o en algunas formas de lesión hepática 
grave, los hepatocitos proliferan rápidamente para restaurar la masa del órgano. 
La regeneración hepática está regulada no solamente por factores extracelulares 
sino también por sustancias liberadas por las células vecinas no parenquimatosas, 
que actúan sobre los hepatocitos en forma de interacciones parácrinas. (Kmiec, 
2001) 
24 
expresan a-actina de músculo liso, un marcador de HSCs activadas. La orienta-
ción perivascular de las HSCs y sus largas prolongaciones citoplásmicas facilitan 
su interacción con los diversos tipos de células vecinas. Estas prolongaciones son 
adyacentes a los nervios hepáticos, con las cuales pueden responder a estimula-
ción a-adrenérgica con un influjo de Ca2+ citosólico y liberación de osmolitos 
(Friedman, 2000). 
Knittel y cols. (1999a), mediante una técnica de aislamiento celular, por medio de 
la cual eliminan a las HSCs ricas en vitamina A, consiguió cultivar fibroblastos de 
hígado de rata normal a los que llamó "miofibroblastos de hígado de rata (MF)". 
Estas células en contraste con las HSCs, carecen de la expresión de proteína glial 
fibrilar acidica, desmina y de moléculas de adhesión de células vasculares (VCAM-
1); sin embargo, ambos tipos celulares muestran coincidencia en la mayoría de 
sus características, con algunas diferencias, entre las cuales podemos mencionar 
a). Su localización, los MF se ubican en las zonas periportales, en las paredes de 
las venas centrales, y muy ocasionalmente en el parénquima hepático; las HSCs, 
por su parte, se encuentran sólo en el parénquima, (Knittel y cols., 1999b). 
b). Durante el daño hepático agudo, el número de HSCs se incrementa predomi-
nantemente, mientras que el número de MF literalmente no cambia. En contraste, 
cuando se trata de una lesión crónica, las dos poblaciones celulares participan en 
la formación de MEC de alta densidad (cicatriz). 
Knittel y cols., demuestran, que poblaciones de fibroblastos funcionalmente dife-
rentes, están presentes en diferentes compartimentos del hígado normal, res-
26 
ponden diferencialmente al daño agudo, y pueden ser detectadas en distintas 
áreas de hígado fibrótico, sin embargo, ambas poblaciones son consideradas co-
mo células fibrogénicas (Knittel y cols., 1999b). 
Las células endoteliales sinusoidales (SEC) son fenestradas, el número y tamaño 
de sus ventanas, varía desde 200 nm de diámetro, hasta 1 Jlm, según su localiza-
ción en el sinusoide y la composición de la MEC. 
Las células de Kupffer y las células "pit" son residentes normales del espacio 
sinusoidal: las células de Kupffer son miembros del sistema fagocítico-mononu-
clear, y las células "pit" corresponden a las células asesinas naturales (NK) 
(Kmiec, 2001, Rojkind & Greenwel, 1994). 
Otro componente del hígado que se ha ignorado por muchos años es su inerva-
ción. Puesto que las terminales adrenérgicas se encuentran en la asociación cer-
cana con HSCs, estas células son altamente contráctiles y pueden regular el flujo 
portal de la sangre. 
Fisiología de la fibrosis 
El endotelio sinusoidal cuya estructura se designa como el filtro del hígado, es 
probablemente el blanco principal del estrés oxidativo, está situado estratégica-
mente para permitir el libre intercambio de proteínas y otros nutrientes entre los 
hepatocitos y la sangre, además de aislar a éstas células de la mayoría de las 
células sanguíneas, de las plaquetas y de partículas coloidales más grandes, tales 
como kilomicrones y virus (Cogger y cols., 2004). 
27 
hepático se acompaña además de la activación de las células de Kupffer lo que 
favorece la activación parácrina de las células estelares (Friedman, 2000). 
El hígado normal, permite el libre intercambio entre las células del hígado y el flujo 
sanguíneo, debido, a la constitución porosa de las SEC y la escasez de MEC, en 
el espacio perisinusoidal, por lo tanto, la capilarización del sinusoide deteriora 
poderosamente este intercambio. Además, debido a las conexiones directas entre 
las células y su entorno, cualquier modificación cuantitativa o cualitativa del 
microambiente de la MEC influenciará las funciones celulares, produciendo 
deterioro de la función del hepatocito y cambios en el fenotipo de la HSC. Estos 
cambios ilustran el papel principal de la MEC en el hígado, no solamente como 
plataforma para su arquitectura, sino también como una red continua entre las 
células, que permite, vía sus propios receptores, el intercambio continuo de seña-
les entre ellas (Bedossa & Paradis, 2003). 
Aunque la fibrosis es un acontecimientobiológico importante por sí mismo, 
representa un desequilibrio entre la síntesis y degradación de las moléculas de la 
MEC y se asocia además, con otros mecanismos esenciales en el órgano tales 
como distorsión arquitectónica, regeneración de la célula hepática, y redistribución 
vascular, estos mecanismos conjuntamente con los depósitos fibrosos, contribu-
yen a las severas consecuencias para la función hepática. 
La agresión está presente por meses o años antes de que se acumule una cica-
triz significativa, aunque este tiempo puede acelerarse cuando se trata de enfer-
medad hepática congénita. La fibrosis hepática es reversible, mientras que la cirro-
sis, estado final consecuencia de la fibrosis, generalmente es irreversible. 
29 
Al estudiar la patogénia de la fibrosis se ha puesto atención especial en la frecuen-
te asociación con el incremento de la peroxidación de lípidos y/o la alteración del 
sistema anti-oxidativo. La ruptura oxidativa de los lípidos de la membrana puede 
deberse a la interacción con gran variedad de radicales libres y se caracteriza por el 
incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y radicales orgánicos inter-
medios durante el proceso de propagación (reacción en cadena). Este proceso, 
mediado por radicales libres, está implicado frecuentemente en el cambio del equi-
librio oxido-reductor intracelular hacia la oxidación, lo que bioquímicamente se 
define como estrés oxidativo (Poli & Parola, 1997). 
Los blancos biológicos principales de los radicales libres y las ROS son las 
proteínas, los lípidos y el ONA. La peroxidación de los lípidos ocurre principal-
mente en la membrana plasmática alterando sus propiedades físicas y como con-
secuencia sus funciones biológicas. 
Los hepatocitos y las células de Kupffer son una fuente de ROS, éstos compues-
tos ejercen una estimulación paracrina sobre las HSCs, además, su actividad in 
vivo se amplifica por la pérdida de antioxidantes, como ocurre típicamente en la 
enfermedad hepática. El medio de cultivo condicionado de hepatocitos, adicionado 
a cultivos de HSCs, produce estrés oxidativo en éstas células, incrementando su 
proliferación y la síntesis de colágena. La sobre-expresión en las HSCs de la enzi-
ma citocromo p450 2E1, cuya actividad genera ROS, estimula la expresión del 
gene de colágena 1, el cual es atenuado por antioxidantes. Las (SEC) dañadas 
estimulan la producción de una variante celular de fibronectina (isoforma EIIIA) 
que tiene un efecto activador sobre las HSCs, adicionalmente, las SEC convierten 
30 
el factor de crecimiento transformante-f31 latente (TGF-f31) a su forma activa a tra-
vés de la acción de la plasmina, proceso que a su vez desencadena la formación 
de la cicatriz constituida por fibras complejas de MEe, lo que contribuye a la 
pérdida de las microvellosidades de los hepatocitos y la capilarización del sinusoi-
de con el consiguiente deterioro de la función hepática (Friedman, 2000). 
Las Metaloproteasas en el Hígado 
El recambio normal de MEe así como su reconstrucción durante la enfermedad 
hepática crónica, depende parcialmente de la actividad de las metaloproteasas de 
matriz extracelular (MMP) y sus inhibidores tisulares (TIMPs) (Alcolado y cols., 
1997, Rojkind & Pérez-Tamayo, 1983). Las MMPs son una familia de endopep-
tidasas dependientes de ea +2 y Zn2+ cuyos sustratos específicos son los principa-
les componentes proteicos de la MEe, como la colágena intersticial entre otras 
(Birkedal-Hansen, y cols., 1993, Birkedal-Hansen, 1995, Woessner & Nagase, 
2000). Los esfuerzos para revertir la fibrosis y cirrosis deben incluir la degradación 
del exceso MEe con el fin de restaurar la arquitectura normal del hígado. 
Hay dos tipos de degradación de la matriz hepática, una que destruye la matriz de 
baja densidad del hígado normal (degradación patológica de la matriz) y que como 
consecuencia empeora la enfermedad hepática, y la otra, la degradación del 
exceso de cicatriz que puede ayudar a restaurar la normalidad de la arquitectura 
del hígado dañado (degradación restaurativa de la matriz). 
Una extensa familia de MMPs también llamadas matrixinas, contribuye a la degra-
dación de la matriz ya sea patológica o restaurativa. Las MMPs son enzimas que 
31 
degradan específicamente sustratos colagénicos y no colagénicos (Benyon & 
Arthur, 2001). 
Estas enzimas se clasifican en cinco categorías basadas en su especificidad por el 
sustrato (tabla 4): colagenasas intersticiales (MMP-1, -8, -13); gelatinasas (MMP-2, 
-9); estromelisinas (MMP-3, -7, -10, -11); asociadas a membrana (MMP-14, -15, -
16,-17,-24,-25) Y metaloelastasa (MMP-12). Su actividad se regula a muchos 
niveles para restringirla a regiones discretas dentro del ambiente pericelular. Se 
producen y secretan en forma de pro-enzimas inactivas y pueden activarse por 
ruptura proteolítica e inhibirse a través de su unión con inhibidores específicos 
conocidos como inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMPs, tabla 6). Estos 
TIMPs forman complejos que se combinan en proporciones definidas con las 
MMPs, por ejemplo, la MT-1-MMP (MMP-14) Y el TIMP-2 forman un complejo 
ternario con la MMP-2 el cual produce una actividad óptima de la enzima. De esta 
manera, la actividad neta de la enzima refleja la cantidad relativa de las MMPs 
activadas y sus inhibidores, especialmente de los TIMPs. 
La degradación patológica de la MEe del hígado, se refiere a una ruptura 
temprana de la matriz subendotelial que ocurre a través de la acción de al menos, 
cuatro enzimas: la MMP-2 y la MMP-9 que degradan a la colágena tipo IV, la MT-
1-MMP Y MT-2-MMP que a su vez activan a la MMP-2, y la estromelisina-1 (MMP-
3) que se encarga de la degradación de los proteoglicanos y glicoproteínas, y que 
a su vez activa a la colagenasa latente. Es posible que este mecanismo esté 
involucrado en la invasión tumoral. 
32 
Tabla 4 Las Metaloproteasas de Matriz Extracelular 
Colagenasas Intersticiales 
MMP-1 Colagenasa Intersticial 
Peso Molecular de 
la Pro enzima (kDa) 
55 
MMP-8 Colagenasa de Neutrófilos 75 
MMP-13 Colagenasa-3 
Gelatinasas 
MMP-2 
Gelatinasa A (72 
nasa tipo IV) 
MMP-9 Gelatinasa 8 (92 
nasa tipo IV) 
Estromelisinas 
MMP-3 Estromelisina-1 
MMP-7 Matrilisina 
MMP-10 Estromelisina-2 
MMP-11 Estromelisina-3 
Tipo de Membrana 
MMP-14 MT1-MMP 
MMP-15 MT2-MMP 
MMP-16 MT3-MMP 
MMP-17 MT4-MMP 
MMP-24 MT5-MMP 
MMP-25 MT6-MMP 
Metaloelastasa 
MMP-12 Metaloelastasa 
(Benyon & Arthur, 2001) 
kDa colage-
kDa colage-
66 
72 
92 
57 
28 
57 
62 
63 
63 
63 
64 
65 
64 
54 
Sustratos 
Colágena 111>1, 11, VII, VIII, X 
Colágena 1>111, 11 
Colágena 11>111, 1. VII. X 
Colágenas V>IV, 1, VII, X, gelatinas, elastina, 
laminina 
Colágenas V>IV, 1, VII, X, gelatinas, elastina, 
laminina 
Colágenas 111, IV, V IX, gelatinas, fibronectina, 
proteoglicanos, laminina, activa MMP-1 
Entactina, gelatina, elastina, fibronectina, 
vitronectina, laminina, fibrinógeno 
Colágenas 111, IV, V IX, fibronectina, proteo-
glicanos, laminina, activa MMP-1. gelatinas 111, 
IV, V>colágenas,elastina, agrecano 
débil actividad contra proteínas de ECM 
Activa MMP-2 Y MMP-13, colágena 1, 11, 111, 
fibronectina, vitronectina, gelatina, fibrinógeno 
Fibronectina, tenascina, laminina, agrecano, 
perlecano, activa MMP-2 
Colágena 111, fibronectina 
Fibrinógeno, fibrina, activa TNF-a pero no MMP-
2 
Activa MMP-2, proteoglicanos 
Colágena IV, gelatina, fibronectina, fibrina 
Elastina, gelatinas, colágena IV, laminina, 
fibronectina, proteoglicano 
33 
fibrótico, aunque aún no es claro cual es la fuente celular de esta enzima. 
Alternativamente, es posible que otras enzimas tales como la MT-1-MMP y la 
MMP-2 puedan poseer también actividad de colagenasa intersticial, lo cual a la 
fecha no está determinado. 
Tabla 6 Los TIMPs en el hígado 
TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 
Peso 
Molecular 20 21 .7 21.6 22.6 
(kDa) 
Tamaño de los 0.9 1.0,3.54.5-5.0 1.2-1.4 transcritos,(kb) 
Inhibe todas si si si no se sabe las MMPs 
encontrado en 
Propiedades estudios se une a pro se una a pro se une a la MEC moleculares especiales MMP-9 MMP-2 de tejido 
cardiaco 
liberado por HSCs 
activadas. liberado por HSCs Papel en la elevada expresión activadas. enfermedad en hígado fibrótico elevada expresión no se conoce no se conoce hepática proteína de fase 
aguda liberada por en hígado fibrótico 
hepatocitos. 
Arthur, 1998 
La progresión de la fibrosis está asociada de modo muy significativo con un 
incremento marcado en TIMP-1 y TIMP-2 lo que produce disminución neta en la 
actividad de las MMPs y por lo tanto la acumulación de la matriz (Friedman, 2003). 
Durante los años siguientes a su descubrimiento, se pensó que estas enzimas 
tenían como funciones primordiales, la regulación de la composición de la MEe, 
35 
ANTECEDENTES 
La cirrosis hepática es un proceso dinámico de depósito y eliminación de MEC y 
regeneración nodular de las células del parénquima que produce trastornos pro-
fundos en las interacciones célula-matriz, que conducen a la pérdida progresiva de 
la estructura y la función del órgano. (Arthur, 1995; Iredale y cols., 1995; Popper, 
1977). 
Actualmente, tanto las HSCs como los miofibroblastos (MF), se consideran como 
la fuente principal no solo de la MCE (Friedman y cols., 1985; Cassiman y cols., 
2002a) sino también de las MMPs, como la MMP-1 y MMP-13 (Iredale y cols. 
1996; Watanabe y cols., 2000), MMP-2 (Milani y cols., 1994), y de TIMP-1 y TIMP-
2 (Iredale, 1997; Herbst y cols., 1997). 
Las células de Kupffer también participan en la regulación de la MEC hepática por-
que expresan MMP-9 (Winwood y cols., 1996), por último, las células endoteliales 
sinusoidales producen MMP-2 y MMP-9 (Upadhya y cols., 1997). En cambio, la 
demostración de la participación de los hepatocitos es polémica. En algunos artí-
culos se menciona que estás células expresan TIMP-1 (Roeb y cols., 1994), y 
TIMP-2 (Roeb y cols., 1995), pero estos resultados han sido rebatidos entre otros 
por Terada y cols., (1996). Lo mismo ocurre con los datos sobre la expresión de 
las MMPs, en algunos casos no ha podido ser demostrada en éstas células (Milani 
y cols., 1994; Iredale y cols., 1996; Terada y cols., 1996), en otros casos, se ha 
detectado en hepatocitos, sólo cuando se presenta un daño químico agudo 
(Herbst y cols., 1997). Así mismo, la presencia de éstas enzimas, han sido 
37 
detectadas como componentes constitutivos de la célula en ensayos in vitro 
(MMP-2 y MMP-9) (Haruyama y cols., 2000), y expresándose en niveles bajos 
durante el cultivo (Knittel y cols., 1999 b). Cuando los hepatocitos se co-cultivan 
con HSCs inducen en éstas células la síntesis de MMP-2 y MMP-13 (Théret y 
cols., 1997; Shaeffer y cols., 2003). 
En un estudio previo (Montfort y cols., 1990) se describió el cambio en la actividad 
colagenolítica presente en preparaciones enriquecidas de hepatocitos y células 
sinusoidales por separado, durante el proceso de desarrollo e involución de la 
enfermedad en dos modelos experimentales de cirrosis hepática, y se propuso 
que la actividad colagenolítica presente en el órgano completo, es el resultado de 
la combinación de las actividades expresadas por ambas poblaciones celulares. 
En la actualidad se acepta que las HSCs hepáticas son las responsables del pro-
ceso fibrótico, mientras que los hepatocitos, a pesar de ser las células más nume-
rosas, y las más afectadas, han sido habitualmente descartadas como participan-
tes del proceso. 
Un modelo animal experimental de cirrosis hepática empleado con frecuencia es la 
respuesta del hígado a una droga hepatotóxica, el CCI4, la cual induce peroxida-
ción de los lípidos de la membrana del hepatocito, y se ha observado, que depen-
diendo de la dosis, tiempo de exposición, o la edad de los animales empleados, 
puede haber regresión del proceso con recuperación completa del hígado (Weber 
y cols., 2003). 
La cirrosis experimental inducida por CCI4 , parece reproducir superficialmente las 
características principales de la enfermedad humana, el hígado es nodular, hay 
38 
HIPÓTESIS 
La condición normal o patológica de la MEC hepática determina, en el hepatocito, 
los niveles de expresión de algunas de las enzimas y sus correspondientes 
inhibidores (MMPs y TIMPs), que son fundamentales en la remodelación del 
hígado. 
OBJETIVO 
Determinar la presencia de las MMPs y sus respectivos TIMPs, en los hepatocitos 
normales y cirróticos, y comparar cualitativamente los resultados entre las dos 
condiciones. 
OBJETIVOS PARTICULARES 
Confirmar en los hepatocitos de animales normales y cirróticos: 
• La actividad enzimática de algunas MMPs en el sobrenadante del medio de 
cultivo primario de hepatocitos . 
• La existencia de los transcritos de los RNAm específicos para diferentes 
MMPs y sus correspondientes TIMPs. 
• La presencia de los productos génicos (proteasas y sus inhibidores), a nivel 
citoplásmico. 
40 
IV) Control normal, ratas sin tratamiento. Sacrificadas en los tiempos esta-
blecidos para los grupos I y 11. 
Aislamiento y cultivo de hepatocitos 
Se obtuvieron cultivos primarios de hepatocitos aislados por perfusión portal in situ 
de acuerdo a la técnica de Berry y Friend modificada (1969). La perfusión se llevó 
a cabo en dos etapas: en la primera se perfundieron con 50 mi de solución TD-
salina (NaC1137 mM, KCI 50 mM, Na2HP04 0.7 mM, Trizma Base 25 mM, rojo de 
fenal 0.001 %) adicionada de ácido etilen glicol-bis (~-aminoetil éter)-N, N, N', N'-
tetracético. (EGTA) (Sigma) 2.5 mM a una velocidad de flujo de 15 ml/min, y en la 
segunda etapa, se usaron 75 mi de TD-salina con 1.0 mM CaCb y 100 U/mi de 
colagenasa bacteriana tipo IV (Sigma Chemical Ca., St Louis, MO). Al completar la 
perfusión el hígado se colocó en una caja de Petri con medio de cultivo Williams-E 
heparinizado (Sigma Chemical), suplementado con suero neonatal de ternera, se 
retiró la cubierta y se agitó vigorosamente para liberar las células, la suspensión 
celular obtenida se pasó por una malla de nylon y el filtrado se centrifugó 3 veces 
a 50 x g por un min y se resuspendió en 10 mi del mismo medio. La suspensión 
final se mezcló con 23 mi de percoll isotónico (Sigma Chemical) y se centrifugó 5 
min a 210 x g para separar los detritus y células muertas. Las células vivas 
obtenidas se resuspendieron en medio Williams-E suplementado con 0.01 % de 
insulina, de 10 nm/100ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y suero 
neonatal de ternera al 10 %; una vez determinada su viabilidad por exclusión de 
43 
azul Tripán, se sembraron en multicámaras de 6 pozos (30 mm de diámetro), 
Corning, Costar Co, Cambridge, MA) a razón de 8.0 x 105 células por pozo, a 37° 
C en atmósfera de CO2 al 5%, y saturación de humedad. El medio se reemplazó a 
las tres hrs. y subsecuentemente cada 24 hrs; en el 6° día de cultivo fue sustituido 
con medio sin suero, mismo que fue colectado al 8° día, dializado contra H20 (48 
hrs), concentrado (1/10 volumen) y redializado contra Tris-HCI 5 mM, pH 7.4, 
determinándosele finalmente la concentración de proteína con el método de Lowry 
modificado (BioRad, Richmond, CA). Todos los medios se sometieron a electrofo-
resis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SOS). 
Los cultivos se obtuvieron de los 4 grupos en estudio; las células empleadas para 
hibridación in situ e inmunohistoquímica, se sembraron sobre cubreobjetos de 
vidrio contenidos en multicámaras y al cabo de la incubación (4 días) en medio 
Williams-E suplementado con 0.01 % de insulina, factor de crecimiento epidérmico 
(EGF) 10 nm/100ml y suero neonatal de ternera al 10 0/0, se trataron como sigue: 2 
lavados con amortiguador salino de fosfatos 150 mM (PBS) pH 7.0, se fijaron 
durante 10 min con p-formaldehído al 4% en PBS en presencia de Ca2+, y 
finalmente 3 lavados con PBS. 
Tratamiento del tejidoSe tomaron fragmentos de hígado fresco de los animales de cada grupo, para 
extracción de RNA total. Para los estudios histológicos, inmunohistoquímicos, y de 
hibridación in situ, los fragmentos se fijaron en p-formaldehído al 4.0 % en PBS pH 
44 
7.0, durante dos hrs, se lavaron con PBS, se deshidrataron y se incluyeron en 
parafina. 
HSCs y Miofibroblastos en suspensiones y cultivos celulares 
hepáticos 
La proporción de HSCs en las suspensiones frescas de hepatocitos empleadas 
para los cultivos primarios (8 días) y la extracción de RNA total, se determinó por 
medio de citometría de flujo, empleando un anticuerpo monoclonal anti-desmina 
revelado con un segundo anticuerpo (anti-lgG de ratón preparado en cabra (Fab2) 
marcado con isotiocianato de fluoresceína (Dako Co., Glostrup, Denmark). Como 
control positivo se usó la línea de células HSCs clona cFSC-2G proporcionadas 
por el Dr. Marcos Rojkind (Greenwel y cols., 1993). 
Las suspensiones celulares de animales normales y cirróticos (hepatocitos recién 
aislados, hepatocitos en cultivo primario de 8 días y células estelares hepáticas), 
ajustadas a 5.0 X105 cels/ml, se lavaron con PBS-heparina, se fijaron y 
permeabilizaron con acetona-metanol-H20 v/v/v (2:2: 1) durante 30 min a 4°C 
(O'Brien & Bolton, 1995). Se bloquearon con solución de Hanks-HEPES sin Ca2+ , 
saponina al 0.01 % Y suero de cabra al 3% durante 15 min a 4° C. Los anticuerpos 
(primario y secundario) se diluyeron en Hanks-HEPES sin Ca2+ -saponina al 0.01 %, 
con suero normal de cabra al 1 % (Hanks-HEPES). Las células se incu-baron con 
el anticuerpo primario durante una hora a 37° C, y se lavaron tres veces con la 
45 
solución Hanks-HEPES. El anticuerpo secundario se incubó con las células por 30 
min a 370 C y se lavaron nuevamente con la solución mencionada. 
El análisis se llevó a cabo en un FACSort (Beckton Dickinson, Sunnyvale, CA) 
equipado con un láser de argón SP2016 (Spectra Physics, Mountain Veiw, CA), 
ajustado a 10 000 eventos por adquisición. 
La presencia de MF en el cultivo primario (Knittel y cols., 1979), fue determinada 
por análisis de fibulina-2 (proteína de matriz extracelular secretada típicamente por 
éstas células) en los sobrenadantes de cultivo por medio de inmunoelec-
trotransferencia (western blot, Towbin y cols., 1979), utilizando un anticuerpo anti-
fibulina-2, proporcionado por el Dr. Takako Sasaki; como control positivo de 
fibulina-2, se empleó el medio de cultivo condicionado de fibroblastos de rata. 
Ensayo de actividad colagenolítica 
Se determinó la actividad colagenolítica de 28 medios condicionados, utilizando 
como sustrato colágena de tendón de rata marcada con anhídrido acético 3H+. 
(100 JlI de una solución de 1.4 mg/ml con actividad específica de 4.06 X 106 
cpm/mg diluida v/ven Tris Nagai pH 7.6 (NaCI 0.4 M, Tris 0.1 M, CaCI2 0.02 M). 
Debido a la variabilidad del rendimiento en el aislamiento de hepatocitos para cada 
cultivo en los diferentes grupos, se emplearon cantidades equivalentes de proteína 
para realizar determinaciones comparables. Se manejaron medios condicionados 
de 8 días de cultivo para asegurar que la actividad colagenolítica obtenida no tenía 
46 
relación alguna con la colagenasa exógena empleada en el aislamiento de las 
células (Nagai y cols., 1982). 
Las incubaciones fueron mantenidas a 30° C durante 18 hrs La actividad 
colagenolítica de los sobrenadantes se activó con 1.0 mM de p-aminofenil-
mercuriacetato (APMA) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Se emplearon como 
inhibidores específicos 1-10-0-fenantrolina 80 mM, y ácido etilen diaminotetra-
acético (EDTA) 50 mM. Al cabo de la incubación, la mezcla de cada reacción se 
sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-(SDS) aI8% • 
Una vez precipitada con dioxano-metanol (1:4 v/v) la colágena no degradada, se 
cuantificó midiendo la radioactividad del sobrenadante (300 J.lI en 10 mi de Bray) 
en un contador de centelleo líquido. 
La actividad colagenolítica se expresó como la media ± la desviación estándar de 
la actividad específica, de siete determinaciones por grupo. El análisis estadístico 
se realizó empleando la prueba t de Student, considerando como significativo un 
valor de p<0.05. La comparación de los datos se realizó entre los resultados 
obtenidos en el mismo grupo y entre los datos obtenidos en los diferentes grupos. 
Zimogramas 
Esta prueba se realizó con la finalidad de identificar proteínas con actividad 
proteolítica presentes en los medios condicionados de cada grupo en estudio, para 
lo cual, se examinaron volúmenes equivalentes a 10 J.lg de proteína total de los 
mismos 28 sobrenadantes de cultivo empleados en el ensayo anterior (actividad 
47 
colagenolítica) sobre geles de poliacrilamida-SDS al 8%) adicionados con 1.0 mg 
Iml de gelatina ó caseína. En cada gel se corrió una muestra de medio condiciona-
do sin tratamiento y otra con activadores de metaloproteasas (APMA ó PHMB (p-
hidroximercuribenzoato)) a una concentración final de 1.0 mM. 
Al término de la electroforesis los geles se lavaron con tritón X-100 al 2.5% duran-
te 30 min, se enjuagaron con agua y se incubaron durante toda la noche a 37° C 
en 100 mi de solución de glicina 100 mM, CaCI2 5 mM (pH 8.0) suplementada con 
5 mi de ZnCb 1.0 mM. 
Para cada sustrato (gelatina o caseína) se corrió un gel similar (paralelo) 
adicionado de EDTA 50 mM (concentración final) e incubado con el inhibidor en 
Tris 50 mM, NaCI 150 mM (TNC), con el fin de inhibir la actividad de las 
metaloproteasas presentes en el medio condicionado (Pardo y cols., 1997). 
Al final de la incubación los geles se enjuagaron con agua, y se tiñeron con 
solución de azul de Coomassie. La actividad proteolítica se presentó como una 
banda clara sobre un fondo azul. Para evaluar el peso molecular aproximado de 
las bandas con actividad enzimática obtenidas en los geles, se corrieron también 
marcadores de peso molecular. (BioRAD, Richmond, CA), y metaloproteasas 
puras de origen humano (MMP-2 y MMP-9, Chemicon, Temecula, CA). En otros 
casos, se emplearon sobrenadantes de cultivo de macrófagos de ratón y fibroblas-
tos de rata los cuales tienen actividad para MMP-9 y MMP-2 respectivamente, 
como controles positivos. 
48 
Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa 
(RT-PCR) 
Se extrajo el RNA total de hepatocitos frescos aislados, de células en cultivo y de 
fragmentos de hígado de animales de cada uno de los grupos en estudio de 
acuerdo a la técnica de ehomczynski y Sacci (1987), así como de fragmentos de 
útero de rata post-parto y de HSes en cultivo, que se emplearon como controles, 
El DNA complementario (cDNA) de las muestras mencionadas fue sintetizado por 
transcripción reversa a partir de 0.5 Jlg de RNA total, con el sistema RT-peR 
(Super Script™ One StepTM RT-peR System, Life Technologies, Gaithersburg. 
MD) de acuerdo a las indicaciones del fabricante y con los iniciadores específicos 
correspondientes diseñados por Wells y cols., (1996) para MMPs-2, 3, 10,13; 
Okada y cols., (1994) para TIMP-1; y eook y cols., (1994) para TIMP-2, (tabla 7). 
Se incluyeron los oligonucleótidos específicos de ~-actina la cual es una proteína 
constitutiva de hepatocitos y GADPH, como control interno. 
La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp® peR System 9700(PE, 
Applied Biosystems, Foster eity, A) con las siguientes condiciones, transcripción 
reversa un ciclo de 30 min a 55° e, seguida de 2 min a 94° e, amplificación: 40 
ciclos que incluyen 15 seg a 94° e, 30 seg a 58° e y 1 min a 72° e, elongación 
final: 10 seg a 72° e. Todas las amplificaciones se realizaron simultáneamente. Al 
finalizar, se tomaron 51-11 de cada reacción para analizar el tamaño de los 
productos obtenidos en geles de agarosa al 20/0 en Tris-acetato 40mM EDTA 1.0 
49 
mM pH 8.0 (TAE) Y se revelaron con solución de bromuro de etidio cuya 
concentración fue de 0.2 Jlg/ml. 
Para determinarsi los productos del RT -PCR correspondían a los genes que 
codifican para las proteínas esperadas, los cONA obtenidos fueron purificados, 
con el sistema "QIAquick® PCR" (QIAGEN Inc, Valencia CA) y se emplearon com~ 
templetes para la reacción de PCR llevada a cabo en un termociclador GeneAmp® 
PCR System 2700 (PE, Applied Biosystems, Foster City, A) (50 ciclos de 20 seg a 
94 o C Y 4 min a 60 0 C y mantenidos finalmente a 40 C) y secuenciados con un 
sistema secuenciador de ONA (Big dye terminator cycle sequencing ready reac-
tion, Applied Biosystems), con 10 ng del cONA templador por cada 100 pb ( pares 
de bases) del producto de PCR, los amplificados se purificaron por cromatografía 
en sefadex G-50 (Amersham Biosciences) en columnas de Axygen para ser 
procesados en un analizador ABI Prism 3700 ONA Analyser, PE, (Applied 
Biosystems), con el programa de análisis de secuencias ABI Prism v 3.0. 
Finalmente las secuencias obtenidas fueron comparadas con el programa para 
alineamiento "BLAST" (Altschul y cols., 1997) del National Center for 
Biotechnology Information (NCBI). 
50 
Tabla 7 Iniciadores usados para RT -PCR 
Número Amplicon 
complementario anticomplementario 
Proteínas de acceso tamaño Referencias 
5'-3' 5'-3' 
EMBL (pb) 
Wells,GMA 
MMP-2 X71466 CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT 309 
1996 
Wells,GMA 
MMP-3 X02601 ATC CGA GGT CAT GAA GAG CT TAT GTG GGT CAC TTT CCC TG 317 
1996 
Wells,GMA 
MMP-10 X05083 GTC CAA GCA GGT TAC CCA AA TTC AGT GTG TGT GTC ACC GT 307 
1996 
Wells,GMA 
MMP-13 M60616 GCC CTGAAT GGG TAT GAC AT GCA TGA CTC TCA CAA TGC GA 324 
1996 
Okada, A 
TIMP-1 ACA GCT TTC TGC AAC TCG CTA TAG GTC nT ACG AAG GCC 317 
1994 
Cook, TF 
TIMP-2 ATT TAT CTA CAC GGC CCC CAA GAA CCA TCA CTT CTC TTG 351 
1994 
Wells,GMA 
GADPH X54798 ACC CCC CAA TGT ATC CGT TGT TAC TCC TTG GAG GCC ATG TA 299 
1996 
Wells,GMA 
p-actina L00981 TCC TTC CTG GGT ATG GAA TC ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG 300 
1996 
Hibridación in situ 
La hibridaciones se realizaron mediante un método no radiactivo, en muestras de 
2-3 animales por grupo (hepatocitos en cultivo primario de 4 días y cortes histo-
lógicos hepáticos de 4J.lM montados en portaobjetos de vidrio silanizados (Sigma 
Chemical Co., St Louis, MO). 
Se generaron transcritos marcados con digoxigenina, a partir de cONA específicos 
para metaloproteasas, proporcionados por diversos investigadores: 
51 
Colagenasa de rata (MMP-13), cONA de 388 pb (sonda complementaria) (2212-
2600) plásmido linearizado con Stu-I C.D. Quinn (St. Louis Univertsity, St. Louis 
MO) (Quinn y cols., 1990). Gelatinasa A humana (MMP-2), cONA de 1108 pb 
(sonda complementaria), plásmido linearizado con EcoR-1. G.1. Goldberg 
(Washington University, St. Louis MO) (Collier y cols., 1988). Colagenasa de rata 
(MMP-13), cONA de 800 pb (sonda no complementaria), plásmido linearizado con 
Sac 1. estromelisina 1 de rata (MMP-3), cONA de 492 pb (sonda complementaria), 
plásmido linearizado con Sac 1. L.M. Matrisian (Vanderbilt University, Nashville, 
TEN) (Quinn y cols., 1990). Estromelisina 2 de rata (MMP-10), cONA de 700 pb 
(sonda complementaria), plásmido linearizado con Sac 1. L.M. Matrisian 
(Vanderbilt University, Nashville, TEN) (Quinn y cols., 1990). TIMP-1 de ratón, 
cONA de 800 pb (sonda complementaria), plásmido linearizado con Kpn-I O.R. 
Edwards (Calgary University, Calgary, Alberta, Canada) (Leco y cols., 1992). 
TIMP-2 de ratón, cONA de 700 pb (sonda complementaria), plásmido linearizado 
con Hind-III. O.R. Edwards (Calgary University, Calgary, Alberta, Canada (Leco y 
cols., 1992). Además se empleó como control negativo el transcrito obtenido a 
partir del cONA de luciferasa en pGEM (Life Tech, Gibco BRL, Gaithersburg, MO), 
inserto de 1750 pb linearizado con Hind 111. 
Los templetes linearizados, se purificaron por extracción con fenol-cloroformo y 
precipitación con etanol. Los transcritos marcados con digoxigenina (no comple-
mentarios y complementarios) se obtuvieron por transcripción in vitro a partir de 
52 
5~g cONA específico, digoxigenina acoplada a trifosfato de uridina (Boehringer 
Mannheim, Mannheim, Germany) y RNA polimerasas SP6, T3 y T7 (Boehringer). 
Las muestras se desproteinizaron (proteinasa K al 0.001 % en Tris 0.05 M, pH 8.0) 
(Sigma Chemical Co, St. Louis MO) y acetilaron (solución de trietanolamina 0.1 M 
pH 8.0, anhídrido acético 1.25 ml/500 mi de solución, 10 min.). Posteriormente se 
colocaron en solución de equilibrio (formamida desionizada al 50%, NaCI 0.6 M, 
EOTA 1.0 mM pH 8.0, heparina 50 J,Jg/ml, ditiotreitol 10 mM, Tris -HCI 10 mM pH 
7.5 durante 10 min, se prehibridaron durante 1 hora todos a Tamb. Finalmente se 
hibridaron con los transcritos específicos (RNA-digoxigenina, 500-1000 ng/ml de 
solución) incorporados a la solución de prehibridación (formamida desionizada 50 
0/0, solución salina de citrato (SSC)2X, solución de Oenhardt's 1 X ONA de esperma 
de salmón 0.5 mg/ml, RNA de transferencia de levadura 0.25 mg/ml, sulfato de 
dextran al 10 %, volumen final 9.95 mi) durante 24 hrs a 42° C. Al cabo de la 
incubación las laminillas se lavaron con SSC 2X y SSC 1X (1 hora cada uno ambos 
a Tamb), seguidos de 2 lavados con SSC 0.5X (30 min a 37° C y Tamb 
respectivamente) . 
Para revelar la reacción de hibridación las laminillas se preincubaron 1 hora en 
Buffer I (Tris-HCI 100 mM, NaCI 150 mM, ajustar a pH 7.5), adicionado de suero 
normal de borrego al 20/0 y tritón X-100 al 0.3%, a Tamb y se incubaron 24 hrs a 4° 
C con anticuerpo policlonal de cabra anti-digoxigenina acoplado a fosfatasa 
alcalina (Boehringer Mannheim. Germany). La reacción se desarrolló incubando 
las laminillas de 2 a 24 hrs con la solución de sustrato (Hillan, 1992). Las sondas 
53 
control negativo empleadas fueron transcritos no complementarios específicos 
(MMP-2, MMP-3, MMP-13, Y TIMP-2) marcados con digoxigenina. Se usaron 
cortes de útero post parto y cultivos de HSCs. Finalmente, las laminillas se 
contratiñeron con eosina Y acuosa. 
Inmunohistoquímica 
Con la finalidad de determinar la expresión de las proteínas codificadas por los 
RNAm demostrados por hibridación in situ, tanto en cultivos primarios (4 días) 
como en cortes histológicos embebidos en parafina, se llevó a cabo una técnica de 
tinción indirecta, usando anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra 
MMP-2, MMP-3, MMP-13, TIMP-1, Y TIMP-2 (Oncogene™Research Products, 
Boston,MA). Como control negativo se usó anticuerpo monoclonal dirigido contra 
glucosa oxidasa de Aspergillus niger (lgG1) (Dako, Denmark, clone DAK-G01). El 
anticuerpo secundario empleado, fue IgG1 de cabra anti-lgG de ratón (Dako, Den-
mark) acoplado a fosfatasa alcalina. 
Para generar la acumulación de proteínas en el citoplasma de las células, antes 
de fijar las muestras con PFA al 4% (células y tejidos frescos), se incubaron 
durante 4 a 7 hrs con monensina 5 Jlmll (sal sódica, Sigma Chemical, St. Louis 
MO), el cual es un inhibidor clásico del transporte de proteínas en el sistema 
Golgi/retículo endoplásmico (G/RE) (Okada, 2001, Hunter-Lavin y cols., 2004) en 
medio Williams-E con suero, a 37 o C en atmósfera húmeda y 50/0 de CO2. 
Para mejorar la inmunoreactividad de las muestras (Shi y cols., 1996, Komüves y 
cols., 2000) antes de la tinción , todas las muestras se sumergieron en solución 
54 
Electroforésis de Sobrenadantes de Cultivo en Gel de Acrilamida al 8% 
97 kDa 
66 kDa 
45 kDa 
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 
Figura 3 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 8 % de medios de cultivo (8 días).de: 1. macró-
fagos de ratón; 2. fibroblastos de rata; 3. albúmina sérica de rata (control); 4. hepatocitos del grupo 
111 (aceite de olivo); 5. hepatocitos del grupo I (cirróticos); 6) hepatocitos del grupo 11 (recuperación); 
7) hepatocitos del grupo IV (normal); 8) albúmina sé rica bovina (control). Se inyectó la misma 
cantidad de proteína total. Tinción azul de Coomassie.Las suspensiones de células hepáticas y los cultivos primarios 
derivados de éstas, no presentaron contaminación de MF, y su 
contenido de HSCs fue muy bajo. 
La citometría de flujo de células frescas aisladas de ratas normales y cirróticas nos 
indicó la presencia de 1.6 y 2.12% de células desmina positivas (HSCs) respecti-
vamente. Estos porcentajes se incrementaron a 2.5 y 5.9% a los 8 días de cultivo. 
Los datos representan el promedio de 2 experimentos para cada caso. La 
proporción de células desmina positivas, no fue determinada en otros grupos debi-
do a que comparativamente, sólo los cultivos provenientes de animales cirróticos 
tuvieron actividad colagenolítica significativamente diferente (p=O.023). La 
58 
búsqueda de fibulina-2 por western blot en los sobrenadantes de cultivo primario 
de hepatocitos fue negativa (dato no mostrado), indicándonos que en los sobre-
nadantes de cultivo, no hay contribución de proteínas secretadas por MF. 
La determinación de la actividad enzimática de los sobrenadantes 
de cultivo nos confirmó que las MMPs fueron secretadas por las 
células que constituyen los cultivos. 
Actividad colagenolítica 
La figura 4 muestra la gráfica obtenida con los valores de actividad colagenolítica 
determinados por los niveles de degradación de colágena radiactiva producidos 
por los sobrenadantes de cultivo primario de células hepáticas de cada grupo, al 
cabo de 8 días de cultivo. 
Es aparente que los niveles de actividad colagenolítica en los sobrenadantes de 
cultivo del grupo I (cirróticos) fueron significativamente más altos que aquellos 
encontrados en los sobrenadantes de los otros grupos. (p = 0.023). 
La actividad colagenolítica decrece significativamente al adicionar inhibidores 
específicos, como la 1,1 O-orto-fenantrolina y el EDTA. 
El patrón de degradación de la colágena radioactiva empleada como sustrato se 
muestra en la figura 5, en ella podemos observar en el carril 2 las bandas 
correspondientes a las subunidades estructurales (a1 y a 2) de la colágena tipo I 
empleada en la reacción. 
59 
2S0 
p= 0.023 
-ca 200 e 
'¡ .. o • Ortofenantrolina ... a. 
Q) a EDTA 
" O) ISO ~ Control 
:::l 
EH APMA -E 
B APMA+Orto a. 
~ t!J APMA+ EDTA 
ca 
.~ 100 
~ 
U 
Q) 
a. 
en 
W 
" ca so :2 
> 
+J 
U 
<C 
o 
Grupo I Grupo 11 Grupo 111 Grupo IV 
Figura 4. La actividad de colagenasa exhibida por los sobrenadantes de cultivo nos indica, que la 
acción de la proteasa, se incrementa significativamente en los animales cirróticos. 50 111 de 
sobrenadante + 100 111 de colágena tritiada, tratados con 45 111 de diversos reactivos (activador 
(APMA) y/o inhibidores (EDTA y ortofenantrolina) y se incubaron 18 hrs. a 30°C. Las barras son el 
promedio de siete cultivos. Los valores corresponden a la media de la desviación estándar de la 
actividad específica obtenida. Solamente el grupo I (cirrosis) mostró una diferencia estadística-
mente significativa (p=0.023) con respecto a los otros 
grupos. 
Figura 5 Patrón de degradación de la actividad 
colagenolítica de los medios condicionados de cultivo 
primario de hepatocitos del grupo I con 8 días de cultivo. 
Carril 1 medio de cultivo tratado con APMA. Carril 2 medio 
tratado con APMA + EDT A. No se observan productos de 
degradación de la colágena en el carril 1 lo que nos sugiere 
la presencia de otras proteasas en el medio, El carril 2 
muestra la inhibición de la actividad, debida a la presencia 
de EDT A Y a que se han preservado las subunidades de 
normales de la colágena. En paralelo fue corrido medio de 
cultivo por lo que se puede indicar con SN algunas de las 
bandas que corresponden solo al sobrenadante. 
60 
Zimogramas 
Los zimogramas de gelatina de los mismos medios de cultivo condicionados (7 por 
grupo) mostraron patrones de actividad gelatinolítica similares a los exhibidos por 
los sobrenadantes de fibroblastos de rata y macrófagos de ratón (Fig. 6 Y 7) los 
cuales presentan actividad de gelatinasa A y gelatinasa B respectivamente. La 
actividad proteolítica fue activada por APMA (carriles B, O, F, Y H) e inhibida 
completamente por EDTA (geles paralelos, no mostrados) . En todos los grupos el 
tratamiento con APMA hizo que el peso molecular de la proteína activa fuera 
menor (carriles B, O, F Y H) con respecto al de su respectiva pro enzima (carriles 
A, e, E, y G) figura 7. 
Los zimogramas de caseína mostraron diversas bandas proteolíticas a los 66 y 72 
kDa en todos los medios de cultivo condicionado (figura 8) las cuales 
probablemente correspondían a estromelisina, ya que éstas desaparecieron 
cuando el gel se incubó con EDTA 0.05M. 
Los medios de cultivo condicionado correspondientes a los grupos I y 111, 
presentaron dos bandas de actividad proteolítica adicionales (106 Y 49.5 kDa) que 
95kOa 
72kDa 
PM FR MR Grupo 111 Grupo I Grupo 11 Grupo IV 
Figura 6 Degradación de 
proteína de sobrenadantes 
de cultivo primario de célu-
las. Zimograma de gelati-
na. De izquierda a dere-
cha: fibroblastos de rata; 
macrófagos de ratón; he-
patocitos grupo 111; hepato-
citos grupo 1; hepatocitos 
grupo 11; hepatocitos grupo 
IV. La concentración de 
proteína es equivalente en 
todos los grupos. 
61 
no desaparecieron en presencia de EDTA y que fueron inhibidas al ser tratadas 
adicionalmente con E-64 1.0 mM, benzamidina 1.0 mM y/o fenilmetilsulfonil-
fluoruro (PMSF) 1.0 mM. 
FR MR A B e D E F G H 
Figura 7 Efecto del APMA (activador) sobre las enzimas con actividad gelatinolítica de los cuatro 
grupos estudiados. Los carriles A, C, E, y G, corresponden a la actividad de los sobrenadantes 
mostrados en la figura 6. Los carriles B, D, F, Y H, indican el cambio en el patrón electroforético de 
las proteasas activadas, el cual produce bandas con una migración mayor, lo que nos habla de la 
pérdida del propéptido y la consecuente disminución del peso molecular de las gelatinasas activas. 
Figura 8 Actividad proteolítica sobre caseína, que nos indica la actividad de la MMP-3. L o s 
c a r r i I e s (2 , 4, 6, 8) c o r r e s pon den a los sobrenadantes t r a t a d o s con APMA 
(activador), en esta prueba es muy aparente la similitud en el patrón enzimático producido por los 
grupo IV (normales). 
hepatocitos de ani-
males tratados con 
CCI4 y los que no 
tuvieron contacto 
con el tóxico. 
Carriles y 2 
sobrenadante de 
hepatocitos grupo 
111 (aceite de olivo); 
carriles 3 y 4 
grupo I (cirróticos); 
carriles 5 y 6 
grupo 11 
(recuperación); 
carriles 7 y 8 
62 
Los transcritos de RNA presentes en las células aisladas, nos 
indican que los hepatocitos son capaces de sintetizar los 
mensajeros específicos para las MMPs. 
A partir de RNA total de hígado completo de animales pertenecientes a los 4 
grupos, y de hepatocitos aislados de los grupos III y IV, se obtuvieron los cONA de 
las MMPs. Los patrones electroforéticos, de estos productos de RT -peR, se 
muestran en la figura 9, que corresponden a: a). estromelisina-1 (MMP-3, 317 pb) 
y colagenasa de rata (MMP-13, 324 pb): y b). estromelisina-2 (MMP-10, 307 pb) Y 
gelatinasa A (MMP-2, 309 pb). Se produjeron resultados similares tanto para 
TIMP-1 como para TIMP-2 (datos no mostrados). 
El tamaño de las copias fue el esperado (ver tabla 7), y las secuencias obtenidas 
corresponden a los genes que codifican para las MMPs y TIMPs con 
Figura 9 Patrón electroforético en gel de agarosa al 2.5% de los cONA de: a) MMP-3 (317 pb) Y 
MMP-13 (324 pb); b) MMP-10 (307 pb) Y MMP-2 (324pb). producidos a partir del RNA total extraído 
de fragmentos de hígado de rata(carriles 1-4), y de hepatocitos frescos (carriles 5 y 6). El carril 7 
del gel lb' corresponde al cONA producido a partir de RNA total de útero de rata post-parto. Carriles 
1 y 5, ratas del grupo IV; carriles 2 y 6, ratas del grupo 111; carril 3; ratas del grupo 1; carril 4, ratas 
del grupo 11. 
63 
Una homología que fluctúa entre el 96 y 100% , con respecto a los genes 
reportados en la literatura para Rattus norvegicus (Altschul