Importancia-de-las-celulas-NK-NKT-y-T-reguladoras-en-transplante-alogenico-de-celulas-hematopoyeticas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DIVISION DE POSGRADO 
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL 
U.M.A.E. ESPECIALIDADES “DR. ANTONIO FRAGA MOURET” 
CENTRO MÉDICO NACIONAL, LA RAZA. 
 
 
 
 
 
 
 
“Importancia de las células NK, NKT y T reguladoras en 
trasplante alogénico de células hematopoyéticas”. 
 
 
TESIS  PARA  OBTENER  EL  GRADO  DE  ESPECIALIZACION  EN  
HEMATÓLOGIA PRESENTA: 
 
 
 
 
 CAROLINA GARCIA CASTILLO 
 
 
 
 
Asesor :  Dr. Jorge Vela Ojeda 
 
México, D.F.                2008 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Dr. Jesús Arenas Osuna 
División de Educación en Salud 
 
 
 
 
Dr. Jorge Vela Ojeda 
Titular del Curso Universitario 
 
 
 
 
 
 
Dra. Carolina García Castillo 
R4 Hematología. 
 
 
No. Protocolo 
 
 
 
 
Indice 
 
Antecedentes científicos………………………………………………………...…..5 
Justificación……………………………………………………………….………….9 
Planteamiento del problema……………………………………………………….10 
Objetivos generales…………………………………………………………………11 
Hipótesis……………………………………………………………………………..12 
Material y métodos………………………………………………………………....13 
Resultados…………………………………………………………………………..20 
Discusión.........................................................................................................44 
Conclusiones...................................................................................................47 
Referencias bibliográficas…………………………………………………………48 
Anexos …………………………………………………………………………..….52 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen 
Título: “Importancia de las células NK, NKT y T reguladoras en trasplante alogénico de células 
hematopoyéticas”. 
Objetivos: Evaluar la movilización de células NK, NKT y Tregs en el donador, estudiar el valor 
pronóstico de la cifra de células NK, NKT y Tregs y evaluar la reconstitución inmune en 
pacientes sometidos a alotrasplante. 
Material y métodos. Diseño: Se incluyeron 13 pacientes con enfermedades hematológicas 
sometidos a alotrasplante entre Septiembre de 2006 y Mayo de 2007. Los donadores fueron 
movilizados con filgrastim y se les tomaron muestras basales, 4 y 5 días después de filgrastim. 
Se tomaron muestras los días 0, 30, 100 y 180. Por citometría de flujo se determinó la cantidad 
de células nucleadas, CD34+ y subvariedades de linfocitos. 
Análisis estadístico: T pareada, rango logarítmico y curvas de Kaplan-Meier. 
Resultados: Se movilizaron células T. Siete de los 13 pacientes (54%) presentaron EICHa. 
Cinco (38%) desarrollaron EICHc. La mediana de células Tregs infundidas fue de 4.9 x(10)6/L. 
Existió una correlación directa entre la cantidad de células infundidas y el desarrollo de EICH, 
para algunos subtipos de células Tregs. En cuanto a las células NKT infundidas, hubo una 
correlación inversa con el desarrollo de EICHc. Con excepción de Tregs, los subgrupos de 
linfocitos se reconstituyeron al día 180. 
Conclusiones: Filgrastim moviliza células T a sangre periférica. Hay una correlación directa 
entre la dosis de Tregs y el desarrollo de EICH. La reconstitución inmune ocurre al día 180, con 
excepción de células Tregs. 
Palabras clave: Células NK, NK/T y Tregs. 
 
 
 
 
 
Abstract 
Title: “Clinical relevance of NK, NKT and regulatory T cells in allogeneic stem cell 
transplantation (ASCT)”. 
Purpose: To asses if NK, NKT and Tregs are mobilized to peripheral blood; to study the 
prognostic significance of NK, NKT and Tregs cells in relation to the dose received, and to 
asses the immune reconstitution after ASCT. 
Patients and methodos: Between September 2006 and May 2007, 13 patients with 
hematological diseases were enrolled. Donors were mobilized with filgrastim. Blood samples 
were collected before filgrastim and after 4 and 5 days of treatment, as well as from the 
apheresis products. Patient’s samples were obtained on days 0, 30, 100 and 180 after 
transplant. Flow cytometry was done in all samples to determine the CD34+ cells and 
lymphocyte subsets content. 
Statystical analysis: Paired T test, log-rank test, and Kaplan-Meier curves. 
Results: T cells were mobilized with filgrastim. Seven of 13 patients (54%) developed aGVHD 
and five (38%) cGVHD. The median dose of Tregs infused was 4.9 x(10)6/L. A direct correlation 
between the infused Tregs cell count and development of GVHD was observed. An inverse 
correlation was observed between NKT cell dose infused and cGVHD. With the exception of 
Tregs, almost all lymphocyte subsets were reconstituted at day 180 
Conclusions: T cells were mobilized to peripheral blood. There is a direct correlation between 
the Tregs dose and development of GHVD. The immune reconstitution was completed at day 
180 after transplant, with the exception of Tregs cells. 
Key words: T, NK, NK/T, Tregs cells. 
 
 
 
 
Antecedentes científicos: 
 El Trasplante Alogénico de Células Hematopoyéticas (TACH) es una 
terapia curativa para un número creciente de enfermedades hemato-
oncológicas que ponen en peligro la vida. A la fecha, más de 30,000 
trasplantes están siendo realizados mundialmente cada año [1]. 
 El pronóstico de un paciente quien ha recibido un TACH, es determinado 
por varios factores que incluyen el estado clínico del paciente, la toxicidad 
del régimen de acondicionamiento, el éxito del injerto, la duración de la 
inmunosupresión, el desarrollo de Enfermedad Injerto Contra Huésped 
(EICH), y la recaída de la neoplasia, lo cuál se asocia, entre otras cosas, 
con la fuerza del efecto Injerto Contra Tumor (ICT) [2]. 
 Las células T aloreactivas contenidas en el injerto, tienen un papel central 
en EICH, efecto ICT y velocidad del injerto; esas células también son 
capaces de “limpiar” la médula ósea del receptor y atacar a las células del 
huésped que, de otro modo, podrían iniciar aloreacciones contra las células 
madre del donador. 
 La eliminación de las células residuales tumorales, podría también ser 
atribuida a esas células, que destruyen a las células tumorales alogénicas, 
debido a que expresan el mismo blanco del antígeno leucocitario de 
histocompatibilidad (HLA) clase I que las células sanas del paciente [3]. 
 Una demostración directa de que los linfocitos del donador son capaces 
de prevenir el crecimiento tumoral en el receptor, es probada por la 
capacidad de la infusión de linfocitos del donador de inducir remisión en 
pacientes con Leucemia Mieloide Crónica (LMC) que recaen después de un 
TCH [4]. 
 Durante el TACH, el paciente es infundido con una preparación de células 
obtenidas del donador, que no contiene únicamente células madre 
hematopoyéticas (CMH), sino también, una gran variedad de subgrupos 
linfocitarios diferentes tales como Natural Killer (NK), Natural Killer T (NKT), 
células dendríticas y células T reguladoras (Tregs) [5]. 
 Durante la última década, el uso de sangre periférica como una fuente de 
CMH para TACH, se ha incrementado considerablemente [6,7]. Durante el 
proceso conocido como movilización, la administración de G-CSF favorece 
la migración de los progenitores linfo-hematopoyéticos a la sangre 
periférica. Las células tallo expresan en su superficie el marcador CD34+. 
 Esta fuente de aloinjerto puede contener hasta 10 veces más células 
CD3+, 50 veces más células CD14+, y19 veces más células CD56+ que los 
injertos de médula ósea. 
 Ese hecho, parece afectar el injerto, el desarrollo de EICH, el efecto ICT, y 
probablemente incluso la supervivencia [8,9]. 
 Consecuentemente, es muy importante conocer, como ha sido el caso 
para las células CD34+, si la dosis de esas células juega algún papel en el 
resultado clínico de pacientes tratados con TACH. 
 El subgrupo de células NK CD16+ CD56deb, ejerce una función citolítica 
potente in vitro, con un potencial proliferativo y productor de citocinas bajo. 
En contraste, el subgrupo CD16deb CD56bri ejerce actividad citolítica leve, 
prolifera más vigorosamente en respuesta a citocinas tales como IL-2, y 
secreta citocinas inflamatorias [10]. 
 Las células NKT coexpresan en el humano, una cadena invariante del 
Receptor de Células T (TCR) alfa (Valfa24Jalfa15) y TCR Vbeta11. 
 Esas células tienen potente actividad supresora y antitumoral, debido a 
que producen citocinas como IL-4, IL-10, IL-13, e IFN gamma, lo cuál inicia 
una respuesta Th1 o Th2 [11]. 
 La capacidad de las células NKT para suprimir EICH ha sido demostrada 
en modelos murinos de trasplante de médula ósea (TMO). Este fenómeno 
es dependiente de citocinas supresoras tales como IL-4 [12]. 
 El poder de las células NKT para destruir tumores es mediado por 
exocitosis de gránulos (perforina, interacciones Fas-FasL, TNF y TRAIL) 
[13, 14]. 
 La producción de citocinas Th1 por esas células, tales como IL-2, e IFN 
gamma, resulta en la activación de otras células antitumorales importantes 
como NK, CD4+, CD8+, células B, neutrófilos, macrófagos y células 
dendríticas. Se ha demostrado que las células NKT son capaces de lisar 
células tumorales de diferentes neoplasias hematológicas tales como 
leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia granulocítica crónica (LGC) [15]. 
 En modelos murinos de TACH, Baker y cols, demostraron que la infusión 
de células CD8+NKT a una dosis de 2-5 x 107, resultó en supervivencia 
prolongada, sin riesgo de desarrollar EICH, en comparación a los ratones 
que no la recibieron [16]. 
 Nuestro grupo ha demostrado que la dosis de células NKT contenida en el 
aloinjerto, es un factor pronóstico independiente para supervivencia libre de 
enfermedad (SLE) y supervivencia global (SG). Los pacientes que 
recibieron < 1.5 x 107/kg de células NKT tuvieron mejor supervivencia [17]. 
 
 Las células Tregs suprimen la respuesta inmune a aloantígenos. La 
circulación in vivo y la localización tisular de Tregs durante una respuesta 
inmune adaptativa no es clara. La inflamación inducida por irradiación o 
aloinjerto conduce a reducción paralela de la proliferación de células T 
efectoras en órganos linfoides y tejidos periféricos. El trasplante de Tregs 
confiere protección a largo plazo desde estímulos inflamatorios sistémicos. La 
supresión ocurre durante fases multipasos de la inflamación, pero es óptima en 
la fase inicial, proporcionando protección contra la EICH mientras mantiene el 
efecto injerto contra tumor incluso con dosis fisiológicas de Tregs debido a su 
expansión in vivo [18]. 
La respuesta inmunológica posterior al TCH se caracteriza por ser deficiente 
con una duración y gravedad variable según la manipulación del injerto, el tipo 
de trasplante, desarrollo de EICH y nivel de actividad tímica residual. 
 Las dosis escalonadas de quimioterapia citorreductora utilizadas en el 
trasplante alogénico de células tallo periféricas resultan en profunda 
perturbación de la respuesta inmune. Mientras una recuperación más temprana 
de la inmunidad innata (serie mieloide y NK) resulta en reconstitución de la 
inmunidad protectora contra muchos agentes bacterianos, los niveles absolutos 
de la función de los linfocitos T y B permanecen anormales por varios meses 
resultando en susceptibilidad prolongada a patógenos virales. 
 La reconstitución de estas células parece derivar de células de diferente 
origen. Se considera que puede ser secundaria a la expansión de linfocitos 
maduros infundidos, linfocitos T residuales que han sobrevivido a la 
quimioterapia de acondicionamiento y al desarrollo de células T nativas 
dependientes e independientes del timo [17]. 
Justificación: 
 La EICH se presenta en 50 a 60% de los pacientes sometidos a 
alotrasplante, y de ellos 12 a 15% presentan EICH grave, la mayoría de 
estos últimos, desafortunadamente fallece por complicaciones infecciosas. 
 La EICH es el resultado de la interacción de células T inmunológicamente 
competentes derivadas del donante con los antígenos tisulares del receptor. 
Esta entidad puede afectar la piel, el tracto gastrointestinal y el hígado. 
 En la actualidad la EICH constituye el mayor problema después de que se 
realiza un TCH alogénico. 
 Además, aquellos pacientes que no fallecen por complicaciones de la 
EICH, suponen un impresionante costo hospitalario, debido a aumento de 
días de estancia hospitalaria, antibióticos, uso de G-CSF, transfusiones, 
inmunosupresores, etc. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Objetivos generales: 
a. Evaluar la movilización de las células NK, NKT y Tregs en un donador 
sano después de aplicación de G-CSF. 
b. Estudiar el valor pronóstico de la cifra de células NK, NKT y Tregs en 
pacientes sometidos a trasplante alogénico. 
c. Evaluar la reconstitución inmune de los pacientes trasplantados. 
 
Objetivos específicos: 
a. Cuantificar por citometría de flujo a las células NK, NKT y Tregs en 
donador sano (basal). 
b. Cuantificar las mismas células en el donador después de cinco días de 
haber recibido G-CSF a 10 mcg/kg. 
c. Correlacionar la cantidad de células con la presencia de EICH. 
d. Correlacionar la cantidad de células con la SLE. 
e. Correlacionar la cantidad de células con la SG. 
f. Estudiar la reconstitución inmune celular después del trasplante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Material y métodos: 
a. Equipo 
- Analizador automático para citometría hemática modelo Cell Dyn 3000 marca 
Abbott. 
- Citómetro de flujo modelo “FACScalibur” de Becton Dickinson utilizando el 
programa de “Cell Quest Pro”, versión 3.2.1 “apple system” 7.6.1 y el programa 
para CBA (Cytometric Bead Array). 
b. Anticuerpos. 
- NK. CD3-, CD16+, CD56+. 
- NKT (invariantes). CD3+, CD16+, CD56+. Valfa24 y Vbeta11. 
- Tregs. CD4+, CD25bri (FoxP3). 
- Control de isotipo: 
 . CD45 acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC). 
 . CD34 acoplado a ficoeritrina (PE). 
 . CD19 acoplado a PE. 
 . CD3 acoplado a PerCP. 
 . CD4 acoplado a FITC. 
 . CD8 acoplado a PE. 
 . CD25 acoplado a PE. 
 . CD62L acoplado a PE. 
 . FoxP3 acoplado a PE. 
 . Valfa24 acoplado a PE. 
 . Vbeta11 acoplado a PE. 
 . CD16+CD56+ acoplados a PE. 
 . Células leucémicas como control “positivo” de CD34. 
 . Perlas calibradoras. 
 Se utilizaron 1 x 106 células mononucleares obtenidas de las bolsas de 
cosecha y de las muestras obtenidas tanto del paciente como del donador. 
c. Material. 
- Tubos para el citómetro de flujo (Falcon 2052). 
- Tubos de plástico 12 X 75. 
- Tubo “vacutainer” tapón lila 12 X 75. 
- Papel “parafilm”. 
- Portaobjetos. 
- Pipetas automáticas de 1.0, 0.1, 0.05, 0.02 mL. 
- Puntas para pipetas automáticas. 
 d. Método: 
 Se incluyeron a todos los pacientes que completaron el protocolo de 
trasplante de médula ósea del servicio de hematología del Hospital de 
Especialidades del CMN “La Raza” y fueron aceptados por el Comité de 
Trasplante de Células Hematopoyéticas y tuvieran un donador relacionado. 
 Para la movilización, al donador se le administró Filgrastim a dosis de 10 
Mcg/kg/día x 5 días, iniciando 6 días previos al TACH. El día correspondiente a 
la 4ª. y 5ª. dosis se realizó aféresis de células tallo y se tomaron muestrastanto al donador como a las bolsas recolectadas. 
 El paciente a su ingreso inició quimioterapia de acondicionamiento con 
esquema BUCY (Busulfán/ciclofosfamida) ó Busulfán/Fludarabina. El esquema 
se eligió de acuerdo a las condiciones propias de cada paciente. Una vez 
completado el acondicionamiento se realizó la infusión de células tallo y se 
tomaron las muestras, como sigue: 
1. Basal de Sangre Periférica (SP) (al donador antes de recibir FEC-G). 
2. Día 4. (Al donador después de la 4a. dosis de FEC-G). 
3. Día 5. (Después de la 5a. dosis). 
4. Bolsa de aféresis 1. 
5. Bolsa de aféresis 2. 
 Posterior al trasplante en los días +30, +100 y + 180. 
 A partir de muestras de sangre periférica y de las bolsas de cosecha 
(provenientes de donadores sanos) se tomó una alícuota de 3 ml previa 
homogeneización y partiendo de este volumen, se realizaron las siguientes 
determinaciones: 
- Se cuantificaron las células nucleadas en el analizador automático para BH 
Cell Dyn 3000 (x106/mL). - Se realizó el análisis morfológico con la tinción de 
Wright para determinar la cantidad de células con morfología linfoide y su 
relación con la cantidad de células progenitoras hematopoyéticas por unidad. 
- Se ajustó la cantidad de células nucleadas a 1 x 106 /100 mL de PBS a partir 
de la cual se tomaron alícuotas de 150 µL para ser depositadas en los tubos de 
Falcon, posteriormente se determinó la cantidad de células positivas para 
TCRs por citometría de flujo para cada bolsa de cosecha. 
d. Criterios de inclusión. 
 - Septiembre de 2006 a Mayo de 2007 . 
- Pacientes con enfermedades onco-hematológicas en remisión completa. 
- Edad: 16 a 55 años. 
- Aceptados por el Comité de Trasplante de Células Hematopoyéticas. 
- Expectativa de vida > 3 meses. 
- Consentimiento informado. 
- Panel viral negativo a VIH, HB y C, y CMV. 
 e. Criterios de exclusión. 
- Recaída. 
- Deseo de abandonar el protocolo. 
- Embarazo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados 
 Se incluyeron a pacientes mayores de 17 años y menores de 49, la edad 
promedio al trasplante fue de 35 años, y la mediana de 32 (Tabla 1). 
Tabla 1 
Statistics
EDAD
13
0
34.62
32.00
10.28
17
49
Valid
Missing
N
Mean
Median
Std. Deviation
Minimum
Maximum
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Filgrastim logró movilizar células mononucleadas (Figura 1). 
 
 
Figura 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Los linfocitos totales mostraron una tendencia a movilizarse a sangre 
periférica con el empleo de filgrastim (Figura 2). 
Figura 2 
 
 
 Las células NK también tendieron a movilizarse a sangre periférica con el 
empleo de filgrastim (Figura 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 
 
 Las células Tregs (CD4+/CD62+) presentaron una discreta tendencia a 
movilizarse a sangre periférica (Figura 4). 
Figura 4 
 
 Se determinaron los días en que ocurrió el injerto de eritrocitos, neutrófilos y 
plaquetas; también la cantidad de los diferentes subtipos celulares infundidos. 
Los datos relacionados con el total de la dosis transfundida de las diferentes 
variedades celulares, se encuentran resumidos en la tabla 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2 
Statistics
9 4 11.0000 11.0000 6.8557 1.00 24.00
9 4 12.8889 15.0000 5.2068 1.00 20.00
9 4 11.22 11.00 8.33 1 28
12 1 380.0833 308.0000 214.8562 165.00 873.00
12 1 372.6667 335.4500 128.9378 142.00 609.60
12 1 35.3250 26.8000 22.2775 14.80 96.80
12 1 22.1333 6.2500 41.3001 .80 148.00
12 1 11.6771 4.9050 13.4316 .10 36.23
12 1 1.3153 1.0020 1.6137 .01 5.65
12 1 2.1668 .3508 6.2845 .02 22.10
12 1 12.6002 9.5150 16.7376 .02 61.28
7 6 .1921 7.500E-02 .3285 .00 .93
12 1 5.6100 6.0760 4.7996 .06 15.42
12 1 3.2733 2.9400 2.0387 1.15 7.19
INJ. ERIT.
INJ. NEUT.
INJ. PLAQ.
CNT
infundidas
Linfos totales
infundidos
NK totales
infundidas
NKT totales
infundidas
CD4-25 tot
infundidas
CD4 CD62L
tot infunfifo
CD62L CD25
tot infunfifo
CD4 FoxP3
total infundido
CD62L FoxP3
total infundido
FoxP3 CD25
total infundido
CD34
infundidas
Valid Missing
N
Mean Median Std. Deviation Minimum Maximum
 
 
 Se realizó un panel muy amplio de marcadores inmunofenotípicos, y se 
determinaron las diferentes variedades de cada subtipo de células Tregs. Se 
determinaron las cantidades de células nucleadas, linfocitos, células NK, NKT y 
Tregs tanto antes del trasplante, como a los días 100 y 180, los hallazgos más 
importantes se encuentran en la tabla 3. 
 
 
Statistics
7 0 2600.0000 2500.0000 848.5281 1800.00 4200.00
7 0 4957.1429 3500.0000 3252.1055 1400.00 9600.00
4 3 3200.0000 3350.0000 1485.4853 1300.00 4800.00
7 0 .3671 .3300 .1100 .22 .51
7 0 .3714 .3900 4.880E-02 .30 .43
4 3 .3100 .3450 .1192 .14 .41
7 0 922.8571 810.0000 317.3129 550.00 1504.00
7 0 1830.2857 1505.0000 1230.0299 546.00 3840.00
4 3 920.7500 930.5000 456.0975 416.00 1406.00
7 0 72.3794 60.1600 36.2900 32.00 140.62
7 0 274.1857 213.7000 300.7148 35.60 914.00
4 3 69.5250 47.5000 64.4526 20.00 163.10
7 0 21.2786 21.8700 18.1878 .55 45.40
7 0 70.7429 24.8000 136.9292 .00 380.00
4 3 15.8750 12.9000 15.8811 .80 36.90
7 0 48.4843 49.1400 32.7907 .66 91.50
7 0 108.6371 9.0000 135.8641 1.60 324.60
4 3 14.3825 12.9500 15.0317 1.23 30.40
7 0 20.1186 1.6300 41.4849 .04 112.75
7 0 1.4671 1.0000 1.3813 .30 3.90
4 3 6.0075 6.0000 5.7894 .23 11.80
7 0 7.1243 2.0700 12.9401 .04 36.00
7 0 2.0729 1.2000 2.6657 .30 7.80
4 3 5.6950 5.8500 5.4066 .23 10.85
7 0 62.0800 34.9000 74.4422 .13 200.00
7 0 52.9443 8.1000 97.2418 .45 266.80
4 3 3.7700 2.7500 3.9280 .28 9.30
3 4 1.3567 1.5200 1.2431 .04 2.51
6 1 2.1667 1.0000 2.8668 .27 7.77
3 4 67.9333 2.9000 113.5082 1.90 199.00
6 1 20.9883 13.5500 24.7629 .13 64.44
7 0 40.0943 2.8000 90.4735 .46 244.40
4 3 4.3200 2.7500 4.9749 .28 11.50
CNT basal
CNT día 100
CNT día 180
Linfocitos %
basal
Linfocitos %
día 100
Linfocitos %
día 180
Linfocitos
totales basal
Linfocitos
totales día
100
Linfocitos
totales día
180
NK basal
NK día 100
NK día 180
NKT basal
NKT día 100
NKT día 180
CD4 CD25
basal
CD4 CD25
día 100
CD4 CD25
día 180
CD4 CD62L
basal
CD4 CD62L
día 100
CD4 CD62L
día 180
CD62L CD25
Basal
CD62L CD25
día 100
CD62L CD25
día 180
CD4 FoxpP3
basal
CD4 FoxP3
día 100
CD4 FoxP3
día 180
CD62L FoxP3
basal
CD62L FoxP3
día 100
CD62L FoxP3
día 180
CD25 FoxP3
basal
CD25 FoxP3
día 100
CD25 FoxP3
día 180
Valid Missing
N
Mean Median Std. Deviation Minimum Maximum
 
 Se trasplantaron 13 pacientes, correspondiendo 10 (77%) al género 
masculino y 3 (23%) al femenino (Tabla 4) 
Tabla 4 
GENERO
10 76.9 76.9 76.9
3 23.1 23.1 100.0
13 100.0 100.0
1
2
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
 En cuanto al tipo de padecimiento, se incluyeron enfermedades 
oncológicas11/13 (85%) y no oncológicas 2/13 (15%). Dentro de las primeras, 
cinco pacientes tenían leucemia granulocítica crónica (38%), tres con leucemia 
mieloide aguda (23%), dos con linfoma no Hodgkin (15%), uno con síndrome 
mielodisplásico hipoplásico (8%). Dentro de las causas no oncológicas el 100% 
lo constituyó la Anemia Aplásica con dos pacientes (15% del total) (Tabla 5). 
Tabla 5 
ENF.
2 15.4 15.4 15.4
5 38.5 38.5 53.8
3 23.1 23.1 76.9
2 15.4 15.4 92.3
1 7.7 7.7 100.0
13 100.0 100.0
AAG
LGC
LMA
LNH
SMDh
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
 En cuanto al estado de la enfermedad al momento del trasplante, las 
características principales se resumen en la Tabla 6. 
 
 
 
 
Tabla 6 
EDO. ENF.
2 15.4 15.4 15.4
1 7.7 7.7 23.1
2 15.4 15.4 38.5
2 15.4 15.4 53.8
4 30.8 30.8 84.6
1 7.7 7.7 92.3
1 7.7 7.7 100.0
13 100.0 100.0
AAG
FB
FC
FC TEMP
RC
RP
SMDh
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
Abreviaturas: AAG: Anemia Aplásica Grave, FB: Fase Blástica, FC: Fase Crónica, FC TEMP: Fase Crónica 
Temprana, RC: Remisión Completa, RP: Remisión Parcial, SMDh: Síndrome Mielodisplásico hipoplásico.Con respecto a los regímenes de acondicionamiento, los más empleados 
fueron aquellos basados en busulfán (Tabla 7). 
Tabla 7 
ACOND.
4 30.8 30.8 30.8
5 38.5 38.5 69.2
1 7.7 7.7 76.9
1 7.7 7.7 84.6
2 15.4 15.4 100.0
13 100.0 100.0
BU-CY2
BU-FLU
CEAC
CY
GAL-CY
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
Abreviaturas: BU-CY2: Busulfán-Ciclofosfamida, BU-FLU: Busulfán-Fludarabina, CEAC: , CY: Ciclofosfamida, 
GAL-CY: Globulina Antilinfocito-Ciclofosfamida. 
 
 La profilaxis para EICH se basó principalmente en el empleo de Ciclosporina 
A (Tabla 8) 
 
 
 
Tabla 8 
PROF. EICH
3 23.1 23.1 23.1
6 46.2 46.2 69.2
3 23.1 23.1 92.3
1 7.7 7.7 100.0
13 100.0 100.0
CsA-MM
CsA-MTX
CsA
MM
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
Abreviaturas: CsA-MM: Ciclosporina A-Micofenolato de Mofetilo, CsA-MTX: Ciclosporina A-Metotrexate, CsA: 
Ciclosporina A, MM: Micofenolato de Mofetilo. 
 
 De los 13 pacientes, siete presentaron algún grado de EICH aguda (54%) y 
seis pacientes no la presentaron (Tabla 9). 
Tabla 9 
EICHA
4 30.8 30.8 30.8
1 7.7 7.7 38.5
1 7.7 7.7 46.2
1 7.7 7.7 53.8
6 46.2 46.2 100.0
13 100.0 100.0
CUTANEO
HEPATICO
IN, CU,HE
INT MUCOC
NO
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
Abreviaturas: IN: Intestinal, CU: Cutáneo, HE: Hepático, MUCOC: Mucocutáneo. 
 Con respecto a la Enfermedad Injerto Contra Huésped crónica, esta se 
presentó en grados variables en cinco de los trece pacientes (38%), y 62% 
de los pacientes no la desarrollaron (Tabla 10) 
 
 
 
 
 
Tabla 10 
EICHC
1 7.7 7.7 7.7
1 7.7 7.7 15.4
1 7.7 7.7 23.1
1 7.7 7.7 30.8
1 7.7 7.7 38.5
8 61.5 61.5 100.0
13 100.0 100.0
CRONEXT GIV
HE.GI.CU
HE.GI.CU IV
HEP. CUT.
HEPATICO
NO
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
Abreviaturas: CRONEXT GIV: Enfermedad injerto contra huésped Crónico Extenso Grado IV. HE: Hepático, GI: 
Gastrointestinal, CU: Cutáneo. 
 Seis de los trece pacientes (46%) desarrollaron algún proceso infeccioso 
(Tabla 11). 
Tabla 11 
INFECCIO
2 15.4 15.4 15.4
2 15.4 15.4 30.8
1 7.7 7.7 38.5
1 7.7 7.7 46.2
7 53.8 53.8 100.0
13 100.0 100.0
CANDIDIASIS
CATETER
NEUM. ATIP.
NEUMONIA
NO
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
 
 Diez de trece pacientes (77%) desarrollaron algún grado de mucositis siendo 
el grado I el más frecuente en cinco pacientes (38%) (Tabla 12). 
 
 
 
 
 
Tabla 12 
MUCOSITI
3 23.1 23.1 23.1
5 38.5 38.5 61.5
2 15.4 15.4 76.9
2 15.4 15.4 92.3
1 7.7 7.7 100.0
13 100.0 100.0
NO
SI
SI II
SI III
SI IV
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
 
 La cistitis se presentó en tres pacientes (23%) (Tabla 13). 
Tabla 13 
CISTITIS
10 76.9 76.9 76.9
3 23.1 23.1 100.0
13 100.0 100.0
NO
SI
Total
Valid
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
 
 
 La mediana de la Supervivencia Global de los 13 pacientes fue de 12 meses 
(Figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 
 
 A 12 pacientes se les determinó la cantidad de células Tregs infundidas, 
observando una media de 11.7 X 10(6)/L, una mediana de 4.9 X 10(6)/L, con 
una desviación estándar de 4.1. Al correlacionar la dosis infundida con la 
existencia o no de EICH aguda, se observó una relación directamente 
proporcional entre la cantidad de células infundidas y el desarrollo de EICH 
aguda (Figura 6). 
 
 
 
 
 
Figura 6 
 
 La determinación de células CD4+, CD62L (selectina)+, también observó el 
mismo patrón; es decir, los pacientes que desarrollaron EICH crónico, 
recibieron dosis mayores de estas células (Figura 7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7 
 
 La dosis de células CD4+/CD25+ (Tregs) fue mayor en los pacientes que 
desarrollaron EICH crónica que en los que no desarrollaron esta complicación 
(Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 
 
 En relación al desarrollo de EICH crónico, y la cantidad de células 
FoxP3/CD25+, se observó una relación directa con el número de células 
infundidas (Figura 9). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9 
 
 La misma relación directa se observó en relación a la dosis infundida de 
células CD25+/FoxP3+ y el desarrollo de EICH crónica (Figura 10). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10 
 
 La relación entre Tregs selectina+ y EICHa si siguió el patrón lógico 
esperado, es decir, a mayor número de Tregs infundidas, menor EICH, tanto en 
su forma aguda (Figura 11), como en su forma crónica (Figura 12). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12 
 
 
Sin embargo, con respecto a las células NKT infundidas, se observó una 
relación inversa entre la cantidad de células infundidas y el desarrollo de EICH 
crónica (Figura 13). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13 
 
 Con respecto a la reconstitución inmune, se observó un aumento no 
significativo en la cantidad de células nucleadas al día 100 y 180 con respecto 
del basal (Figura 14). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14 
 
 Las células NKT presentaron un aumento para el día 100, sin embargo, para 
el día 180, la reconstitución inmune era casi completa, con una cuenta de las 
mismas, discretamente inferior a la basal (Figura 15). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15 
 
 La reconstitución de las células Tregs CD4+/FoxP3+ no ocurrió, incluso en el 
día 180 después del trasplante, siguió un patrón descendente con respecto al 
tiempo, por lo menos hasta ese día (Figura 16). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16 
 
 La reconstitución inmune de los linfocitos fue completa al día 180, 
presentando un aumento significativo al día 100 (Figura 17). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Discusión 
 La correlación entre células Tregs y EICH aguda y crónica es directamente 
proporcional a la dosis infundida, igual como sucede en los primeros modelos 
de EICH en ratón. Recientemente la atención ha sido dirigida hacia Tregs y su 
potencial para atenuar EICH y autoinmunidad en modelos murinos, revisados 
en Bach, Shevach y Wood y Sakaguchi [19 y 20]. Las Tregs fenotípicamente se 
caracterizan por la coexpresión de CD4 y CD25, tanto en ratones, como en 
humanos, pueden inhibir la activación de células T autoreactivas en forma 
antígeno-específica, de una forma dependiente de contacto celular [21]. CD25 
también es expresado por células T recientemente activadas y es por lo tanto 
un marcador no confiable para Tregs. FOXP3, el cuál codifica un factor de 
transcripción también conocido como Scurfin, fue identificado como un gen 
regulador clave requerido para el desarrollo y actividad funcional de células 
Tregs [22]. A diferencia de CD25, FoxP3 es expresado exclusivamente por 
Tregs y no por células T activadas y es de tal manera un marcador molecular 
confiable para cuantificar Tregs en sangre periférica. Varios estudios han 
demostrado que las células Tregs suprimen EICH en modelos animales [23] 
 Tregs humanas y murinas comparten muchas características, pero en 
humanos, esos datos son conflictivos, posiblemente debido a diferencias en las 
técnicas de fenotipificación empleadas para caracterizar esas células. 
 En el presente estudio, se determinó la movilización celular con filgrastim en 
donadores sanos, así como la reconstitución inmune de los diferentes subtipos 
de células T reguladoras y se correlacionó la cantidad de células infundidas con 
algunas características clínicas relevantes. 
 Se incluyeron 13 pacientes, de los cuáles cinco (38%) desarrollaron algún 
grado de Enfermedad Injerto Contra Huésped. Esta alta incidencia es debida a 
que se consideraron todos los grados de EICH. 
 Seis pacientes (48%) presentaron algún proceso infeccioso, lo cuál es 
esperado dado que la mayoría de ellos fueron sometidos a regímenes de 
acondicionamiento mieloablativo. 
 Una complicación observada frecuentementefue la presencia de mucositis 
en diez pacientes (77%), esta incidencia alta, también se debió a la inclusión de 
mucositis grado I en 50% de los pacientes que la desarrollaron. 
 La mediana de supervivencia global al momento de realizar el análisis fue de 
12 meses, esto debido al poco tiempo de seguimiento del estudio. 
 Doce de los trece pacientes contaron con un panel inmunofenotípico amplio. 
 En este estudio se observó una relación directa entre la cantidad de células 
Tregs y el desarrollo de EICHa, lo cuál puede ser explicado por el pequeño 
tamaño de muestra, o porque existen diferentes subtipos de células Tregs, que 
podrían estar implicadas en procesos inmunoprotectores, o bien potenciadores 
de la respuesta inmune. De hecho la población CD4+CD25+ puede tener una 
gran cantidad de células T activadas, mas que reguladoras, por ello, para 
diferenciar las verdaderas células T con capacidad reguladora, se usa FoxP3 y 
otros marcadores. 
 Se observó también un patrón directamente proporcional entre el desarrollo 
de EICH y la cantidad de células Tregs selectina+ (CD4+/CD62L) y 
CD4+/CD25+, tanto para la forma aguda como para la crónica, y del subtipo de 
células Tregs FoxP3/CD25+ y EICH crónica, lo cuál podría sugerir que estos 
subtipos de células Tregs tienen un efecto estimulante para el desarrollo de 
EICH. 
 Las células Tregs con positividad para CD62L (selectina) son muy 
importantes, ya que selectina es necesaria para que los linfocitos Tregs viajen 
a los tejidos en donde existe un intenso fenómeno inflamatorio ocasionado por 
EICH. La cantidad de células NKT y CD62L/FoxP3, se comportaron como 
verdaderas células reguladoras de la respuesta inmune, pues se observó un 
patrón inversamente proporcional para el desarrollo de EICHc, por lo que estos 
subtipos celulares podrían ser los principalmente implicados en el efecto 
protector hacia los tejidos del receptor, lo cual concuerda con estudios previos 
y con el marco teórico del estudio. 
 La reconstitución inmune de los linfocitos T y las células NKT fue completa al 
día 180 del trasplante, sin embargo, en el caso de las células Tregs 
CD4+/FoxP3, no ocurrió por lo menos hasta el día 180 del trasplante, lo cuál 
podría indicar que los diferentes subtipos de células Tregs, tienen periodos 
diferentes de reconstitución y que posiblemente su maduración y selección en 
timo pueda ser mas retardada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Conclusiones 
 Existe una movilización adecuada de los diferentes subtipos celulares 
mediante la estimulación de un donador sano con FILGRASTIM. 
 La reconstitución inmune de los linfocitos T y de algunos subtipos de células 
Tregs es completa para el día 180. 
 Existen algunos subtipos de células Tregs que no presentan reconstitución 
inmune para el día 180 del trasplante. 
 En este estudio, dada la pequeña muestra estudiada no se puede concluir, 
pero la tendencia orienta a que existen subtipos de células Tregs que tienen 
efecto protector sobre el desarrollo de EICH tanto aguda como crónica y otros 
subtipos con efecto que favorece el desarrollo de esta complicación. 
 Las células NKT se comportan como reguladoras con respecto a EICH, al 
igual que las Tregs CD62L +. 
 Es necesario realizar un seguimiento más prolongado para determinar el 
tiempo de reconstitución inmune de todos los subtipos de células Tregs e incluir 
más pacientes para que los resultados tengan mayor consistencia. 
 
 
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Anexo 1. 
 
HEMATOLOGIA 
HOJA DE RECOLECCION DE DATOS 
PROTOCOLO 
“Importancia de las células NK, NK/T y T reguladoras en trasplante alogénico de 
células hematopoyéticas”. 
 
Nombre del paciente: 
 
Sexo: 
 
Edad : Número de filiación: 
Teléfono: Dirección: 
 
Nombre del donador: 
 
Pruebas de Histocompatibilidad 
 
Sexo del donador: Edad del donador: Fecha de la movilización: 
 
Dosis utilizada de Filgrastim: 
 
: 
Complicaciones durante la 
movilización: 
 
Cantidad de NK, NKT y Tregs 
movilizadas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 2 
 1
Estadios clínicos de la EICHa según los criterios de Glucksberg 
 
Organo I II III IV 
Piel Rash 
maculopapular 
<25% 
superficie 
corporal 
Rash 
maculopapular 
del 25 al 50% 
superficie 
corporal 
Eritrodermia 
generalizada 
Descamación 
y bulas 
Hígado Bilirrubina de 
2 a 3 mg/dL 
Bilirrubina de 
3 a 6 mg/dL 
Bilirrubina de 
6 a 15 mg/dL 
Bilirrubina 
>15 mg/dL 
Intestino Diarrea de 
500 a 1000 
ml/día 
Diarrea de 
1000 a 1500 
ml/día 
Diarrea 
>1500 ml/día 
Ileo doloroso 
 
Fuente: Glucksberg H. Store R, Fefer A. Clinical manifestation of graft versus host disease in human recipients of 
marrow from HLA-matched siblings donors. Transplantation. 1974; 18: 295-304. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2
Anexo 3 
Clasificación de EICHc 
 
Componente Puntos Medidas Evaluador 
Piel Rash 
eritematoso, 
esclerosis, 
úlceras o prurito 
% superficie 
corporal 
C 
Ojos Prueba de 
Shirmer bilateral 
sin anesthesia, 
síntomas 
Mm 
Escala 0-10 
C 
P 
Boca Eritema, 
hiperqueratosis, 
úlceras, síntomas 
Puntuación 0-15 P 
C 
Hematológico Plaquetas, 
eosinófilos 
Número/mcl, % C 
Gastrointestinal Síntomas 
esofágicos, 
diarrhea 
0-3 C 
Hígado Bilirrubina, ALT, 
fosfatasa alcalina 
Mg/dL, U/L C 
Pulmón Bronquiolitis 
obliterante 
FEV1 C 
Escala de 
síntomas 
30 puntos 0-100 P 
Actividad global Gravedad de los 
síntomas 
0-10 P/C 
 
Abreviaturas: ALT: Alanino amino transferasa, C: Evaluado por el clínico, FEV1: Volumen espiratorio forzado del primer 
segundo, P: Reportado por el paciente. 
 
 
 
 3
	Portada
	Índice
	Resumen
	Antecedentes
	Justificación
	Objetivos
	Material y Métodos
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	Referencias Bibliográficas
	Anexos