Induccion-de-la-reaccion-acrosomal-por-proteinas-recombinantes-de-la-zona-pelucida-en-humanos--papel-de-los-carbohidratos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
Facultad de Medicina 
 
 
 
 
INDUCCIÓN DE LA REACCIÓN ACROSOMAL POR 
PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE LA ZONA PELÚCIDA 
EN HUMANOS: PAPEL DE LOS CARBOHIDRATOS 
 
 
 
T E S I S 
 
que para obtener el grado de : 
 
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
(Biología Experimental) 
 
 
P r e s e n t a: 
 
Biól. María Elena González González Pacheco 
 
Directora de tesis: Dra. Mayel del Valle Chirinos Espín 
 
 
 
 
México, D.F. Mayo, 2007 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
Este proyecto de investigación fue apoyado por el Consejo Nacional de 
Ciencia y Tecnología (CONACyT 47011). Durante mis estudios de 
maestría gocé de una beca otorgada por CONACyT (No. de registro 
182399). 
 
 
 
 
 
 
El Comité Tutoral que supervisó el desarrollo de este trabajo de tesis 
estuvo integrado por: 
 
Dr. Fernando Larrea Gallo. 
Dr. Horacio Merchant Larios. 
Dra. Mayel del Valle Chirinos Espín. 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Al Departamento de Biología de la Reproducción del Instituto Nacional 
de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán las facilidades 
otorgadas para la realización de este trabajo de tesis. 
 
Al Dr. Fernando Larrea Gallo por la confianza y el apoyo proporcionados 
durante todos estos años. 
 
A la Dra. Mayel del Valle Chirinos Espín por el tiempo dedicado a la 
realización de este proyecto y a mi formación profesional. 
 
A Rodrigo, Myrna, Pathy y Analilia por compartir algo más que pipetas y 
gradillas mientras trabajamos juntos, gracias por ser tan buenos 
compañeros. 
 
A todos mis compañeros y amigos del laboratorio: Euclides, Lorenza, 
Rocío, Isabel, Elena y Angélica por tenderme la mano cuando lo he 
necesitado. 
 
A mis amigos Liz, David y Caro, compañeros de penas y alegrías, 
gracias por su amistad, por escucharme y por hacerme pasar ratos tan 
agradables. 
 
A Dios, por llenarme de bendiciones, entre ellas poder dedicarme a lo 
que amo. 
 
 
 
DEDICATORIAS 
 
A Gefú, por ser un ejemplo de superación y determinación. Tú me has 
enseñado a luchar por lo que se anhela. Gracias por todos estos años de 
amor y de sueños compartidos. 
 
A mis papás, por su amor y apoyo incondicional y por creer siempre en 
mí. 
 
A Naty y Fer, mis hermanos queridos, por su cariño y consejos, a su 
lado siempre me siento tranquila, contenta y reconfortada. También a la 
pequeña Ainhoa quien se ha convertido en una nueva ilusión en 
nuestras vidas y esperamos ansiosamente su llegada. 
 
INDICE 
 
RESUMEN.............................................................................................3 
ABSTRACT............................................................................................4 
ABREVIATURAS....................................................................................5 
1. INTRODUCCIÓN...............................................................................7 
1.1. Generalidades sobre la fecundación................................................7 
1.2. Generalidades sobre el espermatozoide...........................................8 
1.3. Capacitación espermática..............................................................9 
1.4. Reacción acrosomal....................................................................11 
1.4.1. Inducción de la reacción acrosomal..........................................13 
1.5. Estructura de la zona pelúcida......................................................15 
1.6. Síntesis de las proteínas de la zona pelúcida..................................17 
1.7. Clasificación de las proteínas de la zona pelúcida............................18 
1.8. Caracterización funcional de las familias de proteínas 
de la zona pelúcida.....................................................................20 
1.9. Glicosilación de las proteínas de la zona pelúcida............................22 
1.10. Papel de los carbohidratos de la zona pelúcida en la interacción 
entre gametos..........................................................................23 
2. OBJETIVOS.....................................................................................26 
3. MATERIAL Y MÉTODOS...................................................................27 
3.1. Material.....................................................................................27 
3.2. Material biológico........................................................................28 
3.3. Obtención de proteínas recombinantes...........................................28 
3.4. Electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 
y Western blot............................................................................29 
3.5. Purificación de proteínas recombinantes.........................................30 
3.6. Muestras de semen y capacitación espermática...............................31 
3.7. Inducción de la reacción acrosomal por 
las proteínas recombinantes.........................................................32 
3.8. Análisis de la reacción acrosomal...................................................32 
 
3.9. Análisis de los carbohidratos presentes en las 
proteínas recombinantes..............................................................33 
3.10. Lectin-histoquímica de tejido ovárico humano................................33 
3.11. Desglicosilación de las proteínas recombinantes.............................34 
3.12. Lectin blot................................................................................35 
3.13. Análisis estadístico.....................................................................35 
4. RESULTADOS..................................................................................36 
4.1. Obtención y purificación de proteínas recombinantes 
de la ZP humana........................................................................36 
4.2. Inducción de la reacción acrosomal por ZP2, ZP3 y ZP4....................39 
4.3. Identificación de los carbohidratos presentes en las 
proteínas ZP2, ZP3 y ZP4.............................................................41 
4.4. Carbohidratos presentes en cortes de tejido ovárico humano.............43 
4.5. Desglicosilación de las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4.............................44 
4.6. Análisis de reconocimiento por lectinas de 
las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4 desglicosiladas..................................46 
4.7. Inducción de la reacción acrosomal por las proteínas 
ZP2, ZP3 y ZP4 desglicosiladas.....................................................48 
5. DISCUSIÓN....................................................................................49 
6. CONCLUSIONES..............................................................................57 
7. ANEXOS..........................................................................................58 
Anexo 1.........................................................................................58 
Anexo 2.........................................................................................59 
8. BIBLIOGRAFÍA...............................................................................60 
9. PRODUCCIÓNCIENTÍFICA GENERADA 
DURANTE ESTE TRABAJO DE TESIS.................................................70 
 
 
ABREVIATURAS 
β-gal β-galactosa 
BCA Ácido bincinconínico 
BSA Albúmina sérica bovina 
Ca2+ Calcio 
CaI Ionóforo de calcio 
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementario 
CHO Ovario de hámster chino 
DAB 3,3’-diaminobencidina 
DE Desviación estándar 
EE Error estándar 
FITC Isotiocianato de fluoresceína 
FIV Fertilización in vitro 
Galβ1-3NAcGal β−gal-(1-3)N-acetilgalactosidasa 
HRP Peroxidasa de rábano 
HSA Albúmina sérica humana 
INCMNSZ Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador 
Zubirán 
kDa Kilo daltones 
mHTF Modified human tubal fluid 
mRNA Ácido ribonucléico mensajero 
N Nitrógeno 
NAcGal N-acetilgalactosamina 
NAcGlc N-acetilglucosamina 
Ni-NTA Níquel-ácido nitrilotriacético 
nm Nanómetros 
O Oxígeno 
OPD Ortofenilendiamina 
PA-1 Teratocarcinoma de ovario humano 
PBS Solución amortiguadora de fosfatos 
PSA Aglutinina de Pisum sativum 
PVDF Polvinildifluorido 
RA Reacción acrosomal 
rhZP Proteínas recombinantes de la zona pelúcida humana 
SWM Sperm washing media 
TBST Solución amortiguadora de tris 
TYB Test yolk buffer 
ZP Zona pelúcida 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
En mamíferos, el ovocito se encuentra rodeado por una matriz extracelular 
llamada zona pelúcida (ZP), la cual se localiza por debajo del cúmulo oóforo y 
por encima de la membrana plasmática del ovocito. Para poder fecundar, el 
espermatozoide tiene que atravesar la ZP y finalmente fusionarse con la 
membrana plasmática del ovocito. En humanos, la ZP está formada por cuatro 
glicoproteínas, llamadas ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, pero las funciones específicas de 
estas glicoproteínas no se han determinado debido a la escasa cantidad de 
material biológico disponible. Esta dificultad se ha visto solventada gracias al 
uso de proteínas recombinantes de la ZP, producidas utilizando los cDNA que 
codifican para cada una de ellas. Trabajos previos señalan que las proteínas 
recombinantes ZP3 y ZP4 son capaces de estimular la reacción acrosomal 
(RA), pero se desconoce la naturaleza del sitio activo de estas moléculas. 
Debido a esto, el objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad de las 
proteínas recombinantes ZP2, ZP3 y ZP4 humanas expresadas en células Sf9 
de inducir la RA en espermatozoides y caracterizar sus sitios activos. Para ello, 
se expresaron las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4 en células Sf9 de insecto mediante 
el sistema de expresión de baculovirus. Las proteínas recombinantes obtenidas 
fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad y tratadas con o sin las 
enzimas N-glicosidasa F, O-glicosidasa y neuraminidasa. Los productos se 
caracterizaron mediante SDS-PAGE, Western blot, Lectin blot y análisis de 
reconocimiento por lectinas. Las proteínas obtenidas se incubaron con 
espermatozoides y se determinó la incidencia de acrosomas reaccionados. Los 
resultados mostraron que las proteínas recombinantes de la ZP están 
glicosiladas de manera similar a la nativa y poseen actividad biológica, ya que 
ZP3 y ZP4 indujeron RA, aunque después de ser desglicosilada, ZP3 disminuyó 
su capacidad de inducción. Esto sugiere que ZP3 y ZP4 podrían estimular la RA 
mediante diferentes receptores o mecanismos. Debido a sus caracteristicas 
estas proteínas pueden ser de utilidad para la investigación en andrología, asi 
como para diagnóstico en el campo de infertilidad masculina. 
 
ABSTRACT 
 
In mammals, the oocyte is surrounded by an extracellular matrix, the zona 
pellucida (ZP), located beneath the cummulus ooforus and above the oocyte 
plasma membrane. To fertilize the oocyte, the sperm has to penetrate the ZP 
and fuses with oocyte plasma membrane. In human, the ZP is composed of 
four glycoproteins: ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, but their specific functions has not 
been determined due to difficulties to obtain native ZP. This limitation has been 
circumvented due to the availability of the ZP proteins cDNAs wich have been 
utilized to obtain recombinant proteins. Previous works suggest that 
recombinant proteins ZP3 and ZP4 are able to induce acrosome reaction, but 
the active site of these mollecules remain unknown. The aim of this work was 
to study the ability of human ZP2, ZP3 and ZP4 recombinant proteins 
expressed in Sf9 cells to induce sperm acrosome reaction and to characterize 
their active site. For this purpose, ZP2, ZP3 and ZP4 proteins were expressed 
in insect Sf9 cells using a baculovirus expression system. The expresed 
recombinant proteins were affinity purified and trated with or without N-
glycosidase F, O-glycosidase and neuraminidase. The products were 
characterized by SDS-PAGE, Western blot, Lectin blot and lectin binding 
analysis. Sperm and recombinant proteins were incubated and the incidence of 
reacted acrosomes on sperm samples was evaluated. The results showed that 
the recombinant ZP proteins were glycosylated in a native similar way and 
posses biological activity since ZP3 and ZP4 induced acrosome reaction. 
Nevertheless after deglycosylation, ZP3 diminished the ability to do so. This 
suggest that ZP3 and ZP4 may induce acrosomal reaction by mean of different 
receptors or mechanisms, dependent or not on the carbohydrates present in 
them. Due to their characteristics these proteins can be useful in andrology 
research and diagnosis in the male infertility field. 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1. Generalidades sobre la fecundación. 
 
La fecundación se define como la fusión de dos células haploides, el 
espermatozoide o gameto masculino y el ovocito o gameto femenino, para 
formar un cigoto diploide, y es un fenómeno necesario para la reproducción de 
todos los organismos eucariontes. 
 
En mamíferos, cuando el gameto femenino es ovulado se encuentra 
rodeado de una capa de células foliculares, denominada cúmulo oóforo. Por 
debajo del cúmulo oóforo y por encima de la membrana plasmática del ovocito 
se localiza la zona pelúcida (ZP) que es una matriz extracelular formada de 
glicoproteínas. El espermatozoide tiene que atravesar estas barreras y 
finalmente fusionarse con la membrana plasmática del ovocito para poder 
fecundar. A continuación se describen una serie de eventos sucesivos 
importantes que ocurren cuando el espermatozoide entra en contacto con el 
ovocito(1): 
 
a) Asociación no específica: Una vez que el espermatozoide pasa a 
través del cúmulo oóforo, interactúa con la ZP mediante una adhesión 
débil e inespecífica. 
b) Unión primaria: Es una unión firme entre el espermatozoide y la ZP. Es 
especie-específica y está mediada por receptores en la ZP (receptores 
primarios) que reconocen ligandos específicos en la membrana 
plasmática de la cabeza del espermatozoide. 
c) Reacción acrosomal (RA): Como consecuencia de la unión primaria se 
produce un fenómeno de exocitosis en el espermatozoide conocido como 
reacción acrosomal, que culmina con la liberación del contenido del 
acrosoma el cual es indispensable para la penetración de la ZP. 
d) Unión secundaria: Los espermatozoides reaccionados se mantienen 
unidos a la ZP por medio de una unión secundaria. Ésta involucra 
componentes de la membrana acrosomal interna que se unen a 
receptores secundarios en la ZP. 
e) Penetración: El espermatozoide penetra a través de la ZP gracias a la 
combinación de la fuerza mecánica ejercida por los movimientos del 
flagelo y a la digestión enzimática de las glicoproteínas de la ZP llevada 
a cabo por las proteasas acrosomales. 
f) Fusión: El espermatozoide alcanza el espacio perivitelino, región 
estrecha entre la ZP y la membrana plasmática del ovocito, y se fusiona 
con esta membrana para penetrar en el huevo. Por debajo de la 
membrana plasmática del ovocito, se encuentran los gránulos corticales, 
los cuales son liberados hacia el espacio perivitelino poco después de la 
fecundación, fenómeno conocido como reacción cortical. Las enzimascontenidas en los gránulos corticales producen modificaciones en la ZP 
haciéndola impenetrable para otros espermatozoides y por tanto 
previniendo la poliespermia. 
 
Cabe mencionar que los eventos de unión entre el espermatozoide y la 
ZP pueden estar mediados por reconocimientos de tres tipos: 1) entre 
carbohidrato y carbohidrato, 2) entre carbohidrato y proteína y/o, 3) entre 
proteína y proteína(2-6). 
 
1.2. Generalidades sobre el espermatozoide. 
 
 En los mamíferos, los espermatozoides se encuentran entre las células 
más pequeñas debido a que se han especializado con el único fin de 
transportar DNA al ovocito. Los espermatozoides maduros poseen cuatro 
componentes fundamentales: el acrosoma, el núcleo que contiene el DNA 
altamente compactado, una pieza media rica en mitocondrias y la cola, que 
contiene el axonema y las proteínas motor de dineína. Para maximizar la 
eficiencia en el transporte, el espermatozoide no tiene ribosomas, retículo 
endoplásmico ni aparato de Golgi(7). 
 
Los espermatozoides poseen además la característica particular de 
experimentar varias etapas de maduración durante su vida, resultantes de la 
interacción que tienen con los diferentes ambientes por los que migran y las 
distintas funciones que tienen que llevar a cabo(8). 
 
Los espermatozoides liberados de los túbulos seminíferos y los que se 
encuentran dentro de las regiones proximales del epidídimo son inmóviles e 
incapaces de fecundar. Estas células adquieren movilidad progresiva durante 
su paso a través del epidídimo en un proceso llamado maduración 
epididimal(9). Durante este tránsito, el epidídimo presenta un ambiente que 
propicia las modificaciones morfológicas y bioquímicas necesarias para 
preparar a los espermatozoides para su almacenamiento y hacerlos 
competentes para responder a estímulos futuros. 
 
1.3. Capacitación espermática. 
 
En el año 1951 dos trabajos independientes describieron que los 
espermatozoides que no habían residido en el tracto genital femenino no eran 
capaces de fecundar ovocitos(10,11). A partir de esta observación se definió a la 
capacitación como el conjunto de transformaciones ocurridas en el 
espermatozoide que lo habilitan para el proceso de la fecundación y ocurren 
desde la eyaculación hasta el momento en que alcanza a la ZP y se une a 
ella(8). 
 
En el humano, los espermatozoides eyaculados y depositados en la 
vagina presentan en su superficie moléculas originarias del epidídimo y del 
plasma seminal. En este momento se mueven con una movilidad lineal y 
progresiva y deben atravesar el moco cervical donde pierden algunas de las 
moléculas adsorbidas a su superficie. Después de atravesar el moco cervical 
los espermatozoides experimentan un cambio en el tipo de movilidad, pasando 
del movimiento lineal y progresivo a un movimiento vigoroso y no 
progresivo(8). Este tipo de movimiento está asociado a la capacitación y se 
denomina hiperactivación espermática. El moco cervical induce la capacitación 
espermática(12) y la hiperactivación(13), pero no la RA(14). Tanto en el útero 
como en las trompas de Falopio los espermatozoides experimentan una serie 
de modificaciones, principalmente en la membrana, que tienen efectos 
positivos sobre la viabilidad y la hiperactivación espermática(15,16). Por otro 
lado, las secreciones del tracto genital femenino y principalmente el fluido 
oviductal contiene proteínas, como la albúmina sérica humana (HSA) que 
facilitan la capacitación y promueven la inducción de la RA produciendo un 
eflujo de ácidos grasos, colesterol y/o fosfolípidos de la membrana plasmática 
del espermatozoide incrementando así su fluidez y permeabilidad(8,17,18). En 
síntesis, los cambios más importantes que ocurren en la membrana plasmática 
del espermatozoide durante la capacitación son: las moléculas de origen 
epididimal son removidas o alteradas, se redistribuyen los antígenos de 
membrana, los mecanismos responsables del flujo de iones son inhibidos o 
activados y se produce un aumento en la fluidez de la membrana debido a 
cambios en su contenido lipídico(8). 
 
Los espermatozoides humanos pueden ser capacitados in vitro 
empleando un medio de cultivo adecuado que contenga bicarbonato y 
suplementado con sustratos energéticos como glucosa y/o piruvato y HSA. Los 
estudios realizados in vitro sobre la capacitación de espermatozoides humanos 
ha permitido dilucidar algunos de los mecanismos moleculares y/o bioquímicos 
que operan en dicho evento. De esta manera, se ha observado que durante la 
capacitación ocurre un incremento global en la fosforilación de tirosinas, en 
algunos casos como consecuencia de los cambios en el estado redox de la 
célula. Estos cambios son inducidos por las especies reactivas de oxígeno. Este 
evento es esencial en la cascada de cambios bioquímicos que llevarán al 
espermatozoide a experimentar la RA y fusionarse con el ovocito(19). 
 
Se puede considerar a la capacitación espermática como un evento 
preparatorio durante el cual se lleva a los sistemas celulares a niveles de 
activación específicos que serán necesarios para que la RA se desarrolle 
después de la exposición a un estímulo apropiado(8). 
1.4. Reacción acrosomal. 
 
La RA es un evento de primordial importancia para que la fecundación se 
lleve a cabo, aun cuando los mecanismos involucrados en este proceso son 
poco conocidos en el humano. El acrosoma es una vesícula secretora que se 
origina en el aparato de Golgi y se encuentra por encima del núcleo, en la 
región apical del espermatozoide. La membrana del acrosoma localizada por 
debajo de la membrana plasmática de la célula se conoce como membrana 
acrosomal externa y aquella que se encuentra por encima del núcleo como 
membrana acrosomal interna (Fig. 1A). Morfológicamente, la RA consiste en 
una serie de fusiones entre la membrana acrosomal externa y la membrana 
plasmática en la parte anterior de la cabeza del espermatozoide, lo que genera 
vesículas híbridas de estas membranas que permiten la liberación del 
contenido acrosomal (Fig. 1B) y exponen la membrana acrosomal interna 
(Fig. 1C). Los espermatozoides con malformaciones o ausencia del acrosoma 
son infértiles y sólo aquellos que han desarrollado la RA pueden penetrar la ZP 
y fusionarse con la membrana plasmática del ovocito(20). Algunas de las 
funciones que se han propuesto para el acrosoma están relacionadas con la 
adhesión del espermatozoide a la ZP, la penetración de la misma y la fusión de 
los gametos. 
 
Membrana 
plasm á tica 
N úcleo 
Membrana 
acrosomal 
externa 
Membrana 
acrosomal 
interna 
AA BB CC
Membrana 
plasm á tica 
N úcleo 
Membrana 
acrosomal 
externa 
Membrana 
acrosomal 
interna 
AA BB CC
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1: Reacción acrosomal del espermatozoide humano. 
A: Espermatozoide con acrosoma intacto. B: Fusión de membranas. 
C: Espermatozoide con acrosoma reaccionado. 
Tomado de Yanagimachi, 1994(9). 
Se ha considerado tradicionalmente que durante la fecundación el 
espermatozoide puede mantener intacto el acrosoma o bien presentar la RA 
(con acrosoma o sin acrosoma, respectivamente), por lo que en este modelo 
se considera que la RA es un proceso de un sólo paso. Sin embargo, 
recientemente se ha propuesto un modelo de exocitosis acrosomal(21), que 
involucra los siguientes conceptos: a) Compartamentalización del 
acrosoma: tanto el acrosoma como su contenido se encuentran 
compartamentalizados morfológica y bioquímicamente(22); del acrosoma se 
pueden aislar tanto componentes solubles como componentes en forma de un 
material denso pero no asociado a membranas conocido como matriz 
acrosomal. b) El acrosoma es una vesícula secretora: antiguamente se 
consideraba al acrosoma como un lisosoma especializado, concepto que ha 
cambiado gracias a los avances realizados en los estudios sobre secreción 
celular(23). Las condiciones para que se dé una secreción reguladason: que la 
secreción esté acoplada a un estímulo, que los productos de secreción se 
encuentren concentrados y condensados y que los gránulos secretores sean 
almacenados por periodos de tiempo largos. Todos estos criterios se cumplen 
durante la RA por lo que debe considerarse al acrosoma como una vesícula 
secretora. 
 
El modelo de la exocitosis acrosomal propone a la RA como un proceso 
controlado que consta de varios pasos. Propone la existencia de 
espermatozoides en estadios intermedios transicionales cuyas membranas 
plasmática y acrosomal externa se han fusionado en ciertas áreas, lo que 
permite que el contenido acrosomal sea expuesto en la superficie del 
espermatozoide. Las moléculas contenidas en el acrosoma son dispersadas 
gradualmente dependiendo de sus propiedades solubles inherentes o son 
liberadas después de un procesamiento proteolítico de la matriz acrosomal. 
Algunos de los componentes expuestos en el perímetro externo de la matriz 
acrosomal entran en contacto con la ZP e intervienen en la unión entre 
gametos. Otros componentes actúan en la penetración del espermatozoide a 
través de la ZP. Este contenido acrosomal no ha sido plenamente 
caracterizado, pero se sabe que contiene proteasas y glicosidasas(24,25). 
 
El modelo de la exocitosis acrosomal, descrito en el párrafo anterior, 
propone también que la capacitación promueve e inicia el proceso de la 
exocitosis acrosomal pero que los ligandos específicos (como las proteínas de 
la ZP y la progesterona) y los agentes farmacológicos (como el ionóforo de 
Ca2+) aceleran el proceso, estimulando la fusión de las membranas acrosomal 
externa y plasmática y otorgando una ventaja competitiva al espermatozoide 
que se encuentre en el tiempo y lugar correctos y responda a dichos estímulos. 
Este modelo acepta a la RA espontánea como un fenómeno fisiológico 
relevante y basándose en la observación de que la capacitación incrementa en 
gran medida la incidencia de RA espontánea, sostiene que representa una 
versión lenta pero mecanísticamente similar al proceso acelerado por el 
ligando(21). 
 
1.4.1. Inducción de la reacción acrosomal. 
 
Se ha demostrado que el espermatozoide humano desarrolla RA en 
respuesta a la unión con la ZP(26,27), la cual es considerada como el agonista 
natural de este proceso. Sin embargo, como ya se ha señalado, las dificultades 
existentes para la obtención de suficientes cantidades de ZP han dificultado el 
estudio de los mecanismos de la interacción entre la ZP humana y el 
espermatozoide y en particular sobre la inducción de la RA, donde los 
resultados obtenidos varían dependiendo de la metodología empleada. En la 
mayoría de los casos se utilizan ovocitos no viables, que normalmente son 
desechados luego de su uso en ensayos de fertilización in vitro (FIV). En 
general, las ZPs de estos ovocitos se usan intactas o solubilizadas por 
diferentes métodos (tabla 1). 
 
 
 
 
Estado de la ZP % RA Referencias 
Solubilizada con HCl 18%* (28) 
Solubilizada con ácido Tyrodes 21%* (29) 
Solubilizada 10.9%* (30) 
Intacta (ovocitos no viables) 48% (31) 
 
Tabla 1: Inducción de la RA en espermatozoides por la ZP humana 
solubilizada o intacta. 
*Los resultados fueron normalizados contra la RA espontánea. 
 
 
Otra aproximación para estudiar el papel de la ZP en la inducción de la 
RA es la obtención in vitro de las proteínas que la conforman, esta metodología 
ofrece la ventaja de poder estudiar la actividad de cada proteína de manera 
individual. Estudios realizados con proteínas recombinates de la ZP humana 
expresadas en células de ovario de hámster chino (CHO), así como en células 
de teratocarcinoma de ovario humano (PA-1) y células Sf9 de insecto proponen 
a la proteína ZP3 de la ZP como el agonista natural que inicia la RA una vez 
que se une al espermatozoide(32-35). 
 
 Si bien los mecanismos de señalización que llevan a la RA en el humano 
no se conocen con detalle, algunas investigaciones proponen que la ZP induce 
la RA mediante una cascada de señalización transmembranal en la que se 
activan proteínas Gi(36-38). También existen evidencias que sugieren la 
existencia de una vía complementaria o alternativa en la que ocurren cambios 
en la regulación del contenido de Ca2+ intracelular mediante la modulación del 
influjo del catión(39). Por otra parte, se ha demuestrado que la ZP es capaz de 
activar vías alternas de señalización, en la que participan las cinasas de 
proteínas A, C Y G(40). Todo lo anterior sugiere que existen múltiples vías 
mediante las cuales la ZP induce la RA, e incluso es posible que ocurran 
interacciones entre ellas, aunque este hecho todavía esta sujeto a 
investigación. 
 
Existen otros inductores de la RA, como la progesterona y el ionóforo de 
Ca2+ (CaI). En el humano, la progesterona es capaz de inducir la RA(37), 
además de tener un efecto preparativo para la inducción de la RA por la ZP, ya 
que la incubación de espermatozoides con progesterona seguida por la 
incubación con ZP produce mayor estimulación que la obtenida al incubar los 
espermatozoides con ambos inductores al mismo tiempo o con los inductores 
sólos(39), utilizando vías de señalización diferentes(37). Además, se han 
identificado receptores no genómicos de progesterona en la membrana de la 
cabeza del espermatozoide cuya expresión defectuosa se acompaña de 
infertilidad masculina(41). 
 
Por su parte, el catión divalente CaI es considerado como un inductor no 
fisiológico de la RA. Su mecanismo de acción consiste en alterar el paso de 
cationes a través de las membranas celulares, a favor de un gradiente eléctrico 
y en contra del gradiente homeostático normal. Debido a su propiedad de 
inducir RA, este catión se ha utilizado como predictor de éxito en programas de 
FIV(42), aunque se debe tomar en cuenta que su mecanismo de acción es 
diferente al de los ligandos naturales. Además es citotóxico, por lo que la 
concentración utilizada debe establecerse en relación al tiempo de 
incubación(8). 
 
Dada la función de la ZP como inductor de la RA y su papel fundamental 
en el proceso de fecundación, esta matriz ha sido motivo de múltiples estudios 
tanto desde el punto de vista estructural como funcional. A continuación se 
resumen los principales hallazgos. 
 
1.5. Estructura de la zona pelúcida. 
 
La ZP desempeña funciones primordiales durante la fecundación, tales 
como ser el sitio de reconocimiento especie-específico del espermatozoide con 
el ovocito, desencadenar la RA, funcionar como soporte mecánico para la 
penetración del espermatozoide y evitar la polispermia a través de cambios en 
su estructura. Además, después de la fecundación, la ZP protege al ovocito 
desde el sitio de la fecundación hasta la implantación(43). 
 
Debido a esto, la ZP se ha estudiado en varios modelos, si bien la 
estructura de la ZP en el humano aún se desconoce. En general, las 
glicoproteínas que componen la ZP varían en número de tres a cinco, 
dependiendo de la especie examinada. 
 
En la especie mejor estudiada, el ratón, la ZP consta de tres 
glicoproteínas diferentes denominadas ZP1, ZP2 y ZP3, con pesos moleculares 
de 200, 120 y 83 kDa respectivamente(44-47). Cada una de estas glicoproteínas 
consiste en un polipéptido altamente glicosilado de manera heterogénea. 
 
La ZP del ratón está conformada por filamentos de monómeros de ZP2 y 
ZP3 de manera alterna. La unidad formada por ambas proteínas se repite 
cientos de veces en cada filamento los cuales se encuentran a su vez 
conectados entre sí por dímeros de ZP1(48). (Fig. 2). 
 
Residuos de 
carbohidratos
Residuos de 
carbohidratos
Fig. 2: Estructura de la ZP de ratón propuesta por Wassarman, 1988(46). 
 
La estructura primaria de cada una de estas glicoproteínas consiste 
principalmente de módulos o dominios estructurales muy conservados. Estos 
módulos son característicos de proteínas extracelulares de eucariontesy están 
involucrados en procesos regulatorios como la diferenciación, la comunicación 
y el reconocimiento intercelular. También se encuentran altamente 
conservados el número y las posiciones de los residuos de cisteína, así como 
los sitios potenciales de glicosilación ligados a N. 
 
A continuación se describen brevemente dichos dominios (Fig. 3): 
 
• Péptido señal: Situado en el extremo amino terminal. 
• Módulo ZP: Es un dominio conservado, típico y común de algunas 
proteínas relacionadas con funciones receptoras. Estudios recientes con 
proteínas recombinantes humanas sugieren que este dominio está 
relacionado con la polimerización de las proteínas de la ZP(49). 
• Dominio de plegamiento: Este dominio se encuentra presente en las 
familias ZP1 y ZP4. Su función parece estar relacionada con la resistencia a 
la degradación proteolítica(50). 
• Dominio de corte proteolítico: Sitio de actividad de la furina, de la 
familia de las convertasas, que permite la movilización de la proteína hacia 
el margen exterior de la ZP mientras esta misma crece durante la 
maduración del ovocito(51,52). 
• Dominio transmembranal: Localizado en el carboxilo terminal y 
relacionado con el anclado de la glicoproteína a la membrana celular. 
 
1.6. Síntesis de las proteínas de la zona pelúcida. 
 
 La síntesis de la ZP en mamíferos está relacionada con el estado de 
desarrollo del folículo. Este proceso se inicia desde las etapas de desarrollo del 
folículo primordial o primario dependiendo de la especie estudiada(53,54). Se 
desconocen las señales responsables de iniciar la síntesis, si bien es posible 
que estas señales sean hormonales o sean resultado del establecimiento de la 
comunicación entre el ovocito y las células foliculares(43). 
 
El origen de las glicoproteínas de la ZP ha estado sujeto a controversia. 
Diferentes investigaciones han señalado al ovocito, a las células de la 
granulosa o a ambos tipos celulares como los responsables de sintetizar las 
proteínas que conforman la ZP(43,55) según la especie estudiada. En el ratón las 
proteínas de la ZP sólo se expresan en los ovocitos en crecimiento(56,57), a 
diferencia de otras especies (conejo, el cerdo, la vaca, el mono rhesus, el 
mono tití y el humano) en dónde las células de la granulosa expresan los 
mRNA y las proteínas de la ZP en forma dependiente del estado de desarrollo 
del folículo(54,58-61). En el humano se ha observado expresión de las proteínas 
de la ZP tanto en el ovocito como en las células de la granulosa(53,54). 
 
1.7. Clasificación de las proteínas de la zona pelúcida 
 
Las glicoproteínas de la ZP se han agrupado en familias debido a que 
presentan homología estructural. Inicialmente, la clasificación de estas 
proteínas se dificultó debido a su elevada heterogeneidad en geles de 
poliacrilamida en dos dimensiones, como consecuencia de la presencia de 
cadenas de oligosacáridos altamente cargados y diferencias en la estructura 
primaria(62,63). 
 
La primera clasificación de las proteínas que conforman la ZP se realizó 
en ratón, donde se identificaron las tres glicoproteínas de las que consta esta 
estructura y las denominaron ZP1, ZP2 y ZP3, en orden decreciente de sus 
pesos moleculares aparentes al ser analizadas mediante electroforesis en geles 
desnaturalizantes de poliacrilamida de una dimensión(44). Posteriormente, las 
glicoproteínas de la ZP de las diferentes especies estudiadas se han clasificado 
en familias, según la homología presentada con las ZP1, ZP2 y ZP3 del ratón. 
 
Siguiendo el mismo criterio, en 1988 se identificaron tres proteínas en la 
ZP humana, las que fueron denominadas como ZP1, ZP2 y ZP3(64). 
Posteriormente se propuso clasificar las familias de proteínas como ZPA, ZPB y 
ZPC en orden decreciente del tamaño de la secuencia del cDNA(65). Sin 
embargo, ninguna de las dos nomenclaturas fue adoptada de manera 
universal, lo que por años condujo al uso de un sistema de nombramiento dual 
y en ocasiones confuso. 
Recientemente se determinó que la ZP humana está compuesta por 
cuatro glicoproteínas(66). El descubrimiento del verdadero ortólogo humano de 
la ZP1 de ratón se retrasó por ser una proteína muy escasa en la ZP 
humana(67). De manera consistente con la nomenclatura adoptada en el ratón y 
de acuerdo a las homologías persistentes, estas proteínas han sido nombradas 
como ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, donde la proteína ZP4 corresponde a la anterior 
ZP1(68). Las diferencias en la composición de la ZP humana plantea nuevos 
desafíos en la investigación en este campo, ya que el modelo de ratón ya no 
puede extrapolarse al humano (Fig. 3). 
 
 A B C E D 
ZP1 (624 aminoácidos)
ZP2 (745 aminoácidos)
A C E D 
ZP3 (424 aminoácidos)
A C E D 
A B C E D 
ZP4 (540 aminoácidos)
A B C E D 
A C E D 
A C E D 
A B C E D 
 
Fig. 3: Estructura de las cuatro familias de ZP en el humano. Con 
letras se designan los diferentes dominios estructurales: A=péptido 
señal, B=dominio de plegamiento (solamente en las familias ZP1 y 
ZP4), C=módulo ZP, D=sitio de corte proteolítico y E=dominio 
transmembranal. Tomado de Conner et al, 2005(68). 
 
 
 
 
 
1.8. Caracterización funcional de las familias de proteínas de la 
zona pelúcida. 
 
Las investigaciones encaminadas a determinar las funciones de las 
distintas proteínas de la ZP se han enfocado en estudiar su actividad biológica, 
evaluada como su capacidad de unir espermatozoides y/o inducir la RA. No 
obstante la gran cantidad de información concerniente a la estructura primaria 
de estas proteínas, sus funciones específicas y organización tridimensional se 
encuentran bajo intensa investigación. Sin embargo, en humanos, estas 
investigaciones se han visto obstaculizadas por la limitada disponibilidad de ZP 
nativa, lo cual se ha solventado gracias a la obtención de proteínas 
recombinantes de la ZP. Así, se han obtenido proteínas recombinantes de la ZP 
a partir de sistemas eucariontes y procariontes. La expresión en bacterias 
resulta útil cuando se quiere estudiar el papel del esqueleto polipeptídico en la 
interacción entre gametos. En contraste, la utilización de células eucariontes 
hace posible la obtención de proteínas recombinantes con las adecuadas 
modificaciones postraduccionales, entre las que está la glicosilación. 
Dependiendo del tipo celular utilizado para la expresión, las proteínas 
recombinantes pueden resultar glicosiladas de forma diferente. A pesar de esas 
diferencias en los patrones de glicosilación, se ha demostrado que algunas 
proteínas recombinantes humanas mantienen sus capacidades receptoras y de 
inducción de la RA(33-35,69). 
 
En la tabla 2 se resumen las funciones conocidas y principales 
características de las cuatro familias de glicoproteínas en diferentes especies. 
 
 
 
 
 
 
 
Familia ZP Funciones 
PM 
(KDa) 
% de similitud 
con el humano 
Referencias 
ZP1 
Ratón 
Mantenimiento de la 
estructura ZP2-ZP3 
200 Desconocido 
(46,70) 
Humano No conocida - - 
(66,67) 
ZP2 
Ratón 
Receptor espermático 
secundarioa 
120 60 
(46,71,72) 
Conejo No conocida 110-130 72 
(62,73) 
Cerdo 
Receptor espermático
secundariob 
70-100 64 
(62,74-76) 
Humano 
Receptor espermático
secundariob 
70-100 - 
(77-80) 
ZP3 
Ratón 
Receptor espermático 
primario. 
Inductor de RAa,b 
83 67 
 
(56,81-84) 
Conejo 
Receptor espermático 
primarioa 
68-120 69 
(62,65,85) 
Cerdo 
Aumenta la unión 
espermática a ZP4a 
78-120 74 
(56,75,81,86,87) 
Humano Inductor de RAb 53-65 - 
(33,35,77,78,88,89) 
ZP4 
Conejo 
Receptor espermático 
primarioab 
84-95 71 
(62,85,90,91) 
Cerdo 
Receptor espermático 
primarioa 
55 68 
(86,87,92,93) 
Humano Inductor de RAb 60-65 - 
(35,65) 
 
Tabla 2: Principales características de las proteínas pertenecientes a las diferentes familias que 
componen la ZP del conejo, el ratón, el cerdo y el humano. 
a proteína nativa. 
b proteína recombinante. 
Los pesosmoleculares son deducidos a partir de la secuencia de aminoácidos. 
Nota: No existen evidencias sobre la presencia de la proteína ZP1 en la ZP del cerdo y del 
conejo, ni de la presencia de la ZP4 en la ZP del ratón, razón por la cual no se incluyen en esta 
tabla. 
 
Como se observa en la tabla 2, las proteínas de una misma familia no 
siempre llevan a cabo las mismas funciones. Es evidente por tanto, que la 
similitud genética y estructural entre las proteínas no es suficiente para 
predecir su función, por lo que no se pueden extrapolar los conocimientos 
obtenidos de una especie a otra. 
 
1.9. Glicosilación de las proteínas de la zona pelúcida. 
 
Como ya se mencionó, las proteínas de la ZP se encuentran altamente 
glicosiladas. Este tipo de modificación postraduccional se realiza durante la 
síntesis de proteínas en el retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi. 
Existen dos tipos de glicosilaciones, las ligadas a N (asparagina) y las ligadas a 
O (serina o treonina). 
 
Los oligosacáridos ligados a N se sintetizan en el retículo endoplásmico, 
dónde primero se sintetiza el núcleo del oligosacárido que se unirá a la 
proteína. Este núcleo consta de catorce monosacáridos: dos residuos de N-
acetilglucosamina (NAcGlc), nueve de manosa y tres de glucosa. Una vez 
estructurado este núcleo se une a un residuo de asparagina del esqueleto 
polipeptídico, a través del nitrógeno del aminoácido y una de las NAcGlc. 
Posteriormente ocurren modificaciones en las ramas terminales de esta 
estructura, como la adición o remoción de otros monosacáridos, si bien 
siempre queda intacta la parte más interna del núcleo, constituida por los dos 
residuos de NAcGlc y tres de manosa. Este pentasacárido derivado del núcleo 
original de catorce monosacáridos permanece en los carbohidratos ligados a N 
en la proteína madura. Por su parte, las glicosilaciones ligadas a O ocurren en 
el aparato de Golgi, aunque en este organelo también se producen 
modificaciones a los oligosacáridos ligados a N. Durante la glicosilación ligada a 
O, primero se une un monosacárido de NAcGal al oxígeno de la serina o de la 
treonina y después se adicionan residuos de monosacáridos secuencialmente. 
En la parte más exterior de la estructura del oligosacárido se añaden residuos 
de ácido siálico (conocido también como ácido neuramínico)(94). 
 
Una asparagina es susceptible de glicosilación cuando en la proteína se 
encuentra la secuencia de aminoácidos N-X-S/T (asparagina-cualquier 
aminoácido-serina o treonina). Al comparar esa secuencia de aminoácidos con 
la estructura primaria de las proteínas ZP humanas se determinó que las 
proteínas ZP2 y ZP4 tienen seis sitios potenciales de N-glicosilación, mientras 
que la ZP3 tiene tres(2). 
 
El patrón de glicosilación presente en una proteína interviene en 
funciones importantes, entre las cuales están el plegamiento de la misma y 
eventos de reconocimiento. Para modular estas funciones, este patrón es 
susceptible a modificaciones mediante enzimas específicas, conocidas como 
glicosidasas. Entre ellas están la O-glicosidasa que hidroliza el enlace entre el 
disacárido β-gal–(1-3)N-acetilgalactosidasa (Galβ1-3NacGal) y el oxígeno del 
aminoácido, la N-glicosidasa F que hidroliza el enlace entre los dos residuos de 
NAcGlc de oligosacáridos ligados a N y la neuraminidasa o sialidasa que 
hidroliza las uniones entre residuos terminales de ácido siálico y oligosacáridos 
cuando presentan enlaces α2-3, α2-6 o α2-8. 
 
1.10. Papel de los carbohidratos de la zona pelúcida en la 
interacción entre gametos. 
 
Numerosos estudios en direrentes sistemas han demostrado la 
participación de glicoconjugados en las interacciones entre células. Asimismo 
se ha propuesto que la unión entre gametos requiere un apropiado 
reconocimiento de secuencias específicas de carbohidratos en la ZP por 
proteínas tipo lectinas asociadas a la membrana plasmática del 
espermatozoide(95). 
 
Existe relativamente poca información sobre el tipo de carbohidratos 
involucrados en la interacción entre gametos humanos y el papel que juegan. 
La mayor parte de los estudios realizados se basan en ensayos de inhibición de 
la unión entre ZP y espermatozoide. Los carbohidratos que han demostrado 
tener capacidad de inhibición son manosa, fucosa, galactosa y NAcGlc(96). 
También existen evidencias de un posible papel del ácido siálico en dicho 
evento(97). 
 
Por otra parte, se han realizado estudios con el objetivo de examinar el 
tipo y la distribución de los carbohidratos en la ZP humana. En éstos se 
utilizaron técnicas de histoquímica empleando lectinas como sondas. De esta 
forma se ha observado la presencia en la ZP de residuos de manosa, NAcGlc, β-
galactosa (β-gal) y el disacárido Galβ1-3NAcGal enmascarado por residuos 
terminales de ácido siálico(98). En un estudio más reciente se corroboró la 
presencia en la ZP humana de los residuos mencionados anteriormente, 
además de residuos de fucosa y NAcGal(99). 
 
A pesar de la evidencia que existe sobre la participación de los 
carbohidratos en la interacción entre gametos, algunos trabajos señalan que el 
esqueleto polipeptídico es esencial en este evento. Se ha demostrado que la 
proteína ZP3 de humano expresada en bacterias, y por tanto carente de 
carbohidratos, es capaz de unirse al espermatozoide e inducir RA(89). Sin 
embargo, de manera contrastante, los resultados de una investigación reciente 
en la que se expresaron las proteínas ZP3 y ZP4 de humano en bacterias y en 
células de insecto demuestran que las proteínas recombinantes expresadas en 
bacterias son incapaces de inducir RA, mientras que las expresadas en el 
sistema eucarionte sí lo hacen(35). Asimismo, otro grupo demostró que los 
carbohidratos manosa, NAcGlc y NAcGal son capaces de inducir RA en 
espermatozoides de ratón sólo cuando se encuentran conjugados 
covalentemente a un esqueleto polipeptídico(95,100). Todo esto sugiere que la 
unión entre la ZP y el espermatozoide puede estar mediada por un receptor 
multivalente en el espermatozoide o por más de un par ligando-receptor, que 
además pueden actuar de forma concertada o de manera independiente con la 
finalidad de garantizar la eficacia de la unión(96). 
 
Por otra parte, existen trabajos que señalan a un carbohidrato presente 
en la ZP3 del ratón como responsable de la inducción de la RA(101-103). En 
contraste; aunque en el humano se considera a la ZP3 como responsable de 
esta función con base en estudios utilizando proteínas recombinantes, la 
naturaleza del sitio activo se desconoce. 
 
La proteína recombinante ZP3 humana expresada en diferentes líneas 
celulares como células de ovario de hámster chino (CHO)(32,33) y células de 
teratocarcinoma de ovario humano (PA-1)(34), fue capaz de inducir RA en 
diferentes proporciones. Sin embargo, no todas las proteínas recombinantes 
han mostrado tener actividad biológica como en el caso de las proteínas ZP2, 
ZP3 y ZP4 humanas expresadas en células de riñón de embrión humano (línea 
celular 293T)(104), donde si bien las proteínas recombinantes presentaban 
glicosilaciones del tipo ligada a N, estas proteínas no fueron capaces de inducir 
RA en espermatozoides humanos. 
 
Por lo tanto, obtener proteínas recombinantes de la ZP adecuadamente 
caracterizadas, capaces de inducir la RA permitiría estudiar la participación de 
los carbohidratos en este evento. Además, estas proteínas también se podrían 
utilizar para realizar técnicas de diagnóstico en clínicas de reproducción 
asistida como inductores fisiológicos de la RA para predecir el resultado de 
tratamientos de FIV. 
 
2. OBJETIVOS 
 
Objetivo general: 
 
• Estudiar la capacidad de las proteínas recombinantes ZP2, ZP3 y ZP4 
humanas expresadas en células Sf9 de inducir la reacción acrosomal en 
espermatozoides y caracterizar la naturaleza de los sitios activos. 
 
 
 
Objetivos específicos: 
 
 
• Obtener proteínasrecombinantes ZP2, ZP3 y ZP4 en células Sf9 y 
caracterizar el tipo y abundancia de los carbohidratos presentes en las 
mismas. 
 
• Determinar la capacidad de las proteínas recombinantes ZP2, ZP3 y ZP4 
humanas de inducir la reacción acrosomal. 
 
• Establecer la participación de los carbohidratos presentes en las 
proteínas recombinantes de la ZP en la inducción de la reacción 
acrosomal. 
 
3. MATERIAL Y MÉTODOS 
 
3.1. Material. 
Los vectores pAcHLT™ de Pharmingen (San Diego, EE.UU.) conteniendo 
los cDNAs que codifican para las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4 humanas y las 
células Sf9 fueron donados por la Dra. Cecilia Cariño del INCMNSZ. El 
anticuerpo policlonal contra ZP total de cerdo fue donado por la Dra. Bonnie 
Dunbar del Depto. de Biología Celular de Baylor College of Medicine, Texas. La 
poli-L-lisina, la ortofenilendiamina (OPD), el peróxido de hidrógeno (H2O2), la 
avidina conjugada a peroxidasa de rábano (avidina-HRP), la albúmina sérica 
humana (HSA), la albúmina sérica bovina (BSA), el piruvato de sodio, la 
aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocianato de fluoresceína (PSA-
FITC), el ionóforo de calcio A23187 (CaI), las pastillas de 3,3’-
diaminobencidina Sigma fast™ (DAB), la solución de imidazol 3M, el azul de 
Coomassie R250, el Accustain (solución de hematoxilina de Harris modificada), 
la proteína A conjugada a agarosa y la solución de rojo neutro se obtuvieron de 
Sigma Chemical Co (St. Louis, EE.UU.). El kit de lectinas biotiniladas I (Con A, 
DBA, PNA, RCA I, SBA, UEA I, WGA), las lectinas biotiniladas AAA y Jacalina 
(Jac) y la solución de montaje VectaShield™ se obtuvieron de Vector 
Laboratories (Breton, Inglaterra). Los medios Isolate™, sperm washing media 
(SWM), test yolk buffer (TYB) y modified human tubal fluid (mHTF) se 
obtuvieron de Irving Scientific (Santa Ana, EE.UU.). El kit de transfección 
BaculoGold™, el medio TNM-FH y la agarosa Agarplaque Plus™ se obtuvieron 
de Pharmingen (San Diego, EE.UU.). La agarosa acoplada a níquel-ácido 
nitrolotriacético (Ni-NTA) se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, EE.UU.). El kit 
para cuantificación de proteínas basado en el ácido bicinconínico (BCA) se 
obtuvo de Pierce (Rockford, EE.UU.), la membrana de polivinildifluorido (PVDF) 
se obtuvo de Millipore (Billerica, EE.UU.). El inhibidor de proteasas Complete™, 
la N-glicosidasa F, O-glicosidasa y neuraminidasa se obtuvieron de Roche 
(Penzberg, Alemania). El marcador de peso molecular de alto rango y el yodo 
125 (125I) se obtuvieron de Amersham Biosciences, (Buckinghamshire, 
Inglaterra), las placas Biomax XAR se obtuvieron de Kodak (Cedex, Francia). 
La solución de montaje Entellan se obtuvo de Merck (Frankfurt, Alemania). El 
sistema de tinción ABC se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Sta. 
Cruz, EE.UU.). El ácido cítrico, el citrato de sodio, el tris, el ácido clorhídrico, el 
cloruro de sodio, la urea, el clorhidrato de guanidina, el SDS, la glicina, el 
glicerol, el etanol y el ácido acético se obtuvieron de J.T. Baker (Xalostoc, 
México). La acrilamida, la bisacrilamida, el TEMED y el persulfato de amonio se 
obtuvieron de Bio-Rad (Hercules, EE.UU.). Se utilizó un microscopio de 
epifluorescencia Olympus modelo 501 (Melville, EE.UU.) y un lector de ELISA 
Labsystems modelo Multiskan (Helsinki, Finlandia). 
 
La composición de las soluciones empleadas a lo largo de la metodología 
se detalla en el Anexo 1. 
 
3.2. Material biológico. 
 
 El ovario de humano se obtuvo postmortem de una mujer de 14 años. 
Las muestras de semen fueron obtenidas de donantes voluntarios, sanos entre 
20 y 35 años de edad. 
 
3.3. Obtención de proteínas recombinantes. 
 
Las proteínas recombinantes de la zona pelúcida humana (rhZP) ZP2, 
ZP3 y ZP4 se expresaron en la línea celular Sf9, proveniente de tejido ovárico 
de la pupa de la mariposa Spodoptera frugiperda, utilizando el sistema de 
expresión de baculovirus. Las células Sf9 se co-transfectaron empleando los 
vectores pAcHLT que contienen los cDNA’s que codifican para cada una de las 
proteínas humanas(54) junto con un baculovirus lineal genéticamente 
modificado, utilizando el kit comercial de transfección BaculoGold™ que 
permite la recombinación homóloga del inserto con el genoma del baculovirus. 
Este procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con las especificaciones del 
fabricante. 
 
Los procedimientos de cultivo celular, infección viral, aislamiento de los 
virus recombinantes, titulación viral y cálculo de la multiplicidad de infección se 
llevaron a cabo de acuerdo con los previamente descritos por Summers y 
Smith en 1987(105) y Prasad y colaboradores en 1995(106), los cuales se 
describen brevemente a continuación. 
 
Con la finalidad de seleccionar los virus recombinantes se realizó un 
análisis de placa, en el cual las células se infectaron con diluciones crecientes 
del sobrenadante obtenido de la transfección. Después se cubrieron con la 
agarosa AgarPlaque Plus™ al 1.5% y se incubaron a 27°C durante 96 horas. 
Las placas se identificaron como zonas de lisis celular mediante una tinción con 
solución de rojo neutro al 0.01%. Se colectó el virus de las placas con la punta 
de una micropipeta y se utilizó para realizar un análisis de expresión de 
proteínas, incubándolo durante 96 horas con las células Sf9 en medio TNM-FH. 
La presencia de las proteínas se verificó mediante Western blot (ver apartado 
3.4). Posteriormente se realizó la titulación del virus y se realizó el cálculo para 
determinar el volumen de baculovirus recombinante necesario para infectar un 
cultivo celular en suspensión (aproximadamente 1X106 células/ml) en medio 
TNM-FH. El cultivo celular en suspensión se realizó en fermentadores de 250 
ml y se incubó durante 96 horas. Las células se centrifugaron a 1000 g y se 
conservaron a –70ºC para la posterior purificación de las proteínas 
recombinantes. La expresión de las proteínas se analizó mediante 
electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida y Western blot. 
 
3.4. Electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y 
Western blot. 
 
El análisis de las proteínas expresadas se llevó a cabo mediante análisis 
en geles desnaturalizantes de poliacrilamida según la técnica descrita por 
Laemmli(107). Las muestras se separararon en un gel de poliacrilamida al 10%, 
incluyendo un estándar de peso molecular de rango alto (14.3 KDa – 220 KDa) 
para la estimación de la movilidad electroforética de las rhZP y se tiñeron con 
azul de Coomassie. Paralelamente, para identificar las proteínas rhZP mediante 
anticuerpos específicos, se utilizó la técnica de Western blot, donde las rhZP 
separadas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida se electrotransfirieron a 
una membrana de PVDF. Después de bloquear la membrana con solución 
amortiguadora de tris (TBST) con leche descremada al 5%, la identificación de 
las rhZP se realizó mediante la incubación con un anticuerpo anti-ZP total de 
cerdo en una dilución final de 1:1000 en TBST. Este anticuerpo presenta 
reacción cruzada con las proteínas nativas de la ZP de humano(54). La detección 
del complejo antígeno-anticuerpo se realizó incubando la membrana con 
proteína A marcada con 125I(108), y las membranas fueron sujetas a 
autorradiografía. 
 
3.5. Purificación de las proteínas recombinantes. 
 
La purificación de las rhZP se llevó a cabo en condiciones 
desnaturalizantes debido a que trabajos previos demuestran que estas 
proteínas no son secretadas al medio y se quedan asociadas a la membrana de 
las células Sf9(54). La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad 
utilizando agarosa acoplada a níquel-ácido nitrolotriacético (Ni-NTA), la cual 
tiene una alta afinidad por seis residuos consecutivos de histidina. Los vectores 
de expresión pAcHLT donde se clonaron los cDNA’s para ZP2, ZP3 y ZP4 
contienen dicha secuencia entre el promotor y el sitio múltiple de clonación. La 
purificaciónse inició resuspendiendo aproximadamente 120 mg de pastilla 
celular en 1.5 ml de solución de lisis. Se incubó durante 45 minutos en hielo y 
se recuperó la pastilla celular centrifugando a 10,000 g por 10 minutos. La 
pastilla celular obtenida se desnaturalizó con 1.5 ml de solución de 
solubilización y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego de 
centrifugar a 10,000 g por 30 minutos, se recuperó el sobrenadante y se 
mezcló con 1.5 ml de la agarosa acoplada a Ni-NTA, previamente lavada y 
equilibrada con la misma solución. Se incubó durante 2 horas con agitación 
suave y se lavó la resina con 5 volúmenes de la misma solución. 
Posteriormente, la resina se resuspendió en 1.5 ml de solución de lavado con 
urea 6 M y se sometió a un gradiente decreciente de urea. Finalmente, se 
agregaron 1.5 ml de solución de elución, se incubó durante 30 minutos en 
hielo y se recuperó el sobrenadante. Este paso se repitió para una máxima 
recuperación de la proteína purificada. El producto de las eluciones se dializó 
contra solución de diálisis durante toda la noche a 4°C con un cambio de 
solución. Los productos de la purificación se concentraron y se analizó la 
concentración de proteínas empleando el método del BCA, siguiendo las 
instrucciones del fabricante. Finalmente, la pureza e identidad de los productos 
purificados se analizaron mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida y 
Western blot. 
 
3.6. Muestras de semen y capacitación espermática. 
 
 Se utilizaron muestras de semen de donadores con 3 a 5 días de 
abstinencia y que cumplieran con los valores de referencia de la Organización 
Mundial de la Salud(109). El eyaculado se colectó en frascos estériles de 
polietileno en los que se mantuvo a 37ºC durante 30 minutos para permitir su 
licuefacción. Una vez licuado, el semen se sometió a un análisis macroscópico 
en el que se evaluó su viscosidad, volumen y pH y a un análisis microscópico 
dónde se evaluaron los parámetros de densidad, movilidad, viabilidad y 
morfología. 
 
Con la finalidad de separar a los espermatozoides del plasma seminal, el 
semen se centrifugó a 600 g durante 30 minutos a través de un gradiente 
discontinuo de densidad de Percoll (Isolate™). La pastilla de espermatozoides 
se lavó con 3 ml de SWM y se incubó durante la noche a 4°C en volúmenes 
iguales de SWM y TYB(110). El precipitado formado durante la incubación se lavó 
con 3 ml de SWM y la pastilla celular se resuspendió en 50 µl del medio de 
capacitación consistente de mHTF suplementado con HSA al 0.3% y piruvato 
de sodio 1 mM. Sobre la suspensión de espermatozoides se colocaron 
suavemente 3 ml del mismo medio de capacitación y se incubó durante 1 hora 
a 37°C con 5% de CO2. Terminada la incubación, se recuperó la fase superior 
que contenía los espermatozoides móviles (técnica de “swim up”). La fracción 
de espermatozoides obtenida se re-evaluó microscópicamente y la 
concentración se ajustó para los experimentos subsecuentes. 
 
3.7. Inducción de la reacción acrosomal por las proteínas 
recombinantes. 
 
Con la finalidad de determinar la capacidad de las proteínas rhZP de 
inducir RA en los espermatozoides, 150,000 espermatozoides capacitados se 
incubaron a 37°C durante diferentes intervalos de tiempo con cada una de las 
proteínas recombinantes (1 µg/ml) en 10 µl de medio mHTF suplementado. 
Como control negativo se incubaron espermatozoides bajo las mismas 
condiciones en medio mHTF suplementado en ausencia de las proteínas rhZP, y 
como control positivo se incubaron espermatozoides con CaI 10 µM. Una vez 
terminado el tiempo de incubación las muestras fueron lavadas con PBS 10 mM 
y fijadas con etanol frío. 
 
3.8. Análisis de la reacción acrosomal. 
 
Para evaluar el estatus del acrosoma, se empleó la técnica de tinción del 
mismo con la lectina PSA acoplada a isiotiocianato de fluoresceína (PSA-FITC). 
La lectina PSA (Pisum sativum) reconoce residuos de α-metil-manosa y se une 
sólo al contenido acrosomal(111). Los espermatozoides fijados se utilizaron para 
realizar frotis por duplicado en laminillas tratadas con poli-L-lisina. Las células 
fueron incubadas con PSA-FITC a una concentración de 4 µg/ml en PBS 10 mM 
incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad(112). Las 
preparaciones teñidas se lavaron 3 veces con PBS 10 mM, se montaron con la 
solución de montaje para fluorescencia Vectashield™ y se analizaron 
inmediatamente mediante una evaluación doble ciego. Para ello, se analizó un 
mínimo de 200 células por frotis en un microscopio de fluorescencia utilizando 
un filtro de excitación de 460-495 nm y uno de emisión de 510-550 nm. Los 
espermatozoides que mostraron tinción homogénea en la región acrosomal se 
consideraron como espermatozoides intactos, mientras que los que mostraron 
ausencia de tinción, tinción en la región ecuatorial o un patrón irregular de 
fluorescencia en el acrosoma se consideraron como espermatozoides 
reaccionados(29,113,114). Los valores de RA obtenidos bajo los diferentes 
tratamientos se expresaron como porcentaje de células reaccionadas y fueron 
normalizados contra los valores de RA espontánea obtenidos en las 
preparaciones del control negativo. 
 
3.9. Análisis de los carbohidratos presentes en las proteínas 
recombinantes. 
 
Con la finalidad de caracterizar los carbohidratos presentes en las 
proteínas expresadas se llevó a cabo un análisis de reconocimiento por 
lectinas(115). Para ello, se cubrieron los pozos de una placa de 96 pozos con 100 
ng/pozo de cada una de las proteínas rhZP purificadas, diluidas en 100 µl de 
PBS 50 mM (pH 7.4) y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Transcurrida 
la incubación se realizaron 3 lavados con 200 µl de PBST (Tween al 0.05%). A 
continuación, Los pozos se bloquearon con 200 µl de BSA al 1% en PBST por 
1.5 horas a 37°C. Después, se lavaron y se incubaron con 100 µl/pozo de las 
lectinas biotiniladas Con A, DBA, PNA, RCA I, SBA, UEA I, WGA AAA y Jac (1 
ng/µl en PBST) a 37°C durante 1 hora. Los pozos se lavaron e incubaron con 
100 µl de avidina-HRP (5 ng/µl) a 37°C durante 1 hora. Después de los 
lavados, se detectó el complejo agregando 100 µl/pozo de OPD al 0.05% y 
H2O2 al 0.06% en solución de citratos (pH 5.0). Se dejó incubar durante 30 
minutos a temperatura ambiente y la absorbancia se determinó en un lector de 
ELISA a una longitud de onda de 492 nm. 
 
3.10. Lectin-histoquímica de tejido ovárico humano. 
 
Con la finalidad de determinar el tipo de carbohidratos presentes en la 
ZP humana nativa se realizaron análisis de lectinhistoquímica en cortes de 
ovario humano. El ovario se fijó en solución Bouin(116) y después se embebió en 
parafina para realizar cortes de 5 µm que se colocaron sobre laminillas. 
Posteriormente los cortes se desparafinaron y se sumergieron en H2O2 al 1% 
en PBS 10 mM durante 30 minutos con objeto de bloquear las peroxidasas 
endógenas del tejido. A continuación se utilizó el sistema comercial de tinción 
ABC, que se basa en la detección de un anticuerpo biotinilado mediante la 
adición de una mezcla de avidina y peroxidasa biotinilada y utilizando 
diaminobencidina como sustrato. Se usaron las lectinas biotiniladas Con A, 
DBA, PNA, RCA I, SBA, UEA I, WGA, AAA y Jac a diferentes concentraciones 
siguiendo la metodología la sugerida por el fabricante. Los cortes se dejaron 
incubando con cada una de las lectinas durante toda la noche a 4ºC. Como 
control negativo se le realizó el mismo procedimiento a un corte pero en 
ausencia de lectinas. Debido a que algunos residuos de carbohidratos, tales 
como la NAcGal y la galactosa pueden quedar enmascarados por residuos de 
ácido siálico, se realizó otra serie de experimentos en los que los cortes de 
ovario se sometieron a una digestión con neuraminidasa después de la 
desparafinación, a una concentración de 1 unidad/ml e incubando a 37°C 
durante 3 horas. Finalmente todos lostejidos se contratiñeron durante 15 
segundos con Accustain™, se deshidrataron y se montaron con la solución de 
montaje Entellan™. Las preparaciones se observaron mediante microscopía de 
luz. 
 
3.11. Desglicosilación de las proteínas recombinantes. 
 
 Para desglicosilar las proteínas recombinantes se partió con 100 mg de 
pastilla de células Sf9 infectadas con los virus recombinantes para las 
proteínas ZP2, ZP3 y ZP4. Se siguieron los mismos pasos anteriormente 
descritos para la purificación de las proteínas recombinantes (ver apartado 
3.5), pero previo a la elución de las proteínas unidas a la agarosa acoplada a 
Ni-NTA, la misma se incubó durante 48 horas con 2 U de N-glicosidasa F, 1 mU 
de O-glicosidasa y 2 mU de neuraminidasa en un volumen final de 200 µl de 
PBS 20 mM, pH 7.2 a 37ºC, en presencia de inhibidores de proteasas. Las 
enzimas se emplearon a las concentraciones sugeridas por el fabricante. 
Paralelamente, otras pastillas celulares se sometieron al procedimiento 
anteriormente descrito pero en ausencia de enzimas con el objeto de obtener 
proteínas recombinantes intactas para ser utilizadas como control. 
Posteriormente se completó el protocolo de purificación. La concentración de 
las proteínas se determinó utilizando el método del BCA de acuerdo con las 
instrucciones del fabricante. Las proteínas rhZP desglicosiladas y sus controles 
se analizaron mediante Western blot (apartado 3.4). También se analizaron los 
carbohidratos presentes en ellas mediante el análisis de reconocimiento por 
lectinas (apartado 3.9) y mediante Lectin blot como se describe a continuación 
(apartado 3.12). Finalmente se analizó su capacidad de inducir RA (ver 
apartado 3.7). 
 
3.12. Lectin blot. 
 
 Las proteínas desglicosiladas y sus controles se analizaron por la técnica 
de Lectin blot(115). Para ello, las proteínas purificadas se separaron 
electroforéticamente mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida y se 
electrotransfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con 
BSA 1% en TBS, y posteriormente se incubó con la lectina biotinilada Con A 
(20 µg/ml) durante 1.5 horas. Luego de lavar la membrana se incubó con 
avidina-HRP (1 ng/µl) durante 1 hora. Como sustrato de la peroxidasa se 
utilizó DAB. 
 
3.13. Análisis estadístico. 
 
En los casos apropiados, los valores se presentan como la media + el 
error estándar (EE). Las diferencias estadísticas se establecieron utilizando el 
programa Graph Pad Statistical Package, mediante ANOVA y la prueba Tukey 
HSD para comparaciones post hoc. Valores de P < 0.05 se consideraron 
significativos. 
 
4. RESULTADOS 
 
4.1. Obtención y purificación de proteínas recombinantes de la 
ZP humana. 
 
Las proteínas recombinantes ZP2, ZP3 y ZP4 de la ZP humana se 
obtuvieron empleando el sistema de expresión del baculovirus. Después de 
infectar las células con los virus recombinantes obtenidos, se analizó la 
presencia de las proteínas de la ZP en las pastillas celulares mediante 
electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y Western blot como 
se muestra en la figura 4. En el gel teñido con azul de Coomassie se observa 
la presencia de unas bandas mayoritarias de proteína luego de infectar con los 
virus recombinantes para ZP2, ZP3 y ZP4, las cuales están ausentes en el 
extracto de proteínas de las células Sf9 sin infectar. Las mismas se 
identificaron mediante Western blot utilizando un anticuerpo policlonal anti-ZP 
total de cerdo que reconoce proteínas de la ZP nativa humana(54). Las proteínas 
recombinantes identificadas por el anticuerpo mostraron pesos moleculares 
aparentes de 66 kDa para ZP4, 81 kDa para ZP2 y 57 kDa para ZP3. Estos 
pesos son más altos que los esperados para los cDNA correspondientes(54), lo 
cual sugiere que las proteínas podrían estar glicosiladas. Además, dichos pesos 
se encuentran dentro de los rangos descritos para las proteínas de la ZP 
nativa(64,77,78). También se observó que la ZP3 presenta un patrón difuso en el 
Western blot, lo que puede ser debido a una glicosilación diferencial, similar a 
lo observado para la proteína ZP4 de conejo expresada en las células Sf9(106). 
 
 
 
 
 
 
 
97 kDa
66 kDa
46 kDa
Sf9 ZP4 ZP2 ZP3
220 kDa
Sf9 ZP4 ZP2 ZP3
97 kDa
66 kDa
46 kDa
220 kDa
A B
97 kDa
66 kDa
46 kDa
Sf9 ZP4 ZP2 ZP3
220 kDa
Sf9 ZP4 ZP2 ZP3
97 kDa
66 kDa
46 kDa
220 kDa
A B
 
 
Fig. 4: Análisis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (A) y Western blot (B) de las 
proteínas recombinantes de la ZP humana. Sf9: Extracto de proteínas de células Sf9 
sin infectar. ZP4: Extracto de proteínas de células Sf9 infectadas con el virus que 
contiene el cDNA para ZP4. ZP2: Extracto de proteínas de células Sf9 infectadas con el 
virus que contiene el cDNA para ZP2. ZP3: Extracto de proteínas de células Sf9 
infectadas con el virus que contiene el cDNA para ZP3. El Western blot corresponde a 
las mismas proteínas del gel, reconocidas por el anticuerpo anti-ZP de cerdo. 
 
 Las proteínas recombinantes obtenidas se purificaron mediante 
cromatografía de afinidad utilizando agarosa acoplada a Ni-NTA. De igual 
modo, los productos de la purificación se analizaron mediante geles 
desnaturalizantes de poliacrilamida y Western blot como se muestra en la 
figura 5. En ambos paneles se muestra el patrón de proteínas obtenido para 
el extracto celular (E.C.) seguido de la proteína purificada (P.P.) 
correspondiente para cada rhZP. En el gel teñido con azul de Coomassie (Fig. 
5A), en los carriles correspondientes a los E.C se pueden apreciar las proteínas 
totales de las células Sf9, además de las proteínas recombinantes 
correspondientes. Por su parte, en los carriles correspondientes a las P.P se 
observa una banda de aproximadamente 66 kDa para ZP4, otra banda de 81 
kDa para ZP2 y para ZP3 dos bandas de 66 y 57 kDa, mismas que fueron 
reconocidas por el anticuerpo en el Western blot (Fig. 5B). Además, en el gel 
teñido con azul de Coomassie, en los carriles de ZP2 y ZP3 purificadas se 
observa una banda de 50 kDa y otra de 40 kDa respectivamente que 
posiblemente sean proteínas constitutivas de las células Sf9 con cierta afinidad 
a los iones de níquel inmovilizados en la agarosa acoplada a Ni-NTA ya que no 
fueron reconocidas por el anticuerpo anti-ZP total de cerdo en el Western blot. 
 
97 kDa
66 kDa
45 kDa
220 kDa
30 kDa
ZP4
E.C. P.P.
ZP4
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
97 kDa
66 kDa
45 kDa
220 kDa
30 kDa
A B
97 kDa
66 kDa
45 kDa
220 kDa
30 kDa
ZP4
E.C. P.P.
ZP4
E.C. P.P.
ZP4
E.C. P.P.
ZP4
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP2
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
ZP3
E.C. P.P.
97 kDa
66 kDa
45 kDa
220 kDa
30 kDa
A B
 
Fig. 5: Análisis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (A) y Western blot (B) de 
las proteínas recombinantes ZP4, ZP2 y ZP3 purificadas. E.C.: Extracto celular de las 
células Sf9 infectadas con los virus recombinantes. P.P.: Proteína purificada. El 
Western blot corresponde a las mismas proteínas del gel, reconocidas por el anticuerpo 
anti ZP de cerdo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.2. Inducción de la reacción acrosomal por ZP2, ZP3 y ZP4. 
 
Las rhZP purificadas se emplearon para evaluar su actividad sobre la RA 
en espermatozoides, tal y como se describe en Materiales y Métodos. En la 
figura 6 se presentan los resultados de la RA inducida por las proteínas a 
diferentes tiempos de incubación, donde se observa un incremento en el 
porcentaje de espermatozoides que desarrollan RA cuando se incubaron con 
ZP4, ZP3 y CaI, mientras que no hubo cambios en los tratados con ZP2. La 
inducción de la RA fue detectable desde los 10 minutos de incubación, aunque 
la estimulación de la RA por ZP3 y ZP4 fue estadísticamente significativa a 
partir de los 20 minutos de incubación.0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (min)
R
e
a
cc
ió
n
 a
cr
o
so
m
a
l 
(∆
%
)
ZP4
ZP2
ZP3
CaI
*
*
*
**
 
 
Fig. 6: Curva de tiempo del efecto de las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4 sobre la reacción 
acrosomal. El estado del acrosoma se evaluó mediante tinción con PSA-FITC y los 
valores fueron normalizados contra la RA espontánea. Como control positivo de la RA 
se incubaron espermatozoides con CaI. El porcentaje de reacción acrosomal de los 
espermatozoides incubados con ZP4, ZP3 y CaI fue significativamente mayor que el 
control a los 20 y a los 120 min. Los resultados se expresaron como la media + EE. 
* P ‹ 0.05 vs control (mHTF) a cada tiempo de incubación. n = 8. 
 
Debido a que la ZP está compuesta por múltiples proteínas, se trató a 
espermatozoides con la combinación de las proteínas ZP3 y ZP4 con el objetivo 
de observar si tenían un efecto aditivo o sinérgico en la inducción de la RA. El 
resultado se muestra en la figura 7, donde se observa que la combinación de 
ambas proteínas induce la RA de manera similar a las proteínas individuales. 
 
0
5
10
15
20
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (min)
R
ea
cc
ió
n 
ac
ro
so
m
al
 ( ∆
%
)
ZP4
ZP3
ZP4+ZP3*
*
*
*
Fig. 7: Curva de tiempo del efecto de las proteínas recombinantes ZP4, ZP3 y la 
combinación de ambas sobre la RA. El estado del acrosoma se evaluó mediante tinción 
con PSA-FITC y los valores se normalizaron contra la RA espontánea. El porcentaje de 
reacción acrosomal de los espermatozoides incubados con ZP4, ZP3 y su combinación 
fue significativamente más alto que el control negativo desde los 10 minutos de 
incubación. Los resultados se expresaron como la media + EE. * P ‹ 0.05 vs control 
(mHTF) a cada tiempo de incubación. n = 3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.3. Identificación de los carbohidratos presentes en las 
proteínas ZP2, ZP3 y ZP4. 
 
 Con el objetivo de determinar el tipo de carbohidratos presentes en las 
rhZP obtenidas, se llevó a cabo un análisis de reconocimiento por las lectinas 
Con A, DBA, PNA, RCA I, SBA, UEA I, WGA, AAA y Jac, cuya especificidad se 
detalla en el Anexo 2. El resultado de este análisis se resume en la tabla 3. 
 
 
Lectina Con A DBA RCA I PNA WGA UEA I SBA AAA Jac 
ZP4 ++++ + - - ++ - - +++ ++ 
ZP2 ++++ ++ - - + - - +++ ++ 
ZP3 ++++ ++ - - + - - +++ ++ 
 
Tabla 3: Análisis semicuantitativo del reconocimiento de ZP2, ZP3 y ZP4 por 
lectinas. (++++) reconocimiento muy alto, (+++) reconocimiento alto, (++) 
reconocimiento moderado, (+) reconocimiento bajo, (-) reconocimiento nulo (valor 
de absorbancia < 0.05). 
 
 La lectina AAA presentó una alta unión a las tres rhZP, aunque el 
reconocimiento más alto fue con la Con A, mientras que con la Jac se obtuvo 
un reconocimiento moderado. Con la DBA, ZP2 y ZP3 presentaron un 
reconocimiento moderado y ZP4 presentó un reconocimiento bajo. En cambio 
la WGA presentó una unión baja a ZP2 y ZP3 y moderada a ZP4. Las lectinas 
RCA I, PNA, UEA I y SBA no reconocieron a ninguna de las rhZP. 
 
Debido a que la AAA se une tanto a residuos de fucosa α 1-6 ligados a 
NAcGlc como a residuos terminales de fucosa con ligaciones α 1-2(117), pero la 
lectina UEA I, que reconoce residuos de fucosa con enlaces α 1-2, no se unió a 
las rhZP, se puede inferir que las tres rhZP contienen residuos de fucosa del 
tipo α 1-6 ligados a NAcGlc. Estudios previos han demostrado que las ZP’s 
nativas de especies como el humano(99), el ratón(118) y el cerdo(119), presentan 
dicha estructura. 
 
La lectina WGA se une tanto a residuos de ácido siálico como a residuos 
de NAcGlc en secuencias de polilactosamina (Galβ1-4NAcGlc repetidas varias 
veces)(120), por lo que no es posible determinar si en las rhZP están presentes 
ambas estructuras o solamente una de ellas. Por otra parte, existe la 
posibilidad de que las lectinas PNA y RCA I (reconocimiento a β-gal en las 
estructuras Galβ1-3NAcGal y Galβ1-4NAcGal respectivamente) no se unieran a 
las rhZP debido a que sus ligandos específicos hubieran quedado 
enmascarados por residuos de ácido siálico, ya que los carbohidratos 
terminados en galactosa son susceptibles de sialización. En un estudio 
precedente en el que se caracterizaron los carbohidratos de la ZP humana se 
observó reconocimiento nulo con la lectina PNA antes del tratamiento con 
neuraminidasa y positivo después(99), lo que sugiere la presencia de residuos 
de ácido siálico. De cualquier forma no es posible establecer de manera 
concluyente la presencia de residuos de ácido siálico en las proteínas rhZP 
basándonos en los resultados obtenidos, para ello sería necesario haberlas 
sometido a una digestión sólo con neuraminidasa. 
 
De acuerdo con los resultados obtenidos, las rhZP contienen residuos de 
manosa, α-NAcGal, fucosa, ácido siálico y/o NAcGlc, y el antígeno Tn (NAcGal 
ligada al oxígeno de la serina del esqueleto polipeptídico). Además las lectinas 
Con A y AAA reconocen carbohidratos ligados a N mientras que la Jac reconoce 
carbohidratos ligados a O, por lo que se puede concluir que las rhZP poseen 
carbohidratos con ambos tipos de estructuras. 
 
 
 
 
 
4.4. Carbohidratos presentes en cortes de tejido ovárico 
humano. 
 
 Con la finalidad de determinar el tipo de carbohidratos presentes en la 
ZP humana nativa, se utilizaron cortes de ovario humano que fueron 
analizados por lectin-histoquímica con las lectinas Con A, DBA, PNA, RCA I, 
SBA, UEA I, WGA, AAA y Jac. Sólo se obtuvo resultado positivo al incubar con 
la lectina AAA. Si bien no se realizó una detección específica de la ZP, la AAA 
reconoció intensamente el material en el margen exterior de la membrana 
plasmática del ovocito, región donde se encuentra localizada la ZP, así como 
también se obtuvo señal con esta lectina en el margen exterior de las células 
de la granulosa y en el interior del ovocito (Fig. 8A). De igual modo, estos 
análisis se realizaron después de tratar los cortes con neuraminidasa, 
observándose los mismos resultados (datos no mostrados). Con base en este 
resultado se puede sugerir que en la ZP de los folículos en desarrollo existe 
gran cantidad de fucosa, aunque cabe recordar que la AAA reconoce residuos 
de este carbohidrato sea cual sea su localización. Existe evidencia de un 
posible papel de este carbohidrato en la interacción entre gametos derivada de 
un experimento en el que se sometió a espermatozoides a una preincubación 
con D-fucosa y L-fucosa y se observó que la unión de éstos a la ZP humana se 
inhibía parcialmente(96). 
 
 
 A BA B 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8: Lectinhistoquímica de dos cortes de ovario humano donde se observa un 
folículo. (A) Tejido incubado con la lectina AAA biotinilada (20 µg/ml). (B) Control 
negativo incubado en ausencia de la lectina. Aumento de 400X. 
 
4.5. Desglicosilación de las proteínas ZP2, ZP3 y ZP4. 
 
Con la finalidad de estudiar la participación de los carbohidratos de las 
proteínas ZP2, ZP3 y ZP4 en la RA, dichas proteínas se trataron con las 
enzimas N-glicosidasa F, O-glicosidasa y neuraminidasa para obtener proteínas 
desglicosiladas. En la figura 9 se muestran las proteínas rhZP desglicosiladas 
y sus respectivos controles analizadas mediante Western blot con un 
anticuerpo policlonal anti-ZP total de cerdo (lado izquierdo) y Lectin blot 
empleando la lectina Con A (lado derecho). 
 
Al analizar las proteínas mediante Western blot, para la ZP4 
desglicosilada (ZP4d) se observaron dos bandas de proteína de 75.5 kDa y de 
67.5 kDa, mientras que para la proteína ZP4 intacta se observó una sóla banda 
de 75.5 kDa, esto indica que al menos una porción del total de la proteína ZP4 
fue desglicosilada. En cuanto a ZP2, se observó una reducción en el peso 
molecular de la ZP2 desglicosilada (ZP2d) en comparación con la ZP2 intacta, 
pasando de 88.5 kDa a 85.5 kDa, lo cual indica que la proteína fue 
desglicosilada. Para la ZP3, observamos tres productos de expresión