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FFAACCUULLTTAADD DDEE OODDOONNTTOOLLOOGGÍÍAA MARCADORES BIOLÓGICOS EN FLUIDOS BUCALES PARA DETECTAR PATOLOGIAS. T E S I N A QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE C I R U J A N A D E N T I S T A P R E S E N T A: ITZEL ESPERANZA SERVÍN RUEDAS TUTOR: MTRO. CÉSAR AUGUSTO ESQUIVEL CHIRINO ASESORA: C.D. LUZ DEL CARMEN GONZÁLEZ GARCÍA MÉXICO, D. F. 2008 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS A mis padres: Por los esfuerzos realizados para que yo lograra estudiar una carrera profesional, siendo para mi la mejor herencia. A mi madre que es el ser más maravilloso del mundo. Gracias por el apoyo moral, su cariño y comprensión que desde siempre me ha brindado, para guiar mi camino y estar junto a mí en los momentos más difíciles. A mi padre por que ha sido para mí un hombre grande y maravilloso y que siempre he admirado. Gracias por guiar mi vida con su inteligencia, paciencia y cariño. A mis hermanas: Por ayudarme cuando lo necesite. Con Amor, Respeto y Admiración. A mi Universidad: Gracias a la Universidad Nacional Autónoma de México por la oportunidad de estudiar mi licenciatura en la máxima casa de estudios. Orgullosamente UNAM ÍNDICE CAPÍTULO I 1. Introducción……………………………………………………………...7 CAPÍTULO II 2. Aspectos generales de la Saliva…………………………………..8 CAPÍTULO III 3. Glándulas que producen la secreción salival……………………. 10 3.1. Glándula Parótida………………………………………………………..11 3.2. Glándula Submandibular………………………………………………..14 3.3. Glándula Sublingual……………………………………………………..16 CAPÍTULO IV 4. Composición de la Saliva…………………………………………………18 4.2 Carbohidratos………………………………………………………………18 4.3 Inmunoglobulina IgA, IgG y IgM..………………………………………..18 4.4 Factores de la coagulación……………………………………………….19 CAPÍTULO V 5. Enzimas que se encuentran en Saliva..……………………………….21 5.1 Lactato deshidrogenada…………………………………………………..21 5.2 Aspartato aminotransferasa………………………………………………22 5.3 Fosfatasa ácida……………………………………………………………23 5.4 Fosfatasa alcalina…………………………………………………………23 5.5 Amilasa salival……………………………..………………………………24 5.6 Lisozima…………………………………………………………………….25 5.7 Peroxidasa………………………………………………………………….25 5.8 Anhidrasa carbónica………………………………………………………26 5.9 Lipasa lingual………………………………………………………………26 CAPÍTULO VI 6. Proteínas que se encuentran en Saliva………………………….... 29 6.1 Mucinas………………………………………………………………….. 29 6.2 Lactoferrina……………………………………………………………… 30 6.3 Apolactoferrina………………………………………………………….. 30 6.4 Fibronectina……………………………………………………………….30 6.5 Cistatinas…………………………………………………………………..31 6.6 Estaterina…………………………………………………………………..31 6.7 Histatinas…………………………………………………………………...31 CAPÍTULO VII 7. Funciones de la Saliva…………………………………………………….34 7.1 Lubricación y Humidificación……………………………………………..34 7.2 Mantenimiento del equilibrio ecológico………………………………….34 7.3 Función de limpieza……………………………………………………….35 7.4 Integridad dental…………………………………………………………...35 7.5 Función digestiva……………………………………………………….. 37 7.6 Capacidad Buffer….………………………………………………………37 7.7 Función gustativa…………………………………………………………38 7.8 Función diluyente y atemperadora………………………………………38 7.9 Función excretora………………………………………………………….38 7.10 Acción sobre la coagulación…………………………………………….39 CAPÍTULO VIII 8. Método de recolección de Saliva..……………………………………..40 8.1 Procedimiento para obtener la saliva total estimulada……………….45 8.2 Procedimiento para obtener la saliva total no estimulada…………….48 CAPÍTULO IX 9. Fluido Gingival Crevicular.……………………………………………....50 CAPÍTULO X 10. Composición del Fluido Gingival Crevicular………………………53 CAPÍTULO XI 11. Obtención de muestras de Fluido Gingival Crevicular.………..63 CAPÍTULO XII 12. Fluidos Orales como método diagnóstico…………………………65 CAPÍTULO XIII 13. Marcadores biológicos detectados en Fluidos Orales.…………76 CONCLUSIONES..………………………………………………………………100 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFIAS……..……………………………………...101 7 1. INTRODUCCIÓN Desde hace varios años se han realizado estudios con los fluidos orales para poder descubrir su potencial diagnóstico frente a distintas patologías. Gracias al desarrollo de grandes avances tecnológicos apoyados en el área de proteomica y genómica hoy en día se pueden analizar sustancias en cantidades muy pequeñas para facilitar el desarrollo de métodos diagnósticos menos invasivos y de fácil obtención sin causar estrés a los pacientes. Los fluidos orales tanto la saliva como el fluido gingival crevicular son un novedoso método no invasivo que posee numerosas ventajas para realizar el diagnóstico de varias enfermedades. En este trabajo se analizó la información sobre los fluidos orales y sus diversos componentes que pueden ser utilizados como método diagnóstico. Los fluidos orales son secreciones en las cuales se pueden encontrar muchos de los componentes que se encuentran en el suero, el poder utilizar ambos métodos de diagnóstico, permitirá realizar mejores diagnósticos. Actualmente la importancia de obtener un diagnóstico temprano, certero y confiable es necesario para poder detectar patologías en fases tempranas o intervenir en fases tardías evitando el desarrollo y progresión de diversas patologías, discapacidades así como la muerte. 8 CAPÍTULO II 2. Aspectos generales de la Saliva La saliva es una secreción compleja que proviene principalmente de las glándulas salivales mayores en el 93% de su volumen y de las glándulas menores en el 7% restante. Estas glándulas las cuales se extienden por todas las regiones de la boca excepto en la encía y en la región anterior del paladar duro. El 99% de la saliva esta compuesta de agua mientras que el 1% restante está constituido por moléculas orgánicas e inorgánicas. La saliva es estéril cuando sale de las glándulas salivales, pero deja de serlo inmediatamente cuando se mezcla con el fluido crevicular, restos de alimentos, microorganismos y células descamadas de la mucosa oral, etc. La secreción diaria de saliva oscila entre 800 y 1500 mililitros, con un volumen promedio en la boca de 1.1mL. Su producción está controlada por el sistema nervioso autónomo (SNA). En reposo, la secreción oscila entre 0.25 y 0.35 mL y esta secreción procede principalmente de las glándulas submandibulares y sublinguales. El mayor volumen salival se produce antes, durante y después de las comidas, alcanzando su pico máximo alrededor de las 12 del mediodía y disminuye de forma muy considerable por la noche, durante el sueño1. Su pH promedio es de 6.8 a 7.2 en los adultos. La fracción más grande en peso en la saliva es el componente proteíco; gran parte corresponde a glucoproteínas, proteínasdel plasma, anticuerpos, substancias de los grupos sanguíneos y enzimas. Las principales funciones de la saliva son 9 proporcionar un medio protector para los dientes y la mucosa bucal, así como la lubricación para la maceración y deglución del alimento. La función de lubricar la proporcionan las glucoproteínas de alto peso molecular conocidas a veces como mucinas que comprenden 7 a 26% de las proteínas salivales totales. Proporcionan viscosidad porque pueden unir moléculas de agua a sus múltiples grupos hidroxilo. La protección bacteriana la proporcionan las glucoproteínas unidas a las superficies y diversos sistemas antibacterianos inespecíficos. La protección contra la disolución de los tejidos duros la proporcionan amortiguadores salivales y la conservación de una concentración sobresaturada pero estable de los iones calcio y fosfato salivales.2 10 CAPÍTULO III 3. Glándulas que producen la secreción salival La saliva es producida por glándulas especializadas que en general se clasifican en dos clases: salivares mayores (principales) y salivares menores (accesorias). Las glándulas mayores, en número de tres a cada lado son: Parótida, Submandibular y Sublingual. Vierten su producto en la cavidad oral por conductos bien diferenciados. Las glándulas menores constituyen infinidad de pequeñas glándulas rudimentarias que se encuentran dispersas irregularmente en la mucosa o submucosa de todas las paredes de la boca.5 Figura 1. Glándulas salivales11. 11 3.1 Glándula Parótida. La glándula parótida recibe este nombre porque ocupa, junto al oído externo, el espacio que superficialmente se extiende entre el borde posterior de la rama mandibular y el anterior del esternocleidomastoideo; en profundidad se extiende hasta la pared lateral de la faringe. Es la de mayores dimensiones. Se extiende de la base del cráneo hasta un plano caudal al ángulo de la mandíbula; su volumen y peso son muy variables de 25 a 30 g en promedio. Presenta consistencia firme y aspecto multilobulillado, se encuentra alojada en un compartimiento que le forma la fascia parotídea. La fascia superficial que cubre a la glándula se extiende hasta la fascia masetérica. La fascia profunda se extiende en sentido lateroventral para insertarse en la rama de la mandíbula y continuarse con la fascia masetérica. El piso de la celda parotídea, más estrecho, está formado por un tabique irregular que le separa del compartimiento destinado a la glándula sumbandibular llamado tabique submandibuloparotídeo. En su base superior se encuentra el meato acústico y la articulación temporomandibular; por el agujero estilomastoideo emerge el nervio facial, que penetra en la glándula parótida. En su cara inferior se relaciona con un tabique fibroso que le separa de la glándula submandibular. 12 En su cara dorsomedial se relaciona, con el esternocleidomastoideo, el vientre posterior del músculo digástrico, el paquete neurovascular del cuello y, por último, con el proceso estiloideo. El borde medial contacta habitualmente con la faringe en mayor o menor grado, con: carótida interna y yugular interna; nervios vago, glosofaríngeo, hipogloso, accesorio y laríngeo superior; ganglios ótico y cervical superior del simpático; arterias palatina ascendente, faríngea ascendente y maxilar. • En su cara anterior se relaciona en su porción profunda con el pterigoideo medial; y enseguida con el borde posterior de la mandíbula y el del masetero • En su cara lateral se relaciona con la fascia superficial y la piel. • El borde anterior se extiende sobre la cara superficial del masetero, y de esta prolongación anterior, por su cara profunda, emerge, por una o dos raíces, el conducto parotídeo de Stenon. Este tiene en su luz un diámetro medio de 3 mm y una longitud de 3 a 4 cm. Inicialmente, el conducto parotídeo está cubierto por la mencionada prolongación de la glándula; a continuación se aplica a la cara superficial del masetero, cruza su borde anterior, contornea luego el cuerpo adiposo de la mejilla y alcanza al buccinador para después de un corto trayecto submucoso, formar, en la pared yugal del vestíbulo de la boca, frente al cuello del segundo molar superior, una pequeña eminencia llamada papila parotídea, en cuya cima desemboca por un orificio pequeño. La glándula parótida es irrigada por múltiples ramitos colaterales de las arterias que están en su espesor: carótida externa, maxilar, temporal superficial, transversa de la cara, auriculares, anterior y posterior. La circulación venosa se efectúa por las venas intraparotídeas que, en última 13 instancia, son afluentes mediatos o inmediatos de la yugular externa. La circulación linfática, que hace un relevo inicial en los linfonodos intraparotídeos, es tributaria de los linfonodos de la cadena yugular. La inervación es principalmente de carácter autónomo. Las fibras simpáticas, portadoras de estímulos vasomotores, proceden de los plexos periarteriales intraparotídeos. Las parasimpáticos, conductoras de estímulos secretores, llegan a la glándula integradas al nervio auriculotemporal, rama del nervio mandibular -tercera rama del quinto par-; son fibras posganglionares, que comunican con el auriculotemporal, han hecho relevo en el ganglio ótico y proceden del nervio glosofaríngeo (noveno par).5 Figura 2. Glándula Parótida24. 14 3.2 Glándula Submandibular. Esta glándula es más pequeña que la glándula parotídea, pero más grande que la sublingual. Se encuentra en la región suprahioidea, alojada en una celda cuya forma semeja a un prisma triangular de eje ventrocraneal, y se integra debido a que la lámina superficial del cuello, después de insertarse en el hueso hioideo, se desdobla. La hoja superficial se extiende hasta insertarse en la base de la mandíbula. La hoja profunda, se inserta en la línea milohioidea. La pared lateral corresponde a la fosa submandibular, excavada en la cara profunda del cuerpo de la mandíbula. De forma irregular, la glándula submandibular semeja a una almendra con sendas prolongaciones dorsal y ventral. La cara lateral corresponde a la fosa submandibular. El conducto submandibular de Warton de 2 a 3 mm de diámetro por 5 cm de longitud se origina por la confluencia de conductillos y emerge hacia la parte central de la cara profunda de la glándula, continúa en dirección ventromedial, entre la glándula y el hiogloso, alcanza el milohioideo y sigue por su cara profunda, por lo que este músculo queda interpuesto entre el conducto y la glándula. Rebasa al músculo y contacta con la prolongación anterior; se hace medial a la glándula sublingual, hasta alcanzar el surco alveololingual junto a la línea media y termina por abrirse en la papila sublingual a los lados del borde libre del frenillo. La glándula submandibular recibe sangre arterial de la facial, directamente o por medio de sus colaterales (palatina ascendente y submental). La sangre venosa es recogida por venas acompañantes de las arterias mencionadas, en tanto que la linfa drena en los linfonodos submandibulares. 15 Las fibras simpáticas vasomotoras proceden del ganglio simpático cervical superior, las fibras secretoras del parasimpático provienen inicialmente del nervio facial, hacen relevo en el ganglio submandibular, y ahí parten las neurofibras posganglionares que abordan directamente a la glándula.5 Figura 3. Glándula submandibular24. 16 3.3 Glándula Sublingual. La glándula sublingual, la más pequeña en volumen y peso, representa un tercio aproximadamente de la submandibular. Está ubicada en el surco alveololingual,subyacente a la mucosa. Con su borde craneal produce una elevación que se denomina eminencia sublingual. La glándula tiene forma elipsoidal y está aplanada transversalmente y mide 3 cm de longitud, aproximadamente. En su cara lateral la fosa sublingual. Su cara medial se relaciona con el conducto submandibular. Por su extremo posterior, la glándula que nos ocupa contacta con la prolongación anterior de la glándula submandibular, en su extremo anterior queda parcialmente separado de su homónimo por la inserción del geniogloso, en la espina mental. La excreción de la glándula sublingual se efectúa por un conducto principal y varios conductos accesorios. El principal, llamado sublingual de Rivinus o de Bartholin, se desprende cerca del extremo posterior, por la cara profunda; asciende adosado a la cara lateral del conducto submandibular, y temina al lado de éste, en el surco alveololingual, al abrirse en un pequeño orificio. Los conductos accesorios, en número muy variable ( de 20 a 30), son muy cortos y delgados. La glándula sublingual recibe sangre por las arterias sublingual y lingual, y retorna por afluentes de la vena lingual; en tanto que la linfa drena por los linfonodos submandibulares. 17 Los nervios se comportan igual que en la glándula submandibular, con la diferencia de que las neurofibras posganglionares (parasimpáticos), a partir del ganglio submandibular, se incorporan al nervio lingual y llegan por él a esta glándula. Por su estructura se les puede dividir en tres tipos: seroso, mucoso y mixto. La glándula parótida contiene exclusivamente células serosas. Éstas son de núcleo esférico y citoplasma basófilo, cuyos gránulos de cimógeno albergan la enzima ptialina contenida en el producto de secreción que es un líquido claro y fluido y cuyo papel es hidrolizar los almidones. Las glándulas submandibulares y sublingual son mixtas, pero de predominio mucoso; en cambio, las glándulas accesorias son exclusivamente mucosas. Las células de éstas secretan mucina y glucoproteína, que es el componente principal del moco5. Figura 4. Glándula Sublingual24. 18 CAPÍTULO IV 4. Composición de la saliva. Cada glándula salival produce una secreción característica y compleja que consiste en electrólitos, proteínas, glucoproteínas y lípidos. La saliva posee componentes orgánicos e inorgánicos; entre los inorgánicos podemos encontrar iones calcio, fosfato, magnesio7, fluoruro, sodio, potasio, bicarbonato y cloruro3. Dentro de los componentes orgánicos se detectan carbohidratos, proteínas ricas en prolina, glucoproteínas las que se caracterizan por su contenido de aminoácidos prolina, glutamina y glicina; mucinas, histatinas, estaterinas, cistatinas, lactoferrina, apolactoferrina, lipasa lingual, fibronectina y enzimas tales como alfa amilasa, peroxidasa salival, anhidrasas carbónicas, lisozima, fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa y lactato deshidrogenasa. 4.1 Carbohidratos La saliva posee pequeñas cantidades de carbohidratos libres, especialmente glucosa proveniente de la dieta y de la degradación de las glucoproteínas salivales por enzimas bacterianas como la glucosidasa7. 4.2 Inmunoglobulinas IgA, IgG e IgM. Ocurre en una diversidad de formas poliméricas de la molécula básica de inmunoglobulina, a partir de monómero a trímero e incluso formas superiores. 19 La IgA es la inmunoglobulina principal en las secreciones exocrinas como: saliva, leche, secreciones respiratorias, mucina intestinal y lágrimas. Las células que producen IgA se concentran en el tejido subepitelial de las glándulas exocrinas y reaccionan ante antígenos que aparecen localmente. La IgA sérica es principalmente monómero, en tanto que la IgA secretoria es un dímero, que contiene un fragmento secretorio y una cadena J que se fija a moléculas IgA mediante enlaces disulfuro. El tejido gingival y el líquido del surco contienen IgA sérica más que IgA secretoria. Las propiedades de los anticuerpos de IgA secretoria los hacen peculiares e influencian su función en las superficies mucosas. La IgA secretoria resiste más que otras inmunoglobulinas la digestión por enzimas proteolíticas. Hay mucho interés por los efectos protectores de los anticuerpos secretorios contra enfemedades bacterianas y virales en las superficies mucosas. La IgA, a diferencia de IgG e IgM, no activa el complemento por la vía clásica, que comienza con la fijación de complemento a la porción Fc de la molécula de inmunoglobulina. Se describió una vía alterna de activación del complemento; comprende los últimos componentes del complemento, C3 hasta C9, mas no C1, C4 o C2. La inmunoglobulina agregada, incluyendo IgA, puede activar esta vía alterna. Los anticuerpos secretorios pueden evitar o reducir la adhesión de bacterias a las superficies hísticas. Se estima que este mecanismo de protección opera en las enfermedades bacterianas y la caries dental, así como tal vez en la fase temprana de la enfermedad periodontal20. 4.3 Factores de la coagulación La saliva también contiene factores de coagulación (factores VIII, IX, X y XII, antecedente de tromboplastina plasmática (PTA) y el factor de Hageman) que acelera la coagulación sanguínea y protegen a las heridas de la invasión bacteriana8. 20 Tabla 1. Composición de la saliva total en reposo (mixta). (Según Jenkins, 1978)2 CONCENTRACIÓN (mg/100ml) COMPONENTE MEDIA LIMITES Orgánicos Proteínas totales Carbohidrato glucoproteína: Hexosamina Fucosa Acido siálico Hexosas totales Amilasa Lizosima IgA IgG IgM Glucosa Urea Colesterol AMPc 220 10 9 1.2 19.5 38 22 19 1.4 0.2 1.0 20 8 7 140-160 2-22 3-24 0.3-2.1 7.3-4.4 12-70 2.5-50 Inorgánicos Sodio* Potasio Calico Bicarbonato* Fosfato (como P) Cloruro Fluoruro 15 80 5.8 Ca. 10 16.8 50 0.028 0-20 60-100 2.2-11.3 6.1-7.1 0.015-0.045 *Aumenta de manera importante en la estimulación. 21 CAPÍTULO V 5. Enzimas que se encuentran en saliva. 5.1. Lactato deshidrogenasa (LDH). La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima catalizadora que se encuentra en muchos tejidos del cuerpo, pero su presencia es mayor en el corazón, hígado, riñones, músculos, glóbulos rojos, cerebro y pulmones. Esta enzima es una oxidorreductasa, dado que cataliza una reacción redox, en la que el piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. Dado que esta enzima también puede catalizar la oxidación del hidroxibutirato, ocasionalmente es conocida como Hidroxibutirato Deshidrogenasa (HBD). Participa en el metabolismo energético anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente de la glucolisis) para regenerar el NAD+, que en presencia de glucosa es el sustrato limitante de la vía glucolítica. Los vertebrados, en algunos tejidos o tipos celulares, obtienen la mayor parte de su energía del metabolismo anaerobio (toda en el caso de eritrocitos dado que carecen de mitocondrias)12. Figura 5. Reacción de lactato deshidrogenasa51. 22 La LDH pasa a la sangre ante toda destrucción de estos tejidos (traumática, infecciosa o neoplásica), por lo que su elevación en el suero es un signo inespecífico de organicidad de un proceso, es decir, de que un órgano o tejido ha sido lesionado. También es un índice de proliferación en el seguimiento de una neoplasia y es valiosa para el diagnóstico y seguimiento del infarto agudo de miocardio. Los niveles aumentados de LDH pueden indicar: • Cardiopatías: infarto de miocardio, miocarditis, insuficiencia cardíaca aguda, arritmiascardíacas. • Enfermedades hematológicas. • Hepatopatías: hepatitis, hepatopatía tóxica, obstrucción de las vías biliares. • Metástasis tumorales. • Otros: tromboembolismo pulmonar, neumonías, insuficiencia renal aguda, infarto renal, hipotiroidismo, ejercicio muscular muy violento, fiebre tifoidea, tratamiento con medicamentos hepatotóxicos, alcoholismo51. 5.2 Aspartato aminotransferasa (AST). La aspartato aminotransferasa o AST, antes conocida como transaminasa glutámico-oxalacética (GOT), es una enzima aminotransferasa que se encuentra en varios tejidos del organismo de los mamíferos, especialmente el corazón, el hígado y el tejido muscular. Se encuentran cantidades elevadas de esta enzima en el suero en casos de infarto agudo de miocardio, hepatopatía aguda, miopatías, por el empleo de determinados fármacos y en cualquier enfermedad o trastorno en el cual resulten seriamente dañadas las células12. 23 5.3. Fosfatasa ácida. La fosfatasa ácida es una enzima que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas sus cantidades en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Esta enzima cataliza la hidrólisis de los fosfomonoésteres, como el p-nitrofenilfosfato, a través de un proceso cinético uni-biordenado, caracterizado por liberarse en primer lugar el p-nitrofenol y seguido de esto lo haría el fosfato inorgánico. En esta secuencia de reacción se formaría un complejo intermedio covalente enzima-fosfato, el que probablemente sería limitante de la reacción total del proceso catalítico17. 5.4. Fosfatasa alcalina (FAL). La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. El proceso de eliminar el grupo fosfático se denomina desfosforilación. Como sugiere su nombre, las fosfatasas alcalinas son más efectivas en un entorno alcalino. La fosfatasa alcalina recibe el nombre de orto-fosfórico-monoéster hidrolasa. Éstas enzimas proceden de la ruptura normal de las células sanguíneas y de otros tejidos, muchas de ellas no tienen un papel metabólico en el plasma excepto las enzimas relacionadas con la coagulación y con el sistema del complemento La fosfatasa es una enzima clasificada dentro de las hidrolasas. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón tanto el aumento, así como su 24 disminución en plasma tienen significado clínico. Las causas de un aumento de fosfatasa alcalina son: • Enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatoxicidad por medicamentos y osteomalacia. Las causas de una disminución de fosfatasa alcalina: • Cretinismo y déficit de vitamina C54 5.5. Amilasa salival. La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa; se divide en grupos glucosilados o no glucosilados, esta enzima tiene un peso molecularde 62 o 55 kilodaltons. Cada grupo contiene varias isoenzimas que difieren en la base en sus propiedades de carga. Esta enzima tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, es la enzima bucal más destacada e importante. La concentración en saliva parotidea suele ser el cuádruple respecto a la submandibular. La cantidad es variable, se produce principalmente en las glándulas salivares y en el páncreas, tiene un pH de 7. Cuando uno de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre2 así como también el consumo de dietas altas en carbohidratos produce una elevación del contenido de amilasa en la saliva17. Recientemente se han descrito funciones adicionales para esta molécula. Su capacidad de obstaculizar el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, su presencia en la cutícula adquirida del esmalte y su capacidad de fijar el Streptococcus sanguis indican una función en la colonización microbiana bucal20. 25 5.6. Lisozima. Es una proteína básica y una enzima también llamada muramidasa. Su eficiencia depende del pH. Produce lisis de las bacterias catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano, influyendo en el balance ecológico de la flora oral. La saliva sublingual y submandibular contiene niveles más altos de lisozima que la saliva parotidea. La lisozima junto con el calcio salival coadyudan a la actividad acelerante de la coagulación sanguínea por la saliva pero de una manera muy discreta17. La lisozima es abundante en numerosas secreciones como la saliva, las lágrimas y el moco. Está presente también presente en los gránulos citoplasmáticos de de los neutrófilos polimorfonucleares PMN. Una gran cantidad de esta enzima puede hallarse en las claras de huevo2. 5.7. Peroxidasa. Las peroxidasa son enzimas que catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido. En animales, existen peroxidasas con una función predominantemente defensiva en la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carácter oxidante con fines germicidas y bactericidas del peróxido que se genera de forma endógena mediante otras reacciones. Prácticamente todas las peroxidasas son hemoproteínas y tienen como substrato común el H2O2 o peróxido de hidrógeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el inferior, dando lugar a una inhibición por exceso de sustrato ya que cuando ambas posiciones están ocupadas por el peróxido de hidrógeno no es posible la unión del otro sustrato2. 26 5.8. Anhidrasa Carbónica. La anhidrasa carbónica, pertenece a una familia de metaloenzimas de zinc (enzimas que contienen uno o más átomos metálicos como componente funcional de la enzima) constituyen una familia de por lo menos seis isoenzimas diferentes20 y que catalizan la conversión rápida de dióxido de carbono a bicarbonato y protones, una reacción que ocurre más lenta en ausencia del catalizador. El sitio activo de la mayoría de las anhidrasas carbónicas contiene un ión de Zinc (Zn). La función primaria de la enzima en animales es interconvertir el dióxido de carbono y el bicarbonato para mantener el equilibrio ácido-base en la sangre y otros tejidos, y ayudar al transporte de dióxido de carbono fuera de los tejidos12. 5.9. Lipasa lingual. La lipasa lingual se secreta en forma constante en baja cantidad. Sin embargo, ante la presencia del alimento en la boca (factor mecánico) y/o por estimulación parasimpática (factor neurológico), la enzima es secretada en gran cantidad en la cavidad bucal. Esta lipasa actúa sobre el bolo alimentario en su tránsito hacia el estómago y también durante la permanencia del alimento en este órgano. En las secreciones de las glándulas serosas de Ebner, se ha demostrado que contienen una potente lipasa, la cual hidroliza los triglicéridos de cadena larga para liberar los ácidos grasos y glicéridos parciales. El pH óptimo de la lipasa lingual es de 4,5 pero su actividad comienza a pH 2 y aún es activa a pH 7,5. La enzima no es inactivada por la actividad proteolítica de la pepsina gástrica, por lo cual sigue actuando en la cavidad gástrica. La lipasa lingual es una acil-ester-hidrolasa de alta especificidad, ya que reconoce casi específicamente la posición sn-3 de los triglicéridos, siendo mucho menos efectiva para actuar en la posición sn-1 y no actúa sobre la posición sn-22. 27 Tabla 2. Enzimaspresentes en saliva. ENZIMA FUNCIÓN SE UTILIZA PARA DIAGNOSTICO CANTIDAD Lactato deshidrogenasa (LDH) Cataliza reacciónes de óxido-reducción, en la que el piruvato es reducio a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+ 51 Los niveles aumentados de LDH pueden indicar: Cardiopatías: infarto de miocardio, miocarditis, insuficiencia cardíaca aguda, arritmias cardíacas. Enfermedades hematológicas. Hepatopatías: hepatitis, hepatopatía tóxica, obstrucción de las vías biliares. Metástasis tumorales. Otros: tromboembolismo pulmonar, neumonías, insuficiencia renal aguda, infarto renal, hipotiroidismo, ejercicio muscular muy violento, fiebre tifoidea, tratamiento con medicamentos hepatotóxicos, alcoholismo51. 100- 320U/L50 Aspartato aminotransferasa (AST) Esta enzima cataliza la reacción de transferencia de un grupo amino desde el L-aspartato al 2- oxoglutarato formándose L- glutamato y oxaloacetato. Esta enzima utiliza el piridoxal 5'-fosfato como cofactor12. Se encuentran cantidades elevadas de esta enzima en el suero en casos de infarto agudo de miocardio, hepatopatía aguda, miopatías, por el empleo de determinados fármacos y en cualquier enfermedad o trastorno en el cual resulten seriamente dañadas las células12 M 9.25U/L H 10- 40U/L51 Fosfatasa ácida Cataliza la hidrólisis de los fosfomonoésteres17. - 5 ng/ml17 Fosfatasa alcalina (ALP) Elimina grupos fosfato de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides52. Aumenta a causa de: Enf. Ósea de Paget, destrucciones hepáticas, hepatitis, hepatoxicidad por medicamentos y osteomalacia. Se encuentra disminuida a M 30- 100U/L H 45- 115U/L51 28 causa de: Cretinismo y déficit de vitamina C53. Amilasa salival Tiene la función de digerir el glucogeno y el almidón para formar azúcares simpoles17. - Lisozima Produce lisis de bacterias catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N- acetilmurámico y N-acetil-D- glucosamina en un péptido glicano17. - 85- 90mg/ml Peroxidasa Enzimas que catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido2. - < 1200 U/L Anhidrasa carbonica La función primaria de la enzima en animales es interconvertir el dióxido de carbono y el bicarbonato para mantener el equilibrio ácido-base en la sangre y otros tejidos, y ayudar al transporte de dióxido de carbono fuera de los tejidos12. - - Lipasa lingual Hidroliza los trigliceridos de cadena larga para liberar los ácidos grasos y glicéridos parciales. - - 29 CAPÍTULO VI 6. Proteínas que se encuentran en la Saliva. 6.1 Mucinas Las mucinas son glucoproteínas de alto peso molecular constituidas por más de 40% de carbohidratos. El péptido principal de las mucinas contiene un gran número de cadenas laterales de carbohidratos, que varían de tamaño, composición y peso20. En saliva submandibular y sublingual del ser humano se han identificado dos mucinas químicamente diferentes llamadas glucoproteínas mucina 1 (GM1) y glucoproteínas mucina 2 (GM2). Las propiedades viscoelásticas de estas mucinas ayudan a la formación del bolo alimenticio para la masticación y deglución eficaz. Las diferencias estructurales entre las dos mucinas determinan que participen en funciones diferentes. Las GM1 actúa en la interfase tejidos duros-blandos y aporta una barrera de permeabilidad para proteger contra la desecación y la abrasión7. En proporción similar a esta función propuesta, la MG1 también puede actuar como glucoproteína lubricante para reducir al mínimo la abrasión entre las superficies dentales ocluyentes. Al combinarse con factores antimicrobianos en la saliva, la MG1 también puede actuar como portador para localizar estas moléculas protectoras en las interfases tejido-entorno. Varios estudios muestran que la adhesión bacteriana a la superficie dental está mediada por mucinas salivales que cubre la superficie dental como parte de la cutícula adquirida del esmalte. En contraste, la cubierta de las bacterias no adheridas mediante moléculas salivales como mucinas pueden impedir su adhesión a las superficies bucales y así facilitar la limpieza microbiana de la 30 cavidad bucal esas interacciones son selectivas y pueden ser mediadas, en parte, por las cadenas de carbohidratos de las mucinas20. 6.2 Lactoferrina La lactoferrina, una proteína termoestable de 76 kilodanltons que también se encuentra en la leche materna, actúa sobre un amplio espectro de microorganismos y tiene efecto bacteriostático por su capacidad de secretar hierro hasta niveles incompatibles con el desarrollo bacteriano7. Fija dos átomos de hierro por molécula, con la unión simultánea de dos moléculas de bicarbonato. Además posee un efecto bactericida directo independiente del hierro, en diversas cepas de estreptococos mediado por un sitio blanco aniónico para lactoferrina en la superficie de estos microorganismos20. 6.3 Apolactoferrina Se trata de una lactoferrina libre de hiero que ejerce una acción bactericida sobre S. mutans basada en una interacción apolactoferrina- anión. Como este mecanismo opera en condiciones de aerobiosis permite mantener a S. mutans en bajas concentraciones en la saliva pero no es activo contra S. mutans de la placa madura7. 6.4 Fibronectina La fibronectina es una glucoproteína presente en superficies celulares, membranas basales, matrices extracelulares y tejido conjuntivo, así como en líquidos corporales, entre ellos suero y saliva. En la cavidad bucal la fibronectina se localiza a lo largo de la interfase diente-tejido conjuntivo gingival y en la interfase epitelio-cemento e inhibe la colonización epitelial por bacterias gramnegativas7. 31 6.5 Cistatina Estas moléculas constituyen un grupo diverso de inhibidores tiolproteasa; abundantes en tejidos y líquidos corporales; derivadas de las secreciones submandibulares. En saliva predominan la cistatinas de la familia 2: cistatina S, cistatina SA, cistatina SN y cistatina C. La cistatina C la sintetizan las células de la serie mieloide. Cistatina C aumenta en la saliva de pacientes con periodontitis o gingivitis. Su actividad es neutralizar a las cisteín- proteasas microbianas; Cistatina SN posee un efecto anti-adhesivo por unirse a las fimbrias bacterianas12. Su habilidad para combinarse con mucinas sirve para llevar las cistatinas a diversas superficies bucales donde pueden desempeñar una función en los procesos de remineralización/desmineralización y evitar el crecimiento y actividad de la tiol-proteasa de los patógenos bucales20. 6.6 Estaterina La Estaterina es una fosfoproteína rica en tirosina que contiene 43 aminoácidos residuales, las cuales evolucionaron de un gen de histatina ancestral, común; esta molécula fija calcio, tiene gran afinidad por la hidroxiapatita y desempeña una función en la desmineralización al obstaculizar la precipitación de sales de fosfato de calcio20. Mantiene fosfato cálcico salival en estado supersaturado. Forma parte de la “película adquirida”. Implicada en la adherencia bacterianas7. 6.7 Histatinas Las histatinas son una familia de péptidos básicos pequeños caracterizados por gran contenido de histidina. Se han identificado por lo menos siete miembros, uno de los cuales esta fosforilado; varían en tamaño de tres a cinco kilodaltons. Estas moléculas también forman parte de la 32 cutícula adquirida del esmalte e inhiben la precipitación de sales de fosfato de calcio; es interesante que esta proteína en la actualidad muestran actividades bactericidas y fungicidas.Las histatinas pueden impedir el desarrollo de Candida albicans de un estado vegetativo no infeccioso a una modalidad germinativa infecciosa. Por último estos péptidos básicos ayudan a mantener un pH relativamente neutral en la cavidad bucal20. Tabla 3. Proteínas que se encuentran en Saliva. PROTEÍNA FUNCIÓN SE UTILIZA PARA DIAGNÓSTICO CANTIDAD MUCINAS Ayudan a la formación del bolo alimenticio por la masticación y deglución eficaz y protegen contra la desecación y la abrasión7. - 100/600mg/100ml LACTOFERRINA Actúa sobre un amplio espectro de microorganismos y tiene efecto bacteriostático por su capacidad de secretar hierro hasta niveles incompatibles con el desarrollo bacteriano20. - <1 μg//mL APOLACTOFERRINA Ejerce una acción bactericida sobre S. mutans basada en una interración apolactoferrina- anión7. - - FIBRONECTINA Inhibe la colonización epitelial por bacterias Gramnegativas7. 33 <1ug/ml en saliva CISTATINA Neutraliza a las cisteín-proteasas microbianas. Su capacidad para combinarse con mucinas sirve para llevar a las cistetinas a diversas superficies20. Aumenta en pacientes con Periodontitis o Gingivitis. 0.51-0.98mg/l ESTATERINA Tiene la función de fijar calcio, tiene gran afinidad por la hidroxiapatita y desempeña una función en la desmineralización al obstaculizar la precipitación de sales de fosfato de calcio7. - - HISTATINAS Inhiben la precipitación de sales de fosfato de calcio. En la actualidad muestra actividades bactericidas y fungicidas. Ayudan a mantener un pH relativamente neutral en cavidad bucal20. - - 34 CAPÍTULO VII 7. Funciones de la saliva. La saliva proporciona un medio eficaz de protección a todas las estructuras de la cavidad oral, gracias a su participación en distintas funciones. 7.1. Lubricación y humidificación La saliva es uno de los mejores lubricantes de origen natura; la viscosidad de la saliva se debe a las glicoproteínas y a las mucinas. La ausencia o disminución hace que los alimentos se impacten y se retengan alrededor de los dientes, haciendo la comida dificultosa. La saliva embebe el alimento y facilita la masticación de los mismos. Proporciona una lubrificación adecuada para la dicción. Para ésta función es necesaria la presencia de agua y mucina de la saliva, atribuyéndose a las glicoproteínas de la mucina uno de los papeles principales. 7.2 Mantenimiento del equilibrio ecológico La saliva mantiene el equilibrio ecológico de las distintas especies de microorganismos que viven en la cavidad bucal. La adherencia es crítica para la supervivencia de muchas bacterias y una de las funciones básicas de la saliva es la interferencia de dicho proceso mediante el flujo físico, aumentado por los movimientos de la lengua y labios. Además de interferir la adherencia bacteriana por medios físicos, la saliva interfiere por medios más directos la capacidad de adherencia bacteriana, por ejemplo mediante la IgA secretora. Los anticuerpos en saliva reaccionan específicamente con las bacterias 35 orales agregándolas, precipitándolas, aglutinándolas y bloqueando sus receptores, e impidiendo así la adherencia de las bacterias a la mucosa oral y a los dientes. Aparte de estos anticuerpos existen otras macromoléculas en la saliva, como mucinas y lisozimas, con acción similar. Posee la saliva acción bacteriostática. Presenta leucotoxinas y opsoninas que atraen a los leucocitos y aumentan la susceptibilidad de los organismos para la fagocitosis. El ión hipotiocianato (OSCN- ) es fácilmente detectado en saliva total recién recolectada. Las glándulas salivales concentran OSCN- de la sangre y la secretan en saliva, a altas concentraciones, en la que ejerce su función antibacteriana sin embargo la dieta puede inhibir este ión. 7.3 Función de limpieza. El flujo físico produce una acción mecánica de lavado y arrastre eliminando restos de alimento, elementos celulares descamados y numerosas bacterias, hongos y virus, manteniéndolos en suspensión. 7.4 Integridad dental Otra de las funciones de protección se encuentra en el mantenimiento de la integridad dentaria. Además de amortiguar la acidez de la placa, el flujo físico de la saliva ayuda al aclaramiento de los azúcares. La disminución de la tasa de flujo en reposo puede prolongar el tiempo de aclaramiento. La protección dentaria se inicia inmediatamente después de la erupción del diente en la boca. La interacción con la saliva le proporciona al diente una maduración posteruptiva. Se produce una difusión de iones tales como calcio, fósforo, magnesio y flúor. La lesión de caries se caracteriza por una desmineralización subsuperficial del esmalte, cubierta por una capa bastante bien mineralizada, 36 a diferencia de la erosión dentaria de origen químico en la que la superficie externa del esmalte está desmineralizada, no existiendo lesión subsuperficial. Los factores que regulan el equilibrio de la hidroxiapatita (HA) son el pH y la concentración de iones libres de calcio, fosfato y flúor. La saliva, y también la placa, especialmente la placa extracelular que se encuentra en íntimo contacto con el diente, se encuentra sobresaturada de iones calcio, fosfato e hidroxilo con respecto a la HA. Además en las personas que hacen un aporte adecuado de fluoruros, sobre todo mediante el uso de dentífricos fluorados, tanto la saliva como la placa, contienen abundante cantidad de este ion. Por otro lado, algunas proteínas tienen la capacidad de unirse a la HA inhibiendo la precipitación de calcio y fosfato de forma espontánea y manteniendo así la integridad del cristal, se comportan de este modo las proteínas ricas en prolina, las estaterinas, las histatinas y las cistatinas, la acción de algunas proteasas bacterianas y de la calicreína salival, alteran este proceso de regulación . En el equilibrio dinámico del proceso de la caries la sobresaturación de la saliva proporciona una barrera a la desmineralización y un equilibrio de la balanza hacia la remineralización, dicho equilibrio se ve favorecido por la presencia del flúor. El calcio se encuentra en mayor proporción en la saliva no estimulada que en la estimulada, ya que procede, sobre todo, de la secreción de las glándulas submaxilar y sublingual y cuando se produce una estimulación el mayor volumen secretado se obtienen de la glándula parótida. La concentración de fosfato de la saliva procedente de las glándulas submaxilares es aproximadamente 1/3 de la concentración de la saliva parotidea, pero es seis veces superior a la que posee la saliva de las glándulas salivales menores1. 37 7.5 Función digestiva La saliva es la primera secreción que va a estar en contacto con el alimento. Embebe el alimento y facilita la digestión de los mismos. La saliva contiene una amilasa y es posible que la acción principal de ésta, sea la de digerir el almidón. La amilasa salival actúa sobre la molécula de almidón y la extiende en moléculas de disacárido maltosa. 7.6 Capacidad Buffer A pesar de que la saliva juega un papel en la reducción de los ácidos de la placa, existen mecanismos tampón específicos como son los sistemas del bicarbonato, el fosfato y algunas proteínas, los cuales además de éste efecto, proporcionan las condiciones idóneas para autoeliminar ciertos componentes bacterianos que necesitan un pH muy bajo para sobrevivir. El tampón ácido carbónico/bicarbonato ejerce su acción sobre todo cuando aumenta el flujo salival estimulado. El tampón fosfato, juega un papel fundamental en situaciones de flujo salival bajo, por encima de un pH de 6 la saliva está sobresaturada defosfato con respecto a la hidroxiapatita (HA), cuando el pH se reduce por debajo del pH crítico (5,5), la HA comienza a disolverse, y los fosfatos liberados tratan de restablecer el equilibrio perdido, lo que dependerá en último término del contenido de iones de fosfato y calcio del medio circundante. Algunas proteínas como las histatinas o la sialina, así como algunos productos alcalinos generados por la actividad metabólica de las bacterias sobre los aminoácidos, péptidos, proteínas y urea también son importantes en el control del pH salival. Al igual que ocurría con la eliminación de azúcares, los mecanismos tampón tampoco afectan por igual a todas las superficies de los dientes, en 38 las superficies libres, cubiertas por una pequeña capa de placa bacteriana, el efecto de los mecanismos tampón es mayor que en las superficies interproximales. Con frecuencia la boca está expuesta a alimentos que tienen un pH mucho más bajo que el de la saliva y que son capaces de provocar una disolución química del esmalte (erosión), bajo estas condiciones, los mecanismos tampón también se ponen en marcha para normalizar el pH lo antes posible 1. 7.7 Función gustativa El agua diluye los componentes sólidos y excita a las células gustativas. Lava las papilas y las deja en condiciones de ser estimuladas. De este modo los botones gustativos de las papilas son capaces de reconocer las sustancias nocivas. 7.8 Función diluyente y atemperadora La saliva aumenta de forma brusca y masiva tras la penetración de sustancias ácidas con el fin de diluirlas y mantener el pH, pero también logra por el mismo mecanismo, enfriar los alimentos calientes o calentar los frios. 7. 9 Función excretora La saliva es la ruta por la que se van a eliminar productos orgánicos y productos introducidos en el organismo. Elimina urea, ácido úrico y ciertas hormonas. También se eliminan los virus responsables de enfermedades como la rabia, poliomielitis y paperas. 39 7.10 Acción sobre la coagulación La saliva activa en su conjunto la coagulación de la sangre por la presencia de lisozima y calcio salival aunque de manera muy discreta17. Tabla 4. Componentes de la saliva y sus funciones1 FUNCIONES COMPONENTES Lubricación y humidificación Mucina, glicoproteínas ricas en prolina, agua. Mantenimiento del equilibrio ecológico Lisocima, Lactoferrina, lactoperoxidasa, mucinas, cistatinas, histatinas, inmonuglobulinas, proteínas ricas en prolina, IgA Mantenimiento de la integridad de la mucosa. Mucinas, electrolitos y agua Limpieza Agua, Flujo salival Capacidad Buffer Bicarbonato, fosfato, calcio, estaterina, proteínas aniónicas ricas en prolina, flúor Preparación de los alimentos para la deglución Agua, mucinas Digestión Amilasa, lipasa, ribonucleasa, proteasa, agua, mucinas Gustativa Agua, gustina Fonación Agua, mucina Integridad dental Calcio, Fosfato, Magnesio y Flúor Diluyente y atemperadora Aumento del flujo salival Coagulación Lisozima, Calcio, Factores de la coagulación VIII, IX, X y XII, antecedente de tromboplastina plasmática (PTA) y factor de Hageman. 40 CAPÍTULO VIII 8. Método de recolección de Saliva. La saliva total en reposo se define como aquella que se produce espontáneamente, en ausencia de estímulos salivales exógenos o farmacológicos y en situación de relajación. La saliva total estimulada es la que se obtiene después de haber sometido al sujeto a estímulos. Algunos autores reportan que existen diferencias en reposo no solamente en la cantidad sino también pueden presentar cambios en su composición16. La secreción salival puede variar según distintos factores biológicos. Tamaño glandular Algunos autores encuentran una correlación entre tamaño glandular y tasa de secreción. Otro dato que hay que tener en cuenta, especialmente a la hora de la recolección de saliva parcial, es que solamente el 15% de los individuos segregan por igual en el lado derecho que en el izquierdo. La dominancia del lado derecho es del 44% y la del izquierdo del 41%. Esto podría ser debido a diversos factores como estructura, tamaño e inervación de la glándula. Edad y sexo La edad siempre se ha considerado un factor importante a la hora de valorar la cantidad de saliva secretada, ya que con la edad se producen cambios morfológicos en base a que el parénquima funcional va siendo 41 reemplazado por depósitos grasos. Sin embargo este es un concepto que en la actualidad se encuentra a debate. Según algunos autores existe una disminución salival concomitante con los procesos de envejecimiento (saliva mixta o de una sola glándula), en individuos de distintas edades. En contraste, otros no encuentran estos cambios, en general tanto la cantidad de saliva en reposo como la estimulada es menor en mujeres que en hombres, pero, conforme avanza la edad, las mujeres tienden a igualar a los hombres. Las tasas de flujo suelen ser más altas en varones, pero es difícil de conocer si esto es debido al sexo o influirían otros aspectos como el peso corporal, tamaño de las glándulas o una masticación más enérgica. Raza Peck en 1959, estudia la tasa de secreción salival en distintas razas encuentra una tasa de fluido salival más alta en los sujetos de raza negra, comparados con sujetos de raza blanca. Hidratación El grado de hidratación es un factor potencialmente importante. Cuando la pérdida de agua corporal se reduce al 8%, el fluido salival disminuye. La hiperhidratación causa un aumento de la saliva de reposo, pero no afecta a la saliva estimulada. Ritmos circadianos El ritmo o caudal de saliva varía a lo largo del día según estímulos y necesidades fisiológicas, teniendo lugar la mayor parte de la secreción durante las comidas y siendo extremadamente bajo durante el sueño. Este hecho es de una gran relevancia clínica ya que hay que extremar las 42 medidas de higiene oral, debido a que los efectos protectores de la saliva están ausentes. La tasa de saliva total en reposo muestra unos ritmos circadianos con valores más altos aproximadamente hacia las 15:30 horas. Factores ambientales Las temperaturas más elevadas parecen disminuir la cantidad de saliva en reposo. Así por ejemplo, el traslado a climas templados es capaz de disminuir la secreción parotidea. También existen variaciones estacionales. Así, en un mismo individuo, en verano, disminuye el flujo de saliva mixta y el flujo de saliva parotidea no estimulada se ve disminuido en 0.046 - 0.03 ml/min. Hábitos El tipo de masticación, dieta, tabaquismo, horas dormidas, número de dientes etc.. son factores capaces de influir en la tasa de secreción salival. Así encontramos que la masticación en sí misma, tiene un efecto estimulatorio sobre la secreción salival. El fluido de la glándula parótida en reposo disminuye aproximadamente hasta 34% después de una dieta liquida, y vuelve a la normalidad a la semana de restaurar la dieta normal al sujeto. La comida en polvo produce mayor aumento de fluido que la comida en piezas, presumiblemente porque el polvo absorbe más saliva y el individuo necesita beber. Los estímulos gustativos pueden aumentar la secreción pero el incremento de fluido es menor que con los ácidos. La respuesta salival a un solo sabor o a varios también se puede medir. Se incrementa con los sabores mixtos y decrece cuando se separan los componentes del sabor. Otros hábitos como el tabaquismo, pueden influir en la tasa de secreción. Mientras unos autores dicen que la incrementaría, probablemente por el aumento de estímulos gustativos según otros no la afectaría. También se ha 43 encontrado que en los sujetos con un déficit de horas dormidas disminuye latasa de secreción al bajar el nivel de estímulo. Efectos psíquicos El estado emocional del sujeto en el momento de cuantificar la secreción es un factor a tener en cuenta. La ansiedad y el estrés producen una disminución del fluido salival. Los estados depresivos, a veces no detectados en la clínica diaria, conllevan una disminución del flujo mientras que, en los maníacos aumenta la secreción salival. Peso corporal Se ha sugerido que el peso corporal podía tener relación con la tasa de flujo salival. Muchos investigadores registran este dato en sus protocolos. Sin embargo no está demostrado que exista correlación entre la tasa de flujo y el peso corporal. Se enfatiza el hecho de que la distinta tasa de secreción salival encontrada, entre los distintos sujetos, podría deberse, entre otras causas, al diferente peso corporal, que repercutiría, en el distinto tamaño y peso de las glándulas17. Existen métodos no invasivos para recolectar saliva, así como también para recolectarla individualmente de las glándulas mayores. Además de los métodos de recolección de saliva de las diferentes glándulas, también existen maneras sencillas de recolectar la saliva en general contenida en la cavidad bucal16. 44 Tabla 5.Factores que provocan una variación en la secreción salival. TAMAÑO GLANDULAR Algunos autores encuentran una correlación entre el tamaño glandular y tasa de secreción. EDAD Y SEXO Con la edad se producen cambios morfológicos en base a que el parénquima funcional va siendo reemplazado por depósitos grasos, tejido conectivo y oncocitos. RAZA Peck en 1959, estudia la tasa de secreción salival en distintas razas encuentra una tasa de fluido salival más alta en los sujetos de raza negra, comparados con sujetos de raza blanca. HIDRATACIÓN Cuando la pérdida de agua corporal se reduce al 8%, el fluido salival disminuye. RITMOS CIRCADIANOS El ritmo o caudal de saliva varía a lo largo del día según estímulos y necesidades fisiológicas, teniendo lugar la mayor parte de la secreción durante las comidas y siendo extremadamente bajo durante el sueño. FACTORES AMBIENTALES Las temperaturas más elevadas parecen disminuir la cantidad de saliva en reposo. HÁBITOS El tipo de masticación, dieta, tabaquismo, horas dormidas, número de dientes etc.. son factores capaces de influir en la tasa de secreción salival. EFECTOS PSIQUICOS El estado emocional del sujeto en el momento de cuantificar la secreción es un factor a tener en cuenta. PESO CORPORAL Se ha sugerido que el peso corporal podía tener relación con la tasa de flujo salival. Muchos investigadores registran este dato en sus protocolos. 45 8.1 Procedimiento general para obtener la saliva total estimulada. Para la recolección de saliva el paciente debe cumplir los siguientes requisitos: No ingerir ningún alimento dos horas previas de la recolección. No fumar dos horas previas de la recolección. No ingerir líquidos dos horas antes de la recolección. No realizarse limpieza dental con pasta y enjuague durante dos horas antes de la recolección. Método con cera de parafina. Materiales necesarios: • Campana de flujo laminar (para trabajar en un ambiente de esterilidad) • Balanza analítica digital • Micropipetas 20, 100, 1000µL • Refrigerador para muestras y reactivos • Autoclave • Agitador magnético • Agitador mecánico de sustancias • Espectrofotómetro • Centrifuga • Fuente de poder • Bomba de succión • Ultra congelador para guardar muestras y reactivos a -20 °C y – 70 °C • Tubos de eppendorf • Tubos cónicos para toma de la saliva 46 Procedimiento: En este método el paciente está sentado cómodamente en la silla con la cabeza ligeramente inclinada hacia adelante y se le dan las siguientes indicaciones: 1. Tragar saliva antes de iniciar la recolección. 2. Colocar la cera de parafina en la boca hasta que se ponga blanda (30 segundos). 3. Tragar la saliva que se produjo en ese intervalo de tiempo 4. Masticar la cera durante 6 minutos seguidos y con los labios entreabiertos ir dejando fluir la saliva al embudo colocado en el tubo de medición hasta obtener 2 ml. Figura 6. Toma de muestra de la saliva total estimulada. Se le pidió al paciente que masticara una cera para estimular la secreción de la saliva y posteriormente se recolectaron 5 mL en un tubo cónico estéril de plástico. Procesando de la muestra de saliva mediante centrifugación. Centrifugación Una centrífuga es un aparato que separa partículas que se encuentren en solución, estas partículas pueden ser células, organelos subcelulares o 47 macromoléculas. Las muestras de saliva una vez que se recolectaron fueron centrifugadas a 10,000rpm durante 10 min a 4°C, se elimino el sobrenadante y se recolectaron 500uL. Figura 7. Centrifugación de la saliva. Las muestras de saliva se centrifugaron durante 10min a 10,000rpm, en una microcentrífuga a -4°C. Cuantificación mediante espectrofotometría. Figura 8. Lectura de las muestras de saliva en el espectrofotómetro. Método con ácido cítrico. Materiales necesarios: • Tubo colector de saliva graduado en mililitros. • Embudo. • Solución de ácido cítrico al 2% • Hisopo 48 Método: 1. Tragar antes de iniciar la recolección. 2. Colocar la solución de ácido cítrico al 2% sobre el dorso de la lengua con un hisopo (cada 30 segundos durante un período de 6 minutos). 3. Con los labios entreabiertos ir dejando fluir la saliva al embudo colocado sobre el tubo de medición hasta obtener 2ml16. 8.2 Procedimiento para obtener la saliva total no estimulada. Materiales necesarios: • Tubo colector de saliva graduado en mililitros. • Embudo. Método: El paciente debe estar sentado cómodamente en la silla con la cabeza un poco inclinada hacia adelante y se le instruye a no tragar o mover la cabeza, lengua, etc., durante el desarrollo de la recolección y se le dan las siguientes instrucciones: 1. Tragar antes de iniciar la recolección. 2. Acumular saliva durante un período de 2 minutos en piso de boca sin tragar. 3. Con los labios entreabiertos ir dejando fluir la saliva al embudo colocado sobre el tubo de medición hasta obtener 2 ml16. 49 Figura 9. Tubo colector de saliva46 Figura 10. Toma de muestra de saliva47 50 CAPÍTULO IX 9. Fluido Crevicular Gingival. El fluido crevicular gingival (FCG) es un exudado seroso que baña el surco gingival o la bolsa periodontal y que sigue un gradiente osmótico con los tejidos locales9, hay un paso de materiales desde los vasos sanguíneos hacia el tejido conectivo y a través del epitelio al surco8. Su presencia en los surcos normales en términos clínicos puede explicarse porque la encía que aparece clínicamente normal exhibe de modo invariable inflamación cuando se analiza con microscopio. La cantidad de líquido gingival es mayor cuando hay inflamación presente. La producción del líquido gingival aumenta por masticar alimentos correosos, cepillar los dientes y dar masaje gingival, por la ovulación, los anticonceptivos hormonales y el tabaquismo. Otros factores que influencian la cantidad de líquido gingival son la periodicidad circadiana y el tratamiento periodontal. El potencial valor diagnóstico del fluido gingival crevicular y la naturaleza dinámica del fluido fue reconocido hace medio siglo. A finales del decenio de 1950 Brill y Krasse realizaron un experimento con perros a los que se les inyecto un colorante en la circulación sistémica posteriormente colocaron un papel filtro en el surco gingivalde los dientes de los animales de experimentación y se percataron que se podía detectar el colorante inyectado en la circulación sistémica a través del fluido gingival. Desde una perspectiva fisiológica, Egelberg et al. observaron que tras estimulación gingival se produjo un aumento en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos, 51 lo que conduce a una acumulación de líquido en el surco. Estudios realizados en la década de 1970 empezaron a identificar las enzimas y otros indicadores en las muestras de fluido gingival crevicular, pero el interés en este fue poco hasta que se realizaron ensayos clínicos identificando la naturaleza episódica de la periodontitis, y la importancia de la respuesta del hospedero a la enfermedad periodontal. Factores que influyen en la secreción del Fluido Crevicular Gingival Periodicidad circadiana Hay un incremento gradual en la cantidad de líquido gingival desde las &:00 A.M. hasta las 10:00 P.M., así como un decremento a partir de entonces. Hormonas sexuales Las hormonas sexuales femeninas incrementan la circulación del líquido gingival, tal vez debido a que aumentan la permeabilidad vascular. El embarazo, la ovulación y los anticonceptivos hormonales incrementan la producción de líquido gingival. Estimulación mecánica La masticación y el cepillado gingival vigoroso estimulan el exudado de líquido gingival. Aun estímulos menores, como la colocación de tiras de papel en el surco aumentan la producción de líquido. Tabaquismo 52 Motiva un incremento pasajero inmediato, pero notable, en la circulación del líquido gingival. Tratamiento Periodontal Hay un ascenso en la producción del líquido gingival en el transcurso del periodo de cicatrización posterior a la cirugía periodontal. 53 CAPÍTULO X 10. Composición de Líquido Gingival Crevicular. Elementos Celulares En su composición podemos encontrar bacterias, células epiteliales descamadas y leucocitos (neutrófilos polimorfonucleares PMN, linfocitos y monocitos). Compuestos orgánicos Carbohidratos y proteínas. En el líquido gingival se encuentran la hexosamina glucosa y el ácido hexurónico. Inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM, componentes del complemento C3 y C4 y proteínas plasmáticas como albúmina, fibrinógeno y otras. Electrolitos Potasio, sodio y calcio se analizaron en el líquido gingival. La mayor parte de los estudios indican una relación positiva de las concentraciones de calcio y sodio y la proporción sodio-potasio con la inflamación. En el líquido gingival también se han identificado los siguientes productos metabólicos y bacterianos: ácido láctico, urea, hidroxiprolina, endotoxinas, sustancias citotóxicas, sulfuro de hidrógeno, y factores antibacterianos. También las siguientes enzimas: fosfatasa ácida, beta glucuronidasa, lisozimas, catepsina D, proteasas, fosfatasa alcalina y deshidrogenada láctica8. 54 Leucocitos Los leucocitos encontrados son de modo predominante neutrófilos. El recuento diferencial de leucocitos a partir de los surcos gingivales humanos sanos clínicamente indica 91.2 a 91.5% PMN y 8.5 a 8.8% células mononucleares. Las células mononucleares se identificaron como 58% linfocitos B, 24% linfocitos T y 18% fagocitos mononucleares. Se encontró que la proporción entre linfocitos T y B se invirtió a partir de la relación normal de poco más o menos 3:1 en la sangre periférica hasta aproximadamente 1:3 en el líquido del surco de la encía. Hay presencia de leucocitos en el surco de la encía sana no irritada por medios mecánicos (en descanso). Esto denota que la migración leucocitaria podría ser independiente de un incremento en la permeabilidad vascular. La mayor parte de dichas células son viables y se sabe que poseen capacidad fagocítica y mortal. Por tanto, constituyen un importante mecanismo protector contra la extensión de la placa hacia el surco de la encía. Mastocitos Son importantes debido a sus gránulos citoplásmicos, que contienen histamina, sustancia de reacción lenta en la anafilaxia (SRL-A), heparina, factor de anafilaxia quimiotáctico eosinofílico y bradicinina, todos los cuales son liberados hacia los tejidos gingivales. La desgranulación de los mastocitos se efectúa durante las reacciones inmediatas de hipersensibilidad no inmunitarias e inmunitarias de tipo anafiláctico, cuando los antígenos reaccionan con el anticuerpo inmunoglobulina E (IgE) fijo a la superficie. 55 Neutrófilos También llamados leucocitos polimorfonucleares, son imporatantes en la defensa del huésped contra la lesión e infección. Los neutrófilos rodean (fagocitosis) y más tarde matan y digieren a la mayor parte de los microorganismos y neutralizan otras sustancia nocivas. La presencia de receptores de superficie C3b mejora en términos inmunitarios la fagocitosis. Estos receptores unen complejos de bacterias (antígeno)-anticuerpo- complemento a través de C3b, fragmento del tercer componente del complemento formado por complejos inmunes. Los neutrófilos también pueden originar destrucción hística. Sus gránulos contienen sustancias con capacidad para matar, digerir y neutralizar microorganismos, sus productos, o ambos. Sus gránulos contienen además lisozima, hidrolasa ácida, mieloperoxidas, colagenasas I y III, catepsina D, catepsina G, elastasa y lactoferrina. Macrófagos Tienen una función directa importante en la inmunidad celular. Estas células grandes notablemente fagocíticas forman parte del sistema reticuloendotelial depurador. Su actividad fagocítica mejora por receptores de superficie para la porción Fc de la inmunoglobulina G (IgG), que provee mayor contacto de los antígenos con el macrófago luego de la interacción antígeno-anticuerpo. Participan con los linfocitos T al favorecer la respuesta de los linfocitos B ante muchos inmunógenos. Se considera que los macrófagos “procesan” el antígeno para el linfocito B. En las lesiones inflamatorias, los macrófagos se forman por la diferenciación de monolitos transportados a la lesión por la sangre. Dichas células actúan de modo no específico con los antígenos, que les aportan la capacidad para destruir un grupo diverso de bacterias, sin nexo antigénico. 56 Las células mononucleares son atraídas a los sitios de inflamación por las linfocinas (sustancias solubles liberadas por linfocitos) como el interferón- γ (IFN-γ) y factores del complemento. La capacidad de los macrófagos para ingerir, matar y digerir microorganismos depende de la interacción con otros leucocitos, elementos del sistema inmunitario en general, el complemento. Los macrófagos también son importantes dado que secretan interleucina1(IL-1), IL-6, IL-8, IL-10, factor de necrosis tumoral-γ (TNF-γ), factores de crecimiento semejantes a la insulina, TFN- α y γ, así como otros factores estimulantes, inhibitorios y de crecimiento. También producen prostaglandinas, monofosfato adenosina cíclico (cAMP) y colagenasa en respuesta a la estimulación por la endotoxina bacteriana, los complejos inmunes o las linfocinas. Linfocitos Incluyendo tres tipos de células: 1) linfocitos T, o células T, derivados del timo y con una función en la inmunidad celular; 2) linfocitos B o células B, derivados del hígado, el bazo y la médula ósea, precursores de las células plasmáticas que intervienen en la inmunidad humoral, y 3) células asesinas naturales (NK) y asesinas (K). Se reconoce que las células T están compuestas por varios subconjuntos que modulan la reacción humoral. Estos incluyen células T cooperadoras- inductoras (células TH) (CD4 positivas), que ayudan en la reacción celular de las células B para que se diferencien en células plasmáticas y produzcan anticuerpos y células T supresoras-citotóxicas (célulasTS) (CD8 positivas), que estimulan la actividad citotóxica y microbicida de las células inmunitarias. Las células TH liberan IL-2 e IFN- g, en tanto que las células TS liberan IL-4 e IL-5. Las células TH se subdividen aún más en tres grupos 57 (TH1, TH2 y TH0), que se distinguen por sus perfiles de producción de citocinas. Las células B se reconocen por su inmunoglobulina de superficie celular, a menudo inmunoglobulina M (IgM) o D (IgD). Estas inmunoglobulinas de superficie sirven como receptores para antígenos. Las células NK se caracterizan por su falta de receptores para células T (TCR) e inmunoglobulinas de superficie. Células plasmáticas. Son las células terminales en la progresión a partir de las células B. Contienen abundante RNA citoplásmico, característico de la célula que produce proteínas de manera activa. Las células plasmáticas aparecen en centros germinales y en los tejidos, donde producen inmunoglobulina y anticuerpos, y las células efectoras para la inmunidad humoral local y sistémica, respectivamente. Anticuerpos El huésped reacciona ante las bacterias de la boca y sus productos mediante la producción de inmunoglobulinas o anticuerpos por las células plasmáticas. Antes de esto, las células que presentan antígenos, como los macrófagos, presentan a las células T fragmentos de antígenos procesados a través del complejo principal de histocompatibilidad (MCH), en su superficie. Luego de la interacción física de las células T con las células B, éstas últimas reaccionan a los antígenos dependientes de células T con diferenciación de células plasmáticas y producción de anticuerpos. Los anticuerpos, que son glucoproteínas, aparecen en la sangre, los líquidos místicos, así como en las secreciones; son los efectores de la inmunidad humoral. Son muy específicos y sensibles. Todas las clases y los 58 subgrupos de inmunoglobulinas poseen organización estructural similar, mas difieren según sus propiedades biológicas, contenido de carbohidratos, peso y secuencias de aminoácidos. Cada molécula de anticuerpo posee una región variable, que, en vista de su secuencia particular de aminoácidos y la estructura terciaria de su sitio para la combinación de anticuerpos, le permite reaccionar de manera muy específica con un antígeno particular. Con base en diferencias estructurales, las inmunoglubilinas humanas se dividen en cinco clases. Tales disparidades ocasionan la variabilidad en los efectos biológicos. Las cinco clases son IgG, IgM, IgA, IgE e inmunoglobulina D. Las moléculas de las inmunoglobulinas están compuestas por dos cadenas κ o dos cadenas ligeras λ (pequeñas) y uno de cinco tipos de cadenas pesadas (grandes) de polipéptidos. El tipo de cadena pesada determina la clase. Cada clase de inmunoglobulina posee juegos similares de cadenas ligeras, pero juegos de cadenas pesadas peculiares en términos antigénicos. La estructura inmunitaria básica posee forma de Y. La cola de la Y contiene los extremos de dos cadenas pesadas y se llama fragmento Fc. Es en esa región donde ocurre la fijación del complemento. La zona restante de la molécula con forma de Y está compuesta por cadenas ligeras y el resto de las cadenas pesadas. Este es el sitio de unión de antígeno o Fab: fraction of antigen binding. Inmunoglobulinas IgG Consistente en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, es la más abundante de las inmunoglobulinas séricas y se distribuyen por igual entre la sangre y los líquidos extravasculares. Su función primaria es neutralizar las toxinas bacterianas fijándose a los microorganismos, mejorando así su fagocitosis. Si bien la concentración sérica de IgG es alta, su valor en las secreciones es 59 reducido. La IgG constituye 80% de las inmunoglobulinas séricas totales, atraviesa la barrera placentaria y provee a los recién nacidos inmunidad humoral de la madre. IgM Los anticuerpos de la clase IgM son los primeros en formarse luego de un desafío con la mayor parte de los antígenos. Sin embargo, por lo regular aparecen en concentraciones mucho menores que la inmunoglobulina G. Las concentraciones de IgM durante las últimas fase de una infección decrecen por lo regular y se tornan insignificantes, en contraste con las IgG, que a menudo permanecen altas durante periodos largos. Esta síntesis precoz sugiere una función importante de IgM en las primeras etapas de la infección. La IgM también es el activador más eficaz del sistema del complemento. Las moléculas IgM están formadas por cinco subunidades monoméricas (cada una similar a las presentes en la molécula IgG) unidas por enlaces de disulfuro en una cadena J y, por medio de la región Fc, poseen un número mayor de sitios correspondientes para interactuar con un antígeno. Citocinas Una serie de proteínas llamadas citocinas median las interacciones complejas entre los linfocitos, las células inflamatorias y otros elementos celulares del tejido conectivo. En un principio fueron llamadas linfocinas antes de reconocer su producción por otras células. Las citocinas asisten en la regulación y el desarrollo de células inmunitarias efectoras, la comunicación entre una célula y otra y funciones efectoras directas. Algunas exhiben función autocrina, fijándose a la célula que las produjo. Otras son paracrinas, fijándose a las células próximas; incluso otras son endocrinas, con unión a células distantes. Las citocinas pueden ser pleiotróficas, motivando diferentes actividades biológicas a partir 60 de distintas células. Así mismo, diferentes citocinas pueden mostrar reacciones similares. Originalmente, las citocinas fueron denominadas por su actividad biológica. Estas incluyeron al factor activador de macrófagos (MAF), el de inhibición de migración de macrófagos (MIF), el factor quimiotáctico derivado de leucocitos (CTX), la linfotoxina (LT) y el factor activador de osteoclastos (OAF). Más recientemente, la mayor parte de las citocinas de nuevo se denominaron como interleucinas, en referencia a su función en la comunicación interleucocitaria. Hoy en día, 10 interleucinas fueron identificadas y numeradas del número 1 al 10. Otras incluso reciben su nombre con base a su actividad biológica. IL-1. Es una citosina pleiotrófica con actividades diversas. Incluye OAF debido a su estimulación de osteoclastos y al factor activador de linfocitos (LAF), en vista de su capacidad para estimular la proliferación de células T tratadas con fitohemaglutinación. Se sabe también que interviene en la activación de células TH, el fomento de la maduración de células B, la quimiotaxia de neutrófilos y macrófagos, la mejoría de la actividad de las células NK, así como en otras reacciones. Es secretada por monocitos, macrófagos, células B, fibroblastos, neutrófilos, células epiteliales y muchos otros tipos de células estimuladas. Esta estimulación causa fagocitosis, componentes del complemento (C3a y C5a), así como otras sustancias IL-1 aparece en los tejidos gingivales y el líquido del surco. IL-2 .Fue llamada originalmente factor de crecimiento de células T por su efecto sobre las células T activadoras de mitógenos o antígenos (células TH y TC). Se sabe que posee una función general en las reacciones inmunitarias. 61 IL-2 estimula también la actividad funcional de macrófagos, modula la función y causa la proliferación de células NK. IL-3 Apoya el crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas, incluyendo la estimulación del crecimiento de mastocitos y la secreción de histamina. La secretan células TH y otras NK activadas. IL-4 En un principio fue denominada como factor de crecimiento de células B derivado de células T ( BCGF-1), debido a su activación de células B. También podría ser lo que se denominó factor de inhibición de migración (MIF). Se sabe que interviene asimismo en la activación,
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