Prevalencia-de-pseudomonas-aeroginosa-multirresistente-y-produccion-de-Blactamasas-en-infecciones-nosocomiales-del-Hospital-de-Infectologia-Centro-Medico-Nacional-La-Raza

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11 ~I 1
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE MEDICINA
DIVlSION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACION
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
CENTRO MÉDICO NACIONAL LA RAZA
HOSPITAL DE INFECTOLOGíA
"DR. DANIEL MÉNDEZ HERNÁNDEZ"
TESIS DE ESPECIALIDAD EN
INFECTOLOGIA
"Prevalencia de Pseudomonas aeruginosa
multirresistente y producción de B-Iactamasas
en infecciones nosocomiales del Hospital de
Infectología Centro Médico Nacional La Raza"
PRESENTA:
ISAI GUILLERMruLORENZO BAUTISTA
MEDICO~ISTA
MEXICO, D. F. FEBRERO 2005.
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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CENTRO MlDICO RACIORALlA RAZA
HOSPITAL DE INFECTOLOGIA
"DANIEL MlNDO HERNAII El'
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAl
DR. JOSl WIS FUENTES AWN
Jefe de depanamemo clínico
HICMNR,IMSS
2
3
D~tEriíuifEí1íiílNDEZ
Profesora Ulular del curso de Infectolouía
HleMNR,IMSS
~ • I ~ ¡
DR. lES AN _RTINEZ
Asesor prin ·pal de tesis
Médico adscrit8 al rvlcio eadultlS
HleMNR, SS
• SIVA SiNCIIl
ASESOR DE TESIS
.1ft IIPARTAMENlO ROISmaA IACTEIUANA..
QBP Lourdes Osorio Carranza.
Laboratorista Laura Leticia Javier González
Enf. Sanitarista Guadalupe Mejía Bocanegra
Enfermera Emestina Torres Sandoval
Químico Ernmanuel Hemández Garzón 7
4
- - - ---- --- - --- -
AGRADECIMIENTOS
A mi esposa Zully, por su apoyo incondicional y por el tiempo que no
pudimos compartir durante la residencia.
A mi hija Ana Claudia, por el tiempo que le robé para realizar este proyecto
A mis padres y hermanos por su apoyo en todo momento
A mis asesores, por su invaluable colaboración para realizar este proyecto
5
ÍNDICE
RESUMEN 7
ANTECEDENTES 8
JUSTIFICACIÓN 13
PROBLEMA 14
OBJETIVOS 15
PACIENTES Y MÉTODO 16
RESULTADOS 19
DISCUSIÓN 25
CONCLUSIONES 28
BIBLIOGRAFÍA 29
ANEXOS 33
6
7
RESUMEN
Gaytan MJ, Silva SJ, Lorenzo BI. "Prevalencia de Pseudomonas aeruginosa
multirresistente y producción de B-lactamasas en infecciones nosocomiales del Hospital
de Infectología Centro Medico Nacional La Raza"
OBJETIVO: Conocer la prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente
productora de metalo-6-lactamasas y/o 6-lactamasas de espectro extendido en
infecciones nosocomiales del Hospital de Infectología de junio a diciembre de 2004
TIPO DE ESTUDIO: Transversal descriptivo.
LUGAR DE REALIZACIÓN: Hospital de Infectología Centro Medico Nacional La
Raza y laboratorio de resistencia bacteriana del Instituto de Salud Pública (INSP)
PACIENTES y METODO: Incluimos pacientes internados en sala de adultos, unidad de
cuidados intensivos (UCI) y neumología mayores del8 años con infección nosocomial
por P. aeruginosa. La detección de las cepas se realizó mediante tinción de Gram y
prueba de oxidasa; la identificación final y sensibilidad se realizó con el sistema
automatizado Vitek. Todas las cepas recuperadas se enviaron al departamento de
resistencia bacteriana del Instituto Nacional de Salud Pública en donde se les realizo la
identificación de origen clonal mediante el sistema de electrofuresis en campos pulsados
(PFGE), posteriormente la detección de metalo B-lactamasas (MBL) por el método de
sinergia con doble disco usando discos impregnados con ceftazidima, imipenem o
meropenem y EDTA. A las cepas resistentes a ceftazidima se les realizó
isoelectroenfoque (IEF) para determinar puntos isoelectricos (pI). Determinamos en los
aislamientos clínicos la presencia de plásmidos y realizamos la transferencia de la
resistencia mediante conjugación bacteriana ANÁLISIS: Uti1izamos estadistica
descriptiva, medidas de tendencia central y dispersión, mediana y frecuencias simples.
RESULTADOS : En el periodo en estudio captamos 29 episodios de infección
nosocomial (IN) por P. aeruginosa en 27 pacientes, los datos de un paciente del servicio
de neumología no fueron recuperados por 10 que se excluyó. Nueve cepas fueron
multirresistentes 34.6% (9/26), 38.4% (10/26) fueron resistentes a 1 - 3 fármacos y
26.92% (7/26) fueron sensibles a todos los fármacos antipseudomonas.Ochenta y cinco
por ciento de las cepas presentó resistencia a ticarcilina /clavulanato; 76.2 % a cefepime
y ceftazidima; 71.4% ciprofloxacino; 61.9% amikacina, 42.9 % gentamicina; 33.3%
meropenem; 28.6 % piperacilina e imipenem y 28.6% a piperacilina/tazobactam.
Únicamente se procesaron 18 cepas en el INSP. Por PFGE las cepas no tuvieron el
mismo origen clona\. Once por ciento (2/18) fueron positivas a la prueba de sinergia con
doble disco con imipenem y/o meropenem y EDTA. Veintidós por ciento (4/18)
produjeron plásmidos y no se obtuvieron transconjugantes . A 13 cepas resistentes a
ceftazdima se les realizó IEF encontrando en lO de ellas (56%) pI en rangos de 5.0 a y
8.0.siendo más frecuentes 6.0 y 8.0 en el 50% de las cepas estudiadas.
CONCLUSIONES. En el hospital de Infectología la prevalencia de Pseudomonas
aeruginosa multirresistente en el periodo de estudio fue de 34.6%.Las cepas estudiadas
no fueron parte de un brote. La prevalencia de metalo-B-lactamasas fue de 11%. Es
probable la presencia B-lactamasas de espectro extendido.
8
ANTECEDENTES
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo ligeramente curvo, gramnegativo aerobio
no fermentador y no forma esporas. Mide l a 5 1.1 de largo y 0.5 a l 1.1 de ancho. Es móvil
con uno o más flagelos polares. Es catalasa y oxidasa positiva, reductora de nitratos.
Crece en agar MacConkey, en agar chocolate y agar sangre de cordero1•
Las colonias son usualmente planas, diseminadas, de bordes aserrados, y brillo
metálico, Produce pigmento fluorescente soluble en agua - pioverdina- de color verde-
amarillo y café-amarillento, cuando se combina pioverdina con piocianina (pigmento
azul soluble en fenacina) se produce el característico color verde brillante .También
produce pigmento rojo (piorubrina) y pigmento café oscuro (piomelanina). Es
nutricionalmente muy versátil, diversas especies utilizan carbohidratos, simples y
complejos, alcoholes y aminoácidos como fuentes energía Ciertas especies pueden
multiplicarse a 4° C pero la mayoría son mesofilicos, con crecimiento óptimo a
temperatura de 30 a 37° C 1
Por su capacidad de sobrevivir en medios acuosos es un patógeno nosocomial
particularmente importante. Se le ha encontrado en desinfectantes, jabones, detergentes,
gotas oftálmicas, líquidos y equipo de diálisis, también es frecuente encontrarla en
nebulizadores y otros equipos de terapia respiratoria, tarjas, albercas y tinas de
hidroterapia. 2.3
La patogenicidad de Pseudomonas aeruginosa es explicada por varios factores de
virulencia: a) Un flagelo polar que ataca las células epiteliales. b) Producción de daño
tisular por proteasas, hemolisinas, exotoxinas, y endotoxinas. e) Producción de elastasa
d), Inhibiciónde síntesis de proteínas por exotoxina A y diseminaciónde la bacteria 1.
Es poco frecuente encontrarla como parte de la biota en individuos sanos, los
índices de colonización específica para las diversas localizaciones corporales son las
siguientes: piel Oa 2 %, mucosa nasal Oa 3.3%, boca Oa 6.6%, y heces 2.6 a 24% 4
Es una de las principales causas de infección nosocomial. El espectro de
enfermedad va de infecciones superficiales de la piel (foliculitis) 5 hasta sepsis
fulminante
La infección adquirida en la comunidad más severa es la endocarditis en
pacientes usuarios de drogas intravenosas 6. Un fenotipo mucoide inusual está asociado
con infección crónica en individuosportadores de fibrosis quística, dificil de eliminar a
pesar de antibioticoterapia agresiva 7
Resultados del SENTRY (programa de vigilancia antimicrobiana que monitoriza
los patógenos predominantes y patrones de resistencia de infecciones nosocomiales y
adquiridas en la comunidad a través de hospitales centinela de las 4 mayores regiones del
mundo) indican que Pseudomonas aeruginosa fue el aislamiento más frecuente en
neumonía nosocomial en Latino América (149 cepas 28%). Además fue la sexta causa
9
de bacteriemia y la tercera causa más frecuente de infección de vías urinarias e infección
de heridas. La estancia hospitalaria, el uso previo de cefalosporinas de tercera generación
y enfermedad pulmonar obstructiva crónica han sido descritos como los predictores más
importantes de colonización e infección en pacientes con neumonía nosocomial por
Pseudomonas aeruginosaí:9
La red hospitalaria de vigilancia epidemiológica en México (RHOVE 1998-2003)
reporta a Pseudomonas aeruginosa como el principal agente causal de infecciones
nosocomiales con 11% seguido de Escherichia coli 10% y Staphyloccocus aureus
9%. Así mismo fue la principal causa de mortalidad con 11.5% seguido de
Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli con 10 Y 8% respectivamente. Las
principales infecciones nosocomiales fueron neumonía, infección de vías urinarias
IVU) y bacteriemia primaria.
Los pacientes con bacteriemia por Pseudomonas aeruginosa tienen una
frecuencia alta de falla respiratoria aguda, inestabilidad hemodinámica, estancia
prolongada en la unidad de cuidados intensivos y mayor dependencia del ventilador. La
bacteriemia se asocia a mortalidad atribuible del 15% sin embargo no se encontró como
fuctor independiente de la mortalidad. 10
Pseudomonas aeruginosa ha demostrado resistencia intrinseca elevada con la
combinación de disminución en la permeabilidad de membrana, la bomba de flujo
dependiente de energía y la producción de B-Iactamasas codificadas por cromosomas
Produce un amplio número de bombas de flujo que incluye MexAB-OprM y MexXY-
OprM, además de estos, otros 2 sistemas adicionales MexCD-OprJ y MexEF OprN
promueven la resistencia adquirida a múltiples drogas como resultado de sobre expresión
de genes de eflujo. Estas bombas de eflujo cuando se añaden antibióticos promueven su
expulsión, lo mismo sucede con desinfuctantes y solventes orgánicos. Las bombas de
eflujo son proteínas altamente homólogas y consisten en un transportador asociado a la
membrana citoplásmica, un canal de la membrana externa furmado por una proteína que
se une a la membrana periplasmática.!'
Mutaciones en la Topoisomerasa 11 y IV confieren a las fluoroquínolonas
resistencia mas rápida en Pseudomonas aeruginosa que a Enterobacterias porque tiene
menor susceptibilidad inherente 12. La liberación de B-Iactamasa AmpC reduce la
susceptibilidad a penicilinas y cefulosporinas, aunque el nivel de resistencia depende
del grado de desrepresión más variable que en mutantes de Enterobacter.P La sobre
regulación de MexAB-OprM compromete las fluroquinolonas, penicilinas,
cefalosporinas y con algunas excepciones meropenem, también incrementa la resistencia
a otras drogas sin actividad antipseudomona.l'" 15. La regulación alta de otros sistemas
de flujo - MexCD-OprJ y MexEF-OprN confiere resistencia a fluoroquinolonas, algunos
B-Iactamicos; la regulación elevada de MexXY-OprM también afecta aminoglucósidos.
16
La impermeabilidad es importante en la resistencia a carbapenems y se eleva por
la vía de la pérdida de OprD, una porina que forma estrechamiento de los canales
trasmembrana que permiten el acceso a carbapenems pero no a otros B-lactamicos . 16.
10
La pérdida de OprD esta asociado a resistencia a imipenem pero susceptibilidad
reducida a meropenem. OprD esta corregulado con MexEF-OprN y reduce OprD, con la
consecuente resistencia a fluoroquinolonas e imipenem.r "
Una combinación de la regulación de eflujo, pérdida de OprD e impermeabilidad
a aminoglucósidos compromete a todas las drogas excepto a polimixina. Las mutaciones
aparecen en una célula de cada 107 a 109 células aunque el surgimiento simultáneo es
matemática y biológicamente improbable, la emergencia secuencial es probable porque
las infecciones que son resistentes a los primeros antibióticos administrados son tratadas
con segundos antibióticos y así sucesivamente. Las mutaciones que regulan el flujo,
pueden actuar en forma aditiva con estas con efecto en la permeabilidad, expresión de
B-lactamasas o susceptibilidad a la topoisomerasa para exacerbar la resistencia.P
Las B-lactamasas adquiridas mas frecuentes son PSE-l y PSE-4, estas enzimas
puede ser evitadas con el uso de carbapenems, oximino-aminothiazolyl cefalosporinas
(ceftazidime, cefepime, y cefpírome) o monobactams. Las betalactamasas de espectro
extendido (BLEE) OXA al igual que PER-I se ha reportado en Turquía e incluye OXA-
11,-14,-16,-17,-19.19.20
Las metalo-B-lactamasas (MBL) IMP Y VIM rápidamente hidrolizan penicilinas,
cefalosporinas y carbapenems pero no aztreonam, para la resistencia a carbapenems
requiere la pérdida de OprD. IMP-7 se ha identificado en Canadá, IMP-2,-3,-4,-5,-6,-y -
8 se han encontrado en otros países. VIM-I se ha identificado en Italia, VIM-2 en
Grecia, Francia y Corea del Sur. 21
Los genes que codifican MBL VIM e IMP así como las BLEE OXA se
encuentran localizados en integrones que son sistemas naturales de recombinación que
ensamblan una serie de genes adquiridos con apoyo de un simple promotor. Esta
organización facilita la recombinación de genes. 22
El desarrollo de la resistencia a B-lactámicos se ha asociado con la producción de
B-lactamasas adquiridas, sobreproducción de cefalosporinasa AmpC o mecanismos no
enzimáticos tales como el eflujo de drogas e impermeabilidad de la membrana." . La
aparición de metalo-B-lactamasas en aislamientos de muestras clínicas de
Enterobacterias y especies no fermentadoras tales como P. aeruginosa es considerado
uno de los problemas emergentes en el campo de la resistencia bacteriana. Algunos
estudios en países europeos han reportado que VIM-l y VIM-2 son detectados entre
Pseudomonas aureginosa relacionadas clonalmente. 24
La resistencia a antibióticos en Pseudomonas aeruginosa varía entre los
hospitales. Van Eldere en un estudio multicéntrico de vigilancia y patrones de
susceptibilidad de infecciones nosocomiales por P aeruginosa en Bélgica y Luxemburgo
reporta en las quinolonas: ciprofloxacino 24%, levofloxacino; 27.5%, y ofloxacino
37.5%. De los aminoglucósidos, amikacina 10.5%, seguido de Isepamicina 12%;
tobramicina 19.5% y gentamicina 23.5%. De los antibióticos B-lactámicos meropenem
9.5%; piperacilína y piperacilina! tazobactam 24 y 17.5% respectivamente; ceftazidima
28.5%; cefepime 29.5% ; ticarcilina!ácido clavulánico 37% y aztreonam 55.5 %. Las
11
curvas de distribución de concentraciones inhibitorias minimas (MICs) están justamente
por debajo del punto de corte es por esto que aunque el antibiograma reporte como
sensible a determinado antibiótico, no se recomienda la monoterapia por la probabilidad
de inducir resistencias. 25
Bonfiglio G Y coIs. en un estudio sobre mecanismos de resistencia ha B-
lactamicos en 325 aislamientos de P. aeruginosa en Italia reportó que los mecanismos
más frecuentes de resistencia intrinseca a B-Iactámicos en 183 fue probablemente
impermeabilidad y mecanismos de eflujo; la resistencia mediada por B-lactamasas fue
demostrada en 111 cepas (35%) . La desrepresión de la B-lactamasa AmpC fue detectada
en 64 aislamientos, las cuales fueron resistentes a ceftazidima y piperacilina pero
susceptibles a meropenem, mientras que plásmidos secundarios que codifican B-
lactamasas se identificaron en 34 aislamientos, todos ellos resistentes a
carboxipenicilinas y susceptibles a carbapenems . La resistencia a carbapenems fue
independiente de la resistencia a otros B-Iactámicos, lo que indica diferentes
mecanismos de resistencia probablemente debido a la pérdida de la porina D2. 26.
Bert F Y cols en Francia en un estudio deidentificación de genes de B-
lactamasas, PSE y OXA usando técnicas de PCR-RFLP, reportó que las enzimas PSE
fueron las B-lactamasas más comunes, seguidas por oxacilinasas. Las enzimas TEM
fueron poco comunes y ningún aislamiento produjo SHV. Dentro del grupo PSE, PSE-l
fue la enzima más común y se asoció con el serotipo 012. 27
La medición del impacto de la resistencia a drogas es un paso importante para
entender el problema y formular políticas para limitar el surgimiento y diseminación de
organismos resistentes . Es importante reconocer que la resistencia también afecta el
tratamiento de individuos con organismo sensibles, dado que es común que los médicos
utilicen antibióticos de amplio espectro con la consiguiente selección de cepas
resistentes. En áreas con tasas altas de resistencia los médicos utilizan antibióticos de
amplio espectro como terapia empírica incrementando el costo global del tratamiento. 28
Martínez y cols. en España, revisó factores de riesgo y pronóstico en neumonía
nosocomial debido a bacterias gramnegativas, recolectó un grupo de 50 pacientes e
identificó a Pseudomonas aeruginosa en 32 % de los aislamientos, seguido de infección
polimicrobiana en el 18% de los casos con una mortalidad del 24% asociado a factores
de mal pronóstico: enfermedad severa, cirugía previa, uso de antibióticos de amplio
espectro los 6 meses previos y edad avanzada29
Bounza y cols. en un estudio multicéntrico en España en el que participaron 136
centros hospitalarios, identificaron 1014 aislamientos de Pseudomonas aeruginosa en
una semana (25 aislamientos por cada 1000 admisiones al afio). Setenta y cinco por
cíento de las muestras provenían de vías respiratorias bajas, exudado de heridas,
abscesos y orina, los serotipos más comunes fueron: 0:1, 0:4 y 0:11, de los 529
pacientes a quienes se les dio seguimiento 25 % estaban colonizados y los restantes 75%
tuvieron infección clínica. La mortalidad atribuible a P. aeruginosa fue del 5%.30
--------------- - -
12
Martín Z. y coIs. en un brote de neumonía asociada a ventilador en una DCI de
Yucatán reportó una incidencia de 74% en 11 meses. Noventa y ocho por ciento de los
aislamientos correspondieron a bacterias gramnegativas, Pseudomonas aeruIfinosa y
Klebsie/la pneumoniae se hallaron en el circuito de los ventiladores y el lavabo. 1.
En un estudio realizado por la Dra. López Huerta en el HICMNR sobre factores
de riesgo para la adquisición de ínfección nosocomial por Pseudomonas aeurginosa
multirresistente, identificó como factores principales los procedimientos invasivos
(sonda foley y catéteres centrales) , el uso de antibióticos de amplio espectro y cirugías
previas. 32
Nuestro hospital reportó en el año 2003, 238 casos de infecciones nosocomiales,
55 (23%) de las cuales se debieron a Pseudomonas aureginosa; las infecciones mas
frecuentes se relacionaron a infección de piel y tejidos blandos (ITB) 34%, neumonía
16%, IVD e infección del catéter ambas con 14 33
A los microbiólogos clínicos se les cuestiona para determinar la relación de un
grupo de aislamientos bacterianos, esto es el tipo al que pertenecen. Durante la última
década los métodos tradicionales para tipificar cepas, tales como tipificación por
bacteriófagos y serotipificación han sido reemplazados en muchos laboratorios con
nuevos métodos moleculares, tales como "huella digital " por plásmidos ,
ribotipificación, métodos basados en PCR y análisis de patrones de restricción de DNA
cromosomal por campos pulsados en gel de electroforesis (pFGE). En esta última, los
patrones de restricción de los aislamientos son entonces comparados con otros para
determinar su relación y determinar si las cepas estudiadas son parte de un brote o no."
--- - - - - -
13
JUSTIFICACIÓN
Ortiz H Ycols utilizaron el RAPD PCR para amplificar DNA de P. aeruginosa
aislada en lavados bronquioalveolares de 5 pacientes con fibrosis quística del servicio de
neumología y cirugía de tórax en el Instituto Nacional de Pediatría 35
Miranda G Y cols en una UCIP del Hospital de Pediatría siglo XXI del IMSS
demostró por medio de PFGE en 55 cepas de P aeruginosa aislada a 23 pacientes en un
periodo de 2 meses que la misma clona infecto a 14 pacientes 4 de los cuales no estaban
en la UCIP. 36
En México no tenemos conocimiento de estudios publicados sobre prevalencia
de Pseudomonas aeruginosa multirresistente y la producción de B-lactamasas como
mecanismode resistencia antimicrobiana. Dado que es un microorganismo agresivo, la
mayoría de las veces multirresistente, es necesario para conocer su epidemiología en
nuestra institución, realizar un estudio de prevalencia e identificar la producción de
metalo-B-lactamasas (MBL) y/o B-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en
infecciones nosocomiales con la finalidad de conocer las cepas más comunes y de esta
manera poder aplicar tratamiento empírico.
14
PROBLEMA
¿Cuál es la prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente con producción de
metalo-B-lactamasas y/o B-lactamasas de espectro extendido en infecciones
nosocomiales del hospital de Infectología Centro Medico Nacional La raza?
15
OBJETIVO GENERAL
Conocer la prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente productora de
metalo-B-lactamasas y/o B-lactamasas de espectro extendido en infecciones
nosocomiales del Hospital de Infectología de junio a diciembre de 2004
OBJETIVO PARTICULAR
Identificar la frecuencia de metalo-B-lactamasas en Pseudomonas aeruginosa
multirresistente en infecciones nosocomiales del Hospital de Infectología
Identificar la frecuencia de BLEE en Pseudomonas aeruginosa multirresistente en
infecciones nosocomiales del Hospital de Infectolog ía
16
PACIENTES Y METODO
TIPO DE ESTUDIO: Estudio clínico epidemiológico
DISEÑO DEL ESTUDIO: Estudio transversal descriptivo
POBLACIÓN DE ESTUDIO: Pacientes internados al servicio de adultos, unidad de
cuidados intensivos (DCI) y neumología del HICMNR en el periodo comprendido
1/06/04 al 31/12/04
TAMAÑO DE LA MUESTRA: Todos los pacientes ingresados al hospital de
Infectología adultos, neumología y la DCI con infección nosocomial por P. aeruginosa
en el periodo del 1/06/04 al 31/12/04
LUGAR DE REALIZACION: Hospital de Infectología Centro Medico Nacional La
Raza y laboratorio de resistencia bacteriana del Instituto de Salud Pública (INSP)
CRITERIOS DE SELECCIÓN:
CRITERIOS DE INCLUSIÓN:
Pacientes de 18 años o más ingresados al Hospital de Infectología, que presenten
infección nosocomial (una infección por paciente)
Pacientes con muestras tomadas adecuadamente y cultivo puro de Pseudomonas
aeruginosa
Pacientes con expediente clínico completo
- Pacientes que acepten participar en el estudio
CRITERIOS DE NO INCLUSIÓN
Pacientes con infección nosocomial por P aeruginosa adquirida en otro hospital.
CRITERIOS DE ELIMINACIÓN
Pacientes con pérdida de sus muestras durante el proceso
17
VARIABLES
PSEUDOMONAS AERUGINOSA MULTIRESISTENTE: Pseudomonas aeruginosa
resistente a todos los fármacos con actividad antipseudomonas: Amikacina; gentamicina;
cefepime; ceftazidima; ciprofloxacino, imipenem; meropenem; ticarcilina/clavulanato;
piperacilina, piperacilina/tazobactam.
OPERACIONALIZACION: consideramos una cepa multirresistente aquella con
resistencia a 4 grupos de fármacos: amikacina o gentamicina, ceftazidima o cefepime,
ciprofloxacino, imipenem o meropenem.
INDICADOR: Sensible o resistente de acuerdo a la concentracione inhibitoria mínima
(MICs) establecida por la NCCLS . (Ver anexo 3)
ESCALA DE MEDICIÓN: Cualitativa nominal
INFECCIÓN NOSOCOMIAL. Condición localizada o generalizada, resultante de la
reacción adversa a la presencia de un agente infeccioso o su toxina que no estaba
presente o en periodo de incubación en el momento de ingreso del paciente al hospital.
Estas infecciones generalmente ocurren desde las 48 horas de estancia, pero es
importante considerar el periodo de incubación del agente causal y los criterios para la
definición operativa del caso de infección nosocomiaI.
Incluiremos neumonías, infección de víasurinarias, infección de tejidos blandos y
bacteriemias e infección del sitio de inserción de catéter. (Anexo 5)
METALO-B-LACTAMASAS: Pertenecen a la clase B de Ambler, son enzimas
usualmente dependientes de Zinc. Estos iones metálicos coordinan las moléculas de
agua, que sirven como nucleófilos que atacan y rompen la unión amida cíclica del anillo
betalactámico, como consecuencia el antibiótico es biológicamente inactivo. Confieren
resistencia a imipenem y/o meropenem Existen 3 tipos IMP, VIM, y recientemente
SPM.
OPERACIONALIZACIÓN: Consideramos la presencia de MBL si la prueba de
sinergia con doble disco es positiva con incremento del halo de inhibición. (Ver anexo
7).
INDICADOR: Positivo o negativo
ESCALA DE MEDICIÓN: Cualitativa nominal.
18
B-LACTAMSAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE).- Pertenecen a la clase A
de Ambler, son inhibidas por ácido c1avulánico, confieren resistencia a cefalosporinas de
amplio espectro. Existen varios tipos SHV, TEM, GES, PER, VEB e me.
OPERACIONALIZACIÓN: Realizamos isoelectroenfuque IEF y dependiendo de los
puntos isoeléctricos (pI) se amplificara el DNA con genes específicos. (Ver anexox).
INDICADOR: Positivo o negativo
ESCALA DE MEDICION .Cualitativa nominal.
DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO
Mediante vigilancia epidemiológica identificamos infecciones nosocomiales por
Pseudomonas aeruginosa de muestras clínicamente útiles. El escrutinio de cepas se
realizó mediante tinción de Gram. y prueba de oxidasa; la identificación final y
sensibilidad se realizó con el sistema automatizado Vitek. Todas las cepas recuperadas
se enviaron al departamento de resistencia bacteriana del Instituto Nacional de Salud
Pública en donde se les realizo la identificación del origen clonal mediante el sistema de
electrofuresis en campos pulsados (PFGE), posteriormente la detección de metalo B-
lactamasas (MBL) por el método de sinergia con doble disco, usando discos
impregnados con los siguientes antibióticos: ceftazidima, aztreonam, imipenem,
meropenem y EDTA. A las cepas con prueba positiva sugestivas de tener MBL se les
realizara una amplificación de los genes, por medio de PCR y oligonucleotidos
específicos. A las cepas con prueba de disco positiva a ceftazidima (resistentes)
sugestivas de expresar BLEE se les realizó Isoelectroenfuque (IEF) para determínar los
puntos isoelectricos (pI) y posteriormente dependiendo del valor de las bandas en pI, se
les realizara amplificación específica para determinar los genes propuestos de BLEE
Por otra parte determinamos en los aislamientos clínicos la presencia de plásmidos y
realizamos la transferencia de resistencia mediante conjugación bacteriana. (Ver anexos
6,7,8,9 ,10)
ANÁLISIS
Utilizamos estadística descriptiva, medidas de tendencia central y dispersión,
mediana y frecuencias simples.
19
RESULTADOS
En el periodo en estudio se captaron 29 episodios de infección nosocomial (IN)
por P. aeruginosa en 27 pacientes, los datos de un paciente del servicio de neumología
no fueron recuperados por lo que se excluyó. Describimos los datos de 26 pacientes
Cuarenta y seis por cíento (12/26) fueron del sexo femenino y 54% (14/26) del sexo
masculino. La edad tuvo una mediana de 53 con rango de18 a 80 años. El principal
diagnostico de ingreso fue infección de piel y tejidos blandos (fascitis y abscesos) con
46.15% (12/26). (Gráfica 1). Diecisiete pacientes estuvieron en sala de adultos (65.3%),
7 en DCI (26.9010) y 2 en el servicio de neumología (7.75%). (Grafica 2). El 50% (13/26)
de los pacientes había recibido clindamicina y cefotaxima previamente, 4 pacientes
recibieron amikacina (15.3%), 6 ciprofoxacino (23%) , y 4 imipenem (15.3%).
La neumonía fue la IN más frecuente con 34.6% (9/26) , seguida de infección de
piel y tejidos blandos 23.1% (6/26) e infección de vías urinarias 19.2%(5/26). (Grafica
3). Nueve cepas fueron multirresistentes 34.6% (9/26), 38.4% (10/26) fueron resistentes
a 1 - 3 fármacos y 26.92% (7/26) fueron sensibles a todos los fármacos
antipseudomonas. (Gráfica 4)
Ochenta y cinco por ciento de las cepas presentó resistencia a ticarcilina
/clavulanato ; 76.2 % a cefepime y ceftazidima; 71.4% ciprofloxacino; 61.9%
amikacina, 42.9 % gentamicina; 33.3% a meropenem; 28.6 % piperacilina e
imipenem y 28.6% piperacilina/tazobactam. (Grafica 5). Cuatro pacientes no
recibieron tratamiento farmacológico (15.38%); 11.53% recibió monoterapia (3/26)
con ciprofloxacino o carbapenems; 83.6% (19/22) recibió terapia combinada (19/26);
el tratamiento mas utilizado fue la combinación amikacina + ceftazidima con 45.4 %
(10/22).
Cuarenta y dos por ciento de los pacientes fallecieron, (11/26) 10 de ellos por
sepsis o choque séptico. La mortalidad por P. aeruginosa multirresistente fue de 66%
(5/9). (Grafica 4).
Las cepas procesadas en el INSP fueron 23, 5 fueron de fecha anterior al periodo
de estudio. (Cepas 5113, 5114, 5117,5118 y 5120.). En el PFGE hay tres tipos de
patrones de restricción de DNA; las cepas 5105 y 5108 (A); 5107 y 5112 (B) y 5115 y
5116 (C). (figura 1). Por el método de Kirby Bauer 66% ciento (12/18) fueron
resistentes a imipenem, 55% (10/18) a meropenem y a ambos carbapenems; 72.22%
(13/18) fueron resistentes a ceftazidima, y 61% (11/18) fueron resistentes a aztreonam.
Cincuenta por ciento (9/18) fueron resistentes a los 4 antibióticos utilizados
(multirresistentes). Once por ciento (2/18) fueron positivas a la prueba de sinergia con
doble disco con imipenem y/o meropenem y EDTA. (Figura 2) Veintidós por ciento
(4/18) produjeron plásmidos y no se obtuvieron transconjugantes. A 13 cepas resistentes
a ceftazdima se les realizó IEF encontrando en 10 de ellas (56%) pI en rangos de 5.0 a
y 8.0.siendo más frecuentes 6.0 y 8.0 en el 50% de las cepas estudiadas. ( Tabla 1)
5O.00%-.'I"'--~---------"
40.00% H '9I---------------¡
20
Fascitis
11 Toxo cere bral
o Absceso
D8nplema
• Cryptococosis
o Medlastinltis
Gráfica 1- Diagnostico de ingreso de pacientes que cursaron con infección por P aeruginosa en
el HICMNR de iunio a diciembre de 2004
8%
27% IrI adultos
. UCI
o Neumologla
Grafica 2.- Infección nosocomial por Pseudomonas aeruginosa en los diferentes servicios en
el HICMNR de junio a diciembre de 2004
21
23,1
[] Neurnonla • IfTtlIBland l!J 1\IU
co.......rnea;s
. Id' de ~Cen8
Grafica 3- Infecciones nosocomiales en el HICMNR durante el
40.00%
30.00%
20.00%
10.00%
0.00%.¡.&ó-L._ =
l¡) Multirreslsten
te
11 1 a 3 férmacos
Cl sens ible
Gráfica 4.-Sensibilidad de las cepas aisladas causantes de infección nosocomial en el HICMNR
de junio a diciembre 2004
22
Tlcar/clav
Ceftazldima
[] Cefeplme
[] Clpro
11 Amlkacina
[] Gentamlcina
11 Meropenem
[] Plperacilina
IIlmlpenem
Grafica 5.- Porcentaje de resistencia a fármacos antipseudomonas de cepas aisladas en
infecciones nosocomiales en el HICMNR de iunio a diciembre de 2004 .
o MJltiresistente _ Resistenci1l1 a 3 Fánnacos Sensible I
Grafica 6.- Resultado clínico por susceptibilidad a Pseudomonas aeruginosa en el HICMNR de
iunio a diciembre 2004 .
PULSE FIELD GELELECTROPl-\ORESIS
23
FIGURA 2.- Prueba positivade sinergia con doble disco utilizando imipenem, EDTA Y
ceftazidima con deformación del halo de inhibición
24
Result:ados de prueb a de disco,
l\1BL, plásrnidos y pI.
e'"Pa :bn.p mqan. lIZt e -
MBL l"lm pI
~~o~ · • • · - · -
~~o~ r • • · - + 6.0
~~O~ • " • · + + B.On04 · r r ,. - + 6.0,3.0
no~ ,. r ,. ,. - · 6.0y7.Z
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nOB · r · r - - 6.~yB.O
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Tabla 1.- Resuhados por Kirby Bauer , MBL, plásmidos y pI de las cepas procesadas en el
INSP
Imp: imipenem; mem: meropenem; azt: aztreonam; caz: ceftazidima
MBL: metalo-B-Iactamasas.
Plas: plásmidos
pI: puntos isoelectricos.
r: resistente: s: sensible
+: positivo, -:negativo------ -
25
DISCUSIÓN
P. aeruginosa es con frecuencia responsable de infecciones nosocomiales, es
intrinsecamente resistente a varios antibióticos y tiene capacidad para adquirir nuevos
mecanismos de resistencia bajo presión selectiva de antibióticos, complicando los
problemas terapéuticos." Los antibióticos disponibles con potente actividad in vitro e in
vivo son aminoglucósidos, ureidopenicilinas, ceftazidima, cefepime, aztreonam,
carbapenems y cíprofloxacino.' La curva de distribución de concentraciones inhibitorias
minimas (MICs) están justamente por debajo del punto de corte es por esto que aunque
el antibiograma reporte como sensible a determinado antibiótico, no se recomienda la
monoterapia por la probabilidad de inducir resistencias. 25
En nuestro estudio la neumonía fue la infección nosocomial más frecuente,
seguida de infección de piel y tejidos blandos, datos similares a lo informado por la
RHOVE en México (1995-2003) con excepción de infección de vías urinarias que ocupó
el segundo lugar en la RHOVE y el tercer lugar en nuestro hospital, esto se debe a que
en nuestra unidad predomina la infección de piel y tejidos blandos. Treinta y cuatro por
ciento de nuestras cepas fueron multirresistentes cifra mayor a la reportada por el
SENTRY en Latinoamérica (17.1%) en un periodo de 4 ailos (1997-2001), 38 esto debido
a su definición de multirresistencia que incluyo a todos los fármacos con actividad
antipseudomonas y nosotros consideramos de acuerdo a otro estudios 4 fármacos
(ceftazidima o cefepime, ciprofioxacino, amikacina y carbapenems) 37. Los fármacos
con mayor resistencia en nuestro hospital fueron ticarcilinalclavulanato 85.7%;
cefepime/ceftazidima 76.2%; ciprofioxacino 71.4%, muy diferente a lo reportado por el
SENTRYen Latinoamérica con 53.3 y 54.7% para cefepime/ ceftazidima, y 50% para
quinolonas, siendo estos últimos junto con aztreonam los fármacos con mayor
resistencia"; también difiere con lo reportado por Van Eldere en Francia que reporta
resistencia a ciprofioxacino de 24%, ceftazidime 28.5%, cefepime 29.5% , amikacina
10% y meropenem 9%. 25
El nivel mayor de resistencia en el HICMNR podría explicarse porque somos un
centro de referencia y por lo general los pacientes han sido manejados con antibióticos
previamente.
Cuarenta y dos por ciento de los pacientes fallecieron, (11/26) 10 de ellos por
sepsis o choque séptico , esta descrito en bacteriemia por P. aeruginosa que esta tiene
una mortalidad atribuible del 15%, sin embargo no se ha determinado como factor
independiente de mortalidad 10, además no evaluamos otras comorbilidades por lo tanto
no podemos afirmar que la multirresistencia haya originado directamente la muerte de
los pacientes.
Por PFGE hubieron 3 clonas (A, B Y C) que eran iguales entre sí pero diferentes
con respecto a las demás, por lo tanto las cepas procesadas no fueron parte de un brote 34
Los carbapenems tienen potente actividad antipseudomonas y son utilizados con
frecuencia como último recurso en el tratamiento de infecciones producidas por P.
26
aeruginosa multirresistente/". Durante la última década la resistencia a carbapenems ha
sido esporádicamente atribuida a la producción de metalo-B- lactamasas (MBL) IMP Y
VIM39Enzimas de tipo VIM han sido encontradas en Europa y sudeste de Asia, VIM 1
en Italia, VIM 2 en Francia, Grecia, Italia, Corea y España, VIM-2 y VIM 3, en Taiwán
y VIM 4 en Grecia.": IMP se ha encontrado en Canadá, IMP 2; 3; 4; 5; 6 Y 8 en otros
países. 40
De 18 cepas estudiadas 2 (11%) fueron positivas a la prueba de sinergia con
doble disco, a diferencia de otros estudios como el reportado por Poumaras S y cols en
Grecia en donde el gen bla VIM fue detectado en 47 de 53 (88.7%) de los aislamientos
resistentes a carbapenems y por gel de campos pulsados no tuvieron el mismo origen
clonaf4 . La prueba de escrutinio con EDTA tiene una sensibilidad del 95% en
Pseudomonas aeruginosa.46.47.• a diferencia de otros agentes quelantes como el ácido
mercaptopropionico reportado por Sasaki S y cols en Japón que no encontraron genes de
resistencia a MBL en 110 aislamientos de Pseudomonas aeruginosa resistentes a
imipenem 41. Este último hecho puede explicarse porque la resistencia imipenem,
además de las MBL es dada por bombas de eflujo MexEF-OprN, impermeabilidad a la
membrana por la pérdida del OprD y la presencia de B-lactamasas de espectro
extendido del tipo GES. 41
Las B lactamasas en Pseudomonas aeruginosa han sido reportadas ampliamente
pero son mas raras que en Enterobacterias13. Estudios multicentricos en Reino Unido
reportaron B- lactamasas en únicamente 2.5% de 1886 aislamientos de Pseudomonas
aeruginosa en 1982 y 0.7% reportado en Francia en 1993 13 Cuando una B-Iactamasa de
espectro extendido (BLEE), genes bIs TEM, bIs SHV, bIs PER, bIs VER, bla GESIIBC se
sospecha en P aeruginosa, los métodos para determinar el pi por IEF puede únicamente
indicar la presencia de B-Iactamasas adquiridas más que identificar BLEE. El análisis de
la secuencia de los productos obtenidos por PCR es la única manera aceptada para
determinar adecuadamente las BLEE de la misma familia 42
El 76% de las cepas estudiadas con resistencia a ceftazidima produjeron pI
variables de 5.0, 5.6, 6.0, 7.2 Y8.0. Las enzimas TEM 2,30,31,32, Y35 en P aeruginosa
tienen pI en rangos de 5.2 a 5.6; PER tiene pI de 53.5; PSE 2 tiene pI de 6.1; OXA 11
tiene pi de 6.4 y SHV 5 tiene pI de 8.2 43estas enzimas es probable que estén presentes
en nuestra cepas, por lo que es necesario utilizar oligonucleotidos específicos para
identificar los genes correspondientes. La resistencia a B-lactamicos es variable, en
Francia Cavallo ID y cols reportaron en 142 aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
producción de B-lactamasas adquiridas en 29.5% y sobre expresión de cefalosporinasa
AmpC codificadas por cromosomas en 21.3 % 23. De Champs encontró en 44 cepas de
Pseudomonas aeruginosa resistente a ceftazidima, después de realizar genotipo, 9
tenían otras B lactamasas además de AmpC, 6 OXA- 21, con pI (8.4 Y5.7) 2 PSE con pI
(8.4 y.7) Y I PER con pl( 7.8 Y 5.4) 44 La resistencia ceftazidima y cefepime puede
presentarse por B-lactamasas o bien por bombas de eflujo MexAB-OprM, MexCD-
OprJ, MexEF- OprN y MexXY-OprM2 1
Las debilidades de nuestro estudio son que se trato de una muestra pequeña y la
pérdida de varias cepas, además no fue posible utilizar la misma tarjeta para tener la
27
sensibilidad a todos los antimicrobianos con actividad antipseudomonas. Nuestros
resultados son preeliminares, falta realizar PCR con oligonucleotidos específicos a las 2
cepas con prueba positiva a sinergia con doble disco para identificar los genes VIM o
IMP, así mismo realizar PCR con oligonucleotidos específicos para amplificar genes de
BLEE.
Es necesario realizar estudios prospectivos de mayor duración que reflejen con mayor
precisión la resistencia en Pseudomonas aeruginosa, investiguen, de ser posible todos
los mecanismos de resistencia expresados por este patógeno, bombas de eflujo, sobre
expresión de AmpC, enzimas codificadoras de resistencia a aminoglucósidos.
y genes codificadores de resistencia para quinolonas.
28
CONCLUSIONES
La Prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente en el hospital de
Infectología en el período de estudio fue 34.6%.
Las infecciones nosocomiaIes por Pseudomonas aeruginosa mas frecuentes en el
hospital de Infectología fueron neumonía e infección de piel y tejidos blandos.
Los fármacos con mayor resistencia a Pseudomonas aeruginosa fueron
Ticarcilina clavulanato 85.7%, ceftazidima y cefepime 76.2%, ciprofloxacino 71.4% y
amikacina 61.9%.
Lo fármacos con menor resistencia a Pseudomonas aeruginosa fueron
piperacilina/tazobactam 28.6%; imipenem 28.6% y Meropenem 33.3%
Las cepas estudiadas no fueron parte de un brote.
La prevalencia de metalo-B-Iactamasas en el hospital de Infectología fue de 11%
Es probable la presencia B-Iactamasas de espectro extendido en el hospital de
Infectología
Sugerimos la restricción del uso de ceftazidima y cefepime en formaempírica en
infecciones nosocomiales no documentadas por Pseudomonas aeruginosa
Sugerimos el uso de piperacilina/tazobactam + amikacina como terapia de relevo
en infecciones nosocomiales por Pseudomonas aeruginosa.
29
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33
ANEXO 1
FICHA DE RECOLECCiÓN DE DATOS
Nombre Paterno Materno
Sexo. ( ) 1.- Hombre 2.- Mujer
Edad. Años.
Diagnóstico de Ingreso. _
Otro diagnóstico 1. _
Otro diagnóstico 2. _
Servicio. ( ) I.Adu1tos 2. Neumología 3.- Terapia Intensiva
Numero de cama
Tratamiento previo. ( ) l.-Si 2.- No
I.-Amikacina ( ) días _ 2.-Cefepime ( ) días _ 3.-Ceftazidima ( ) días_4.- Ticar/c1av
( ) días_5.-Piper/tazo ( ) días_6.-Ciprofloxacino ( ) días_7.-Imipenem ( ) días 8.-
Meropenem ( ) días_9.-Clindamicina( ) días _10.- Metronidazol ( ) días_11.-
Cefotaxima ( )_
Día Mes Año
Tipo de infección nosocomial. _
Días de estancia hospitalaria _
Fecha de aislamiento
- --=-.,------::-::----,--
Tipo de muestra ( ) 1.- Hemocultivo 2.- Urocultivo Chorro medio 3.- Urocultivo sonda F
4.- Tejido herida 5.- Expectoración 6.-Aspirado endotraqueal 7.- Lavado bronquioalveolar
8.-Punta de catéter. 9.- Biopsia de hueso 10.- Otros (otros líquidos, hisopados de sitio de
inserción)
Factores de riesgo _
Factores de riesgo _
Factores de riesgo _
Factores de riesgo _
Factores de riesgo- --------
Tratamiento recibido ( ) 1.- Si 2.- No
1.- Amikacina ( ) días_ 2.- Cefepime ( ) días_ 3.-Ceftazidima ( ) días_ 4.- Ticar/c1av ( )
días_ 5.- Piper/tazo ( ) días _ 6.-Ciprofloxacino ( ) días _ 7.- Imipenem ( ) días _ 8.-
Meropenem ( ) días _
34
Resistencia en MICs ( ) 1.- Resistente 2.- Sensible
1.- Amikacina ( ) días_ 2.- Cefepime ( ) días_ 3.-Ceftazidima ( ) días_ 4.- Ticar/cIav
( ) días._5.- Piper/tazo ( ) días _ 6.-Ciprofloxacino ( ) días _7.- Imipenem ( ) días_
8.- Meropenem ( ) días _
Evolución clínica ( ) 1.- Mejoría 2.- Curación 3.- Defunción
Diagnóstico de defunción ---::-----::-:---::-----=-:----::---::-:-- _
Relacionado a proceso infeccioso ( ) 1.- Si 2.- No
Producción de BLEE ( ) 1.- Si 2.- No
Producción de Metalo-B-Iactamasas
Tipo de Métalo- enzima _
Otros aislamientos ( ) 1.- Si 2.- No
Sito y microorganismo _
Sitio y microorganismo _
35
ANEXO 2
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
Hospital de Infectología Centro medico Nacional la Raza Fecha _
Por medio de la presente acepto participar en el proyecto de investigación
titulado " Prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente y producción de B-
lactamasas de espectro extendido en infecciones nosocomiales del Hospital de
Infectología Centro Medico Nacional La Raza" registrado ante el comité local de
investigación con el número 10-28-04-04 El objetivo de este estudio es: conocer la
prevalencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente (una bacteria causante de
infecciones hospitalarias) y la producción metalo-B-Iactamasas y/o B-Iactamasas de
espectro extendido (enzimas que le confieren resistencia a antibióticos) de tal manera
que podamos ofrecer a nuestros pacientes terapia empírica adecuada en base a los
resultados que se obtengan.
Se me ha explicado que mi participación consistirá en dejarme examinar por el
médico para determinar si la bacteria aislada realmente esta produciendo infección.
Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos,
inconvenientes, molestias y beneficios derivados de mi participación en el estudio.
El investigador principal se ha comprometido en darme información oportuna
sobre cualquier procedimiento alternativo adecuado que pudiera ser ventajoso para mi
tratamiento, así como a responder a cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que le
plantee acerca de los procedimientos que se llevaran a acabo, los riesgos, beneficios o
cualquier otro asunto relacionado con la investigacióno con mi tratamiento.
Entiendo que conservo el derecho de retirarme del estudio en cualquier momento
en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo del
instituto.
El investigador principal me ha dado seguridades de que no se me identificara en
las presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio y de los datos
relacionados con mi privacidad serán manejados en forma confidencial. También se ha
comprometido a proporcionarme información actualizada que se obtenga durante el
estudio aunque pudiera hacerme cambiar de parecer respecto a mi permanencia en el
mismo.
Nombre y firma del paciente.
principal
Testigo
Nombre y firma del investigador
Testigo
36
ANEXO 3
IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS DE P. AERUGINOSA
Bacilos gramnegativos que hayan crecido en agar sangre, agar chocolate y agar
MacConkey en muestras de orina, sangre, tejido (ITB), expectoración, lavado
broncoalveolar, con prueba de oxidasa positiva, sin fermentar la glucosa cuya
morfología colonial sea de bordes serrados, colonias planas, brillo confluente, brillo
metálico de color azul verdoso, rojo o con pigmento café.
La identificación y susceptibilidad se realizará con el sistema automatizado
(microdilución en caldo) VITEK. Se tomarán cultivos puros de 24 hrs. de P aeruginosa,
se inoculará en solución salina 1.8 mI al 0.45%, para identificación ajustar a 1 de
Macfarland - zona azul del colorímetro- y para susceptibilidad añadir 50 mI de la
suspensión de identificación.
Se utilizaran las tarjetas VITEK GNS 613 que incluye los siguientes antibióticos:
amikacina, cefepime, ceftazidima, cefpirome, ciprofloxacino, imipenem, meropenem,
levofloxacino, piperaclina/tazobactam y ticarcilina /clavulanato. De acuerdo a los MICs
propuestos por la NCCLS se determinaran las categorías de sensible, o resistente (los
MICs intermedios se tomaron como resistentes)
Los MICs considerados como resistentes serán los siguientes: amikacina ~ 32
cefepime ~ 16, ceftazidima ~16, ciprofloxacino ~ 2, gentamicina ~ 8, Imipenem ~8,
meropenem ~8, piperacilina ~ 128, piperacilina/tazobactam> 64, ticarcilina/clavulanato
~128.Todas las concentraciones están en ug/ml.,
Para el control de calidad se usara la cepa de referencia ATCC # 27853
37
ANEXO 4
TÉCNICAS DE TOMA DE MUESTRAS
ESPUTO ESPONTÁNEO: Se utiliza cuando el paciente es capaz de expectorar. Se
toma la primera muestra de la mafiana, se deben remover prótesis dentales; lavar encías,
lengua y boca y verificar que el paciente haga colutorios antes de obtener la muestra;
obtener cuando menos 2 mi de muestra en un frasco de boca ancha estéril
HEMOCULTIVO: Lavarse las manos, seleccionar el sitio de venopunción, desinfectar
la tapa de la botella de hemocultivo con alcohol al 70%, limpiar el sitio con
movimientos concéntricos, de adentro hacia afuera, para abarcar un área de 5 cm, aplicar
primero alcohol al 70 % Y después isodine; esperar un minuto antes de la venopunción,
no palpar la vena a puncionar sin asepsia previa de los dedos, obtener 10 ce de sangre;
inocular en la botella sin cambiar la aguja, agitar el frasco suavemente y enviar la
muestra de inmediato al laboratorio si no es posible conservarla a temperatura ambiente.
UROCULTIVO DE CHORRO MEDIO: Después de una cuidadosa limpieza de la
región genital con agua y jabón, se recomienda se deseche la primera parte de la
micción, la que sigue se vacié en un frasco estéril y eliminar la última parte. Etiquetar
adecuadamente.
UROCULTIVO CUANDO SE TIENE SONDA FOLEY: Preparar el material, lavado
de manos y colocación de guantes; limpiar el segmento del catéter urinario proximal a la
conexión con el tubo de drenaje (con isodine al 1% o alcohol al 70%), pinzar el tubo de
drenaje; puncionar en ángulo de 45 o el catéter en forma oblicua con una jeringa y aguja
de 25 g; aspirar 5 - 10 ce de orina y recolectarla en un frasco est éril, retirar la pinza;
enviar al laboratorio máximo en 30 minutos si no es posible refrigerarla a 4° C.
CULTIVOS DE TEJIDOS BLANDOS EN HERIDAS ABIERTAS: Se podrán
tomar en artesa oen quirófimo previa asepsia y antisepsia de la zona afectada. Se
tomará tejido infectado con hoja de bisturí, enviándose inmediatamente en un frasco de
solución salina a cultivo. No son validas las muestras tomadas por hisopado.
CULTIVO DE SECRECION DEL SITIO DE INSERCIÓN DEL CATETER
INTRAVASCULAR: Colocarse cubrebocas y lavarse las manos; retirar el apósito;
tomar las secreciones con un hisopo estéril y ponerla en un tubo de Stuart. En caso de
sospecha de infección del catéter enviar 3 cm de la punta de catéter para cultivo en
frasco estéril con solución salina.
--~-------
38
ANEXOS
DEFINICIÓN OPERACIONAL DE VARIABLES
MUESTRA CLÍNICAMENTE UTIL: Muestra tomada con la técnica adecuada según
estándares establecidos y aislamiento de cultivo puro de P aeruginosa. Ver anexo 4
INDICADOR: Cultivo positivo-negativo
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Para las muestras de vías aéreas inferiores,
(expectoración espontánea, aspirado endotraqueal y lavado broncoalveolar) el Gram.
debe tener menos de 10 células epiteliales y más de 20 polimorfonucleares en el campo
de 10X. En las muestras de orina en la tinción de Gram. deben observarse
microorganismos y el sedimento con 10 leucocitos o más. Las muestras de tejido en ITB
se les realizará de rutina Gram. y deben visualizarse microorganismos.
NEUMONÍA NOSOCOMIAL: cuatro criterios hacen el diagnostico
1.- Fiebre hipotermia o distermia
2.- Tos
3.- Esputo purulento o drenaje purulento a través de cánula endotraqueal que al examen
macroscópico en seco débil muestra <10 células epitelialesy >20 leucocitos por campo
4.- Signos clinicos de neumonía
5.- Radiografia de tórax compatible con neumonía
6.- Identificación P. aeruginosa en esputo, secreción endotraqueal, lavado
Bronquioalveolar o hemocultivo
INDICADOR: Presente o ausente
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACIÓN: además de los criterios clínicos y la radiografia de tórax,
para aspirado endotraqueal se requiere por cultivo cuantitativo 105 ufc/ml de P.
aeruginosa y para lavado broncoalveolar 104 ufc/ml.
INFECCIÓN DE VIAS URINARIAS SINTOMÁTICA: Tres o más de los siguientes
criterios.
1.- Dolor en flancos
2.- Percusión dolorosa en ángulo costovertebral
3.- Dolor suprapúbico
4.- Disuria
4.- Urgencia miccional
6.- Polaquiuria
7.- Escalofrío
39
8.- Fiebre o distennia
9.- Orina turbia
lO-Cultivo de chorro medio obtenido previa asepsia, mayor a 50,000 ufc/ml de P.
aeruginosa (una muestra)
11.- En caso de sonda Foley una muestra con 50,000 ufc/ml de P. aeruginosa
INFECCIÓN DE VIAS URINARIAS ASINTOMÁTICA Pacientes asintorn áticos de
alto riesgo con un sedimento urinario que contenga 10 o más leucocitos por campo más
cualquiera de los siguientes:
1.-. Muestra obtenida previa asepsia de chorro medio con mas de 50,000 ufc/ml de P.
aeruginosa
2.- En caso de sonda Foley debe contar el paciente con un urocultivo negativo al
momento de la instalación. Se requieren dos muestras con 50,000 ufc/ml de P.
aeruginosa
INDICADOR: Presente o ausente
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Además de los criterios clinicos (no aplican en caso de
infección asintom ática) deben cumplirse los criterios microbiológicos
INFECCIONES DE LA PIEL:
Drenaje purulento, pústulas, vesículas o furúnculos con dos o más de los siguientes
criterios:
1.- Dolor espontáneo o a la palpación.
2.- Inflamación.
3.- Rubor.
4.- Calor.
5.- P aeruginosa aislada por cultivo de aspirado o drenaje de la lesión.
INFECCIÓN DE TEJIDOS BLANDOS: (Fascitis necrosante, gangrena, celulitis
necrosante, miositis, linfadenitis o linfangitis). Tres o más de los siguientes criterios
1.- Dolor localizado espontáneo o a la palpación
2.- Inflamación.
3.- Rubor, palidez o zonas violáceas.
4.- Crepitación.
5.- Necrosis de tejidos .
6.- Trayectos linfangíticos
7.-Drenaje purulento.
8.- P aeruginosa aislada por cultivo de tejido del sitio afectado
INDICADOR: Presente o ausente
40
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Además de los criterios clínicos deben cumplirse con los
criterios microbiológicos (cultivos de tejido y tinción de Gram.)
BACTEREMIAS: El diagnóstico se establece en un paciente con fiebre, hipotermia o
distermia con hemocultivo positivo para Pseudomonas aeruginosa
Este diagnóstico también puede darse aún en pacientes con menos de 48 hrs.de estancia
hospitalaria si se les realizan procedimientos invasivos o reciben terapia intravascular
PRIMARIA: Aislamiento de P. aeruginosa en hemocultivo de pacientes con
manifestaciones clínicas de infección y en quienes no es posible identificar un foco
infeccioso que explique los síntomas.
SECUNDARIA: Hemocultivo positivo de P. aeruginosa en pacientes con síntomas
localizados a cualquier nivel. Se debe identificar el mismo microorganismo en el sitio
afectado.
INDICADOR: Presente o ausente
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Deben cumplirse los criterios clínicos y microbiológicos
BACTEREMIAS RELACIONADAS A LINEAS Y TERAPIA INTRA VASCULAR
Hemocultivo positivo a P aeruginosa con dos o más de los siguientes criterios:
1.- Relación temporal entre la administración de terapia intravascular y la aparición de
manifestaciones clínicas.
2.- Ausencia de foco evidente.
3.- Desaparición de los síntomas y signos al retirar el catéter o solución sospechosa.
4.- Cultivo de punta de catéter con mas de 15 ufc/ml de P aeruginosa.
INDICADOR: Presente o ausente.
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal.
OPERACIONALIZACION: Debe cumplir con criterios clínicos y microbiológicos.
INFECCIÓN DEL SITIO DE INSERCIÓN DEL CATETER
Dos o más de los siguientes criterios:
1.- Calor, edema, rubor, dolor.
2.- Drenaje purulento del sitio de entrada del catéter o del túnel subcutáneo
3.- Tinción de Gram positiva del sitio de entrada del catéter o del material purulento
4.- Cultivo positivo a P. aeruginosa del sitio de inserción del catéter
41
INDICADOR: Presente o ausente
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Debe cumplir con criterios clínicos y microbiológicos
SEXO: Género de los pacientes
INDICADOR: Masculino o femenino
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nominal
OPERACIONALIZACION: Se buscará en el expediente
EDAD: Número de años del paciente en el momento de la inclusión
INDICADOR: Edad en años
ESCALA DE MEDICION: Cuantitativa contínua
OPERACIONALIZACION. Se tomará del expediente
ENFERMEDADES CRONICODEGENERATIVAS: Enfermedades previas de los
pacientes, no curables, solo controlables .
INDICADOR: Hipertensión arterial, diabetes mellitus 2, cardiopatía isquémica,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardiaca, insuficiencia renal,
insuficiencia hepática etc.
ESCALA DE MEDICION: Cualitativa nomínal
OPERACIONALIZACION: Se investigará del expediente
42
ANEXO 6
CARACTERIZACION CLONAL DE LOS AISLAMIENTOS CLÍNICOS DE P
AERUGINOSA POR PFGE
Se empleará el método de electrofuresis en gel por campos pulsados. La Purificación del DNA
se hará a partir de un cultivo puro en caldo Luria Berthani (LB) se cosecharán las células por
centrifugación a 13,000 rpm por S min a 4° C, se lavarán con solución salina Tris (NaCI l M,
Tris 0.01 M pH 8.0), Y se resuspenderán en 440 ul de la misma solución, después mezclar la
suspensión con un volumen igual de agarosa Sea Plaque GTC punto de fusión a 6SoC
(Bioproducts Rockland, Maine USA) en I.S % de solución salina Tris, con la mezcla que se
obtendrá hacer discos de 20 ul Yenfriarlos a-20° C por S min., tratar con solución de lisis EC
(Tris 6 mM [pH 8.0], NaCI I M, EDTA O.lM [pH 8.0], desoxicolato de Na 0.1 %, Sarcosyl
0.5%, SO ug/ml, de RNAsa A, 100 ug/ml de Iisozima, SO ug/ml de lisostafina) e incubar a 37°
C x 3 horas, se decanta y agrega la solución ES (EDTA O.SM [pH 9.0], Sarcosyll%) agregando
1.0 mg/ml de proteínasa K a una temperatura de Soo C durante 18 horas como mínimo y un
máximo de 24 hrs. La solución ES se decanta y lavan los discos 4 veces con solución
amortiguadora TE IX (Tris I M [pH 7.S], EDTA O.SM [pH 8.0], en agitación suavedurante I
hora a temperatura ambiente, después se realizará la digestión del DNA con 20 U de enzima Spe
1 (New England Biolabs, Hertfordshire, United Kingdom), durante 17 horas. Después se separan
los fragmentos del DNA por electroforesis por campos pulsados, en un sistema de electroforesis
(Laboratorios BioRad CHEF-DR II PFGE, Ontario Canadá) en geles de agarosa 1.4% en
amortiguador TBE O.SX (Tris base 4SmM, ácido bórico 4S mM, EDTA I mM [pH 8.0]) a
voltaje de II V/cm., con pulsos de cambio de linearidad de s I a lOO segundos por 23 horas. El
lambda ladder PFG Marker # 340 (New England Blolabs, Ontario Canadá) se usará como
marcador estándar de peso molecular. Después se teñirá el gel con bromuro de etidio y se
visualizará con luz UV. Para determinar los tipos c1ónales se analizarán los perfiles de
restricción visual, usando los criterios de Tenover y Cols .
43
ANEXO 7
Prueba de detección de MBL
l. Tomar unas colonias de cultivo puro e inocular en agar LB, dejar toda la noche
(overnight-OIN).
2. Tomar 3 a 5 colonias y transferirlas a un tubo de ensayo de 13 x lOO con 5 mI de
solución salina al 0.7%.
3. La turbidez se ajusta con la misma solución salina estéril para obtener una turbidez
óptima comparable a un estándar de 0.5 de la escala de Mcfarland.
4. Ajustar con el espectrofotómetro a una longitud de onda de 625 nm con una DO. de 0.08
- 0.10 en absorbancia.
5. En un lapso no mayor de 15 minutos después de ajustar la turbidez, sumergir un hisopo
en el tubo con la suspensión . El hisopo deber ser rotado varias veces, presionando
firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel del líquido. Esto elimina el
exceso de inoculo.
6. Se inocula toda la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton por rayado con el
hisopo. El procedimiento de rayado se repite de 3 a 4, rotando la placa aproximadamente
60° cada vez, esto con la finalidad de asegurar una distribución constante del inoculo.
Como paso final se pasa el hisopo sobre los bordes de la placa.
7 Impregnar unos discos con lO J.l1 de EDTA 0.5 M (Sumol) pH 8 y dejarlos secar en una
caja de petri estéril junto al mechero .
8.- La tapa de la placa puede quedar entreabierta por 3 a 5 min., pero no más del5, para
permitir que el exceso de humedad de la superficie se absorba antes de aplicar el disco.
9 Colocar los discos de la siguiente manera (se puede ayudar con una plantilla), a la
Izquierda Imipenem (lOJ.lg), al centro EDTA 0.5 m (Sumol) y a la derecha Ceftazidima
(30J.lg), con una distancia de 12 mm. entre borde a borde . Los discos se dispensan sobre
la superficie del agar, cada disco deber ser presionado para asegurar contacto pleno con
la superficie del agar. Una vez colocados los discos, no deben ser recolocados.
9 Las placas son invertidas y puestas en una incubadora a 35° C en el lapso de 15 mino
durante18 horas.
lOSe considera positiva la prueba si existe deformación de los halos de Imipenem y
Ceftazidima, como se muestra en la siguiente figura:
11 Utilizar controles positivos y negativos para evitar falsos positivos.
44
ANEXO 8
ISOELECTROENFOQUE (lEF) DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA (ACES)
1. De un cultivo fresco se toma una asada de bacterias y se inocula en 5 ml de LB O/N en
el Shacker a 37°C.
2. Tomar aproximadamente 1.5 mI con una pipeta Pasteur y depositarlo en un eppendorf de
2.0 mI y centrifugar durante 2 min a 12,000 rpm. Realizar 2 veces este procedimiento.
3. Decantar el S/N Y resuspender la pastilla en 1 mI de 30 mM acido N-(2-acetamido)-2-
aminoetanesulfonico (ACES)-NaOH buffer (pH 7.0) (AB).
4. Centrifugar por 2 mino a 12,000 rpm
5. Decantar el S/N y resuspender la pastilla en 700 ~I de buffer ACES-NaOH 30 mM pH
7.0.
6. Todos los pasos realizarlos en presencia de hielo.
7. Se romperán las células por sonicación en hielo dando 6 ciclos de 15" cada ciclo a 50
W). Dar intervalos de enfriamiento entre ciclo y ciclo para evitar el sobre calentamiento.
En caso de que sea necesario dar más ciclos y dejar reposar periodos largos.
8. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 min y se colectara el S/N o la fase acuosa para que sea
almacenada -20°C.
PARA PREPARAR LA NITROCEFINA:
• 0.7 mg de nitrocefina!ml en ACES-NaOH buffer 30mM pH 7.0
• 0.25 mM de nitrocefina en ACES con 2 mM de ZnCI2
CORRIMIENTO DEL GEL
• 0.1 W/cm2 por 2 hrs a JOoC
CONTROLES
• VIM-l : 5.3
• TEM-l: 5.4
BIOENSAYO:
• J-532 Y2 ~g de IPMlml e incubar a 37°C O/N. Confirmación de la hidrólisis del IPM
• 5 minoantes del bioensayo cubrir con un papel filtro conteniendo 20 mM de EDTA por 5
mino*
45
ANEXO 9
EXTRACCIÓN DE MEGAPLASMIDOS (KIESSER)
l.-Sembrar las cepas en 5 mi de LB (+ antibiótico= cefotaxima lug/ml) y dejar a 37° C
overnigth (OIN) con agitación.
2.- Del cultivo de LB, tomar 3 mi con una punta estéril y centrifugar a 13,000 rpm
durante un minuto a temperatura ambiente.
3.- Se decanta y se suspende la pastilla en 400 ul de la solución 1, se vortexea y se agrega
I00 ~l de lizosima (lOmglml)
4.- Mezclar muy suavemente varias veces por inmersión e incubar 30 mino en hielo.
Agregar 250 ul de la solución Il e inmediatamente mezclar con suavidad varias veces
por inmersión.
5.-lncubar a 55° C por 30 mino y posteriormente enfriar en agua a temperatura ambiente
por 5 mino
6.- Agregar 80 ~L de fenol-cloroformo a temperatura ambiente y vortexear por varios
segundos (aproximadamente 10 segundos)
7.- Centrifugar 5 a 10 min a 4° C 12,000 rpm.
8.- Tomar 350 a 400 ~l del sobrenadante (S/N) cuidando de no tocar la pastilla, mantener
el S/N en hielo a 4° C.
CORRIMIENTO DEL GEL
9.- Una vez que se prepara el gel de agarosa al 0.7 %, correr 45 ul del S/N ( + 6~1 de
colorante 6x, azul de bromofenol).
10.- Se coloca TBE lx suficiente para cubrir al gel ya puesto en la cámara, correr la
muestra por 30 a 60 mino a TA a 95 volts y posteriormente a 4° C por 6 hr. A 95 volts.
11.- Teñir el gel con bromuro de etidio por 20 minutos y observar con el tras iluminador.
PREPARACIÓN DE SOL UCIONES.
SOLUCIO N 1
Stock 100ml [ ] final
Sacarosa 1M 30 0.3 M
Tris HCL pH8 1M 2.5 25 mM
EDTA pH8 0.5 M 5 25mM
Agua 62.5
SOLUCION 11
Stock 5ml 1 mi [ ] final
NaOH5M 3OOll1 6Oll1 0.3 111
SDS5% lml 200 111 2
Agua 3.7 mi 74Oll1
46
47
ANEXO 10
CONJUGACIÓN
Método descrito por Miller en 1972
1.- Crecer el cultivo bacteriano de las cepas receptoras E coli J53-2 y donadora
(Pseudomonas aeruginosa) en caldo LB 5 mIcon agitación durante 18 hrs. a una Temp.
De 37° C
2.- Realizar la dilución 1:40 en caldo LB, para fines de este experimento, utilizar 0.5 mi
de cultivo para 20 ml de caldo LB.
3.- Incubar a 37 ° C con agitación hasta la fase logarítmica utilizando el
espectrofotómetro a 600 nm hasta alcanzar una 0 .0. de 0.5 y colocar rápidamente en
hielo o utilizar el tubo 3 de Mcfarland
4.- Mezclar los cultivos de receptora-donadora conservando la relación 1:IO, para fines
de este experimento usar I mi de E coli J53-2 ylOO 111 de Pseudomonas aeruginosa (3
tubos , 24, 48 Y72 c/u a 30° C s/agitación .
5.- Filtrar usando un filtro de membrana y colocarla en medio LB a 37° C por 18 hrs.
6.- Espatular 100 111 de cultivo en medo selectivo de Rifampicina- cefotaxima y
Rifampicina-ampicilina, como controles y espatular además la mezcla de los cultivos en
Rifampicina- cefotaxima y Rifampicina- ampicilina e incubar a 37° C por 24 hrs. por
duplicado.
7.- Incubar a 37° C para obtener trasconjugantes (de la membrana en la cual se filtró la
mezcla, ya pasadas las 24 hrs. en incubación y pasarla a un tubo con medio LB para
homogeneizar y de aquí tomar 100 111 Y espatular en medios de Rifampicina- cefotaxima
y Rifampicina -ampicilina). Debe haber un rango mayor de 25 y menor de 300
trasconjugantes, para este caso hacer diluciones, si no se obtienen trasconjugantes
espatular otra vez (ocupar el tubo de 48 y 72 hrs. según corresponda)
8.- Si se obtienen trasconjugantes picar en medios mínimos para descartar en verdad las
cepas "X"
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	Antecedentes
	Justificación
	Problema
	Objetivos
	Pacientes y Método
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	BibliografíaAnexos